DE60224457T2

DE60224457T2 - Methode zur modifizierung des plasmid-gehalts

Info

Publication number: DE60224457T2
Application number: DE60224457T
Authority: DE
Inventors: Jayaraman Gowrishankar; Rajendran Harinarayanan
Original assignee: CT FOR DNA FINGERPRINTING AND; Centre for DNA Fingerprinting and Diagnosis of Ministry of Science and Technology India
Current assignee: CT FOR DNA FINGERPRINTING AND; Centre for DNA Fingerprinting and Diagnosis of Ministry of Science and Technology India
Priority date: 2002-10-08
Filing date: 2002-10-28
Publication date: 2009-02-05
Anticipated expiration: 2022-10-29
Also published as: US7176028B2; EP1674572B1; DE60230688D1; ATE419343T1; DE60224457D1; EP1551969A1; ATE382689T1; AU2002339634A1; JP2006501837A; US7220588B2; US20040067589A1; WO2004033684A1; EP1551969B1; EP1674572A1; JP4142649B2; US20060246590A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Prozess für Plasmid-DNA, das entweder einen erhöhten Plasmidgehalt in bakteriellen Wirtszellen und eine erhöhte Ausbeute an Plasmid-DNA oder einen verringerten Plasmidgehalt in bakteriellen Wirtszellen ermöglicht.
Stand der Technik
Plasmide sind stabile, extrachromosomale, genetische Elemente in Bakterien, die am häufigsten aus ringförmiger DNA (die häufig eine Größe von einigen Kilobasenpaaren [kb] aufweist) bestehen, und die zur autonomen Replikation in Bakterienzellen imstande sind. Mit dem Aufkommen der rekombinanten DNA-Technologie wurden Plasmide zunehmend in zahlreichen Prozessen als Träger oder Vektoren zur Einführung und Beibehaltung nicht-nativer DNA in bakteriellen Wirtszellen verwendet. In jüngster Zeit wurden Plasmide auch in der Form von DNA-Impfstoffen in der medizinischen und veterinärmedizinischen Praxis als Produkte wichtig. In den meisten solcher Anwendungen ist der bakterielle Wirt Escherichia coli.
Ein wichtiges Merkmal in Bezug auf Plasmide ist ihre Kopienzahlregulierung in bakteriellen Zellen. Unter normalen Wachstumsbedingungen wird jedes Plasmid durch die Wirkung von Feedback-Regulationsschleifen, die die Replikation der Plasmid-DNA kontrollieren, bei einer charakteristischen Kopienzahl in der Zelle gehalten. Eine Klasse von Plasmiden, die weitgehend in der Biotechnologie verwendet wird, sind die "ColE1-artigen" Plasmide, die die natürlich vorkommenden Plasmide ColE1, p15A, RSF1030, CloDF13 und pMB1, wie auch die Klonierungsvektoren pBR322, pBR329, pACYC184, pACYC177 und pUC- und die pBluescript-Reihe von Plasmiden enthalten. In der Replikation der CoE1-artigen Plasmide in E. coli beinhalten die Feedback-Regulationsschleifen eine plasmidspezifische RNA-Spezies (RNA-II), die die Replikation aktiviert, und eine zweite plasmidspezifische RNA-Spezies (RNA-I) und ein Protein (Rop), die zur Hemmung der Replikation dienen [Polisky (1988) Cell 55: 929–932].
Nach dem Stand der Technik wurde versucht, Änderungen in der Kopienzahl von Plasmiden – sowohl aufwärts wie auch abwärts durch Manipulation der betroffenen Feedback-Regulationsschleifen zu erzielen, wie in der Folge kurz beschrieben wird. Manipulationen zur Erhöhung der Plasmid-Kopienzahl sind allgemein erwünscht, wenn das Ziel (i) die Erhöhung der Ausbeuten der Plasmid-DNA aus Kulturen, zum Beispiel in rekombinanten DNA-Routineexperimenten oder in der Herstellung von DNA-Impfstoffen; oder (ii) die Erhöhung der Expression eines oder mehrere Produkte ist, für die ein oder mehrere Plasmid-assoziierte Gene kodieren. Eine Erhöhung in der Plasmid-Kopienzahl wurde entweder konstitutiv durch Mutationen, die die Feedback-Regulationsschleifen inaktivieren (die zum Beispiel in den allgemein verwendeten ColE1-abgeleiteten pUC-Reihen von Plasmidvektoren mit sehr hohen Kopienzahlen vorhanden sind, wie zum Beispiel pUC18 oder pUC19), oder durch induzierbare Prozesse erreicht, die als Runaway-Plasmid-Replikationssysteme bezeichnet werden [Lin-Chao et al. (1992) Mol. Microbiol. 6: 3385–3393; Nordstrom und Uhlin (1992) Bio/Technology 10: 661–666].
Manipulationen zur Senkung der Plasmid-Kopienzahl wurden in Situationen wertvoll, in welchen das Gen oder die Gene, die mit dem Plasmid assoziiert sind, den bakteriellen Wirtszellen einen dosisabhängigen Wachstumsnachteil verleihen. Die Mutation in penB, einem chromosomalen E. coli-Gen, verringerte nachweislich die Kopienzahl sowohl von ColE1-abgeleiteten wie auch p15A-abgeleiteten Plasmiden, höchstwahrscheinlich durch Stabilisierung der RNA-I-Transkripte, die an der negativen Kontrolle der Plasmidreplikation beteiligt sind [Lopilato et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 205: 285–290].
Aufgaben der vorliegenden Erfindung
Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung einer Methode zum Erreichen eines geänderten Plasmidgehalts in einem Bakterium, das eine Mutation in dem chromosomalen Gen nusG aufweist.
Eine weitere Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung einer Methode, in der die nusG-Genmutation zu einer Erhöhung im Plasmidgehalt führt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung einer Methode zur Änderung des Plasmidgehalts, wobei die Differenz im Plasmidgehalt etwa zehnfach ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung eines E. coli-Stamms des Genotyps MC4100 nusG argE86::Tn10 dnaC zjj901::Tn10dKan.
Eine weitere Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung eines E. coli-Stamms mit einer Mutation im Codon 146 des nusG Gens, die zum Ersatz von Glycin durch Aspartat an der entsprechenden Aminosäureposition des kodierten Proteins führt.
Kurzdarstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalten eines geänderten Plasmidgehalts in Bakterien, die eine Mutation im chromosomalen nusG Gen aufweisen, und deren bakterielle Stämme, die das mutierte chromosomale Gen aufweisen, die imstande sind, den Plasmidgehalt zu ändern.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhalten eines geänderten Plasmidgehalts in Bakterien, die eine Mutation im chromosomalen nusG Gen aufweisen, und deren bakterielle Stämme, die die mutierten chromosomalen Gene einzeln oder in verschiedenen möglichen Kombinationen aufweisen, die imstande sind, den Plasmidgehalt zu verändern.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Erhalten eines geänderten Plasmidgehalts in einem Bakterium, das eine Mutation im chromosomalen nusG Gen aufweist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Einführen einer Mutation in das chromosomale Gen nusG des Wirtsbakteriums,
(b) Beibehalten einer funktionellen Kopie des chromosomalen Gens auf einem wahlweisen Replikon in dem Bakterium,
(c) Kultivierung des Bakteriums unter Bedingungen, welche die intrazelluläre Replikation und die Beibehaltung des wahlweisen Replikons gestatten,
(d) Überführen des Bakteriums unter einschränkenden Bedingungen, welche die intrazelluläre Replikation des wahlweisen Replikons nicht länger gestatten,
(e) Schätzen des Gehalts an Plasmidvektoren im Bakterium sowohl unter nicht eingeschränkten als auch unter eingeschränkten Bedingungen, und
(f) Berechnen der Differenz des Gehalts an Plasmidvektoren im Bakterium sowohl unter nicht eingeschränkten als auch unter eingeschränkten Bedingungen in dem Gen.

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt das nusG Gen eine GC-zu-AT Mutation im Codon 146, was zum Ersatz von Glycin durch Aspartat bei der entsprechenden Aminosäure führt.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae die Wirtsbakterien.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Wirtbakterien vorzugsweise E. coli.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Plasmidvektoren vorzugsweise aus einer Gruppe, die von ColE1 abgeleitete Plasmide und von p15A abgeleitete Plasmide umfasst.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die von ColE1 abgeleiteten Plasmide Mitglieder der Inkompatibilitätsgruppe, welche die Plasmide pBR322, pBR329, die pUC Plasmidreihe, die pBluescript Plasmidreihe und deren Derivate umfasst.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die von p15A abgeleiteten Plasmide Mitglieder der p15A Inkompatibilitätsgruppe, welche die Plasmide pACYC184 und pACYC177 sowie deren Derivate umfasst.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung führt die nusG Genmutation zu einer Steigerung im Plasmidgehalt.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Steigerung des Plasmidgehalts etwa zehnfach.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigen die das wahlweisen Replika ein nicht-mutiertes Gen, das nusG umfasst.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung trägt das Verfahren zum Erhalt von Zielgenen in erwünschten Mengen bei.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen E. coli Stamm des Genotyps MC4100 nusG argE86::Tn10 dnaC zjj901::Tn10dKan mit der Zugangsnummer NCIMB 41132, hinterlegt bei NCIMB Limited, Schottland, UK.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung trägt der Stamm eine GC-zu-AT Mutation im Codon 146 des chromosomalen nusG Gens, was zum Ersatz von Glycin durch Aspartat an der entsprechenden Aminosäureposition des kodierten Proteins führt, gemeinsam mit einer argE86::Tn10 Mutation, die ungefähr zu 25% an nusG bei Transduktion des Phagen PI gekoppelt ist.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Plasmid ein IPTG-(Isopropyl-Beta-D-Thiogalaktopyranosid)-abhängiges wahlweises Replikon des nusG Gens.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Plasmid ein temperaturempfindliches wahlweises Replikon des nusG Gens.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht, ungeachtet der oben genannte Entwicklungen nach dem Stand der Technik, ein Bedarf an zusätzlichen und verbesserten Prozeduren zur Erhöhung oder Senkung der Kopienzahlen und Ausbeute einer Plasmid-DNA, angesichts der umfassenden Anwendungen der rekombinanten DNA-Technologie auf Plasmidbasis wie auch der Ausbeuteanforderungen, die durch die Verwendung von Plasmiden als DNA-Impfstoffe entstehen.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft neuartige Prozesse, die wir zur Änderung des Plasmid-DNA-Gehalts in bakteriellen Wirtszellen sowie dessen Ausbeute von entwickelt haben, indem Stämme verwendet werden, die eine Mutation in nusG aufweisen. Vorzugsweise sind die bakteriellen Zellen von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, z. B. Escherichia coli. Die nusG und rho Genprodukte wurden in Transkriptionsterminations- und/oder Antiterminationsreaktionen innerhalb der bakteriellen Zelle impliziert [Sullivan et al. (1992) Cell 68: 989–994; Martinez et al. (1996) J. Mol. Biol. 257: 895–908], während das dnaC Genprodukt an der chromosomalen und Plasmid-DNA-Replikation in vivo teilnimmt [Marians (1996) "Replication Fork Progression", in Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 2. Auflage (Neidhardt et al., Hrsg.), ASM Press, Washington D. C., USA, Kapitel 50, S. 749–763]. Nach dem Stand der Technik gab es keine Beschreibung von Prozessen, die Mutationen in einem dieser Gene zur Änderung des Plasmid-DNA-Gehalts in und der Ausbeute von den entsprechenden bakteriellen Wirtszellen verwenden.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt ein Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Kopienzahlen von Plasmiden in bakteriellen Wirtszellen mit einer Mutation in dem nusg Gen.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt die Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Kopienzahlen von Plasmiden bereit, wobei (i) die bakteriellen Wirtszellen eine Mutation in dem chromosomalen nusG Gen aufweisen, (ii) die Zellen auch ein funktionales nusG⁺ Gen auf einem wahlweisen Replikon tragen, (iii) das Bakterium unter Bedingungen kultiviert wird, die eine intrazelluläre Replikation und Beibehaltung des wahlweisen Replikons gestatten, und (iv) die Kultur anschließend unter einschränkende Bedingungen überführt wird, die keine weitere Replikation des wahlweisen Replikons gestatten.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein bevorzugter Aspekt der Erfindung deren Anwendbarkeit bei von ColE1 abgeleiteten Plasmiden und von p15A abgeleiteten Plasmiden.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist, wie hierin verwendet, ein "von ColE1 abgeleitetes Plasmid" ein Plasmid, das ein Mitglied der ColE1-Inkompatibilitätsgruppe ist, und enthält zum Beispiel die Plasmide pBR322, pBR329, die pUC Plasmidreihe, die pBluescript Plasmidreihe und deren Derivate.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist, wie hierin verwendet, ein "von p15A abgeleitetes Plasmid" ein Plasmid, das ein Mitglied der p15A-Inkompatibilitätsgruppe ist, und enthält zum Beispiel die Plasmide pACYC184 und pACYC177 und deren Derivate.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist, wie hierin verwendet, ein "wahlweises Replikon" ein extra-chromosomales genetisches Element, das zur autonomen Replikation in einer bakteriellen Wirtszelle unter bestimmten Wachstumsbedingungen der bakteriellen Kultur geeignet ist, die als "nicht einschränkend" bezeichnet werden, aber nicht unter gewissen anderen Kulturbedingungen, die als "einschränkend" bezeichnet werden.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wenn nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung, wie sie ein Durchschnittsfachmann in dem Bereich kennt, den diese Erfindung betrifft. Im Falle eines Konflikts gilt die vorliegende Anmeldung mit ihren Definitionen.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die bevorzugten Verfahren und Materialien in der Folge beschrieben, obwohl Verfahren und Materialien, die ähnlich oder gleich den hierin beschriebenen sind, in der Praxis oder Testung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Die Materialien, Verfahren und Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sind nicht als Einschränkung zu verstehen. Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der ausführlichen Beschreibung und aus den Ansprüchen hervor.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde in Übereinstimmung mit den Anforderungen nach einer vollständigen Offenbarung der folgende Stamm dieser Erfindung bei NCIMB Ltd., 23 St Machar Drive, Aberdeen AB24 3RY, Schottland, UK, gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags vor dem Einreichdatum dieser Anmeldung hinterlegt. Der Escherichia coli Stamm GJ3158 wurde am 24. Mai 2002 unter der Zugangsnummer NCIMB 41132 hinterlegt. Der Stamm GJ3158 wurde aus Stamm MC4100 in mehreren Schritten einer Phage-P1-vermittelten Transduktion konstruiert. Der Genotyp des Stamms GJ3158 ist in der Folge beschrieben.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Tatsache, dass die weitverbreitete Verwendung von Plasmiden in zahlreichen rekombinanten DNA-Prozessen den Bedarf an zusätzlichen neuen und verbesserten Verfahren zur Manipulation, sowohl aufwärts wie auch abwärts, der Kopienzahlen solcher Plasmide in bakteriellen Wirtszellen kreiert hat. Verfahren zur Erhöhung des Plasmid-DNA-Gehalts sind auch besonders im Zusammenhang mit der industriellen Herstellung von DNA-Impfstoffen nützlich. Daher stellt die vorliegende Erfindung mehrere Verfahren zur Erhöhung und Senkung des Plasmid-DNA-Gehalts in bakteriellen Wirtszellen bereit. Diese Verfahren beruhen auf Entdeckungen gewisser neuartiger Eigenschaften von bakteriellen Zellen mit Mutationen in den nusG, rho oder dnaC Genen, die hierin beschrieben sind.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist in der Wissenschaft Escherichia coli das bevorzugte Wirtsbakterium für verschiedene rekombinante DNA-Prozesse; und von ColE1 abgeleitete Plasmide und von p15A abgeleitete Plasmide gehören zu den bevorzugten Plasmidvektoren, die in diesen Prozessen verwendet werden. In der Herstellung von DNA-Impfstoffen sind von ColE1 abgeleitete Plasmide mit gewissen Mutationen (in der Replikations-Starter-RNA-II) und/oder Deletionen (des Gens, das für ein kleines Protein kodiert, das als Rop oder Rom bezeichnet wird) bevorzugt, die zu erhöhten Plasmid-Kopienzahlen in den bakteriellen Wirtszellen führen, z. B. Derivate der pUC oder pBluescript Reihe von Plasmiden.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von E. coli als Wirtsbakterium auch ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung. Ebenso ist die Verwendung der von ColE1 abgeleiteten Plasmide und der von p15A abgeleiteten Plasmide ein anderer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung. Ein weiterer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von ColE1-abgeleiteten Plasmiden in sehr hoher Kopienzahl mit einer Mutation in RNA-II und/oder einer Deletion von Rom, z. B. die pUC oder pBluescript Reihe von Plasmiden.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist gemäß einem Aspekt der Erfindung die nusG Mutation jene, die die Funktion des kodierten Proteins verringert. Das folgende Beispiel 1 beschreibt diesen Aspekt der Erfindung in Bezug auf die Verwendung eines E. coli Wirtsbakteriums mit einer GC-zu-AT Mutation im Codon 146 des chromosomalen nusG Gens, was zum Ersatz von Glycin durch Aspartat an der entsprechenden Aminosäurenposition des kodierten Porteins führt, in Verbindung mit dem von p15A abgeleiteten Plasmid pACYC184 in der bakteriellen Wirtszellen. Es kann festgehalten werden, dass eine gewisse Änderung in dem nusG-kodierten Protein durch eine von zahlreichen Methoden erhalten werden kann, die in der Wissenschaft bekannt sind, und dass andere Mutationen in nusG oder andere Plasmidderivate als pACYC184 von einem Fachmann in Erwartung ähnlicher Ergebnisse verwendet werden können.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung trägt die bakterielle Wirtszelle, die eine chromosomale nusg Mutation aufweist, auch ein wahlweises Replikon mit einem funktionalen nusG⁺ Gen. Die Verfahrensschritte enthalten einen, in dem das Bakterium zunächst unter Bedingungen kultiviert wird, die für die intrazelluläre Replikation und die Beibehaltung des wahlweisen Replikons nicht einschränkend sind, gefolgt von einem, in dem die Kultur anschließend unter einschränkenden Bedingungen inkubiert wird, die eine weitere Replikation des wahlweisen Replikations nicht gestatten. Das folgende Beispiel 2 beschreibt die Konstruktion von Plasmid pHYD763, eines temperaturempfindlichen wahlweisen Replikons mit nusG⁺, und seine Verwendung in der bakteriellen Wirtszelle mit einer GC-zu-AT-Mutation in Codon 146 des chromosomalen nusG Gens, was zum Ersatz von Glycin durch Aspartat an der entsprechenden Aminosäureposition des kodierten Proteins führt, um den Gehalt des von p15A abgeleiteten Plasmids pACYC184 zu manipulieren. Das folgende Beispiel 3 beschreibt die Konstruktion von Plasmid pHYD751, eines wahlweisen Replikons mit nusG⁺, dessen Replikation von der Gegenwart von Isopropyl-Beta-D-Thiogalaktopyranosid (IPTG) in dem Kulturmedium abhängig ist, und seiner Verwendung in der bakteriellen Wirtszelle mit einer GC-zu-AT-Mutation in Codon 146 des chromosomalen nusG Gens, was zum Ersatz von Glycin durch Aspartat an der entsprechenden Aminosäureposition des kodierten Proteins führt, um den Plasmidgehalt von einem aus der pUC Reihe von Plasmiden, pUC4k, zu manipulieren. Es kann festgehalten werden, dass auf der Grundlage der Lehren nach dem Stand der Technik andere chromosomalen Mutationen in nusG, einschließlich Null- oder Knock-out-Mutationen, andere Verfahren zur Konstruktion von Plasmiden, die pHYD763 oder pHYD751 äquivalent sind, andere wahlweise Replika mit dem nusG⁺ Gen, oder andere Plasmide als pACYC184 oder pUC4K alternativ von Fachleuten in der Ausführung dieser Aspekte der Erfindung verwendet werden können.
Das folgende Beispiel 4 beschreibt ein Beispiel, das nicht gemäß der Erfindung ist, umfassend die Verwendung einer rho-4 Mutation, die die Funktion des kodierten Proteins verringert, in einem E. coli Wirtsbakterium in Kombination mit dem von p15A abgeleiteten Plasmid pACYC184 in der bakteriellen Wirtszelle. Es kann festgehalten werden, dass andere Mutationen in rho oder andere Plasmidderivate als pACYC184 von einem Durchschnittsfachmann in Erwartung ähnlicher Ergebnisse verwendet werden können.
Das folgende Beispiel 5, das nicht gemäß der Erfindung ist, beschreibt die Verwendung des Plasmids pPMrhoCam, eines temperaturempfindlichen wahlweisen Replikons mit rho⁺ in einer bakteriellen Wirtszelle mit einer chromosomalen rho-4 Mutation, um den Plasmidgehalt des von p15A abgeleiteten Plasmids pACYC184 zu manipulieren. Das folgende Beispiel 6, das nicht gemäß der Erfindung ist, beschreibt die Konstruktion von Plasmid pHAD1201, eines wahlweisen Replikons mit rho⁺, dessen Replikation von der Gegenwart von IPTG in dem Kulturmedium abhängig ist, und dessen Verwendung in einer bakteriellen Wirtszelle mit einer chromosomalen rho-4 Mutation, um den Plasmidgehalt von einem aus der pUC-Reihe von Plasmiden, pUC4K, zu manipulieren. Es kann festgehalten werden, dass auf der Grundlage der Lehren nach dem Stand der Technik als Alternative andere chromosomalen Mutationen in rho-4, einschließlich Null- oder Knock-out-Mutationen, andere Verfahren zur Konstruktion von Plasmiden, die pHYD1201 äquivalent sind, andere wahlweise Replika mit rho⁺, oder andere Plasmide als pACYC184 oder pUC4K von Fachleuten in der Ausführung verwendet werden können.
Das folgende Beispiel 7, das nicht gemäß der Erfindung ist, beschreibt ein E. coli Wirtsbakterium mit einer GC-zu-AT Mutation in Codon 83 des chromosomalen dnaC Gens, was zum Ersatz von Alanin durch Threonin an der entsprechenden Aminosäureposition des kodierten Proteins führt, in Kombination mit den folgenden Plasmiden pACYC184, pBR329 oder pUC19 in der bakteriellen Wirtszelle. Es kann festgehalten werden, dass eine gewisse Veränderung in dem dnaC kodierten Protein durch eine von zahlreichen Methoden erhalten werden kann, die in der Wissenschaft bekannt sind, und dass andere Mutationen in dnaC oder andere Plasmidderivate als pACYC184, pBR329 oder pUC19 von einem Durchschnittsfachmann in Erwartung ähnlicher Ergebnisse verwendet werden können.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Prozesse, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, zur Steigerung der Ausbeuten der Plasmid-DNA, zur Erhöhung der Expression von Produkten, die durch Plasmidgene kodiert werden, und zur Verringerung der Toxizität, die mit bestimmten Genen bei hohen Kopienzahlen zusammenhängt, verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Beispiele nur als Veranschaulichung der Verwendungen, Prozesse und Produkte, wie Vektoren und Stämme angeführt, die in dieser Erfindung beansprucht werden, und die Ausführung der Erfindung selbst ist nicht auf oder durch die beschriebenen Beispiele eingeschränkt. Es ist zu erwarten, dass zusätzliche Konfigurationen derselben Erfindung und/oder alternative Mittel, durch die sie in ihrer Ausführung eingeschränkt ist, durch Modifizierungen erreicht werden können, die Materialien und Verfahren enthalten, die bereits bekannt und in der Wissenschaft gut etabliert sind. Es kann in diesem Zusammenhang auch festgehalten werden, dass Orthologe der nusG, rho und gnaC Gene in zahlreichen gramnegativen und grampositiven Bakterien identifiziert wurden.
In den folgenden Beispielen wurden durchgehend die folgenden Materialien und Verfahren verwendet:

1. Die Genotypen von Escherichia coli Stämmen, die in den Beispielen verwendet wurden, sind in der folgenden Tabelle angeführt.

Stamm	Genotyp
CAG18431	ilv-500::Tn10
CGSC5072	leu-277(Am)trpE9851(Oc)IN(rrnD-rrnE)1 rho4
JBK246	fhuA2 lacY1 glnV44 hisG1 rpsL9 malT1 xylA7 melA2 metB1 rpoB7 rpoB2(ts) thi-1
MC4100	delta (argF-lac)U169 rpsL150 relA1 araD139 flb5301 deoC1 ptsF25
MC4100	MC4100 recA::Kan
recA::Kan
GJ862	gleich wie MC4100
GJ863	MC4100 rho-4
GJ1504	MC4100 nusG
GJ1514	JBK246 recA::Kan
GJ3140	MC4100 dnaC zjj-901::Tn10Kan
GJ3141	MC4100 zjj-901::Tn10dKan
GJ3158	MC4100 nusG ArgE86::Tn10 dnaC zjj-901::Tn10dKan

Die Stämme CAG18431, CGSC5072, JBK246 und MC4100 sind von Coli Genetic Stock Center, 830 Kline Biology Tower, MCD Biology Department, 255 Whitney Ave., P. O. Box 20813, Yale University, New Haven, Connecticut 06520-8193, USA, erhältlich. Stamm MC4100 recA::Kan wurde von Prof. R. Jayaraman, School of Biological Sciences, Madurai Kamaraj University, Madurai 625 014, Indien, erhalten. Stamm GJ3158 ist ein Stamm dieser Erfindung und wurde unter der Zugangsnummer NCIMB 41132 bei NCIMB Ltd, Schottland, hinterlegt. Andere Stämme, die oben angeführt sind, sind in den Beispielen beschrieben.

2. Bakteriophage P1 wurde von Prof. A. J. Pittard, Dept. of Microbiology and Immunology, University of Melbourne, Parkville, Victoria 3052. Australien, erhalten und ist ebenso von der NCCB/CBS (The Netherlands Culture Collection of Bacteria), P. O. Box 85167 3508 AD Utrecht, Niederlande (http://www.cbs.knaw.nl(Nccb), erhältlich. Bakterophage Lambda Klon 556 der bestellten Lambda-Phage-Bank des E. coli Genoms wurde von Dr. K. Isono, Dept. of Biology, Faculty of Science, Kobe University, Japan, erhalten und ist in Kohara et al. [Cell (1987) 50: 495–508] beschrieben; er ist ebenso von der NCCB/CBS (The Netherlands Culture Collection of Bacteria) unter derselben Adresse wie oben angeführt erhältlich.
3. Plasmide pCL1920 und pCL1921 wurden von Dr. M. Inouye, Dept. of Biochemistry, UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School, Piscataway, 08854-5634, USA, erhalten und sind in Lerner und Inouye (Nucleic Acids Res. (1990) 15: 4631] beschrieben; diese zwei Plasmide sind auch von der NCCB/CBS (The Netherlands Culture Collection of Bacteria) unter derselben Adresse wie oben angeführt erhältlich. Plasmid pAM34 wurde von Dr. J. P. Bouche, Centre de Recherche de Biochimie et de Genetique Cellulaires, CNRS, 31062, Toulouse, Frankreich, erhalten und ist in Gil und Bouche [Gene (1991) 105: 17–22] beschrieben; es ist auch in der American Type Culture Collection (ATCC), P. O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA, erhältlich. Plasmid pMAK705 wurde von Dr. S. R. Kushner, Dept. of Genetics, University of Georgia, Athens, GA 30602, USA, erhalten, und ist in Hamilton et al. [J. Bacteriol. (1989) 171: 4617–4622) beschrieben. Plasmid pUC4K wurde von Dr. S. R. Kushner an derselben Adresse wie oben angeführt erhalten, und ist auch von Amersham Biosciences Inc., 800 Centennial Avenue, P. O. Box 1327, Piscataway, NJ 08855-1327, USA, erhältlich. Plasmide pACYC184, pBR329 und pUC19 sind in Chang und Cohen (1978) J. Bacteriol. 134: 1141–1156, Covarrubias und Bolivar (1982) Gene 17: 79–89, beziehungsweise Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33: 103–119 beschrieben; alle diese drei Plasmide sind sowohl von der American Type Culture Collection (ATCC) wie auch der NCCB/CBS an den jeweiligen oben genannten Adressen erhältlich; Plasmide pACYC184 und pUC19 sind auch von New England Biolabs Inc., 32 Tozer Road, Beverly, MA 01915-5599, USA, erhältlich. Plasmid pBluescript II-KS wurde von Stratagene Inc., 11011 N. Torrey Pines Road, Ja Jolla, CA 92037, USA, erhalten. Plasmid pPMrhoCam wurde von Dr. J. P. Richardson, Dept. of Chemistry, Indiana University, Bloomington, 47405, USA, erhalten und ist in Martinez et al. [J. Mol. Biol (1996) 257: 895–908] beschrieben.
4. Bakteriologische Medienmaterialien wurden von Difco Laboratories (P. O. Box 331058, Detroit, Michigan 48232-7058, USA) erworben. Antibiotika und Feinchemikalien wurden von Sigma (P. O. Box 14508, St. Louis, Missouri 63178, USA) erworben. Restriktionsendonukleasen und Enzyme, die bei der DNA-Klonierung verwendet wurden, wurden von New England Biolabs (32 Tozer Rd, Beverly, Massachusetts 01915-5599, USA) erhalten.
5. Nähr- und Glucose-Minimalwachstumsmedien wurden von LB- beziehungsweise Minimal-A-Medien abgeleitet, die in "A Shourt Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria" von J. H. Miller (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., USA, beschrieben sind. Bei Bedarf betrug die Ergänzung eines Minimal-Wachstumsmediums mit besonderen Aminosäuren zur Erfüllung einer auxotropen Anforderung aus einer Endkonzentration von jeweils 40 Mikrogramm/ml. Antibiotika wurden (bei Bedarf) bei den folgenden Endkonzentrationen (Mikrogramm/ml) verwendet: Ampicillin (Amp), 100; Tetracyclin (Tet), 15; Chloramphenicol (Cm), 30; Kanamycin (Kan), 50; und Spectinomycin (Sp), 50. Die hochgestellten Zeichen r und s werden zur Bezeichnung der Phänotypen von Resistenz beziehungsweise Sensitivität verwendet. Stammlösungen von Amp, Kan und Sp wurden in Wasser und jene von Tet und Cm in Ethanol hergestellt. IPTG wurde als Stammlösung von 100 mM in Wasser hergestellt und bei einer Endkonzentration von 1 mM verwendet.
6. Verfahren zur P1-Transduktion und für die meisten anderen mikrobiellen genetischen Routinetechniken waren wie in der oben genannten Referenz von Miller beschrieben. Die Stämme wurden als SMG-resistent (oder SMG-sensitiv) auf der Basis ihrer Fähigkeit (oder Unfähigkeit) klassifiziert, bei 37°C auf Glucose-Minimal-A-Agarplatten zu wachsen, die mit 0,05 mg/ml LSerin, L-Methionin und Glycin (plus andere auxotrope Anforderungen, wie passend und angegeben) ergänzt waren. Falls nicht anders angegeben, erfolgten die Prozeduren zur Herstellung von Plasmid und Lambda Phage DNAs, die Herstellung und Klonierung von DNA-Fragmenten und Plasmidtransformationen nach den Standardtechniken, die in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition" von Sambrook et al. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. USA, beschrieben sind. Wenn nicht anders angegeben, wurden die Stammderivate, die das IPTG-abhängige wahlweise Replikonplasmid pAM34 oder dessen Derivate trugen, in Medium gezüchtet, das mit Amp und IPTG ergänzt war. Wenn nicht anders angegeben, wurden die Stammderivate, die das temperaturempfindliche wahlweise Replikonplasmid pMAK705 oder dessen Derivate trugen, bei einer Temperatur von 30°C gezüchtet.
7. Daten zur DNA-Sequenz und physikalischen Karte des E. coli Genoms wurden von Blattner et al. [Science (1997) 277: 1453–1462] beziehungsweise Rudd [Microbiol. Mol. Biol. Rev. (1998) 62: 985–1019] erhalten. Zugangsnummern in der GenBank Sequenzdatenbank (URL-Site Adresse http://www.ncbi.nlm.nib.gov/Genbank) für das gesamte E. coli Genom und für die Segmente, die nusG und rho tragen, sind NC_000913, AE000472 beziehungsweise AE000454.

Die vorliegende Erfindung ist in der Folge unter Bezugnahme auf Beispiele beschrieben, die nur der Veranschaulichung dienen und in keiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken sollen.
Beispiel 1
Vergleich von Ausbeuten von Plasmid pACYC184 von Kulturen des nusG⁺ Stamms MC41000 und der isogenen nusG Mutante GJ1504
Stamm GJ3158 ist ein Stamm dieser Erfindung, der unter der Zugangsnummer NCIMB 41132 bei NCIMB Ltd. Schottland, gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt wurde. Stamm GJ3158 trägt eine GC-zu-AT Mutation im Codon 146 des chromosomalen nusG Gens, was zum Ersatz von Glycin durch Aspartat an der entsprechenden Aminosäureposition des kodierten Proteins führt, gemeinsam mit einer argE86::Tn10 Mutation, die ungefähr zu 25% an nusG bei Transduktion des Phagen PI gekoppelt ist. Ein P1 Lysat, das auf Stamm GJ3158 hergestellt wurde, wurde zum Transduzieren von Stamm MC4100 zu Tet^s auf LB-Tet Agarplatten bei 37°C verwendet. TET^r Transduktanten, die die nusG Mutation mit geerbt hatten, wurden aufgrund der Tatsache identifiziert, dass sie SGM-resistent waren, während nusG⁺ Transduktanten SMG-sensitiv waren; dieser Test erfolgte auf Platten, die mit L-Arginin ergänzt waren (um eine auxotrope Anforderung zu erfüllen). Einer von den Tet^r SMG-resistenten Transduktanten wurde dann als Rezipient in der Transduktion mit einem P1 Lysat verwendet, das auf Stamm MC4100 hergestellt worden war, und Arg⁺ Transduktanten, die selektiert wurden, wurden dann auf Tet^s und SMG-Resistenz durchmustert. Einer der Arg⁺ Tet^s SMG-resistenten Transduktanten wurde aufbewahrt und als GJ1504 bezeichnet. Stamm GJ1504 ist daher ein isogenes nusG Mutantenderivat von Stamm MC4100.
Die Stämme MC4100 und GJ1504 wurden mit Plasmid pACYC184 transformiert, und transformierte Kolonien wurden durch Inkubation über 14 Stunden bei 30°C auf LB Agarplatten, ergänzt mit CM, selektiert. Jeweils eine Kolonie von MC4100/pACYC184 und GJ1504/pACYC184 wurde von den Transformationsplatten genommen, separat in 30 ml LB Medium, ergänzt mit CM, in einem 150 ml Erlenmeyer-Kolben inokuliert und in einem Gyrotary-Wasserbadschüttler bei 30°C inkubiert. 3 ml Aliquote von den Kulturen wurden in zweistündigen Intervallen, beginnend 6 Stunden nach der Inokulation bis 18 Stunden, entnommen. Für jedes Aliquot wurde die Extinktion bei 600 nm (A₆₀₀) gemessen und ein Plasmidpräparat wurde aus einem 2,5 ml Volumen hergestellt. Es wurde beobachtet, dass für jeden gegebenen Wert von A₆₀₀ der zwei Kulturen die Ausbeute von pACYC184 DNA von GJ1504/pACYC184 höher als jene von MC4100/pACYC184 war, und dass diese Differenz bei A₆₀₀ Werten von etwa 1,0 bis 1,2 sehr wesentlich war (etwa zehnfach oder höher). Es wurde ebenso beobachtet, dass die vorherrschende Spezies von Plasmid pACYC184 unter diesen Bedingungen in dem Derivat GJ1504/pACYC184 die Form aufwies, die in der Wissenschaft als "kovalent geschlossene, ringförmige, superhelikale Monomere" bezeichnet wird.
Der wesentliche Anstieg im Plasmidgehalt in pACYC184 Transformanten von Stamm GJ1504 korrelierte mit einem starken Absinken in der Lebensfähigkeit in den Kolonien und Kulturen nach 24 bis 36 Stunden Inkubation bei 30°C. Wir erhielten auch den Beweis, dass die Aktivität des Enzyms Chloramphenicol-Acetyl-Transferase, für das ein Gen auf dem Plasmid pACYC184 kodiert, in den Kulturen deutlich erhöht war.
Es zeigt sich, dass Transformantenderivate von GJ1504, nicht aber von MC4100, mit einem von zwei anderen Plasmiden, pUC19 opder pBluescript II-KS, eine sehr schlechte Lebensfähigkeit nach 24 Stunden Inbukation bei 30°C hatten.
Beispiel 2
Konstruktion eines temperaturempfindlichen, wahlweisen Replikonplasmids pHYD763, das ein nusG⁺ Gen trägt, und Nachweis einer Erhöhung in der Kopienzahl des Plasmids pACYC184 in GJ1504/pHYD763/ACYC184 nach einer Temperaturerhöhung von 30°C auf 43°C
Der rpoB2 (Ts) Stamm JBK246 wurde zu Kan' mit einem P1 Lysat transduziert, das auf MC4100 recA::Kan hergestellt worden war, und der erhaltene JPK264 recA::Kan Transduktant wurde als GJ1514 bezeichnet.
Chromosomale DNA, die von Stamm MC4100 isoliert wurde, wurde mit BamHI aufgeschlossen und mit BamHI-aufgeschlossenem Plasmidvektor pCL1920 DNA ligiert. Die Ligationsmischung wurde zur Transformation von GJ1514 zu Spec^r bei 42°C verwendet. Es wurde erwartet, dass derart erhaltene Transformantenkolonien ein Plasmid mit einem 22 kb BamHI Fragment hatten, das ein rpoB⁺ Gen von dem MC4100 Chromosom trug, das in Vektor pCL1920 geklont war, so dass die rpoB (Ts) Mutation in GJ1514 für das Wachstum bei 42°C komplementiert wurde. Ein Plasmid mit dem gewünschten Einschub, das derart identifiziert wurde, wurde als pHYD541 bezeichnet.
Plasmid pHYD541 wurde mit HindIII und BamHI aufgeschlossen, und ein 7,8 kb Fragment, von dem erwartet wurde, dass es das nusG⁺ Gen trägt, wurde durch Elution von einem Agarosegelteil gereinigt, gefolgt von einer Agarose-Gelelektrophorese. Das 7,8 kb Fragment wurde in die HindIII und BamHI Stellen von pCL1920 geklont, um Plasmid pHYD545 zu erzeugen. Plasmid pHYD545 wurde seinerseits mit SmaI aufgeschlossen und ein 3,8 kg Fragment, von dem erwartet wurde, dass es das nusG⁺ Gen trägt, wurde durch Elution von einem Agarosegelteil gereinigt, gefolgt von einer Agarose-Gelelektrophorese. Das 3,8 kb Fragment wurde in die SmaI Stelle von pCL1920 geklont, um Plasmid pHYD547 zu erzeugen. Von pHYD547 wurde anschließend ein 3,8 kb BamHI-SacI Fragment, das nusG⁺ Gen trägt, in die BamHI-SacI Stellen des CM^r Plasmids pMAK705 subkloniert, um Plasmid pHYD763 zu erzeugen.
Die Stämme MC4100 und GJ1504 wurden der Reihe nach mit den Plasmiden pHYD763 und pACYC184 transformiert, mit Selektionen auf Cm^r für pHYD763- beziehungsweise Tet^s für pACYC184-Transformationen. Jeweils eine einzige Transformantenkolonie von GJ1504/pHYD763/pACYC184 und MC4100/pHYD763/pACYC184 wurde in 2 ml LB inokuliert, ergänzt mit Cm und Tet, und die Kulturen wurden bis zur stationären Phase durch Inkubation über Nacht bei 30°C gezüchtet. Ein 100 Mikroliter Volumen einer 1:100 Verdünnung, das aus jeder der Kulturen hergestellt wurde, wurde dann in 10 ml LB Medium, ergänzt mit Tet, in einem 150 ml Erlenmeyer-Kolben inokuliert. Beide Kolben wurden unter Schütteln bei 43°C in einem Gyrotary-Wasserbadschüttler inkubiert, bis die A₆₀₀-Werte der jeweiligen Kulturen etwa 1,3 erreichten, wonach Plasmidpräparate aus einem 2,5 ml Volumen der Kultur, das jedem Kolben entnommen wurde, hergestellt wurden. Es wurde beobachtet, dass die Ausbeute von Plasmid pACYC184 von der Kultur des GJ1504 Derivats deutlich höher als jene von der Kultur des MC4100 Derivats war. Zum Zeitpunkt der Ernte wurde ebenso beobachtet, dass es eine deutliche Abnahme in der Lebensfähigkeit der von GJ1504 abgeleiteten Kultur gab, nicht aber der von MC4100 abgeleiteten Kultur.
Beispiel 3
Konstruktion des IPTG-abhängigen wahlweisen Replikonplasmids pHYD751, das das nusG⁺ Gen trägt, und Nachweis der Erhöhung in der Kopienzahl von Plasmid pUC4K in GJ1504/pHYD751/pUC4K nach der IPTG Entnahme
Beginnend mit Plasmid pHYD547 wurde ein 2,1 kb EcoRI-SalI Fragment, das das nusG⁺ Gen trägt, in die EcoRI-SalI Stellen des IPTG-abhängigen Amp^r Plasmidvektors pAM34 subkloniert, um Plasmid pHYD751 zu erzeugen.
Die Stämme MC4100 und GJ1504 wurden der Reihe nach mit den Plasmiden pHYD751 und pUC4K transformiert, mit Selektionen auf Amp^r (in Gegenwart von IPTG) für pHYD751- beziehungsweise Kan^r für pUC4K-Transformationen. Jeweils eine einzige Transformantenkolonie von GJ1504/pHYD751/pUC4K und MC4100/pHYD751/pUC4K wurde in 2 ml LB, ergänzt mit Amp, Kan und IPTG, inokuliert und die Kulturen wurden bis zur stationären Phase durch Inkubation über Nacht bei 30°C gezüchtet. Die Zellen in jeder Kultur wurden durch Zentrifugation bei 4000 U/min über 10 Minuten in einer Tischzentrifuge pelletiert, und dann in 2 ml frischem LB resuspendiert. Ein 10 Mikroliter Volumen jeder Suspension wurde dann in 10 ml LB Medium, ergänzt mit Kan, in einem 150 ml Erlenmeyer-Kolben inokuliert. Beide Kolben wurden unter Schütteln bei 30°C in einem Gyrotary-Wasserbadschüttler inkubiert, bis die A₆₀₀-Werte der jeweiligen Kulturen etwa 1,3 erreichten, wonach Plasmidpräparate aus einem 2,5 ml Volumen der Kultur, das jedem Kolben entnommen wurde, hergestellt wurden. Es wurde beobachtet, dass die Ausbeute von Plasmid pUC4K von der Kultur des GJ1504 Derivats deutlich höher als jene von der Kultur des MC4100 Derivats war. Zum Zeitpunkt der Ernte wurde ebenso beobachtet, dass es eine deutliche Abnahme in der Lebensfähigkeit der von GJ1504 abgeleiteten Kultur gab, nicht aber der von MC4100 abgeleiteten Kultur.
Beispiel 4
Vergleich der Ausbeuten von Plasmid pACYC184 von Kulturen des isogenen rho⁺ Stamms GJ862 und der rho-4 Mutante GJ863
Die isogenen rho Stämme GJ862 und GJ863 wurden in zwei Schritten einer P1 Transduktion wie folgt konstruiert. Im ersten Schritt wurde ein P1 Lysat, das auf Stamm CAG18431 hergestellt worden war, zur Transduktion von MC4100 zu Tet^rIIv verwendet. Ein solcher Transduktant wurde als Rezipient in dem zweiten Schritt für eine Infektion mit einem P1 Lysat, hergestellt auf dem rho-4 mutanten Stamm CGSC5072, verwendet und IIv⁺ Transduktanten wurden selektiert (von welchen alle auch Tet^s geworden waren). Ungefähr 20% der IIv⁺ Tet^s Transduktanten verhielten sich wie MC4100, indem sie SMG-sensitiv waren, während die übrigen 80% SMG-resistent geworden waren und vermutlich das verknüpfte rho-4 Allel geerbt hatten. Ein SMG-sensitiver und ein SMG-resistenter Transduktant von der zweiten Kreuzung wurden in der weiteren Arbeit verwendet und als GJ862 beziehungsweise GJ1863 bezeichnet. Die Bestimmung der DNA Sequenz des chromosomalen rho Gens in GJ183 zeigte, dass die rho-4 Mutation eine GC-zu-TA-Mutation in Codon 243 ist, die zum Ersatz von Alanin durch Glutamat an der entsprechenden Aminosäureposition des kodierten Proteins führt.
Die Stämme GJ862 und GJ863 wurden mit Plasmid pACYC184 transformiert und Transformantenkolonien wurden durch Inkubation über 14 Stunden bei 30°C auf LB Agarplatten, ergänzt mit Cm, selektiert. Jeweils eine Kolonie von GJ862/pACYC184 und GJ863/pACYC184 wurde von den Transformationsplatten genommen, separat in 30 ml LB Medium, ergänzt mit CM, in einem 150 ml Erlenmeyer-Kolben inokuliert und in einem Gyrotary-Wasserbadschüttler bei 30°C inkubiert. 3 ml Aliquote von den Kulturen wurden in zweistündigen Intervallen, beginnend 6 Stunden nach der Inokulation bis 18 Stunden, entnommen. Für jedes Aliquot wurde die (A₆₀₀) gemessen und ein Plasmidpräparat wurde aus einem 2,5 ml Volumen hergestellt. Es wurde beobachtet, dass für jeden gegebenen Wert von A₆₀₀ der zwei Kulturen die Ausbeute von pACYC184 DNA von GJ863/pACYC184 höher als jene von GJ862/pACYC184 war, und dass diese Differenz bei A₆₀₀ Werten von etwa 1,0 bis 1,2 sehr wesentlich war (etwa zehnfach oder höher).
Der wesentliche Anstieg im Plasmidgehalt in pACYC184 Transformanten von Stamm GJ863 korrelierte auch mit einem starken Absinken in der Lebensfähigkeit in den Kolonien und Kulturen nach 24 bis 36 Stunden Inkubation bei 30°C.
Es zeigte sich auch, dass Transformantenderivate von GJ863, nicht aber von GJ862, mit einem von zwei anderen Plasmiden, pUC19 oder pBluescript II-KS, eine sehr schlechte Lebensfähigkeit nach 24 Stunden Inbukation bei 30°C hatten.
Beispiel 5
Verwendung des temperaturempfindlichen wahlweisen Replikonplasmids pPMrhoCam, das das nusG⁺ Gen trägt, und Nachweis der Erhöhung in der Kopienzahl von Plasmid pACYC184 in GJ863/pPMrhoCam/pACYC184 nach einer Temperaturerhöhung von 30°C auf 43°C
Die Stämme MC4100 und GJ863 wurden der Reihe nach mit den Plasmiden pPMrhoCam (ein temperaturempfindliches wahlweises Replikon, das das rho⁺ Gen trägt) und pACYC184 transformiert, mit Selektionen auf Cm^r für pPMrhoCam- beziehungsweise Tet^s für pACYC184-Transformationen. Jeweils eine einzige Transformantenkolonie von GJ863/pPMrhoCam/pACYC184 und MC4100/pPMrhoCam/pACYC184 wurde in 2 ml LB, ergänzt mit Cm und Tet, inokuliert und die Kulturen wurden bis zur stationären Phase durch Inkubation über Nacht bei 30°C gezüchtet. Ein 100 Mikroliter Volumen einer 1:100 Verdünnung, das aus jeder der Kulturen hergestellt wurde, wurde dann in 10 ml LB Medium, ergänzt mit Tet, in einem 150 ml Erlenmeyer-Kolben inokuliert. Beide Kolben wurden unter Schütteln bei 43°C in einem Gyrotary-Wasserbadschüttler inkubiert, bis die A₆₀₀-Werte der jeweiligen Kulturen etwa 1,3 erreichten, wonach Plasmidpräparate aus einem 2,5 ml Volumen der Kultur, das jedem Kolben entnommen wurde, hergestellt wurden. Es wurde beobachtet, dass die Ausbeute von Plasmid pACYC184 von der Kultur des GJ863 Derivats deutlich höher als jene von der Kultur des MC4100 Derivats war. Zum Zeitpunkt der Ernte wurde ebenso beobachtet, dass es eine deutliche Abnahme in der Lebensfähigkeit der von GJ863 abgeleiteten Kultur gab, nicht aber der von MC4100 abgeleiteten Kultur.
Beispiel 6
Konstruktion eines IPTG-abhängigen wahlweisen Replikonplasmids pHYD1201, das das rho⁺ Gen trägt, und Nachweis der Erhöhung in der Kopienzahl von Plasmid pUC4K in GJ863/pHYD1201/pUC4K nach der IPTG Entnahme.
Das IPTG-abhängige, wahlweise Replikonplasmid pHYD1201 wurde in drei Stufen wie folgt konstruiert. Beginnend mit DNA von Lambda Phage Klon 556, das von der Lambda Phage Bank des E. coli Genoms bestellt wurde, wie von Kohara et al. [Cell (1987) 50: 495–508] beschrieben, wurde ein 6–7 kb HindIII Fragment, das das rho⁺ Gen trägt, in die HindIII Stelle von Plasmidvektor pCL1921 subkloniert und ein derart erhaltenes Plasmid wurde als pHYD552 bezeichnet. Im zweiten Schritt wurde ein 3,3 kb NsiI Fragment von pHYD552, das das rho⁺ Gen trägt, in die PstI Stelle des Plasmidvektors pCL1920 geklont, um die Plasmide pHYD567 und pHYD568 zu erhalten (die die zwei Orientierungen des Einschubs in Bezug auf den Vektor darstellen). Die in pHYD568 eingesetzte DNA wird (unter anderem) von einer SalI Stelle an einer Seite (proximal zu dem rho⁺ Promotor) und einer HindII Stelle an der anderen flankiert. Im dritten Schritt wurde das HindIII-SalI Fragment von pHYD567 (das rho⁺ trägt) in die HindIII-SalI Stellen von Plasmidvektor pAM34 geklont, um Plasmid pHYD1201 zu erzeugen. Amb^r Transformanten im dritten Schritt wurden auf Platten, die mit IPTG ergänzt waren, selektiert.
Die Stämme GJ862(rho⁺) und GJ863 (rho-4) wurden der Reihe nach mit den Plasmiden pHYD1201 und pUC4K transformiert, mit Selektionen auf Amp^r (in Gegenwart von IPTG) für pHYD1201- beziehungsweise Kan^r für pUC4K-Transformationen. Jeweils eine einzige Transformantenkolonie von GJ862/pHYD1201/pUC4K und GJ863/pHYD1201/pUC4K wurde in 2 ml LB, ergänzt mit Amp, Kan und IPTG, inokuliert und die Kulturen wurden bis zur stationären Phase durch Inkubation über Nacht bei 30°C gezüchtet. Die Zellen in jeder Kultur wurden durch Zentrifugation bei 4000 U/min über 10 Minuten in einer Tischzentrifuge pelletiert, und dann in 2 ml frischen LB resuspendiert. Ein 100 Mikroliter Volumen jeder Suspension wurde dann in 10 ml LB Medium, ergänzt mit Kan, in einem 150 ml Erlenmeyer-Kolben inokuliert. Beide Kolben wurden unter Schütteln bei 30°C in einem Gyrotary-Wasserbadschüttler inkubiert, bis die A₆₀₀-Werte der jeweiligen Kulturen etwa 1,3 erreichten, wonach Plasmidpräparate aus einem 2,5 ml Volumen der Kultur, das jedem Kolben entnommen wurde, hergestellt wurden. Es wurde beobachtet, dass die Ausbeute von Plasmid pUC4K von der Kultur des GJ863 Derivats deutlich höher als jene von der Kultur des GJ862 Derivats war. Zum Zeitpunkt der Ernte wurde ebenso beobachtet, dass es eine deutliche Abnahme in der Lebensfähigkeit der von GJ863 abgeleiteten Kultur gab, nicht aber der von GJ862 abgeleiteten Kultur.
Beispiel 7
Vergleich von Ausbeuten der Plasmide pACYC184, pBR329 und pUC19 von Kulturen der Derivate des dnaC⁺ Stamms GJ3141 und der isogenen dnaC Mutante GJ3140.
Stamm GJ3158 ist ein Stamm dieser Erfindung und wurde unter der Zugangsnummer NCIMB 41132 bei NCIMB Ltd, Schottland, gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt. Stamm GJ3158 trägt eine GC-zu-AT Mutation im Codon 83 des chromosomalen dnaC Gens, was zum Ersatz von Alanin durch Threonin an der entsprechenden Aminosäureposition des kodierten Proteins führt, gemeinsam mit einem zjj-901::Tn10dKan Einschubs, der ungefähr zu 88% an dnaC bei Transduktion des Phagen PI gekoppelt ist. Ein P1 Lysat, das auf Stamm GJ3158 hergestellt wurde, wurde zum Transduzieren des Stamms MC4100 an Kan^r auf LB Kan Agarplatten bei 37°C verwendet. Kan^r Transduktanten, die die dnaC Mutation mit geerbt hatten, wurden aufgrund der Tatsache identifiziert, dass sie, wenn sie anschließend bei 30°C mit Plasmid pUC19 zu Amp^r transformiert wurden, die Transformantenderivate auch bei 42°C wachsen konnten, während jene Kan^r Transduktanten die das parenterale dnaC⁺ Allel behielten, einen pUC19-Amp^r Transformanten lieferten, der bei 42°C nicht wachsen konnte. Jeweils einer von den derart identifizierten Kan^r dnaC⁺ und Kan^r dnaC Transduktanten wurde als GJ3141 beziehungsweise GJ3140 bezeichnet.
Die Stämme GJ3141 und GJ3140 wurden jeweils mit Plasmiden pACYC184, pBR329 oder pUC19 mit Selektionen bei 30°C auf CM^r, Amp^r beziehungsweise Amp^r Kolonien transformiert. Die Transformantenderivate wurden bei 30°C in LB, ergänzt mit den geeigneten Antibiotika, auf einen A₆₀₀-Wert von etwa 1,6 gezüchtet, und Plasmidpräparte wurden aus 2,5 ml Volumina jeder Kultur hergestellt. Es wurde beobachtet, dass die Ausbeuten von jedem der drei Plasmide bei den GJ3140 Derivaten deutlich geringer als jene von den entsprechenden GJ3141 Derivaten waren.
Zwei Beweislinien wurden erhalten, um zu zeigen, dass die dnaC Mutation unabhängig von den nusG und rho Mutationen bei der Änderung des Plasmidgehalts in bakteriellen Wirtszellen wirkt, so dass der Fachmann verschiedene wechselseitige Kombinationen verwenden kann (von nusG oder rho einerseits und dnaC andererseits), um die Plasmidausbeuten von den Zellen zu modulieren: (i) Wenn die dnaC Mutation von Stamm GJ3158 entweder in den nusG Stamm GJ1504 oder den rho Stamm GJ863 (durch Phage P1-vermittelte Transduktion) eingeführt wurde und Plasmid pACYC184 anschließend in die daraus resultierenden Derivate transformiert wurde, war die Plasmidausbeute von den Transformanten höher als jene von GJ3140/pACYC184, aber geringer als jene von sowohl GJ1504/pACYC184 wie auch GJ863/pACYC184. (ii) Während pACYC184 Transformanten von GJ1504 und GJ863 eine starke Abnahme in der Lebensfähigkeit nach 24 bis 26 Stunden Inkubation bei 30°C aufwiesen, zeigten ähnliche Transformanten der dnaC Mutantenderivate von GJ1504 und GJ863 keinen Verlust an Lebensfähigkeit. Ziemlich ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn Plasmid pUC19 Transformanten der verschiedenen Stämme getestet wurden.

Claims

Verfahren zum Erzielen eines höheren Plasmidgehalts in einem Bakterium, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) Einführen eines Plasmids in das Bakterium, b) Einführen einer Mutation in das chromosomale Gen nusG des Bakteriums, c) Beibehalten einer funktionellen Kopie des chromosomalen Gens auf einem wahlweisen Replikon in dem Bakterium, d) Kultivierung des Bakteriums unter Bedingungen, welche die intrazelluläre Replikation und die Beibehaltung des wahlweisen Replikons gestatten, e) Überführen des Bakteriums unter einschränkender Bedingung, welche die intrazelluläre Replikation des wahlweisen Replikons nicht länger gestattet, f) Schätzen des Plasmidgehalts im Bakterium sowohl unter nicht eingeschränkten als auch unter eingeschränkten Bedingungen und g) Berechnen der Steigerung des Plasmidgehalts im Bakterium unter eingeschränkten Bedingungen im Vergleich zu jenem unter uneingeschränkten Bedingungen, wobei das Plasmid ausgewählt wird aus einer Gruppe, die von ColE1 abgeleitete Plasmide und von p15A abgeleitete Plasmide umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das nusG Gen eine GC-zu-AT Mutation im Codon 146 zeigt, was zum Ersatz von Glycin durch Aspartat bei der entsprechenden Aminosäure führt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Bakterium aus der Familie der Enterobacteriaceae stammt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Bakterium E. coli ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die von ColE1 abgeleiteten Plasmide Mitglieder der Inkompatibilitätsgruppe sind, welche die Plasmide pBR322, pBR329, die pUC Plasmidreihe, die pBluescript Plasmidreihe und deren Derivate umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die von p15A abgeleiteten Plasmide Mitglieder der p15A Inkompatibilitätsgruppe sind, welche die Plasmide pACYC184 und pACYC177 sowie deren Derivate umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Steigerung des Plasmidgehalts etwa zehnfach ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das wahlweise Replikon ein nicht-mutiertes nusG Gen zeigt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Verfahren zum Erhalt von Zielgenen in erwünschten Mengen beiträgt.
E. coli Stamm des Genotyps MC4100 nusG argE86::Tn10 dnaC zjj901::Tn10dKan mit der Zugangsnummer NCIMB 41132, hinterlegt bei NCIMB Limited, Schottland, UK.
Stamm nach Anspruch 10, wobei der Stamm eine GC-zu-AT Mutation im Codon 146 des chromosomalen nusG Gens trägt, was zum Ersatz von Glycin durch Aspartat an der entsprechenden Aminosäureposition des kodierten Proteins führt, gemeinsam mit einer argE86::Tn10 Mutation, die ungefähr zu 25% an nusG bei Transduktion des Phagen PI gekoppelt ist.