DE2921022C2 - - Google Patents
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-
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Description
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur mikrobiologischen
Herstellung des Nebramycin-Komplexes.
Es ist bekannt, daß Streptomyces tenebrarius
(ATCC 17920) ein aus mehreren Bestandteilen bestehendes,
als Nebramycin bezeichnetes Antibioticumgemisch erzeugt
(Stark, Hoehn und Knox, Antimicrobial Agents and Chemotherapy,
1967, Seite 314; britische Patentschrift 11 78 489
und US-Patentschrift 36 91 279). Das Antibioticumgemisch
enthält neben Nebenbestandteilen (Minorkomponenten) die
Bestandteile Nebramycin-2 (Apramycin), Nebramycin-4
(6′′-O-Carbamoyl-kanamycin B) und Nebramycin-5′ (6′′-O-Carbamoyl-tobramycin)
{Koch, Davis und Rhoades, J. of Antibiotics 26 [1973], 745}. In der US-Patentschrift 38 53 709
ist ein ausschließlich Nebramycin-2 und Nebramycin-7
erzeugender Mikroorganismus beschrieben. In der US-Patentschrift
40 32 404 ist von japanischen Verfassern die Herstellung
von Nebramycin-2 und Nebramycin-5′ durch Züchtung
des Stammes Streptoalloteichus hindustanus beschrieben.
Das Nebramycin-2 (Apramycin) wird erfolgreich zur Behandlung
von Krankheiten bei Tieren und Pflanzen eingesetzt
(US-Patentschriften 36 91 279, 38 53 709 und 38 76 767)
und das durch Hydrolyse des Nebramycines-5′ (6′′-O-Carbamoyl-tobramycines) hergestellte Nebramycin-6 (Tobramycin) ist
ein in der Humanmedizin angewandtes Antibioticum mit
breitem Wirkungsspektrum, das in erster Linie bei der Bekämpfung
von durch polyresistente Pseudomonas-Stämme verursachten
Infektionen Bedeutung hat (Preston und Wick,
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1970, Seite 322).
Die Erhöhung der Produktionsfähigkeit der die genannten
Antibiotika erzeugenden Mikroorganismen erfordert eine
umfangreiche Forschungsarbeit. Bei den zur Stammveredelung
üblichen Verfahren muß nach der Bestrahlung mit UV-Licht
oder annähernd UV-Licht und Röntgenstrahlen sowie nach
der Behandlung mit mutagenen Stoffen die Produktionsfähigkeit
einer sehr großen Anzahl überlebender Zellen
untersucht werden, damit die mehr Antibiotica synthetisierenden
Individuen ausgewählt werden können. Auf diese
Weise kann die Produktionsfähigkeit eines Mikroorganismus
auch mit sich über lange Zeit erstreckender stammveredelnder
Arbeit im allgemeinen nur unwesentlich gesteigert
werden. Wie eigene Versuche zeigten, läßt sich die Produktionsfähigkeit
von Streptomyces tenebrarius durch bekannte
Verfahren nicht wesentlich verbessern. Die in üblicher
Weise vorgenommene Selektionsarbeit wird durch den
Umstand, daß der Mikroorganismus einen aus mehreren Bestandteilen
bestehenden Antibioticum-Komplex biosynthetisiert,
sehr erschwert, weil deshalb bei der Untersuchung
der isolierten Individuen die Zusammensetzung des erzeugten
Komplexes bestimmt werden muß, damit die die gewünschte
vorteilhafte Verbindung überwiegend erzeugenden Stämme
ausgewählt werden können. Das Verfahren ist außerordentlich
arbeitsaufwendig und wenn die Fehlergrenzen der bekannten
Meßverfahren berücksichtigt werden, ist der Nachweis des
zu erwartenden 2 bis 5%igen Anstieges der Produktionsfähigkeit
und damit die Isolierung der besser erzeugenden
Stämme nahezu hoffnungslos.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues
schnell und einfach durchführbares Gärungsverfahren zur
mikrobiologischen Herstellung des Nebramycin-Komplexes,
durch welches Gärbrühen mit höherer Antibioticumkonzentration
hergestellt werden können, als dies bisher der
Fall war, zu schaffen.
Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß der
den Nebramycin-Komplex erzeugende Mikroorganismus Streptomyces
tenebrarius in Gegenwart von ab 2300 µg des Nebramycin-Komplexes/cm³
beziehungsweise 3000 µg Nebramycin-5′/cm³ sowie
ferner 3200 µg Nebramycin-2/cm³ nicht weiterwächst und die
weitere Erzeugung der genannten Antibiotica aufhört. Die dem
Nährmedium zugesetzten oder durch die eigenen biosynthetischen
Vorgänge der Zellen aufgebauten und in das Nährmedium abgegebenen
Antibiotica hemmen demnach oberhalb der angegebenen
Konzentrationsgrenzen ihre eigene Synthese.
Ferner wurde überraschenderweise festgestellt, daß sich
in denjenigen Zellen, welche in einem Nebramycin-2 enthaltenden
Nährmedium gezüchtet und dadurch auf experimentellem
Wege in bezug auf Nebramycin-2 resistent gemacht wurden,
diese Konzentrationsgrenze in vorteilhafter Richtung verschiebt
und sich bei der Gärung in überraschender Weise im
Nährmedium 3mal so viel Nebramycin-2 und Nebramycin-5′
ansammelt. Besonders bemerkenswert ist, daß auch die
Nebramycin-5′-Erzeugung des in bezug auf Nebramycin-2
resistent gemachten Stammes bedeutend ansteigt, obwohl
zwischen den beiden Verbindungen keine nähere strukturelle
Verwandtschaft besteht. Es ist interessant, daß bei in
bezug auf Nebramycin-5′ beziehungsweise Nebramycin-6 resistent gemachten Stämmen die Nebramycin-5′- und die
Nebramycin-2-Erzeugung gleichermaßen ansteigen.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur
mikrobiologischen Herstellung des Nebramycin-Komplexes,
bei dem man einen den Nebramycin-Komplex synthetisierenden Stamm
Streptomyces tenebrarius in einer submersen belüfteten
Gärungskultur in einem Stickstoff- und Kohlenstoffquellen
und anorganische Salze und gegebenenfalls pflanzliche und/oder
tierische Fette enthaltenden Nährmedium bei Temperaturen
von 30 bis 42°C, vorzugsweise 35 bis 38°C, züchtet und den
sich in der Kulturbrühe anreichernden Nebramycin-Komplex
oder gegebenenfalls das Nebramycin-2, Nebramycin-4
(6′′-O-Carbamoyl-kanamycin B) und Nebramycin-5′ (6′′-O-Carbamoyl-tobramycin)
abtrennt, welches dadurch gekennzeichnet
ist, daß man als Streptomyces tenebrarius einen
solchen Streptomyces tenebrarius einsetzt, den man nach
Bestrahlen mit UV-Licht in einem Nebramycin-2 und/oder
Nebramycin-5′ und/oder Nebramycin-6 enthaltenden Nährmedium
züchtet und die in Gegenwart von Nebramycin-2 und/oder
Nebramycin-5′ und/oder Nebramycin-6 in einer Konzentration
von 10 bis 30 mg/cm³ wachsenden, Luftmycel und Sporen
bildenden Individuen isoliert hat. Selbstverständlich können
dabei auch Nebenbestandteile abgetrennt werden. Auch kann gegebenenfalls
in an sich bekannter Weise das erhaltene Nebramycin-5′
(6′′-O-Carbamoyl-tobramycin) zu Nebramycin-6 (Tobramycin)
und das erhaltene Nebramycin-4 (6′′-O-Carbamoylkanamycin
B) zu Nebramycin-5 (Kanamycin) hydrolysiert werden.
Vorzugsweise werden als Streptomyces tenebrarius die in
der nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes
für Gesundheitswesen (Orszàgos Közeg´sz´gügyi Int´zet) unter
den Bezeichnungen MNG 169 am 28. Dezember 1977 und MNG 170 am
5. April 1978 hinterlegten Stämme eingesetzt.
Erfindungsgemäß wird zweckmäßig in der Weise vorgegangen,
daß mit den Sporen oder dem vegetativen Myzel der Stämme
Streptomyces tenebrarius MNG 169 oder MNG 170 oder anderer
erfindungsgemäß hergestellter in bezug auf Nebramycin-2,
Nebramycin-5′ und/oder Nebramycin-6 resistenter Stämme ein
organischer Stickstoff- und Kohlenstoffquellen und anorganische
Salze enthaltendes Nährmedium beimpft und die Kultur unter
entsprechender Belüftung bei 30 bis 42°C, vorzugsweise
35 bis 38°C, bebrütet wird. Die Gärung wird zweckmäßig nach
der 96sten bis 120sten Stunde abgebrochen. Zu diesem Zeitpunkt
enthält das Nährmedium 3000 bis 6000 µg Nebramycin-2/cm³,
650 bis 1500 µg Nebramycin-5′/cm³,
100 bis 300 µg Nebramycin-4/cm³ und gegebenenfalls Nebenbestandteile.
Als Nährmedium für die Gärungskultur für die Züchtung,
insbesondere der in Gegenwart einzelner Bestandteile des
Nebramycin-Antibioticumgemisches kräftig wachsenden und
Sporen bildenden Stämme Streptomyces tenebrarius MNG 169
und MNG 170, wird vorzugsweise ein solches, welches als
Stickstoffquelle ein Pepton, insbesondere Sojamehl, und/oder
Erdnußmehl und/oder Maisbrei unf/oder Casein und/oder
Aminosäuren und/oder Aminosäurederivate und/oder anorganische
Ammoniumsalze sowie als Kohlenstoffquelle Glucose und/oder
Fructose und/oder Stärke und/oder pflanzliche und/oder
tierische Fette und/oder Öle und/oder Glycerin und auch im
Falle eines Gehaltes an anorganischen Ammoniumsalzen gegebenenfalls
auch andere anorganische Salze enthält,
verwendet. Als von Ammoniumsalzen verschiedene anorganische
Salze kann es zweckmäßig Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat
und/oder Kobaltsalze enthalten. Die sich auf die Züchtung
günstig auswirkenden Spurenelemente sind in den übrigen
Bestandteilen des Nährmediums als Verunreinigungen enthalten.
Vorzugsweise wird als pflanzliches Öl ein Gemisch aus
Leinöl und Palmöl verwendet.
Zweckmäßig wird bei der Züchtung wie folgt vorgegangen:
Die Menge der zur Züchtung zugeführten Luft wird der Zusammensetzung des Nährmediums und den technischen Daten des Gärgefäßes entsprechend gewählt. Durch ein mit der Sulfitoxydationszahl von 1,1 bis 1,4 Millimol O₂ l/Minute charakterisiertes Gärgefäß wird je Minute zweckmäßig ein Luftvolumen, welches das 1,0- bis 1,4fache des Nährmediumvolumens ausmacht, geleitet; dabei wird das Nährmedium vorteilhaft mit einem Rührer mit einer Drehzahl von 300 bis 500 Minuten-1 gerührt.
Die Menge der zur Züchtung zugeführten Luft wird der Zusammensetzung des Nährmediums und den technischen Daten des Gärgefäßes entsprechend gewählt. Durch ein mit der Sulfitoxydationszahl von 1,1 bis 1,4 Millimol O₂ l/Minute charakterisiertes Gärgefäß wird je Minute zweckmäßig ein Luftvolumen, welches das 1,0- bis 1,4fache des Nährmediumvolumens ausmacht, geleitet; dabei wird das Nährmedium vorteilhaft mit einem Rührer mit einer Drehzahl von 300 bis 500 Minuten-1 gerührt.
Die Nährböden werden 30 bis 60 Minuten lang bei 121 bis
123°C mit Dampf sterilisiert. Vor dem Sterilisieren wird
ihr pH-Wert zweckmäßig auf 7,2 bis 7,4 eingestellt.
Bei der Gärung sind vielfach Zusätze zur Unterdrückung
der Schaumbildung nicht erforderlich, beispielsweise wenn als
Nährmedium ein solches, welches als Nährstoffquelle pflanzliche
und/oder tierische Fette und/oder Öle enthält, da
diese gleichzeitig die Schaumbildung hemmen.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens zur Herstellung von in bezug auf
Nebramycin-2 resistenten Stämmen werden die in einem Phosphatpuffer
mit einem pH-Wert von 7,0 suspendierten Sporen
des Ausgangsstammes 3 Minuten lang mit UV-Licht bestrahlt,
wobei alle 10 Sekunden eine Probe entnommen wird. Die Proben
werden nach entsprechender Verdünnung auf feste Nährböden,
die Nebramycin-2, Nebramycin-5′ oder Nebramycin-6 in zunehmender
Menge enthalten, aufgebracht. Die Kulturen werden
4 Tage lang bei 37°C bebrütet. Dann werden von den das
meiste Antibioticum enthaltenden Nährböden Luftmycel und
Sporen entwickelnde Kolonien isoliert und die Produktionsfähigkeit
dieser Kolonien sowie die quantitative Zusammensetzung
des erzeugten Nebramycin-Komplexes an Schüttelkulturen
untersucht.
Mit den das meiste Antibioticum in der günstigsten
Zusammensetzung synthetisierenden Stämmen werden die Behandlung
mit dem UV-Licht und das Aufbringen (Ausfächern)
auf antibioticumhaltigen Nährboden wiederholt, wobei Kolonien,
welche auch in Gegenwart von mindestens 20 mg Nebramycin-2/cm³
beziehungsweise Nebramycin-6 (oder Nebramycin-5′)
noch wachsen und Luftmyzel sowie Sporen bilden, erhalten
werden.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die in bezug auf
ihre eigenen Produkte resistenten Mikroorganismen in der
Weise hergestellt, daß die Sporen von Streptomyces tenebrarius
mit UV-Licht bestrahlt und die alle 10 Sekunden
der bestrahlten Suspension entnommenen Proben auf feste
Nährböden, die Nebramycin-2 oder Nebramycin-6 in zunehmender
Menge enthalten, aufgebracht werden. Die Kulturen
werden 4 Tage lang bei 37°C bebrütet. Dann werden von den
das meiste Antibioticum enthaltenden Nährböden Luftmyzel
und Sporen entwickelnde Kolonien isoliert und ihre Produktionsfähigkeit
wird untersucht. Die das meiste
Nebramycin-2 und/oder Nebramycin-5′ erzeugenden Stämme
werden auf Schrägagar, der Nebramycin-2 oder Nebramycin-6
in zunehmender Menge enthält, geimpft. Die Schrägagarkulturen
werden 4 Tage lang bei 37°C bebrütet. Das Überimpfen
auf antibioticumhaltige Nährböden wird 4mal wiederholt.
Die danach erhaltenen Varianten sind in bezug auf
Konzentrationen von 10 bis 30 mg/cm³ Nebramycin-2 und
Nebramycin-6 (oder Nebramycin-5′) resistent.
Bei beiden Ausführungsformen des erfindungsgemäßen
Verfahrens werden resistente Stämme, welche beim Züchten
in entsprechenden Nährmedien mindestens 3mal so viel
Nebramycin-2 und/oder Nebramycin-5′ synthetisieren als der
Ausgangsstamm, erhalten.
Der Hauptvorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
besteht darin, daß nach ihm Kulturbrühen, welche mindestens
3mal so viel des Nebramycin-Komplexes beziehungsweise
von Nebramycin-2 und Nebramycin-5′ enthalten wie die
üblichen Kulturbrühen, hergestellt werden können. So
können solche mit einem Gehalt an mehr als 5 mg Nebramycin-2/cm³
und 0,8 bis 1,4 mg Nebramycin-5′/cm³ erhalten
werden. Die zur Biosynthese großer Antibioticummengen
fähigen Stämme können in einfach durchführbarer wirtschaftlicher
Weise isoliert werden und diese Stämme bewahren
ihre Produktionsfähigkeit ohne jeden Eingriff
über lange Zeit hinweg.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele
näher erläutert.
Mit den Sporen oder der vegetativen Kultur von Streptomyces
tenebrarius (ATCC 17920) wurde ein mit destilliertem
Wasser bereiteter Nährboden der folgenden Zusammensetzung
beimpft:
Gew.-%
Dextrin1,0
Hefeextrakt0,1
Caseinhydrolysat (10%ig)2,0
Fleischextrakt0,1
Kobalt(II)-chloridhexahydrat (CoCl₂ · 6 H₂O)0,001
Agar2,0
Der pH-Wert des Nährbodens wurde vor dem Sterilisieren mit
Natriumhydroxyd auf 7,2 eingestellt und dann wurde der Nährboden
20 Minuten lang bei 121°C sterilisiert.
Die Kulturen wurden 4 Tage lang bei 37°C bebrütet. Dann
wurde mit einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von
7,0 eine Sporensuspension, die 5 × 10⁷ bis 10⁸ Sporen
und 100 µg 8-Methoxypsoralen je Millimeter enthielt,
bereitet. Die Sporensuspension wurde filtriert und homogenisiert
und dann mittels einer Lichtquelle mit einer
Leistung von 15 W mit UV-Licht bestrahlt, wobei sich sie
Lichtquelle in einer Entfernung von 20 cm von der Oberfläche
der Suspension befand. Während der 3 Minuten dauernden
Behandlung wurden alle 10 Sekunden Proben entnommen,
die nach entsprechender Verdünnung auf feste Nährböden
der oben angegebenen Zusammensetzung, welche jedoch zusätzlich
noch 2, 5, 10 bezeihungsweise 20 mg/cm³ Nebramycin-2
enthielten, aufgebracht wurden.
Die bei 37°C wachsenden und Sporen bildenden Kolonien
wurden nach 4 Tagen auf Schrägagarböden der gleichen
Zusammensetzung und mit dem gleichen Nebramycin-2-Gehalt
überimpft und 4 Tage lang bei 37°C bebrütet. Als Vergleichsversuch
wurde auch ein Teil der auf den kein Antibioticum
enthaltenden Nährböden gewachsenen Kolonien isoliert und
weitergezüchtet.
Mit den Kulturen wurden in der im weiter unten folgenden
Abschnitt d) angegebenen Weise Schüttelkulturen beimpft.
Nach der Gärung wurde der Gesamtwirkstoffgehalt der Gärbrühen
untersucht und die Zusammensetzung des erzeugten
Antibioticumgemisches mit annähernder Genauigkeit bestimmt.
Die mutationsauslösende und die Resistenz in bezug auf
Nebramycin-2 erhöhende Behandlung wurde mit den das meiste
Antibioticum in der günstigsten Zusammensetzung erzeugenden
Stämmen wiederholt und die Produktionsfähigkeit der isolierten
Stämme wurde erneut untersucht. Die Nebramycin-5′ und
Nebramycin-2 in großer Menge erzeugenden Stämme wurden bis
zu ihrer Verwendung an einem kühlen Ort gelagert.
In der folgenden Tabelle 1 ist die Produktionsfähigkeit
der ohne Mutationsbehandlung weitergezüchteten (Blindversuch),
der in Gegenwart von 8-Methoxypsoralen mit UV-Licht bestrahlten
und auf antibioticumfreiem Nährboden weitergezüchteten
(Vergleichsversuche) und der ebenso bestrahlten
auf Nebramycin-2 enthaltendem Nährboden weitergezüchteten
Stämme (erfindungsgemäß) verglichen.
Aus der obigen Tabelle 1 geht hervor, daß die Produktionsfähigkeit
der auf Nebramycin-2 enthaltendem Nährboden gezüchteten
Mikroorganismen nach der ersten UV-Behandlung
auf durchschnittlich das 1,85fache und nach der zweiten
UV-Behandlung auf das 3,1fache der Produktionsfähigkeit
des Ausgangsstammes anstieg. Die nicht mit Nebramycin-2
behandelten Stämme (Vergleichsversuch) synthetisierten nach
der ersten UV-Bestrahlung lediglich um 2% und nach der
zweiten Bestrahlung um 16% mehr Antibioticum als der Ausgangsstamm.
Ferner geht aus der obigen Tabelle 1 hervor,
daß sich das Verhältnis der Bestandteile des mit den in
bezug auf Nebramycin-2 resistenten Stämmen erhaltenen
Antibioticumgemisches auf die Bestandteile Nebramycin-2
und Nebramycin-5′ zu verschoben hat.
Der die günstigsten Eigenschaften aufweisende Stamm
MNG 169 wurde bis zu seiner weiteren Verwendung an einem
kühlen Ort gelagert.
Die im vorstehenden Abschnitt a) beschriebene UV-Behandlung,
die Isolierung und die Klassifizierung der
isolierten Kolonien durch Züchten in Schüttelkulturen
wurden wiederholt.
Die das meiste Antibioticum in der günstigsten Zusammensetzung
erzeugenden Stämme wurden auf Schrägagar
der im vorstehenden Abschnitt a) angegebenen Zusammensetzung
aufgeimpft. Die einzelnen Schrägagarböden enthielten
Nebramycin-2 in Konzentrationen von 0 bis 30 mg/cm³.
Die Kulturen wurden 4 Tage lang bei 37°C bebrütet.
Vom das meiste Antibioticum enthaltenden Schrägagar wurde
erneut eine Reihenüberimpfung vorgenommen. Das Bebrüten
und Überimpfen wurde 4mal wiederholt. Danach wurde die
Produktionsfähigkeit der in Gegenwart der größten
Nebramycin-2-Konzentration wachsenden und Luftmyzel bildenden
Kulturen untersucht. Es wurde in der im weiter unten
folgenden Abschnitt d) beschriebenen Weise gegoren.
Als Vergleichsversuch wurde die Produktionsfähigkeit
des nicht mit Nebramycin-2 behandelten, jedoch ebenfalls
5mal überimpften und weitergezüchteten Stammes untersucht.
Die Produktionsfähigkeit der nicht mit Antibioticum
behandelten Stämme (Vergleichsversuch) sowie der nach
einer UV-Behandlung 5mal auf Nebramycin-2 enthaltende
Närböden überimpften Stämme (erfindungsgemäß) und die
Zusammensetzung des erzeugten Nebramycin-Komplexes sind
in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellt.
Aus der obigen Tabelle 2 geht hervor, daß durch die
Behandlung mit Nebramycin-2 die Produktionsfähigkeit des
Stammes auf das 2,4fache anstieg und die Zusammensetzung
des erzeugten Antibioticumkomplexes sich vorteilhaft
änderte. Einer der isolierten Stämme, dessen Nebramycin-2-Erzeugung
besonders hoch war, wurde in der Nationalen
Stammsammlung des Landesinstitutes für Gesundheitswesen
unter der Bezeichnung MNG 170 hinterlegt.
Es wurde in der im obigen Abschnitt a) beschriebenen
Weise gearbeitet, jedoch mit dem Unterschied, daß an Stelle
des Nebramycin-2-es Nebramycin-5′ oder Nebramycin-6 verwendet
wurde. Auf diese Weise wurden Stämme, welche in Gegenwart
von 25 mg Nebramycin-5′ oder Nebramycin-6/cm³ kräftig
wuchsen und ein Luftmyzel bildeten, erhalten. In der Kulturbrühe
der am besten erzeugenden Stämme sammelte sich durchschnittlich
1,35mal so viel Nebramycin-Komplex an als
im Nährmedium des Ausgangsstammes. Der Antibioticumkomplex
hatte die folgende bioautographisch bestimmte durchschnittliche
Zusammensetzung: 56 Gew.-% Nebramycin-2,
17 Gew.-% Nebramycin-4 und 25 Gew.-% Nebramycin-5′. Ferner
enthielt der Komplex etwa 1 Gew.-% andere biologisch aktive
Verbindungen.
Mit dem gemäß dem obigen Abschnitt a) isolierten in
Gegenart von Nebramycin-2 wachsenden und auf dem Nährboden
gemäß dem obigen Abschnitt a) gehaltenen Stamm Streptomyces
tenebrarius MNG 169 wurde ein mit Leitungswasser bereitetes
Nährmedium der folgenden Zusammensetzung beimpft:
Gew.-%
Sojamehl3,0
Caseinhydrolysat (10%-ig)5,0
Ammoniumchlorid (NH₄Cl)0,5
Ammoniumnitrat (NH₄NO₃)0,1
Calciumcarbonat (CaCO₃)0,3
Magnesiumsulfat (MgSO₄)0,5
Kobalt(II)-nitrat [Co(NO₃)₂]0,001
L-Glutamin0,3
Gemisch von Palmöl und Leinöl im Gewichtsverhältnis von 1 : 13,0
Glucose (als 50%ige Lösung getrennt sterilisiert)4,0.
Vom Nährmedium wurden vor dem Beimpfen je 100 cm³ in
500 cm³ Erlenmeyer-Kolben gefüllt, sein pH-Wert wurde mit
Natriumhydroxyd auf 7,2 eingestellt und dann wurde es in
einem Autoklaven 20 Minuten lang bei 121°C sterilisiert.
Die Züchtung wurde auf einem Schütteltisch mit einer
Frequenz von 260 Minuten-1 und einer Amplitude von 4 cm
vorgenommen. Es wurde 120 Stunden lang bei 37°C gezüchtet.
Der pH-Wert von 100 cm³ Kulturbrühe wurde mit Oxalsäure
auf 2,5 eingestellt. Das von Ca+2-Ionen freie Filtrat wurde
auf eine mit dem Ionenaustauscherharz Amberlite CG-50
(Ammoniumform, Teilchengröße: 0,074 mm)
bereitete Chromatographiersäule
mit einem Durchmesser von 1 cm und einer Höhe von
12 cm aufgebracht und mit ionenfreiem Wasser gewaschen.
Die Antibiotica wurden mittels linearer Gradientenelution
eluiert, wobei als Stammlösungen 120 cm³ 0,05 n Ammoniumhydroxyd
und 120 cm³ 0,35 n Ammoniumhydroxyd verwendet
wurden. Es wurde mit einer Geschwindigkeit von 6 bis
8 cm³/Stunde eluiert. Es wurden Fraktionen von 1,5 cm³
aufgefangen. Die gemäß der bioautographischen Untersuchung
gleiche Antibiotica enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt
und bei 60°C unter vermindertem Druck zur Trockne
eingedampft. Die Eindampfrückstände wurden bis zur Gewichtskonstanz
getrocknet.
Gemäß den Gewichtsmessungen enthielten 100 cm³ Kulturbrühe
520 mg Nebramycin-2, 142 mg Nebramycin-5′ und 18 mg
Nebramycin-4.
Bei Züchtung des nicht resistenten Stammes unter den
gleichen Bedingungen enthielten 100 cm³ Kulturbrühe
142 mg Nebramycin-2, 37,6 mg Nebramycin-5′ und
57 mg Nebramycin-4.
Mit dem gemäß dem Beispiel 1, Abschnitt a) isolierten
und auf der Grundlage der Ergebnisse der gemäß dem
Beispiel 1, Abschnitt d) durchgeführten Gärung (biologische
Wertmessung, Bioautographie und säulenchromatographische
Abtrennung) ausgewählten Stamm Streptomyces tenebrarius MNG 169
wurde ein mit Leitungswasser bereitetes Nährmedium der
folgenden Zusammensetzung beimpft:
Gew.-%
Sojamehl2,0
Caseinhydrolysat (10%ig)3,0
Ammoniumnitrat (NH₄NO₃)0,1
Ammoniumchlorid (NH₄Cl)0,3
Calciumcarbonat (CaCO₃)0,3
Magnesiumsulfat (MgSO₄)0,5
Gemisch von Palmöl und Leinöl im Gewichtsverhältnis von 1 : 13,0
Glucose (als 50%ige Lösung getrennt sterilisiert)2,0.
Vom Nährmedium wurden vor dem Beimpfen je 100 cm³ in
500 cm³ Erlenmeyer-Kolben gefüllt, sein pH-Wert wurde
mit Natriumhydroxyd auf pH 7,2 eingestellt und dann wurde
es in einem Autoklaven 20 Minuten lang bei 121°C sterilisiert.
Die beimpften Kolben wurden 16 Stunden lang auf dem
Schütteltisch gezüchtet, worauf das beimpfte Material
(Inokulum) untersucht wurde. Unter dem Mikroskop war ein
kräftiges Wachstum zu sehen und es waren Myzelfragmente
vorhanden. Die Kultur hatte einen pH-Wert von 6,8 bis 7,0.
Mit dem beimpften Material wurden 5 l Nährmedium der
im folgenden angegebenen Zusammensetzung, das in einer
Laboratoriumsgärvorrichtung aus Glas 45 Minuten lang bei
121°C sterilisiert wurde, beimpft. Die Gärvorrichtung hatte
ein Nutzvolumen von 10 l. Das mit Leitungswasser bereitete
und vor dem Sterilisieren mit Natriumhydroxyd auf einen
pH-Wert von 7,2 eingestellte Nährmedium hatte die folgende
Zusammensetzung:
Gew.-%
Sojamehl3,0
Caseinhydrolysat (10%ig)5,0
Ammoniumnitrat (NH₄NO₃)0,1
Ammoniumchlorid (NH₄Cl)0,5
L-Glutaminsäure0,3
Calciumcarbonat (CaCO₃)0,5
Magnesiumsulfat (MgSO₄)0,5
Kobalt(II)-nitrat [Co(NO₃)₂]0,001
Gemisch von Palmöl und Leinöl im Gewichtsverhältnis von 1 : 13,0
Glucose (als 50%ige Lösung getrennt sterilisiert)4,4.
Während der Gärung wurden die biologische Aktivität
gemessen und die Zusammensetzung des Antibioticum-Komplexes
und der Verbrauch der Kohlenstoffquelle untersucht. In der
96sten Stunde der Gärung enthielt die Kulturbrühe keine
Glucose mehr. In der 120sten Stunde war unter dem Mikroskop
eine stark fragmentarische Kultur zu sehen, später
konnte ein schwaches Sekundärwachstum beobachtet werden.
die biologische Aktivität der Kultur erreichte in der
120sten Stunde ihr Maximum; gemäß dünnschichtchromatographischen
Untersuchungen enthielten 100 cm³ Kulturbrühe
zu diesem Zeitpunkt 420 mg Nebramycin-2, 90 mg Nebramycin-5′
und außerdem Nebramycin-4.
Der pH-Wert der Gärbrühe wurde mit einer 50%igen
wäßrigen Schwefelsäure auf 2 eingestellt. Dann wurden
die Zellen des Mikroorganismus abfiltriert und auf dem
Filter mit 1,5 l Wasser gewaschen. Das Waschwasser wurde
mit dem Filtrat vereinigt und der pH-Wert der erhaltenen
Lösung wurde mit 25%igem Ammoniak auf 7 eingestellt. Danach
wurde die neutralisierte Lösung unter Rühren mit
Oxalsäure auf einen pH-Wert von 2,5 angesäuert. Die angesäuerte
Lösung wurde 20 Minuten lang gerührt und ihr
pH-Wert wurde mit 5%igem Ammoniak auf 7,5 eingestellt
und die einen Niederschlag enthaltende Lösung wurde filtriert.
Die erhaltenen 5,1 l Filtrat wurden durch eine mit dem
Ionenaustauscherharz Wofatit CP-300 (Ammoniumform)
gefüllte Ionenaustauschersäule mit einem Durchmesser von 3,6 cm und einer
Höhe von 60 cm hindurchgelassen. Die Säule wurde zunächst
mit ionenfreiem Wasser gewaschen, dann wurde mit 4 l 0,15 n
Ammoniumhydroxyd und anschließend mit 2 l n Ammoniumhydroxyd
eluiert, wobei Fraktionen von je 200 cm³
aufgefangen wurden. Der Antibioticumgehalt der Fraktionen
wurde dünnschichtchromatographisch analysiert, wobei die
im Beispiel 1, Abschnitt a) beschriebene Adsorbensschicht
und das dort beschriebene Entwicklergemisch und ferner
Ninhydrin verwendet wurden. Die Fraktionen 4 bis 19 wurden
bei 80°C unter vermindertem Druck auf ein Volumen von
300 cm³ eingedampft, dann mit 1 g Aktivkohle geklärt,
filtriert und schließlich unter vermindertem Druck zur
Trockne eingedampft. So wurden 23,5 g rohes Nebramycin-2
erhalten, welches nach dem Umkristallisieren aus einem
Gemisch von Äthanol und Wasser im Volumenverhältnis von
7 : 1 17,1 g reines Nebramycin-2 ergab. Die Fraktionen
20 bis 27 wurden bei 80°C unter vermindertem Druck eingedampft.
So wurden 6 g eines Antibioticumgemisches,
welches hauptsächlich aus Nebramycin-5′ bestand, jedoch,
wie die dünnschichtchromatographische Analyse zeigte,
auch beträchtliche Mengen Nebramycin-4 und Nebramycin-2
enthielt, erhalten. Dieses Gemisch wurde in 60 cm³ Wasser
gelöst und mit 40 cm³ einer n Natronlauge 2 Stunden lang
bei 90°C hydrolysiert. Nachdem das Gemisch auf Raumtemperatur
abgekühlt war, wurde sein pH-Wert mit einer 50%igen
wäßrigen Schwefelsäure auf 7,5 eingestellt. Das Gemisch
wurde mit 800 mg Aktivkohle geklärt und dann filtriert.
Die abfiltrierte Aktivkohle wurde mit 2 × 15 cm³ Wasser
gewaschen. Das mit dem Waschwasser vereinigte Filtrat wurde
auf eine mit dem Ionenaustauscherharz Amberlite CG-50-I
gefüllte Ionenaustauschersäule
mit einem Durchmesser von 2,8 cm und einer Höhe von 40 cm
aufgebracht. Nachdem die Lösung eingesickert war, wurde die
Säule mit ionenfreiem Wasser gewaschen. Dann wurde mit
800 cm³ 0,125 n Ammoniumhydroxyd, 800 cm³ 0,15 n Ammoniumhydroxyd,
800 cm³ 0,175 n Ammoniumhydroxyd, 800 cm³ 0,2 n
Ammoniumhydroxyd und 800 cm³ 0,3 n Ammoniumhydroxyd eluiert,
wobei Fraktionen von je 100 cm³ aufgefangen wurden. Die
Fraktionen, welche gemäß der dünnschichtchromatographischen
Analyse das Nebramycin-2, das Nebramycin-5 (Kanamycin B)
und das Nebramycin-6 einheitlich enthielten, wurden bei
80°C unter vermindertem Druck eingedampft. Aus den Fraktionen
4 bis 12 wurden 0,8 Nebramycin-2, aus den Fraktionen
21 bis 27 1,15 g Nebramycin-5 und aus den Fraktionen
30 bis 38 3,25 g Nebramycin-6 erhalten. Letzteres wurde
aus Methanol umkristallisiert, wodurch 2,7 g analysenreines
Nebramycin-6 gewonnen wurden.
Die im Beispiel 2 beschriebene Gärverfahrensweise wurde
mit dem Stamm MNG 170 wiederholt. Wie dünnschichtchromatographische
Untersuchungen zeigten, enthielten 100 cm³
Kulturbrühe 560 mg Nebramycin-2 neben wenig Nebramycin-5′.
Nach der Beendigung der Gärung wurde der pH-Wert der
Gärbrühe mit Oxalsäure auf 2 eingestellt und die angesäuerte
Gärbrühe 20 Minuten lang gerührt. Dann wurden die
Zellen des Mikroorganismus und das ausgefallene Calciumoxalat
abfiltriert und auf dem Filter mit 1,5 l Wasser
gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser wurden vereinigt,
der pH-Wert der Lösung wurde mit 25%-igem Ammoniak auf
7,5 eingestellt und die Lösung wurde filtriert. Die erhaltenen
4,9 l Filtrat wurden auf eine mit dem Ionenaustauscherharz
Wofatit CP-300 in der Ammoniumform gefüllte
Ionenaustauschersäule mit einem Durchmesser von 4 cm und
einer Höhe von 40 cm aufgebracht. Die Säule wurde zunächst
mit ionenfreiem Wasser gewaschen und dann wurde mit 5 l
0,12 n Ammoniumhydroxyd und anschließend mit 1 l n Ammoniumhydroxyd
eluiert, wobei Fraktionen von je 200 cm³ aufgefangen
wurden. Der Antibioticumgehalt der Fraktionen wurde
in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise und unter Verwendung
von Ninhydrin analysiert. Die ausschließlich
Nebramycin-2 enthaltenden Fraktionen 5 bis 23 wurden eingedampft
und die erhaltenen 27,3 g Rohprodukt wurden aus
einem Gemisch von Äthanol und Wasser im Volumenverhältnis
von 7 : 1 umkristallisiert. So wurden 22,1 g reines
Nebramycin-2 erhalten.
Claims (4)
1. Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung des
Nebramycin-Komplexes, bei dem man einen den Nebramycin-Komplex synthetisierenden Stamm Streptomyces
tenebrarius in einer submersen belüfteten Gärungskultur
in einem Stickstoff- und Kohlenstoffquellen
und anorganische Salze und gegebenenfalls pflanzliche
und/oder tierische Fette enthaltenden Nährmedium
bei Temperaturen von 30 bis 42°C, vorzugsweise
35 bis 338°C, züchtet und den sich in der Kulturbrühe
anreichernden Nebramycin-Komplex oder gegebenenfalls
dasNebramycin-2, Nebramycin-4 und
Nebramycin-5′ abtrennt, dadurch gekennzeichnet, daß
man als Streptomyces tenebrarius einen solchen
Streptomyces tenebrarius einsetzt, den man nach
Bestrahlen mit UV-Licht in einem Nebramycin-2 und/oder
Nebramycin-5′ und/oder Nebramycin-6 enthaltenden
Nährmedium züchtet und die in Gegenwart vonNebramycin-2
und/oder Nebramycin-5′ und/oder Nebramycin-6 in einer
Konzentration von 10 bis 30 mg/cm³ wachsenden, Luftmycel
und Sporen bildenden Individuen isoliert hat.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Streptomyces tenebrarius die in der nationalen
Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes
für Gesundheitswesen (Orszàgos Közeg´sz´gügyi
Int´zet) unter den Bezeichnungen MNG 169 am 28. Dezember
1977 und MNG 170 am 5. April 1978 hinterlegten
Stämme einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Nährmedium für die Gärungskultur
ein solches, welches als Stickstoffquelle
ein Pepton, insbesondere Sojamehl, und/oder Erdnußmehl
und/oder Maisbrei und/oder Casein und/oder
Aminosäuren und/oder Aminosäurederivate und/oder
anorganische Ammoniumsalze sowie als Kohlenstoffquelle
Glucose und/oder Fructose und/oder Stärke
und/oder pflanzliche und/oder tierische Fette und/oder
Öle und/oder Glycerin und auch im Falle eines
Gehaltes an anorganischen Ammoniumsalzen gegebenenfalls
auch andere anorganische Salze enthält, verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet,
daß man als pflanzliches Öl ein Gemisch
aus Leinöl und Palmöl verwendet.
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|---|---|---|---|
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|---|---|
| DE2921022A1 DE2921022A1 (de) | 1979-11-29 |
| DE2921022C2 true DE2921022C2 (de) | 1987-10-15 |
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|---|---|---|---|
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| US3876767A (en) * | 1972-02-04 | 1975-04-08 | Lilly Co Eli | Treatment of swine dysentery with apramycin |
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