HU176103B - Microbiological process for producing nebramycin complex - Google Patents

Microbiological process for producing nebramycin complex Download PDF

Info

Publication number
HU176103B
HU176103B HU78GO1404A HUGO001404A HU176103B HU 176103 B HU176103 B HU 176103B HU 78GO1404 A HU78GO1404 A HU 78GO1404A HU GO001404 A HUGO001404 A HU GO001404A HU 176103 B HU176103 B HU 176103B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
nebramycin
complex
strains
tobramycin
isolated
Prior art date
Application number
HU78GO1404A
Other languages
English (en)
Inventor
Istvan Ott
Gabor Ambrus
Jozsef Gyimesi
Ilona Harsanyi
Janos Berdy
Valeria Szell
Tibor Balogh
Laszlo Toelgyesi
Istvanne Kadar
Laszlo Nagy
Janos Erdei
Endrene Szuecs
Istvan Kaszab
Ferenc Fabian
Kalman Polya
Lajos Kun
Janos Vig
Jenoe Szilagyi
Csaba Nagy
Original Assignee
Gyogyszerkutato Intezet
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gyogyszerkutato Intezet filed Critical Gyogyszerkutato Intezet
Priority to HU78GO1404A priority Critical patent/HU176103B/hu
Priority to AT0357279A priority patent/AT363180B/de
Priority to FR7912950A priority patent/FR2426736B1/fr
Priority to DE19792921022 priority patent/DE2921022A1/de
Publication of HU176103B publication Critical patent/HU176103B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/22—Cyclohexane rings, substituted by nitrogen atoms
    • C07H15/222—Cyclohexane rings substituted by at least two nitrogen atoms
    • C07H15/226—Cyclohexane rings substituted by at least two nitrogen atoms with at least two saccharide radicals directly attached to the cyclohexane rings
    • C07H15/234—Cyclohexane rings substituted by at least two nitrogen atoms with at least two saccharide radicals directly attached to the cyclohexane rings attached to non-adjacent ring carbon atoms of the cyclohexane rings, e.g. kanamycins, tobramycin, nebramycin, gentamicin A2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/46—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin
    • C12P19/48—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin the cyclohexyl radical being substituted by two or more nitrogen atoms, e.g. destomycin, neamin
    • C12P19/485—Having two saccharide radicals bound through only oxygen to non-adjacent ring carbons of the cyclohexyl radical, e.g. gentamycin, kanamycin, sisomycin, verdamycin, mutamycin, tobramycin, nebramycin, antibiotics 66-40B, 66-40D, XK-62-2, 66-40, G-418, G-52
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

A találmány tárgya új eljárás nebramicin-komplex előállítására mikrobiológiai úton.
Ismeretes, hogy a Streptomyces tenebrarius (ATCC 17 920) több komponensből álló, nemramicinnek elnevezett antibiotikum-keveréket szintetizál (Stark, Hoehn és Knox, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1967, 314. oldal; 1 178 489 számú nagy-britanníai és a 3 691 279 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Az antibiotikum-keverék minor komponensek mellett nebramicin-2 (apramicin), nebramicin-4 (6*-0-karbamoil-kanamicin B) és nebramicin-5' (6-0-karbamoil-tobramicin) komponenseket tartalmaz [Koch, Davis és Rhoades, J. of Antibiotics, 26, 745 (1973)]. A 3 853 709 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban a szerzők kizárólag nebramicin-2-t és nebramicin-7-et termelő mikroorganizmust írnak le. Japán szerzők a 4032 404 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Streptoalloteichus hindustanus törzs tenyésztésével oldják meg a nebramicin-2 és a nebramicin-5' előállítását.
Az apramicin (nebramicin-2) előnyösen használható növényi és állati betegségek kezelésére (3 691 279, 3 853 709 és 3 876 767 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), a ó’-O-karbamoil-tobramicin (nebramicin-5') hidrolízisével előállított tobramicin 25 (nebramicin-6) pedig szélesspektnjmú, elsősorban polirezisztens Pseudomonas-ok okozta fertőzések leküzdésében jelentős szerepet játszó, a humán-terápiában használt antibiotikum (például Preston és Wick, Antimicrobial Agettts an< Chemotherapy, 1970, 322. oldal). 30
Jelentős kutatómunkát igényel a fenti antibiotikumokat termelő mikroorganizmusok termelőképességének fokozása. A törzsnemesítéskor használt ismert módszerek, az UV-, közeli UV- és röntgen-besugárzások, vala5 mint a mutagén anyagokkal végzett kezelések után igen nagyszámú túlélő sejt termelőképességét kell megvizsgálni a több antibiotikumot szintetizáló egyedek kiválasztására. így eljárva, hosszú időn át végzett törzsnemesítő munkával is rendszerint csak csekély mértékben lehet 10 egy mikroorganizmus termelőképességét növelni. Tapasztalataink szerint a Streptomyces tenebrarius termelőképességét az ismert módszerekkel jelentősen nem lehet fokozni. A szokásosan végzett szelekciós munkát igen megnehezíti, hogy a mikroorganizmus több karnis ponensből álló antibiotikum-komplexet bioszintetizál, így az izolált egyedek vizsgálata során meg kell határozni a termelt komplex összetételét ahhoz, hogy ki lehessen választani a kívánt előnyös vegyületet túlsúlyban termelő törzseket. Ez rendkívül munkaigényes eljárás, és az 20 ismert mérési módszerek hibahatárait figyelembe véve szinte reménytelenné teszi a várható 2—5%-os termelőképesség-emelkedés kimutatását, így a jobban termelő törzsek izolálását.
A találmány célja olyan új, gyors és könnyen kivitelezhető fermentációs eljárás kidolgozása, amellyel az eddiginél nagyobb antibiotikum-koncentrációjú fermentlevek állíthatók elő.
Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy a nebraraicin-kompiexet termelő Streptomyces tenebrarius mikroorganizmus 2300 gg/ml nebramicin-komplex, illetve
3000 [JLg/m( nebramicin-4 és nebramicin-5', továbbá 3200 p.g/ml nebramicin-2 jelenlétében nem növekszik, és az említett antibiotikumok további termelése leáll. A táptalajhoz adagolt, vagy a sejtek saját bioszintetikus folyamatai révén felépült és a táptalajba kiválasztott antibiotikumok tehát a fenti koncentráció-határokon felül gátolják saját további szintézisüket.
Azt észleltük továbbá, hogy azokban a sejtekben, amelyeket nebramicin-2 tartalmú táptalajon növesztve kísérleti úton n©bramicin-2-re érzéketlenné tettünk, ez a koncentráció-határ előnyösen eltolódik, és a fermentáció során a táptalajban —- meglepő módon — háromszor több nebramicin-2 és nebramicin-5' halmozódik fel. Különösen figyelemre méltó, hogy a nebramicin-2-re rezisztenssé tett törzsek nebramicin-5' termelése is jelentősen megnő annak ellenére, hogy a két vegyület között nincs közelebbi szerkezeti rokonság. Érdekes módon a nebramicin-5'-re, illetve a nebramicin-6-ra érzéketlenné tett törzsek esetében a nebramicin-2 és a nebramicin-5' termelés egyaránt növekszik.
Fentiek alapján a találmány tárgya új eljárás nebramicin-komplex, nevezetesen nebramicin-2, nebramicin-5' és nebramicin-4 előállítására mikrobiológiai úton, Streptomyces tenebrarius törzs felhasználásával. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy egy nebramicin-komplexet bioszintetizáló Streptomyces tenebrarius törzset nebramicin-2-t vagy nebramicin-5'-t vagy nebramicin-6-ot tartalmazó táptalajon tenyésztünk, a 10 mg/ml és 30 mg/ml közötti mennyiségű nebramicin-2 és/vagy nebramicin-5' és/vagy nebramicin-6 jelenlétében növekvő, légmicéliumot fejlesztő és spórázó egyedeket elkülönítjük, az így kapott új, rezisztens törzseket, előnyösen az Országos Közegészségügyi Intézet Nemzeti Törzsgyűjteményében MNG 169 és MNG 170 sorszámmal letétbe helyezett mikroorganizmusokat süllyesztett, levegőztetett fermentációs, körülmények között nitrogén- és szénforrást, szervetlen sókat és növényi vagy állati eredetű zsírokat vagy olajokat tartalmazó táptalajon 30 C° és 42 C° közötti hőmérsékleten tenyésztjük, majd a tenyészetben felhalmozódó antibiotikumokat ismert módon elkülönítjük.
A találmány értelmében a nebramicin-2, nebramicin-5' és nebramicin-4 előállítására célszerűen úgy járunk el, hogy a Streptomyces tenebrarius MNG 169 vagy MNG 170 számú, vagy a találmány szerinti eljárással előállított más, előnyösen nebramicin-2-re, nebramicin-5'-re és/vagy nebramicin-6-ra rezisztens törzs spóráival vagy vegetatív micéliumával szerves nitrogén- és szénforrást, továbbá szervetlen sókat tartalmazó táptalajt oltunk, majd megfelelő levegőcserét biztosítva 30 C° és 42 C° közötti, előnyösen 35—38 C° hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket. A fermentációt a 96—120. órában fejezzük be, ekkor a táptalaj 3000 fzg/ml és 6000 közötti mennyiségű nebramicin-2-t, 650 μg/ml és 1500 μg/mI közötti mennyiségű nebramicin-5'-t, továbbá 100—300 μg/ml nebramicin-4et és esetenként minor komponenseket tartalmaz.
A nebramicin antibiotikum-keverék egyes összetevői jelenlétében erőteljesen növekvő és spórázó Streptomyces tenebrarius MNG 169 vagy MNG 170 tenyésztésekor szénforrásként előnyösen glükózt, keményítőt, glicerint vagy fruktózt és növényi vagy állati olajokat vagy zsírokat adunk a táptalajhoz. Nítrogénforrásként mogyorólisztet, kukoricalekvárt, peptont, előnyösen szójalisztet, kazeint, aminosavakat és szervetlen ammó niumsókat használunk. Szervetlen sóként továbbá kalciumkarbonátot, magnéziumszulfátot és kobalt-sókat célszerű adni a táptalajhoz. A termelést előnyösen befolyásoló nyomelemeket a táptalaj többi összetevője szennyezőanyagként tartalmazza.
A tenyésztést előnyösen 35 C° és 38 C° közötti hőmérsékleten 96—120 órán át végezzük. A tenyészeteken átáramoltatott levegő mennyiségét a táptalaj összetétele és a készülék műszaki adatai szerint kell megválasztani. Egy 1,1—1,4 mM O2 liter/perc szulfitoxidációs számmal jellemzett fermentoron előnyösen 1,0—-1,4 térfogatnyi levegőt vezetünk át percenként, egységnyi táptalaj-térfogatra számítva, miközben percenként 300—500-at forduló keverővei keverjük a táptalajt.
A táptalajok sterilezését 30—60 percen át 121—423 C° hőmérsékleten gőzzel végezzük. A táptalajok pH-ját sterilezés előtt 7,2—7,4 közötti értékre célszerű beállítani.
A fermentáció közben habzásgátlót nem kell adagolni, mivel a tápanyagforrásként adagolt növényi vagy állati zsírok vagy olajok egyúttal a tenyészlé habzását is gátolják.
A találmány egy előnyös kivitelezési változata szerint a nebramicin-2-re rezisztens törzsek előállítására úgy járunk el, hogy a kiindulási törzs 7,0 pH-jú foszfát-pufferben szuszpendált spóráit, 10 másodpercenként mintát véve, 3 percen át ultraibolya fénnyel besugározzuk, és a mintákat megfelelő hígítás után növekvő mennyiségű nebramicin-2-t, nebramicin-5'-t vagy nebramicin-6-ot tartalmazó szilárd halmazállapotú táptalajokra szélesztjük. Négy napon át 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket, majd a legtöbb antibiotikumot tartalmazó táptalajokon légmicéliumot és spórákat fejlesztő telepeket izoláljuk, és rázott tenyészetekben vizsgáljuk termelőképességüket és a termelt nebramicin-komplex kvantitatív komponens-összetételét.
A legtöbb antibiotikumot a legelőnyösebb komponens-összetételben szintetizáló törzsekkel megismételjük az ultraibolya fénnyel való kezelést és az antibiotikumos táptalajon történő szélesztést, ami után legalább 20 mg/ml nebramicin-2, illetve nebramicin-6 (vagy nebramicin-5') jelenlétében is növekvő, légmicéliumot fejlesztő és spórázó telepeket kapunk.
A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös kivitelezési változata szerint a saját termékre rezisztens mikroorganizmusok előállítását úgy végezzük, hogy a Streptomyces tenebrarius spóráit ultraibolya fénnyel besugározzuk, majd a besugárzott spóraszuszpertzióból 10 másodpercenként vett mintákat megfelelő hígítás után növekvő mennyiségű nebramiein-2-t vagy nebramicin-6ot tartalmazó szilárd halmazállapotú táptalajra szélesztjük. Négy napon át 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket, majd a legtöbb antibiotikumot tartalmazó táptalajokon légmicéliumot és spórákat fejlesztő telepeket izoláljuk, és vizsgáljuk termelőképességüket. A legtöbb nebramicin-2-t és/vagy nebramicin-5'-t termelő törzseket növekvő mennyiségű nebramicin-2-t vagy nebramicin-6-ot tartalmazó ferdeagarokra oltjuk, majd 37 C° hőmérsékleten négy napon át inkubáljuk a tenyészeteket. Az antibiotikumot tartalmazó táptalajokra való átoltást négyszer megismételjük, ami után 10 mg/ml és 30 mg/ml közötti mennyiségfl nebramicin-2-re és tobramicin-6-ra (vagy nebramicin-5'-re) rezisztens variánsokhoz jutunk.
Mindkét kivitelezési változat szerint eljárva olyan rezisztens törzseket kapunk, amelyek megfelelő táptalajon tenyésztve a kiindulási törzsnél legalább háromszor több nebramicin-2-t és/vagy nebramicin-5'-t szintetizálnak. Két ilyen törzset letétbe helyeztünk az Országos Közegészségügyi Intézet Nemzeti Törzsgyűjteményében, ahol az MNG 169 és MNG 170 sorszámot kapták.
A találmány szerinti eljárás legfőbb előnye, hogy segítségével az eddiginél legalább háromszor több nebramicin-komplexet, nebramicin-2-t és nebramicin-5'-t tartalmazó tenyészlevek állíthatók elő. A nagy mennyiségű antibiotikumok bioszintézisére képes törzsek egyszerűen kivitelezhető, gazdaságos módon izolálhatok, és ezek a törzsek termelőképességüket hosszú időn át beavatkozás nélkül megtartják.
A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi kiviteli példákkal részletesen szemléltetjük.
1. példa
a) Nebramicin-2-re rezisztens Streptomyces tenebrarius (MNG 169) izolálása
A Streptomyces tenebrarius spóráival vagy vegetatív
tenyészetével a következő összetételű, desztillált vízzel
készült táptalajt oltjuk:
dextrin 1,0%
élesztőkivonat 0,1%
kazein-hidrolizátum (10%-os) 2,0%
húskivonat 0,1%
kobalt(II)-klorid—víz (1/6) 0,001%
agar 2,0%
A táptalaj pH-ját sterilezés előtt nátriumhidroxiddal
7,2-re állítjuk be, a sterilezést 121 C° hőmérsékleten 20 percen át végezzük.
Négy napon át 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket, majd milliliterenként 5x ΙΟ7—108 spórát és 100 μg/ml 8-metoxi-pszoralént tartalmazó 7,0 pH-jú foszfát-pufferes spóraszuszpenziót készítünk, ismert módon. A spóraszuszpenziót szűrés és homogenizálás után 15 W-os fényforrásból eredő ultraibolya fénnyel besugározzuk, a fényforrás és a szuszpenzió felületének távolsága 20 cm. A 3 percig tartó kezelés közben 10 másodpercként mintákat veszünk, amiket megfelelő hígítást követően a fentiekben megadott összetételű, továbbá 2, 5, 10 és 20 mg/ml nebramicin-2-vel kiegészített szilárd halmazállapotú táptalajokon szélesztünk.
Négy napon át 37 C° hőmérsékleten növekvő és spórázó telepeket hasonló összetételű és azonos mennyiségű nebramicin-2-t tartalmazó ferdeagarokra oltjuk, majd 37 C° hőmérsékleten négy napon át inkubáljuk őket. Kontroll vizsgálatokra izoláljuk és tenyésztjük a nebramicin-2-t nem tartalmazó táptalajon kinőtt telepek egy részét is.
A kinőtt tenyészetekkel az ld példában megadottak szerint eljárva rázott tenyészeteket oltunk, majd a fermentációt követően vizsgáljuk a fermentlevek össz-hatóanyag tartalmát, és közelítő pontossággal meghatározzuk a termelt antibiotikum-keverék összetételét.
A legtöbb antibiotikumot a legelőnyösebb összetételben bioszintetizáló törzsekkel megismételjük az előzőekben ismertetett, mutációt kiváltó és a nebramÍcin-2-veI szembeni rezisztenciát fokozó kezelést, majd az izolált törzsek termelőképességét ismételten vizsgáljuk. A nagy mennyiségű nebramicin-5'-t és nebramicin-2-t termelő törzseket felhasználásig hűtve tároljuk.
A mutációs kezelés nélkül szélesztett, továbbá az ultraibolya fénnyel 8-metoxi-pszoralén jelenlétében besugárzott és nebramicin-2-mentes, illetve nebramicin-2-t tartalmazó táptalajon való növesztést követően izolált törzsek termelőképességét az 1. táblázatban adjuk meg.
1. táblázat
A nebramicin-2 jelenlétében növekvő Streptomyces tenebrarius törzs termelőképessége
Kezelt A vizsgált telepek száma (db) A tíz legjobban termelő törzs átlagos termelőképessége* (pg/ml) A termelt nebramicin-komplex átlagos komponens-összetétele (%)* * Termelőképesség a kontroll ’/.-ában
nebramicin-2 nebramicin-4 nebramicin-5'
Kiindulási törzs (kontroll) Első UV-kezelést követő 140 2950 51 35 14 100
aj szélesztés táptalajon b) szélesztés apramicint 21 3010 47 38 15 102
tartalmazó táptalajon Második UV-kezelést követő 92 5480 62 14 24 185
a) szélesztés táptalajon b) szélesztés apramicint 19 3420 52 32 16 116
tartalmazó táptalajon 86 9040 68 12 20 306
* A biológiai értékmérést Bacillus subtilis ATCC 6633 mikroorganizmussal és nebramicin-komplex standard anyagot használva végeztük. A standard 3:1:1 arányban tartalmazott nebramicin-2-t, nebramicin-4-et és nebramicin-5'-t.
* * A komplex komponens-összetételét kvantitatív vékonyrétegkromatográfiát követő bioautográfiával határoztuk meg. A szilikagél (Merek, Darmstadt, NSZK) vékonyrétegre 0,1-0,5 pg/ml közötti mennyiségű antibiotikumot cseppentettünk, majd futtatóelegyként etilalkohol, metil-etil-keton és 25%-os ammóniumhidroxid 1:1:1 arányú elegyét használva kromatografáltunk. A géi teljes száradása után Bacillus subtilis ATCC 6633 mikroorganizmust tartalmazó táptalajt rétegeztünk a szilikagél felületére és inkubáció utáni standard-del összehasonlítva, meghatároztuk a gátlási zónák nagyságát.
A táblázatból látható, hogy a nebramicin-2-t tartalmazó táptalajon növesztett mikroorganizmusok termelőképessége az első kezelést követően átlagosan 1,85szorosra, a második kezelés után 3,1-szeresre emelkedett a kiindulási törzs termelőképességéhez viszonyítva. A nebramicin-2-vel nem kezelt törzsek az első ultraibolya besugárzás után mindössze 2%-kal, a második besugárzás után 16%-kal több antibiotikumot szintetizáltak. Kitűnik a táblázatból az is, hogy a nebramicin-2re rezisztens törzsekkel kapott antibiotikum-keverék komponensaránya a nebramicin-2 és a nebramicin-5' javára változott.
A legelőnyösebb tulajdonságokkal rendelkező MNG 169 jelű törzset további felhasználásig hűtve tároljuk.
b) Nebramicin-2-re rezisztens Streptomyces tenebrarius (MNG 170) izolálása
Megismételjük az la példában megadott eljárás szerint az UV-kezelést, izolálást és az izolált telepek rázott tenyészetben kivitelezett minősítését.
A legtöbb antibiotikum-komplexet a legelőnyösebb összetételben bioszintetizáló törzseket az la példában megadott összetételű és nullától 30 mg/ml-ig növekvő mennyiségű apramicín-2-t tartalmazó ferdeagarokra oltjuk. Négy napon át 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket, majd a legtöbb antibiotikumot tartalmazó ferdeagarról újra sorozatos átoltást végzünk. Négyszer megismételjük az inkubációt és a sorozatos átoltásokat, ezt követően vizsgáljuk a legtöbb nebramicin-2 jelenlétében növekvő és légmicéliumokat fejlesztő tenyészetek termelőképességét. A fermentációt az ld példában megadottak szerint végezzük.
Kontrollként vizsgáljuk a nebramicin-2-vel nem kezelt, de ugyancsak ötször átoltott és növesztett törzs termelőképességét.
A nebramicin-2-vel nem kezelt, illetve egy UV-kezelést követően nebramicin-2-t tartalmazó táptalajon ötször átoltott törzsek termelőképességét és a termelt nebramicin-komplex összetételét a 2. táblázatban adjuk meg.
A táblázat adataiból látható, hogy a nebramicin-2-vel végzett kezelés eredményeképpen a törzs termelőképessége 2,4-szeresére fokozódott és a termelt antibiotikum-komplex összetétele előnyösen változott. Az izolált törzsek közül egyet, melynek különösen nebramicin-2 termelése volt kiemelkedő, MNG 170 sorszámmal letétbe helyeztünk az Országos Közegészségügyi Intézet Nemzeti Törzsgyűjteményében.
2.táblázat
A nebramicin-2 jelenlétében növekvő Streptomyces tenebrarius termelőképessége
Kezelés módja A vizsgált telepek száma (db) Az öt legjobban termelő törzs átlagos termelőképessége* (pg/ml) A termelt nebramicin-komplex átlagos komponens-összetétele Termelés a kiindulási törzs termelőképes1^ SVgíUvA %-ában
nebramicin-2 nebramicin-4 (%)** nebramicin-5'
Kiindulási törzs (1. kontroll) 1 3020 57 26 17 100
Kezelés nélkül (2. kontroll) 28 2880 58 28 14 95,4
UV-besugárzott és apramicinnel
egyszer kezelt törzsek 44 3925 65 10 25 130
□V-besugárzott és apramicinnel
ötször kezelt törzsek 32 7350 71 5 24 243
* A biológiai értékmérést Bacillus subtilis ATCC 6633 mikroorganizmussal és az la példában leírt nebramicin-komplex standard anyagot használva végeztük.
** A komplex komponens-összetételét kvantitatív vékonyrétegkromatográfiát követő bioautográfiával határoztuk meg, az la példában leírt módon.
ej Nebramicin-5'-re vagy nebramicin-6-ra rezisztens 50 d) Nebramicin-2 és nebramicm-5' előállítása rázott Streptomyces tenebrarius izolálása lombikban
Az la példában megadott eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy nebramicin-2 helyett nebramicin-5'-t vagy nebramicin-6-ot használunk. Ilyen módon olyan törzsekhez jutunk, amelyek 25 mg/ml nebramicin-5' vagy nebramicin-6 jelenlétében erőteljesen nőnek és légmicéliumokat fejlesztenek. A legjobban termelő törzsek tenyészlevében átlagosan 1,35-szor több nebramicin-komplex halmozódik fel, mint a kiindulási 60 törzs táptalajában. A bioszintetizált antibiotikum-komplex átlagos, bioautográfiával meghatározott összetétele: 56% nebramicin-2, 17% nebramicin-4 és 25% nebramicin-5'. A komplex körülbelül 1%-nyi mennyiségű más, biológiailag aktív vegyületeket tartalmaz. 65
Az la példában megadott módon izolált, nebramicin-2 jelenlétében növekvő, az la példában megadott táp55 talajon fenntartott Streptomyces tenebrarius MNG 169 törzzsel az alábbi összetételű, 500 ml térfogatú Erienmeyer-lombikokban sterilezett, 100 ml, csapvízzel készült táptalajt oltjuk:
szójaliszt 3,0% kazein-hidrolizátum (10%-os) 5,0% ammóniumklorid 0,5% ammóniumnitrát 0,1% kalciumkarbosát 0,3% magnéziumszulfát 04% kobaltnitrát 0,001%
L-glutamin 0,3% pálmaolaj és lenolaj 1: 1 arányú elegye 3,0% glükóz (külön, 50%-os oldatként sterilezve) 4,0%
A táptalaj pH-ját sterilezés előtt nátriumhidroxiddal 7,2-re állítjuk be, a sterilezést 121 C° hőmérsékleten 20 percen át autoklávban végezzük.
A tenyésztést 4 cm kitéréssel, percenként 260-at forduló síkrázógépen végezzük 120 órán át, 37 C° hőmérsékleten.
100 ml tenyészlé pH-ját oxálsavval 2,5-re állítjuk be. A Ca+ +-mentes szűrletet ammónium-ciklusú, 200 mesh szemcseméretű Amberlite CG—50 gyantából (Fluka AG., Svájc) készült 1 cm átmérőjű és 12 cm magasságú kromatografáló oszlopra öntjük, majd ion-mentes vízzel mossuk. Az antibiotikumokat lineáris grádiens-elúcióval eluáljuk, törzsoldatként 120 ml 0,05 N és 120 ml 0,35 N ammóniumhidroxidot használunk. Az eluálás sebessége 6—8 ml/óra. 1,5 ml térfogatú frakciókat különítünk el. A bioautográfiás vizsgálat szerint azonos antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson, 60 C° hőmérsékleten szárazra pároljuk. A termékeket súlyállandóságig szárítjuk, majd megmérjük súlyukat.
A mérések szerint 100 ml tenyészlében 520 mg nebramicin-2 és 142 mg nebramicin-5' van, 18 mg nebramícin-4 mellett.
Nem rezisztens törzzsel végezve a tenyésztést olyan fermentleveket kapunk, amelyek 100 ml-éből 142 mg nebramicin-2-t, 37,6 mg nebramicin-5'-t és 57 mg nebramicin-4-et izolálhatunk.
2. példa
Nebramicin-2-t, nebramicin-5'-t és nebramicin-4-et tartalmazó tenyészlevek előállítása laboratóriumi fermentorban
Az la példában megadottak szerint izolált és rázott
tenyészetekben az ld példa szerinti módon kivitelezett fermentáció eredményei (biológiai értékmérés, bioautográfia és oszlopkromatográfiás izolálás) alapján kiválasztott MNG 169 jelű Streptomyces tenebrarius törzzsel az alábbi összetételű, 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokban sterilezett, 100 ml térfogatú, csapvízzel készült
táptalajt oltjuk:
szójaliszt 2,0%
kazein-hidrolizátum (10%-os) 3,0%
ammónium-nitrát 0,1%
ammónium-klorid 0,3%
kalcium-karbonát 0,3%
magnézium-szulfát pálmaolaj és lenolaj 1: 1 arányú 0,5%
elegye glükóz (külön, 50%-os oldatként 3,0%
sterilezve) 2,0%
A táptalaj pH-ját nátriumhidroxiddal 7,2-re állítjuk be, a sterilezést autoklávban, 121 C° hőmérsékleten, 20 percen át végezzük.
A tenyésztést 16 órán át sikrázógépen folytatjuk, a 16. órában megvizsgáljuk az inokulumot. A mikroszkópi képben erőteljes növekedés látszik, fragmentált micéliumok észlelhetők. A tenyészet pH-ja 6,8—7,0.
Az így kapott oltóképes inokulummal 10 liter hasznos térfogatú laboratóriumi üvegfermentorban 121 C° hőmérsékleten, 45 percen át sterilezett, 5 liter térfogatú, az alábbiakban megadott összetételű, csapvízzel készült táptalajtoltunk:
szójaliszt 3,0%
kazein-hidrolizátum (10%-os) 5,0%
ammónium-nitrát 0,1%
ammónium-klorid 0,5%
L-glutaminsav 0,3%
kalcium-karbonát 0,5%
magnézium-szulfát 0,5%
kobalt(ll)-nitrát 0,001%
pálmaolaj és lenolaj 1:1
arányú elegye 3,0%
glükóz (külön, 50%-os oldatként
sterilezve) 4,4%
A táptalaj pH-ját sterilezés előtt nátriumhidroxiddal 7,2-re állítjuk be.
A fermentáció közben mérjük a biológiai aktivitást, bioautográfiával vizsgáljuk a termelt antibiotikumkomplex faktorösszetételét és a szénforrás fogyását. A fermentáció 96. órájában a tenyészlében nincs glükóz. A 120. órában erőteljesen fragmentált tenyészet látszik a mikroszkópi képben, később gyenge szekunder növekedés észlelhető. A tenyészet biológiai aktivitása a 120. órában éri el a maximumot; vékonyréteg kromatográfiás vizsgálat szerint ekkor 100 milliliterenként 420 mg nebramicin-2-t és 90 mg nebramicin-5'-t tartalmaz, nebramicin-4 mellett.
A fermentlé pH-ját 50%-os vizes kénsavval 2-re állítjuk be. Ezután a mikroorganizmus sejtjeit leszűrjük, és a szűrőn 1,5 liter vízzel átmossuk. A szűrletet és a mosóiét egyesítjük, és a kapott oldat pH-ját 25%-os ammóniumhidroxiddal 7-re állítjuk. Ezután a semlegesített oldat pH-ját keverés közben oxálsavval 2,5-re állítjuk be. A megsavanyított oldatot 20 percig keverjük, majd pH-ját 25%-os ammóniumhidroxiddal 7,5-re állítjuk, és a csapadékos oldatot leszűrjük. Az így kapott
5,1 liter szűrletet 3,6 cm átmérőjű, 60 cm magas, ammónium-ciklusú Wofatit CP—300-as ioncserélő oszlopon (VEB Farbenfabrik, Német Demokratikus Köztársaság) folyatjuk át. Az ioncserélő oszlopot először ionmentes vízzel kimossuk, majd 4 liter 0,15 n ammóniumhidroxiddal, ezután 2 liter 1 n ammóniumhidroxiddal eluáljuk 200 ml-es frakciókat gyűjtve. A frakciók antibiotikum-tartalmát rétegkromatográfiás módszerrel analizáljuk az la példában leírt adszorbens réteget és kifejlesztő elegyet, valamint ninhidrines előhívást alkalmazva. A 4—19. frakciókat 80 C°-on, csökkentett nyomáson 300 ml térfogatúra bepároljuk. A kapott sűrítményt 1 g aktívszénnel kezelve derítjük, majd szűrés után csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. így 23,5 g nebramicin-2 bázis nyersterméket kapunk, melyet etanol és víz 7:1 arányú elegyéből átkristályosítva 17,1 g tiszta nebramicin-2 bázishoz jutunk. A 20—27. frakciókat 80 C°-on csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. így 6 g antibiotikum-keveréket kapunk, melynek főkomponense nebramicin-5' de a rétegkromatográfiás analízis szerint jelentős mennyiségben tartalmaz nebramicin-4-et és nebramicin-2-t is. Ezt a bepárlási maradékot 60 ml vízben oldjuk, majd 40 ml 1 n nátriumhidroxiddal 90 C°-on 2 órán át hidrolizáljuk. Szobahőmérsékletre való lehűlés után a reakcióelegy pH-ját 7,5 értékre állítjuk be 50% vizes kénsavval, majd 800 mg aktívszénnel derítjük, és ezt követően szűrjük, A kiszűrt aktívszenet 2x15 ml vízzel mossuk. A mosófolyadékkal egyesített szűrletet 2,8 cm átmérőjű 40 cm magas Amberlite CG—50—I ioncserélő oszlopra (Fluka AG., Svájc) rétegezzük. Az oldat beszívódása után az oszlopot ionmentes vízzel kimossuk, majd 800 ml 0,125 n, 800 ml 0,15 n, 800 ml 0,175 n, 800 ml 0,2 n és 800 ml 0,3 n ammóniumhidroxiddal eluáljuk 100 ml-es frakciókat gyűjtve. Ezután a nebramicin-2-t, a nebramicin-5-öt (kanamicin B) és a nebramicin-6-ot a rétegkromatográfiás analízis szerint egységesen tartalmazó frakciókat 80 C°-on, csökkentett nyomáson bepároljuk. A 4—12. frakciókból 0,8 g nebramicin-2 bázist, a 21—27. frakciókból 1,15 g nebramicin-5 (kanamicin-B) bázist és a 30—38. frakciókból 3,25 g nebramicin-6 bázist kapunk. Az így előállított nebramicin-6 bázist metanolból átkristályosítva 2,7 g analitikai tisztaságú nebramicin-6 bázishoz jutunk.
3. példa
Nebramicin-2 előállítása laboratóriumi üvegfermentorban
A 2. példában megadott fermentációs eljárást ismételjük meg az MNG 170 sorszámú törzzsel. A vékonyréteg kromatográfiás vizsgálat szerint az előállított fermentlé 100 milliliterenként 560 mg nebramicin-2-t tartalmaz, kevés nebramicin-5' mellett.
A fermentáció befejezése után a fermentlé pH-ját oxálsavval 2 értékre állítjuk be, a megsavanyított fermentlét 20 percig keverjük. Ezután a mikroorganizmus sejtjeit és a kivált kalciumoxalátot szüljük, majd a szűrőn 1,5 liter vízzel mossuk. A szűrletet és a mosóiét egyesítjük. Az egyesített oldat pH-ját 25%-os ammóniumhidroxiddal 7,5-re állítjuk be, majd szűrjük. A kapott 4,9 liter szűrletet 4 cm átmérőjű, 40 cm Bagas ammónium-formájú Wofatit CP—300-as ioncserélő oszlopon folyatjuk át. Ezután az ioncserélő oszlopot ionmentes vízzel kimossuk, majd 5 liter 0,12 n ammóniumhidroxiddal és ezt követően 1 liter 1 n ammóniumhidroxiddal eluáljuk, 200 ml-es frakciókat gyűjtve. A frak ciók antibiotikum-tartalmát rétegkromatográfiás módszerrel analizáljuk az la példában leírt adszorbens réteget és kifejlesztő elegyet, valamint ninhidrines előhívást alkalmazva. Az egységesen nebramicin-2-t tartalmazó 5—23. frakciókat bepárolva 27,3 g nebramicin-2 bázis nyersterméket kapunk, melyet etanol és víz 7:1 arányú elegyböl átkristályosítva 22,1 g tiszta nebramicin-2 bázishoz jutunk.

Claims (3)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Eljárás nebramicin-2, nebramicin-5' és nebramicin-4 előállítására mikrobiológiai úton Streptomyces tenebrarius törzs felhasználásával, azzal jellemezve, hogy nebramicin-komplexet bioszintetizáló Streptomyces tenebrarius törzset nebramicin-2-t (apramicint) vagy nebramicin-5'-t (6-0-karbamoil-tobramicint) vagy nebramicin-6-ot (tobramicint) tartalmazó táptalajon tenyésztünk, a 10 mg/ml és 30 mg/ml közötti, előnyösen 20 mg/ml mennyiségű nebramicin-2 és/vagy nebramicin-5' és/vagy nebramicin-6 jelenlétében növekvő, légmicéliumot fejlesztő és spórázó egyedeket elkülönítjük, az így kapott új, rezisztens törzseket, előnyösen az MNG 169 és MNG 170 sorszámmal letétbe helyezett mikroorganizmusokat, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között nitrogén- és szénforrást, szervetlen sókat és adott esetben növényi és/vagy állati eredetű zsírokat és/vagy olajokat tartalmazó táptalajon, előnyösen 35 C° és 38 C° közötti hőmérsékleten tenyésztjük, majd a tenyészetben felhalmozódó nebramicin komplexet vagy adott esetben a nebramicin-2-t, nebramicin-4-et (6-0-karbamoil-kanamicin-B) és nebramicin-5'-t ismert módon elkülönítjük.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a fermentációt nitrogén forrásként szójalisztet, kazeint, aminosavakat, aminosav-származékokat és szervetlen sókat, szénforrásként glükózt és növényi és/vagy állati eredetű zsírokat és/vagy olajokat tartalmazó táptalajon végezzük.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítás! módja, azzal jellemezve, hogy növényi olajként lenolaj és pálmaolaj elegyét használjuk.
HU78GO1404A 1978-05-23 1978-05-23 Microbiological process for producing nebramycin complex HU176103B (en)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU78GO1404A HU176103B (en) 1978-05-23 1978-05-23 Microbiological process for producing nebramycin complex
AT0357279A AT363180B (de) 1978-05-23 1979-05-15 Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von nebramycin-komplex
FR7912950A FR2426736B1 (fr) 1978-05-23 1979-05-22 Procede de fabrication du complexe de nebramycine par voie microbiologique
DE19792921022 DE2921022A1 (de) 1978-05-23 1979-05-23 Verfahren zur mikrobiologischen herstellung des nebramycin-komplexes

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU78GO1404A HU176103B (en) 1978-05-23 1978-05-23 Microbiological process for producing nebramycin complex

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU176103B true HU176103B (en) 1980-12-28

Family

ID=10996858

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU78GO1404A HU176103B (en) 1978-05-23 1978-05-23 Microbiological process for producing nebramycin complex

Country Status (4)

Country Link
AT (1) AT363180B (hu)
DE (1) DE2921022A1 (hu)
FR (1) FR2426736B1 (hu)
HU (1) HU176103B (hu)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1178489A (en) * 1967-04-04 1970-01-21 Lilly Co Eli Tenebrimycin Antibiotics
US3691279A (en) * 1970-04-15 1972-09-12 Lilly Co Eli Antibiotic nebramycin and preparation thereof
US3853709A (en) * 1970-10-26 1974-12-10 Lilly Co Eli Process for preparing nebramycin factors ii and vii
US3876767A (en) * 1972-02-04 1975-04-08 Lilly Co Eli Treatment of swine dysentery with apramycin
US4032404A (en) * 1976-07-14 1977-06-28 Bristol-Myers Company Fermentation process for producing apramycin and nebramycin factor V'

Also Published As

Publication number Publication date
FR2426736B1 (fr) 1985-08-09
ATA357279A (de) 1980-12-15
DE2921022C2 (hu) 1987-10-15
FR2426736A1 (fr) 1979-12-21
DE2921022A1 (de) 1979-11-29
AT363180B (de) 1981-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI78469B (fi) Foerfarande foer framstaellning av n-substituerade 1-desoxinojirimycinderivat.
SU1036251A3 (ru) Способ получени антибиотика @ -15003 @ -3
PETERSEN et al. Production of cladospirone bisepoxide, a new fungal metabolite
US3716579A (en) Ester derivatives of pleuromutilin
RU2196826C2 (ru) Способ биотрансформации соединений колхициноидов в соответствующие 3-гликозилпроизводные
EP0048585A1 (en) Antibiotics TM-531 B and TM-531 C
Slechta et al. Isolation and characterization of a new antibiotic U-62162
JPS63139191A (ja) 抗腫瘍抗菌剤
JPS61148189A (ja) Ｃｌ−１５７７ｄおよびｃｌ−１５７７ｅ抗生／抗腫瘍化合物およびそれらの製法
US2885433A (en) O-carbamyl-d-serine
US3592925A (en) Antibiotics ah272alpha2 and ah272beta2 and process for producing same
HU176103B (en) Microbiological process for producing nebramycin complex
US5070191A (en) Demethylallosamidin and a process for production thereof
CA1154393A (en) Antibiotic em 4940
Venkata Dasu et al. Studies on production of griseofulvin
EP0042172B1 (en) Antibiotic compounds, pharmaceutical compositions containing such compounds, process for production thereof
CS221839B2 (en) Method of making the tylactone
US4239690A (en) Antibiotics produced by Cytospora sp. W.F.P.L. 13A
US4339535A (en) Process for preparing antibiotic EM 4940
US4220718A (en) Antibiotics produced by Cytospora sp. W.F.P.L. 13A
US3901880A (en) (s)-alanyl-3-(+60 -(s)-chloro-3-(s)-hydroxy-2-oxo-azetidinylmethyl)-(s)-alanine
US5364623A (en) Antibiotic produced by Bacillus subtilis ATCC 55422 capable of inhibiting bacteria
US3835170A (en) Hypotensive agent, oudenone, its salts and processes for production and preparation thereof
SU352469A1 (ru) Способ получения антибиотического комплекса
US4298599A (en) Novel antibiotic BN-235 substance, and process for the production thereof

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee