DE19932908A1 - Gene zur Biosynthese von Anticapsin und Bacilysin, ihre Isolierung und Verwendung - Google Patents
Gene zur Biosynthese von Anticapsin und Bacilysin, ihre Isolierung und VerwendungInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft Gene für die Biosynthese von Anticapsin und Bacilysin, ihre Isolierung und Verwendung, insbesondere in der Medizin und Landwirtschaft. Bevorzugt handelt es sich um Gen-Produkte, die generell als Antagonisten der Glukosaminsynthese einsetzbar sind und als Mittel zur Antibiose gegen mikrobielle Krankheits- und Fäulniserreger verwendet werden können.
Description
Die Erfindung betrifft Gene für die Biosynthese von Anticapsin und Bacilysin, ihre Isolierung
und Verwendung, insbesondere in der Medizin und Landwirtschaft.
Bacilysin ist ein bekanntes Dipeptid, das als antibiotischer Wirkstoff beschrieben wurde
(Zuber und Marahiel, 1992). Es wird artspezifisch von Bacillus subtilis und auch von
einzelnen Stämmen anderer Bacillus-Spezies der Bacillus subtilis-Gruppe gebildet
(Loeffler et al., 1986) und aus der Zelle in das umgebende Kulturmedium ausgeschieden.
Bacilysin besteht N-terminal aus L-Alanin und C-terminal aus der nicht proteinogenen
Epoxyaminosäure L-Anticapsin (Rogers et al., 1965; Walker und Abraham, 1970a; Neuss et
al., 1970) und wurde chemisch als L-Alanyl-L-β-(2,3-epoxycyclohexanono-4)Alanin (Walker
und Abraham, 1970b; Chmara et al., 1981) beschrieben. Nach Aufnahme in sensible Zellen
wird Bacilysin proteolytisch gespalten und dadurch das antibiotisch wirksame Anticapsin
freigesetzt. Anticapsin hemmt bei Bakterien und Pilzen die Glokosaminsynthetase und
dadurch die Biosynthese der Aminozucker Glukosamin und N-Acetylglukosamin, die für die
Zellwandsynthese benötigt werden. So wird die Synthese der Zellwand gehemmt und Zellyse
verursacht (Whitney and Funderburk, 1970; Kenig et al., 1976; Milewski, 1993). Bacilysin
und Anticapsin werden durch andere Di- und Tripeptide (Perry and Abraham, 1979) sowie
durch Glukosamin und N-Acetylglukosamin (Walton and Rickes, 1962; Chmara, 1985)
kompetitiv gehemmt und können u. a. dadurch von anderen antibiotischen Wirkstoffen
unterschieden werden. Ein weitere Möglichkeit zur Identifizierung von Anticapsin und
Bacilysin besteht darin, daß ihre Biosynthese durch Mutationen in aro-Genen für die
Biosynthese der aromatischen Aminosäuren Phenylalanin und Tyrosin unterbunden wird
(Hilton et al., 1988a).
Durch Bacillus subtilis A14 (Walker and Abraham, 1970a, b) und einen Stamm von
Streptomyces griseoplanus (Whitney et al., 1970) wird unmittelbar auch extrazelluläres
Anticapsin gebildet, doch beschränken sich solche Befunde auf diese Ausnahmefälle.
Bekannt ist weiterhin, daß Bacilysin eine relativ breite, unspezifische Wirkung gegen
Gram-positive und -negative Bakterien sowie gegen Sproß- und Fadenpilze besitzt und von
sensiblen Zellen über ein Dipeptid-und Oligopeptid-Permeasesysteme (Diddens et al., 1979;
Perry and Abraham, 1979; Chmara et al., 1981) effektiv aufgenommen wird.
Defektmutationen in diesem Permeasesystem führen zu Resistenz gegen Bacylisin.
Extrazelluläres Anticapsin wird von Bakterien meist nicht inkorporiert und hat deshalb eine
relativ geringe antibakterielle Aktivität, ausgenommen gegen Streptococcus pyogenes und
Salmorrella gallinarum (Neuss et al., 1970). Dagegen hat Anticapsin eine stark antifungische
Wirkung, u. a. gegen Candida albicans sowie Botrytis cinerea und andere filamentöse Pilze
(Neuss et al., 1970; Kenig et al., 1976; Chmara et al., 1980).
Zur Biosynthese von Bacilysin ist für Bacillus subtilis 168 bekannt, daß sie vom
Syntheseweg für aromatische Aminosäuren beim Prephenat abzweigt, das offenbar als
primärer metabolischer Precursor zur Synthese von Anticapsin dient (Hilton et al., 1988a).
Die enzymatischen Reaktionen dazu und auch zu der folgenden Verbindung von Anticapsin
mit L-Alanin zu Bacilysin sind noch unbekannt. Die Ausscheidung (Exkretion) des gebildeten
Bacilysins aus der Zelle erfolgt vermutlich mittels eines Peptidtransport-Systems (Diddens et
al., 1979).
Befunde zur Regulation der Bacilysinbiosynthese lassen auf ihre Suppression durch
wachstumsfördernde Supplemente (u. a. Ammonium, Nitrat, Proteinhydrolysate,
Phenylalanin, L-Alanin) und durch andere wachstumsfördernde Bedingungen (z. B.
Vollmedien oder eine optimale Temperatur bei 37°C) schließen. Von besonderem Interesse
für eine Überproduktion ist auch die Endprodukthemmung durch akkumuliertes Bacilysin
(Özcengiz and Alaeddinoglu, 1991).
Zur Genetik der Bacilysinbiosynthese wurde mittels konventioneller genetischer Methoden
(chemische Mutagenese, Transduktion) lediglich die grobe Kartierung eines bac-1-Locus
innerhalb einer ca. 90 kb-Region zwischen den Genen ctrA und sacA erreicht (Hilton et al.,
1988b), während kodierende Gene oder Gen-Gruppen und die Gen-Produkte noch unbekannt
sind. Für eine dazu verwendete Bacilysin-negative (Bac-) Mutante Bacillus subtilis NG79
bac-1 wurde ein Defekt in der Bindungsreaktion von L-Alanin mit L-Anticapsin zu Bacilysin
ermittelt, doch wurde eine entsprechende Aminosäureligase noch nicht isoliert.
Von einigen Bacillus-Stämmen werden auch halogenierte Bacilysinderivate (Chlorotetain,
Bromotetain) gebildet, deren Biosynthese und Genetik ebenso wenig charakterisiert sind.
Diese Halogenderivate sind jedoch insofern von Interesse, als sie gegenüber dem Bacilysin
einige Unterschiede in ihrer Wirkungsweise und im Spektrum ihrer Produzenten aufweisen
(Loeffler et al., 1990; Katzer, 1991).
Zum Ergebnisstand sind schließlich noch erfolgreiche Arbeiten (Wild, 1994; Baldwin et al.,
1995) zu chemischen Synthesen von Anticapsin, Bacilysin und Chlorotetain zu erwähnen, die
zwar zu detaillierten Kenntnissen der Molekülstruktur, nicht jedoch, ebenso wie die
Bacilysinbiosynthese, zu einem ökonomisch nutzbaren Produktionsverfahren geführt haben.
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, Gene für die Biosynthese von Anticapsin und
Bacilysin zu isolieren sowie strukturell und funktionell zu charakterisieren und dadurch
gezielt für eine Überproduktion von Antibiotika und eine wirksame und vielseitige Antibiose
gegen mikrobielle Krankheits- und Fäulniserreger nutzbar zu machen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Gene oder eine Gen-Gruppe zur
Biosynthese von Anticapsin und Bacilysin gentechnisch zunächst mittels eines geeigneten
bakteriellen Wirts-Vektor-Systems kloniert und amplifiziert und dadurch einer strukturellen
und funktionellen Charakterisierung zugänglich werden. Aufgrund der Gen-Amplifikation
und des dadurch bedingten Gen-Dosis-Effektes sowie gegebenenfalls unter Nutzung von
anderen bakteriellen Wirts-Vektor-Systemen mit erhöhter Gen-Amplifikation und verstärkter
und/oder induzierbarer Gen-Expression wird eine ökonomisch nutzbare Biosynthese der
Wirkstoffe erreicht, die dann gegen mikrobielle Krankheits- und Fäulniserreger eingesetzt
werden. Vorteilhaft ist eine Exkretion der Wirkstoffe, so daß sie kostengünstiger aus den
Kulturüberständen isolierbar sind. Als Wirtsstämme bieten sich dafür solche Organismen an,
die natürlicherweise Anticapsin oder Bacilysin aus der Zelle ausscheiden. Vorteilhaft ist
außerdem die Unterdrückung der Endprodukthemmung, wie bei der Bacilysinbiosynthese
durch akkumuliertes Bacilysin, so daß die Überproduktion der Antibiotika nicht durch eine
hohe Konzentration der Antibiotika selbst gehemmt wird. Wegen der strukturellen
Ähnlichkeit der halogenierten Bacilysinderivate und ihrer zumindest partiell gleichen
Biosynthese kann die vorliegende Erfindung auch zur biotechnologischen Herstellung von
Chlorotetain und Bromotetain oder von neuen, stärker oder spezifischer wirksamen Bacilysin-
und Anticapsinderivaten genutzt werden.
Alternativ können die rekombinanten Wirkstoffbildner als zelluläre Antagonisten angewendet
werden, indem sie in der Umgebung von mikrobiellen Fäulnis- und Krankheitserregern, z. B.
im Boden, in Kulturflüssigkeiten oder auf die Oberfläche anderer Organismen, ausgebracht
und die ausgeschiedenen Antibiotika wirksam werden.
Eine weitere Möglichkeit der Anwendung der klonierten Bacilysin-Gene besteht in ihrer
Einführung in die antibiotisch zu schützenden Organismen, so daß diese selbst den
antibiotischen Wirkstoff bilden und so einen Selbstschutz gegen mikrobielle Krankheits- und
Fäulniserreger erlangen. Beispielhaft können die Gene, die unmittelbar zur Biosynthese von
Anticapsin oder Bacilysin benötigt werden, in Nutzpflanzen transferiert und exprimiert
werden und so durch transgene Synthese von Anticapsin oder Bacilysin eine erhöhte Toleranz
oder Resistenz gegen ein breites Spektrum verschiedenartiger phytopathogener Erreger
erzielt werden.
Die Aufgabe der Erfindung wird insbesondere dadurch gelöst, daß entsprechende
erfindungsgemäße Gene aus einem Bakterienstamm der Bacillus subtilis-Gruppe,
vorzugsweise aus Bacillus subtilis 168, mit in der Gentechnik üblichen Methoden isoliert
werden.
Gegenstand der Erfindung sind Gene zur in-vitro- und in-vivo-Biosynthese von Anticapsin
und Bacilysin sowie ihre Fragmente, Varianten und Mutanten, die durch Basenaustausche
oder andere Mutationen gekennzeichnet sind, ebenso RNA-Nukleinsäuresequenzen, in denen
T durch U ausgetauscht ist, und Nukleinsäuresequenzen, die vollständig oder partiell
komplementär bzw. homolog sind.
Die Gene und ihre Produkte stellen selbst diagnostische und/oder therapeutische Substanzen
dar oder dienen als Targets zur Suche nach neuen therapeutisch wirksamen Substanzen.
Erfindungsgemäß handelt es sich vorzugsweise um Bacilysin-Gene von Bacillus subtilis 168,
im weiteren als "bac"-Gene bezeichnet, innerhalb einer 7471 bps-DNA-Sequenz gemäß SEQ
ID No. 1 (Anhang 1), ihre Mutanten, Varianten sowie ihre vollständig oder partiell
komplementären DNA-Sequenzen.
Zur Primärklonierung (Ausführungsbeispiel 1) der bac-Gene werden vorzugsweise positiv
selektive Klonierungsvektoren mit hoher Klonierungskapazität und Stabilität eingesetzt und
Gen-Banken mit großen chromosomalen DNA-Inserten isoliert, so daß nicht nur einzelne
Gene, sondern auch Gen-Gruppen mit hinreichender Wahrscheinlichkeit isoliert werden
können. Als ein vorteilhafter Klonierungsvektor erweist sich der palindrome, einfach positiv
selektive Klonierungsvektor pPS15 (Steinborn, 1996). Dieser palindrome Plasmidvektor und
auch der für nachfolgende Klonierungen verwendete nicht palindrome Plasmidvektor pSB595
(s. u.) gehören zu der Inkompatibilitätsgruppe inc18, und ihre besonders hohe
Klonierungskapazität sowie strukturelle und segregative Plasmidstabilität gehen auf ihre
Theta-Replikation bzw. ein Partition-Gen parS zurück.
Als Wirtsstamm für die Primärklonierung der erfindungsgemäßen Gene werden bakterielle
Bacilysin-negative Stämme, vorzugsweise von Bacillus subtilis 168, genutzt. Wegen einer
chromosomalen bac-Mutation weisen sie keine chromosomal kodierte Bacilysinbildung auf,
und die Klonierung der bac-Gene kann aufgrund der Komplementation der chromosomalen
Mutation nachgewiesen werden. Bevorzugt werden eine Mutante NG79 bac-1 (Hilton et al.,
1988b) oder Derivate von NG79 aus der Stammfamilie Bacillus subtilis 168 als Bacilysin-
negative Wirtsstämme eingesetzt. Insbesondere wird ein stabilisierender Stamm Bacillus
subtilis GSB298 hip-1 bac-1 oder ein vergleichbarer Stamm als Bacilysin-negativer
Wirtsstamm verwendet, der eine erhöhte Transformationsfähigkeit und stabilisierende
Wirkung auf rekombinante Plasmidderivate mit einem großen Insert aufweist, wobei dieser
GSB298 als spontane hip (host increased plasmid stability)-Mutante von NG79 bac-1
abgeleitet und aufgrund seiner stabilisierenden Wirkung auf palindrome, zweifach positiv
selektive Klonierungsvektoren (Steinborn, 1996) isoliert wird.
Es werden Gen-Banken mit großen chromosomalen DNA-Inserten vorzugsweise mittels
partieller Restriktasespaltung der Donor-DNA und Insertion von vorselektierten, großen (<
10 kb) DNA-Fragmenten erhalten. Beispielhaft wird nach partieller BamHI-Spaltung eine
Gen-Bank isoliert, aus der ein rekombinanter Stamm Bacillus subtilis GSB298 (pSB657) mit
bac-Genen aus Bacillus subtilis 168 isoliert wird. Dieser scheidet plasmidkodiertes Bacilysin
aus, welches anhand der Hemmung eines Bacilysin-sensiblen Indikatorstammes,
vorzugsweise von Escherichia coli B oder Proteus vulgaris, und der Hemmung von
Bacilysin durch N-Acetylglukosamin nachgewiesen wird. Ein zusätzlicher Beweis für die
plasmidkodierte Expression von Bacilysin wird dadurch erhalten, daß pSB657 dieses nicht in
einem Wirtsstamm Bacillus subtilis GSB285 aroI906 (Steinborn, 1996) exprimiert, da die
Mutation aroI906 die Biosynthese von Prephenat als Precursor für Anticapsin unterbindet.
Eine optimale Bildung und antibiotische Wirksamkeit von Bacilysin wird durch Nutzung
eines PA-Minimalmediums (Perry and Abraham, 1979) und Kultivierung bei 30°C erreicht.
Agar-Diffusionsteste dienen zur halbquantitativen Bestimmung der Bacilysinaktivität anhand
von Inhibitionszonen um wachsende Kolonien oder Stanzlöcher, die mit Kulturüberständen
beschickt werden.
Erfindungsgemäß sind die bac-Gene in dem durch Primärklonierung erzeugten
rekombinanten Plasmid pSB6S7 innerhalb eines 21,5 kb-BamHI-Inserts enthalten. Durch
Subklonierung wird aus dem 21,5 kb-BamHI-Insert von pSB657 ein weiterer rekombinanter
Stamm Bacillus subtilis GSB298 (pSB660) abgeleitet, wobei in dem so erhaltenen
rekombinanten Plasmid pSB660 die bac-Gene innerhalb eines 7,5 kb-PstI-Inserts enthalten
sind (Ausführungsbeispiel 2).
Das PstI-Insert von pSB660 wird anhand von DNA-Homologien und übereinstimmender
Restriktionsdaten (Abb. 1) als 7471 bps-DNA-Sequenz (Abb. 2), lokalisiert in der Region
von bp 3 867 455 bis bp 3 874 925 der genomischen DNA-Sequenz (SubtiList database,
Institut Pasteur, Moszer et al., 1995; Moszer, 1998) des Genoms von Bacillus subtilis 168,
identifiziert (Ausführungsbeispiel 3). Diese Position liegt innerhalb der 90 kb-Region, in der
der bac-1-Locus mittels Transduktion kartiert worden ist (Hilton, H., et al., 1988b); dadurch
werden die Lokalisierung und Funktion der bac-Gene bestätigt.
Gemäß der Erfindung kodiert das rekombinante Plasmid pSB660 in Bacillus subtilis
GSB298 eine erhöhte oder zumindest mit dem Gen-Donorstamm Bacillus subtilis 168
vergleichbare Bacilysinbildung (Abb. 3), so daß der durch die bac-1 Mutation (Hilton et al.,
1988b) bedingte Defekt in der Ligasereaktion in GSB298 durch pSB660 funktionell
vollständig komplementiert wird. Im Unterschied zu vergleichbarem Wachstum und
vergleichbaren maximalen Werten der Bacilysinbildung wird aber ein unterschiedlicher
Verlauf der Bacilysinbildung beobachtet, die beim rekombinanten Stamm GSB298 (pSB660)
unverzüglich mit Beginn des Wachstums einsetzt. Dagegen erfolgt die chromosomal kodierte
Bacilysinbildung mit einer deutlichen lag-Phase und gleicht sich erst zur stationären Phase
dem Niveau der plasmidkodierten Bacilysinbildung an. Diese Angleichung der Maximalwerte
wird als Ausdruck der Endprodukthemmung durch akkumuliertes Bacilysin gewertet. In dem
PstI-Insert sind 6 offene Leserahmen (ORF's) mit bisher unbekannter Funktion und der
ursprünglichen Bezeichnung (s. SubtiList database) ywfA bis ywfF enthalten, die aufgrund der
beschriebenen Komplementation und weiterer Befunde (s. u.) zu ihrer Funktion in der
Bacilysinbiosynthese zu bacA bis bacF (Abb. 1) umbenannt und erfindungsgemäß
beansprucht werden. Damit wird jedoch nicht ausgeschlossen, daß nicht noch weitere Gene
an einer optimalen Bacilysinbiosynthese beteiligt sind. Eine essentielle Funktion der Gene
bacB bis bacE für die Bacilysinbiosynthese wird anhand von inaktivierenden Mutationen in
den einzelnen bac-Genen nachgewiesen, die die Bildung von extrazellulärem Bacilysin mehr
oder weniger reduzieren oder eliminieren. Dazu werden Deletions (Δ)- und
Insertionsmutationen (::) in klonierten bac-Genen (Ausführungsbeispiel 4) in rekombinanten
Plasmiden und in chromosomalen bac-Genen (Ausführungsbeispiel 5) in Bacillus subtilis 168
erzeugt und ihr Einfluß auf die Bacilysinbildung untersucht. Eine wesentliche Rolle der Gene
bacB bis bacE wird dadurch belegt, daß ein diese Gene enthaltenes Deletionsderivat pSBb72
= pSB660 ΔbacA ΔbacF in GSB298 eine mit pSB660 vergleichbare Bacilysinbildung kodiert
(Abb. 3), während von pSB672 abgeleitete Mutanten pSB676 pSB672 bacB*, pSB677 =
pSB672 ΔbacC und pSB678 = pSBb72 ΔbacD im Vergleich zu pSB660 und pSB672 nur
etwa 1/10 Bacilysinbildung in GSB298 kodieren (Abb. 4). Ein Deletionsderivat pSB674 =
pSB672 ΔbacE bewirkt in GSB298 sogar einen vollständigen Ausfall der Bildung von
extrazellulärem Bacilysin und eine vollständige Inhibition des Wachstums sowie Zellyse,
korreliert mit auffälligen Aufblähungen der natürlicherweise stäbchenförmigen Zellen bis zu
Protoplasten-ähnlichen Zellformen, wie sie für die antibiotische Wirkung von Anticapsin
typisch sind. Daraus ist zu schließen, daß bacE eine für die Ligasereaktion der
Bacilysinbildung erforderliches Enzym kodiert und in GSB298 (pSB674) bei inaktivem bacE-
Gen sowohl in pSB674 wie auch in GSB298 bac-1 (wie für die bac-1-Mutation
nachgewiesen; Hilton et al., 1988b) intrazellulär eine für die Wirtszelle letale Konzentrierung
von Anticapsin erfolgt. Es ist aber auch nicht auszuschließen, daß in GSB298 ein zusätzliches
Gen mutiert ist, z. B. ein Transport-Gen, so daß die Exkretion von Bacilysin und/oder
Anticapsin inhibiert ist. Diese Annahme wird dadurch belegt, daß pSB674 die gleichen
aberranten Zellformen und Zellyse auch in einer multiplen Insertionsmutante GSB322
bewirkt, nicht aber in Insertionsmutanten, bei denen nur einzelne chromosomale bac-Gene
inaktiviert wurden (Ausführungsbeispiel 7). Hinweise auf die Transportfunktion eines bac-
Gens in Beziehung zum Selbstschutz der Bakterienzellen gegen das von ihnen selbst gebildete
und ausgeschiedene Bacilysin werden nicht erhalten, da sich alle chromosomalen
Insertiosmutationen, auch multiple, nicht negativ auf ihre Resistenz gegen extrazelluläres
Bacilysin auswirken (Ausführungsbeispiel 6).
Eine essentielle Funktion der Gene bacB bis bacE für die Bacilysinbiosynthese wird auch
durch Insertionsmutationen (Ausführungsbeispiel 5) der chromosomalen Gene bacB in
GSB319, bacC in GSB320, bacD in GSB321 oder bacE in GSB315 belegt, da diese zum
Verlust der chromosomal kodierten Bacilysinbildung führen. Keine wesentliche Funktion ist
unter diesen Bedingungen für die Gene bacA und bacF nachweisbar, da die Inaktivierung der
chromosomalen Gene bacA bis bacF in GSB322 durch pSB672 mit den aktiven Genen bacB
bis bacE komplementiert werden kann (Ausführungsbeispiel 7). Die essentielle Funktion der
Gene bacB bis bacE, ihre Kopplung in einem Gen-Cluster mit gleicher Orientierung der
ORF's (s. Abb. 1) und Aktivierung durch gemeinsame regulatorische Sequenzen der
Transkription stromaufwärts von bacB (Ausführungsbeispiel 3) lassen auf eine
Transkriptionseinheit von bacB bis (zumindest) bacE schließen. Die experimentellen
Befunde und Schlußfolgerungen zur Funktion der bac-Gene in der Bacilysinbiosynthese
werden durch einen Vergleich der putativ kodierten Proteine BacB, BacE und BacF zu
Proteinen der "SWISS-PROT database" im ExPASY Molecular Biology Server erhärtet
(Ausführungsbeispiel 3). Es werden hohe Homologien zu einer Prephenatdehydratase für
BacB, zu D-Alanin-D-Alanin-Ligasen für BacE bzw. einem Efflux-Protein für BacF
nachgewiesen, die eine deutlich Beziehung zur Bacilysinbiosynthese erkennen lassen.
Eine Beziehung der bac-Gen-kodierten Proteine zum Prephenat als primären Precursor der
Anticapsinbiosynthese wird durch den experimentellen Befund verstärkt, daß von Bacillus
subtilis 168 abgeleitete chromosomale bac-Insertionsderivate (s. Ausführungsbeispiel 5)
GSB319, GSB320, GSB321, GSB315 und GSB322 keine Auxotrophie für aromatische
Aminosäuren hervorrufen (Ausführungsbeispiel 5) und deshalb die durch bac-Gen-Produkte
katalysierten Reaktionen, ausgehend vom Prephenat, in der Biosynthese zu Anticapsin bzw.
Bacilysin (nicht aber in der Biosynthese zum Prephenat) wirken.
In einer weiteren Ausführungsvariante (Ausführungsbeispiel 8) des Verfahrens werden
verschiedene rekombinante Plasmide in heterologe Wirtsstämme von verschiedenen
Bacillus-Species transformiert, und überraschenderweise weisen die erhaltenen
rekombinanten Stämme eine recht unterschiedliche plasmidkodierte Bacilysinbildung auf.
Selbst nach Transformation von pSB660, das bacA bis bacF in aktiver Form enthält, ist für
Bacillus coagulans (pSB660), Bacillus lichiniformis ATCC9789 (pSB660) und Bacillus
megaterium PV361 (pSB660) kein extrazelluläres Bacilysin nachweisbar. Für diese Stämme
ist noch nicht auszuschließen, daß zwar plasmidkodiertes Bacilysin intrazellulär synthetisiert,
dieses aber nicht exkretiert wird und deshalb nicht extrazellulär nachgewiesen werden kann.
Dagegen ist für Bacillus pumilus ATCC12140, wie für GSB298 (s. o.), schon durch pSB674,
das nur bacB bis bacE in aktiver Form enthält, eine hohe plasmidkodierte Bacilysinbildung
feststellbar. Damit wird nochmals die essentielle Funktion dieser bac-Gene für die
Bacilysinbiosynthese bestätigt. Eine besonders hohe plasmidkodierte Bacilysinbildung wird
für den Wirtsstamm Bacillus amyloliquefaciens GSB272 ermittelt, so daß GSB272 (pSB660)
und GSB272 (pSB672) eine gegenüber dem Donorstamm Bacillus subtilis 168 ca. 5-fach
erhöhte Bacilysinbildung aufweisen. Besonders überraschend aber ist der Befund, daß ein
rekombinantes Plasmid pSB679 = pSB660 Δ(bacA bacD bacE bacF), welches also nur noch
bacB und bacC in aktiver Form enthält, in GSB272 eine etwa gleich hohe Bacilysinbildung
bewirkt. Dieses Ergebnis belegt die essentielle Gen-Funktion von bacB und bacC in der
Bacilysinbildung und läßt andererseits darauf schließen, daß in GSB272 die übrigen
essentiellen bac-Gene funktionsfähig im bakteriellen Chromosom vorhanden sind. Diese
Annahme liegt sehr nahe, da die meisten Wildtypstämme von Bacillus amyloliquefaciens
eine chromosomal kodierte Bacilysinbildung aufweisen (s. o.).
Aufgrund der Wirkung auf ein spezifisches Target, der begrenzten Stabilität von Bacilysin
und Anticapsin sowie des ubiquitären Vorkommens von Inhibitoren in Eukaryonten ist bei
ihrer Applikation gegen mikrobielle Krankheits- und Fäulniserreger keine Toxizität bei
Menschen, Tieren und Pflanzen zu erwarten.
Die Erfindung wird nachstehend anhand der folgenden Abbildungen und
Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Die Abbildungen zeigen in
Abb. 1: Restriktionskarte des PstI-Inserts von pSB660 entsprechend der DNA-Sequenz in
Anlage 1 mit den Genen bacA, bacB, bacC, bacD, bacE und bacF aus Bacillus subtilis 168.
Es sind nur solche Restriktaseschnittstellen angegeben, die für die Konstruktion von
Plasmidderivaten genutzt werden.
Abb. 2: Wachstum und Bacilysinbildung bei dem rekombinanten Stamm Bacillus subtilis
GSB298 (pSB672) im Vergleich zum Gen-Donorstamm Bacillus subtilis 168 und dem
Bacilysin-negativen Wirtsstamm GSB298 bac-1 bei 30°C in PA-Minimalmedium.
Abb. 3: Wachstum und Bacilysinbildung bei den rekombinanten Stämmen Bacillus subtilis
GSB298 (pSB672), GSB298 (pSB674) und GSB298 (pSB676) bei 30°C in PA-Minimalmedium.
DNA-Sequenz des 7471 bps-PstI-Inserts von pSB660, lokalisiert von bp 3 867 455 bis bp 3 874 925
in der DNA-Sequenz (SubtiList database) des Genoms von Bacillus subtilis 168
gemäß Sequenzprotokoll.
Übliche Materialien und Methoden werden im folgenden nicht detailliert beschrieben.
Kenntnisse zur Kultivierung von Bakterien, Stammselektion, Isolierung von chromosomaler
DNA, Plasmid-DNA und DNA-Fragmenten, Restriktasespaltung von DNA, Ligation von
DNA-Fragmenten, Plasmidtransformation, Elektrophorese und DNA-Sequenzanalyse werden
vorausgesetzt und sind durch Publikationen (Sambrook et al., 1989; Harwood and Cutting,
1990; Nicholl, 1994) allgemein zugänglich. Bei Nutzung von käuflichen Kits, Enzymen und
anderen Materialien wird nach den Protokollen der Hersteller oder Lieferfirmen verfahren.
Folgende spezielle Materialien und Methoden werden häufiger verwendet:
# Bakterienstamm Bacillus subtilis GSB285 hip1 (Steinborn, 1996/98) als Rezipientenstamm für Subklonierungen von bac-Genen; abgeleitet als spontane, plasmidstabilisierende (für rekombinante Plasmide mit großem Insert) Mutante von GSB26 sacA321 aroI906 metB5 amyE str1 aus der Stammlinie von Bacillus subtilis 168. Die aroI906-Mutation verhindert die Biosynthese von Anticapsin und Bacilysin, so daß diese nicht die Plasmidtransfonmation (bes. in Protoplasten) beeinträchtigen können
# Plasmidvektor pPS1S (15,4 kb; MLSr) als palindromer, positiv selektiver Klonierungsvektor mit hoher Klonierungskapazität und Stabilität (Steinborn, 1996/98), so daß bei Klonierungen annähernd alle Plasmidtransformanten ein rekombinantes Plasmid enthalten und auch rekombinante Plasmide mit einem großen Insert stabil erhalten bleiben
Plasmidvektor pSB595 (7 kb; MLSr) als nicht palindromer Klonierungsvektor mit hoher Klonierungskapazität und Stabilität, abgeleitet von einem Plasmid pSB472 (Steinborn, 1996/98) durch Einführung einer multiplen Klonierungsstelle. Beide Plasmidvektoren gehören zu der Inkompatibilitätsgruppe inc18 und ihre hohe strukturelle und segregative Stabilität geht auf den Theta-Typ ihrer Replikation bzw. auf ein Partition-Gen parS zurück
# DNA-Isolierungen aus Stämmen von Bacillus und Escherichia coli:
# Bakterienstamm Bacillus subtilis GSB285 hip1 (Steinborn, 1996/98) als Rezipientenstamm für Subklonierungen von bac-Genen; abgeleitet als spontane, plasmidstabilisierende (für rekombinante Plasmide mit großem Insert) Mutante von GSB26 sacA321 aroI906 metB5 amyE str1 aus der Stammlinie von Bacillus subtilis 168. Die aroI906-Mutation verhindert die Biosynthese von Anticapsin und Bacilysin, so daß diese nicht die Plasmidtransfonmation (bes. in Protoplasten) beeinträchtigen können
# Plasmidvektor pPS1S (15,4 kb; MLSr) als palindromer, positiv selektiver Klonierungsvektor mit hoher Klonierungskapazität und Stabilität (Steinborn, 1996/98), so daß bei Klonierungen annähernd alle Plasmidtransformanten ein rekombinantes Plasmid enthalten und auch rekombinante Plasmide mit einem großen Insert stabil erhalten bleiben
Plasmidvektor pSB595 (7 kb; MLSr) als nicht palindromer Klonierungsvektor mit hoher Klonierungskapazität und Stabilität, abgeleitet von einem Plasmid pSB472 (Steinborn, 1996/98) durch Einführung einer multiplen Klonierungsstelle. Beide Plasmidvektoren gehören zu der Inkompatibilitätsgruppe inc18 und ihre hohe strukturelle und segregative Stabilität geht auf den Theta-Typ ihrer Replikation bzw. auf ein Partition-Gen parS zurück
# DNA-Isolierungen aus Stämmen von Bacillus und Escherichia coli:
- - Plasmid-DNA und hochmolekulare chromosomale DNA und in großem Maßstab mittels QIAGEN Plasmid-Kit bzw. Genomic-Kit
- - Plasmid-DNA in kleinem Maßstab (Minipräps) nach einer alkalischen Methode (Sambrook et al., 1989)
# Isolierung von DNA-Fragmenten aus Gelen mittels QIAGEN QIAEX II-Kit oder Elektro
elution für Fragmente <10 kb bzw. <10 kb
# DNA-Sequenzierungen an einem A. L. F. DNA Sequencer (Pharmacia LKB)
# Plasmidtransformation in Bacillus meist nach der PEG-Protoplasten-Methode (Chang and Cohen, 1979) oder (Ausführungsbeispiel 5) in kompetente Zellen (Dubnau and Davidoff- Abelson, 1971) von Bacillus subtilis 168
# Plasmidtransformation in kompetente Zellen von Escherichia coli nach Hanahan (1983)
# Selektion auf plasmidkodierte Chloramphenicolresistenz (Cmr
# DNA-Sequenzierungen an einem A. L. F. DNA Sequencer (Pharmacia LKB)
# Plasmidtransformation in Bacillus meist nach der PEG-Protoplasten-Methode (Chang and Cohen, 1979) oder (Ausführungsbeispiel 5) in kompetente Zellen (Dubnau and Davidoff- Abelson, 1971) von Bacillus subtilis 168
# Plasmidtransformation in kompetente Zellen von Escherichia coli nach Hanahan (1983)
# Selektion auf plasmidkodierte Chloramphenicolresistenz (Cmr
) oder MLS-
Antibiotikaresistenz (MLSr
), u. a. Erythromycinresistenz (Emr
), durch Zusatz von 10 µg/ml
Chloramphenicol (Cm) bzw. 5 µg/ml Erythromycin (Em)
# Insertionsmutagenese (Niaudet et al., 1982) zur Inaktivierung von chromosomalen bac- Genen des Gen-Donors Bacillus subtilis 168 durch chromosomale Insertion.
# Kultivierung meist (s. u.) bei 37°C in flüssigem TBY-Vollmedium (1% bactotryptone, Difco - 0,5% yeast extract, Difco - 0,5% NaCl; pH 7,0) oder auf TBY-Agar (1,8% Agar- Agar)
# Kultivierung zur Bildung von Bacilysin bei 30°C in flüssigem PA-Minimalmedium (optimiert zur Biosynthese von Bacilysin; Perry and Abraham, 1979) - 0,2% Glukose - 50 µg/ml essentielle Aminosäuren oder auf PA-Agar (1,5% Agar-Agar)
# Screening auf Bacilysin-bildende Klone durch Replikatechnik oder Ausstriche auf PA- Minimalagar mit Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris oder vorzugsweise Escherichia coli B als Bacilysin-sensible Indikatororganismen anhand von Hemmhöfen um wachsende Kolonien.
Testplatten: 25 ml oder 50 ml PA-Agar in runden Platten, d = 10 cm, bzw. quadratischen Platten, 14 × 14 cm, pro 100 ml Agar mit 1 ml gewaschener Suspension des Indiktorstammes, E470 nm
# Insertionsmutagenese (Niaudet et al., 1982) zur Inaktivierung von chromosomalen bac- Genen des Gen-Donors Bacillus subtilis 168 durch chromosomale Insertion.
# Kultivierung meist (s. u.) bei 37°C in flüssigem TBY-Vollmedium (1% bactotryptone, Difco - 0,5% yeast extract, Difco - 0,5% NaCl; pH 7,0) oder auf TBY-Agar (1,8% Agar- Agar)
# Kultivierung zur Bildung von Bacilysin bei 30°C in flüssigem PA-Minimalmedium (optimiert zur Biosynthese von Bacilysin; Perry and Abraham, 1979) - 0,2% Glukose - 50 µg/ml essentielle Aminosäuren oder auf PA-Agar (1,5% Agar-Agar)
# Screening auf Bacilysin-bildende Klone durch Replikatechnik oder Ausstriche auf PA- Minimalagar mit Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris oder vorzugsweise Escherichia coli B als Bacilysin-sensible Indikatororganismen anhand von Hemmhöfen um wachsende Kolonien.
Testplatten: 25 ml oder 50 ml PA-Agar in runden Platten, d = 10 cm, bzw. quadratischen Platten, 14 × 14 cm, pro 100 ml Agar mit 1 ml gewaschener Suspension des Indiktorstammes, E470 nm
= 1, suspendiert bei 50°C
# halbquantitative Bestimmung der Bacilysinbildung in Kulturüberständen mittels Lochplattentest und beschriebener (s. o.) Testplatten. Durchmesser der Löcher: 5 mm, Probevolumen: 30 µl. Die Bacilysinaktivität wird durch relative Einheiten (Urel
# halbquantitative Bestimmung der Bacilysinbildung in Kulturüberständen mittels Lochplattentest und beschriebener (s. o.) Testplatten. Durchmesser der Löcher: 5 mm, Probevolumen: 30 µl. Die Bacilysinaktivität wird durch relative Einheiten (Urel
) dargestellt,
die an einer Eichkuve (linearer Auftrag der Hemmhofdurchmesser zu logarithmischem
Auftrag von Verdünnungen eines repräsentativen Bacilysin-haltigen Kulturüberstandes)
ermittelt werden.
# Die plasmidkodierte Synthese von Bacilysin, zur Unterscheidung von chromosomal kodierter Bacilysinsynthese und Synthese von anderen Hemmstoffen, wird biologisch durch positive Ergebnisse zu allen folgenden Nachweisen bestätigt:
# Die plasmidkodierte Synthese von Bacilysin, zur Unterscheidung von chromosomal kodierter Bacilysinsynthese und Synthese von anderen Hemmstoffen, wird biologisch durch positive Ergebnisse zu allen folgenden Nachweisen bestätigt:
- - Bacilysinsynthese in Korrelation zur Anwesenheit des rekombinanten Plasmids in einem Bacilysin-negativen Wirtsstamm
- - keine Bacilysinsynthese in Aro-auxotrophen (Aro-) Wirtsstämmen, wie Bacillus subtilis GSB285 aroI906
- - kompetitive Hemmung der antibiotischen Aktivität durch N-Acetylglukosamin
- - Hemmung der Bacilysinsynthese durch Supplemente (L-Alanin, casamino acids) im PA- Kulturmedium und Kultivierung bei 37°C
- - antibiotische Aktivität (soweit getestet) gegen bekannte Bacilysin-sensible Indikatorstämme (Escherichia coli B, Escherichia coli K12, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcuc aureus, Salmonella typhimurium, Saccharomyses cerevisiae)
# biochemischer Nachweis von Anticapsin und Bacilysin durch Dünnschichtchromatographie
und Bioautographie, wie von Sakajoh et al. (1987) beschrieben
Die Primärklonierung erfolgt durch "shot gun" nach partieller Restiktasespaltung der
chromosomalen Donor-DNA und Vorselektion von großen DNA-Fragmenten (< 10 kb) zur
Ligation. Dazu wird ein positiv selektiver Klonierungsvektor pPS 15 genutzt, in einen
stabilisierenden, Bacilysin-negativen (Bac-) Rezipientenstamm Bacillus subtilis GSB298 bac-1
transformiert und ein Screening auf Bacilysin-positive (Bac+) Klone auf PA-Agarplatten mit
Escherichia coli B als Bacilysin-sensiblen Indikatororganismus ausgeführt. So wird nach
partieller BamHI-Spaltung unter 2944 rekombinanten Transformanten ein hoch
exprimierender Bac+-Klon gefunden, der mit "GSB298 (pSB657)" bezeichnet wird. In
pSB657 wird ein 21,5 kb-BamHI-Insert ermittelt und die plasmidkodierte Bildung von
Bacilysin durch alle (s. o.) biologischen und biochemischen Nachweise bestätigt.
pSB657 komplementiert in GSB298 die bac-1-Mutation, so daß durch GSB298 (pSB657) im
Vergleich zum Donorstamm Bacillus subtilis 168 eine zumindest vergleichbare oder erhöhte
Bacilysinbildung ((wie für GSB298 (pSB672) in Abb. 3)) erfolgt. Bei vergleichbarem
Wachstum wird für den Donorstamm eine zeitlich stark verzögerte Bacilysinbildung
beobachtet.
Dazu werden Subklonierungen nach Spaltung des Inserts von pSB657 durch verschiedene
Restriktasen ausgeführt und wieder pPSIS und GSB298 als Wirts-Vektor-System genutzt.
Hoch exprimierende Klone, vergleichbar mit GSB298 (pSB657), werden nach PstI-Spaltung
erhalten und diese mit "GSB298 (pSB660)" bezeichnet. PSB660 enthält ein 7,5 kb-PstI-
Insert, das nach Reklonierung in pPS15 und Retransformation in GSB298 wieder
reproduzierbar eine hohe Bacilysinbildung (Abb. 3) kodiert.
Das in pSB660 (Ausführungsbeispiel 2) enthaltene 7,5 kb-PstI-Insert wird in pUC18
rekloniert und dadurch der rekombinante Stamm Escherichia coli XL1 (pSB661) erhalten.
Von beiden Enden des PstI-Inserts wird dann sequenziert und mit den erhaltenen DNA-
Sequenzen (42 bps bzw. 226 bps) ein Homologievergleich mit der genomischen DNA-
Sequenz (SubtiList database) des Gen-Donors Bacillus subtilis 168 ausgeführt. Eine
vollständige DNA-Homologie wird für die Region von bp 3 67 55 bis bp 3 74 25 der
genomischen DNA-Sequenz gefunden, so daß das PstI-Insert 7 471 bps enthält. Durch
Restriktasespaltungen des PstI-Inserts werden Restriktaseschnittstellen (Abb. 1 ermittelt, die
alle durch das Restriktionsmuster der DNA-Sequenz der Datenbank bestätigt und für weitere
Plasmidkonstruktionen (Ausführungsbeispiele 4 u. 5) genutzt werden. Außerdem wird durch
diesen Homologievergleich das PstI-Insert innerhalb der ca. 90 kb-Region zwischen den
bekannten Genen ctrA und sacA lokalisiert, in der nach Literaturangaben ein bac-1 Locus
kartiert worden ist.
Nach Angaben der Datenbank sind in dem PstI-Fragment 6 vollständige, funktionell noch
unbekannte ORF's ywfA bis ywfF enthalten, die wegen ihrer Funktion in der Bacilysin-
Biosynthese zu bacA bis bacF (Abb. 1) umbenannt werden. Erste Hinweise auf ihre Funktion
werden durch einen Homologievergleich der durch die Gene bacA bis bacF putativ kodierten
Proteine BacA bis BacF zu bekannten Proteinen anderer Organismen mittels der "SWISS-
PROT database" (ExPASY Molecular Biology Server, Fasta 3) erhalten: Hohe Homologien
für BacB zu einer Prephenatdehydratase von Streptomyces coelicolor (28%), für BacE zu D-
Alanin-D-Alanin-Ligasen von Haemophilus influenzae (29%) und von Bacillus subtilis (21,5%)
sowie für BacF zu einem Macrolid-Effluxprotein (24,8%) weisen auf Funktionen in der
Synthese vom Prephenat zum Antikapsin, Ligation von Antikapsin mit L-Alanin zu Bacilysin
bzw. beim Transport hin.
Bei der Suche nach putativen Operonstrukturen werden stromaufwärts zu bacB (von bp
3874425 bis bp 3874360 der genomischen DNA-Sequenz) Promotermotive (acattg/taatat)
ermittelt, während ein Transkriptionsterminator wahrscheinlich nur stromabwärts von bacA
(von bp 3873120 bis bp 3873061) vorliegt.
Zur Ermittlung der biologischen Funktion der einzelnen bac-Gene werden zunächst die
flankierenden Gene bacA und bacB deletiert, indem aus dem Insert von pSB660 (s. Abb. 1)
ein Subfragment von PvuII (bp 1680) bis SalI (bp 5642) in einen Plasmidvektor pSB595
kloniert und so ein rekombinantes Derivat pSB672 = pSB660 ΔbacA ΔbacF isoliert wird.
Auch pSB672 komplementiert die bac-1-Mutation in GSB298 und kodiert eine mit pSB657
und pSB660 vergleichbar hohe Bacilysinbildung (Abb. 3). Ebenfalls durch Subklonierung aus
dem Insert von pSB660 wird pSB679 = pSB660 Δ(bacA bacD bacE bacF) erzeugt, indem ein
Subfragment von PvuII (bp 1680) bis SacI (bp 3558) in den Plasmidvektor pSB595 kloniert
wird. Weitere Mutanten pSB676 = pSB672 bacB*, pSB677 = pSB672 ΔbacC, pSB678 =
pSB672 ΔbacD und pSB674 = pSB672 ΔbacE werden von pSB672 abgeleitet (Positionen der
folgenden Restriktaseschnittstellen s. Abb. 1) durch "Klenow-fill-in" (*; Kit von Stratagene)
in BglII (bp 2236); Deletion in EcoRV (bp 2863) bis NruI (bp 3144), Deletion in EheI (bp
3539) bis Ecl136II (bp 3558) bzw. Deletion in PvuI (bp 4816) bis PvuI (bp 5242). pSB676,
pSB677 und pSB678 kodieren in GSB298 eine im Vergleich zu den Ausgangsplasmiden auf
1/10 reduzierte Bacilysinbildung (Abb. 4). Sehr drastische Auswirkungen hat dagegen die
Deletion in bacE: GSB298 (pSB674) bildet kein Bacilysin, kann bei Kultivierung in PA-
Medium (also unter Bedingungen der Bacilysinbildung) nicht wachsen, bildet untypische,
aufgeblähte Zeliformen und lysiert schließlich.
Im Unterschied zu Ausführungsbeispiel 4 werden hier chromosomale bac-Gene des Gen-
Donors durch Insertion inaktiviert, um ihre Funktion in der Bacilysinbiosynthese zu ermitteln.
Die Insertion erfolgt durch generelle Rekombination über doppeltes Gross-over und wird
mittels Integrationsplasmide ausgeführt. In den Integrationsplasmiden ist ein
Selektionsmarker innerhalb des zu inaktivierenden bac-Gens inseriert und wird so von
Fragmenten des bac-Gens flankiert, die in einem homologen Wirtsstamm das doppelte Cross-
over bewirken. Meist (Ausnahmen: Klenow-fill-in bei pSB676 bzw. pSB682, s. u.) wird
vorher ein interner Teil des bac-Gens deletiert, so daß nach doppeltem Cross-over eine
Reversion zur Reaktivierung des bac-Gens ausgeschlossen wird. Durch das doppelte Cross-
over wird nur ein chromosomales DNA-Fragment mit dem aktiven bac-Gen gegen ein
homologes Fragment mit dem inaktivierten bac-Gen-Derivat aus dem Integrationsplasmid
rekombinativ ausgetauscht, so daß der Vektoranteil von der Integration ausgeschlossen bleibt.
Integrationsplasmide werden entsprechend den Mutanten pSB674 bis pSB678
(Ausführungsbeispiel 4) konstruiert und zusätzlich ein cmlR-Gen für
Chloramphenicolresistenz als Selektionsmarker in die mutierte Stelle eingeführt. Als Gen-
Donor für den cmlR-Selektionsmarker dienen ein Plasmid pSB523 und pSB573, in denen das
cmlR-Gen innerhalb von multiplen Klonierungsstellen enthalten ist. Es werden die
Integrationspiasmide pSB682 = pSB672 bacB*::cmlR, pSB683 = pSB672 ΔbacC::cmlR,
pSB684 = pSB672 bacD::cmlR, pSB680 = pSB672 ΔbacE::cmlR und pSB685 =
pSB660Δ (bacA bis bacF)::cmlR erhalten. pSB685 wird von pSB660 (s. Abb. 1) nach
Deletion von Pvull (bp 1680) bis EcoRV (bp 5681) abgeleitet. Zur chromosomalen
Integration werden die Inegrationsplasmide linearisiert (als Voraussetzung für doppeltes
Cross-over) und in kompetente Zellen von Bacillus subtilis 168 transformiert. Die Selektion
erfolgt über Chloramphenicolresistenz, und doppeltes Cross-over (zum Ausschluß von
einfachem Cross-over und Mutationen) wird nachgewiesen durch die Abwesenheit von
plasmidkodierter MLS-Antibiotikaresistenz (kodiert durch den plasmideigenen
Selektionsmarker des Integrationsplasmides) und von freier Plasmid-DNA des
Integrationsvektors, durch Southernhybridisierung mit dem cmlR-Gen als markierte Probe
sowie durch Klonierung und Restriktionsanalyse der betreffenden chromosomalen Region.
Als Insertionsmutanten werden GSB319 = Bacillus subtilis 168 bacB*::cmlR, GSB320 =
Bacillus subtilis 168 ΔbacC::cmlR, GSB321 = Bacillus subtilis 168 ΔbacD::cmlR, GSB315 =
Bacillus subtilis 168 ΔbacE::cmlR und GSB322 = Bacillus subtilis 168 Δ(bacA bis
bacF)::cmlR isoliert, und alle erweisen sich als Bacilysin-negativ.
Zur Prüfung auf Auxotrophie werden die Insertionsmutanten auf PA-Minimalagar
ausgestrichen und als prototroph für die Aminosäuren Phenylalanin und Tyrosin identifiziert,
deren Biosynthese (ebenso wie für Anticapsin) vom Prephenat im Biosyntheseweg der
aromatischen Aminosäuren abzweigt.
In einem Lochplattentest mit verschiedenen chromosomalen Insertionsmutanten (s.
Ausführungsbeispiel 5) als Indikatorstämme und einem Bacilysin-haltigen Kulturüberstand
als Probe werden die Insertionsmutanten auf Bacylisinsensibilität geprüft. Alle
Insertionsmutanten, auch GSB322 mit Deletion in bacA bis bacF, zeigen keine
Inhibitionszonen und erweisen sich dadurch (wie GSB298 und Bacillus subtilis 168) als
unverändert Bacilysin-resistent.
Verschiedene Deletionsplasmide (s. Ausführungsbeispiel 4) werden in unterschiedliche
chromosomale Insertionsmutanten (s. Ausführungsbeispiel 5) transformiert und die so
erzeugten Plasmidtransformanten auf Effekte hinsichtlich der Bacilysinbildung oder
korrelierter Merkmale untersucht. Bemerkenswert sind die folgenden Ergebnisse:
# GSB322 (pSB672) zeigt eine mit GSB298 (pSB660) oder GSB298 (pSB672) vergleichbar hohe plasmidkodierte Bacilysinbildung, so daß bacB bis bacE als essentiell oder hinreichend, bacA und bacF dagegen als unwesentlich oder nicht relevant für eine hohe Bacilysinbildung gewertet werden können
# GSB322 (pSB674) (nicht aber Plasmidtransformanten von pSB674 mit anderen chromosomalen Insertionsmutanten) verhält sich bei Kultivierung in PA-Minimalmedium hinsichtlich Defekt in der Bacilysinbildung, aberranter Zellformen und Zellyse wie GSB298 (pSB674), so daß dieser Mutantenphänotyp (wie auch bei NG79 oder GSB298) nicht auf den Defekt in nur einem bac-Struktur-Gen zurückgehen kann.
# GSB322 (pSB672) zeigt eine mit GSB298 (pSB660) oder GSB298 (pSB672) vergleichbar hohe plasmidkodierte Bacilysinbildung, so daß bacB bis bacE als essentiell oder hinreichend, bacA und bacF dagegen als unwesentlich oder nicht relevant für eine hohe Bacilysinbildung gewertet werden können
# GSB322 (pSB674) (nicht aber Plasmidtransformanten von pSB674 mit anderen chromosomalen Insertionsmutanten) verhält sich bei Kultivierung in PA-Minimalmedium hinsichtlich Defekt in der Bacilysinbildung, aberranter Zellformen und Zellyse wie GSB298 (pSB674), so daß dieser Mutantenphänotyp (wie auch bei NG79 oder GSB298) nicht auf den Defekt in nur einem bac-Struktur-Gen zurückgehen kann.
pSB660 und verschiedene Deletionsplasmide (s. Ausführungsbeispiel 4) werden in Bacillus
amyloliquefaciens GSB272, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis ATCC9789, Bacillus
megaterium PV361 und Bacillus pumilus ATCC 12140 transformiert und die erhaltenen
Plasmidtransfomanten auf plasmidkodierte Bacilysinbildung getestet. Plasmidtransformanten
von Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis ATCC9789 und Bacillus megaterium
ATCC12140 bilden kein extrazelluläres Bacilysin, während in Bacillus pumilus ATCC12140
(wie in Bacillus subtilis GSB298) schon pSB672 mit bacB bis bacE als aktive Gene eine hohe
Bacilysinbildung kodiert. Eine besonders hohe plasmidkodierte Bacilysinbildung, bis 5-fach
im Vergleich zu GSB298 (pSB660) oder GSB298 (pSB672), wird in Bacillus
amyloliquefaciens GSB272 erreicht, wozu bereits das Deletionsplasmid pSB679
(Ausführungsbeispiel 4) mit bacB und bacC hinreichend ist.
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Claims (30)
1. bac-Gene zur Biosynthese von Anticapsin und Bacilysin sowie ihre Fragmente, Mutanten
und Varianten.
2. bac-Gene nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem bakteriellen Gen-
Donorstamm, besonders aus Bacillus, isoliert werden.
3. bac-Gene nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie vorzugsweise aus
Bacillus subtilis 168 stammen.
4. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie die
Sequenz ID No. 1 betrifft sowie Fragmente, Mutanten und Varianten dieser Sequenz.
5. RNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie voll
ständig oder partiell komplementär sind.
6. DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie
vollständig oder partiell homolog sind.
7. Rekombinante Vektoren, die für Anticapsin oder Bacilysin kodierende Gene enthalten.
8. Rekombinante Plasmide, die für Anticapsin oder Bacilysin kodierende Gene enthalten.
9. Ein rekombinantes Plasmid pSB657 nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es
durch shot-gun-Klonierung von bac-Genen aus Bacillus subtilis 168 erhalten wird und in
Wirtsstämmen von Bacillus extrazelluläres Bacilysin kodiert.
10. Plasmid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß in dem durch Primärklonierung
erzeugten rekombinanten Plasmid pSB657 die bac-Gene innerhalb eines 21,5 kb-BamHI-
Inserts enthalten sind.
11. Ein rekombinantes Plasmid pSB660 nach Anspruch 8, 9 oder 10, dadurch
gekennzeichnet, daß es durch PstI-Subklonierung aus dem 21,5 kb-BamHI-Insert von
pSB657 erhalten wird und die buc-Gene innerhalb eines 7,5 kb-PstI-Inserts enthält.
12. Plasmid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das 7,5 kb-PstI-Insert von
pSB660 mittels DNA-Sequenzierung und Vergleich der DNA-Homologie als 7471 -PstI-
Fragment, lokalisiert von bp 3867455 bis bp 3874925 in der DNA-Sequenz (SubtiList
database) des Genoms von Bacillus subtilis 168, identifiziert wird.
13. Offene Leserahmen ywfA, ywfB, ywfC, ywfD, ywfE und ywjF (SubtiList database) im
Insert des rekombinanten Plasmids pSB660, die an der Bacilysinbiosynthese in Bacillus-
Wirtsstämmen beteiligte Funktionen kodieren und deshalb zu bacA bis bacF gemäß Abb. 1
umbenannt werden, die damit Gegenstand des Anspruchs ist.
14. Ein rekombinantes Plasmid pSB672 nach Anspruch 8, 11 und 13, dadurch
gekennzeichnet, daß es durch Subklonierung von PvuII, bp1680, bis SalI, bp5642, aus dem
PstI-Insert von pSB660 erhalten wird und die Gene bacB bis bacE innerhalb eines 3968 bps-
Inserts enthält.
15. Ein rekombinantes Plasmid pSB679 nach Anspruch 8, 11 und 13, dadurch
gekennzeichnet, daß es durch Subklonierung von PvuII, bp 1680, bis SacI; bp 3558, aus dem
PstI_Insert von pSB660 erhalten wird und die Gene bacB und bacC innerhalb eines 1878 bps-
Inserts enthält.
16. Verwendung der rekombinanten Plasmide pSB657, pSB660, pSB672, pSB679 oder von
Derivaten dieser Plasmide nach einem der Ansprüche 9 bis 15 in bakteriellen Wirtsstämmen,
vorzugsweise in Bacillus subtilis und auch in heterologen Bacillus-Wirtsstämmen, zur
Bacilysinbildung.
17. Verwendung nach Anspruch 16 in den heterologen Wirtsstämmen Bacillus
amyloliquefaciens GSB272 und Bacillus pumilus ATCC12140.
18. Verfahren zur Isolierung von bac-Genen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und 13,
dadurch gekennzeichnet, daß sie mittels gentechnischer Methoden isoliert und in geeigneten
Wirtsstämmen amplifiziert werden sowie ihre Funktion bei der Biosynthese von Anticapsin
und Bacilysin charakterisiert wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß palindrome, posititiv selektive
Plasmidvektoren und nichtpalindrome Plasmidvektoren mit hoher Klonierungskapazität und
Stabilität zur Isolierung von Gen-Banken mit großen chromosomalen DNA-Inserten bzw.
für Subklonierungen verwendet werden.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß ein palindromer, einfach
positiv selektiver Plasmidvektor pPS15 und ein nichtpalindromer Plasmidvektor pSB595
eingesetzt werden.
21. Verfahren nach Anspruch 19 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß Bacylisin-negative
Wirtsstämme, vorzugsweise von Bacilluc subtilis 168, für die primäre Klonierung genutzt
werden, die wegen einer chromosomalen Mutation keine chromosomal kodierte
Bacilysinbildung aufweisen, und die Klonierung von bac-Genen aufgrund der
Komplementation der chromosomalen Mutation nachgewiesen wird.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mutante NG79 hac-1
oder Derivate von NG79 aus der Stammfamilie Bacillus subtilis 168 als Bacylisin-negative
Wirtsstämme eingesetzt werden.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß ein stabilisierender Stamm
Bacillus subtilis GSB298 oder ein vergleichbarer Stamm als Bacilysin-negativer Wirtsstamm
eingesetzt wird, der eine erhöhte Transformationsfähigkeit und stabilisierende Wirkung auf
rekombinante Plasmidderivate mit einem großen Insert aufweist.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß GSB298 als spontane Mutante
von NG79 abgeleitet und aufgrund einer stabilisierenden Wirkung auf palindrome, zweifach
positiv selektive Plasmidvektoren isoliert wird.
25. Verfahren nach Anspruch 18 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß Gen-Banken mit großen
chromosomalen DNA-Inserten vorzugsweise mittels partieller Restriktasespaltung der Donor-
DNA und Insertion von vorselektierten, großen (< 10 kb) DNA-Fragmenten isoliert
werden.
26. Verfahren nach Anspruch 18, 20, 23 und 25, dadurch gekennzeichnet, daß nach partieller
BamHI-Spaltung eine Gen-Bank erhalten und aus dieser ein rekombinanter Stamm Bacillus
subtilis GSB298 (pSB6S7) mit klonierten bac-Genen von Bacillus subtilis 168 isoliert wird,
die extrazelluläres Bacilysin kodieren.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das plasmidkodierte
extrazelluläre Bacilysin anhand der Hemmung eines Bacilysin-sensiblen Indikatorstammes,
vorzugsweise von Escherichia coli B oder Proteus vulgaris, und der Hemmung von
Bacilysin durch N-Acetyl-glukosamin nachgewiesen wird und nicht in Wirtsstämmen, wie
Bacillus subtilis GSB285 aroI906, gebildet wird, die in der Synthese von aromatischen
Aminosäuren defekt sind.
28. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß pSB660, pSB672 oder
pSB679 oder Derivate dieser rekombinanten Plasmide in bakteriellen Wirtsstämmen,
vorzugsweise von Bacillus, aufgrund der Gen-Amplifikation eine Überproduktion von
Anticapsin oder Bacilysin bewirken und die rekombinanten Stämme zur industriellen
Produktion der Wirkstoffe genutzt werden.
29. Verfahren nach Anspruch 16 und 28, dadurch gekennzeichnet, daß pSB660, pSB672 oder
pSBb79 in dem Wirtsstamm Bacillus amyloliquefaciens GSB272 eine mehrfach erhöhte
Bacilysinbildung bewirkt.
30. Verfahren nach Anspruch 28 und 29, dadurch gekennzeichnet, daß die plasmidkodierte
Bacilysinbildung sofort mit Wachstumsbeginn startet und dadurch ein Vorteil gegenüber der
chromosomal kodierten Bacilysinbildung des Donorstammes erzielt wird, die bei
vergleichbarem Wachstum mit erheblicher zeitlicher Verzögerung erfolgt.
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