JPH0779698B2 - 安全性の高い多機能クロ−ニングベクタ− - Google Patents
安全性の高い多機能クロ−ニングベクタ−Info
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- JPH0779698B2 JPH0779698B2 JP60216209A JP21620985A JPH0779698B2 JP H0779698 B2 JPH0779698 B2 JP H0779698B2 JP 60216209 A JP60216209 A JP 60216209A JP 21620985 A JP21620985 A JP 21620985A JP H0779698 B2 JPH0779698 B2 JP H0779698B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/78—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Pseudomonas
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は多機能クローニングベクターに関する。更に詳
しくは本発明は、バチルス・サチルス(以後バチルスと
略す)、エッセリシア・コリ(以後イーコリと略す)お
よびシュードモナス・エルギノサ(以後シュードモナス
と略す)のいずれの菌腫間においても機能する複製起源
および抗生物質に対する耐性をもたらす二種以上のDNA
セグメントを含有する多機能クローニングベクターに関
する。更にまた、本発明はこれらのベクターの組替え体
にも関する。
しくは本発明は、バチルス・サチルス(以後バチルスと
略す)、エッセリシア・コリ(以後イーコリと略す)お
よびシュードモナス・エルギノサ(以後シュードモナス
と略す)のいずれの菌腫間においても機能する複製起源
および抗生物質に対する耐性をもたらす二種以上のDNA
セグメントを含有する多機能クローニングベクターに関
する。更にまた、本発明はこれらのベクターの組替え体
にも関する。
遺伝子工学の発展に伴い、種々のクローニングベクター
が知られているが、複数の微生物,例えばバチルス,イ
リーコ,およびシュードモナスで選択し得る多機能クロ
ーニングベクターは一般的に存在しない。僅かにその一
種である多機能クローニングベクターは、ストレプトマ
イセス,バチルスおよびイーコリ(特開昭58−134100
号),あるいはコリネバクテリウムおよびブレビバクテ
リウム(特開昭58−105999号)などにおいて知られてい
るにすぎない。
が知られているが、複数の微生物,例えばバチルス,イ
リーコ,およびシュードモナスで選択し得る多機能クロ
ーニングベクターは一般的に存在しない。僅かにその一
種である多機能クローニングベクターは、ストレプトマ
イセス,バチルスおよびイーコリ(特開昭58−134100
号),あるいはコリネバクテリウムおよびブレビバクテ
リウム(特開昭58−105999号)などにおいて知られてい
るにすぎない。
本発明は従来知られていない新規な多機能クローニング
ベクター、即ちバチルス,シュードモナス、イーコリに
おいて機能し、各々の菌において二種以上の薬剤耐性を
発現できるベクターを提供しようとするものである。
ベクター、即ちバチルス,シュードモナス、イーコリに
おいて機能し、各々の菌において二種以上の薬剤耐性を
発現できるベクターを提供しようとするものである。
遺伝子工学におけるベクターの重要性はPecombinant Mo
lecules;Impact on Science and Society Miles Intern
ational Symposium Series No.10 edited by R.F.Beers
Raven Press.New York,(1977)に明解に記載されてい
る。
lecules;Impact on Science and Society Miles Intern
ational Symposium Series No.10 edited by R.F.Beers
Raven Press.New York,(1977)に明解に記載されてい
る。
イーコリにおいてはプラスミドベクターが応用面で頻繁
に使用されており、代表的なプラスミドベクターとして
pBR322をあげることができる。pBR322を例にとりその利
点を列記すれば次のように記す事ができる。(1)細胞
中で多数のコピーで存在する為、分離取得が容易であ
る。(2)分子量が小さく、種々の制限酵素の切断部位
が1ケ所に限定されるため、複製能を損なうことなくDN
A断片をクローン化することが容易に可能である。
(3)プラスミド上に存在するアンピシリン耐性および
テトラサイクリン耐性遺伝子を選択マーカーとして利用
できるので、プラスミド保有菌の選別が可能である。
(4)プラスミド分子中の唯一の切断点として、アンピ
シリン耐性遺伝子内に制限酵素PstI、テトラサイクリン
耐性遺伝子内に制限酵素BamHI,HindIIIおよびSalIによ
る切断点があり、これらの切断部位へ他のDNA断片が組
み込まれると、薬剤耐性遺伝子が分断され、薬剤感受性
を示すようになる(挿入失活化)ため、1つの薬剤耐性
でプラスミド保有菌を選択し、しかる後に他方の薬剤へ
の感受性を確認することによって組換え体保有の簡便な
検出が可能である。〔Bolivar.F.et al.;Gene,2,95(19
77)参照〕。イーコリではその他種々の特性を有するプ
ラスミドベクターが数多く作製されている。
に使用されており、代表的なプラスミドベクターとして
pBR322をあげることができる。pBR322を例にとりその利
点を列記すれば次のように記す事ができる。(1)細胞
中で多数のコピーで存在する為、分離取得が容易であ
る。(2)分子量が小さく、種々の制限酵素の切断部位
が1ケ所に限定されるため、複製能を損なうことなくDN
A断片をクローン化することが容易に可能である。
(3)プラスミド上に存在するアンピシリン耐性および
テトラサイクリン耐性遺伝子を選択マーカーとして利用
できるので、プラスミド保有菌の選別が可能である。
(4)プラスミド分子中の唯一の切断点として、アンピ
シリン耐性遺伝子内に制限酵素PstI、テトラサイクリン
耐性遺伝子内に制限酵素BamHI,HindIIIおよびSalIによ
る切断点があり、これらの切断部位へ他のDNA断片が組
み込まれると、薬剤耐性遺伝子が分断され、薬剤感受性
を示すようになる(挿入失活化)ため、1つの薬剤耐性
でプラスミド保有菌を選択し、しかる後に他方の薬剤へ
の感受性を確認することによって組換え体保有の簡便な
検出が可能である。〔Bolivar.F.et al.;Gene,2,95(19
77)参照〕。イーコリではその他種々の特性を有するプ
ラスミドベクターが数多く作製されている。
一方、イーコリ以外の工業的に有用な微生物、例えばア
ミラーゼ生産菌であるバチルス、抗生物質生産菌である
ストレプトマイセス、各種有害廃棄物等を分解するシュ
ードモナス等でも遺伝子工学技法が開発されており、各
菌におけるベクターも取得されている。しかしながら、
これらの宿主菌を用いた実用的な応用例は少なく、応用
を遅らせている原因の1つとして、これらの菌種ではイ
ーコリ程有利なプラスミドベクターがないことをあげる
ことができる。同じ原核生物であるにもかかわらず、グ
ラム陽性のバチルスではイーコリの遺伝子は形質発現で
きないというのが通説になっている。プラスミドベクタ
ーが保有している遺伝子の遺伝的発現は、その遺伝子が
導入される細胞の遺伝的背景によって制限を受け、また
影響される。たとえばイーコリの薬剤耐性遺伝子をバチ
ルスのプラスミドに連結した形でバチルスに導入して
も、その組換え体プラスミドは複製するが、イーコリの
薬剤耐性は形質発現しない。〔Kreft.J.,et al.;Molec.
Gen,Genet,162 59(1978)Schottel,J.L.et al,;J.Bact
eriol.,146 360(1981)〕またイーコリのベクターであ
るpBR322,pACYC184等はシュードモナスに形質転換でき
ない。〔“Plasmid of Medical,Environmental and Com
mercial Importance"(K.N.Timmis and A.P hler,eds)
PP.411−422〕というようなこともあるため、これらの
菌種を宿主菌として用いた実用的な応用が少ないものと
考えられる。
ミラーゼ生産菌であるバチルス、抗生物質生産菌である
ストレプトマイセス、各種有害廃棄物等を分解するシュ
ードモナス等でも遺伝子工学技法が開発されており、各
菌におけるベクターも取得されている。しかしながら、
これらの宿主菌を用いた実用的な応用例は少なく、応用
を遅らせている原因の1つとして、これらの菌種ではイ
ーコリ程有利なプラスミドベクターがないことをあげる
ことができる。同じ原核生物であるにもかかわらず、グ
ラム陽性のバチルスではイーコリの遺伝子は形質発現で
きないというのが通説になっている。プラスミドベクタ
ーが保有している遺伝子の遺伝的発現は、その遺伝子が
導入される細胞の遺伝的背景によって制限を受け、また
影響される。たとえばイーコリの薬剤耐性遺伝子をバチ
ルスのプラスミドに連結した形でバチルスに導入して
も、その組換え体プラスミドは複製するが、イーコリの
薬剤耐性は形質発現しない。〔Kreft.J.,et al.;Molec.
Gen,Genet,162 59(1978)Schottel,J.L.et al,;J.Bact
eriol.,146 360(1981)〕またイーコリのベクターであ
るpBR322,pACYC184等はシュードモナスに形質転換でき
ない。〔“Plasmid of Medical,Environmental and Com
mercial Importance"(K.N.Timmis and A.P hler,eds)
PP.411−422〕というようなこともあるため、これらの
菌種を宿主菌として用いた実用的な応用が少ないものと
考えられる。
イーコリで頻繁に使用されているプラスミドベクターpB
R322またはpCRI(pMBIまたはcolEIの複製起源をもつ)
は本来非伝達性であるが、伝達性プラスミドおよび第3
の非伝達性プラスミドとの3者共存により伝達されるこ
とが知られており、(“Current Chemotherapy and Imm
unotherapy"Proceedings of the 12th International C
ongress of Chemotherapy VoI.1 p6)、ベクターのもつ
薬剤耐性および組換え体のもつ未知遺伝子は伝播拡散す
る恐れがあり危険であり、安全性の面からベクターとし
ては不適である。
R322またはpCRI(pMBIまたはcolEIの複製起源をもつ)
は本来非伝達性であるが、伝達性プラスミドおよび第3
の非伝達性プラスミドとの3者共存により伝達されるこ
とが知られており、(“Current Chemotherapy and Imm
unotherapy"Proceedings of the 12th International C
ongress of Chemotherapy VoI.1 p6)、ベクターのもつ
薬剤耐性および組換え体のもつ未知遺伝子は伝播拡散す
る恐れがあり危険であり、安全性の面からベクターとし
ては不適である。
イーコリの系で開発されているほとんどのプラスミドベ
クターは、その複製起源の由来が、ColEI,pMBI,p15A,R6
−5に限られている。この為、生産物の増量および遺伝
子の相互作用を検討するにあたり、複数のプラスミドベ
タターを1個の細胞に入れる必要が生じた時、不和合性
の問題が生じ、(即ち、宿主内で安定に共存できず、ベ
クタープラスミドの宿主からの脱落が起こる。)その目
的が達し得ない場合があった。
クターは、その複製起源の由来が、ColEI,pMBI,p15A,R6
−5に限られている。この為、生産物の増量および遺伝
子の相互作用を検討するにあたり、複数のプラスミドベ
タターを1個の細胞に入れる必要が生じた時、不和合性
の問題が生じ、(即ち、宿主内で安定に共存できず、ベ
クタープラスミドの宿主からの脱落が起こる。)その目
的が達し得ない場合があった。
ベクターとして、シュードモナスでこれまでよく使われ
ているRP−4は、分子量が38Mdと大きな伝達性プラスミ
ドであり、ベクターとしては好ましいものではない。ま
たRP−4は複製に必要な遺伝情報がプラスミド分子上に
分散しているため、小さいベクター用のプラスミドとす
る事は困難である。わずかにRSF1010およびRlb679(5.5
Md)が報告されているが、使い易い制限酵素による挿入
失活法という点からは満足できるものではない。
ているRP−4は、分子量が38Mdと大きな伝達性プラスミ
ドであり、ベクターとしては好ましいものではない。ま
たRP−4は複製に必要な遺伝情報がプラスミド分子上に
分散しているため、小さいベクター用のプラスミドとす
る事は困難である。わずかにRSF1010およびRlb679(5.5
Md)が報告されているが、使い易い制限酵素による挿入
失活法という点からは満足できるものではない。
バチルスは、 (a)抗生物質ブチロシン,ポリミキシン等の生産菌で
ある。
ある。
(b)アンダーゼ,プロテアーゼ等の生産菌である。
(c)菌体外酵素生産菌として工業的にも重要である。
(d)宿主菌であるバチルスはヒトに寄生しないので遺
伝子操作における異種DNA受容菌として安全性が高い,
という特色があることが知られている。しかるにベクタ
ーの開発は遅れ、いまだに実用化されるには至っていな
い。この原因としては、イーコリの薬剤耐性がバチルス
では発現しない為イーコリの薬剤耐性マーカーをバチル
スにそのまま使用できないことが掲げるれる。また、コ
ンピテントセルを用いた形質転換の効率がイーコリの系
に比べて1μgDNA当たり102〜103も低く、形質転換効率
の改善されたプロトプラスト法は時間と習熟が必要であ
り、そのため、挿入失活法のきく、使い易い制限酵素部
位をもった薬剤マーカー等の検討が遅れたためと考えら
れる。また、バチルス−イーコリのシャトルベクターも
開発されているが(日本農芸化学会、昭和55年度大会講
演要旨集P408)、バチルスで遺伝子操作を行うには、バ
チルスではただ一種の薬剤に対する耐性の発現があるだ
けなので挿入失活法が使えず不便である。
伝子操作における異種DNA受容菌として安全性が高い,
という特色があることが知られている。しかるにベクタ
ーの開発は遅れ、いまだに実用化されるには至っていな
い。この原因としては、イーコリの薬剤耐性がバチルス
では発現しない為イーコリの薬剤耐性マーカーをバチル
スにそのまま使用できないことが掲げるれる。また、コ
ンピテントセルを用いた形質転換の効率がイーコリの系
に比べて1μgDNA当たり102〜103も低く、形質転換効率
の改善されたプロトプラスト法は時間と習熟が必要であ
り、そのため、挿入失活法のきく、使い易い制限酵素部
位をもった薬剤マーカー等の検討が遅れたためと考えら
れる。また、バチルス−イーコリのシャトルベクターも
開発されているが(日本農芸化学会、昭和55年度大会講
演要旨集P408)、バチルスで遺伝子操作を行うには、バ
チルスではただ一種の薬剤に対する耐性の発現があるだ
けなので挿入失活法が使えず不便である。
本発明者らは、グラム陽性菌であるバチルス及びグラム
陰性菌であるシュードモナス及びイーコリで複製が可能
であり、各々の菌種で、プラスミド保有菌の選別を容易
にする遺伝子マーカーである薬剤耐性につき鋭意検討し
てきた。その結果、プロテウス・ミラビリス由来のプラ
スミドpMS71の複製部分とバチルス・セレウス由来のプ
ラスミドpMS140−1の複製部分を同一プラスミド上に連
結する事により、グラム陽性菌と陰性菌内で複製する事
ができ、それらにグラム陽性菌の薬剤耐性を連結するこ
とにより、その薬剤耐性が個々の菌種で発現することを
見い出した。
陰性菌であるシュードモナス及びイーコリで複製が可能
であり、各々の菌種で、プラスミド保有菌の選別を容易
にする遺伝子マーカーである薬剤耐性につき鋭意検討し
てきた。その結果、プロテウス・ミラビリス由来のプラ
スミドpMS71の複製部分とバチルス・セレウス由来のプ
ラスミドpMS140−1の複製部分を同一プラスミド上に連
結する事により、グラム陽性菌と陰性菌内で複製する事
ができ、それらにグラム陽性菌の薬剤耐性を連結するこ
とにより、その薬剤耐性が個々の菌種で発現することを
見い出した。
また、本発明者らの当該プラスミドベクターをつくるに
あたって、 1:非常に幅広い宿主で複製すること。
あたって、 1:非常に幅広い宿主で複製すること。
即ち1つのベクターで発現のよい宿主を検索すること
も、1つのベクターで種々の生物由来遺伝子および遺伝
子産物の検討も行えること。
も、1つのベクターで種々の生物由来遺伝子および遺伝
子産物の検討も行えること。
2:どの宿主においても2つの薬剤耐性が発現すること。
即ちプラスミド保持菌の選別および挿入失活法が使用で
き、組換え細胞の検索が容易にできること 3:バチルスの形質転換の系でのように頻度が悪いか、あ
るいは複雑で時間がかかる操作をしなくても、頻度が良
く簡単で確実なイーコリの系で形質転換が行え、その後
好みの宿主にそのまま形質転換が行えること。
き、組換え細胞の検索が容易にできること 3:バチルスの形質転換の系でのように頻度が悪いか、あ
るいは複雑で時間がかかる操作をしなくても、頻度が良
く簡単で確実なイーコリの系で形質転換が行え、その後
好みの宿主にそのまま形質転換が行えること。
4:ベクターのコピー数が多くかつその分離取得が容易で
あり、小型のものであること。
あり、小型のものであること。
5:ベクターが安全であること(即ち、いかなるプラスミ
ドとの共存系でも可動化されないこと。) 6:組換えに使う制限酵素が使い易いものであり、プラス
ミドベクター内の(特に薬剤耐性を切断する)制限酵素
切断部位がベクター内で1ケ所存在し、組換え細胞の取
得頻度を高くすること。
ドとの共存系でも可動化されないこと。) 6:組換えに使う制限酵素が使い易いものであり、プラス
ミドベクター内の(特に薬剤耐性を切断する)制限酵素
切断部位がベクター内で1ケ所存在し、組換え細胞の取
得頻度を高くすること。
7:よく知られているイーコリのベクターpCR1,pBR322,pA
CYC184,pSC101,pMB9等と宿主細胞内で安定に共存(即
ち、不和合性を示さない)できること。
CYC184,pSC101,pMB9等と宿主細胞内で安定に共存(即
ち、不和合性を示さない)できること。
8:選択毒性の高い薬剤耐性遺伝子を選択マーカーとして
用いる。
用いる。
9:選択マーカーは、その活性を酵素量で定量できるこ
と。
と。
等を目的としベクターの開発を行い、本発明を完成し
た。
た。
尚、本発明によるプラスミドベクターは通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されており微生物の
識別のための表示および受託番号は以下のとおりであ
る。エッセリシア・コリ(Escherichia Coli(ML4901−
pMS163(Apr Sar)−微工研菌寄第8288号(FERM P−828
8),エッセリシア・コリ(Escherichia Coli)ML4901
−pMS163−2(AprKmr)−微工研菌寄第8289号(FERM P
−8289),エッセリシア・コリ(Escherichia Coli)ML
4901−pMS163−5(Apr Kmr)−微工研菌寄第8290号(F
ERM P−8290),エッセリシア・コリ(Esherichia Col
i)ML−4901−pMS505−1(AprSmr)−微工研菌寄第829
1号(FERM P−8291), エッセリシア・コリ(Esherichia Coli)ML−4901−pMS
504(AprTcr)−微工研菌寄第8292号(FERM P−829
2),エッセリシア・コリ(Esherichia Coli)ML−4901
−pMS506(SmrTCr)−微工研菌寄第8293号(FERM P−82
93)。
技術院微生物工業技術研究所に寄託されており微生物の
識別のための表示および受託番号は以下のとおりであ
る。エッセリシア・コリ(Escherichia Coli(ML4901−
pMS163(Apr Sar)−微工研菌寄第8288号(FERM P−828
8),エッセリシア・コリ(Escherichia Coli)ML4901
−pMS163−2(AprKmr)−微工研菌寄第8289号(FERM P
−8289),エッセリシア・コリ(Escherichia Coli)ML
4901−pMS163−5(Apr Kmr)−微工研菌寄第8290号(F
ERM P−8290),エッセリシア・コリ(Esherichia Col
i)ML−4901−pMS505−1(AprSmr)−微工研菌寄第829
1号(FERM P−8291), エッセリシア・コリ(Esherichia Coli)ML−4901−pMS
504(AprTcr)−微工研菌寄第8292号(FERM P−829
2),エッセリシア・コリ(Esherichia Coli)ML−4901
−pMS506(SmrTCr)−微工研菌寄第8293号(FERM P−82
93)。
本発明の有用性は、バチルス属、シュードモナス属、エ
ッセリシア属を宿主菌とする遺伝子工学のための有利な
プラスミドベクターを提供できる点にある。その主たる
利点は真核生物または原核生物で発現できる遺伝子を公
知の試験管内DNA組換え技術により組換え操作後、エッ
セリシア・コリ、シュードモナス・エルギノサ、シュー
ドモナス・プチダ、バチルス・サチルスのすべての菌種
で形質転換が可能であり、目的の形質を有する形質転換
株を選択しうる点にある。更に詳しくは、各々の薬剤に
感受性を示すそれぞれの宿主菌に、薬剤耐性を1もしく
はそれ以上付与する事が出来る為にプラスミドベクター
保持菌を容易に選択(選別)出来、更に、ストレプトマ
イシン耐性遺伝子内にある唯一のたとえばEcoRI,HindII
I,に遺伝子を挿入すればストレプトマイシン感受性を、
又、アンピシリン耐性遺伝子内にある唯一の例えばPst
I,BglIIに遺伝子を挿入すればアンピシリン感受性を示
すことにより、1つの薬剤でプラスミド保有菌を選択
し、しかる後に他方の薬剤に感受性を示す事を確認する
ことにより組換え体保有菌を簡便に検出できる点にあ
る。
ッセリシア属を宿主菌とする遺伝子工学のための有利な
プラスミドベクターを提供できる点にある。その主たる
利点は真核生物または原核生物で発現できる遺伝子を公
知の試験管内DNA組換え技術により組換え操作後、エッ
セリシア・コリ、シュードモナス・エルギノサ、シュー
ドモナス・プチダ、バチルス・サチルスのすべての菌種
で形質転換が可能であり、目的の形質を有する形質転換
株を選択しうる点にある。更に詳しくは、各々の薬剤に
感受性を示すそれぞれの宿主菌に、薬剤耐性を1もしく
はそれ以上付与する事が出来る為にプラスミドベクター
保持菌を容易に選択(選別)出来、更に、ストレプトマ
イシン耐性遺伝子内にある唯一のたとえばEcoRI,HindII
I,に遺伝子を挿入すればストレプトマイシン感受性を、
又、アンピシリン耐性遺伝子内にある唯一の例えばPst
I,BglIIに遺伝子を挿入すればアンピシリン感受性を示
すことにより、1つの薬剤でプラスミド保有菌を選択
し、しかる後に他方の薬剤に感受性を示す事を確認する
ことにより組換え体保有菌を簡便に検出できる点にあ
る。
本発明のベクターは、(1)バチルスにおいて機能する
複製起源、(2)イーコリ,シュードモナスで機能する
複製起源、(3)イーコリ,シュードモナスいずれにも
抗生物質に対する耐性を付与するDNAセグメント(4)
バチルス,イーコリ,シュードモナスいずれにも抗生物
質に対する耐性を付与するDNAセグメントを結合させる
ことによって組立てられる。(2)と(3)を組合せる
ことにより、イーコリ,シュドモナスで複製し、両方の
菌で抗生物質に対する耐性を発現するプラスミドが得ら
れる。また(1)と(2)とを組合わせることにより、
イーコリ,バチルス,シュードモナスで複製するプラス
ミドが得られる。(1)と(2)の結合で得られるプラ
スミドに(4)を結合することによりイーコリ,バチル
ス,シュードモナスで複製し、しかもイーコリ,バチル
ス,シュードモナスのいずれでも抗生物質耐性の発現が
認められるプラスミドが得られる。
複製起源、(2)イーコリ,シュードモナスで機能する
複製起源、(3)イーコリ,シュードモナスいずれにも
抗生物質に対する耐性を付与するDNAセグメント(4)
バチルス,イーコリ,シュードモナスいずれにも抗生物
質に対する耐性を付与するDNAセグメントを結合させる
ことによって組立てられる。(2)と(3)を組合せる
ことにより、イーコリ,シュドモナスで複製し、両方の
菌で抗生物質に対する耐性を発現するプラスミドが得ら
れる。また(1)と(2)とを組合わせることにより、
イーコリ,バチルス,シュードモナスで複製するプラス
ミドが得られる。(1)と(2)の結合で得られるプラ
スミドに(4)を結合することによりイーコリ,バチル
ス,シュードモナスで複製し、しかもイーコリ,バチル
ス,シュードモナスのいずれでも抗生物質耐性の発現が
認められるプラスミドが得られる。
バチルスにおいて複製するDNAセグメントとしては真核
生物又は、原核生物いずれから由来するものでも用いる
ことが出来るが、好ましくは原核生物特にグラム陽性菌
に属するスタフィロコッカス属,ストレプトコッカス
属,コリネバクテリウム属,クロストリジウム属,ブレ
ビバクテリウム属,バチルス属、放線菌に由来するプラ
スミド、ファージがあげられる。
生物又は、原核生物いずれから由来するものでも用いる
ことが出来るが、好ましくは原核生物特にグラム陽性菌
に属するスタフィロコッカス属,ストレプトコッカス
属,コリネバクテリウム属,クロストリジウム属,ブレ
ビバクテリウム属,バチルス属、放線菌に由来するプラ
スミド、ファージがあげられる。
イーコリ,シュードモナスにおいて複製するDNAセグメ
ントとしては真核生物または原核生物いずれから由来す
るものでも用いることが出来るが、好ましくは原核生物
特にグラム陰性菌に属する、エッセリシア属,シュード
モナス属,クレブシェラ属,サルモネラ属,アルカリゲ
ネス属,フラボバクテリウム属,エンテロバクター属,
サイトロバクター属,ヘモフィルス属,ナイセリア属,
シゲラ属,アシネトバクター属,カンピロバクター属,
ビブリオ属,プロテウス属,セラチア属,エルシニア属
に由来するプラスミド、ファージがあげられる。1つの
複数起源でイーコリとシュードモナスでの両菌種で複製
できるものでも、イーコリの複製起源とシュードモナス
の複製起源を自然にあるいは人工的に結合したものでも
使用できる。バチルス,イーコリ,シュードモナスのい
ずれにおいても選択可能な抗生物質に対する耐性として
は真核生物または原核生物いずれのものでも利用でき
る。好ましくは原核生物、特にグラム陽性菌由来の抗生
物質、例えばβ−ラクタム抗生物質,アミノ配糖体抗生
物質,テトラサイクリン系抗生物質,クロラムフェニコ
ール系抗生物質,マクロライド系抗生物質等に対する耐
性があげられるが、選択可能なものならば抗生物質に対
する耐性以外に重金属に対する耐性、各種栄養要求性等
あらゆる選択可能なものが利用出来る。
ントとしては真核生物または原核生物いずれから由来す
るものでも用いることが出来るが、好ましくは原核生物
特にグラム陰性菌に属する、エッセリシア属,シュード
モナス属,クレブシェラ属,サルモネラ属,アルカリゲ
ネス属,フラボバクテリウム属,エンテロバクター属,
サイトロバクター属,ヘモフィルス属,ナイセリア属,
シゲラ属,アシネトバクター属,カンピロバクター属,
ビブリオ属,プロテウス属,セラチア属,エルシニア属
に由来するプラスミド、ファージがあげられる。1つの
複数起源でイーコリとシュードモナスでの両菌種で複製
できるものでも、イーコリの複製起源とシュードモナス
の複製起源を自然にあるいは人工的に結合したものでも
使用できる。バチルス,イーコリ,シュードモナスのい
ずれにおいても選択可能な抗生物質に対する耐性として
は真核生物または原核生物いずれのものでも利用でき
る。好ましくは原核生物、特にグラム陽性菌由来の抗生
物質、例えばβ−ラクタム抗生物質,アミノ配糖体抗生
物質,テトラサイクリン系抗生物質,クロラムフェニコ
ール系抗生物質,マクロライド系抗生物質等に対する耐
性があげられるが、選択可能なものならば抗生物質に対
する耐性以外に重金属に対する耐性、各種栄養要求性等
あらゆる選択可能なものが利用出来る。
本発明にかかるテトラサイクリン耐性,アンピシリン耐
性,ストレプトマイシン耐性又はカナマイシン耐性やサ
ルファー剤耐性付与ベクターは、プラスミドベクターが
宿主細胞中に安定に保持されていることを確認するにも
有用である。これは、プラスミドベクターを保持してい
ない宿主菌にとっては有毒な濃度のテトラサイクリン,
アンピシリン,ストレプトマイシンあるいはカナマイシ
ン、サルファー剤にさらすことにより容易にプラスミド
保持菌を選択できるからである。しかも適当な濃度の抗
生物質を含有した培地でプラスミドベクター保持菌を培
養することにより形質転換体を安定に保持することがで
きる。
性,ストレプトマイシン耐性又はカナマイシン耐性やサ
ルファー剤耐性付与ベクターは、プラスミドベクターが
宿主細胞中に安定に保持されていることを確認するにも
有用である。これは、プラスミドベクターを保持してい
ない宿主菌にとっては有毒な濃度のテトラサイクリン,
アンピシリン,ストレプトマイシンあるいはカナマイシ
ン、サルファー剤にさらすことにより容易にプラスミド
保持菌を選択できるからである。しかも適当な濃度の抗
生物質を含有した培地でプラスミドベクター保持菌を培
養することにより形質転換体を安定に保持することがで
きる。
シュードモナスは、以下の難分解性物質、即ち(a):
有機ハロゲン化合物(溶媒、消化剤、電気絶縁剤、農薬
などに広く用いられており、その多くは微生物的に難分
解性で、しばしば高い毒性を示す)。
有機ハロゲン化合物(溶媒、消化剤、電気絶縁剤、農薬
などに広く用いられており、その多くは微生物的に難分
解性で、しばしば高い毒性を示す)。
例えばDL−2−クロルプロピオン酸の資化J.Bacterio
l.,150,522(1982)日本農芸化学会大会(昭和57年4
月;東京) (b):芳香属化合物(多くは難分解性物質として知ら
れている。) 例えばn−オクタンの資化 日本農芸化学会大会(昭和
58年度;仙台) (c):リグリンのビフェニル型モデル化合物 例えば5,5デヒドロディベニール酸の分解日本農芸化学
会大会(昭和58年度;仙台) (d):アゾ染料(全染料の大半を占める。) 例えば、パラーアミノアゾベンゼンの資化 European J.Appl,Microbiol,12,189(1981) (e)メタノール 例えば、資化Molec,gen,Genet.,178,375(1980)などを
分解する酵素を生産することが知られており、環境浄化
において重要である。
l.,150,522(1982)日本農芸化学会大会(昭和57年4
月;東京) (b):芳香属化合物(多くは難分解性物質として知ら
れている。) 例えばn−オクタンの資化 日本農芸化学会大会(昭和
58年度;仙台) (c):リグリンのビフェニル型モデル化合物 例えば5,5デヒドロディベニール酸の分解日本農芸化学
会大会(昭和58年度;仙台) (d):アゾ染料(全染料の大半を占める。) 例えば、パラーアミノアゾベンゼンの資化 European J.Appl,Microbiol,12,189(1981) (e)メタノール 例えば、資化Molec,gen,Genet.,178,375(1980)などを
分解する酵素を生産することが知られており、環境浄化
において重要である。
本発明の多機能クローニングベクターを使用すれは、上
記のような難分解汚染物質の分解酵素を多種生産するシ
ュードモナス属,アミラーゼ,プロテアーゼなどの有用
酵素生産菌として知られるバチルス属〔(Bull.Environ
m.Contam.Toxicol.,26,38(1981)〕の遺伝子のクロー
ニングをイーコリ,バチルス,シュードモナスいずれの
宿主菌においても行うことができる訳である。つまり、
好みの宿主菌で分析あるいは有用物質の生産が可能であ
る。
記のような難分解汚染物質の分解酵素を多種生産するシ
ュードモナス属,アミラーゼ,プロテアーゼなどの有用
酵素生産菌として知られるバチルス属〔(Bull.Environ
m.Contam.Toxicol.,26,38(1981)〕の遺伝子のクロー
ニングをイーコリ,バチルス,シュードモナスいずれの
宿主菌においても行うことができる訳である。つまり、
好みの宿主菌で分析あるいは有用物質の生産が可能であ
る。
既に詳述したように、本発明に係るベクターは、種々の
特徴を有している。即ち、コピー数が多く、種々の制限
酵素による切断個所は1ケ所であり複製能を損なうこと
なくDNA断片のクローン化が行え、プラスミド上に存在
するテトラサイクリン耐性,ストレプトマイシン耐性,
あるいはアンピシリン耐性,カナマイシン耐性またはサ
ルファー剤耐性を選択マーカーとして利用できプラスミ
ド保持菌の選別が容易に可能である。プラスミド分子中
の唯一の制限酵素切断点としてアンピシリン耐性遺伝子
内にXbaI BglIIまたはPstIがありカナマイシン耐性遺伝
子内にXhoI CleI SmaI HindIII、サルファー剤耐性遺伝
子内にPstI、あるいはストレプトマイシン耐性遺伝子内
にEcoRI,HindIIIが存在する。このように、非常に使い
易い制限酵素部位が存在するため、DNAの複製機能を損
なうことなく、DNA断片のクローン化が行え、挿入失活
法により容易に組換え体の選択ができる。
特徴を有している。即ち、コピー数が多く、種々の制限
酵素による切断個所は1ケ所であり複製能を損なうこと
なくDNA断片のクローン化が行え、プラスミド上に存在
するテトラサイクリン耐性,ストレプトマイシン耐性,
あるいはアンピシリン耐性,カナマイシン耐性またはサ
ルファー剤耐性を選択マーカーとして利用できプラスミ
ド保持菌の選別が容易に可能である。プラスミド分子中
の唯一の制限酵素切断点としてアンピシリン耐性遺伝子
内にXbaI BglIIまたはPstIがありカナマイシン耐性遺伝
子内にXhoI CleI SmaI HindIII、サルファー剤耐性遺伝
子内にPstI、あるいはストレプトマイシン耐性遺伝子内
にEcoRI,HindIIIが存在する。このように、非常に使い
易い制限酵素部位が存在するため、DNAの複製機能を損
なうことなく、DNA断片のクローン化が行え、挿入失活
法により容易に組換え体の選択ができる。
また、本発明に係るベクターは、べくたーに付与されて
いる抗生物質に対して感受性を有するバチルス、イーコ
リ、シュードモナス細胞のいずれにも導入することがで
き、イーコリ、シュードモナス両方の菌において、アン
ピシリン耐性、カナマイシン耐性、サルファー剤耐性、
ストレプトマイシン耐性の発現、あるいはバチルス、イ
ーコリ、シュードモナスいずれの細胞においても、アン
ピシリン耐性、テトラサイクリン耐性、ストレプトマイ
シン耐性の発現がおこる。したがっていずれの菌におい
てもプラスミドベクター保持菌の選別が容易であるばか
りでなく挿入失活法による組換え体の選別も容易であ
る。即ち、本発明のベクターは、組換えDNA技術による
物質の生産の為の宿主細胞を選択する上で融通がきき非
常に有利である。
いる抗生物質に対して感受性を有するバチルス、イーコ
リ、シュードモナス細胞のいずれにも導入することがで
き、イーコリ、シュードモナス両方の菌において、アン
ピシリン耐性、カナマイシン耐性、サルファー剤耐性、
ストレプトマイシン耐性の発現、あるいはバチルス、イ
ーコリ、シュードモナスいずれの細胞においても、アン
ピシリン耐性、テトラサイクリン耐性、ストレプトマイ
シン耐性の発現がおこる。したがっていずれの菌におい
てもプラスミドベクター保持菌の選別が容易であるばか
りでなく挿入失活法による組換え体の選別も容易であ
る。即ち、本発明のベクターは、組換えDNA技術による
物質の生産の為の宿主細胞を選択する上で融通がきき非
常に有利である。
また、遺伝子操作実験の安全を期する為にはプラスミド
ベクターが保持する薬剤耐性および組換え遺伝子の伝播
拡散を防止することが非常に重要である。本発明に係る
プラスミドベクターは自己伝達性がないばかりでなく、
伝達性プラスミドとの二者共存、あるいは伝達性プラス
ミド、非伝達性プラスミドおよび本発明に係るプラスミ
ドベクターとの三者共存の系においも伝達されず(非可
動化)、従来から頻繁に使用されている三者共存の系で
伝達される前記したようなpBR322またはpCRIに比較し、
安全性の高いベクターといえる。安全性の面からさらに
言及するなら、当該プラスミドベクターの薬剤耐性マー
カーであるサルファー剤耐性は、易熱性のデヒドロプテ
ロエイト・シンセターゼの変化によるものであり、従来
の染色体上に存在するサルファー剤耐性の耐熱性酵素の
変化によるものとは異なり、安全性が高いといえる。
ベクターが保持する薬剤耐性および組換え遺伝子の伝播
拡散を防止することが非常に重要である。本発明に係る
プラスミドベクターは自己伝達性がないばかりでなく、
伝達性プラスミドとの二者共存、あるいは伝達性プラス
ミド、非伝達性プラスミドおよび本発明に係るプラスミ
ドベクターとの三者共存の系においも伝達されず(非可
動化)、従来から頻繁に使用されている三者共存の系で
伝達される前記したようなpBR322またはpCRIに比較し、
安全性の高いベクターといえる。安全性の面からさらに
言及するなら、当該プラスミドベクターの薬剤耐性マー
カーであるサルファー剤耐性は、易熱性のデヒドロプテ
ロエイト・シンセターゼの変化によるものであり、従来
の染色体上に存在するサルファー剤耐性の耐熱性酵素の
変化によるものとは異なり、安全性が高いといえる。
また、イーコリ宿主菌内における不和合性の面からも当
該プラスミドベクターは有用性が高い。即ち現在イーコ
リで用いられているプラスミドベクターのほとんどは、
その複製起源がColEI、pMBI,p15A,R6−5に由来するも
のである(例えば、ベクタープラスミドpCRI、pBR322、
PACYC184、pSC101等)が、当該プラスミドベクターは、
これらいずれの複製起源をもつプラスミドともイーコリ
宿主内で安定に共存できる(不和合群が異なる)という
特徴をもつ。このため、一つの宿主内に多数のプラスミ
ドベクターを共存させ遺伝子産物の増産をはかったり
(例えば目的産物の増収をはかる場合、その目的産物が
複数の酵素の作用を受けていれば、その数だけ安定に共
存できるプラスミドベクターが必要となる)、各種遺伝
子の相互作用を解析する場合にも有用である。
該プラスミドベクターは有用性が高い。即ち現在イーコ
リで用いられているプラスミドベクターのほとんどは、
その複製起源がColEI、pMBI,p15A,R6−5に由来するも
のである(例えば、ベクタープラスミドpCRI、pBR322、
PACYC184、pSC101等)が、当該プラスミドベクターは、
これらいずれの複製起源をもつプラスミドともイーコリ
宿主内で安定に共存できる(不和合群が異なる)という
特徴をもつ。このため、一つの宿主内に多数のプラスミ
ドベクターを共存させ遺伝子産物の増産をはかったり
(例えば目的産物の増収をはかる場合、その目的産物が
複数の酵素の作用を受けていれば、その数だけ安定に共
存できるプラスミドベクターが必要となる)、各種遺伝
子の相互作用を解析する場合にも有用である。
上記したような特徴を有する本発明の多機能プラスミド
ベクターを得るためには、先ずプラスミド供給源である
菌、例えばイーコリ、バチルスなどが培地に培養され
る。それぞれのプラスミドの供給源である例えばエッセ
リシア・コリML4901及びバチルス・サチルスCRK3000、
シュードモナス・プチダTn1126、シュードモナス・エル
ギノサPAO2142は炭素源として、糖蜜、グルコース、デ
キストリン、グリセロール等の炭水化物、窒素源とし
て、大豆粉、ペプトン、アミノ酸混合物等、無機塩とし
て、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウ
ム、マグネシウム、リン酸、塩酸、硫酸イオン等のイオ
ンを生成し得る通常の栄養無機塩類、その他微生物の増
殖や発育に必要な微量元素を添加した通常の培地で培養
される。しかしながら、これら微量元素は、通常培地の
他の成分に不純物として含まれているので添加しなくて
もよい。
ベクターを得るためには、先ずプラスミド供給源である
菌、例えばイーコリ、バチルスなどが培地に培養され
る。それぞれのプラスミドの供給源である例えばエッセ
リシア・コリML4901及びバチルス・サチルスCRK3000、
シュードモナス・プチダTn1126、シュードモナス・エル
ギノサPAO2142は炭素源として、糖蜜、グルコース、デ
キストリン、グリセロール等の炭水化物、窒素源とし
て、大豆粉、ペプトン、アミノ酸混合物等、無機塩とし
て、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウ
ム、マグネシウム、リン酸、塩酸、硫酸イオン等のイオ
ンを生成し得る通常の栄養無機塩類、その他微生物の増
殖や発育に必要な微量元素を添加した通常の培地で培養
される。しかしながら、これら微量元素は、通常培地の
他の成分に不純物として含まれているので添加しなくて
もよい。
本発明においてプラスミド宿主菌として使用される菌は
前記したように、例えばエッセリシア・コリML4901、バ
チルス・サチルスCRK3000、シュードモナス・エルギノ
サPAO2142、シュードモナス・プチダTn1126をあげるこ
とができる。これらの菌の培養に使用される培地の例、
培養条件の例を示せば以下の通りである。もちろんこれ
らの菌株、培地培養条件はあくまでも例示的にあげたも
のであって、その他の一般的な変更、修飾は可能であ
り、それらも本発明に包含されることはいうまでもな
い。
前記したように、例えばエッセリシア・コリML4901、バ
チルス・サチルスCRK3000、シュードモナス・エルギノ
サPAO2142、シュードモナス・プチダTn1126をあげるこ
とができる。これらの菌の培養に使用される培地の例、
培養条件の例を示せば以下の通りである。もちろんこれ
らの菌株、培地培養条件はあくまでも例示的にあげたも
のであって、その他の一般的な変更、修飾は可能であ
り、それらも本発明に包含されることはいうまでもな
い。
次に菌の培養について詳述する。
1.エッセリシア・コリ、シュードモナス・エルギノサ、
及びシュードモナス・プチダについて下記の培地を調整
し、培養を行った。
及びシュードモナス・プチダについて下記の培地を調整
し、培養を行った。
(a)液体培地(菌の増殖およびプラスミドの分離に用
いる。)Lブロスはバクト・トリプトン10g,酵母エキス
5g,食塩5g、グルコース1gを1の脱イオン水に溶か
し、加温冷却後、水酸化ナトリウムでpH=7.4に修正
し、120℃で20分間加圧滅菌して調整する。
いる。)Lブロスはバクト・トリプトン10g,酵母エキス
5g,食塩5g、グルコース1gを1の脱イオン水に溶か
し、加温冷却後、水酸化ナトリウムでpH=7.4に修正
し、120℃で20分間加圧滅菌して調整する。
(b)寒天培地 ラクトースブロムチモルブルー(Lac−BTB)寒天培地
は、肉エキス10g、ペプトン10g,食塩5g、ラクトース10
g、寒天15g、ブロムチモルブルー0.8gを1の脱イオン
水に加温して溶かし、冷却後水酸化ナトリウムPH=7.4
に修正し120℃20分間加圧滅菌して調整する。
は、肉エキス10g、ペプトン10g,食塩5g、ラクトース10
g、寒天15g、ブロムチモルブルー0.8gを1の脱イオン
水に加温して溶かし、冷却後水酸化ナトリウムPH=7.4
に修正し120℃20分間加圧滅菌して調整する。
2.バチルスサチルスは、下記の培地により培養される。
(a)液体培地 アンチバイオティックメディウム3(バクトーペナッセ
イ培地)(DIFCO社製)17.5gを1の脱イオン水に溶か
し、120℃15分間加圧滅菌して調整する。
イ培地)(DIFCO社製)17.5gを1の脱イオン水に溶か
し、120℃15分間加圧滅菌して調整する。
(b)寒天培地 ハートインフュージョン寒天培地(ニッスイ製)25gを
脱イオン水1に加温して溶かし、120℃15分間加圧滅
菌して調整する。
脱イオン水1に加温して溶かし、120℃15分間加圧滅
菌して調整する。
但し、少量の培養は、10mlのブロスを試験管にて、大量
の培地は、200mlのブロスを坂口フラスコで行う。全て
の菌は30℃〜37℃で培養される。
の培地は、200mlのブロスを坂口フラスコで行う。全て
の菌は30℃〜37℃で培養される。
このようにして培養された菌からプラスミドが先ず単離
される。プラスミドの単離は、通常の方法で行い得るが
以下に示すような方法によるのが簡便である。
される。プラスミドの単離は、通常の方法で行い得るが
以下に示すような方法によるのが簡便である。
プラスミドの単離 プラスミドの単離は、クリアードライセイト法によるが
その概略は次のとおり。
その概略は次のとおり。
(1)被検菌をLブロス200mlで37℃にて一夜振とう培
養する。
養する。
(2)4℃で6000回転15分間遠心し、菌体を集める。
(3)菌を30mlの10mMTris−1mMエチレンジアミン四酢
酸ナトリウム(以後EDTAと略す)(pH8.0)に再浮遊さ
せて後、50mlの遠心管に移し6000回転、10分間遠心す
る。
酸ナトリウム(以後EDTAと略す)(pH8.0)に再浮遊さ
せて後、50mlの遠心管に移し6000回転、10分間遠心す
る。
(4)沈渣を10mlの冷25%ショ糖液(25gのショ糖を50m
M Tris−1mM EDTA(pH8.0)100mlに溶かしたもの)に充
分浮遊させ、続いて、リボヌクレアーゼ(最終濃度20μ
g/ml)を加え最高速度でボルテックスミキサーを用い、
2分間攪拌する。
M Tris−1mM EDTA(pH8.0)100mlに溶かしたもの)に充
分浮遊させ、続いて、リボヌクレアーゼ(最終濃度20μ
g/ml)を加え最高速度でボルテックスミキサーを用い、
2分間攪拌する。
(5)新たに調製した1%リゾチーム溶液を1ml加え良
く振って、5分間氷冷する。
く振って、5分間氷冷する。
(6)0.5M EDTA(pH8.0)2.0ml加え、良く振って、10
分間氷冷放置する。
分間氷冷放置する。
(7)冷トリトン リテイック、ミックステュアー16ml
を加え、静かに遠心管を廻しながら、2回上下逆にし、
静かに混和し、15分間氷冷する。
を加え、静かに遠心管を廻しながら、2回上下逆にし、
静かに混和し、15分間氷冷する。
(8)30000回転、4℃にて20分間遠心し、上澄みを滅
菌したメスシリンダーに静かにとる。
菌したメスシリンダーに静かにとる。
(9)ポリエチレングリコール(♯6000)を10%(W/
V)になるように入れよく混ぜ、続いて5M食塩を1/9量加
え4℃にて一夜保存する。
V)になるように入れよく混ぜ、続いて5M食塩を1/9量加
え4℃にて一夜保存する。
(10)5000回転、4℃にて10分間遠心し、上澄みを捨
て、沈渣にSSC(SSC:0.15M食塩及び0.015Mクエン酸ナト
リウム)溶液を10倍に希釈したものを5ml加えDNAを静か
に溶解させる。
て、沈渣にSSC(SSC:0.15M食塩及び0.015Mクエン酸ナト
リウム)溶液を10倍に希釈したものを5ml加えDNAを静か
に溶解させる。
(11)塩化セシウム5g、DNAサンプル5mlを静かに混ぜ
る。
る。
(12)完全に溶解した後、エチジウムブロマイド(10mg
/ml)を0.1ml、SSCの10倍希釈液を0.1ml加え37000〜400
00回転20℃にて35乃至40時間遠心する。
/ml)を0.1ml、SSCの10倍希釈液を0.1ml加え37000〜400
00回転20℃にて35乃至40時間遠心する。
(13)遠心はブレーキをかけず止め、遠心管をローター
からしずかに取り出し遠心管の側面より紫外線をあて、
DNAのけい光を調べる。
からしずかに取り出し遠心管の側面より紫外線をあて、
DNAのけい光を調べる。
(14)エチジウムブロマイドのけい光バンドを注射針を
用い、側面から取り出す。それぞれのバンドが混じらな
いように注意する。
用い、側面から取り出す。それぞれのバンドが混じらな
いように注意する。
(15)塩化セシウム飽和イソプロパノールをサンプルと
等量加え,、静かに振り、エチジウムブロマイドを脱色
する。この操作を3〜4回繰り返す。
等量加え,、静かに振り、エチジウムブロマイドを脱色
する。この操作を3〜4回繰り返す。
(16)鮮紅色の上澄みを捨て、DNAサンプルを透析チュ
ーブに移し、SSCを10倍に希釈した溶液にて透析する。
ーブに移し、SSCを10倍に希釈した溶液にて透析する。
(17)こうしてできたccc DNAを保持する。
(1)イーコリからの分離 上記の操作方法に準ずるが、更に詳しくは「薬剤感受性
測定法」三橋進編、P42〜P48を参照した。
測定法」三橋進編、P42〜P48を参照した。
(2)バチルスからの分離 上記の操作方法に準ずるが、(6)に於いて、10分間氷
冷する代わりに37℃で30分間温めて行った。
冷する代わりに37℃で30分間温めて行った。
(3)シュードモナスからの分離 上記の操作方法に準ずるが、(5)において1%リゾチ
ーム溶液を使用した。又(6)の0.5M EDTAは添加せず
に行った。
ーム溶液を使用した。又(6)の0.5M EDTAは添加せず
に行った。
4.上記すべての菌種からのプラスミド単離の簡便法とし
て以下に示すような「Nucleic Acids Research」Vol.17
Number6(1979)P1513〜1523の方法に従うことも好まし
い方法である。
て以下に示すような「Nucleic Acids Research」Vol.17
Number6(1979)P1513〜1523の方法に従うことも好まし
い方法である。
簡便法による単離: (1)菌に合った培地で一夜培養する。
(2)1.0〜1.5mlのブロスを1.5ml容エッペンドルフチ
ューブに入れ10000回転1分間遠心し集菌する。その
後、上澄みを捨てる。
ューブに入れ10000回転1分間遠心し集菌する。その
後、上澄みを捨てる。
(3)リゾチーム溶液(以後溶液1と記す)を100μl
入れ、菌をボルテックスミキサーでほぐして氷冷して30
分間静置する。
入れ、菌をボルテックスミキサーでほぐして氷冷して30
分間静置する。
(4)アルカリ性SDS溶液(以後溶液2と記す)を200μ
l入れ、エッペンドルフチューブの転倒を繰り返し攪拌
し、5分間氷上に静置する。
l入れ、エッペンドルフチューブの転倒を繰り返し攪拌
し、5分間氷上に静置する。
(5)3M酢酸ナトリウム水溶液(pH4.8)(以後溶液3
と記す)を150μl加え攪拌し、氷上で60分間静置す
る。
と記す)を150μl加え攪拌し、氷上で60分間静置す
る。
(6)10000回転5分間遠沈し、上澄みを集め(約400μ
l)て、2倍量の99.5%エタノールを入れ攪拌し、−20
℃で30分間静置する。
l)て、2倍量の99.5%エタノールを入れ攪拌し、−20
℃で30分間静置する。
(7)10000回転、3分間遠沈し、上澄みを捨て、沈渣
に100mM酢酸ナトリウム−50mM Tris−HCl緩衝液(pH8.
0)100μlを加えて溶解させ、2倍量の99.5%エタノー
ルを入れ攪拌し、−20℃で5分間静置する。
に100mM酢酸ナトリウム−50mM Tris−HCl緩衝液(pH8.
0)100μlを加えて溶解させ、2倍量の99.5%エタノー
ルを入れ攪拌し、−20℃で5分間静置する。
(8)10000回転、3分間遠沈し、上澄みを捨て、減圧
乾燥する。SSCの10倍希釈溶液を100μl加え、形質転換
及びアガロース電気泳動用のサンプルとする。
乾燥する。SSCの10倍希釈溶液を100μl加え、形質転換
及びアガロース電気泳動用のサンプルとする。
組換えDNAプラスミドの形質転換は文献公知の一般な方
法の改変を適用することにより行われる。以下に文献を
例示する。
法の改変を適用することにより行われる。以下に文献を
例示する。
形質転換 各々の菌に関する形質転換方法の概略は、下記のとおり
である。
である。
(1)イーコリ イーコリをLブロスで一夜培養した後、その0.1mlを新
しいLブロス10mlに植え、37℃で振とう培養を3.5時間
行い、集菌する。5mlの10mM食塩−10mM Tris HCl緩衝液
(pH.8.0)で1回洗浄したあと集菌を行い、その後、菌
体を5mlの75mM塩化カルシウム−10mM Tris塩酸緩衝液
(pH8.0)に浮遊させ室温にて20分間放置する。同様に
再度集菌、塩化カルシウム−Tris塩酸緩衝液に浮遊し、
氷中で5分間以上静置するコンピテントセルを得ること
ができる。
しいLブロス10mlに植え、37℃で振とう培養を3.5時間
行い、集菌する。5mlの10mM食塩−10mM Tris HCl緩衝液
(pH.8.0)で1回洗浄したあと集菌を行い、その後、菌
体を5mlの75mM塩化カルシウム−10mM Tris塩酸緩衝液
(pH8.0)に浮遊させ室温にて20分間放置する。同様に
再度集菌、塩化カルシウム−Tris塩酸緩衝液に浮遊し、
氷中で5分間以上静置するコンピテントセルを得ること
ができる。
冷コンピテントセル200μl、プラスミド溶液20μlを
加え軽く混和し20分間氷冷後42℃で2分間温め、次い
で、Lブロス1mlを加えた後37℃で90分間振とう培養し
た。3000回転10分間遠心後1mlBSG溶液で菌体を洗浄し、
再度BSG溶液1mlに浮遊し、次いでその0.1ml又は、更に
希釈したもの0.1mlをカナマイシン12.5μg/ml含有のBTB
寒天培地上に塗抹し、37℃で24時間培養し、形質転換を
することができる。詳細は「薬剤感受性測定法」三橋進
編P38〜41を参照 (2)バチルス グルコース0.5%を添加したバクトペナッセイ培地5mlに
菌を植え一夜培養し、集菌後C−1培地0.5mlに菌を浮
遊し、その0.2mlをC−1培地20mlに接種し、37℃で対
数増殖期後期まで培養し、C−2培地80mlに全量を加え
30℃で弱めに振とう培養を2時間行う。集菌し氷冷した
C−3培地10mlに浮遊し、0.2mlずつ分注し−80℃に保
存することによりコンピテントセルを得る。
加え軽く混和し20分間氷冷後42℃で2分間温め、次い
で、Lブロス1mlを加えた後37℃で90分間振とう培養し
た。3000回転10分間遠心後1mlBSG溶液で菌体を洗浄し、
再度BSG溶液1mlに浮遊し、次いでその0.1ml又は、更に
希釈したもの0.1mlをカナマイシン12.5μg/ml含有のBTB
寒天培地上に塗抹し、37℃で24時間培養し、形質転換を
することができる。詳細は「薬剤感受性測定法」三橋進
編P38〜41を参照 (2)バチルス グルコース0.5%を添加したバクトペナッセイ培地5mlに
菌を植え一夜培養し、集菌後C−1培地0.5mlに菌を浮
遊し、その0.2mlをC−1培地20mlに接種し、37℃で対
数増殖期後期まで培養し、C−2培地80mlに全量を加え
30℃で弱めに振とう培養を2時間行う。集菌し氷冷した
C−3培地10mlに浮遊し、0.2mlずつ分注し−80℃に保
存することによりコンピテントセルを得る。
次に20mMの塩化マグネシウムを添加したC−1培地1.8m
lに上記コンピテントセル0.2mlを混合し、この菌混合液
450μlとプラスミド溶液50μlを混ぜ37℃で30分間反
応させて薬剤平板培地に播くことにより形質転換でき
る。形質発現に時間の必要なものは、遠心により集菌し
た菌を、バクトペナッセイ培地で37℃1.5h培養後、薬剤
平板培地に播く。詳細はJ.Bacteriol.,98 1239−1247
(1969)に従った。上記C−1,C−2,C−3培地は次のと
おり C−1培地:硫安160mg,リン酸水素二カリウム1.12g,リ
ン酸二水素カリウム480mg,クエン酸ナトリウム80mgをイ
オン交換水75mlに溶解し、加圧滅菌する。これに別滅菌
した10%硫酸マグネシウム水溶液0.16ml,25%グルコー
ス1.6ml,5mg/mlのヒスチジン、アデニン、メチオニンを
各々0.4ml,5mg/mlのロイシンを0.16ml加え、混合したも
の。
lに上記コンピテントセル0.2mlを混合し、この菌混合液
450μlとプラスミド溶液50μlを混ぜ37℃で30分間反
応させて薬剤平板培地に播くことにより形質転換でき
る。形質発現に時間の必要なものは、遠心により集菌し
た菌を、バクトペナッセイ培地で37℃1.5h培養後、薬剤
平板培地に播く。詳細はJ.Bacteriol.,98 1239−1247
(1969)に従った。上記C−1,C−2,C−3培地は次のと
おり C−1培地:硫安160mg,リン酸水素二カリウム1.12g,リ
ン酸二水素カリウム480mg,クエン酸ナトリウム80mgをイ
オン交換水75mlに溶解し、加圧滅菌する。これに別滅菌
した10%硫酸マグネシウム水溶液0.16ml,25%グルコー
ス1.6ml,5mg/mlのヒスチジン、アデニン、メチオニンを
各々0.4ml,5mg/mlのロイシンを0.16ml加え、混合したも
の。
C−2培地:C−1培地のヒスチジン,アデニン,メチオ
ニン,ロイシンの代わりに、10%カザミノ酸0.16ml(pH
7.0)5mg/mlのヒスチジン1.6mlを加え混合したもの。
ニン,ロイシンの代わりに、10%カザミノ酸0.16ml(pH
7.0)5mg/mlのヒスチジン1.6mlを加え混合したもの。
C−3培地:C−1培地のヒスチジン,アデニン,メチオ
ニン,ロイシンの代わりに、最終濃度が5%になるよう
にグリセリンを添加したもの。
ニン,ロイシンの代わりに、最終濃度が5%になるよう
にグリセリンを添加したもの。
(3)シュードモナス・エルギノサ,シュードモナス・
プチダ 10mlのLブロスで対数増殖期中期まで生育させた菌を遠
心して集菌し、0.1M塩化マグネシウム液5mlで洗浄し集
菌する。0.1M塩化マグネシウム液5mlで再浮遊し氷中で2
0分間静置し、遠心して集菌する。これを1mlの0.1M塩化
マグネシウム液に浮遊させることによりコンピテントセ
ルを得る。
プチダ 10mlのLブロスで対数増殖期中期まで生育させた菌を遠
心して集菌し、0.1M塩化マグネシウム液5mlで洗浄し集
菌する。0.1M塩化マグネシウム液5mlで再浮遊し氷中で2
0分間静置し、遠心して集菌する。これを1mlの0.1M塩化
マグネシウム液に浮遊させることによりコンピテントセ
ルを得る。
このコンピテントセル200μlとプラスミド液50μlを
混合し、氷中で60分間静置後42℃で2分間保温した後L
ブロス1mlを添加し、37℃にて90分間培養した。遠心集
菌後、BSGで2回洗浄し、更に0.5mlのBSGを加え、薬剤
含有のLac−BTB寒天培地に播いて、37℃で培養すること
により形質転換することができる。詳細はAntimicrobia
l Agents And Chemotherapy Sep.1982,p358〜363に従っ
た。
混合し、氷中で60分間静置後42℃で2分間保温した後L
ブロス1mlを添加し、37℃にて90分間培養した。遠心集
菌後、BSGで2回洗浄し、更に0.5mlのBSGを加え、薬剤
含有のLac−BTB寒天培地に播いて、37℃で培養すること
により形質転換することができる。詳細はAntimicrobia
l Agents And Chemotherapy Sep.1982,p358〜363に従っ
た。
形質転換の確認は一般的な方法により行い得るが、例示
すれば以下に述べるようにして行われる。
すれば以下に述べるようにして行われる。
形質転換後の確認: (1)形質転換体は、ベクター側のマーカーで選択す
る。
る。
(2)目的の他の耐性であるかどうかをチエックする。
通常は滅菌ようじで、各被験菌を調べたい薬剤含有プレ
ート上にストリークし、生育しているか否かを調べる。
次いで単コロニーを薬剤プレート上で2回精製する。
通常は滅菌ようじで、各被験菌を調べたい薬剤含有プレ
ート上にストリークし、生育しているか否かを調べる。
次いで単コロニーを薬剤プレート上で2回精製する。
(3)簡便法でDNAを単離し、アガロースゲル電気泳動
にて目的の大きさのものかどうか、又、二種のものが混
じっていないかどうか確認する。このDNAを再形質転換
し、たしかに目的の遺伝子マーカーがプラスミド上にあ
ることを確認する。必要ならば制限酵素で切り確認す
る。
にて目的の大きさのものかどうか、又、二種のものが混
じっていないかどうか確認する。このDNAを再形質転換
し、たしかに目的の遺伝子マーカーがプラスミド上にあ
ることを確認する。必要ならば制限酵素で切り確認す
る。
(4)よりきれいで大量のDNAを取得する為にクリアー
ドライセイト法でDNAを単離する。アガロースゲルで再
確認をする。
ドライセイト法でDNAを単離する。アガロースゲルで再
確認をする。
(5)次のステップへ進むDNAはすべて(4)のものを
使用する。
使用する。
単離されたDNAプラスミドを切断する制限酵素およびそ
の他の遺伝子組換え用酵素は、一般に知られている酵素
が目的に応じて使用されるが、これらは市販されている
酵素を使用すれば充分である。
の他の遺伝子組換え用酵素は、一般に知られている酵素
が目的に応じて使用されるが、これらは市販されている
酵素を使用すれば充分である。
単離されたプラスミドDNAは、一般的な遺伝子操作法を
応用して、本発明の目的に合ったプラスミドを調製する
ことができる。以下にいくつかの本発明のプラスミドの
調製法を詳述する。
応用して、本発明の目的に合ったプラスミドを調製する
ことができる。以下にいくつかの本発明のプラスミドの
調製法を詳述する。
pMS500の作製: pMS140−1はTcr遺伝子の外部に制限酵素EcoRIで1箇所
切断される。また、pMS71−17はAprSarであり、それら
の耐性を与える遺伝子の外部に制限酵素EcoRIで1箇所
切断される。この両者を制限酵素EcoRIで完全に消化し
て直鎖状化した後、プラスミド分子の両端に単鎖として
突き出た同一接着末端で両DNA分子の連結した和合分子
を生成させるためにT4ファージDNAリガーゼを作用させ
る。このDNA混合物中からの両プラスミドの和合連結し
た組換え体プラスミドの所得は、いったんpMS71−17に
由来する薬剤耐性で選択される。イーコリML4901の形質
転換株を分離し、これら形質転換株のなかでTcrを示す
ものを所得する。その後、これらのAprTcr株から通常の
方法でプラスミドDNAを分離し、アガロースゲル電気泳
動の結果から両方のプラスミドが連結された株を取得す
ることができる。
切断される。また、pMS71−17はAprSarであり、それら
の耐性を与える遺伝子の外部に制限酵素EcoRIで1箇所
切断される。この両者を制限酵素EcoRIで完全に消化し
て直鎖状化した後、プラスミド分子の両端に単鎖として
突き出た同一接着末端で両DNA分子の連結した和合分子
を生成させるためにT4ファージDNAリガーゼを作用させ
る。このDNA混合物中からの両プラスミドの和合連結し
た組換え体プラスミドの所得は、いったんpMS71−17に
由来する薬剤耐性で選択される。イーコリML4901の形質
転換株を分離し、これら形質転換株のなかでTcrを示す
ものを所得する。その後、これらのAprTcr株から通常の
方法でプラスミドDNAを分離し、アガロースゲル電気泳
動の結果から両方のプラスミドが連結された株を取得す
ることができる。
こうして得られる形質転換株の保有するプラスミドは、
バチルス、イーコリ、シュードモナスで複製できるシャ
トルベクターである。グラム陽性菌由来のTcrはバチル
ス、イーコリ、シュードモナスで発現するが、グラム陰
性菌の薬剤耐性であるAprSarはイーコリ、シュードモナ
スでは発現するが、バチルスでは発現しない。イーコリ
の薬剤耐性遺伝子がバチルスに導入されても形質発現し
ないことは通説となっていることは前にも記した通りで
ある。各々の菌株で2つの異なった薬剤耐性が発現すれ
ば、一方の薬剤に耐性を示す遺伝子内に他種の遺伝子を
クローニングして薬剤感受性とし、もう一方の薬剤耐性
で形質転換体を容易に選別できる。
バチルス、イーコリ、シュードモナスで複製できるシャ
トルベクターである。グラム陽性菌由来のTcrはバチル
ス、イーコリ、シュードモナスで発現するが、グラム陰
性菌の薬剤耐性であるAprSarはイーコリ、シュードモナ
スでは発現するが、バチルスでは発現しない。イーコリ
の薬剤耐性遺伝子がバチルスに導入されても形質発現し
ないことは通説となっていることは前にも記した通りで
ある。各々の菌株で2つの異なった薬剤耐性が発現すれ
ば、一方の薬剤に耐性を示す遺伝子内に他種の遺伝子を
クローニングして薬剤感受性とし、もう一方の薬剤耐性
で形質転換体を容易に選別できる。
pMS500−1の作製: pMS500−1のバチルスで発現しないAprを除去し、ベク
タープラスミドを小さなものに保ち、イーコリ、バチル
ス、シュードモナスでの複製とTcr耐性を含有した部分
を残す為に、制限酵素KpnI,HindIIIで完全消化後、SIヌ
クレアーセで処理を行い、接着末端を平滑末端にした
後、T4ファージDNAリガーゼにより両末端を連結し、イ
ーコリに形質転換を行いTcrを示すものを所得し、Apsで
あることを確認する。Tcr形質転換体よりプラスイドDNA
を分取し、アガロース電気泳動により目的の分子量のも
のであることを確認する。
タープラスミドを小さなものに保ち、イーコリ、バチル
ス、シュードモナスでの複製とTcr耐性を含有した部分
を残す為に、制限酵素KpnI,HindIIIで完全消化後、SIヌ
クレアーセで処理を行い、接着末端を平滑末端にした
後、T4ファージDNAリガーゼにより両末端を連結し、イ
ーコリに形質転換を行いTcrを示すものを所得し、Apsで
あることを確認する。Tcr形質転換体よりプラスイドDNA
を分取し、アガロース電気泳動により目的の分子量のも
のであることを確認する。
pMS502の取得: pMS500−1に(イーコリ、バチルス、シュードモナスで
発現する)二つめの薬剤耐性を付加するためにpMS500−
1をTcr遺伝子の外にあり、各菌での複製部分と関係な
い遺伝子上に1箇所存在するPstI部位を制限酵素PstIで
完全消化し、直鎖状接着末端をつくっておく。pMS501
(昭和58年、日本細菌学会誌1号)のSmrはバチルス、
イーコリで形質発現することができ、イーコリベクター
pACYC177の複製起源をもち、Smr遺伝子の外にPstI切断
部位が1箇所存在しているため、これも制限酵素PstIで
完全消化し、T4ファージDNAリガーゼによりpMS501と連
結し、TcrSmr形質転換体を取得することができる。これ
をpMS502とする。このものは、バチルス、イーコリ、シ
ュードモナスで複製し、TcrSmrを各菌種に与える。
発現する)二つめの薬剤耐性を付加するためにpMS500−
1をTcr遺伝子の外にあり、各菌での複製部分と関係な
い遺伝子上に1箇所存在するPstI部位を制限酵素PstIで
完全消化し、直鎖状接着末端をつくっておく。pMS501
(昭和58年、日本細菌学会誌1号)のSmrはバチルス、
イーコリで形質発現することができ、イーコリベクター
pACYC177の複製起源をもち、Smr遺伝子の外にPstI切断
部位が1箇所存在しているため、これも制限酵素PstIで
完全消化し、T4ファージDNAリガーゼによりpMS501と連
結し、TcrSmr形質転換体を取得することができる。これ
をpMS502とする。このものは、バチルス、イーコリ、シ
ュードモナスで複製し、TcrSmrを各菌種に与える。
pMS502−1の取得: pMS502のSmr耐性遺伝子内には遺伝子操作で有用に使用
できる制限酵素部位HindIIIとEcoRIが各1箇所存在す
る。このEcoRI部位を生かすために、AccIではさまれる
プラスミドベクターに不必要な部分をAccIで消化し、切
り離してT4ファージDNAリガーゼで両末端を連結する。
できる制限酵素部位HindIIIとEcoRIが各1箇所存在す
る。このEcoRI部位を生かすために、AccIではさまれる
プラスミドベクターに不必要な部分をAccIで消化し、切
り離してT4ファージDNAリガーゼで両末端を連結する。
pMS503の取得: pMS502−1には、制限酵素EcoRI部位がSmr遺伝子の外に
もう1箇所存在する。このため、pMS502−1をEcoRIで
部分消化しておく。pTTE11(TcrApr)(J.Bacteriol.,7
76-786,(1981)のAprはバチルス・リケニホルミス由
来で、イーコリ、バチルスで形質発現することが知られ
ており、制限酵素EcoRIでAprを含んだDNAフラグメント
を切り出し、pMS502−1と連結し、イーコリに形質転換
し、TcrSmrAprのベクタープラスミドを得る。
もう1箇所存在する。このため、pMS502−1をEcoRIで
部分消化しておく。pTTE11(TcrApr)(J.Bacteriol.,7
76-786,(1981)のAprはバチルス・リケニホルミス由
来で、イーコリ、バチルスで形質発現することが知られ
ており、制限酵素EcoRIでAprを含んだDNAフラグメント
を切り出し、pMS502−1と連結し、イーコリに形質転換
し、TcrSmrAprのベクタープラスミドを得る。
pMS503−1の取得: pMS503は制限酵素EcoRI部位をはさんだ両側に制限酵素S
acI部位が存在するので、薬剤耐性、および複製に関係
ないこの部位をSacIで消化後切除し、形質転換体よりプ
ラスミドDNAを分取しアガロース電気泳動で確認する。
acI部位が存在するので、薬剤耐性、および複製に関係
ないこの部位をSacIで消化後切除し、形質転換体よりプ
ラスミドDNAを分取しアガロース電気泳動で確認する。
pMS503−1はそのままでも勿論プラスミドベクターとし
て使用できるがSmr遺伝子内にある有用な制限酵素部位E
coRI及びHindIIIがSmr以外にもそれぞれ1ケ所ずつ存在
する。またApr遺伝子内にある有用な制限酵素部位PstI
はApr遺伝子外にも1ケ所存在し、このままではEcoRI、
HindIII、PstI部位へのクローニングが困難である。
又、実際使用するクローニングベクターとしては小型で
あることも有利な条件であること、また、薬剤に対する
耐性は1つのベクターで2個あれば充分と考えられる。
て使用できるがSmr遺伝子内にある有用な制限酵素部位E
coRI及びHindIIIがSmr以外にもそれぞれ1ケ所ずつ存在
する。またApr遺伝子内にある有用な制限酵素部位PstI
はApr遺伝子外にも1ケ所存在し、このままではEcoRI、
HindIII、PstI部位へのクローニングが困難である。
又、実際使用するクローニングベクターとしては小型で
あることも有利な条件であること、また、薬剤に対する
耐性は1つのベクターで2個あれば充分と考えられる。
pMS504の取得: pMS503−1にはSmr耐性遺伝子の外部に制限酵素HaeII切
断個所が存在するため、pMS503−1Iを制限酵素HaeIIで
消化し、T4DNAリガーゼによる結合を行い、イーコリへ
変質転換を行いAprTcrSms株を取得する。このものは、A
pr遺伝子外部にあったPstI部位も同時に消失しており、
Apr遺伝子内にあるPstI、BglIIが挿入失活部位として使
用できる。その他のクローニング部位として、このプラ
スミド上に1箇所ある制限酵素部位は、例えばHindII
I、EcoRI、SstI(SacI)等があげられる。イーコリ、シ
ュードモナス、バチルスで複製可能であり、いずれの菌
でもAprTcrの形質発現がある。
断個所が存在するため、pMS503−1Iを制限酵素HaeIIで
消化し、T4DNAリガーゼによる結合を行い、イーコリへ
変質転換を行いAprTcrSms株を取得する。このものは、A
pr遺伝子外部にあったPstI部位も同時に消失しており、
Apr遺伝子内にあるPstI、BglIIが挿入失活部位として使
用できる。その他のクローニング部位として、このプラ
スミド上に1箇所ある制限酵素部位は、例えばHindII
I、EcoRI、SstI(SacI)等があげられる。イーコリ、シ
ュードモナス、バチルスで複製可能であり、いずれの菌
でもAprTcrの形質発現がある。
pMS506の取得: pMS503−1にはAprをはさんだ片方に制限酵素SacI部位
が1箇所あり、これで完全消化しておく。次に制限酵素
EcoRIで部分消化しSIヌクレアーゼで平滑末端とした後T
4ファージDNAリガーゼを作用させて結合後イーコリへ形
質転換しTcrSmrApsを得る。このものは、Smr遺伝子外に
あった制限酵素HindIII、EcoRI部位も同時に除去されて
おり、Smr遺伝子内部のHindIII、EcoRI部位が挿入失活
部位として使用できる。その他のクローニング部位とし
ては、このプラスミドベクター上に1箇所存在する例え
ばPstI、PvuIがあげられる。イーコリ、シュードモナ
ス、バチルスで複製可能であり、いずれの菌でもTcrSmr
を形質発現する。
が1箇所あり、これで完全消化しておく。次に制限酵素
EcoRIで部分消化しSIヌクレアーゼで平滑末端とした後T
4ファージDNAリガーゼを作用させて結合後イーコリへ形
質転換しTcrSmrApsを得る。このものは、Smr遺伝子外に
あった制限酵素HindIII、EcoRI部位も同時に除去されて
おり、Smr遺伝子内部のHindIII、EcoRI部位が挿入失活
部位として使用できる。その他のクローニング部位とし
ては、このプラスミドベクター上に1箇所存在する例え
ばPstI、PvuIがあげられる。イーコリ、シュードモナ
ス、バチルスで複製可能であり、いずれの菌でもTcrSmr
を形質発現する。
以上のようにして得られたプラスミドは、プラスミドと
しての有用性のすべての条件を満たしている。即ち、先
に述べたように、以下のような特徴を有している。
しての有用性のすべての条件を満たしている。即ち、先
に述べたように、以下のような特徴を有している。
コピー数が多く分離取得が容易である。
プラスミド上に存在するテトラサイクリン耐性、ア
ンピシリン耐性、ストレプトマイシン耐性あるいはカナ
マイシン耐性、サルファー剤耐性を選択マーカーとして
使用できる。
ンピシリン耐性、ストレプトマイシン耐性あるいはカナ
マイシン耐性、サルファー剤耐性を選択マーカーとして
使用できる。
プラスミド分子中の唯一の制限酵素切断点として、
アンピシリン耐性遺伝子内にPstI、BglIIまたはBglII、
XbaI、ストレプトマイシン耐性遺伝子内にEcoRI、HindI
II、カナマイシン耐性遺伝子内にXhoI、ClaI、SmaI、Hi
ndIII、サルファー剤耐性遺伝子内にPstI等の非常に使
い易い制限酵素部位が存在する。この為、DNAの複製能
を損なうことなく、DNA断片のクローン化が行え、挿入
失活法により容易に組換え体の選択ができる。
アンピシリン耐性遺伝子内にPstI、BglIIまたはBglII、
XbaI、ストレプトマイシン耐性遺伝子内にEcoRI、HindI
II、カナマイシン耐性遺伝子内にXhoI、ClaI、SmaI、Hi
ndIII、サルファー剤耐性遺伝子内にPstI等の非常に使
い易い制限酵素部位が存在する。この為、DNAの複製能
を損なうことなく、DNA断片のクローン化が行え、挿入
失活法により容易に組換え体の選択ができる。
ベクターに付与されている抗生物質に対して感受性
を有するベチルス、イーコリ、シュードモナスのいずれ
の細胞にも導入することができ、しかも、バチルス、イ
ーコリ、シュードモナスいずれの細胞においても、アン
ピシリン耐性、テトラサイクリン耐性、ストレプトマイ
シン耐性あるいはイーコリ、シュードモナス両方の菌に
おいてアンピシリン耐性、カナマイシン耐性、サルファ
ー剤耐性、,ストレプトマイシン耐性の発現があるた
め、いずれの細胞においても遺伝子組換え操作および挿
入失活法による組換え体の選択が行える。つまり、遺伝
子組換えDNA技術によって物質を生産させる宿主細胞を
選択する上で融通がきき、非常に有利である。
を有するベチルス、イーコリ、シュードモナスのいずれ
の細胞にも導入することができ、しかも、バチルス、イ
ーコリ、シュードモナスいずれの細胞においても、アン
ピシリン耐性、テトラサイクリン耐性、ストレプトマイ
シン耐性あるいはイーコリ、シュードモナス両方の菌に
おいてアンピシリン耐性、カナマイシン耐性、サルファ
ー剤耐性、,ストレプトマイシン耐性の発現があるた
め、いずれの細胞においても遺伝子組換え操作および挿
入失活法による組換え体の選択が行える。つまり、遺伝
子組換えDNA技術によって物質を生産させる宿主細胞を
選択する上で融通がきき、非常に有利である。
イーコリ宿主菌内では、当該プラスミドベクター
は、伝達性プラスミドとの二者共存もしくはそれに第三
の非伝達性プラスミドを加えた三者共存においても伝達
されず安全である。
は、伝達性プラスミドとの二者共存もしくはそれに第三
の非伝達性プラスミドを加えた三者共存においても伝達
されず安全である。
当該プラスミドベクターは、その複製起源がColE
1、pMB1、p15A、R6−5に由来するベクタープラスミドp
CR1、pBR322、pACYC184、pSC101等のすべてと、1個の
大腸菌宿主内で安定に存在することができる。(不和合
群が異なる)。
1、pMB1、p15A、R6−5に由来するベクタープラスミドp
CR1、pBR322、pACYC184、pSC101等のすべてと、1個の
大腸菌宿主内で安定に存在することができる。(不和合
群が異なる)。
以下に本発明を具体的に説明するために実施例をあげ
る。本発明はこれら実施例に限定されるものでないこと
はいうまでもない。
る。本発明はこれら実施例に限定されるものでないこと
はいうまでもない。
なお、実施例において使用される制限酵素用およびその
他の遺伝子操作用緩衝液、酵素反応失活の条件、DNA溶
液の洗浄、濃縮等の条件、略号等は以下に述べるとおり
である。
他の遺伝子操作用緩衝液、酵素反応失活の条件、DNA溶
液の洗浄、濃縮等の条件、略号等は以下に述べるとおり
である。
(1)制限酵素用緩衝液 “Molecular Cloning"(cold Spring Harbor Laborator
y 1982.P104)に従い調製した。又、夫々の緩衝液は図
1のような成分を含む。
y 1982.P104)に従い調製した。又、夫々の緩衝液は図
1のような成分を含む。
(2)その他の遺伝子操作用緩衝液 (a)BAL31用緩衝液の成分 12mM塩化カルシウム、12mM塩化マグネシウム、0.6M食
塩、20mMTris塩酸緩衝液(pH8.0)、1mM EDTA (b)SIヌクレアーゼ用緩衝液の成分 0.28M食塩、0.05M酢酸ナトリウム(pH4.6)、4.5mM硫酸
亜鉛 (c)T4ファージDNAリガーゼ用緩衝液 10mM塩化マグネシウム、20mMジチオスレイトール、50mM
Tris塩酸緩衝液、1mMアデノシン三リン酸、50μgウシ
血清アルブミン。各緩衝液は、共に蒸溜水又は各々の制
限酵素に指定されている緩衝液に、無機塩等を加え所定
の濃度に調製し、ミリポアフィルターを通して除菌後使
用する。
塩、20mMTris塩酸緩衝液(pH8.0)、1mM EDTA (b)SIヌクレアーゼ用緩衝液の成分 0.28M食塩、0.05M酢酸ナトリウム(pH4.6)、4.5mM硫酸
亜鉛 (c)T4ファージDNAリガーゼ用緩衝液 10mM塩化マグネシウム、20mMジチオスレイトール、50mM
Tris塩酸緩衝液、1mMアデノシン三リン酸、50μgウシ
血清アルブミン。各緩衝液は、共に蒸溜水又は各々の制
限酵素に指定されている緩衝液に、無機塩等を加え所定
の濃度に調製し、ミリポアフィルターを通して除菌後使
用する。
(d)TE緩衝液の成分 10mM Tris塩酸緩衝液1mM EDTA(pH8.0) (3)酵素反応失活条件 PstI及びEcoRIについては反応終了時期になったら70℃
の恒温水槽中で5分間静置し酵素を失活させる。
の恒温水槽中で5分間静置し酵素を失活させる。
その他のものについては、DNA溶液と等量のフェノール
を加えて激しく攪拌後、遠心しDNA層をエッペンドルフ
チューブに移す。DNA量と等量のエーテルを加え、激し
く混合し、上層のエーテル層を捨てる。このエーテル処
理操作を4回繰り返し酵素を除去した。
を加えて激しく攪拌後、遠心しDNA層をエッペンドルフ
チューブに移す。DNA量と等量のエーテルを加え、激し
く混合し、上層のエーテル層を捨てる。このエーテル処
理操作を4回繰り返し酵素を除去した。
(4)DNA溶液の洗浄、濃縮等の条件 最終濃度が70%になるようにエタノールを添加し、−20
℃、60分間静置した後10000回転5分間遠心を行い、上
澄みを捨てる。エタノール添加前にDNA溶液中の塩濃度
を上げる必要があり、通常は5M食塩を1/50量又は3M酢酸
ナトリウムを1/10量添加する。
℃、60分間静置した後10000回転5分間遠心を行い、上
澄みを捨てる。エタノール添加前にDNA溶液中の塩濃度
を上げる必要があり、通常は5M食塩を1/50量又は3M酢酸
ナトリウムを1/10量添加する。
(5)略字 Apr:アンピシリン耐性 Aps:アンピシリン感受性 Tcr:テトラサイクリン耐性 Tcs:テトラサイクリン感受性 Smr:ストレプトマイシン耐性 Sms:ストレプトマイシン感受性 Kmr:カナマイシン耐性 Kms:カナマイシン感受性 Sar:サルファー剤耐性 Sas:サルファー剤感受性 実施例1プロテウス ミラビリスGN5404からのpMS71の
取得: プロテウス ミラビリスGN5404をLブロスにて37℃で一
夜振とう培養した培養液1.5mlをエッペンドルフチュー
ブに入れ10000回転1分で集菌しTE緩衝液で1度菌体を
洗浄し、10000回転1分間遠心後、集菌し上澄みを捨
て、菌体をボルテックスミキサーで充分浮遊させ、100
μlの冷溶液I(50mMブドウ糖、10mM EDTA、25mM Tris
塩酸緩衝液 pH8.0、2mg/mlリゾチーム)を加え攪拌後
氷中で30分間保つ。200μlの溶液II(0.2N水酸化ナト
リウム及び1%ラウリル硫酸を含有する。)を加え5〜
10回反転混合後氷中に5分間保つ。150μlの冷溶液III
(3M酢酸ナトリウム pH4.8)を加え、混合後氷中で60
分間静置する。10000回転5分間の遠沈により上澄みを
分取し(約400μl)、別のエッペンドルフチューブに
移す。2倍量(800μl)の冷エタノールを加え混合後
−20℃に30分間静置する。10000回転3分間遠沈して上
澄みを捨て、100μlの溶液IV(0.1M酢酸ナトリウム、5
0mM Tris塩酸緩衝液 pH8.0)を添加して沈渣を溶か
す。2倍量の冷エタノールを加え混合し、−20℃に10分
間置く10000回転3分間の遠沈により沈渣を集め真空デ
シケーター中で乾燥する。沈渣に100μlのTE緩衝液を
添加して溶かし、形質転換用pMS71の材料とした。
取得: プロテウス ミラビリスGN5404をLブロスにて37℃で一
夜振とう培養した培養液1.5mlをエッペンドルフチュー
ブに入れ10000回転1分で集菌しTE緩衝液で1度菌体を
洗浄し、10000回転1分間遠心後、集菌し上澄みを捨
て、菌体をボルテックスミキサーで充分浮遊させ、100
μlの冷溶液I(50mMブドウ糖、10mM EDTA、25mM Tris
塩酸緩衝液 pH8.0、2mg/mlリゾチーム)を加え攪拌後
氷中で30分間保つ。200μlの溶液II(0.2N水酸化ナト
リウム及び1%ラウリル硫酸を含有する。)を加え5〜
10回反転混合後氷中に5分間保つ。150μlの冷溶液III
(3M酢酸ナトリウム pH4.8)を加え、混合後氷中で60
分間静置する。10000回転5分間の遠沈により上澄みを
分取し(約400μl)、別のエッペンドルフチューブに
移す。2倍量(800μl)の冷エタノールを加え混合後
−20℃に30分間静置する。10000回転3分間遠沈して上
澄みを捨て、100μlの溶液IV(0.1M酢酸ナトリウム、5
0mM Tris塩酸緩衝液 pH8.0)を添加して沈渣を溶か
す。2倍量の冷エタノールを加え混合し、−20℃に10分
間置く10000回転3分間の遠沈により沈渣を集め真空デ
シケーター中で乾燥する。沈渣に100μlのTE緩衝液を
添加して溶かし、形質転換用pMS71の材料とした。
実施例2pMS71のイーコリML4901への形質転換: イーコリML4901をLブロスで一夜培養する。その0.1ml
を新しいLブロス10mlに植え37℃で振とう培養する。3.
5時間後OD560nmが0.4になった所で5mlを室温にて3000回
転10分間遠心し、集菌菌体を5mlの10mM食塩−10mMTris
塩酸緩衝液(pH8.0)で1回洗浄する。3000回転10分間
の遠心で集めた菌体を5mlの75mM塩化カルシウム−10mMT
ris塩酸緩衝液(pH8.0)に浮遊させ室温に20分間放置し
た。3000回転10分間遠心し沈渣を再び5mlの75mM塩化カ
ルシウム−10mMTris塩酸緩衝液(pH8.0)に再浮遊し5
分間以上氷中に置いた。このようにしてコンピテントセ
ルを得た。
を新しいLブロス10mlに植え37℃で振とう培養する。3.
5時間後OD560nmが0.4になった所で5mlを室温にて3000回
転10分間遠心し、集菌菌体を5mlの10mM食塩−10mMTris
塩酸緩衝液(pH8.0)で1回洗浄する。3000回転10分間
の遠心で集めた菌体を5mlの75mM塩化カルシウム−10mMT
ris塩酸緩衝液(pH8.0)に浮遊させ室温に20分間放置し
た。3000回転10分間遠心し沈渣を再び5mlの75mM塩化カ
ルシウム−10mMTris塩酸緩衝液(pH8.0)に再浮遊し5
分間以上氷中に置いた。このようにしてコンピテントセ
ルを得た。
実施例1で得たプラスミド溶液の20μlを滅菌小試にと
り氷冷保存したものに、冷コンピテントセル200μlを
加え、軽く混和し20分間氷冷した。42℃で2分間熱処理
後Lブロス1mlを入れ37℃で90分間振とう培養した。300
0回転10分間の遠心後1mlBSG(食塩8.5g、リン酸二水素
カリウム0.3g、リン酸水素二ナトリウム0.6g、ゼラチン
100mg/l)で菌体を洗浄し、1mlのBSGに再浮遊後その10
倍希釈液0.1mlをスルホンアミド100μg/ml含有のLac−B
TB寒天培地上に塗抹し、37℃で24時間培養した。形質転
換株の純培養を薬剤含有プレート上で2回繰り返し、そ
のコロニーから実施例1の方法に従ってプラスミドの分
離を行い、アガロースゲル電気泳動により同一サイズの
ものであることを確認した。
り氷冷保存したものに、冷コンピテントセル200μlを
加え、軽く混和し20分間氷冷した。42℃で2分間熱処理
後Lブロス1mlを入れ37℃で90分間振とう培養した。300
0回転10分間の遠心後1mlBSG(食塩8.5g、リン酸二水素
カリウム0.3g、リン酸水素二ナトリウム0.6g、ゼラチン
100mg/l)で菌体を洗浄し、1mlのBSGに再浮遊後その10
倍希釈液0.1mlをスルホンアミド100μg/ml含有のLac−B
TB寒天培地上に塗抹し、37℃で24時間培養した。形質転
換株の純培養を薬剤含有プレート上で2回繰り返し、そ
のコロニーから実施例1の方法に従ってプラスミドの分
離を行い、アガロースゲル電気泳動により同一サイズの
ものであることを確認した。
実施例3:アガロースゲル電気泳動によるプラスミドの確
認: TEAS緩衝液(0.05MTris塩酸、2mM EDTA、18mM食塩、20m
M酢酸ナトリウム、pH8.0)で調製した0.8%アガロース1
600(和光純薬製)を120℃で10分間オートクレーブにか
け、温度が65℃になった時点でアガロースを取り出し泡
の立たないようによく混ぜ、電気泳動用装置に静かに流
し込み、静置してゲルとした。DNAサンプル10μlにブ
ルージュース(10倍濃度のTEAS緩衝液2ml、ブロムフェ
ノールブル1.0mg、ショ糖12g、0.5M EDTA0.8mlを蒸溜水
で20mlにしたもの〕1μlを加えて混和しゲルに注入し
た。60mAで10分間泳動しブルージュースがゲル内に流れ
てゆくのを確認後25mAで12時間泳動した。ゲルを装置か
ら静かに取り出しエチジウムブロマイド(0.5μg/ml)
で30分間染色し、ゲルを2回蒸溜水で洗浄後紫外線ラン
プ照射のトランスイルミネータUVフイルター上に乗せポ
ラロイドタイプ 57フイルムに撮影した。
認: TEAS緩衝液(0.05MTris塩酸、2mM EDTA、18mM食塩、20m
M酢酸ナトリウム、pH8.0)で調製した0.8%アガロース1
600(和光純薬製)を120℃で10分間オートクレーブにか
け、温度が65℃になった時点でアガロースを取り出し泡
の立たないようによく混ぜ、電気泳動用装置に静かに流
し込み、静置してゲルとした。DNAサンプル10μlにブ
ルージュース(10倍濃度のTEAS緩衝液2ml、ブロムフェ
ノールブル1.0mg、ショ糖12g、0.5M EDTA0.8mlを蒸溜水
で20mlにしたもの〕1μlを加えて混和しゲルに注入し
た。60mAで10分間泳動しブルージュースがゲル内に流れ
てゆくのを確認後25mAで12時間泳動した。ゲルを装置か
ら静かに取り出しエチジウムブロマイド(0.5μg/ml)
で30分間染色し、ゲルを2回蒸溜水で洗浄後紫外線ラン
プ照射のトランスイルミネータUVフイルター上に乗せポ
ラロイドタイプ 57フイルムに撮影した。
実施例4クリアード ライセイト法によるDNAの分取: 実施例2で得たpMS71/ML4901をLブロス200ml/500ml坂
口コルベンで37℃一夜振とう培養し、4℃6000回転で、
15分間遠心し集菌した菌体をTE緩衝液にて1度洗浄す
る。集菌菌体を10mlの冷25%ショ糖液(25%ショ糖/50m
MTris塩酸緩衝液−1mM EDTA pH8.0)に再浮遊させ、リ
ボヌクレアーゼを最終濃度20μg/mlとなるように加え、
30ml容の遠心チューブに移す。2分間最高速度のボルテ
ックスミキサーを用いて混合した後、1%リゾチーム
(0.25MTris塩酸緩衝液 pH8.0)溶液1mlを加えよく振
った後5分間氷冷した。0.5M EDTA(pH8.0)2.0mlを加
え静かに混合後10分間氷冷した。冷トリトン溶菌液(0.
1%トリトンX−100、50mMTris塩酸緩衝液、62.5mMEDTA
pH8.0)16mlを加え、2回上下逆にし静かに混合後15分
間氷冷した。4℃にて30000回転20分間遠心し、上澄み
を100ml容三角フラスコに分取しポリエチレングリコー
ル6000を10%(W/V)入れ静かに混合してポリエチレン
グリコールが溶けてから1/9量の5M食塩を加え混合後4
℃で一夜保存した。4℃にて5000回転10分間遠心し上澄
みを捨て、沈渣にTE緩衝液5.3mlを加えDNAを静かに溶解
させた。塩化セシウム5gにDNAサンプル5.1mlを静かに混
ぜ完全に溶解した後エチジウムブロマイド(10mg/ml)
を0.1ml加え混合後20℃にて37000回転40時間遠心した。
トランスイルミネータUVフイルター上で遠心管の側面か
ら注射針を用いて螢光バンドを約1ml抜き出した。塩化
セシウム飽和イソプロパノールを等量加え静かに振りエ
チジウムブロマイドを脱色した。これを3回繰り返し、
トランスイルミネータUVフィルター上で完全に脱色され
ているのを確認後透析チューブに移し0.1SSC(15mM食
塩、1.5mMクエン酸ナトリウム)に透析した。
口コルベンで37℃一夜振とう培養し、4℃6000回転で、
15分間遠心し集菌した菌体をTE緩衝液にて1度洗浄す
る。集菌菌体を10mlの冷25%ショ糖液(25%ショ糖/50m
MTris塩酸緩衝液−1mM EDTA pH8.0)に再浮遊させ、リ
ボヌクレアーゼを最終濃度20μg/mlとなるように加え、
30ml容の遠心チューブに移す。2分間最高速度のボルテ
ックスミキサーを用いて混合した後、1%リゾチーム
(0.25MTris塩酸緩衝液 pH8.0)溶液1mlを加えよく振
った後5分間氷冷した。0.5M EDTA(pH8.0)2.0mlを加
え静かに混合後10分間氷冷した。冷トリトン溶菌液(0.
1%トリトンX−100、50mMTris塩酸緩衝液、62.5mMEDTA
pH8.0)16mlを加え、2回上下逆にし静かに混合後15分
間氷冷した。4℃にて30000回転20分間遠心し、上澄み
を100ml容三角フラスコに分取しポリエチレングリコー
ル6000を10%(W/V)入れ静かに混合してポリエチレン
グリコールが溶けてから1/9量の5M食塩を加え混合後4
℃で一夜保存した。4℃にて5000回転10分間遠心し上澄
みを捨て、沈渣にTE緩衝液5.3mlを加えDNAを静かに溶解
させた。塩化セシウム5gにDNAサンプル5.1mlを静かに混
ぜ完全に溶解した後エチジウムブロマイド(10mg/ml)
を0.1ml加え混合後20℃にて37000回転40時間遠心した。
トランスイルミネータUVフイルター上で遠心管の側面か
ら注射針を用いて螢光バンドを約1ml抜き出した。塩化
セシウム飽和イソプロパノールを等量加え静かに振りエ
チジウムブロマイドを脱色した。これを3回繰り返し、
トランスイルミネータUVフィルター上で完全に脱色され
ているのを確認後透析チューブに移し0.1SSC(15mM食
塩、1.5mMクエン酸ナトリウム)に透析した。
実施例5pMS7.1−17の取得: クリアードライセイト法(実施例4)で得られたpMS71
40μlに10倍濃度の中濃度緩衝液(500mM食塩、100mM
Tris塩酸緩衝液 pH7.5、100mM塩化マグネシウム、10mM
ジチオスレイトール)4μlに制限酵素BamHI 2μl
(3.2単位)を加え37℃で一夜反応させた。同様にクリ
アードライセイト法で得られたpMS160−1 40μlにつ
いても、10倍濃度の中濃度緩衝液4μlにBamHI 2μ
l(3.2単位)を加え37℃で一夜反応させた。その10μ
lを使用しアガロースゲル電気泳動で各々のプラスミド
が1箇所切断されているのを確認後、それぞれのプラス
ミド溶液に3M酢酸ナトリウム3μl、冷エタノール80μ
lを加え混合後−80℃で30分放置した後10000回転5分
間遠心し上澄みを捨て真空ポンプで乾燥させた。各々滅
菌蒸溜水30μlで溶かし10倍濃度の高濃度緩衝液3μ
l、EcoRI 2μl(4.0単位)を加え37℃で一夜反応さ
せた。アガロースゲル電気泳動でプラスミドの切断を確
認後、それぞれ20μlずつを混合し、40μlのTE飽和フ
ェノールを加え激しく攪拌する。10000回転1分間遠心
した後、上層のDNA層を他のエッペンドルフチューブに
移した。40μlのエーテルを加え激しく混合し残留フェ
ノールをエーテル層に移行させた後静置し上層のエーテ
ル層を捨てた。このエーテルによる処理を4回繰り返し
た後80μlのエタノールを加え−80℃で30分間放置し
た。10000回転5分間遠心し上澄みを捨て、沈渣を真空
ポンプで乾燥した。T4DNAリガーゼ用緩衝液30μlを加
えDNAを溶解後、T4DNAリガーゼ1μlを加え攪拌後16℃
で一夜反応させた。この20μlを実施例2と同様に調製
したML4901のコンピテントセル200μlに加え形質転換
させSa Apなる形質転換株を得、アガロースゲル電気泳
動、各種制限酵素による分析の結果、S71−17(5.2Md)
を得た。
40μlに10倍濃度の中濃度緩衝液(500mM食塩、100mM
Tris塩酸緩衝液 pH7.5、100mM塩化マグネシウム、10mM
ジチオスレイトール)4μlに制限酵素BamHI 2μl
(3.2単位)を加え37℃で一夜反応させた。同様にクリ
アードライセイト法で得られたpMS160−1 40μlにつ
いても、10倍濃度の中濃度緩衝液4μlにBamHI 2μ
l(3.2単位)を加え37℃で一夜反応させた。その10μ
lを使用しアガロースゲル電気泳動で各々のプラスミド
が1箇所切断されているのを確認後、それぞれのプラス
ミド溶液に3M酢酸ナトリウム3μl、冷エタノール80μ
lを加え混合後−80℃で30分放置した後10000回転5分
間遠心し上澄みを捨て真空ポンプで乾燥させた。各々滅
菌蒸溜水30μlで溶かし10倍濃度の高濃度緩衝液3μ
l、EcoRI 2μl(4.0単位)を加え37℃で一夜反応さ
せた。アガロースゲル電気泳動でプラスミドの切断を確
認後、それぞれ20μlずつを混合し、40μlのTE飽和フ
ェノールを加え激しく攪拌する。10000回転1分間遠心
した後、上層のDNA層を他のエッペンドルフチューブに
移した。40μlのエーテルを加え激しく混合し残留フェ
ノールをエーテル層に移行させた後静置し上層のエーテ
ル層を捨てた。このエーテルによる処理を4回繰り返し
た後80μlのエタノールを加え−80℃で30分間放置し
た。10000回転5分間遠心し上澄みを捨て、沈渣を真空
ポンプで乾燥した。T4DNAリガーゼ用緩衝液30μlを加
えDNAを溶解後、T4DNAリガーゼ1μlを加え攪拌後16℃
で一夜反応させた。この20μlを実施例2と同様に調製
したML4901のコンピテントセル200μlに加え形質転換
させSa Apなる形質転換株を得、アガロースゲル電気泳
動、各種制限酵素による分析の結果、S71−17(5.2Md)
を得た。
実施例6pMS71−17およびpMS140−1からpMS500の作製: pMS140−1 50μl(1μgDNA)に制限酵素用の10倍濃
度の高濃度緩衝液5μlおよびEcoRI 0.5μl(2.5単
位)を加え、37℃で一夜反応させる。同様にpMS71−17
50μlをEcoRIで処理する。両者を混合し70℃5分間
熱処理をして反応を停止させ、220μlの99.5%エタノ
ールを加え混合後−20℃60分間静置した。次に10000回
転5分間遠心し上澄みを捨て減圧乾燥する。これにT4DN
Aリガーゼ用緩衝液50μlとT4DNAリガーゼ0.2μl(1
単位)を加え16℃で一夜反応させる。イーコリのコンピ
テントセル懸濁液200μlを加え氷上で20分間反応さ
せ、次いで42℃で2分間処理した。これに1mlのLブロ
スを加え37℃で90分間振とう培養し、3000回転10分間遠
心分離して集菌した菌体を2回1mlのBSGで洗浄し、アン
ピシリン25μg/ml含有Lac−BTB寒天培地上に広げる。一
夜37℃にて培養後、生育コロニーを滅菌したつまようじ
でTc12.5μg/ml及びアンピシリン25μg/mlを含有したLa
c−BTB寒天培地上のそれぞれにストリークし、両方の培
地に生育したものを同一薬剤濃度の培地上で2度純化し
AprTcr株を取得した。
度の高濃度緩衝液5μlおよびEcoRI 0.5μl(2.5単
位)を加え、37℃で一夜反応させる。同様にpMS71−17
50μlをEcoRIで処理する。両者を混合し70℃5分間
熱処理をして反応を停止させ、220μlの99.5%エタノ
ールを加え混合後−20℃60分間静置した。次に10000回
転5分間遠心し上澄みを捨て減圧乾燥する。これにT4DN
Aリガーゼ用緩衝液50μlとT4DNAリガーゼ0.2μl(1
単位)を加え16℃で一夜反応させる。イーコリのコンピ
テントセル懸濁液200μlを加え氷上で20分間反応さ
せ、次いで42℃で2分間処理した。これに1mlのLブロ
スを加え37℃で90分間振とう培養し、3000回転10分間遠
心分離して集菌した菌体を2回1mlのBSGで洗浄し、アン
ピシリン25μg/ml含有Lac−BTB寒天培地上に広げる。一
夜37℃にて培養後、生育コロニーを滅菌したつまようじ
でTc12.5μg/ml及びアンピシリン25μg/mlを含有したLa
c−BTB寒天培地上のそれぞれにストリークし、両方の培
地に生育したものを同一薬剤濃度の培地上で2度純化し
AprTcr株を取得した。
実施例7pMS500からpMS500−1の調製: プラスミドpMS500保有株から、前記したプラスミドを単
離する方法により、プラスミドを取得し、その20μlに
制限酵素用の10倍濃度の低濃度緩衝液2μlおよびKpnI
0.5μl(4.5単位)を加え、30℃にて一夜反応した。
これに0.25μlの5M食塩とHindIII0.5μl(6.0単位)
を加え37℃にて5時間反応した。次いで2μlの3M酢酸
ナトリウムおよび99.5%エタノール 50μlを加え混合
後−20℃に60分間静置した。これを10000回転5分間遠
心し上澄みを捨て減圧乾燥し、沈澱をSIヌクレアーゼ用
緩衝液50μlに懸濁後、SIヌクレアーゼ 0.5μl(29
単位)を添加し、30℃にて30分間反応後50μlTE飽和フ
ェノールを加えボルテックスミキサーで激しく攪拌(約
5秒)し、10000回転1分間遠心後上層の水層を分取す
る。これに50μlの水飽和エーテルを加えて攪拌(約2
秒)した後1分間静置し、上層のエーテル層を捨てる。
このエーテル処理を4回繰り返し、その後水層(約50μ
l)に99.5%エタノール120μlを加え−20℃で静置す
る。1時間後10000回転5分間遠沈し、沈澱を70%エタ
ノール100μlで洗浄後再び遠沈し、上澄みを捨て、減
圧乾燥し、T4リガーゼ用緩衝液50μlに懸濁し、T4DNA
リガーゼ0.2μl(10単位)を添加し16℃で一夜反応し
た。その後イーコリへの形質転換は実施例6と同様に行
い、テトラサイクリン12.5μg/mlを含有したLac−BTB寒
天培地に菌液を広げ、37℃にて一夜培養して、生育した
コロニーでアンピシリン25μg/mlに生育しないものを取
得した。このようにして、TcrAps株を得た。
離する方法により、プラスミドを取得し、その20μlに
制限酵素用の10倍濃度の低濃度緩衝液2μlおよびKpnI
0.5μl(4.5単位)を加え、30℃にて一夜反応した。
これに0.25μlの5M食塩とHindIII0.5μl(6.0単位)
を加え37℃にて5時間反応した。次いで2μlの3M酢酸
ナトリウムおよび99.5%エタノール 50μlを加え混合
後−20℃に60分間静置した。これを10000回転5分間遠
心し上澄みを捨て減圧乾燥し、沈澱をSIヌクレアーゼ用
緩衝液50μlに懸濁後、SIヌクレアーゼ 0.5μl(29
単位)を添加し、30℃にて30分間反応後50μlTE飽和フ
ェノールを加えボルテックスミキサーで激しく攪拌(約
5秒)し、10000回転1分間遠心後上層の水層を分取す
る。これに50μlの水飽和エーテルを加えて攪拌(約2
秒)した後1分間静置し、上層のエーテル層を捨てる。
このエーテル処理を4回繰り返し、その後水層(約50μ
l)に99.5%エタノール120μlを加え−20℃で静置す
る。1時間後10000回転5分間遠沈し、沈澱を70%エタ
ノール100μlで洗浄後再び遠沈し、上澄みを捨て、減
圧乾燥し、T4リガーゼ用緩衝液50μlに懸濁し、T4DNA
リガーゼ0.2μl(10単位)を添加し16℃で一夜反応し
た。その後イーコリへの形質転換は実施例6と同様に行
い、テトラサイクリン12.5μg/mlを含有したLac−BTB寒
天培地に菌液を広げ、37℃にて一夜培養して、生育した
コロニーでアンピシリン25μg/mlに生育しないものを取
得した。このようにして、TcrAps株を得た。
実施例8pMS500−1とpMS501からpMS502の取得: pMS500−1 20μlに2μlの制限酵素用の10倍濃度の
中濃度緩衝液2μlおよびPstI 1μl(5単位)を添
加し30℃で反応した。別にまた、pMS501 50μlに10倍
濃度の中濃度緩衝液5μlおよびPstI 1μl(5単
位)を添加し30℃で一夜反応した。両者を混合し、70℃
で5分間酵素失活処理を行い、他は実施例6と同様にエ
タノール沈澱処理、T4リガーゼ反応の操作を行い、イー
コリへ形質転換した。得られた菌株をテトラサイクリン
12.5μg/mlを含有したLac−BTB寒天培地にて選択し、更
にこの培地で生育したコロニーをストレプトマイシン6.
25μg/ml含有Lac−BTB寒天培地にストリークして、テト
ラサイクリン12.5μg/mlストレプトマイシン6.25μg/ml
に対する耐性を有している株を選択して、TcrSmr株を取
得した。
中濃度緩衝液2μlおよびPstI 1μl(5単位)を添
加し30℃で反応した。別にまた、pMS501 50μlに10倍
濃度の中濃度緩衝液5μlおよびPstI 1μl(5単
位)を添加し30℃で一夜反応した。両者を混合し、70℃
で5分間酵素失活処理を行い、他は実施例6と同様にエ
タノール沈澱処理、T4リガーゼ反応の操作を行い、イー
コリへ形質転換した。得られた菌株をテトラサイクリン
12.5μg/mlを含有したLac−BTB寒天培地にて選択し、更
にこの培地で生育したコロニーをストレプトマイシン6.
25μg/ml含有Lac−BTB寒天培地にストリークして、テト
ラサイクリン12.5μg/mlストレプトマイシン6.25μg/ml
に対する耐性を有している株を選択して、TcrSmr株を取
得した。
実施例9pMS502からpMS502−1の調整: pMS502 20μlに10倍濃度の中濃度緩衝液2μlおよび
AccI 2μl(1.4単位/μl)を加え混合した後、37
℃にて一夜反応した。以下実施例12と同様にフェノール
処理、エーテル処理(5回)、エタノール沈澱、T4リガ
ーゼ処理およびイーコリへの形質転換処理を行って得た
菌株につき、テトラサイクリン12.5μg/ml耐性で選択
し、更にストレプトマイシン6.25μg/ml耐性株を選択し
てプラスミドを分離しアガロース電気泳動により、元の
pMS502より小さくなったものを選択しpMS502−1を取得
した。
AccI 2μl(1.4単位/μl)を加え混合した後、37
℃にて一夜反応した。以下実施例12と同様にフェノール
処理、エーテル処理(5回)、エタノール沈澱、T4リガ
ーゼ処理およびイーコリへの形質転換処理を行って得た
菌株につき、テトラサイクリン12.5μg/ml耐性で選択
し、更にストレプトマイシン6.25μg/ml耐性株を選択し
てプラスミドを分離しアガロース電気泳動により、元の
pMS502より小さくなったものを選択しpMS502−1を取得
した。
実施例10pMS502−1とpTTE11からpMS503の調製: pTTE11 20μlに10倍濃度の高濃度緩衝液2μl及びEc
oRI 0.5μl(0.25単位)を加え37℃にて一夜反応し
た。別にpMS502−1 20μlに10倍濃度の高濃度緩衝液
2μlおよびEcoRI 1μl(0.5単位)を加え、37℃に
て10分間反応した。両者を混合し、70℃にて5分間熱処
理を行い、以下は実施例6と同様に処理して、イーコリ
への形質転換を行いストレプトマイシン3.13μg/ml含有
したLac−BTB寒天培地に生育するコロニーを選択し、更
にアンピシリン25μg/mlおよびテトラサイクリン12.5μ
g/mlを有するコロニーを選択して、TcrSmrApr株を得
た。アガロースゲル電気泳動により、元のpTTE11が混在
していないこと、及びpMS502−1よりサイズが大きくな
っていることを確認した。
oRI 0.5μl(0.25単位)を加え37℃にて一夜反応し
た。別にpMS502−1 20μlに10倍濃度の高濃度緩衝液
2μlおよびEcoRI 1μl(0.5単位)を加え、37℃に
て10分間反応した。両者を混合し、70℃にて5分間熱処
理を行い、以下は実施例6と同様に処理して、イーコリ
への形質転換を行いストレプトマイシン3.13μg/ml含有
したLac−BTB寒天培地に生育するコロニーを選択し、更
にアンピシリン25μg/mlおよびテトラサイクリン12.5μ
g/mlを有するコロニーを選択して、TcrSmrApr株を得
た。アガロースゲル電気泳動により、元のpTTE11が混在
していないこと、及びpMS502−1よりサイズが大きくな
っていることを確認した。
実施例11pMS503からpMS503−1の調製: pMS503 20μlに10倍濃度の低濃度緩衝液2μl及びSa
cI 0.5μl(1.25単位)を加え、37℃にて一夜反応し
た。以下実施例5と同様にフェノール処理(20μl)お
よびエーテル処理(20μl、4回)を行い、エタノール
濃縮後リガーゼ反応およびイコリへの形質転換を行っ
て、ストレプトマイシン3.13μg/mlで選択した生育コロ
ニーをテトラサイクリン12.5μg/mlおよびアンピシリン
25μg/mlで生育することを確認した。このコロニーから
実施例1の方法に従いプラスミドの分離を行って、アガ
ロースゲル電気泳動でプラスミドが小さくなっているこ
とを確認した。
cI 0.5μl(1.25単位)を加え、37℃にて一夜反応し
た。以下実施例5と同様にフェノール処理(20μl)お
よびエーテル処理(20μl、4回)を行い、エタノール
濃縮後リガーゼ反応およびイコリへの形質転換を行っ
て、ストレプトマイシン3.13μg/mlで選択した生育コロ
ニーをテトラサイクリン12.5μg/mlおよびアンピシリン
25μg/mlで生育することを確認した。このコロニーから
実施例1の方法に従いプラスミドの分離を行って、アガ
ロースゲル電気泳動でプラスミドが小さくなっているこ
とを確認した。
実施例12pMS503−1からpMS504の調製: pMS503−1 20μlに10倍濃度の低濃度緩衝液2μlお
よびHaeII 0.5μl(4単位)を添加し、37℃にて一夜
反応した。以下実施例16と同様に処理したものをアンピ
シリン25μg/mlで選択し、生育コロニーをテトラサイク
リン12.5μg/mlで生育し、ストレプトマイシン3.13μg/
mlで生育しないコロニーを選択して、AprTcrSms株を得
た。このもの、実施例16と同様にアガロースゲル電気泳
動で確認した。
よびHaeII 0.5μl(4単位)を添加し、37℃にて一夜
反応した。以下実施例16と同様に処理したものをアンピ
シリン25μg/mlで選択し、生育コロニーをテトラサイク
リン12.5μg/mlで生育し、ストレプトマイシン3.13μg/
mlで生育しないコロニーを選択して、AprTcrSms株を得
た。このもの、実施例16と同様にアガロースゲル電気泳
動で確認した。
実施例13pMS503−1からpMS506の調製: pMS503−1 50μlに10倍濃度の低濃度緩衝液5μlお
よびSacI 1.5μl(22.5単位)を添加し37℃にて一夜
反応した。このものに10倍濃度の高濃度緩衝液6μlを
加え、更にEcoRI 1μl(0.5単位)を添加して、37℃
にて15分間反応した。その後、70℃にて5分間熱処理を
行って反応を停止させた。これに99.5%エタノール140
μlを加え混合後、−20℃にて60分間静置した。以下は
実施例12と同様にSIヌクレアーゼ処理、フェノール処
理、エーテル処理(4回)、エタノール処理、次いでT4
リガーゼ処理を行った後、イーコリへの形質転換を行っ
た。このものをストレプトマイシン3.13μg/mlを含有し
たLac−BTB寒天培地を播いて生育するコロニーを選択
し、この生育コロニーがテトラサイクリン12.5μg/ml耐
性であり、アンピシリン25μg/mlに感受性であることを
確認して、SmrTcrAps株を得た。このものから、実施例
1の方法に従いプラスミドの分離を行ってアガロースゲ
ル電気泳動で確認した。
よびSacI 1.5μl(22.5単位)を添加し37℃にて一夜
反応した。このものに10倍濃度の高濃度緩衝液6μlを
加え、更にEcoRI 1μl(0.5単位)を添加して、37℃
にて15分間反応した。その後、70℃にて5分間熱処理を
行って反応を停止させた。これに99.5%エタノール140
μlを加え混合後、−20℃にて60分間静置した。以下は
実施例12と同様にSIヌクレアーゼ処理、フェノール処
理、エーテル処理(4回)、エタノール処理、次いでT4
リガーゼ処理を行った後、イーコリへの形質転換を行っ
た。このものをストレプトマイシン3.13μg/mlを含有し
たLac−BTB寒天培地を播いて生育するコロニーを選択
し、この生育コロニーがテトラサイクリン12.5μg/ml耐
性であり、アンピシリン25μg/mlに感受性であることを
確認して、SmrTcrAps株を得た。このものから、実施例
1の方法に従いプラスミドの分離を行ってアガロースゲ
ル電気泳動で確認した。
実施例14プアスミドベクターのバチルス、シュードモナ
スへの形質転換: イーコリから文献(三橋進編「薬剤感受性測定法」P.42
〜48)の記載の方法に従って得られたプラスミドベクタ
ー25μlを使用し、バチルス・サチルス、シュードモナ
ス・エルギノサ、シュードモナス・プチダへの形質転換
を行った。
スへの形質転換: イーコリから文献(三橋進編「薬剤感受性測定法」P.42
〜48)の記載の方法に従って得られたプラスミドベクタ
ー25μlを使用し、バチルス・サチルス、シュードモナ
ス・エルギノサ、シュードモナス・プチダへの形質転換
を行った。
(A)バチルス・サチルス(CRK3000):前記実施例で
得たpMS504またはpMS506 25μlとバチルス・サチルス
(CRK3000)コンピテントセル200μlを混合し、37℃に
て30分間反応した。このものをテトラサイクリン6.25μ
g/mlを含有するハートインフュージョン寒天培地に播い
て37℃にて一夜培養して、生育したコロニーをテトラサ
イクリン12.5μg/mlで純粋培養した。この菌株を感受性
測定用ブイヨン(ニッスイ製)に植え37℃で18時間静置
培養する。この菌液をBSGで105〜106cells/mlになるよ
うに希釈しこれを接種用菌液とし、ミクロプランターに
よって各種、各濃度の薬剤含有寒天平板にその5μlを
接種した。37℃18時間培養後、菌の生育の有無を判定し
た。結果を表1に示す。
得たpMS504またはpMS506 25μlとバチルス・サチルス
(CRK3000)コンピテントセル200μlを混合し、37℃に
て30分間反応した。このものをテトラサイクリン6.25μ
g/mlを含有するハートインフュージョン寒天培地に播い
て37℃にて一夜培養して、生育したコロニーをテトラサ
イクリン12.5μg/mlで純粋培養した。この菌株を感受性
測定用ブイヨン(ニッスイ製)に植え37℃で18時間静置
培養する。この菌液をBSGで105〜106cells/mlになるよ
うに希釈しこれを接種用菌液とし、ミクロプランターに
よって各種、各濃度の薬剤含有寒天平板にその5μlを
接種した。37℃18時間培養後、菌の生育の有無を判定し
た。結果を表1に示す。
以上形質転換された菌株は、その他ニトロセフィン法に
よってもpMS504がβ−ラクタマーゼをつくっていること
が確認できた。
よってもpMS504がβ−ラクタマーゼをつくっていること
が確認できた。
(B)シュードモナス・エルギノサ、シュードモナス・
プチダ:前記実施例で得られたpMS506 25μlとシュー
ドモナス・エルギノサまたはシュードモナス・プチダの
コンピテントセル200μlと混合し、0℃にて60分間反
応させた。その後42℃にて2分間加熱処理をし、そのも
のにLブロス1mlを添加し、37℃にて90分間培養した。3
000回転にて10分遠心し、BSGで2回洗浄し、更にBSG0.5
mlを加えた。このものをストレプトマイシン12.5μg/ml
を含有したLac−BTB寒天培地に播いて選択を行い、更に
ストレプトマイシン25μg/ml含有培地で純粋培養を2回
繰り返し、形質転換した純粋培養シュードモナス・エル
ギノサ菌株およびシュードモナス・プチダ菌株を得た。
これらの菌(106cells/ml)のMIC(μg/ml)を以下表
2、3に示す。
プチダ:前記実施例で得られたpMS506 25μlとシュー
ドモナス・エルギノサまたはシュードモナス・プチダの
コンピテントセル200μlと混合し、0℃にて60分間反
応させた。その後42℃にて2分間加熱処理をし、そのも
のにLブロス1mlを添加し、37℃にて90分間培養した。3
000回転にて10分遠心し、BSGで2回洗浄し、更にBSG0.5
mlを加えた。このものをストレプトマイシン12.5μg/ml
を含有したLac−BTB寒天培地に播いて選択を行い、更に
ストレプトマイシン25μg/ml含有培地で純粋培養を2回
繰り返し、形質転換した純粋培養シュードモナス・エル
ギノサ菌株およびシュードモナス・プチダ菌株を得た。
これらの菌(106cells/ml)のMIC(μg/ml)を以下表
2、3に示す。
なお、使用したイーコリ(106cells/ml)のMIC値は以下
表4に示すとおりであった。
表4に示すとおりであった。
第1図は本発明のイーコリ、シュードモナスで機能する
多機能ベクタープラスミドの制限サイトとプラスミドを
作製する工程を示す。 第2図は本発明の多機能ベクターを製造する工程中の各
プラスミドの制限酵素切断図ならびに耐性部位を示す
(なお、図中矢印は各々のプラスミド上の制限酵素切断
部位が次のプラスミド上のどの位置に移ったかを示すた
めのものである)。 第3図は本発明の中間体プラスミドの制限サイトと各プ
ラスミドの作成工程を示す。 第4図は本発明のイーコリ、バチルスおよびシュードモ
ナスで機能する多機能プラスミドベクターの制限サイト
と各プラスミドの作成工程を示す。 第5図A、第5図Bおよび第5図Cは本発明の多機能ベ
クターを製造する工程中の各プラスミドの制限酵素図
〔一点鎖線の部分が、pMS71の複製を司る部分(エッセ
リシア・コリとシュードモナス・エルギノサ)で、点線
の部分がpMS140−1の複製を司る部分(バチルス・サチ
ルス)〕ならびに耐性部位を示す。
多機能ベクタープラスミドの制限サイトとプラスミドを
作製する工程を示す。 第2図は本発明の多機能ベクターを製造する工程中の各
プラスミドの制限酵素切断図ならびに耐性部位を示す
(なお、図中矢印は各々のプラスミド上の制限酵素切断
部位が次のプラスミド上のどの位置に移ったかを示すた
めのものである)。 第3図は本発明の中間体プラスミドの制限サイトと各プ
ラスミドの作成工程を示す。 第4図は本発明のイーコリ、バチルスおよびシュードモ
ナスで機能する多機能プラスミドベクターの制限サイト
と各プラスミドの作成工程を示す。 第5図A、第5図Bおよび第5図Cは本発明の多機能ベ
クターを製造する工程中の各プラスミドの制限酵素図
〔一点鎖線の部分が、pMS71の複製を司る部分(エッセ
リシア・コリとシュードモナス・エルギノサ)で、点線
の部分がpMS140−1の複製を司る部分(バチルス・サチ
ルス)〕ならびに耐性部位を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 (C12N 1/21 C12R 1:385) (C12N 1/21 C12R 1:07)
Claims (9)
- 【請求項1】多機能組替えDNAクローニングベクターで
あって、 a)下記の制限酵素地図およびテトラサイクリン耐性の
位置が示されるバチルス・サチルスで機能するバチルス
・セレウス由来のpMS140−1なる制限フラグメント および下記の制限酵素地図およびサルファ剤耐性の位置
が示されるエッセリシア・コリならびにシュードモナス
・エルギノーサで機能するプロテウス・ミラビリス由来
のpMS71なる制限酵素フラグメントである複製起源、 ならびに b)該ベクターを構成している複製起源が機能し得る感
受性宿主細胞であって、形質転換、細胞分裂おび培養が
可能な宿主細胞に導入された時、少なくとも、一種の抗
生物質に対する、グラム陽性菌由来の薬剤耐性であっ
て、バチルス・サチルス、エッセリシア・コリおよびシ
ドモナス・エルギノーサの何れの菌種においても発現す
る耐性を付与する二種のDNAセグメントを含有する多機
能クローニングベクター。 - 【請求項2】該プラスミドにおいて、選択マーカーとな
る遺伝子が、アンピシリン耐性遺伝子、ストレプトマイ
シン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子から選ば
れる1種または2種以上の遺伝子である特許請求の範囲
第1項記載のベクター。 - 【請求項3】該選択マーカーとなる遺伝子がグラム陽性
菌のクロモゾームまたはプラスミド由来である特許請求
の範囲第2項記載のベクター。 - 【請求項4】a)下記の制限酵素地図およびテトラサイ
クリン耐性の位置が示されるバチルス・サチルスで機能
するバチルス・セレウス由来のpMS140−1なる制限フラ
グメント および下記の制限酵素地図およびサルファ剤耐性の位置
が示されるエッセリシア・コリならびにシュードモナス
・エルギノーサで機能するプロテウス・ミラビリス由来
のpMS71なる制限酵素フラグメントである複製起源、 ならびに b)該ベクターを構成している複製起源が機能し得る感
受性宿主細胞であって、形質転換、細胞分裂おび培養が
可能な宿主細胞に導入された時、少なくとも、一種の抗
生物質に対する、グラム陽性菌由来の薬剤耐性であっ
て、バチルス・サチルス、エッセリシア・コリおよびシ
ドモナス・エルギノーサの何れの菌種においても発現す
る耐性を付与する二種のDNAセグメントを含有する多機
能クローニングベクターのいずれかを含有する、形質転
換された細菌宿主細胞。(ただし該宿主細胞は、形質転
換前、DNAセグメント含有該ベクターによって耐性が付
与されるところの抗生物質に対して感受性を有してお
り、そして該ベクターを構成している少なくとも1個の
複製起源は該宿主細胞において機能を有する。) - 【請求項5】細菌宿主細胞がバチルス・サチルス、エッ
セリシア・コリ、シュードモナス・エルギノーサまたは
シュードモナス・プチダである特許請求の範囲第1項記
載のベクター。 - 【請求項6】pMS504(AprTcr)およびその誘導体である
特許請求の範囲第1項記載のベクター。 - 【請求項7】pMS506(TcrSmr)およびその誘導体である
特許請求の範囲第1項記載のベクター。 - 【請求項8】pMS76およびその類縁プラスミドと伝達性
プラスミドとの3者共存系においても可動化されない特
許請求の範囲第1項記載のベクター。 - 【請求項9】pSC101、pCR1、pBR322、pACYC184、pACYC1
77、またはpMB9とエッセリシア・コリ宿主内で安定に存
在できる(不和合性を示さない)特許請求の範囲第8項
記載のベクター。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60216209A JPH0779698B2 (ja) | 1985-10-01 | 1985-10-01 | 安全性の高い多機能クロ−ニングベクタ− |
EP86307570A EP0218468A3 (en) | 1985-10-01 | 1986-10-01 | Safe, versatile cloning vector |
US07/814,203 US5290691A (en) | 1985-10-01 | 1991-12-26 | Safe and versatile cloning vector |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60216209A JPH0779698B2 (ja) | 1985-10-01 | 1985-10-01 | 安全性の高い多機能クロ−ニングベクタ− |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6279786A JPS6279786A (ja) | 1987-04-13 |
JPH0779698B2 true JPH0779698B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=16684983
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60216209A Expired - Lifetime JPH0779698B2 (ja) | 1985-10-01 | 1985-10-01 | 安全性の高い多機能クロ−ニングベクタ− |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0218468A3 (ja) |
JP (1) | JPH0779698B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1202612B (it) * | 1987-03-03 | 1989-02-09 | Eniricerche Spa | Plasmidi ricombinanti utili per l'espressione in bacillus di proteine eterologhe |
CA1335428C (en) * | 1988-06-14 | 1995-05-02 | Steven C. Pruitt | Cdna cloning vectors |
US5238834A (en) * | 1988-06-14 | 1993-08-24 | Health Research, Inc. | CDNA cloning vectors |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4503155A (en) * | 1982-02-01 | 1985-03-05 | Eli Lilly And Company | Multifunctional, cloning vectors for use in Streptomyces, Bacillus, and E. coli |
JPS59162885A (ja) * | 1983-03-08 | 1984-09-13 | Ajinomoto Co Inc | 複合プラスミド |
JPS6027388A (ja) * | 1983-07-22 | 1985-02-12 | Green Cross Corp:The | プラスミツド |
-
1985
- 1985-10-01 JP JP60216209A patent/JPH0779698B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-10-01 EP EP86307570A patent/EP0218468A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0218468A3 (en) | 1988-08-10 |
EP0218468A2 (en) | 1987-04-15 |
JPS6279786A (ja) | 1987-04-13 |
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