JPH05207894A - マクロライド系抗生物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 マクロライド系抗生物質生産菌とハンセヌラ
（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属に属する酵母とを混合培養す
ることを特徴とするマクロライド系抗生物質の製造法 【効果】 マクロライド系抗生物質の生産性を顕著に高
めることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は，医薬品として殊に抗菌
剤として有用なマクロライド系抗生物質の新規製造法に
関する。更に詳しくは，本発明は，マクロライド系抗生
物質生産菌とハンセヌラ（Hansenula）属に属する酵母
とを混合培養することを特徴とするマクロライド系抗生
物質の製造法及び，該酵母に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来，マクロライド系抗生物質は，各種
の微生物より生産されることが知られている。このう
ち，１６員環マクロライドであるロザミシンは，ミクロ
モノスポラ ロザリア（Micromonospora rosaria）Ｎ
ＲＲＬ３７１８により（フランス特許第２，０８１，４
４８号），また１４員環マクロライドであるエリスロマ
イシンは，サッカロポリスポラ属に属する菌株より得ら
れることが知られている（米国特許第２，６５３，８９
９号）

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は，天然に
存在する多くの微生物が生産する物質について研究を行
う過程で，ハンセヌラ（Hansenula）属に属する酵母
で，他のマクロライド系抗生物質生産菌と混合培養する
ことにより，マクロライド系抗生物質の発酵生産性を大
幅に向上させることができる微生物を単離し本発明を完
成した。

【０００４】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明はハンセ
ヌラ（Hansenula）属に属する酵母とマクロライド系抗
生物質生産菌と混合培養することによるマクロライド系
抗生物質の製造法及びハンセヌラ（Hansenula）属に属
する該酵母に関する。

【０００５】本発明におけるマクロライド系抗生物質と
しては１４員環マクロライドとしてエリスロマイシン，
または，ＹＬ−０２１０７Ｑ物質（特願平２−１４３８
０４号）等であり，また，１６員環マクロライドとして
は，ロザミシン，ピクロマイシン，ＹＳ−０２９３０Ｋ
−Ｄ，Ｅ及びＨ物質（特開昭６１−２６８１７６号）等
である。

【０００６】従って，本発明におけるマクロライド系抗
生物質生産菌としては，上記のマクロライド系抗生物質
を生産することができる菌であれば特に制限することは
なく，エリスロマイシン生産菌であるサッカロポリスポ
ラ エリスラエ（Saccharopolyspora erythrae）ＮＲＲ
Ｌ ３２７５株，ＹＬ−０２１０７Ｑ物質生産菌である
キブデロスポランギウム エスピー ＹＬ−０２１０７
Ｑ株（Kibdelosporangium sp.ＹＬ−０２１０７Ｑ），
ロザミシン生産菌であるミクロモノスポラ ロザリア
（Micromonospora rosaria）ＮＲＲＬ ３７１８株，ピ
クロマイシン生産菌であるストレプトマイセス エスピ
ー（Streptomyces sp.）ＡＰ１８３株，ＹＳ−０２９
３０Ｋ−Ｄ，Ｅ及びＨ物質生産菌であるミクロモノスポ
ラ エスピー（Micromonospora sp.）ＹＳ−０２９３
０Ｋ株等が挙げられる。

【０００７】更に，本発明におけるハンセヌラ属に属す
る酵母としては，ハンセヌラ属に属し，上記マクロライ
ド系抗生物質生産菌と混合培養することによりマクロラ
イド系抗生物質の発酵生産性を高めることができる酵母
であれば特に制限はない。その例として本発明者等が東
京都板橋区内の土壌から新たに分離したハンセヌラエス
ピー（Hansenula sp.）ＵＢ−１株を挙げることができ
る。本菌株の菌学的特徴は以下の通りである。

【０００８】１．各種培地における性状 １）ＭＹ液体培地 ２４℃で４〜７日間液体培養した。細胞は４〜７ｘ２〜
３μｍで長楕円形である。一つの細胞が単独かまたは２
つの細胞が連なる多極出芽法で増殖する。皮膜はわずか
に形成される。

【０００９】２）ＭＹ寒天培地 ２４℃で４〜７日培養後，コロニーの色調は茶白〜うす
茶色でその形状は楕円形または円形を呈する。表面は滑
らかである。仮性菌糸を形成する。 ３．子嚢胞子の形成 改良ゴロドゴワ寒天培地で，１〜４個の球形の胞子を形
成する。 ４．射出胞子の形成 ＭＹ寒天培地上では認められない。 ５．生理的性質 １．生育温度 ：５〜３２℃ 至適生育温度 ：２０〜２４℃ ２．硝酸塩の還元 ：陽性 ３．デンプンの加水分解 ：陽性 ４．脂肪の分解 ：陰性 ５．尿素の分解 ：陽性 ６．カロチノイド色素の生成 ：陰性 ７．ゼラチンの液化 ：陰性 ８．デンプン様物質の生成 ：陰性 ９．ビタミン要求性 ：陰性 １０．酸の生成 ：陰性 ４）炭素源の利用性

【００１０】

【表１】

【００１１】＋：陽性 −：陰性 ＮＴ：試験せず 上記諸性質より,本菌は子嚢菌酵母類に属し,N.J.W.Kreg
er-van Rij著「ザ・イースト・ア・タキソノミック・
スタディ（The Yeasts A Taxonomic Study,198
4）」によれば，胞子の形状，硝酸塩の同化性などか
ら，ハンセヌラ（Hansenula）属に属するものと考えら
れる。そこで上記文献に記載されている既知菌種と比較
検討を行なったが，本菌株と性状が一致するものは見い
だせなかった。従って本菌株をハンセヌラ（Hansenul
a）属の新種と認めハンセヌラ エスピー（Hansenula
sp.）ＵＢ−１と命名した。なお本菌株は工業技術院工
業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号１２６７２号として
寄託されている。

【００１２】本発明に係る酵母は，上記菌学的性状にお
ける特徴の他，マクロライド系抗生物質の発酵生産性を
高める点でも特徴づけられる。本発明に用いられる菌株
は，他の放線菌にも見られるごとく，人工的にまた自然
に変異をおこしやすいが，本発明のいうハンセヌラ エ
スピー（Hansenula sp.）ＵＢ−１株は天然から分離さ
れた酵母あるいはこれを紫外線，Ｘ線，化学薬剤などで
人工的に変異させた菌株及びそれらの自然変異株をも包
含するものである。本発明の新菌種に属する酵母は天然
の土壌より分離して取得したものであるが，前記微生物
工業技術研究所に寄託した菌株を復元することによって
容易に取得することができる。

【００１３】（製造法）本発明の製造法を実施するに当
たり，ハンセヌラ（Hansenula）属の菌株を接種し，好
気的に発育させることにより，本発明の目的微生物を生
育させることができる。栄養物としては公知のものを使
用すればよい。たとえば市販されているペプトン，肉エ
キス，コーン・スティープ・リカー，綿実粉，落花生
粉，大豆粉，酵母エキス，ＮＺ−アミン，ガゼインの水
解物，魚粉，硝酸ソーダー，硝酸アンモニュウム等の無
機または有機の窒素源，市販されている糖蜜，澱粉，デ
キストリン，蔗糖，グルコース，マルトース，フラクト
ース，キシロース，ラムノース，マンニトール，グリセ
リン等の炭水化物あるいは脂肪等の炭素源が使用でき
る。

【００１４】また金属塩として，Ｎａ，Ｋ，Ｍｇ，Ｃ
ａ，Ｚｎ，Ｆｅ等の硫酸塩，塩酸塩，硝酸塩，燐酸塩，
炭酸塩等が必要に応じて添加または，培地から除去され
る。さらに必要に応じて，バリン，ロイシン，イソロイ
シン，スレオニン，フェニルアラニン，トリプトファ
ン，メチオニン，リジン，アルギニン，システイン，シ
スチン等の他，通常知られているアミノ酸類や，オレイ
ン酸メチル，ラード油，シリコン油，界面活性剤等が適
宜使用される。これらのもの以外でも，該微生物が利用
し，発酵生産に役立つものであれば何れでも使用するこ
とができる。培養法としては，一般の好気的方法と同様
に行えばよく，その培養方法は固体培養でも液体培養で
もよい。液体培養の場合は，静置培養，撹拌培養，振盪
培養等のいずれを実施してもよいが，特に通気撹拌培養
が好ましい。また，培養温度は生産菌が発育し，本発明
の化合物を生産する温度，すなわち２０℃〜３２℃の範
囲で適宜変更出来るが，およそ２４℃〜３２℃の範囲が
好ましい。培地のｐＨは４〜９の範囲で適宜変更出来る
が，できればｐＨ５〜８が好ましい。培養時間は種々の
条件によって異なり，１０時間〜９６時間であるが，通
常２４時間〜７２時間程度でよい。

【００１５】次に二次代謝産物の生産力価向上を目的と
する微生物を各種の方法で培養する際に，上記ハンセヌ
ラ（Hansenula）属に属する酵母と当該生物を発酵培地
に加えて混合培養を行なう。栄養物としては公知のもの
を使用すればよい。たとえば市販されているペプトン，
肉エキス，コーン・スティープリカー，綿実粉，落花生
粉，大豆粉，酵母エキス，ＮＺ−アミン，カゼインの水
解物，魚粉，硝酸ソーダー，硝酸アンモニュウム等の無
機または有機の窒素源，市販されている糖蜜，澱粉，デ
キストリン，蔗糖，グルコース，マルトース，フラクト
ース，キシロース，ラムノース，マンニトール，グリセ
リン等の炭水化物あるいは脂肪等の炭素源が使用でき
る。

【００１６】また金属塩として，Ｎａ，Ｋ，Ｍｇ，Ｃ
ａ，Ｚｎ，Ｆｅ等の硫酸塩，塩酸塩，硝酸塩，燐酸塩，
炭酸塩等が必要に応じて添加または，培地から除去され
る。さらに必要に応じて，バリン，ロイシン，イソロイ
シン，スレオニン，フェニルアラニン，トリプトファ
ン，メチオニン，リジン，アルギニン，システイン，シ
スチン等の他，通常知られているアミノ酸類や，オレイ
ン酸メチル，ラード油，シリコン油，界面活性剤等が適
宜使用される。これらのもの以外でも，該微生物が利用
し，発酵生産に役立つものであれば何れでも使用するこ
とができる。

【００１７】培養法としては，一般に好気的方法と同様
に行えばよく，その培養方法は固体培養でも液体培養で
もよい。液体培養の場合は静置培養，撹拌培養，振盪培
養等のいずれを実施してもよいが，特に通気撹拌培養が
好ましい。また，培養温度は生産菌が発育し，本発明の
化合物を生産する温度，すなわち２０℃〜３２℃の範囲
で適宜変更出来るが，およそ２４〜３２℃の範囲が好ま
しい。培地のｐＨは４〜９の範囲で適宜変更できるが，
できればｐＨ５〜８が好ましい。培養時間は種々の条件
によって異なり，１０時間〜１９２時間であるが，通常
９６時間〜１６８時間程度で培養物に蓄積される目的化
合物が最高力価に達する。

【００１８】培養物から目的とする化合物を採取するに
は，微生物の生産する代謝産物に用いる通常の抽出，分
離，精製の手段が適宜利用される。培養物中の目的化合
物は培養物をそのままか，又は遠心分離あるいは培養物
に濾過助剤を加え濾過して得られた培養濾液に，酢酸エ
チル，クロロホルム，ベンゼン，トルエン等の水と混和
しない有機溶媒を加えて抽出する。また培養濾液を適宜
の担体に接触させ，濾液中の目的化合物を吸着させ，次
いで適当な溶媒で溶出することにより目的化合物を抽出
することができる。酢酸エチル，クロロホルム等の有機
溶媒で摘出する場合には培養濾液にこれらの溶媒を加
え，よく振盪し，目的化合物を抽出する。

【００１９】つぎに上記の各操作法を用いて得られた目
的化合物含有画分は例えば，シリカゲル等を担体に用い
たカラムクロマトグラフィーや，シリカゲル系ＯＤＳ逆
相担体のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等
の常法により，更に純粋に分離精製することができる。

【００２０】

【実施例】

実施例 １ ハンセヌラ（Hansenula）エスピーＵＢ−１株をサブロ
ー寒天培養地（ディフコ社製）に育成させ，その菌体を
エーゼでかきとりサブロー液体培地（ディフコ社製）に
接種する。２８℃で３日間振とう培養する。前述で得ら
れた酵母種培養液を以下の混合培養に用いる。混合培養
の対象とするマクロライド生産菌として，ミクロモノス
ポラ エスピーＹＳ−０２９３０Ｋ株（特開昭６１−２
６８１７６号）を用いる。マクロライド生産菌の種培養
培地として，ＤＳＹ培地（デキストリン５．０％，エス
サンミート（味の素（株）製）３．０％，酵母エキス
０．５％，リン酸水素二カリウム０．１％，硫酸マグネ
シウム・７水塩０．１％，滅菌前ｐＨ８．０）を作製
し，これを５００ｍｌ三角フラスコに３０ｍｌずつ分注
し，１２０℃で２０分間滅菌したものに，あらかじめ寒
天培地に生育させた上記菌株の菌糸をかきとり，接種
し，２８℃で７２時間振盪培養を行い種培養液とする。
つぎにコーンスターチ１０．０％，ドライ・イースト
（オリエンタル社製）２．０％，硫酸マグネシウム・７
水塩０．２％，塩化コバルト・６水塩０．００１％，炭
酸カルシウム０．１５％（滅菌前ｐＨ６．０〜６．５）
を含む培地を５００ｍｌの三角フラスコに３０ｍｌずつ
分注し，１２０℃，２０分滅菌した後，上記生産菌の種
培養液と酵母種培養液をそれぞれ，４％および５％にな
るように接種し，２８℃で１６８時間培養する。

【００２１】このようにして培養した培養液を３０００
ｒｐｍで１０分間遠心して遠心上清を得る。得られた遠
心上清液１．５ｍｌに１．５ｍｌの炭酸水素ナトリウム
液を加えてｐＨ８．５に調整した後，３ｍｌの酢酸エチ
ルを加えてよく撹拌する。酢酸エチル層を分離して，こ
れに無水硫酸ナトリウムを加えて脱水する。次に無水硫
酸ナトリウムをろ別した後，２ｍｌの酢酸エチル層を取
り，０．１Ｍ燐酸バッファー（ｐＨ３．２）１ｍｌを加
えてよく撹拌し，水層をＨＰＬＣ法で生産力価を調べ
る。同じ試料を検定菌としてバチルス スブチリス Ａ
ＴＣＣ６６３を用い，ペーパーディスク法で同時に検定
する。結果を表２及び表３に示した。

【００２２】

【表２】

【００２３】 ハンセヌラ エスピーＵＢ−１株無添
加培養， ハンセヌラ エスピーＵＢ−１株との混合
培養

【００２４】

【表３】

【００２５】ハンセヌラ エスピーＵＢ−１株無添加
培養 ハンセヌラ エスピーＵＢ−１株との混合培養

【００２６】実施例 ２ ハンセヌラ（Hansenula）属に属する酵母の種培養培地
の調製及びその種培養液の作成法は実施例１と全く同様
の方法で行った。混合培養の対象とする二次代謝産物生
産菌としてエリスロマイシン生産菌：Saccharopolyspor
a erythreaeＮＲＲＬ，３２７５ロザミシン生産菌：Mi
cromonospora rosaria ＮＲＲＬ ３７１８，ピクロマ
イシン生産菌：Streptomyces sp.ＡＰ−１８３及びＹ
Ｌ−０２１０７Ｑ物質生産菌：キグデロスポランギウム
エスピー ＹＬ−０２１０７Ｑ株を用いた。

【００２７】種培養液としてデキストリン２．０％，グ
ルコース ０．５％，ポリペプトン０．５％，酵母エキ
ス ０．５％，ブレインハート・インフヒュージョンブ
イヨン（栄研化学）０．５２％，コーン・スチープ・リ
カー０．５％，肉エキス０．３％，炭酸カルシウム
０．２％を含む培地（ｐＨ８．０）を作製し，これを５
００ｍｌ三角フラスコに６０ｍｌずつ分注し，１２０℃
で２０分間滅菌したものにベネット寒天培地にあらかじ
め生育させた上記菌株の菌糸をかきとり接種し，２８℃
で７２時間振盪培養を行い種培養液とする。

【００２８】つぎにポテトスターチ ３．０％，大豆粉
１．５％，コーン・スチープ・リカー ０．５％，酵
母エキス ０．２％，硫酸マグネシウム・７水塩 ０．
００２％，アデカノール（旭電化製）０．０３％を加え
た培地（ｐＨ７．１）を含む培地を５００ｍｌの三角フ
ラスコに６０ｍｌずつ分注し，１２０℃，２０分滅菌し
た後，上記種培養液４％と実施例１と同様にして得られ
た酵母培養液５％を接種し，１６８時間，２８℃で培養
する。実施例１に示したのと同じ方法で培養液を処理
し，それぞれの目的物質の生産性を，バチルス・ズブチ
リスＡＴＣＣ６６３３株に対する抗菌活性を指標に検定
する。培養結果の例を表４に示す。

【００２９】

【表４】

【００３０】 ハンセヌラ エスピーＵＢ−１株無添
加培養， ハンセヌラ エスピーＵＢ−１株との混合培養

【００３１】

【発明の効果】本発明によれば，マクライド系抗生物質
菌とハンセヌラ属に属する酵母とを混合発酵することに
より，マクロライド系抗生物質の生産性を顕著に向上さ
せることができる。また，マクロライド系抗生物質であ
れば１４員環，１６員環といった非糖部の環の大きさに
かかわりなく生産性を向上させることができる点，及び
その生産菌の種類の如何にかかわらず，生産性を向上さ
せることができる点で顕著な効果を有するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 17/08 Ｃ１２Ｒ 1:01 1:78） (Ｃ１２Ｐ 17/08 Ｃ１２Ｒ 1:465 1:78） (Ｃ１２Ｐ 17/08 Ｃ１２Ｒ 1:29 1:78） (72)発明者 佐々木 敏夫 埼玉県浦和市文蔵５−22−12−504 (72)発明者 上桐 和麿 東京都板橋区蓮根３−16−１ 山之内製薬 株式会社蓮根寮 (72)発明者 今井 美光 東京都大田区田園調布３−21−12 (72)発明者 鈴木 賢一 埼玉県北本市二ッ家１−67 (72)発明者 森岡 幹夫 埼玉県新座市あたご３−12−１

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マクロライド系抗生物質生産菌とハンセ
   ヌラ（Hansenula）属に属する酵母とを混合培養するこ
   とを特徴とするマクロライド系抗生物質の製造法
2. 【請求項２】 ハンセヌラ（Hansenula）属に属する酵
   母がハンセヌラ エスピー（Hansenula sp.）ＵＢ−１
   株（微工研菌寄第１２６７２号）である請求項１記載の
   製造法
3. 【請求項３】 マクロライド系抗生物質が１４員環マク
   ロライド又は１６員環マクロライドである請求項１記載
   の製造法
4. 【請求項４】 マクロライド系抗生物質の増産能力を有
   するハンセヌラ エスピー（Hansenula sp.）ＵＢ−１
   株（微工研菌寄第１２６７２号）。