KR920001374B1

KR920001374B1 - 셀루로즈를 분해하는 클로스트리디움속 세균 및 그의 이용방법

Info

Publication number: KR920001374B1
Application number: KR1019890003676A
Authority: KR
Inventors: 김병홍; 윤기흥; 전영숙; 신영숙; 김상봉; 지차호; 김산호
Original assignee: 한국과학기술원; 이상수
Priority date: 1989-03-23
Filing date: 1989-03-23
Publication date: 1992-02-11
Also published as: KR900014582A

Abstract

내용 없음.

Description

셀루로즈를 분해하는 클로스트리디움속 세균 및 그의 이용방법

본 발명의 목적은 섬유소 분해력이 우수한 혐기성 섬유소 분해 세균인 클로스트리디움(clostridium sp. KCTC8440)의 분리방법 및 포자의 형성방법과 그들을 이용함에 있다.

본 발명에서 분리한 클로스트리디움(clostridium)속 세균의 형태는 간균이며, 그람 양성균으로 균체 말단 부위에 포자(spore)를 형성하고, 황산염을 환원하지 않는 특징을 가지고 있다. 섬유소를 분해하는 클로스트리디움(clostridium)속 세균으로 1944년 Hungate에 의해 처음으로 클로스트리디움 셀로바이오파룸(clostridium cellobioparum)이 반추동물의 제1위(Rumen)에서 분리되었고(J.Bacteriol., Vol.48,499-513,1944). 최근에 퇴적층 및 혐기 발효조 등에서 클로스트리디움 파피로솔벤스(clostridium papyrosolvens), 클로스트리디움 셀룰로보란스(clostridium cellulovorans), 클로스트리디움 파플로리티(clostridium populeti) 등이 각기 분리 보고되어 있다(International J. of Systematic Bacteriol., Vol. 32, 78-91, 1982 ; Vol. 33, 837-840, 1984 ; Vol.34, 155-159, 1984 ; Vol.35, 160-163, 1985 ; Applied and Environmental Microbiology Vol.48, 88-93, 1984).

클로스트리디움속에 속하지 않지만 반추동물 제1위에서 혐기성 섬유소 분해 세균이 분리 보고되고 있는데, 이들 중에서 중요한 세균으로는 루미노코커스(Ruminococcus)속균, 박테로이드스(Bacteroides)속균, 유박테리아(Eubacteria)속 세균 등이 많이 알려지고 있다.

혐기상태인 반추동물의 제1위(Rumen)는 혐기성 미생물이 생육하는 곳으로 독특한 구조를 가지고 있다. 다른 포유류가 이용할 수 없는 섬유소를 반추동물이 이용할 수 있는 것은 동물이 섬유소를 직접 소화하지 못하고 제1위에 존재하는 섬유소 분해세균이 섬유소를 분해 발효하여 여기서 발생하는 발효산물이 반추동물의 영양원으로 이용되기 때문이다. 그러므로 이들 혐기성 미생물은 제1위 활성에 대단히 중요하며 그중에서도 특히 섬유소 분해균의 활성은 매우 중요하다. 정상적인 반추동물의 제1위내 미생물은 섬유소 분해 세균과 당을 이용하는 그밖의 세균들이 균형을 이루면서 1위내 활성을 유지한다. 섭취하는 사료나 반추동물의 외적 및 내적 요인이 제1위내의 환경을 변화시키며 제1위 미생물도 큰 영향을 받게된다. 이러한 변화는 결국 반추동물의 생리에 영향을 주어 병인이 되거나 성장 및 영양에 영향을 주게된다. 가장 큰 영향을 받는 미생물은 약 알칼리성 pH와 복잡한 영양요구를 갖는 섬유소 분해세균이며 이들 섬유소 분해세균의 균형파괴는 곧 반추동물의 영양에 영향을 미친다.

이러한 이유로 제1위 활성에 정상적인 미생물의 균형은 대단히 중요하다. 제1위내 미생물의 균형이 파괴되었을때 정상회복은 많은 시간이 필요하며 섬유소 분해세균의 공급과 pH 조절로 회복시간을 단축할 수 있다. 본 발명은 이런점에 유의하여 반추동물의 제1위의 환경에서 생육할 수 있는 혐기성 섬유소 분해세균중 활성이 강하고 유통과정에서 산소와 접촉하여도 죽지 않는 포자를 형성하는 세균을 분리 동정하고 포자를 생산하는 방법을 확립하였다. 반추동물의 제1위에서 섬유소 분해력이 강한 것으로 알려진 루미노코커스(Ruminococuus)속, 박테로이드스(Bacteroides)속 등에 속하는 세균은 포자를 형성하지 못하므로 생균체는 산소에 의해 쉽게 사멸되므로 유통과정에서 실활될 가능성이 높다. 또 이들은 복잡한 영양 요구성이기 때문에 배양하기도 어렵다. 한편 섬유소를 분해하는 클로스트리디움(clostridium)속 세균은 포자를 형성하기 때문에 상품화가 쉬울뿐 아니라 영양요구성이 간단하고 반추동물 제1위의 정상 균총의 하나로 알려져 있다(Hungate, Canadian J. of Bacteriology, 3, 289-311, 1957 ; J. of Bacteriology, 48, 499-513, 1944). 이와같은 배경에서 본 발명에서는 섬유소 분해력이 강하고 포자를 형성하는 혐기성 세균을 분리 동정하여 지금까지 알려지지 않은 세균임과 반추동물의 제1위 환경에서 섬유소 분해력이 강한 것을 밝혔다. 또한 이 세균의 포자를 생산하는 방법을 확립하였으며 포자가 공기 중에서 사멸되지 않는 것을 증명하였으며, 국내에서 건초생산에 문제가 되는 동절기에 농후사료와 함께 조사료를 사용하는데 반추동물 제1위의 미생물균은 Cellulose를 이용하지 못하므로 이때 Cellulose분해력이 강한 이 세균이 반추동물의 사료첨가제로 사용될 수 있는 아주 유용한 미생물이다.

[실시예 1]

분리 및 동정은 다음과 같다.

세균의 분리와 동정에 사용한 배지의 조정은 표 1과 같다. 섬유소 배지는 기본배지에 여과지 혹은 72시간 볼밀(Ball-Mill)한 여과지를 1%가 되게 첨가하여 제조하였다.

필요에 따라 다양한 발효기질을 첨가한 기본배지도 사용하였다. 배지 제조를 비롯한 모든 조작은 혐기성 미생물 취급법에 따라 수행하였다(A roll tube method for cultivation of strict anaerobes p.117-132 ; In. J. R. Norris and D. W. Ribbons(ed), Methods in Miocrobiology, Vol. 36, Academic press, Inc., London). 세균의 분리와 배양을 위해 18×142mm 혐기성 시험관 혹은 50ml, 150ml 용량의 혈청병을 사용하였다. 모든 배치는 121℃에서 15분간 멸균하였고, 배양온도는 30℃-35℃이었다. 분리균은 표준방법(Mannual of Methods for General Bacteriology, American Society for Microbiology)에 따라 동정하였다. 우사폐수 등 분리용 시료 1g씩 10ml 섬유소 배지에 접종하고 포자를 갖는 균을 선택하기 위하여 80℃에서 15분간 가열한후 섬유소가 분해될때까지 배양한다. 여기서 분해능이 우수한 배양을 선택하여 적당한 비율로 희석한후 섬유소 분해세균의 분리에 사용하였다. 희석된 배양액을 80℃에서 15분간 가열한후 섬유소를 함유하는 한천 고체배지와 혼합하여 롤 튜브법으로 배양하였다. 이때 따로 멸균된 포도당을 0.1%-0.2%가 되도록 첨가하였다. 7-10일 배양하면 섬유소를 분해하여 분해환을 형성하는 취락이 형성되는데 이를 액체배지에 접종하여 순수분리하였다.

분리균 중에서 섬유소 분해력이 강한 클로스트리디움(균주번호 SC221, KCTC8440)를 선별하고 이의 특징을 표 2와 같이 조사하였다. 포자의 위치는 전자현미경 사진(도표 1)에서 보는 바와같이 균체 말단 부위에 위치하며, 그람염색에서 그람음성으로 염색되었지만 전자현미경 사진에서는 그람양성균으로 판명되었다.

[표 1]

[표 2]

분리균(SC221, KCTC8440)은 섬유소, 셀로바이오스, 포도당 등을 발효하여 수용성인 아세트산, 에탄올, 젖산과 수소, 이산화탄소 등 기체를 생산하였다. 지금까지 보고된 섬유소를 분해하는 클로스트리디움속 세균 중에서 클로스트리디움 셀로바이오파럼과 클로스트리디움 셀룰로리티컴이 분리균과 같은 발효산물을 생산한다. 분리균의 특성을 이들과 비교한 결과(표 2) 세포형태, 포자위치 및 몇가지 생리적 특성은 비슷하였으나 최적온도 및 최적 pH와 DNA의 구아닌 사이토신 함량과 당발효성 등에서 크게 차이가 나는 것을 발견하였다. 위와같은 특성을 비교해 보았을때 분리균은 지금까지 분리 보고된 섬유소 분해 클로스트리디움 세균과 다른 새로운 균으로 동정되었다.

[실시예 2]

분리균(SC221, KCTC8440)이 반추동물 제1위 환경에서 섬유소를 분해하여 생육하는지를 조사하기 위해 면양의 제1위에서 채취한 내용물을 여과하여 고형물을 제거하고 여과지를 1%되게 첨가, 멸균한 배지에 분리균을 접종하여 여과지 분해를 관찰하였다. 비교를 위해 표준균 클로스트리디움 셀로바이오파룸(KCTC3043)과 클로스트리디움 셀룰로보란스(KCTC3044)를 접종한 시험관을 동시에 배양하여 여과지가 완전히 붕괴하는데 소요되는 시간을 측정하였다.(표 3).

[표 3]

표 3에서 보는 바와같이 분리균은 면양의 제1위 내용물에서 여과지를 6일만에 완전히 분해하였으며, 표준균과 비교했을 때 분해력이 월등하였다.

[실시예 3]

지금까지 알려진 섬유소 분해력이 있는 클로스트리디움 속 세균은 액체배지에서 포자를 잘 형성하지 않는 것으로 보고 되었다. 분리균이 포자를 형성하는 배양 조건을 다음과 같이 확립하였다. 발효기질로 셀로바이오스 0.5%, 포도당 1.0% 그리고 섬유소 1%를 첨가한 표 1에서 그 조성을 나타낸 기본배지에 펩톤, 고기즙(Meat Extract), 트립티카제(tripticase) 효모추출물 각각을 0.5%씩 첨가하여 분리균(SC221, KCTC8440)을 배양한 결과 포자형성이 가장 왕성하였다. 최적 배지 조건에서 전체 세포의 50% 이상이 포자로 판명되었다.

[실시예 4]

분리균의 포자가 산소에 노출되어도 안정성을 유지하는가를 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 하였다. 분리균의 포자 시료는 실시예 3과 같은 방법으로 10일간 배양하여 균체를 회수한 후 냉동건조하였다. 포자시료는 30일동안 공기에 노출되도록 포장된 시료와 공기에 노출되지 않은 시료를 구별하였다. 포자의 안정성 유무는 여과지가 첨가된 배지에 포자 시료를 적당히 희석하여 80℃에서 15분간 가열 접종한후 여과지가 분해된 경과일수로 비교하였다.

[표 4]

위의 결과 표 4는 포자가 1달 동안 산소에 노출되어도 안정성을 유지하고 있으며, 포자가 포함된 균체는 호기적균처럼 냉동건조하면 취급이 용이하다는 점이다.

위의 실시예 1-실시예 4와 같이 분리균은 지금까지 보고된 혐기성 섬유소 분해 클로스트리디움과 다른 새로운 균이고, 반추동물 제1위에서 섬유소 분해력이 우수할 뿐만 아니라 다량의 포자를 형성한다. 그리고 생성된 포자는 산소의 존재하에서도 안정성을 유지하기 때문에 반추동물의 제1의 활성 촉진제로서 사용될 수 있다. 따라서 본 발명에서 제조한 혐기성 세균인 클로스트리디움은 포자상태에서 반추동물의 사료첨가제로 매우 유용한 것이다.

[도표 1]

Claims

반추동물 제1위 환경에서 섬유소 분해력이 강한 염기성인 클로스트리디움(clostridium)속 세균 SC221, KCTC8440.
제1항에 있어서, 클로스트리디움(clostridium)속 세균 SC221, KCTC8440을 배지에 배양하여 포자를 형성하는 방법.
제2항에 있어서, 배지는 표 1에서 나타낸 것과 같이 효모추출물, (NH₄)₂SO₄, K₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄, CaCl₂, 2H₂O, 레자추린 용액, 미량 원소용액으로 이루어진 pH 7.4의 기본 배지에 셀로바이로스 0.5%, 포도당 1.0%, 섬유소 1.0%, 펩톤 0.5%, 고기즙 0.5%, 트립티카제 0.5%를 첨가한 방법.
클로스트리디움(clostridium)속 세균 SC221, KCTC8440의 반추동물 사료첨가제로서의 용도.