DE2101345A1

DE2101345A1 - Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C

Info

Publication number: DE2101345A1
Application number: DE19712101345
Authority: DE
Inventors: Hans Jörg Dr Buus Nuesch Jakob Dr Riehen Treichler, (Schweiz)
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1970-01-21
Filing date: 1971-01-13
Publication date: 1971-07-29
Also published as: US3776815A; FR2081445B1; GB1335264A; NL7100776A; CH553850A; FR2081445A1

Description

GIBA-GEIGY AG, BASEL (SCHWEIZ)

DEUTSCHLAND

Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cephalosporin-C· Bekanntlich wird Cephalosporin C neben weiteren Antibiotika (ohne Cephaloüporin-Kern : Cephalosporin N, Cephalosporine P] durch Fermentation von Pilzen der Gattungen' Emericellopsis-Cephaloöporiurn wie den Brot zu-Starrun I.M.I. -'1-9137 (A,T.C.C. II55O ) und Mutanten hiervon, z.B. die Clevedon Mutante 8650

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(A.T.CC14533 ) erhalten, vgl. z.B. die U.S.-Patente 2,831,797 und 3*396,083. Es ist auch bekannt, dass die fermentative Ausbeute an Cephalosporin C immer noch unbefriedigend ist, obwohl unfangreiche Untersuchungen im Hinblick auf eine Steigerung der Cephalosporin C-Produktion durchgeführt wurden, vgl. E. van Heyningen "Cephalosporins" in Advances in Drug Research, Vol. 4, S. 9 (Academic Press, London and New York, 1967)· So wurde z.B. vorgeschlagen, dem Nährrnediurn bei der Züchtung von Cephalosporium I.M.I. 49137 eine geringe Menge (θ,025 bis 0,05 Gew.$) Methionin zuzusetzen, urn die Cephalosporin N-Produktion zu erhöhen (s. Miller et al., U.S.-Patent 2,831,797; Kavanagh et al., Arch. Bioehem. Biophys. ££, 268 (1958)). Oberhalb dieser Kethionin-Konzentration wurde keine Ausbeutesteigerung mehr erzielt. Deinain und Newkirk (Appl. Microbiol. 10, 321 (1962)), Ott et al., (Appl. Microbiol. 10, 515 (1962)), Caltrider und Niss (Appl. Microbiol. lAj 746 (1966)) und andere untersuchten die Produktion von Cephalosporin C durch die Mutante 8650 bei Zusatz von D-Methionin, D,L-Methicnin, L-Mothionin und verschiedenen anderen schwefelhaltigen und nicht schwefelhaltigen Verbindungen, zum Beispiel Cystein, Cystin, S-Aethylcystein, Hornocystein, Honiocystin, Cyytathionin, N-Acetyl-Methionin, α-Methyl-methionin, Aethionln, Thioglycolsäure,

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Taurin, 6-I>iorcaptopurin oder Serin, sum Fermentations medium, fanden aber aussei' Methionin-sulfoxid und S-Methylcystein keine Substanz, die annähernd gleich produktionssteigernd wirkte vjie Methionin. Für Methionin selbst wurde (ebenso wie für andere wirksame Verbindungen) eine maximale- Konzentration festgestellt, oberhalb derer die Cephalosporin C-Produktion nicht mehr zu, sondern wieder abnahm (nach Demain und Newkirk ca. 0,3 bis 1 G-ev;.^). Als maximal erreichbare Ausbeuteerhöhung durch Methioriinxu- · sat?: wird e:lne Erhöhung auf das etwa ¹I- bis 7-fache der ohne Methionin erzielten Ausbeute an Cephalosporin C erreicht. Dies ist aber noch unbefriedigend, insbesondere auch deshalb, v.'eil die Ausbeute starken Schwankungen unterliegt und das Maximum bei Ausführung der Fermentation im technischen Masstab oft nicht erreicht wird.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass

man die Cephalosporin-Produktion wesentlich verbessern kann, wenn man xur Züchtung Mutanten verwendet, bei denen der Stoffwechsel und/oder die Biosynthese organischer Schwefelverbindungen, welche zum Aufbau des Cephalosporin-Kernes gebraucht werden, Insbesondere des Methionine, gestört sind.

Man kann auf diese Weise die unter Methioninzusatz · erhältliche Ausbeute noch um. ein Vielfaches erhöhen und ausserdem auch die starken AusbeuteSchwankungen verhindern. Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur fermentative Herstellung von Cephalosporin C in einen· organische SchweL'elverLjnducgerj en 1ha] te η do n iiähr-rceüiu;;;, dachten

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BAD ORIGINAL

gekennzeichnet, dass man Mutanten -züchtet, bei denen der Stoffwechsel und/oder die Biosynthese organischer Schwefelverbindungen gestört sind.

Aufgrund von Versuchen mit radioaktiv niar-

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kierten "Verbindungen, z.B. S^ -Methionin, C -Serin u.a. kann man annehmen, dass bei der Fermentation mit Stämmen der Gattungen Einerice-llopsis-Cephalosporium, z.B. dem oben erwähnten Stamm 865O, die primäre schwefelliefernde Substanz für die Biosynthese des Cephalosporins C das Methionin ist, dass dieses durch Demethylierung -in Homocystein übergeht, welches mit Serin zu Cystathionin kondensiert wird; dieses wird in Cystein, α-Ketobuttersäure und Ammoniak gespalten und das so gebildente Cystein zum Aufbau des Cephalosporin-Kernes benützt (vgl. Caltrider und Niss., I.e.). Die schwefelhaltige Prlrnärsubstanz, das Methionin, kann von den genannten Stämmen unter Verwendung von anorganischem Schwefel aufgebaut werden, braucht also im Mährrnediurn nicht vorhanden zu sein, ebensowenig andere organische Schwefelverbindungen: die Stämme sind ' in ihrem V/ach rs turn unabhängig vom Methionin oder anderen organischen Sehwefe!verbindungen, sie sind "prototroph" in bezug auf diese Verbindungen.

Im Gegensatz dazu sind die Mutanten gemäss der Erfindung zu ihrem V/achsturn darauf angewiesen, dass ihnen organische schwefelhaltige Verbindungen, z.B. Methionin

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(D, L; D oder L) oder dessen SuIfoxid oder SuIfon, Cystein(D,L; D oder L), Cystin(D,L; D oder L), Homocystein(D,L; D oder L), Homocystin(D,L; D oder L), Cystathionln(alle Isomeren, z.B. DjL-allo-Cystathionin), und oder S-methyl-cystein(D,L; D oder L) von aussen zur Verfügung gestellt werden, sie sind "auxotroph" (wachstumsabhängig) in bezug auf organische Schwefelverbindungen. Der Einfachheit halber bezeichnen viir im folgenden die erfindungsgemässen Mutanten als Q

"Methionin-auxotroph"; dieser Ausdruck schliesst also die" Äuxötrophie in bezug auf andere organische Schwefelverbindungen ein. .

Bei der Fermentation der Methionin-auxotrophen Mutanten wird der für das Wachstum und die Cephalosporin C-Produktion erforderliche Schwefel dem Nährmedium in Form organischer Schwefelverbindungen, z.B. die oben genannten, vor allem Methionin, zugesetzt. Was die Konzentration dieser j Verbindungen im Nährmedium anbetrifft, hat sich gezeigt, dass im Gegensatz zu den bisher verwendeten Stämmen bei den reuen Mutanten keine obere Konzentrationsgrenze besteht.» bei deren Ueberschreiten die zugesetzten organischen Schwefelverbindungen, ζ-«Β'« Methionin, auf Wachstum oder Cephalosporin C-Produktion hemmend wirken. Man kann diese Verbindungen daher in so hohen Konzentrationen, wie sie durch das erhöhte Wachstum und die erhöhte Produktion erforderlich sind, anwenden. Die organischen Schwefelverbindungen sind nicht limitierender Faktor des Nährmediums»

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Tabelle 1 zeigt, wie sich das Niehtvorhandensein bzw, die Anwesenheit verschiedener Methionin-Konzentrationen in einem synthetischen Medium, das keine anderen organischen Schwefelverbindungen enthält, auf das Wachstum des -Basisstammes 865O und der daraus erhaltenen Methioninauxotrophen Mutante 8650/A auswirken.

Das Wachstum wurde in einem Agardiffusionstest, bei dem dem Pilz ein keine organischen Schwefelverbindungen enthaltendes festes Minimalrnedium (Mährmedium II, s.u.) und, mittels einzelner aufgelegter B'ilterrondellen, die zu prüfenden schwefelhaltigen Lösungen zur Verfügung gestellt werden (Auxanogramm), bestimmt: auf Minimalagar in einer Petrischale streicht man 0,1 ml Mycelsuspension aus, inkubiert 2h Stunden bei 23 C und legt dann Filterrondellen (Whatman Antibiotic discs 6mm 0 ) die in der Testlösung (0$, 1%, 2,5& 5%) Methionin getränkt und dann getrocknet sind, auf die Platte. Dann inkubiert man 7 Tage bei 23 C. Der Basisstamrn wächst gut ganz ohne Methionin; bei Zusatz von unter 1% Methionin wird das Wachstum verbessert; mit zunehmender Methioninkonzentration zeigt sich immer stärkere Hemmung um die Filterrondelle. Die Mutante wächst ohne Methioninzusatz überhaupt nicht; mit zunehmender Methioninkonzentration tritt immer stärkeres ■Wachstum, ohne irgendeine Hemmung auf.

Tabelle 2 zeigt* wie sich das Nichtvor-handenKein bzw. die Anwesenheit verschiedener Methionin-Konzentrationcn in

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einem synthetischen Nährmed ium,- das keine anderen organischen Schwefelverbindungen enthält, auf die Produktion von Cephalosporin C durch den Basisstainm 865O und die Mutante 865O/A " auswirken.

Die Stämme wurden in der üblichen Weise unter Schütteln in Erlenineyorkolben in dem keine organischen Schwefelverbindungen enthaltenden flüssigen synthetischen Grundmedium (Nährmedium III,s.u. ) oder in mit verschiedenen Konzentrationen j an Methionin versetztem synthetischem Grundmedium während 7 Tagen gezüchtet (vgl. Beispiel l), Experimente a) bis e)). Nach 96,120^144 und I68 Stunden wurden Proben entnommen,, um die Cephalosporin C-Ausbeute zu bestimmen. Die maximalen Ausbeuten bei den Methioninkonzentrationen 0$, 0,1$, 0,2Jo, 0,4$ und 0,8$ im synthetischen Medium sind in der Tabelle angegeben. Man sieht, dass der Basisstamm auch ohne Methionin gut produziert, die Produktion bei 0,2 bis 0,4$ Methionin ein Maximum erreicht und dann wieder abnimmt, so dass bei 0,8$ Methionin unter 70$ m des Maximums produziert werden. Die Mutante wächst ohne Methionin nicht und produziert daher auch nicht. Schon bei geringer Methioninkonzentration (0,1$) ist die Produktion wesentlich höher als beim Basisstamm im gleichen Nährmediurrij und bei. einer Konzentration von 0,8$ Methionin wird das 5- bis 6-fache des mit dem Basisstamm produzierten Maximums erzielt.

Die Cephalosporin C-Ausbeute wurde im Agardiffusions -

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test gegenüber dem .Stamm Alealigenes Faecalis ATCC No. 875O nach dem von Claridge und Johnson (2.Interscienee Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Chicago, 1962) beschriebenen Verfahren bestimmt. Der Teststamm wurde noch besonders im Hinblick auf Resistenz gegenüber Cephalosporin P und N selektioniert. Dadurch ist seine Empfindlichkeit gegenüber Cephalosporin C soviel grosser, dass es nicht nötig ist, die genannten anderen Antibiotika vor der Messung zu entfernen. Zwecks Bestimmung des Cephalosporin C-Gehaltes werden Proben der Fermentationsbrühe vom Myeel befreit und mit 0,1-molarem Phosphatpuffer vom pH 7 so verdünnt, dass der Cephalosporin C-Gehalt der Lösung ca. 20 - 100 γ/ml beträgt.

Zum qualitatativen Nachweis von Cephalosporin C (neben P und N) in der Kulturlösung ist ein Bioautograrnm mit Neisseria catharalis ( ζ'.B. Stamm ETH 4l63) geeignet. Das Papierchromatogramm wird auf Whatman Nr. 1-Papier im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (11:3J11) ausgeführt. Die Laufzeit beträgt bei 2h C 8-10 Stunden. Zur Kontrolle werden entsprechende Cephalosporin-Standardpräparate rnitgeführt.

Die Züchtung der Methionin-auxotrophen Mutanten wird in der für die Züchtung von Stämmen der Gattungen Ernericellopsis-Cephalosporium üblichen Weise in Schüttelkolben oder den in der Antibiotikaproduktion üblichen Fermentern vorgenommen.

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Die Herstellung der Methionin-auxotrophen Mutanten erfolgt nach den für die Gewinnung von Mutanten bekannten Methoden,

So können zur Mutationsauslösung Strahlen wie Röntgen- oder ultraviolette Strahlen oder chemische Agentien verwendet werden. Bekannte chemische Mutagene sind z.B. alkylierende Agentien wie Diäthylsulfat., Aethylmethansulfonät, Aethylathansulfonat, oder Analoge von Nucleotidbasen wie 5-Bromuracil oder 2-Aminopurin, oder j|

Verbindungen, Vielehe die Nucleotidbasen chemisch verändern, wie Hydroxylamin, salpetrige Säure oder 1 -Methyl -3-nitro-I- nitroso guanidin oder ^lbindungen, die einen Ausfall oder einen zusätzlichen Einschub einer oder mdirer Nucleotidbasen bewirken^ z.B. Acridine wie Proflavin. Die mutationsauslösenden Strahlen oder chemischen Agentien werden zur Einwirkung auf Konldien des Pilzstamrnes gebracht. Die Einwirkungszeit wird so bemessen, dass die Zahl der Mutanten möglichst gross ist,; bei einer solchen Einwirkungsdauer werden die meisten Konidien (ca. 90 - 99 $) abgetötet. ™ Pig. 1 zeigt die Einwirkung eines Mutagens, des 1- Methyl - 3-rritro-lnitrosoguanidins auf den oben erwähnten Cephalosporium-Stamm 865O. Auf der Abszisse ist die Einviirkungszeit· (in Minuten) aufgetragen, auf der Ordinate links die Zahl der überlebenden Konidien in % (-]-) und auf der Ordinate rechts die Zahl der auxotrophen Mutanten in $0 (·*φ>)· Man sieht, dass bei einer Einwirkungszeit von 20 Minuten ein Maximum von Mutationen erreicht wird. Die Isolierung der für das erfindurigs-

gemässe Verfahren benötigten Mutanten wird vorzugsweise

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aus Proben mit maximaler Mutationsrate vorgenommen. Man verwendet zweckmässig nicht die nmtagen behandelten Konidien selber, sondern die Konidien der daraus erhältlichen Toch-' *' terkultur.

Zur Isolierung der Mutanten kann man wie folgt vorgehen:
1. Die auxotrophe Mutanten enthaltende Konidienprobe wird auf ein festes "Vollmedium" ausgesät, d.h. auf ein Nährmedium, das auch die für Methionin-auxotrophe Mutanten erforderlichen organischen Schwefelverbindungen enthält. Die lebensfähigen unveränderten und mutierten Konidien wachsen auf dem Nährboden, z.B. einer Agarplatte, und bilden (getrennte) Kolonien. Mit Hilfe der "Stempeltechnik" wird ein Abbild dieser Platte auf ein "Minirnalmedium" übertragen., d.h. auf ein Nährmediurn., das die für Methionin-auxotrophe Mutanten erforderlichen zusätzlichen organischen Schwefelverbindungen nicht enthält. Auf diesem Minimalmediurn wachsen die methionin-auxotrophen Mutanten nicht. Durch Vergleich mit dem Vollmedium (master plate) erkennt man auf diesem die Kolonien von methionin-auxotrophen Mutanten und kann sie abtrennen.

Da durch die Mutationen verschiedene auxotrophe Mutanten gebildet werden können und die gewünschten MethioninauxGtropheri in sehr geringer Zahl vorkommen, ist eine entsprochende Anzahl von Versuchen mit Minirnalinedien erforderlich,, um die gewünschten Mutanten zu isolieren. Im

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Durchschnitt findet man auf 10 000 überlebende Konidien höchstens 1 bis 2 auxotrophe Mutanten. 2. Bei einem anderen Verfahren werden zunächst die auxotrophen Mutanten durch . Abtrennung von den überlebenden prototz'ophen Organismen angereichert. Zu diesem Zweck wird eine mutagen behandelte Konidienprobe Bedingungen ausgesetzt., unter denen nur die überlebenden prototrophen Organismen, nicht aber die auxotrophen Mutanten wachsen; die wachsenden Organismen werden dann entweder mechanisch oder auf chemischem Wege eliminiert.

a) Als Beispiel für die mechanische Eliminierung ist die sog. Konzentrierungsmethode nach N.-Fries (Nature 159* 199 (19^7)) und die Filtration enrichment technique of Woodward, De Zaun and Srb, Proc. Nat. Acad. Sei. 40_, I92 (195²I-) zu nennen. Sie beruht auf der Eliminierung der prototrophen, in einem flüssigen Minimalmedium wachsenden Organismen durch wiederholte Filtration. In dem flüssigen Miniinalmediurn keimen nur Jj die protctrophen Organismen der mutagen behandelten Konidienprobe, Bei Filtration durch ein steriles Glasvatte filter werden die aiisgekeimten, mit Hyphen versehenen Konidien auf dem Filter zurückgehalten, während die auxotrophen Konidien ins Filtrat gelangen. Nach mehrmaliger Wiederholung der Keimung und Filtration sind die auxotrophen Konidien im Filtrat angereichert. Jetzt wird das .Filtrat auf festes Minimalmedium, dem organische Schwefelverbindungen (z.B. Methionin) zugesetzt sind, verteilt, um die Methionin-auxotrophen Mu-

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tanten zum Wachsen zu bringen.' Ausser diesen wachsen auf dem Nährboden die durch Filtration nicht eliminierten prototrophen Organismen. Die Abtrennung der gewünschten Mutanten erfolgt wie unter 1.) beschrieben. Im Durchschnitt findet man eine methionin-auxotrophe Mutante auf 10 000 bis 100 wachsende Konidien. Der Anreicherungsfaktor beträgt ca. 5 - 6.

b) Zur selektiven chemischen Abtötung wachsender prototropher Pilze kann man sich antifungischer, die ruhenden Sporen nicht angreifender Antibiotika oder Stoffwechselinhibitoren, z.B. Amphothericin B oder 2-Desoxyglueose, bedienen. ·

3) Eine Abwandlung.der Methode 2) ist die sog. Doppelmutantenmethode , (Mitchell, Proc. Uat.Acad. Sei. "^Sj 115 (195C}> Lester and Gross/ Science 129, 572 (1959)).Sie beruht auf der Beobachtung., dass es einfach-auxotrophe Mutanten gibt, die auf Minimalmedium noch eine gewisse Stoffwechseltätigkeit ausüben und dadurch rasch absterben, während entsprechende durch die mutagene Behandlung neu induzierte doppelt-auxotrophe Mutanten auf dem Minimalmedium ganz inaktiv sind und daher lebensfähig bleiben. Man kann beispielsweise Konidien einer Inositol-—auxotrophen Mutante eines Cephalosporium-Stammes mutagen behandeln und auf ein Inositol-freies Minimalmcdiurn aussäen. Auf diesem Medium stirbt der grösste Teil der Inositol -auxotrophen Einfachmutanten ab, während die gesuchten neu Induzierten Doppelmutanten nicht geschädigt werden. Nach einer te-

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stimmten Inkubationszeit, während der erfahrungsgemäss die meisten Einfachmutanten zugrundegegangen sind., wird die Kultur mit einer die für die auxotrophen Mutanten nötigen Nährstoffe enthaltenden Lösung unterschichtet., um die no<2h lebensfähigen Einfach- und Doppelmutanten zum Wachstum zu bringen. Die Trennung erfolgt z.B. nach dem unter l) beschriebenen Verfahren. Im Durchschnitt findet

man eine Methionin-auxotrophe Mutante auf 3 000 bis 20 000 ^ wachsende Konidien. Wenn erwünscht., kann man aus den Doppelmutanten durch Spontanrückmutation gebildete Methion-auxotrophe Einfachmutanten isolieren, z.B. durch Kultivierung auf einem inositolfreien, methioninhaltigen Minimalmedium, auf dem nur die Methionin-auxotrophe Einfachmutanten wachsen.

Mittels der unter 2) und 3) beschriebenen Methoden kann man auch spontan, also ohne Anwendung mutagener Mittel, entstandene auxotrophe Mutanten anreichern j und isolieren.

Um unter den verschiedenen auxotrophen Mutanten die gewünschten Methionin-auxotrophen zu erkennen, bedient man sich der oben beschriebenen Auxanographie durch Züchtung der Mutante auf einem festen Minimalmedium unter Auflegen von Fil.terrondellen, die mit einer für das Wachstum dieser Mutante nötigen organischen Schwefelverbindung getränkt sind. Die gesuchten Mutanten zeigen um die Filterrondelle herum Wachstum. _; Die Erfindung wird in dem nachfolgenden Beispiel

beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

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Die folgenden Nährniedien v.'erden vervjendet: Nälirrnedium I (Nährlösung Nl 48)

Cornsteep dry 23,5 g

Saccharose 20,0 g

Ammoniumacetat 4,5 g

Le itungsw asser ad 1000 rnl

pH vor der Sterilisation 7,3

pH nach der Sterilisation 6,8 - 7,0

Sterilisation : im Autoklaven bei 120 C, 1,2 atü, 20 Min.

Nährmedium II (Minimalagar)

Saccharose	15 g
Glucose	2,5 g
Natriumnitrat	5,0 g
K₂HPO₄	3 g
Mg SO₄-TH₂O	0,2 g"
Pe SO₄-THpO	0,05 g
KCl	0,5 g
I) Spurenelementlösung '	2 ml
Baeto-Agar	25 g
Dest. V/asser	ad 1000 ml
pH vor der Sterilisation	7,3
pH nach der Sterilisation	7,0

Sterilisation im Autoklaven : 20 Min., 120°C , 1,2 atü.

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1) Spurene 1 eihent 1 ösung

Fe SO₄. 7H₂O 1,Og

Cu SO₄. SH₂O 0,15 g

Zn SO₄. 7H₂O 1,Og

Fin SO₄. 4H₂O 0,1 g

K₂Mo O₄.2H₂O 0,1 g

Die einzelnen Komponenten in etwas Aqua dest. lösen,

dann auf 1 Liter auffüllen.

Nährmedium III (Synthetisches Grundrnedium C 3)

(NH₄)₂ SO₄ 2,5 g

KNO₃ - - 5,0 g

Mg SO₄.7H₂O 0,2 g

KH₂PO₄ 0,2 g

Ca CO^ 5,0 g

Spureiielernentlösung * s.o. 10 ml

Maltose 40,0 g

Kethyloleat 7*0 g

iySeso-Irtosit . 2,0 g

H₂O dest. ad 1000 ml

pH vor der Sterilisation 7,3

pH nach der Sterilisation 7,0+0,2

.Sterilisation : im Autoklaven, 20 Min., 120°C, 1,2 atü.

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Nährmediurn IV (Komplexes Vollmedium C..)

a) Hefeextrakt	4,0	g
b) Glucose	10, 0	ε
b) NaCl	1,0	g
b) PeSO₄.(7H₂O)	0,1	g
b) MgSO₄.(7H₂O)	0,1	g
b) Methionin (DL)	0,1	g
b) Cystein (DL)	1,0	g
b) Lysin (L)	0,5	g
b) a-Äminoadipinsäure	(lösen in Na-Biearbonat) 0,1	g
b) Valin (DL)	1,0	g
b) Caüamino acids	1,0	g
a) Agar	25,Og
Leitungswasser	ad lÖÖO ml

pH nach Sterilisation : 7*0 £

a) mit H₂O dest. auf 8θΟ ml,

b) auf 200 ml auffüllen

a) 20 Minuten sterilisieren/

b) in G5~Pilter sterilisieren;

a) + b) im Wasserbad bei 50 C mischen.

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tfahrmediunt V (Nährlösung Kl 48 + 3)

Cornsteep ύτγ 23,5 R

Methionin (DL) - 1 S

Cystein (L) 1 β

Homocystein (L) 100

Gystatnionin (L) ^00

Serin (L) 100 mg

Homoserin (L) 100 mg

L^itimgsvmsser ad 1 ad 1000 isl

pH von Sterilisation 7#5

Sterilisation t ISO⁰C 1,2 atü, 20 Min.

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Beispiel 1 t

In einem $ÖQ «i-Erlenmeyerkolteen »it k W«ehern, d*r 10· »1 Nährmcdiuw I enthält, wird dle«e nährlösung wit einer Sporensuspension von Mutante 86$Q/ä beimpf t xmd kB Stunden auf einer rotierenden Sehüttelmasehine mit 250 upm, Amplitude 50 fiffli/ bei 23° inkubiert. Dann werden 5 -pi äiirser 1, V#rkuXt.ur in einen zweiten gleichen 500 »1-Erlenmeyericolben mit 100 ml der gleichen Nährlösung überimpft und wie vorher 48 Stunden Inkubißrt. Hit je 5 ml- ^{v :;}-ilieser »weiten Vorkultur beimpft-man die H*öptkulturlösungen, die sich, in 500 ffil-Erlenmeyerkolben mit einem Strörnüngsbreeher und 3~S^|C*¹i^<5h.ten-Watteverschluss befinden. Die H*»ptkuiturlösungen bestehen aus ;

*) 80 ml -'ffährfflodtiua III "(synthetisches Örundmediuw C 3);

b) 80 i»l fiährmediu» III mit Zusatz von 1 gaiter D,L

c) 8a ml NShrmedlu» III mit Zusatz von 2 g/Liter D, L- ä) 80 »1 Nührmedlu* III mit Zusatz von * g^Liter ß,!»- ♦ > 80 ni VUhrmedlxm III mit Zusatz von B g^ifcer ©,L

Pie Inkubation dtr Hauptkulturen erfolgt auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 250 upm bei 23° während J Tagen (168 Std.}* Vom #. Tag an werden täglich Proben zur Aktiv!täts^ bestimmung entnommen. .

In der Kulturlösung a) ist kein Wachstum festzustellen. In der Tabelle 2, äucsernte reehte Spalte sind»

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. _ig.

die maximalen Ausbeuten an Cephalosporin C in γ/ml für die Kulturen a) bis e) angegeben (Durchschnittswerte von je 5 Versuchen).

In gleicher Weise wie für die Methionin-auxotrophe Mutante 865Q/A angegeben wird der Basisstamm 8650 gezüchtet. Er wächst gut in der Methionin-freieft Kulturlösung a).

In der Tabelle 2 ist auch für diesen Stamm die ^

maximale Ausbeute an Cephalosporin C (Durchschnittswerte.: aus je 5 Versuchen) für die Kulturen a) bis e) angegeben.

Die Tabelle 2 zeigt, dass die Ausbeute an Cephalosporin C bei der Methionin-auxötrophen Mutante 8650/A bei einem Methioninzusatz von 4 bis 8 g/l ca. 5 mal grosser als beim Bäsisstamm bei optimalem Methioninzusatz (2 g/l)

XSt. ' : "■: ■ ■■■■.'■■-■ ;■", - ', . ■", ;

Die obige Mutante vmrcle wie f©lgt hergestellt: _ \' Man verwendet zur mutagenen Behandlung, eine irisclie Koni dien- ' ■·■ suspension mit einem Titer von 10"■ '/ml. Diese erhält man wie folgt:

Man lässt eine wie oben erhaltene 2. Vorkultür solange wachsen, bis Konidien auftreten (je nach-Stamm"zwischen

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72 und 120 Stunden), filtriert dann die Kulturbrühe durch Glaswatte, wobei das Mycel in der Glaswatte zurückgehalten wird, während, die Konidien ins FiItrat gelangen, zentrifugiert das Piltrat, dekantiert und suspendiert das Konidien-Sedirnent in 0,2-m. Phosphatpuffer vom pH 7*2. Zentrifugieren und Suspendieren in Phosphatpuffer werden noch zweimal wiederholt. In der erhaltenen Pufferlösung wird die Konidlenkonzentration mit Hilfe einer Zählkammer bestimmt und auf 10 '/ml eingestellt.

Man versetzt 'j>6 ml der Konidiensuspension mit K ml einer frisch bereiteten l$igen (Gew./Vol) Lösung von 1-Methyl~3-nitro-l-nitrosoguanidin in DirnethyDformamid-Wasser (1:10). Die Behandlung wird bei 27° durchgeführt. Wie Fig. zeigt, wird die maximale Mutationsrate nach 20 Minuten erreicht (105 Mutanten auf 20 000 überlebende Konidien = 0,5#. Zur Isolierung der Methionin-auxotrophen Mutanten verwendet man die Tochtergeneration der mutagen behandelten Konidien. 2 ml der wie oben vom Mutagen befreiten, gewaschenen und in Phosphatpuffer aufgenommenen mutagen behandelten Konidienprobe werden im Nährmedium VI (Nährlösung Nl 48 + S) unter den gleichen Bedingungen wie für die zweite Vorkultur beschrieben inkubiert. Wenn sich reichlich Konidien gebildet haben (72 bis 120 Stunden) wird die Kulturbrühe durch Glaswatte filtriert, das Konidien-haltige FiItrat wird zentri-

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fugiert und die Konidien werden wie oben beschrieben in Phosphatpuffer aufgenommen, gezählt und nach geeigneter Verdünnung auf ein festes synthetisches Nährmedium mit Methioninzusatz, z.B. Nährmedium II mit 0,5$ D,L-Methionin, ausgesät. Die Platten werden 7 Tage bei 25 bebrütet, wobei nicht mehr als 30-50 Kolonien pro Platte auftreten sollen. Mit Hilfe eines Stempelkissens aus Schmirgelpapier wird ein Abbild der Platte auf das feste Nährmedium II ohne Methionin übertragen. Die Vollmedium- ^ platte wird bei 4 aufbewahrt, die Minimalagarplatte 7 Tage bei 25 gebrütet. Dann vergleicht man die beiden Platten und isoliert die nur auf dem Vollmedium wachsenden Kolonien.

Bei der Isolierung der Mutanten nach vorheriger Anreicherung durch mechanische oder chemische Eliminierung eines beträchtlichen Anteils der noch lebenden prototrophen Konidien wird ebenfalls die Tochtergeneration der mutagen

behandelten Konidien als Ausgangsmaterial verwendet. Bei M

der Konzentrierungsmethode nach Fries inkubiert man die Tochterkonidien wiederholt in flüssigem Minimaimedium (Nährmedium II ohne Agar) und filtriert nach jeder Inkubation durch Glaswatte. Bei der Zellgiftmethode und der Doppelmutantenmethode werden feste Nährböden (il) mit Minirnalmedium verwendet. Die angereicherten Konidien werden in gleicher Weise wie o.ben für die nicht angereicherten

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beschrieben auf das feste Nährmedium II mit Methionin
ausgesät und, wie dort beschrieben, nach Bildung von
Kolonien auf Minimalmedium repliziert und weiterbehandelt.

In gleicher Weise wie oben beschrieben kann die Mutante 865O/A in Nährmedien, welche statt de.r synthetischen natürliche Stickstoffquellen, z.B. Fischmehl, Sojamehl, Erdnussmehl oder Cornsteep enthalten, gezüchtet werden!. Man erhält auf diese Weise mit der Mutante ebenfalls eine wesentlich höhere Cephalosporin C Produktion als mit dem Ausgangsstamm.

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Tabelle 1 :

Niihrrnedium II (Minimalmedium) D,L-Methionin in %	8β50	8650/A,
■—	starkes Wachstum	kein Wachstum
1	starkes Wachstum· geringe Hemmung um die Pilterrondelle.	massiges■Wachstum; keine Hemmung um die Pilterrondelle.
2,5	mittleres Wachstum; ausgeprägter Hemmhof um die Pilterrondelle-	mittleres Wachstum; kein Hemmhof um die Filterrondelle.
5	mittleres Wachstum; ausgeprägter, grosser Hemmhof um die Pilter rondelle.	starkes Wachstum; kein Kemmhof um die Pilterrondelle.

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Claims

-25~ 2'; 01345 Patentansprüche i

1. Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C durch Fermentation mit Stämmen der Gattungen Emericellopsis-Cephalosporium in Gegenwart organischer Schwefelverbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man mit Mutanten fermentiert, bei denen der Stoffwechsel und/oder die Biosynthese organischer Schwefelverbindungen gestört sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet., dass man mit Methionin-aux'otrophen Mutanten fermentiert.

3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Nährmedium schwefelhaltige Aminosäuren zusetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Nährmedium Methionin(D,L; D oder L) oder dessen SuIfoxid oder SuIfon, Cystein(D,L; D oder L), Cystin(D,L; D oder L), Homocystein(D,L; D oder L), Hornocystin(D,L; D oder.L)Cystathionin und/oder S-Methyl~cystein(D,L; D oder L) zusetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Nährmedium D,L-Methionin zusetzt.

109831/1940

- 2β - 2 ; 01 345

6. Verwendung von Mutanten, bei denen der Stoffwechsel und/oder die Biosynthese organischer Schwefelverbindungen gestört sind, zur Herstellung von Cephalosporin C durch ■Fermentation.

7· Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man Mutanten, welche gegenüber Methionin(D,L; D oder L) oder dessen Sulfoxid oder Sulfon, Cystein(D,L; D oder L), Cystin (D,L; D oder L), Homocystein(D,L; D oder L), Homocystin(D,L; D oder L), Cystathionin und/oder S-Methyl--cystein(D,L; D oder L) auxotroph sind.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7* dadurch gekennzeichnet, dass man Cephalosporin C mittels der in den Beispielen beschriebenen Mutanten herstellt.

9· Mutanten von Stämmen der Gattungen Emericellopsis-Cephalosporium, bei denen der Stoffwechsel und/oder die Biosynthese organischer Schwefelverbindungen gestört sind.

10. Methionin-auxctrophe Mutanten von Stämmen der Gattungen Emericellopsis-Cephalosporium.

11. Verfahren zur Herstellung von für die Herstellung von Cephalosporin C besonders geeigneter Mutanten

1 09831/19AO

von Stämmen der Gattungen Emericellopsis-Cephalosporium, dadurch gekennzeichnet, dass man Stämme der Gattungen
Emerieellopsis-Cephalosporium mutiert und aus den Mutanten diejenigen selektioniert, bei denen der Stoffwechsel und/oder die Biosynthese organischer Schwefelverbindungen gestört sind.

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it

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