ES2347875T3

ES2347875T3 - Procedimiento para la produccion de dipeptidos.

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Publication number: ES2347875T3
Application number: ES05013734T
Authority: ES
Inventors: Shin-ichi c/o Techn. Res. Lab. Hashimoto; Kazuhiko c/o BioFrontier Laboratories Tabata
Original assignee: Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Current assignee: Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Priority date: 2004-06-25
Filing date: 2005-06-24
Publication date: 2010-11-22
Anticipated expiration: 2025-06-24
Also published as: CN103642882A; JP4796495B2; HK1083345A1; CN1973042A; CN1973042B; EP1627884B9; US7939302B2; JPWO2006001379A1; DE602005022387D1; EP1627884B1; US20090269806A1; WO2006001379A1; ATE474847T1; US7514243B2; US20050287626A1; EP1627884A1

Abstract

Un procedimiento para producir un dipéptido, que comprende: cultivar en un medio un microorganismo que tiene la capacidad de producir una proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos donde la proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos es una proteína seleccionada del grupo que consiste en los siguientes apartados [1] a [11]: [1] una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 8; [2] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos donde uno o más residuos de aminoácidos son suprimidos, sustituidos o añadidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 8 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos; [3] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 65% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 8 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos; [4] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 80% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 17 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos; ES 2 347 875 T3 [5] una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 37 o 38; null - 359 - [6] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos donde uno o más residuos de aminoácidos son suprimidos, sustituidos o añadidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 37 o 38 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos; [7] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 65% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 37 o 38 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos; [8] una proteína que no tiene actividad péptido sintetasa ribosomal (referida en adelante como NRPS); [9] una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 43; [10] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos donde uno o más residuos de aminoácidos son suprimidos, sustituidos o añadidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 43 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos; y [11] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 65% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 43 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos. ES 2 347 875 T3 y donde dicho microorganismo ha sido modificado genéticamente con el fin de que tenga la capacidad de producir al menos una de dichas una o más clases de aminoácidos; permitir que el dipéptido se forme y se acumule en el medio; y recuperar el dipéptido del null medio. - 360 -

Description

Antecedentes de la Invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir un dipéptido que comprende cultivar en un 5 medio un microorganismo que tiene la capacidad de producir una proteína como se define en las reivindicaciones que tiene una actividad formadora de una

o más clases de aminoácidos y donde dicho microorganismo ha sido modificado genéticamente para que tenga la

10 capacidad de producir al menos una de dichas una o más clases de aminoácidos, permitir que el dipéptido se forme y se acumule en el medio, y recuperar el dipéptido del medio. En la actualidad, muchos de los aminoácidos son

15 producidos mediante el denominado método de fermentación (Hiroshi Soda, et al., Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center (1986) y Biotechnology 2a ed., Vol. 6, Products of Primary Metabolism, VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim (1996)). El método de fermentación

20 utilizado en la presente memoria hace referencia a un método en el que se cultiva un microorganismo en un medio que comprende sustancias poco costosas tales como glucosa, ácido acético, metanol, amoníaco, sulfato de amonio y aguas de infusión de maíz para obtener un

25 aminoácido deseado utilizando la actividad metabólica del microorganismo. El método de fermentación es excelente como método para producir aminoácidos a partir de materiales poco costosos con ligeras cargas medioambientales.

30 En cuanto al método de síntesis peptídica a gran escala, se conocen métodos de síntesis química (método en fase líquida y método en fase sólida), métodos de síntesis enzimática y métodos de síntesis biológica que

35 utilizan técnicas de ADN recombinante. Actualmente, los métodos de síntesis enzimática y los métodos de síntesis biológica se emplean para la síntesis de péptidos de cadena larga mayores de 50 residuos, y los métodos de síntesis química y los métodos de síntesis enzimática se emplean principalmente para la síntesis de dipéptidos.

En la síntesis de dipéptidos mediante métodos de síntesis química, son necesarias operaciones tales como la introducción y eliminación de grupos protectores para grupos funcionales, y también se forman racematos. Los métodos de síntesis química son considerados de este modo poco ventajosos con respecto al coste y la eficacia. Son poco favorables también desde el punto de vista de la higiene medioambiental debido al uso de grandes cantidades de disolventes orgánicos y similares.

En cuanto a la síntesis de dipéptidos mediante métodos enzimáticos, se conocen los siguientes métodos: un método que utiliza la reacción inversa de la proteasa

(J. Biol. Chem., 119, 707-720 (1937)); métodos que utilizan aminoacil-ARN-t-transferasa termoestable (Solicitud de Patente Japonesa no Examinada, Publicada Núm. 146539/83, Solicitud de Patente Japonesa no Examinada, Publicada Núm. 209991/83, Solicitud de Patente Japonesa no Examinada, Publicada Núm. 209992/83 Solicitud de Patente Japonesa no Examinada, Publicada Núm. 106298/84); un método que utiliza la reacción inversa de la prolina-iminopeptidasa (documento WO 03/010307 folleto); y métodos que utilizan péptido sintetasa no ribosómica (referida en adelante como NRPS por sus siglas en inglés) (Chem. Biol., 7, 373-384 (2000), FEBS Lett., 498, 42-45 (2001), Patente de los Estados Unidos Núm.

5.795.738 y Patente de los Estados Unidos Núm. 5.652.116, documento EP 1 096 011).

Sin embargo, el método que utiliza la reacción inversa de la proteasa requiere la introducción y eliminación de grupos protectores para grupos funcionales de aminoácidos utilizados como sustratos, lo que ocasiona dificultades al aumentar la eficacia de la reacción de formación de péptidos y evitar la reacción peptidolítica. Los métodos que utilizan la aminoacil-ARN-t sintetasa termoestable tienen el defecto de que la expresión de la enzima y la prevención de reacciones secundarias que forman subproductos distintos de los productos deseados resultan difíciles. El método que utiliza prolinaiminopeptidasa requiere la amidación de uno de los aminoácidos utilizados como sustratos. Los métodos que utilizan NRPS son poco eficaces ya que es necesario el suministro de la coenzima 4'-fosfopanteteína.

Además de los defectos anteriores, estos métodos son poco ventajosos respecto a los costes de producción ya que todos ellos utilizan aminoácidos o sus derivados como sustratos.

Por otra parte, existe un grupo de péptido sintetasas que tienen un peso molecular de enzima inferior al de los NRPS y no requieren la coenzima 4'fosfopanteteína: por ejemplo, γ-glutamilcisteína sintetasa, glutatión sintetasa, D=alanil-D-alanina (D-Ala-D-Ala) ligasa, y poli-γ-glutamato sintetasa. La mayoría de las enzimas utilizan D-aminoácidos como sustratos o catalizan la formación de enlaces peptídicos en el grupo γ-carboxilo. Debido a tales propiedades, no pueden ser utilizadas para la síntesis de dipéptidos por medio de la formación de enlaces peptídicos en el grupo α-carboxilo del L-aminoácido.

Se ha informado de que una proteína que no tiene similitud con NRPS (producto del gen albC) es responsable de la síntesis de la estructura de la ciclo(Lfenilalanil-L-leucina) en Streptomyces noursei ATCC 11455 conocida como cepa productora del antibiótico albonoursina y de que la albonoursina fue detectada cuando la ciclo-dipéptido oxidasa se hizo actuar sobre el caldo de cultivo de Escherichia coli y streptomyces lividans en las que se había introducido el gen albC (Chemistry & Biol., 9, 1355-1364 (2002)). No obstante, no existe ningún informe de que el producto del gen albC forme un dipéptido de cadena lineal.

El único ejemplo conocido de una enzima susceptible de síntesis de dipéptidos por medio de la actividad para formar un enlace peptídico en el grupo α-carboxilo del Laminoácido es la bacilisina (antibiótico dipeptídico derivado de un microorganismo perteneciente al género Bacillus) sintetasa. Se sabe que la bacilisina sintetasa tiene la actividad sintetizadora de bacilisina [L-alanilL-anticapsina (L-Ala-L-anticapsina)] y L-alanil-L-alanina (L-Ala-L-Ala), pero no hay información a cerca de su actividad para sintetizar otros dipéptidos (J. Ind. Microbiol., 2, 201-208 (1987) y Enzimas. Microbial. Technol., 29, 400-406 (2001)).

En cuanto a los genes de la bacilisina biosintetasa de Bacillus subtilis 168 cuya información del genoma completo ha sido aclarada (Nature, 390, 249-256 (1997)), se sabe que la productividad de la bacilisina aumenta mediante la amplificación de operones de la bacilisina que contienen ORF ywfA-F (documento WO00/03009 folleto). No obstante, no se sabe si un ORF que codifica una proteína que tiene actividad ligadora de dos o más aminoácidos por medio de enlaces peptídicos está contenido en estos ORF, y si está contenido, qué ORF codifica la proteína. Los microorganismos en los cuales las actividades de una o más clases de peptidasas y una o más clases de proteínas que tienen actividad transportadora de péptidos se han reducido o perdido y que tienen la capacidad de producir un dipéptido han sido descritos en el documento EP 1 529 837.

Esto es, hasta ahora no se conoce ningún método para producir un dipéptido que conste de una o más clases de aminoácidos mediante fermentación.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para producir un dipéptido que comprende cultivar en un medio un microorganismo que tiene la capacidad para producir una proteína como se define en las reivindicaciones que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos y donde dicho microorganismo ha sido modificado genéticamente con el fin de que tenga la capacidad de producir al menos una de dichas una o más clases de aminoácidos, permita la formación del dipéptido y se acumule en el medio, y recuperar el dipéptido del medio.

Compendio de la Invención

La presente invención se refiere a los siguientes apartados (1) a (14).

1. (1) Un procedimiento para producir un dipéptido, que comprende: cultivar en un medio un microorganismo que tiene la capacidad de producir una proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos donde la proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos es una proteína seleccionada del grupo que consiste en los siguientes apartados [1] a [11]:

[1] una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 8;

[2] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos donde uno o más residuos de aminoácidos son suprimidos, sustituidos o añadidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 8 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[3] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 65% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 8 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[4] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 80% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 17 y que tiene actividad formadora del

dipéptido: a partir de una o más clases de

aminoácidos;

[5]: una proteína que tiene la secuencia de

aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 37 o 38;

[6] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos donde uno o más residuos de aminoácidos son suprimidos, sustituidos o añadidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 37 o 38 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[7] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 65% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 37 o 38 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[8] una proteína que tiene actividad péptido sintetasa no ribosómica (en adelante referida como NRPS);

[9] una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 43;

[10] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos donde uno o más residuos de aminoácidos son suprimidos, sustituidos o añadidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 43 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos; y

[11] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 65% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 43 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos.

y donde dicho microorganismo ha sido modificado genéticamente con el fin de que tenga la capacidad de producir al menos una de dichas una o más clases de aminoácidos; permitir que se forme el dipéptido y se acumule en el medio; y recuperar el dipéptido del medio.

Publicación de Patente Núm. 4: Solicitud de Patente Japonesa No examinada Publicada Núm. 106298/84 Publicación de Patente Núm. 5: WO 03/010307 folleto Publicación de Patente Núm. 6: Patente de los Estados Unidos Núm. 5.795.738 Publicación de Patente Núm. 7: Patente de los Estados Unidos Núm. 5.652.116

Publicación de Patente Núm. 8: WO 00/03009 folleto

Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para producir un dipéptido que comprende cultivar en un medio un microorganismo que tiene la capacidad de producir una proteína como se define en las reivindicaciones que tienen actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos y donde dicho microorganismo ha sido modificado genéticamente con el fin de que tenga la capacidad de producir al menos una de dichas una o más clases de aminoácidos, permitir que se forme el dipéptido y se acumule en el medio, y recuperar el dipéptido del medio.

Compendio de la Invención

La presente invención se refiere a los siguientes apartados (1) a (14).

[3] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 65%

o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 8 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[4] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 80% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 17 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[5] una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 37 o 38;

[7] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 65%

o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 37 o 38 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[8] una proteína que no tiene actividad péptido sintetasa ribosomal (referida en adelante como NRPS);

[11] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 65%

o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 43 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos,

2. (2) El procedimiento de acuerdo con el apartado (1) anterior, donde la proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos es una proteína codificada por ADN seleccionado del grupo que consiste en los apartados

[1] a [8] siguientes:

[1] ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 9 a 16 y 36;

[2] ADN que hibrida con el ADN que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 9 a 16 y 36 en condiciones restrictivas y que codifica una proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[3] ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una homología del 80% o más con la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 18 y que codifica una proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[4] ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 39 o 40;

[5] ADN que hibrida con el ADN que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 39 o 40 en condiciones restrictivas y que codifica una proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[6] ADN que codifica una proteína que tiene actividad NRPS;

[7] ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 44; y

[8] ADN que hibrida con ADN que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 44 en condiciones restrictivas y que codifica una proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos.

3. (3) El procedimiento de acuerdo con el apartado (1) anterior, donde el microorganismo que tiene la capacidad de producir una proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos es un microorganismo que porta un ADN recombinante que comprende el ADN seleccionado del grupo que consiste en los apartados

[1] a [8] del apartado (2) anterior.

4. (4) El procedimiento de acuerdo con cualquiera de los apartados (1) a (3) anteriores, donde la capacidad de producir un aminoácido se adquiere mediante el método seleccionado del grupo que consiste en los apartados [1] a [5] siguientes:

[1] un método en el que se reduce o elimina al menos una regulación de la biosíntesis del aminoácido;

[2] un método en el que se intensifica la expresión de al menos una de las enzimas implicadas en la biosíntesis del aminoácido;

[3] un método en el que se incrementa el número de copias de al menos uno de los genes de enzimas implicadas en la biosíntesis del aminoácido;

[4] un método en el que se debilita o se bloquea al menos una de las rutas metabólicas que se ramifican a partir de la ruta biosintética del aminoácido a metabolitos distintos del aminoácido; y

[5] un método en el que se selecciona una cepa celular que tiene una resistencia superior a un análogo del aminoácido en comparación con una cepa de tipo salvaje.

5.: (5) El procedimiento de acuerdo con cualquiera de los apartados (1) a (4) anteriores, donde el microorganismo es un microorganismo perteneciente al género Escherichia, Corynebacterium, Bacillus, Serratia, Pseudomonas o Streptomyces.

6.: (6) El procedimiento de acuerdo con el apartado (5) anterior, donde el microorganismo perteneciente al género Escherichia, Corynebacterium, Bacillus, Serratia, Pseudomonas o Streptomyces es Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium lactofermentum, Corynebacterium flavum, Corynebacterium efficiens,

Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Serratia marcescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Streptomyces coelicolor o Streptomyces lividans.

7.: (7) El procedimiento de acuerdo con cualquiera de los apartados (1) a (4) anteriores, donde el microorganismo es un microorganismo en el cual se reducen o se pierden las actividades de una o más clases de peptidasas y una o más clases de proteínas que tienen actividad de penetración/transporte de péptidos (referida en adelante también como proteínas de penetración/transporte de péptidos).

8.: (8) El procedimiento de acuerdo con cualquiera de los apartados (1) a (4) anteriores, donde el microorganismo es un microorganismo en el cual se reducen o se pierden las actividades de tres o más clases de peptidasas.

9.: (9) El procedimiento de acuerdo con los apartados

(7) o (9), donde la peptidasa es una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 45 a 48, o una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de 80% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 45 a 48 y que tiene actividad peptidasa.

10. (10) El procedimiento de acuerdo con los apartados

(7) o (9) anteriores, donde la proteína de penetración/transporte de péptidos es una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 49 a 53, o una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de 80% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 49 a 53 y que tiene actividad de penetración/transporte de péptidos.

11.: (11) El procedimiento de acuerdo con cualquiera de los apartados (7) a (10), donde el microorganismo es un microorganismo perteneciente al género Escherichia, Bacillus o Corynebacterium.

12.: (12) El procedimiento de acuerdo con el apartado

(11) anterior, donde el microorganismo perteneciente al género Escherichia, Bacillus o Corynebacterium es Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium lactofermentum, Corynebacterium flavum, Corynebacterium efficiens, Bacillus subtilis o Bacillus megaterium.

13.: (13) El procedimiento de acuerdo con cualquiera de los apartados (1) a (12) anteriores, donde el aminoácido es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L-alanina, L-glutamina, ácido Lglutámico, glicina, L-valina, L-leucina, Lisoleucina, L-prolina, L-fenilalanina, L-triptófano, L-metionina, L-serina, L-treonina, L-cisteína, Lasparagina, L-tirosina, L-lisina, L-arginina, Lhistidina, ácido L-aspártico, ácido L-αaminobutírico, L-4-hidroxiprolina, L-3hidroxiprolina, L-ornitina y L-citrulina.

14.: (14) El procedimiento de acuerdo con cualquiera de los apartados (1) a (13) anteriores, donde el dipéptido es un dipéptido representado por la fórmula (I):

R1 -R2 (I)

(donde R1 yR2, que pueden ser iguales o diferentes, representan un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L-alanina, L-glutamina, ácido Lglutámico, glicina, L-valina, L-leucina, Lisoleucina, L-prolina, L-fenilalanina, L-triptófano, L-metionina, L-serina, L-treonina, L-cisteína, Lasparagina, L-tirosina, L-lisina, L-arginina, Lhistidina, ácido L-aspártico, ácido L-αaminobutírico, L-4-hidroxiprolina, L-3hidroxiprolina, L-ornitina y L-citrulina.

La presente invención proporciona un procedimiento para producir un dipéptido que comprende cultivar en un medio un microorganismo que tiene la capacidad de producir una proteína como se define en las reivindicaciones que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos y donde dicho microorganismo ha sido modificado genéticamente con el fin de que tenga la capacidad de producir al menos una de dichas una o más clases de aminoácidos, permitir que se forme el dipéptido y se acumule en el medio, y recuperar el dipéptido del medio.

Breve Descripción de los Dibujos

La Fig. 1 muestra las etapas para construir el plásmido pPE43. La Fig. 2 muestra las etapas para construir el plásmido pQE60ywfE. La Fig. 3 muestra las etapas para construir pAL-nou y pAL-alb, que son vectores plasmídicos para la expresión de proteínas que tienen actividad sintetizadora de un dipéptido de cadena lineal. La Fig. 4 muestra las etapas para construir el vector pPE56 potenciado con la expresión del gen ywfE. La Fig. 5 muestra las etapas para construir el vector de expresión pPE86 con el gen ywfE y el gen ald. La Fig. 6 muestra las etapas para construir el

vector de expresión pPHEA2 con el gen pheA resistente a la retro-alimentación, y el gen pheA

resistente a la retro-alimentación plasmídico pPHEAF2 de expresión resistente a la retro-alimentación.: y del el gen vector aroF

Explicación de los Símbolos

ywfE: gen ywfE derivado de Bacillus subtilis 168 Ptrp: gen promotor de Triptófano PT5: promotor T5 Ampr: gen de resistencia a Ampicilina lacIq gen represor de Lactosa albC: gen albC o gen análogo a albC ald: gen ald pheAfbr: gen pheA resistente a la retro-alimentación aroFfbr: gen aroF resistente a la retro-alimentación

Descripción Detallada de la Invención

La proteína que tiene la actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos utilizados en el procedimiento de producción de la presente invención es una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido donde los mismos o diferentes aminoácidos se unen por medio de un enlace peptídico de una o más clases de aminoácidos, como se define más abajo:

[2] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos donde uno o más residuos de aminoácidos son suprimidos, sustituidos o añadidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 8 y que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[3] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de 65% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 8 y que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[4] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de 80% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 17 y que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[6] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos donde uno o más residuos de aminoácidos son suprimidos, sustituidos o añadidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 37 o 38 y que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[7] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de 65% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 37 o 38 y que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[8] una proteína que tiene actividad NRPS;

[10] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos donde uno o más residuos de aminoácidos son suprimidos, sustituidos o añadidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 43 y que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos; y

[11] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de 65% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID

NO:: 43 y que tiene actividad formadora de un

dipéptido: a partir de una o más clases de

aminoácidos.

En la presente invención, los aminoácidos son aquellos que son producidos por los microorganismos utilizados en el procedimiento de producción de la presente invención descritos más abajo, preferiblemente L-aminoácidos y glicina, más preferiblemente L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, L-valina, L-leucina, Lisoleucina, L-prolina, L-fenilalanina, L-triptófano, Lmetionina, L-serina, L-treonina, L-cisteína, Lasparagina, L-tirosina, L-lisina, L-arginina, Lhistidina, ácido L-aspártico, ácido L-α-aminobutírico, L4-hidroxiprolina, L-3-hidroxiprolina, L-ornitina, Lcitrulina y glicina, adicionalmente preferiblemente Lalanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, L-valina, Lleucina, L-isoleucina, L-prolina, L-fenilalanina, Ltriptófano, L-metionina, L-serina, L-treonina, Lcisteína, L-asparagina, L-tirosina, L-lisina, L-arginina, L-histidina, ácido L-aspártico, ácido L-α-aminobutírico y glicina.

La proteína anterior que consiste en una secuencia de aminoácidos donde uno o más residuos de aminoácidos son suprimidos, sustituidos o añadidos y que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos se puede obtener, por ejemplo, introduciendo una mutación dirigida al sitio en el ADN que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 8, 37, 38 y 43 mediante mutagénesis dirigida al sitio descrita en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (referido en adelante como Molecular Cloning, Tercera Edición); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (referido en adelante como Current Protocols in Molecular Biology); Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982); Gene, 34, 315 (1985); Nucleic Acids Research. 13, 4431 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985), etc.

El número de residuos de aminoácidos que son suprimidos, sustituidos o añadidos no está específicamente limitado, pero está en el intervalo en el que es posible la deleción, sustitución o adición mediante métodos bien conocidos tales como la mutagénesis dirigida al sitio anterior. El número adecuado es de 1 a docenas, preferiblemente de 1 a 20, más preferiblemente de 1 a 10, adicionalmente preferiblemente de 1 a 5.

La expresión "uno o más residuos de aminoácidos son suprimidos sustituidos o añadidos en cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 8, 37, 38 y 43" significa que la secuencia de aminoácidos puede contener deleciones, sustituciones o adiciones de un único o de varios residuos de aminoácidos en una posición arbitraria.

Los residuos de aminoácidos que se pueden sustituir son, por ejemplo, aquellos que no están conservados en todas las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NOS: 1 a 8, 37 y 38, o ambas secuencias de aminoácidos de un NRPS conocido y aquella mostrada en el SEQ ID NO: 43 cuando las secuencias son comparadas utilizando un soporte lógico de alineamiento conocido. Un ejemplo de un soporte lógico de alineamiento conocido es el soporte lógico de análisis de alineamiento contenido en el soporte lógico de análisis génico Genetyx (Software Development Co., Ltd.). Como parámetros de análisis para el soporte lógico de análisis, se pueden utilizar los valores por defecto.

La deleción o adición de residuos de aminoácidos puede estar contenida, por ejemplo, en la región N-terminal o la región C-terminal de la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 8, 37, 38 y 43.

La deleción, sustitución y adición pueden estar contenidas simultáneamente en una secuencia, y los aminoácidos que van a ser sustituidos o añadidos pueden ser naturales o no. Los ejemplos de los aminoácidos naturales son L-alanina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-glutamina, ácido L-glutámico, glicina, L-arginina, L

histidina,: L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L

metionina,: L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L

treonina,: L-triptófano, L-tirosina, L-valina y L

cisteína.

Los siguientes son ejemplos de los aminoácidos susceptibles de sustitución mutua. Los aminoácidos del mismo grupo pueden ser sustituidos mutuamente.

Grupo A: leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalina, alanina, ácido 2-aminobutanoico, metionina, O

metilserina, t-butilglicina, t-butilalanina, ciclohexilalanina Grupo B: ácido aspártico, ácido glutámico, ácido isoaspártico, ácido isoglutámico, ácido 2-aminoadípico, ácido 2aminosubérico Grupo C: asparagina, glutamina Grupo D: lisina, arginina, ornitina, ácido 2,4-diaminobutanoico, ácido 2,3-diaminopropiónico Grupo E: prolina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina Grupo F: serina, treonina, homoserina Grupo G: fenilalanina, tirosina

Con el fin de que la proteína de la presente invención pueda tener actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos, es deseable que la homología de su secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 8, 37, 38 y 43, preferiblemente la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1 es de 65% o más, preferiblemente 75% o más, más preferiblemente 85% o más, más preferiblemente 90% o más, particularmente preferiblemente 95% o más, y muy preferiblemente 98% o más.

La homología entre las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos se puede determinar utilizando el algoritmo BLAST de Karlin y Altschul [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] y FASTA [Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]. Basándose en el algoritmo BLAST, se han desarrollado programas tales como BLASTN y BLASTX [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)]. Cuando se analiza una secuencia de nucleótidos mediante BLASTN basándose en BLAST, los parámetros, por ejemplo, son los siguientes: puntuación=100 y longitud de palabra=12. Cuando se analiza una secuencia de aminoácidos mediante BLASTX basándose en BLAST, los parámetros, por ejemplo, son los siguientes: puntuación=50 y longitud de palabra=3. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se utilizan los parámetros por defecto de cada programa. Las técnicas específicas para estos análisis son conocidas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).

La secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 17 es una región conservada entre las proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NOS: 1 a 7 y también es una región correspondiente a la secuencia consenso de proteínas que tienen actividad ligasa Ala-Ala derivada de diferentes microorganismos.

Las proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de 80% o más, preferiblemente 90% o más, más preferiblemente 95% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 17 y que tienen actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos también están incluidas en las proteínas producidas por los microorganismos utilizados en el procedimiento de producción de la presente invención.

Con el fin de que la proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de 80% o más, preferiblemente 90% o más, más preferiblemente 95% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 17 pueda tener actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos, es deseable que la homología de su secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 8 sea de al menos 80% o más, normalmente 90% o más, y concretamente 95% o más.

La homología entre las secuencias de aminoácidos puede ser determinada utilizando BLAST o FASTA como se ha descrito antes.

Es posible confirmar que las proteínas de los apartados [1] a [11] anteriores son proteínas que tienen actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos, por ejemplo, de la siguiente manera. Esto es, se prepara un transformante que expresa la proteína mediante técnicas recombinantes, se produce la proteína de la presente invención utilizando el transformante, y después se permite que estén presentes la proteína de la presente invención, una o más clases de aminoácidos y ATP en un medio acuoso, seguido de análisis mediante HPLC o similar para saber si se forma un dipéptido y se acumula en el medio acuoso.

El ADN utilizado en el procedimiento de producción de la presente invención es un ADN que codifica una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido donde el mismo o diferentes aminoácidos están unidos por un enlace peptídico a partir de una o más clases de aminoácidos como se define más abajo:

[12] ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 9 a 16 y 36;

[13] ADN que hibrida con ADN que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 9 a 16 y 36 en condiciones restrictivas y que codifica una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[14] ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de 80% o más con la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 18 y que codifica una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[15] ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 39 o 40;

[16] ADN que hibrida con ADN que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 39 o 40 en condiciones restrictivas y que codifica una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[17] ADN que codifica una proteína que tiene actividad NRPS;

[18] ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 44; y

[19] ADN que hibrida con ADN que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 44 en condiciones restrictivas y que codifica una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos.

El ADN anterior susceptible de hibridación en condiciones restrictivas hace referencia a ADN que es obtenido mediante hibridación de colonias, hibridación en placa, hibridación por transferencia Southern, o similar utilizando una parte o todo el ADN que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 9 a 16, 36, 39, 40 y 44 como sonda. Un ejemplo específico de semejante ADN es un ADN que puede ser identificado realizando una hibridación a 65°C en presencia de 0,7 a 1,0 moles/l, preferiblemente 0,9 moles/l de cloruro de sodio utilizando un filtro con ADN derivado de colonias o de placas inmovilizado sobre él, y lavando después el filtro a 65°C con una concentración de 0,1 a 2 veces, preferiblemente una concentración de 0,1 veces de solución de SSC (solución de SSC con una concentración de 1 vez: 150 mmoles/l de cloruro de sodio y 15 mmoles/l de citrato de sodio). La hibridación se puede llevar a cabo de acuerdo con los métodos descritos en Molecular Cloning, Tercera Edición; Current Protocols in Molecular Biology; DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Segunda Edición, Oxford University (1995), etc. Específicamente, el ADN hibridable incluye ADN que tiene una homología de al menos 75% o más, preferiblemente una homología de 85% o más, más preferiblemente una homología de 90% o más, particularmente preferiblemente una homología de 95% o más con la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 9 a 16, 36, 39. 40 y 44 calculada mediante el uso de BLAST o FASTA descritos antes basándose en los parámetros anteriores.

Las muestras de ADN que se van a someter a hibridación incluyen, por ejemplo, ADN cromosómicos de microorganismos pertenecientes al mismo género, preferiblemente las mismas especies que las que tienen la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 9 a 16, 36, 39, 40 y 44 en sus ADN cromosómicos. Es posible confirmar que el ADN que hibrida con el ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 9 a 16, 36, 39, 40 y 44 en condiciones restrictivas es el ADN que codifica una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos, por ejemplo, produciendo una proteína codificada por el ADN mediante técnicas de ADN recombinante y midiendo la actividad de la proteína descrita antes.

(i) Preparación del ADN Utilizado en el Procedimiento deProducción de la Presente Invención

Los ADN utilizados en el procedimiento de producción de la presente invención se pueden obtener mediante:

1.: (a) Hibridación Southern de una genoteca de ADN cromosómico de un microorganismo, preferiblemente un microorganismo perteneciente al género Bacillus, utilizando una sonda diseñada basándose en la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 9 a 16 y 36, o mediante PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)] utilizando ADN cebadores diseñados basándose en la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 9 a 16 y 36 y, como molde, el ADN cromosómico de un microorganismo, preferiblemente un microorganismo perteneciente al género Bacillus;

2.: (b) Hibridación Southern de una genoteca de ADN cromosómico de un microorganismo, preferiblemente un microorganismo perteneciente al género Streptomyces, utilizando una sonda diseñada basándose en la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 39 o 40, o mediante PCR utilizando ADN cebadores diseñados basándose en la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 3 o 4 y, como molde, el ADN cromosómico de microorganismo, preferiblemente un microorganismo perteneciente al género Streptomyces; y

3.: (c) Hibridación Southern de una genoteca de ADN cromosómico de un microorganismo, preferiblemente un microorganismo perteneciente al género Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas o Xanthomonas, utilizando ADN que codifica NRPS conocido, por ejemplo, NRPS descrito en Bur. J. Biochem. 270, 4555 (2003), Publicación Nacional PCT Núm. 512835/03, Patente de los Estados Unidos Núm. 5795738 o Patente de los Estados Unidos Núm. 5652116, o una sonda diseñada basándose en la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 44, o mediante PCR utilizando ADN cebadores diseñados basándose en la secuencia de nucleótidos de ADN que codifica el NRPS anterior y, como molde, el ADN cromosómico de un microorganismo, preferiblemente un microorganismo perteneciente al género Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas o Xanthomonas.

El ADN utilizado en el procedimiento de producción de la presente invención también se puede obtener llevando a cabo una investigación de diferentes bases de datos de secuencias de genes en busca de una secuencia que tenga una homología de 75% o más, preferiblemente una homología de 85% o más, más preferiblemente una homología de 90% o más, más preferiblemente una homología de 95% o más, particularmente preferiblemente una homología de 98%

o más con la secuencia de nucleótidos de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 8, 17, 37, 38 y 43, y obteniendo el ADN deseado, basándose en la secuencia de nucleótidos obtenida mediante la búsqueda, a partir de una genoteca de ADN cromosómico o ADNc de un organismo que tenga la secuencia de nucleótidos de acuerdo con el método descrito antes.

El ADN obtenido, como tal o después de la escisión con las enzimas de restricción apropiadas, es insertado en un vector mediante un método convencional, y el ADN recombinante obtenido es introducido en una célula anfitriona. Después, la secuencia de nucleótidos del ADN puede ser determinada mediante un método de secuenciación convencional tal como el método didesoxi [Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 74, 5463 (1977)] o utilizando un secuenciador de nucleótidos tal como 373A DNA Sequencer (Perkin-Elmer Corp.).

En los casos en los que se encuentra que el ADN obtenido es un ADN parcial mediante el análisis de la secuencia de nucleótidos, se puede obtener el ADN completo mediante hibridación Southern de una genoteca de ADN cromosómico utilizando el ADN parcial como sonda.

También es posible preparar el ADN deseado mediante síntesis química utilizando un sintetizador de ADN (p. ej., Modelo 8905, PerSeptive Biosystems) basado en la secuencia de nucleótidos determinada del ADN.

Los ejemplos de los ADN que se pueden obtener mediante el método descrito antes son los ADN que tienen las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 9 a 16, 36, 39, 40 y 44.

Los ejemplos de los vectores para insertar el ADN anterior incluyen pBluescriptII KS(+) (Stratagene), pDIRECT [Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)], pCR-Script Amp SK(+) (Stratagene), pT7 Blue (Novagen, Inc.), pCR II (Invitrogen Corp.) y pCR-TRAP (Genhunter Corp.).

Las células anfitrionas anteriores incluyen microorganismos pertenecientes al género Escherichia. Los ejemplos de los microorganismos pertenecientes al género Escherichia incluyen Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1. Escherichia coli MC1000, Escherichia coli ATCC 12435, Escherichia coli W1485. Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No. 49, Escherichia coli W3110, EScherichia coli NY49, Escherichia coli MP347. Escherichia coli NM522 y Escherichia coli ME8415.

La introducción del ADN recombinante se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los métodos para la introducción de ADN en las células anfitrionas anteriores, por ejemplo, el método en el que se utilizan iones calcio [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], el método del protoplasto (Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada Núm. 248394/88) y la electroporación [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)].

Un ejemplo del microorganismo que porta el ADN utilizado en el procedimiento de producción de la presente invención obtenido por medio del método anterior es Escherichia coli NM522/pPE43, que es un microorganismo que porta un ADN recombinante que comprende ADN que tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1.

(ii) Preparación de Microorganismos que tienen Capacidad de Producir Aminoácidos

Los microorganismos que tienen la capacidad de producir aminoácidos utilizados en el procedimiento para producir un dipéptido de la presente invención incluyen cualquiera de los microorganismos que han sido modificados genéticamente con el fin de que tengan la capacidad de producir una o más clases de aminoácidos, por ejemplo, un microorganismo al cual se ha conferido artificialmente la capacidad de producir al menos una clase de aminoácido entre los aminoácidos que constituyen el dipéptido deseado mediante un método conocido.

Los ejemplos de los métodos conocidos son:

1.: (a) un método en el cual al menos se reduce o elimina al menos una de las regulaciones de la biosíntesis de un aminoácido;

2.: (b) un método en el cual la expresión de al menos una de las enzimas implicadas en la biosíntesis de un aminoácido está intensificada;

3. (c) un método en el que se incrementa el número de copias de al menos uno de los genes de las enzimas implicadas en la biosíntesis de un aminoácido;

4.: (d) un método en el cual al menos una de las rutas metabólicas que se ramifican a partir de la ruta

5.: (e) un método en el que se selecciona una cepa celular que tiene una resistencia superior a un análogo de un aminoácido en comparación con una cepa de tipo salvaje.

biosintética: de un aminoácido a metabolitos

distintos: del aminoácido está debilitada o

bloqueada; y

Los métodos conocidos anteriores se pueden utilizar solos o combinados.

El método del apartado (a) anterior está específicamente descrito en Agric. Biol. Chem., 43, 105111 (1979); J. Bacteriol., 110, 761-763 (1972); Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323 (1993), etc. El método del apartado (b) anterior está específicamente descrito en Agric. Biol. Chem., 43, 105-111 (1979); J. Bacteriol., 110, 761-763 (1972), etc. El método del apartado (c) anterior está específicamente descrito en Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323 (1993); Agric. Biol. Chem., 39, 371-377 (1987), etc. El método (d) anterior está específicamente descrito en Appl. Environ. Microbiol., 38, 181-190 (1979); Agric. Biol. Chem., 42, 1773-1778 (1978), etc. El método del apartado (e) anterior está específicamente descrito en Agric. Biol. Chem., 36, 1675-1684 (1972); Agric. Biol. Chem., 41, 109116 (1977); Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023 (1973), Agric. Biol. Chem., 51, 2089-2094 (1987), etc. Los microorganismos que tienen la capacidad de producir diferentes aminoácidos pueden ser preparados haciendo referencia a las publicaciones anteriores.

Adicionalmente, como para la preparación de microorganismos que tienen la capacidad de producir aminoácidos mediante los métodos de los apartados (a) a

(e) anteriores, solos o combinados, se describen muchos ejemplos en Biotechnology 2a ed., Vol. 6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996) sección 14a y 14b; Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79, 1-35 (2003); Hiroshi Soda, et al., Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center (1986), etc. Además de los anteriores, se han realizado muchos informes sobre los métodos para la preparación de microorganismos que tienen la capacidad de producir aminoácidos específicos: por ejemplo, Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada Núm. 164297/03; Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975); Agric. Biol. Chem., 39, 1149-1153 (1975); Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada Núm. 13599/83: J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283 (1958); Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada Núm. 94985/88; Agric. Biol. Chem. 37. 2013-2023 (1973); WO 97/15673; Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada Núm. 18596/81; Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada Núm. 144092/81 y Publicación Nacional PCT Núm. 511086/03. Los microorganismos que tienen la capacidad de producir una o mas clases de aminoácidos se pueden preparar haciendo referencia a las publicaciones anteriores.

Los ejemplos de los microorganismos que tiene la capacidad de producir aminoácidos preparados mediante los métodos anteriores incluyen cepas productoras de Lglutamina (p. ej. un microorganismo donde están suprimidos el gen glnE y/o el gen glnB), cepas productoras de L-alanina [p. ej. un microorganismo donde la expresión del gen de la alanina deshidrogenasa (gen ald) está intensificada], y microorganismos productores de L-fenilalanina (p. ej. un microorganismo que expresa

el: gen pheA resistente a la retroalimentación de

fenilalanina: y/o el gen aroF resistente a la

retroalimentación de tirosina).

Los microorganismos anteriores incluyen cualquiera de los microorganismos a los cuales se pueden aplicar los métodos de los apartados (a) a (e) anteriores o microorganismos que tienen los genotipos anteriores, preferiblemente procariotas, más preferiblemente bacterias.

Los procariotas incluyen microorganismos pertenecientes a los géneros Escherichia, Serratia. Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azotobacter, Chromatium, Erwinia, Methylobacterium, Phormidium, Rhodobacter. Rhodopseudomonas. Rhodospirillum, Scenedesmus. Streptomyces, Synechoccus y Zymomonas, por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi, Anabaena cylindrica, Anabaena doliolum, Anabaena flos-aquae, Arthrobacter aurescens, Arthrobacter citreus, Arthrobacter globformis, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter mysorens, Arthrobacter nicotianae, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter protophormiae, Arthrobacter roseoparaffinus, Arthrobacter sulfureus, Arthrobacter ureafaciens, Chromatium buderi, Chromatium tepidum, Chromatium vinosum, Chromatium warmingii, Chromatium fluviatile, Erwinia uredovora, Erwinia carotovora, Erwinia ananas, Erwinia herbicola, Erwinia punctata, Erwinia terreus, Methylobacterium rhodesianum, Methylobacterium extorquens, Phormidium sp. ATCC 29409, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodopseudomonas blastica, Rhodopseudomonas marina, Rhodopseudomonas palustris, Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum salexigens, Rhodospirillum salinarum, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces aureus, Streptomyces fungicidicus, Streptomyces griseochromogenes, Streptomyces griseus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivogriseus, Streptomyces rameus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces vinaceus y Zymomonas mobilis. Los procariotas preferidos incluyen bacterias pertenecientes a los géneros Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium. Corynebacterium, Pseudomonas y Streptomyces, por ejemplo, las especies anteriormente mencionadas pertenecientes a los géneros Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas y Streptomyces. Las bacterias más preferidas incluyen Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium lactofermentum, Corynebacterium flavum, Corynebacterium efficiens, Bacillus subtills, Bacillus megaterium, Serratia marcescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Streptomyces coelicolor y Streptomyces lividans, entre las cuales es particularmente preferida Escherichia coli.

Los ejemplos específicos de los microorganismos que producen aminoácidos incluyen Escherichia coli JGLB1 y Escherichia coli JGLBE1, que son cepas productoras de Lglutamina, Escherichia coli JM101 que porta un plásmido de expresión con el gen ald, que es una cepa productora de L-alanina. Escherichia coli JM101 que porta un plásmido de expresión con el gen pPHEA2 y/o aroF, que son cepas productoras de L-fenilalanina, Escherichia coli JGLE1 y Escherichia coli JGLBE1 que portan un plásmido de expresión con el gen ald, que son cepas productoras de Lglutamina y L-alanina, Escherichia coli JM101 que porta un plásmido de expresión con el gen ald y pPHEA2 y/o un plásmido de expresión con el gen aroF, que son cepas productoras de L-alanina y L-fenilalanina, y cepas ATCC 21277 que portan pPHEA y/o un plásmido de expresión con el gen aroF, que son cepas productoras de L-treonina y Lfenilalanina.

Adicionalmente, los ejemplos específicos de los microorganismos que tienen la capacidad de producir aminoácidos incluyen FERM BP-5807 y ATCC 13032 cepas productoras de ácido L-glutámico, FERM P-4806 y ATCC 14751 cepas productoras de L-glutamina, ATCC 21148, ATCC 21277 y ATCC 21650 cepas productoras de L-treonina, FERM P-5084 y ATCC 13286 cepas productoras de L-lisina, FERM P-5479, VKPM B-2175 y ATCC 21608 cepas productoras de Lmetionina, FERM BP-3757 y ATCC 14310 cepas productoras de L-isoleucina, ATCC 13005 y ATCC 19561 cepas productoras de L-valina, FERM BP-4704 y ATCC 21302 cepas productoras de L-leucina, FERM BP-4121 y ATCC 15108 cepas productoras de L-alanina, ATCC 21523 y FERM BP-6576 cepas productoras de L-serina, FERM BP-2807 y ATCC 19244 cepas productoras de L-prolina, FERM P-5616 y ATCC 21831 cepas productoras de L-arginina, ATCC 13232 cepa productora de L-ornitina, PERM BP-6674 y ATCC 21607 cepas productoras de Lhistidina, DSM 10118, DSM 10121, DSM 10123 y FERM BP-1777 cepas productoras de L-triptófano, ATCC 13281 y ATCC 21669 cepas productoras de L-fenilalanina, ATCC 21652 cepa productora de L-tirosina, W3110/pHC34 cepa productora de L-cisteína (Publicación Nacional PCT Núm. 511086/03). Escherichia coli SOLR/pRH71 que produce L-4hidroxiprolina descrita en el documento WO96/27669. FERM BP-5026 y FERM BP-5409 cepas productoras de L-3hidroxiprolina, y FERM P-5643 y FERM P-1645 cepas productoras de L-citrulina.

Las cepas anteriores denominadas mediante los Núms. FERM, Núms. ATCC, Núm. VKPM y Núms. DSM son asequibles del International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science y Technology (Japón), American Type Culture Collection (EEUU), Russian National Collection of Industrial Microorganisms (Rusia) y Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Alemania), respectivamente.

(iii) Preparación de Microorganismos que tienen la Capacidad de Producir una Proteína que Tiene ActividadFormadora de un Dipéptido a partir de Una o Más Clases deAminoácidos y que tienen la Capacidad de Producir almenos una de dichas Una o Más Clases de Aminoácidos

Los microorganismos que tienen la capacidad de producir una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos y que tiene la capacidad de producir al menos una de dichas una o más clases de aminoácidos se pueden preparar mediante los siguientes métodos:

(a): un método de introducción de ADN que codifica una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos preparados mediante el método del apartado (i) anterior en un microorganismo que tiene la capacidad de producir una o más clases de aminoácidos preparados mediante el método del apartado (ii) anterior;

(b): un método para conferir, mediante el método del apartado (ii) anterior, la capacidad de producir una

: o más clases de aminoácidos a un microorganismo que porta ADN que codifica una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una

: o más clases de aminoácidos preparados mediante el método del apartado (i) anterior;

(c): un método de introducción de ADN que codifica una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos en un microorganismo que tiene inherentemente la capacidad de producir una o más clases de aminoácidos mediante el método del apartado (i) anterior; y

(d): un método para conferir la capacidad de producir

una o más clases de aminoácidos a un microorganismo que tiene inherentemente la capacidad de producir una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos mediante el método del apartado (ii) anterior.

La introducción de ADN que codifica una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una

o más clases de aminoácidos preparados mediante el método del apartado (i) anterior en un microorganismo puede conferir al microorganismo la capacidad para producir una proteína que tenga actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos. La capacidad para producir una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos puede ser conferida a un microorganismo expresando el ADN preparado mediante el método del apartado (i) anterior en una célula anfitriona utilizando los métodos descritos en Molecular Cloning, Tercera Edición, Current Protocols in Molecular Biology, o similar, por ejemplo, de la siguiente manera.

Basándose en el ADN preparado mediante el método descrito en el apartado (i) anterior, se prepara según se necesite un fragmento de ADN de una longitud apropiada que comprende una región que codifica la proteína. La productividad de la proteína puede ser intensificada remplazando un nucleótido de la secuencia de nucleótidos de la región que codifica la proteína con el fin de elaborar un codón sumamente adecuado para la expresión en una célula anfitriona.

El fragmento de ADN se inserta aguas abajo de un promotor en un vector de expresión apropiado para

preparar un ADN recombinante.

Se puede obtener un transformante que produce la proteína introduciendo el ADN recombinante en una célula anfitriona adecuada para el vector de expresión.

En cuanto a la célula anfitriona, se puede utilizar cualquiera de los microorganismos que son capaces de expresar el gen deseado. Se prefieren los procariotas, y son más preferidas las células bacterianas. Los ejemplos de los procariotas preferidos son los procariotas mencionados en el apartado (ii) anterior.

El microorganismo puede tener o no la capacidad de producir una o más clases de aminoácidos. Cuando se utiliza como célula anfitriona un microorganismo sin la capacidad, se puede obtener un microorganismo utilizado en el procedimiento de producción de la presente invención preparando un transformante introduciendo el ADN recombinante obtenido mediante el método anterior en el microorganismo mediante el siguiente método, y confiriendo después la capacidad de producir una o más clases de aminoácidos al transformante mediante el método del apartado (ii) anterior.

Los vectores de expresión que pueden ser empleados son aquellos susceptibles de replicación autónoma o integración en el cromosoma en las células del microorganismo y que comprenden un promotor en una posición apropiada para la transcripción del ADN

utilizado: en el procedimiento de producción de la

presente invención.

Cuando: se utiliza un procariota como célula

anfitriona, se prefiere que el ADN recombinante que

comprende el ADN utilizado en el procedimiento de producción de la presente invención sea un ADN recombinante que sea susceptible de replicación autónoma en el procariota y comprenda un promotor, una secuencia de unión al ribosoma, el ADN utilizado en el procedimiento de producción de la presente invención, y una secuencia terminadora de la transcripción. El ADN recombinante puede comprender adicionalmente un gen que regule el promotor.

Los ejemplos de los vectores de expresión adecuados son pBTrp2, pBTacl y pBTac2 (productos de Boehringer Mannheim GmbH), pHelixl (Roche Diagnostics Corp.), pKK233-2 (Amersham Pharmacia Biotech), pSE280 (Invitrogen Corp.), pGEMEX-1 (Promega Corp.), pQE-8 (Qiagen, Inc.), pET-3 (Novagen, Inc.), pKYP10 (Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada Núm. 110600/83), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript II SK(+), pBluescript II KS(-) (Stratagene), pTrS30 [preparado a partir de Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)], pTrS32 [preparado a partir de Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)], pPAC31 (WO98/12343), pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pSTV28 (Takara Bio Inc.), pUC118 (Takara Bio Inc.), pPA1 (Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada Núm. 233798/88), pWH1520 (MoBiTec), pCS299P (documento WO 00/63388), pVLT31 [Gene, 123, 17 (1993)] y pIJ702 (Genetic Manipulation of Streptomyces: a Laboratory Manual: John Innes Foundation).

Cuando se utiliza un microorganismo perteneciente al género Escherichia como célula anfitriona, se puede utilizar cualquiera de los promotores capaces de funcionar en Escherichia coli como promotor. Por ejemplo, se pueden utilizar promotores derivados de Escherichia coli o fagos, tales como el promotor trp (Ptrp), el promotor lac (Plac), el promotor PL, el promotor PR y el promotor PSE, el promotor SPO1, el promotor SPO2 y el promotor penP. Asimismo se pueden utilizar promotores diseñados y modificados artificialmente tales como un promotor en el que se combinan dos PtrpS en tándem, el promotor tac, el promotor lacT7 y el promotor letI, etc.

También son útiles promotores tales como el promotor xylA para la expresión en microorganismos pertenecientes al género Bacillus [Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)], el promotor P54-6 para la expresión en microorganismos pertenecientes al género Corynebacterium (Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)], el promotor tac para la expresión en microorganismos pertenecientes al género Pseudomonas [Gene, 123, 17-24 (1993)] y el promotor xylA para la expresión en microorganismos pertenecientes al género Streptomyces (Genetic Manipulation of Streptomyces: a Laboratory Manual: John Innes Foundation).

Se prefiere utilizar un plásmido en el que la distancia entre la secuencia de Shine-Dalgarno (secuencia de unión al ribosoma) y el codón de iniciación se ajuste a una longitud apropiada (p. ej., 6 a 18 nucleótidos).

En el ADN recombinante en el que el ADN utilizado en el procedimiento de producción de la presente invención es ligado a un vector de expresión, la secuencia terminadora de la transcripción no es esencial, pero se prefiere colocar la secuencia de terminación de la transcripción inmediatamente aguas abajo del gen estructural.

Un ejemplo de semejante ADN recombinante es pPE43.

La introducción del ADN recombinante en células de microorganismos se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los métodos para introducir ADN en las células, por ejemplo, el método en el que se utilizan iones calcio [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], el método del protoplasto (Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada Núm. 248394/88) y la electroporación [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)].

Los ejemplos de los microorganismos que tienen inherentemente la capacidad de producir una o más clases de aminoácidos utilizados en el método (c) anterior incluyen cepas conocidas que tienen la capacidad de

producir: aminoácidos descritas en el apartado (ii)

anterior.

Los: ejemplos de los microorganismos que tienen

inherentemente la capacidad de producir una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una

o más clases de aminoácidos utilizados en el método (d) anterior incluyen: (A) microorganismos pertenecientes al género Bacillus, más preferiblemente, microorganismos pertenecientes al género Bacillus que tienen actividad sintetizadora de bacilisina, más preferiblemente, microorganismos pertenecientes a una especie seleccionada del grupo que consiste en Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium y Bacillus pumilus, muy preferiblemente, microorganismos seleccionados del grupo que consiste en las cepas Bacillus subtilis ATCC 15245, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus subtilis IAM 1213, Bacillus subtilis IAM 1107, Bacillus subtilis IAM 1214, Bacillus subtilis ATCC 9466, Bacillus subtilis IAM 1033, Bacillus subtilis ATCC 21555, Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 y Bacillus pumilus NRRL B12025; y (B) microorganismos pertenecientes al género Streptomyces, preferiblemente, microorganismos pertenecientes al género Streptomyces que tienen la capacidad de producir albonoursina, más preferiblemente, microorganismos pertenecientes a la especie Streptomyces albulus o Streptomyces noursei.

(iv) Microorganismos en los Cuales se Reducen o Pierdenlas Actividades de Peptidasas y Proteínas que tienenActividad de penetración/transporte de Péptidos

Los microorganismos utilizados en el procedimiento de producción de la presente invención incluyen los microorganismos preparados mediante el método del apartado (111) anterior en los cuales las actividades de una o más clases de peptidasas y una o más clases de proteínas que tienen actividad de penetración/transporte de péptidos (referidas en adelante como proteínas de penetración/transporte de péptidos) se reducen o se pierden, y aquellos en los cuales se reducen o pierden las actividades de tres o más clases de peptidasas.

Semejante microorganismo puede ser obtenido, por ejemplo, mediante los siguientes métodos: (a) un método que confiere, mediante el método del apartado (iii) anterior, la capacidad de producir una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos y la capacidad de producir al menos una de dichas una o más clases de aminoácidos a un microorganismo en el cual las funciones de una o más clases de peptidasas y una o más clases de proteínas de penetración/transporte de péptidos se reducen o se pierden, o un microorganismo en el cual las funciones de tres o más clases de peptidasas se reducen o se pierden; y (b) un método que reduce u ocasiona la pérdida de las funciones de a) una o más clases de peptidasas y una o más clases de proteínas de penetración/transporte de péptidos o b) tres o más clases de peptidasas de un microorganismo que tiene la capacidad de producir una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos y la capacidad de producir al menos una de dichas una o más clases de aminoácidos que se pueden preparar mediante el método del apartado (iii) anterior.

Los microorganismos en los cuales se reducen o se pierden las actividades de una o más clases de peptidasas y una o más clases de proteínas de penetración/transporte de péptidos incluyen microorganismos en los cuales las actividades de una o más clases arbitrarias de peptidasas y una o más clases arbitrarias de proteínas de penetración/transporte de péptidos se reducen o se pierden siempre que los microorganismos puedan crecer normalmente, específicamente, microorganismos en los cuales se reducen o se pierden las actividades de preferiblemente una a nueve clases, más preferiblemente una a siete clases, más preferiblemente una a cuatro clases de peptidasas y preferiblemente una a cinco clases, más preferiblemente una a tres clases, más preferiblemente una o dos clases, particularmente preferiblemente una clase de proteína de penetración/transporte de péptidos.

Los ejemplos de tales microorganismos son microorganismos en los cuales las actividades de una o más clases de peptidasas y una o más clases de proteínas de penetración/transporte de péptidos se reducen o se pierden debido a que las secuencias de nucleótidos de una o más clases de genes que codifican peptidasas (referidos en adelante como genes de peptidasa) y una o más clases de genes que codifican proteínas de penetración/transporte de péptidos (referidos en adelante como genes de proteínas de penetración/transporte de péptidos) entre los genes de peptidasa y los genes de las proteínas de existentes en el ADN genómico de los microorganismos son completamente o parcialmente suprimidas o dichas secuencias de nucleótidos contienen sustituciones o adiciones de nucleótidos.

La expresión "la actividad petidasa es reducida" significa que la actividad peptidolítica se reduce, o se reduce normalmente a 80% o menos, preferiblemente 50% o menos, más preferiblemente 30% o menos, más preferiblemente 20% o menos, particularmente preferiblemente 10% o menos, muy preferiblemente 5% o menos en comparación con la peptidasa que no tiene ninguna de las deleciones, sustituciones y adiciones de nucleótidos anteriores.

La actividad peptidolítica de un microorganismo puede ser medida permitiendo que un péptido como sustrato y células de microorganismos estén presentes en un medio acuoso, realizando de ese modo una reacción peptidolítica, y determinando después la cantidad de péptido restante mediante un método conocido, p. ej., un análisis HPLC.

Las peptidasas anteriores pueden ser cualquiera de las proteínas que tienen actividad peptidolítica. Se prefieren las proteínas que tienen una elevada actividad hidrolizante de dipéptidos. Son más preferidas las dipeptidasas.

Los ejemplos de las peptidasas incluyen: aquellas que existen en Escherichia coli tales como PepA que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 45, PepB que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 46, PepD que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 47, PepN que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 48, PepP [Núm. de acceso GenBank (abreviado en adelante como Genbank) AAC75946]. PepQ (GenBank AAC76850), PepE (GenBank AAC76991), PepT (GenBank AAC74211), Dcp (GenBank AAC74611) y IadA (GenBank AAC77284); aquellas que existen en Bacillus subtilis tales como AmpS (GenBank AF012285), PepT (GenBank X99339), YbaC (GenBank Z99104), YcdD (GenBank Z99105). YjbG (GenBank Z99110), YkvY (GenBank Z99111), YqjB (GenBank Z99116) y YwaD (GenBank Z99123); y aquellas que existen en Corynebacterium glutamicum tales como las proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por BAB97732, BAB97858, BAB98080, BAB98880, BAB98892, BAB99013, BAB99598 y BAB99819 (Núms. de registro de DNA Data Bank de Japón). Los ejemplos de las dipeptidasas incluyen PepA, PepB, PepD y PepN que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NOS: 45 a 48, PepQ, PepB e IadA. También se incluyen las proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos que tienen una homología de 80%

: o más, preferiblemente 90% o más, más preferiblemente 95%

: o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 45 a 48 y que tienen actividad peptidasa en las proteínas que tienen una elevada actividad hidrolizante de dipéptidos. La homología entre las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos se puede determinar utilizando BLAST, FASTA o similar descritos antes.

La expresión "la actividad de una proteína de penetración/transporte de péptidos es reducida" significa que la actividad de absorción de péptido es reducida, o reducida normalmente al 80% o menos, preferiblemente 50%

o menos, más preferiblemente 30% o menos, más preferiblemente 20% o menos, particularmente preferiblemente 10% o menos, muy preferiblemente 5% o menos en comparación con una proteína de penetración/transporte de péptidos que no tiene ninguna de las deleciones, sustituciones y adiciones de nucleótidos anteriores.

La actividad de absorción de un péptido de un microorganismo se puede medir permitiendo que el péptido como sustrato y las células del microorganismo estén presentes en un medio acuoso, realizando de ese modo una reacción de absorción del péptido, y determinando después la cantidad del péptido restante mediante un método conocido, p. ej., análisis HPLC.

Las proteínas de penetración/transporte de péptidos anteriores pueden ser cualquiera de las proteínas implicadas en la penetración o transporte de péptidos de los microorganismos, por ejemplo, proteínas codificadas por genes que forman un operón en el ADN cromosómico que forma un complejo en la membrana celular para expresar la actividad de absorción del péptido y aquellas que tienen actividad de absorción de péptidos como proteínas individuales. Se prefieren las proteínas que tienen una elevada actividad de absorción de dipéptido.

Los ejemplos de las proteínas de penetración/transporte de péptidos incluyen: aquellas que existen en Escherichia coli tales como DppA que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 49, DppB que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 50, DppC que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 51, DppD que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 52, DppF que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 53, OppA (GenBank AAC76569), OppB (GenBank AAC76568), OppC (GenBank AAC76567), OppD (GenBank AAC76566), OppF (GenBank AAC76565), YddO (GenBank AAC74556), YddP (GenBank AAC74557), YddQ (GenBank AAC74558), YddR (GenBank AAC74559), YddS (GenBank AAC74560), YbiK (GenBank AAC73915), MppA (GenBank AAC74411), SapA (GenBank AAC74376), SapB (GenBank AAC74375), SapC (GenBank AAC74374), SapD (GenBank AAC74373) y SapF (GenBank AAC74372); aquellas que existen en Bacillus subtilis tales como DppA (GenBank CAA40002), DppB (GenBank CAA40003), DppC (GenBank CAA40004), DppD (GenBank CAA40005), DppB (GenBank CAA40006), OppA (GenBank CAA39787), OppB (GenBank CAA39788), OppC (GenBank CAA39789), OppD (GenBank CAA39790), OppF (GenBank CAA39791), AppA (GenBank CAA62358), AppB (GenBank CAA62359), AppC (GenBank CAA62360), AppD (GenBank CAA62356), AppF (GenBank CAA62357), YclF (GenBank CAB12175) y YkfD (GenBank CAB13157); y aquellas que existen en Corynebacterium glutamicum tales como las proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por BAB99048, BAB99383, BAB99384, BAB99385, BAB99713, BAB99714, BAB99715, BAB99830, BAB99831 y BAB99832 (Núms. de registro de DNA Data Bank de Japón). Los ejemplos de las proteínas que tienen una elevada actividad de absorción de dipéptido incluyen DppA, DppB, DppC, DppD y DppF que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NOS: 49 a 53, y las proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos que tienen una homología de 80% o más, preferiblemente 90% o más, más preferiblemente 95% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 49

a 53.

La homología entre las secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando programas tales como BLAST y FASTA descritos antes.

Los microorganismos en los cuales las actividades de tres o más clases de peptidasas se reducen o se pierden incluyen los microorganismos en los cuales se reducen o se pierden las actividades de tres o más clases arbitrarias de peptidasas siempre que los microorganismos puedan crecer normalmente, específicamente, microorganismos en los cuales las actividades de preferiblemente tres a nueve clases, más preferiblemente tres a seis clases, más preferiblemente tres o cuatro clases de peptidasas se reducen o se pierden.

Los ejemplos de peptidasas incluyen las peptidasas descritas antes y las dipeptidasas existentes en Escherichia coli, Bacillus subtilis y Corynebacterium glutamicum. Las proteínas que consisten en las secuencias de aminoácidos que tienen una homología de 80% o más, preferiblemente 90% o más, más preferiblemente 95% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SBQ ID NOS: 45 a 48 y que tienen actividad peptidasa también se incluyen en las proteínas que tienen una elevada actividad hidrolizadora de dipéptidos.

(v) Preparación de Microorganismos en los Cuales se Reducen o se Pierden las Actividades de Peptidasas yProteínas de penetración/transporte de Péptidos

Los microorganismos en los cuales se reducen o se pierden las actividades de peptidasas y proteínas de penetración/transporte de péptidos se pueden obtener mediante cualquier método con capacidad para preparar tales microorganismos. Por ejemplo, se pueden obtener introduciendo una deleción, sustitución o adición de un nucleótido en genes de peptidasa y genes de proteínas de penetración/transporte de péptidos en ADN cromosómicos, de los microorganismos descritos más abajo.

Los métodos para introducir una deleción, sustitución o adición de un nucleótido en un gen en el ADN cromosómico de un microorganismo incluyen métodos que utilizan la recombinación homóloga. Un ejemplo de los métodos que utilizan la recombinación homóloga general es el método que utiliza un plásmido para la recombinación homóloga preparado ligando un gen mutante en el que se ha introducido una deleción, sustitución o adición de nucleótidos en un ADN plasmídico incapaz de replicación autónoma en una célula anfitriona en la que se va a introducir la deleción de nucleótidos o similar y que porta un gen de resistencia a fármacos.

El plásmido para la recombinación homóloga es introducido en una célula anfitriona mediante un método habitual, seguido de selección de un transformante en el cual el plásmido para la recombinación homóloga ha sido integrado en el ADN cromosómico mediante recombinación homóloga utilizando la resistencia a fármacos como marcador. El transformante obtenido se cultiva utilizando un medio que no contiene el fármaco durante varias horas a un día, y después se extiende sobre un medio de agar que contiene el fármaco y sobre un medio de agar sin el fármaco. Seleccionando una cepa que no crece sobre el primer medio pero puede crecer sobre el último medio, se puede obtener la cepa en la cual se produjo una segunda recombinación homóloga en el ADN cromosómico. La introducción de una deleción, sustitución o adición de nucleótidos en un gen deseado del ADN cromosómico se puede confirmar determinando la secuencia de nucleótidos de una región del ADN cromosómico que contiene el gen en el cual se ha introducido la deleción o similar.

Por medio del uso del método anterior, se puede introducir una deleción, sustitución o adición de nucleótidos en los genes deseados de los ADN cromosómicos de microorganismos tales como los pertenecientes a los géneros Escherichia, Bacillus y Corynebacterium.

Adicionalmente, se puede introducir eficazmente una deleción, sustitución o adición de nucleótidos en genes plurales utilizando la recombinación homóloga de acuerdo con un método en el que se utiliza ADN de cadena lineal.

Específicamente, se incorpora un ADN de cadena lineal que contiene un gen en el cual se va a introducir una deleción, sustitución o adición de nucleótidos en una célula para ocasionar la recombinación homóloga entre el ADN cromosómico y el ADN de cadena lineal introducido. Este método es aplicable a cualquiera de los microorganismos susceptibles de incorporar eficazmente un ADN de cadena lineal. Los microorganismos preferidos son aquellos pertenecientes a los géneros Escherichia y Bacillus. Se prefiere Escherichia coli, y se prefiere adicionalmente Escherichia coli que expresa un grupo de proteínas recombinantes derivadas del fago λ (sistema de recombinación Red).

Un ejemplo de Escherichia coli que expresa el sistema de recombinación Red de λ es Escherichia coli JM101 que porta pKD46, que es un ADN plasmídico que comprende un gen del sistema de recombinación Red de λ (asequible de Escherichia coli Genetic Stock Center, Yale University, EEUU).

Los ejemplos de los ADN útiles para la recombinación homóloga son los siguientes:

1.: (a) ADN de cadena lineal en el cual están presentes en ambos extremos los ADN que tienen homología con los ADN presentes en el exterior de una región del ADN cromosómico que va a ser sometido a la introducción de una deleción, sustitución o adición de nucleótidos de un gen de resistencia a fármacos;

2.: (b) ADN de cadena lineal en el cual los ADN que tienen homología con los ADN presentes en el exterior de una región de ADN cromosómico que va a ser sometido a introducción de una deleción, sustitución o adición de nucleótidos están ligados directamente entre sí:

3.: (c) ADN de cadena lineal que tiene un gen de resistencia a fármacos y un gen que se puede utilizar para la selección negativa y en el cual los ADN que tienen homología con los ADN presentes en el exterior de una región de ADN cromosómico que se va a someter a introducción de una deleción, sustitución o adición de nucleótidos están presentes en ambos extremos; y

4.: (d) ADN de cadena lineal del apartado (a) anterior en el cual se encuentra adicionalmente presente una secuencia de nucleótidos reconocida por la recombinasa Flp derivada de levadura [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 5875 (1985)] entre el gen de resistencia a fármacos y los ADN que tienen homología con los ADN presentes en el exterior de una región del ADN cromosómico.

En cuanto al gen de resistencia a fármacos, se puede utilizar cualquier gen de resistencia a fármacos que confiera resistencia a un fármaco al cual el microorganismo anfitrión muestre sensibilidad. Cuando se utiliza Escherichia coli como microorganismo anfitrión, los ejemplos de los genes de resistencia a fármacos son el gen de resistencia a kanamicina, el gen de resistencia a cloranfenicol, el gen de resistencia a gentamicina, el gen de resistencia a espectinomicina, el gen de resistencia a tetraciclina y el gen de resistencia a ampicilina.

El "gen que se puede utilizar para la selección negativa" hace referencia a un gen que es fatal para un microorganismo anfitrión en ciertas condiciones de cultivo cuando el gen es expresado en el microorganismo anfitrión. Los ejemplos de los genes son el gen sacB derivado de un microorganismo perteneciente al género Bacillus [Appl. Environ. Microbiol., 59, 1361-1366 (1993)] y el gen rpsL derivado de un microorganismo perteneciente al género Escherichia [Genomics, 72. 99104 (2001)].

Los ADN que tienen homología con los ADN presentes en el exterior de una región del ADN cromosómico que se va a someter a la introducción de una sustitución o deleción, que existe en ambos extremos de los ADN de cadena lineal anteriores, están localizados en la misma dirección que en el ADN cromosómico, y su longitud es preferiblemente de aproximadamente 10 pb a 100 pb, más preferiblemente aproximadamente 20 pb a 50 pb, y más preferiblemente aproximadamente de 30 pb a 40 pb.

La secuencia de nucleótidos reconocida por la recombinasa Flp derivada de levadura no está específicamente limitada con tal que ésta sea una secuencia de nucleótidos reconocida por dicha proteína y que catalice la recombinación homóloga. Los ejemplos preferidos son los ADN que tienen la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 54, y los ADN que tienen una secuencia de nucleótidos donde uno a varios nucleótidos son suprimidos, sustituidos o añadidos en el ADN mencionado y que tienen una secuencia de nucleótidos reconocida por la recombinasa Flp derivada de levadura y que cataliza la recombinación homóloga.

La expresión "que tiene homología" significa que el ADN de cadena lineal anterior tiene tal grado de homología que permite la aparición de recombinación homóloga entre la región sujeto del ADN cromosómico y el ADN de cadena lineal, específicamente, una homología de 80% o más, preferiblemente una homología de 90% o más, más preferiblemente una homología de 95% o más, más preferiblemente una homología de 100%.

La homología entre las secuencias de nucleótidos se puede determinar utilizando programas tales como BLAST y FASTA descritos antes.

El ADN de cadena lineal anterior se puede preparar mediante PCR. El ADN de cadena lineal deseado también se puede obtener construyendo ADN que contiene el ADN de cadena lineal anterior en un plásmido y llevando a cabo después un tratamiento con enzimas de restricción.

Los ejemplos de los métodos para introducir una deleción, sustitución o adición de nucleótidos en el ADN cromosómico de un microorganismo incluyen los siguientes Métodos 1 a 4.

Metódo 1:

Un método que comprende introducir el ADN de cadena lineal de los apartados (a) o (d) anteriores en un microorganismo anfitrión y seleccionar un transformante que porta el ADN de cadena lineal insertado en su ADN cromosómico mediante recombinación homóloga utilizando la resistencia a fármacos como marcador.

Método 2:

Un método que comprende introducir el ADN de cadena lineal del apartado (b) anterior en el transformante obtenido de acuerdo con el Método 1 anterior y eliminar el gen de resistencia a fármacos insertado en su ADN

cromosómico suprimir microorganismo.: mediante una región el Método del ADN 1 para crom sustituir o osómico del

Método 3:

Un método que comprende:

[1] introducir el ADN de cadena lineal del apartado

(c) anterior en un microorganismo anfitrión y seleccionar un transformante que porta el ADN de cadena lineal insertado en su ADN cromosómico mediante recombinación homóloga utilizando la resistencia a fármacos como marcador;

[2] sintetizar ADN ligando los ADN que tienen homología con los ADN presentes en el exterior de una región del ADN cromosómico que va a ser sometida a la introducción de una sustitución o deleción en la misma dirección que el ADN cromosómico, e introducir el ADN sintetizado en el transformante obtenido en el apartado [1] anterior; y

[3] cultivar el transformante sometido a la operación del apartado [2] anterior en condiciones tales que el gen que se pueda utilizar para la selección negativa sea expresado, y seleccionar una cepa capaz de crecer mediante cultivo como cepa en la cual se eliminan el gen de resistencia a fármacos y el gen que se puede utilizar para la selección negativa del ADN cromosómico.

Método 4:

Un método que comprende:

[1] introducir el ADN de cadena lineal del apartado

(d) anterior en un microorganismo anfitrión y seleccionar un transformante que porta el ADN de cadena lineal insertado en su ADN cromosómico mediante recombinación homóloga utilizando la resistencia a fármacos como marcador; y

[2] introducir un plásmido de expresión del gen de recombinasa Flp en el transformante obtenido en el apartado [1] anterior, y tras la expresión del gen, obtener una cepa sensible al fármaco utilizado en el apartado [1] anterior.

En los métodos anteriores, la introducción del ADN de cadena lineal en un microorganismo anfitrión se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los métodos para introducir ADN en el microorganismo, por ejemplo, el método que utiliza iones calcio [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], el método del protoplasto (Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada Núm. 248394/88) y la electroporación [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)].

Utilizando un ADN de cadena lineal en el cual se

incorpora un gen arbitrario que va a ser insertado en el ADN cromosómico en la porción central del ADN de cadena lineal utilizado en el Método 2 o el Método 3 [2], es posible eliminar el gen de resistencia a fármacos y al mismo tiempo insertar un gen arbitrario en el ADN cromosómico.

Los Métodos 2 a 4 anteriores son métodos que no dejan obtener finalmente genes foráneos tales como un gen de resistencia a fármacos y un gen utilizable para la selección negativa sobre el ADN cromosómico del transformante. Por lo tanto, es posible producir fácilmente un microorganismo que tenga deleciones, sustituciones o adiciones de nucleótidos en dos o más regiones diferentes del ADN cromosómico repitiendo las operaciones de los Métodos 1 y 2, el Método 3 [1] a [3], y el Método 4 [1] y [2] utilizando el mismo gen de resistencia a fármacos y el mismo gen utilizable para la selección negativa.

(vi) Procedimiento para Producir un Dipéptido de laPresente Invención

Se puede producir un dipéptido cultivando en un medio un microorganismo obtenido mediante los métodos de los apartados (iii) y (v) anteriores, permitiendo que el dipéptido se forme y se acumule en el cultivo, y recuperando el dipéptido del cultivo.

El cultivo del microorganismo en el medio se puede llevar a cabo de acuerdo con un método común utilizado para el cultivo de microorganismos.

Esto es, se puede utilizar cualquiera de los medios naturales y sintéticos con tal que contenga fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, etc. que pueden ser asimilados por el microorganismo y es un medio adecuado para el cultivo eficaz del microorganismo.

El medio no contiene necesariamente aminoácidos que constituyen el dipéptido deseado; sin embargo, algunos de los medios naturales y medios para cultivar una cepa que requiere un aminoácido contienen dichos aminoácidos. El medio utilizado en el procedimiento de producción de la presente invención puede contener un aminoácido en una cantidad requerida para el crecimiento de un microorganismo utilizado en la presente invención. Esto es, la cantidad de aminoácido contenida en un medio corriente es muy pequeña en comparación con la del aminoácido producido por el microorganismo utilizado en el procedimiento de producción de la presente invención y la presencia del aminoácido contenido en un medio corriente no afecta a la cantidad de dipéptido producido por la presente invención: por consiguiente, el medio utilizado en el procedimiento de producción de la presente invención puede contener el aminoácido en semejante cantidad.

Por ejemplo, un medio natural utilizado en la presente invención puede contener el aminoácido normalmente en una cantidad de menos de 2,5 g/l, preferiblemente 0,5 g/l o menos, más preferiblemente 0,1 g/l o menos, más preferiblemente 20 mg/l o menos, y un medio sintético puede contener el aminoácido normalmente en una cantidad de 1 g/l o menos, preferiblemente 50 mg/l

o menos, más preferiblemente 1 mg/l o menos, más preferiblemente 0,5 mg/l o menos. Cuando se produce un dipéptido que consiste en dos clases diferentes de aminoácidos de acuerdo con el procedimiento de producción de la presente invención y el microorganismo utilizado tiene la capacidad de producir solamente uno de los aminoácidos que constituyen el dipéptido, el otro aminoácido que no puede ser producido por el microorganismo puede ser añadido al medio utilizado en la presente invención. En este caso, el aminoácido se añade normalmente en una cantidad de 0,5 g/l a 100 g/l, preferiblemente 2 g/l a 50 g/l.

En cuanto a las fuentes de carbono, se puede utilizar cualquiera de las fuentes de carbono que pueden ser asimiladas por el microorganismo. Los ejemplos de las fuentes de carbón adecuadas incluyen carbohidratos tales como glucosa, fructosa, sacarosa, melazas que los contienen, almidón y producto hidrolizado de almidón; ácidos orgánicos tales como ácido acético y ácido propiónico; y alcoholes tales como etanol y propanol.

En cuanto a las fuentes de nitrógeno, se pueden utilizar amoníaco, sales de amonio de ácidos orgánicos o inorgánicos tales como cloruro de amonio, sulfato de amonio, acetato de amonio y fosfato de amonio, y otros compuestos que contienen nitrógeno así como peptona, extracto de carne, extracto de levadura, aguas de infusión de maíz, producto hidrolizado de caseína, torta de soja, producto hidrolizado de torta de soja, y diferentes células microbianas fermentadas y sus productos digeridos.

Los ejemplos de las sales inorgánicas incluyen dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato de dipotasio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro de sodio, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, sulfato de cobre y carbonato de calcio.

El cultivo se lleva a cabo normalmente en condiciones aerobias, por ejemplo, en cultivo con sacudimiento o cultivo celular con agitación centrífuga con aireación. La temperatura de cultivo es preferiblemente de 15 a 40°C, y el período de cultivo es normalmente de 5 horas a 7 días. El pH se mantiene de 3,0 a 9,0 durante el cultivo. El ajuste del pH se lleva a cabo utilizando un ácido orgánico o inorgánico, una solución de álcali, urea, carbonato de calcio, amoníaco, etc.

Si fuera necesario, se pueden añadir antibióticos tales como ampicilina y tetraciclina al medio durante el cultivo.

Cuando se cultiva un microorganismo transformado con un vector de expresión que comprende un promotor inducible, se puede añadir un inductor al medio, si fuera necesario. Por ejemplo, en el caso de un microorganismo transformado con un vector de expresión que comprende el promotor lac, se puede añadir al medio isopropil-β-Dtiogalactopiranósido o similar al medio; y en el caso de un microorganismo transformado con un vector de expresión que comprende el promotor trp, ácido indolacrílico o similar.

Los dipéptidos producidos mediante el procedimiento anterior incluyen dipéptidos en los cuales una o dos clases de aminoácidos están conectadas por el enlace α. Se prefieren aquellos en los que los aminoácidos son Laminoácidos o glicina. Son más preferidos aquellos representados por la fórmula (I):

R1 -R2 (I)

(donde R1 yR2, que pueden ser iguales o diferentes, representan cada uno un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L-alanina (L-Ala), L-glutamina (L-Gln), ácido L-glutámico (L-Glu), glicina (Gly), L-valina (L-Val), L-leucina (L-Leu), L-isoleucina (L-Ile), L-prolina (L-Pro), L-fenilalanina (L-Phe), L-triptófano (L-Trp), Lmetionina (L-Met), L-serina (L-Ser), L-treonina (L-Thr), L-cisteína (L-Cys), L-asparagina (L-Asn), L-tirosina (L-Tyr), L-lisina (L-Lys), L-arginina (L-Arg), L-histidina (L-His), ácido L-aspártico (L-Asp), ácido L-αaminobutírico (L-α-AB), L-4-hidroxiprolina (L-4-HYP), L3-hidroxiprolina (L-3-HYP), L-ornitina (L-Orn) y Lcitrulina (L-Cit). Son adicionalmente preferidos los dipéptidos donde R1 es L-Ala, Gly, L-Met, L-Ser o L-Thr y R2 es L-Gln, L-Glu, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro. L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, L-α-AB, L-4-HYP, L-3-HYP, L-Orn

o L-Cit. Son particularmente preferidos los dipéptidos: dipéptidos donde R1 es L-Ala y R2 es L-Gln, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-α-AB o L-Cit; dipéptidos donde R1 es Gly y R2 es L-Gln, Gly, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, Lα-AB o L-Cit: dipéptidos donde R1 es L-Met y R2 es L-Phe, L-Met, L-Cys, L-Tyr, L-Lys o L-His; dipéptidos donde R1 es L-Ser y R2 es L-Gln, Gly, L-Phe, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Tyr, L-His o L-α-AB; dipéptidos donde R1 es L-Thr y R2 es L-Gln, L-Leu, L-Phe, L-Met, L-Ser, L-Thr o L-α-AB; dipéptidos donde R1 es L-Gln y R2 es L-Phe o L-α-AB; un dipéptido donde R1 es L-Phe y R2 es L-Gln; un dipéptido donde R1 es L-Trp y R2 es Gly; dipéptidos donde R1 es L-Cys y R2 es L-Ala, L-Gln, Gly o L-Met; dipéptidos donde R1 es L-Lys y R2 es L-Ala, Gly o L-Met; un dipéptido donde R1 es L-Arg y R2 es L-α-AB; un dipéptido donde R1 es L-His y R2 es L-Met; y dipéptidos donde R1 es L-α-AB y R2 es L-Ala, L-Gln, Gly, L-Ser, L-Thr, L-Arg o L-α-AB. Son muy preferidos L-alanil-L-alanina (L-Ala-L-Ala), Lalanil-L-glutamina (L-Ala-L-Gln), L-alanil-L-fenilalanina (L-Ala-L-Phe), L-treonil-L-fenilalanina (L-Thr-L-Phe), Lalanil-L-tirosina(L-Ala-L-Tyr), L-Alanil-L-metionina (L-Ala-L-Met), L-Alanil-L-valina(L-Ala-L-Val), L-Alanil-Lisoleucina(L-Ala-L-Ile), L-Alanil-L-Leucina(L-Ala-L-Leu) y L-Serinil-L-fenilalanina (L-Ser-L-Phe).

La recuperación del dipéptido formado y acumulado en el cultivo se puede llevar a cabo mediante métodos comunes utilizando carbón activo, resinas de intercambio iónico, etc. o mediante medios tales como la extracción con un disolvente orgánico, la cristalización, la cromatografía en capa fina y la cromatografía de líquidos de alta resolución.

El método para obtener ADN que codifica una proteína que tiene actividad formadora de dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos y similares se ilustra en los siguientes ejemplos experimentales, pero el método para obtener el ADN y similares no está limitado a los siguientes ejemplos experimentales.

Ejemplo Experimental 1

Búsqueda de una Proteína que tiene Actividad Sintetizadora del Dipéptido Utilizando una Base de Datos

Utilizando, como problema, la secuencia de aminoácidos del gen de la D-Ala-D-Ala ligasa derivada de Bacillus subtilis 168 [Nature, 390, 249-256 (1997)], se llevó a cabo una búsqueda de un gen que codifica una proteína que tiene homología que está presente en las secuencias de ADN genómico de Bacillus subtilis 168 utilizando la función de búsqueda de la homología de Subtilist (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/) que es una base de datos del ADN genómico de Bacillus subtilis

168.

De las secuencias obtenidas como resultado de la búsqueda, se excluyeron los genes que codifican las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NOS: 33, 34 y 35 que son motivos de D-Ala-D-Ala ligasa [Biochemistry, 30, 1673 (1991)] y que codifican proteínas cuya función ya había sido aclarada. De las secuencias restantes, se seleccionó la secuencia que mostraba la homología más alta (2,1%) con el motivo de la D-Ala-D-Ala como gen de función desconocida, ywfE.

La secuencia de nucleótidos del gen ywfE se muestra en el SEQ ID NO: 9, y la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos se muestra en el SEQ ID NO: 1.

Ejemplo Experimental 2

Construcción de una Cepa que Expresa el gen ywfE

Basándose en la información de la secuencia de nucleótidos obtenida en el Ejemplo Experimental 1, se obtuvo un fragmento del gen ywfE de Bacillus subtilis de la siguiente manera.

Esto es, se inoculó Bacillus subtilis 168 (ATCC 23857) en medio LB [10 g/l de Bacto-triptona (Difco), 5 g/l de extracto de levadura (Difco) y 5 g/l de cloruro de sodio] y se sometió a cultivo estático durante la noche a 30°C. Después de cultivar, el ADN cromosómico del microorganismo se aisló y se purificó de acuerdo con el método en el que se utiliza fenol saturado descrito en

Current Protocols in Molecular Biology.

Utilizando un sintetizador de ADN (Modelo 8905, PerSeptive Biosystems, Inc.), se sintetizaron los ADN que tenía las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 19 a 22 (referidas en adelante como cebador A, cebador B, cebador C y cebador D, respectivamente). El cebador A tiene una secuencia en la que se añade una secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia de reconocimiento de XhoI al extremo 5' de una región del ADN cromosómico de Bacillus subtilis que contiene el codón de iniciación del gen ywfE. El cebador B tiene una secuencia en la que se añade una secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia de reconocimiento de BamHI al extremo 5' de una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia que contiene el codón de terminación del gen ywfE. El cebador C tiene una secuencia en la que se añade una secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia de reconocimiento de EcoRI al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos de la región promotora de trp del vector de expresión pTrS30 que contiene el promotor trp [preparado a partir de Escherichia coli JH109/pTrS30 (FERM BP-5407)]. El cebador D tiene una secuencia en la que se añade una secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia de reconocimiento de XhoI al extremo 5' de una secuencia complementaria a la secuencia de la región promotora trp de un vector de expresión pTrS30 que contiene el promotor trp.

Se amplificó un fragmento del gen ywfE mediante PCR utilizando el cebador A y el cebador B anteriores, y el ADN cromosómico de Bacillus subtilis como molde. Se amplificó un fragmento de la región promotora trp mediante PCR utilizando el cebador C y el cebador D, y pTrS30 como molde. La PCR se llevó a cabo mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, reacción a 55°C durante 2 minutos y reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprendía 0,1 µg del ADN cromosómico o 10 ng de pTrS30 como molde, 0,5 µmol/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa de Pfu (Stratagene), 4 µl de tampón para ADN polimerasa de Pfu (10 x) (Stratagene) y 200 µmol/l de cada uno de los dNTP (dATP, dGTP, dCTP y dTTP).

Se sometió un décimo de cada una de las mezclas de reacción resultantes a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que un fragmento de ADN de aprox. 1,4 kb correspondiente al fragmento del gen ywfE y un fragmento de ADN de aprox. 0,3 kb correspondiente al fragmento de la región promotora trp se habían amplificado respectivamente en la PCR que utilizaba el cebador A y el cebador B y la PCR que utilizaba el cebador C y el cebador D. Después, la mezcla de reacción resultante se combinó con una cantidad igual de fenol/cloroformo (1 vol/l vol) saturada con TE [10 mmoles/l de Tris-HCl (pH 8,0), 1 mmol/l de EDTA]. La solución resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con un volumen el doble de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó para precipitar el ADN, y el ADN obtenido se disolvió en 20 µl de TB.

Las soluciones obtenidas de este modo (5 µl de cada una) se sometieron respectivamente a reacción para escindir el ADN amplificado utilizando el cebador A y el cebador B con las enzimas de restricción XhoI y BamHI y a reacción para escindir el ADN amplificado utilizando el cebador C y el cebador D con las enzimas de restricción BcoRI y XhoI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperaron respectivamente un fragmento de 1,4 kb que contenía un gen ywfE y un fragmento de 0,3 kb que contenía la región promotora trp utilizando el Kit GENECLEAN II (BIO 101).

El vector de expresión pTrS30 que contenía el promotor trp [preparado a partir de Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)] (0,2 µg) se escindió con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se recuperó un fragmento de ADN de 4,5 kb de la misma manera que antes.

El fragmento de 1,4 kb que contenía el gen ywfE, el fragmento de 0,3 kb que contenía la región promotora trp y el fragmento de ADN de 4,5 kb obtenido antes se sometieron a ligación utilizando un kit de ligación (Takara Bio Inc.) a 16°C durante 16 horas.

Se transformó Escherichia coli NM522 (Stratagene) utilizando la mezcla de reacción de acuerdo con el método en el que se utilizan iones calcio [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], se diseminó sobre un medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C.

Se extrajo un plásmido de una colonia del transformante que creció en el medio de acuerdo con un método conocido y se analizó la estructura del plásmido utilizando enzimas de restricción, por medio de lo cual se confirmó que se había obtenido el vector de expresión pPE43 que contenía el gen ywfE ligado aguas abajo del promotor trp (Fig. 1).

Ejemplo Experimental 3

Producción de un Dipéptido

Se inoculó Escherichia coli NM522 que portaba pPE43 (Escherichia coli NM522/pPE43) obtenida en el Ejemplo Experimental 2 en 8 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo, y se cultivó a 28°C durante 17 horas. El cultivo resultante se centrifugó para obtener células húmedas.

Se preparó una mezcla de reacción (0,1 ml) que comprendía 60 mg/ml (concentración final) de células húmedas, 120 mmoles/l de tampón fosfato de potasio (pH 7,4), 60 mmoles/l de cloruro de magnesio, 60 mmoles/l de ATP, 30 mmoles/l de L-Ala, 30 mmoles/l de L-Gln y 0,4% Nymeen S-215, y la reacción se llevó a cabo a 37°C durante 3 minutos.

Una vez completada la reacción, se derivatizó el producto de reacción mediante el método del dinitrofenol y después se analizó mediante HPLC. El análisis mediante HPLC se llevó a cabo utilizando, como columna de separación, una columna Lichrosorb-RP-18 (Kanto Kagaku) y, como eluyente ácido fosfórico al 1% (v/v) y acetonitrilo al 25% (v/v) a una velocidad de flujo de 0,7 ml/min. Como resultado, se confirmó que se habían formado 120 mg/l de L-alanil-L-glutamina (L-Ala-L-Gln) y se habían acumulado en la mezcla de reacción.

La formación de L-Ala-L-Gln no se observó cuando la reacción se llevó a cabo utilizando células de Escherichia coli NM522/pTrS30, que es una cepa de control que porta solamente un vector.

Ejemplo Experimental 4

Purificación de Dipéptido Sintetasa Recombinante Etiquetada con His C-Terminal

Utilizando el sintetizador de ADN anterior, se sintetizaron ADN que tenían las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 23 y 24 (referidas en adelante como cebador E y cebador F, respectivamente). El cebador B tiene una secuencia de nucleótidos que contiene una región donde el codón de iniciación del gen ywfE (atg) es sustituido por la secuencia de reconocimiento de NcoI (ccatgg). El cebador F tiene una secuencia de nucleótidos que contiene una región donde el codón de terminación del gen ywfE es sustituido por la secuencia de reconocimiento de BamHI (ggatcc).

La PCR se llevó a cabo utilizando el ADN cromosómico de Bacillus subtilis 168 (ATCC 23857) como molde y el cebador E y el cebador F anteriores como grupo de cebadores. Esto es, se llevó a cabo la PCR mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprendía 0,1 µg del ADN cromosómico, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200 µmol/l cada uno de los dNTP.

Un décimo de la mezcla de reacción resultante se sometió a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado un fragmento de aprox. 1,4 kb correspondiente al fragmento del gen ywfE. Después, la mezcla de reacción restante se mezcló con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE. La solución resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con dos veces el volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó, y el producto precipitado de ADN obtenido se disolvió en 20 µl de TE.

La solución obtenida de este modo (5 µl) se sometió a reacción para escindir el ADN amplificado con las enzimas de restricción NcoI y BamHI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 1,4 kb que contenía el gen ywfE utilizando el kit GENECLEAN II.

Se escindió el vector de expresión recombinante etiquetado con His C-terminal pQE60 (Qiagen, Inc.) (0,2 µg) con las enzimas de restricción NcoI y BamHI. Se separaron los fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 3,4 kb de la misma manera que antes.

El fragmento de ADN de 1,4 kb que contenía el gen ywfE y el fragmento de ADN de 3,4 kb obtenido antes se sometieron a una reacción de ligación utilizando un kit de ligación a 16°C durante 16 horas.

Se transformó Escherichia coli NH522 utilizando la mezcla de reacción de ligación de acuerdo con el método en el que se utilizaban iones calcio, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml ampicilina, y cultivo durante la noche a 30°C.

Se extrajo un plásmido de una colonia del transformante que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido y se analizó la estructura del plásmido utilizando las enzimas de restricción, por medio de lo cual se confirmó que se había obtenido pQE60ywfE, que es un vector de expresión del gen ywfE etiquetado con His C-terminal (Fig. 2).

Se inoculó Escherichia coli NM522 que portaba pQE60ywfE (Escherichia coli NM522/pQE60ywfE) en 8 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo, y se cultivó a 28°C durante 17 horas. El cultivo resultante se inoculó en 50 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina en un matraz Erlenmeyer de 250-ml, y se cultivó a 30°C durante 3 horas. Después, se añadió isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) para dar una concentración final de 1 mmol/l, seguido de cultivo adicional a 30°C durante 4 horas. El cultivo resultante se centrifugó para obtener células húmedas, y la enzima recombinante etiquetada con His se purificó de las células húmedas utilizando HisTrap (kit de purificación de proteínas etiquetadas con His, Amersham Pharmacia Biotech) de acuerdo con las instrucciones adjuntas.

Ejemplo Experimental 5

Producción de Dipéptidos Utilizando la Enzima Recombinante Etiquetada con His (1)

(i): Se preparó una mezcla de reacción (0,1 ml) que comprendía 0,04 mg de la enzima recombinante etiquetada con His purificada obtenida en el Ejemplo Experimental 4, 100 mmoles/l de Tris-HCl (pH 8,0), 60 mmoles/l de cloruro de magnesio, 60 mmoles/l de ATP, 30 mmoles/l de L-Ala y 30 mmoles/l de L-Gln, y la reacción se llevó a cabo a 37°C durante 16 horas. Una vez completada la reacción, se analizó el

producto de reacción como en el Ejemplo Experimental 3 anterior, por medio de lo cual se confirmó que se habían formado 3,7 g/l de L-Ala-L-Gln y 0,3 g/l de L-alanil-L-alanina (L-Ala-L-Ala) y que se acumulaban en la mezcla de reacción.

(ii): Las reacciones se llevaron a cabo en las mismas condiciones que en el apartado (i) anterior utilizando mezclas de reacción que tenían la misma composición que la de la mezcla de reacción del apartado (i) anterior excepto que se utilizaron 0,01 mg de la enzima y L-Phe, L-Met, L-Leu y L-Val, respectivamente, en lugar de L-Gln. Una vez completadas las reacciones, se analizaron los productos de reacción de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 3 anterior, por medio de lo cual se confirmó que se habían formado los siguientes dipéptidos y que se acumulaban en las respectivas mezclas de reacción: 7,0 g/l de Lalanil-L-fenilalanina (L-Ala-L-Phe) sola: 7,0 g/l de L-alanil-L-metionina (L-Ala-L-Met) y 0,03 g/l de L-Ala-L-Ala; 5,0 g/l de L-alanil-L-leucina (L-Ala-L-Leu) y 0,2 g/l de L-Ala-L-Ala; y 1,6 g/l de Lalanil-L-valina (L-Ala-L-Val) y 0,3 g/l de L-Ala-L-Ala.

(iii) Las reacciones se llevaron a cabo en las mismas condiciones que en el apartado (i) anterior utilizando mezclas de reacción que tenían la misma composición que la de la mezcla de reacción del apartado (i) anterior excepto que se utilizaron 0,01 mg de la enzima, se utilizó Gly en lugar de L-Ala, y se utilizaron L-Phe y L-Met, respectivamente, en lugar de L-Gln.

Una vez completadas las reacciones, se analizaron los productos de reacción de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 3 anterior, por medio de lo cual se confirmó que se habían formado 5,2 g/l de glicil-Lfenilalanina (Gly-L-Phe) y 1,1 g/l de glicil-L-metionina (Gly-L-Met) y que se acumulaban en las respectivas mezclas de reacción.

Cuando se excluyó ATP de las composiciones de las mezclas de reacción anteriores, no se formó ningún dipéptido.

Los resultados anteriores revelaron que el producto del gen ywfE tiene actividad productora, en presencia de ATP, de los siguientes dipéptidos: L-Ala-L-Gln plus L-Ala-L-Ala, L-Ala-L-Phe, L-Ala-L-Met plus L-Ala-L-Ala, L-Ala-L-Leu plus L-Ala-L-Ala, o L-Ala-L-Val plus L-Ala-L-Ala a partir de L-Ala plus L-Gln, L-Phe, L-Met, L-Leu o L-Val; y Gly-L-Phe o Gly-L-Met a partir de Gly plus L-Phe

o L-Met.

Ejemplo Experimental 6

Producción de Dipéptidos Utilizando la Enzima Recombinante Etiquetada con His (2)

Se preparó una mezcla de reacción (0,1 ml) que comprendía 0,04 mg de la enzima recombinante etiquetada con His purificada obtenida en el Ejemplo Experimental 4, 100 mmoles/l de Tris-HCl (pH 8,0), 60 mmoles/l de cloruro de magnesio y 60 mmoles/l de ATP. A esta mezcla se le añadieron respectivamente combinaciones de diferentes Laminoácidos, Gly y β-Ala seleccionados entre los aminoácidos mostrados en la primera fila de la Tabla 1 y en la columna más a la izquierda de la Tabla 1 para dar una concentración de 30 mmoles/l de cada una, y las mezclas resultantes se sometieron a reacción a 37°C durante 16 horas. Una vez completadas las reacciones, se analizaron los productos de reacción mediante HPLC, por medio de lo cual se confirmó que se habían formado los dipéptidos mostrados en la Tabla 1.

Tabla 1-1

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Tabla 1-2

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5

10

Tabla 1-3

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Los dipéptidos formados por medio de la reacción

5 utilizando, como sustratos, dos (o una) clases de Laminoácidos, Gly y β-Ala mostrados en la primera fila y la columna más a la izquierda de la Tabla 1 se muestran en las respectivas celdas de la tabla. En la tabla, ○ significa que se formaba un dipéptido aunque su secuencia

10 no estaba identificada; × significa que la formación de dipéptido no estaba confirmada; y una celda en blanco significa que no se llevó a cabo la reacción.

Ejemplo Experimental 7

15 Producción de un Dipéptido Utilizando una Cepa queExpresa la Enzima Recombinante Etiquetada con His

Se inoculó Escherichia coli NM522/pQE60ywfE obtenida en el Ejemplo Experimental 4 en 8 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo, y se cultivó a 28°C durante 17 horas. El cultivo resultante se inoculó en 50 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, y se cultivó a 30°C durante 3 horas. Después, se añadió IPTG para dar una concentración final de 1 mmol/l, seguido de cultivo adicional a 30°C durante 4 horas. El cultivo resultante se centrifugó para obtener células húmedas.

Se colocó una mezcla de reacción (20 ml, pH 7,2) que comprendía 200 g/l de célula húmedas, 50 g/l de glucosa, 5 g/l de ácido fítico (diluido hasta la neutralidad con solución de hidróxido de sodio conc. al 33%), 15 g/l de dihidrogenofosfato de potasio, 5 g/l de sulfato de magnesio heptahidratado, 4 g/l de Nymeen S-215, 10 ml/l de xileno, 200 mmoles/l de L-Ala y 200 mmoles/l de L-Gln en un vaso de precipitados de 50 ml, y se llevó a cabo la reacción a 32°C a 900 rpm durante 2 horas. Durante la reacción, se mantuvo el pH de la mezcla de reacción a 7,2 utilizando 2 moles/l de hidróxido de potasio.

El producto de reacción se analizó mediante el mismo método que en el Ejemplo Experimental 3, por medio de lo cual se confirmó que se habían acumulado 25 mg/l de L-Ala-L-Gln.

Ejemplo Experimental 8

Clonación de los Genes Correspondientes al Gen ywfE de Diferentes Microorganismos del Género Bacillus y Análisisde los Mismos

Basándose en la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 9, se obtuvieron los genes correspondientes al gen ywfE que existe en Bacillus subtilis ATCC 15245, ATCC 6633. IAM 1213, IAM 1107, IAM 1214, ATCC 9466, IAM 1033 y ATCC 21555, Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 y Bacillus pumilus NRRL B-12025 de la siguiente manera.

Esto es, se inocularon respectivamente Bacillus subtilis ATCC 15245, ATCC 6633, IAM 1213, IAM 1107, IAM 1214, ATCC 9466, IAM 1033 y ATCC 21555, Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 y Bacillus pumilus NRRL B12025 en medio LB y se sometieron a cultivo estático durante la noche a 30°C. Después de cultivar, se aislaron los ADN cromosómicos de los respectivos microorganismos y se purificaron de acuerdo con el método en el que se utiliza fenol saturado descrito en Current Protocols in Molecular Biology.

Utilizando un sintetizador de ADN (Modelo 8905, PerSeptive Biosystems. Inc.), se sintetizaron los ADN que tenían las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 25 y 26 (referidas en adelante como cebador G y cebador H, respectivamente). El cebador G tiene una secuencia que contiene una región aguas arriba del codón de iniciación del gen ywfE en el ADN cromosómico de Bacillus subtilis 168, y el cebador H tiene una secuencia complementaria a una secuencia que contiene una región aguas abajo del codón de terminación del gen ywfE.

Se llevo a cabo la PCR utilizando cada uno de los ADN cromosómicos de Bacillus subtilis ATCC 15245, ATCC 6633, IAM 1213, IAM 1107, IAM 1214, ATCC 9466, IAM 1033 y ATCC 21555 y Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 como molde y el cebador G y el cebador H anteriores como grupo de cebadores. Esto es, se llevó a cabo la PCR mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprende 0,1 µg del ADN cromosómico, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200 µmoles/l de cada uno de los dNTP.

Se sometió un décimo de cada una de las mezclas de reacción resultantes a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado un fragmento de aprox. 1,4 kb correspondiente al fragmento del gen ywfE. Después, se mezcló la mezcla restante con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE. La solución resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con el doble de volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó, y el producto precipitado de ADN obtenido se disolvió en 20 µl de TE.

Se sometieron cada uno de los fragmentos de ADN de 1,4 kb obtenidos de ese modo derivados de los ADN cromosómicos de las respectivas cepas y pCR-blunt (Invitrogen Corp.) a reacción de ligación utilizando un kit de ligación a 16°C durante 16 horas.

Se transformó Escherichia coli NM522 utilizando cada mezcla de reacción de ligación de acuerdo con el método en el que se utilizan iones calcio, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C.

Se extrajo un plásmido de una colonia de cada transformante que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido y se analizó la estructura de cada plásmido utilizando enzimas de restricción. Como resultado, se confirmó que se habían obtenido los siguientes plásmidos que contenían un gen correspondiente al gen ywfE: pYWFE1 (derivado de ATCC 15245, ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 36), pYWFE2 (derivado de ATCC 6633, ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 10), pYWFE3 (derivado de IAM 1213, ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 11), pYWFE4 (derivado de IAM 1107, ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 12), pYWFB5 (derivado de IAM 1214, ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 13), pYWFE6 (derivado de ATCC 9466, ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 9), pYWFE7 (derivado de IAM 1033, ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 36), pYWFE8 (derivado de ATCC 21555, ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 14) y pYWFE9 (derivado de IFO 3022, ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 15).

Por otra parte, se obtuvo un gen correspondiente al gen ywfE derivado de Bacillus pumilus NRRL B-12025 (ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 16) de la siguiente manera.

Se llevó a cabo la PCR utilizando el ADN cromosómico de la cepa NRRL B-12025 preparado antes como molde y los ADN que consistían respectivamente en las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 27 y 28 como grupo de cebadores. Esto es, se llevó a cabo la PCR mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 98°C durante 5 segundos, una reacción a 55°C durante 30 segundos y una reacción a 72°C durante un minuto, utilizando 50 µl de una mezcla de reacción que comprende 0,1 µg del ADN cromosómico, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de polimerasa Z-taq (Takara Bio Inc.), 5 µl de tampón para polimerasa Z-taq (10 x) (Takara Bio Inc.) y 200 µmoles/l de cada uno de los dNTP.

Se sometió un décimo de la mezcla de reacción resultante a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado un fragmento de aprox. 0,8 kb. Después, la mezcla de reacción restante se combinó con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE. La mezcla resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con el doble de volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó, y el producto precipitado de ADN obtenido se disolvió en 20 µl de TE.

Se sometieron el fragmento de ADN de 0,8 kb obtenido de este modo y pGEM T-easy (Promega Corp.) a reacción de ligación utilizando un kit de ligación durante 16 horas.

Se transformó Escherichia coli DH5α utilizando la mezcla de reacción de acuerdo con el método en el que se utilizan iones calcio, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µ/ml de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C.

Se extrajo un plásmido del transformante obtenido antes y se determinó la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN de aprox. 0,8 kb, por medio de lo cual se confirmó una secuencia desde los nucleótidos 358 a 1160 de la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO:

16.

El plásmido anterior fue escindido con EcoRI y sometido después a electroforesis en gel de agarosa para separar un fragmento de ADN. El fragmento de ADN se purificó utilizando el kit GENECLEAN II, y aprox. 0,5 µg del fragmento de ADN purificado se marcaron con DIG utilizando DIG-High Prime DNA Labeling & Detection Starter Kit I (Roche Diagnostics Corp.) de acuerdo con las instrucciones adjuntas.

Se llevó a cabo el análisis Southern del ADN cromosómico de la cepa NRRL B-12025 utilizando el ADN marcado con DIG obtenido antes.

El ADN cromosómico de la cepa NRRL B-12025 fue digerido completamente con BamHI, EcoRI, HindIII, KpnI, PstI, SacI, SalI y SphI, respectivamente, y se sometió a electroforesis en gel de agarosa para separar los fragmentos de ADN, seguido de transferencia a membrana de nailon de carga positiva (Roche Diagnostics Corp.) de acuerdo con un método común.

Después de fijar los fragmentos de ADN sobre la membrana de nailon mediante irradiación UV, se llevó a cabo la hibridación de Southern utilizando la sonda de ADN anterior y la membrana de nailon.

La hibridación se llevó a cabo poniendo en contacto la membrana de nailon con el ADN sonda a 65°C durante 16 horas, lavando la membrana de nailon dos veces con una solución que consistía en SDS al 0,1% y 2 x SSC a la temperatura ambiente durante 5 minutos, y lavando adicionalmente la membrana dos veces con una solución que consistía en SDS al 0,1% y 0,5 x SSC a 65°C durante 15 minutos. Las otras operaciones y condiciones y la detección del ADN hibridado se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones adjuntas al DIG-High Prime DNA Labeling & Detection Starter Kit I mencionado antes.

Como resultado, se observó el desarrollo de color en torno a 3,5 kpb de los fragmentos completamente digeridos con HindIII y PstI.

Con posterioridad, el ADN cromosómico de la cepa NRRL B-12025 fue completamente digerido con HindIII y PstI, respectivamente, y sometido a electroforesis en gel de agarosa para separar los fragmentos de ADN. A partir de los respectivos ADN digeridos con las enzimas de restricción, se purificaron fragmentos de 3-4 kpb utilizando GENECLEAN II Kit, seguido de autociclación utilizando un kit de ligación.

Basándose en la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN de 0,8 kb determinada antes, se diseñaron y sintetizaron las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 29 y 30, y se utilizaron en la PCR utilizando el ADN ciclado obtenido antes como molde. La PCR se llevó a cabo mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 98°C durante 5 segundos, una reacción a 55°C durante 30 segundos y una reacción a 72°C durante 3 minutos y 30 segundos, utilizando 50 µl de una mezcla de reacción que comprendía 10 ng del ADN ciclado, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de polimerasa pyrobest (Takara Bio Inc.), 5 µl de tampón para polimerasa pyrobest (10 x) (Takara Bio Inc.) y 200 µmoles/l de cada uno de los dNTP.

Se sometió un décimo de la mezcla de reacción resultante a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado un fragmento de aprox. 3,0 kb. Después la mezcla de reacción restante se combinó con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE. La mezcla resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con el doble de volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó, y el producto precipitado de ADN obtenido se disolvió en 20 µl de TE.

Se sometieron a una reacción de ligación el fragmento de ADN obtenido de este modo y Zero Blunt PCR Cloning Kit (Invitrogen Corp.) utilizando un kit de ligación.

Se transformó Escherichia coli NM522 utilizando la mezcla de reacción de acuerdo con el método en el que se utilizan iones calcio, se diseminó sobre un medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C.

Se extrajo un plásmido de una colonia del transformante que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido y la estructura del plásmido se analizó utilizando enzimas de restricción. Como resultado, se confirmó que se había obtenido el plásmido pYWFE10 (derivado de NRRL B-12025, ADN que tenía la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 16) que contenía un gen correspondiente al gen ywfE.

Las secuencias de nucleótidos de los genes correspondientes al gen ywfE que están contenidos respectivamente en los plásmidos pYWFE1 a pYWFE10 obtenidos antes fueron determinadas utilizando el Secuenciador de ADN 373A.

Las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por los genes contenidos respectivamente en pYWFE1, pYWFE6 y pYWPE7 eran idénticos a la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen ywfE, mientras aquellas proteínas codificadas por los genes contenidos respectivamente en pYWFE2, pYWFE3, pYWFE4, pYWFE5, pYWFE8, pYWFE9 y pYWFE10 eran diferentes de la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen ywfE.

Las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por los genes correspondientes al gen ywfE que están contenidas en pYWFE2, pYWFE3, pYWFE4, pYWFE5, pYWFE8, pYWFE9 y pYWFE10, y pYWFE1 y pYWFE7 se muestran en los SEQ ID NOS: 2 a 8 y 1, respectivamente, y las secuencias de nucleótidos de estos genes se muestran en los SEQ ID NOS: 10 a 16 y 36, respectivamente.

Ejemplo Experimental 9

Se llevó a cabo la PCR utilizando cada uno de los ADN cromosómicos de Bacillus subtilis ATCC 15245, ATCC 6633, IAM 1213, IAM 1107, IAM 1214, ATCC 9466, IAM 1033 y ATCC 21555 y Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 como molde y el cebador A y el cebador B descritos en el Ejemplo Experimental 2 como grupo de cebadores. Esto es, la PCR se llevó a cabo por medio de 30 ciclos, un ciclo que consistía en una a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprendía 0,1 µg del ADN cromosómico, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200 µmoles/l de cada uno de los dNTP.

Cuando se utilizó el ADN cromosómico de Bacillus pumilus NRRL B-12025 como molde, se llevó a cabo la PCR utilizando los DNA que tenían respectivamente las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 31 y 32 como grupo de cebadores en las mismas condiciones que antes.

Se sometió un décimo de cada una de las mezclas de reacción resultantes a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado un fragmento de ADN de aprox. 1,4 kb correspondiente al fragmento del gen ywfE. Después, la mezcla de reacción restante se combinó con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE. La mezcla resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con el doble de volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó, y el producto precipitado de ADN obtenido se disolvió en 20 µl de TE.

Cada una de las soluciones obtenidas de este modo (5 µl) se sometió a reacción para escindir el ADN amplificado con las enzimas de restricción NcoI y BamHI. Se separaron los fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 1,4 kb que contenía un gen correspondiente al gen ywfE utilizando el Kit GENECLEAN

II.

Con posterioridad, se escindieron 0,2 µg del vector de expresión recombinante etiquetado con His C-terminal pQE60 con las enzimas de restricción NcoI y BamHI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 3,4 kb de la misma manera que antes.

Se sometió cada uno de los fragmentos de ADN de 1,4 kb que contenían un gen correspondiente al gen ywfE de Bacillus subtilis 168 y el fragmento de ADN de 3,4 kb obtenido antes a una reacción de ligación utilizando un kit de ligación a 16°C durante 16 horas.

Se extrajo un plásmido de una colonia de cada transformante que había crecido sobre el medio de acuerdo con un método conocido y se analizó la estructura de cada plásmido utilizando enzimas de restricción. Como resultado, se confirmó que se habían obtenido los siguientes vectores de expresión del gen etiquetado con His C-terminal: pQE60ywfE1 (un vector que contenía el gen derivado de ATCC 15245), pQE60ywfE2 (un vector que contenía el gen derivado de ATCC 6633), pQE60ywfE3 (un vector que contenía el gen derivado de IAM 1213), pQE60ywfE4 (un vector que contenía el gen derivado de IAM 1107), pQE60ywfE5 (un vector que contenía el gen derivado de IAM 1214), pQE60ywfE6 (un vector que contenía el gen derivado de ATCC 9466), pQE60ywfE7 (un vector que contenía el gen derivado de IAM 1033), pQE60ywfE8 (un vector que contenía el gen derivado de ATCC 21555), pQE60ywfE9 (un vector que contenía el gen derivado de IFO 3022) y pQE60ywfE10 (un vector que contenía el gen derivado de NRRL B-12025).

Se inocularon respectivamente las cepas de Escherichia coli NM522/pQE60ywfE1 a NM522/pQE60ywfE10 obtenidas antes en 8 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo, y se cultivaron a 28°C durante 17 horas. Cada uno de los cultivos resultantes se inoculó en 50 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, y se cultivó a 30°C durante 3 horas. Después, se añadió IPTG para dar una concentración final de 1 mmol/l, seguido de cultivo adicional a 30°C durante 4 horas. El cultivo resultante se centrifugó para obtener células húmedas, y las enzimas recombinantes etiquetadas con His se purificaron a partir de las respectivas células húmedas utilizando HisTrap de acuerdo con las instrucciones adjuntas.

Ejemplo Experimental 10

Producción de Dipéptidos Utilizando Enzimas Purificadas

Se prepararon mezclas de reacción (0,1 ml cada una) que comprendían 0,04 mg de las respectivas enzimas recombinantes obtenidas en el Ejemplo Experimental 9, 100 mmoles/l de Tris-HCl (pH 8,0), 60 mmoles/l de cloruro de magnesio, 60 mmoles/l de ATP, 30 mmoles/l de L-Ala y 30 mmoles/l de L-Gln, y se llevaron a cabo las reacciones a 37°C durante 16 horas.

Una vez completadas las reacciones, las mezclas de reacción se analizaron mediante el método descrito en el Ejemplo Experimental 3, por medio de lo cual se confirmó que se habían formado y acumulado de 3,0 a 3,5 g/l de L-Ala-L-Gln y de 0,25 a 0,3 g/l de L-Ala-L-Ala.

Cuando se excluía ATP de las composiciones de las mezclas de reacción anteriores, no se formaban L-Ala-L-Gln ni L-Ala-L-Ala en absoluto.

Los resultados anteriores revelaron que todos los productos de los genes obtenidos en el Ejemplo Experimental 8 tienen actividad productora de L-Ala-L-Gln y L-Ala-L-Ala a partir de L-Ala y L-Gln en presencia de ATP.

Ejemplo Experimental 11

Adquisición del Gen albC y su Gen Análogo

El gen albC y su gen análogo se obtuvieron de Streptomyces noursei y Streptomyces albulus basándose en la secuencia de nucleótidos del gen albC de Streptomyces noursei [Chemistry & Biol., 9, 1355 (2002)] de la siguiente manera.

Se inocularon Streptomyces noursei IFO15452 y Streptomyces albulus IFO14147 en medio KM73 [2 g/l de extracto de levadura (Difco) y 10 g/l de almidón soluble (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] que contenía glicina al 1% y medio KP [15 g/l de glucosa, 10 g/l de glicerol, 10 g/l de polipeptona (Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), 10 g/l de extracto de carne (Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Ltd.) y 4 g/l de carbonato de calcio], respectivamente, y se sometieron a cultivo con sacudimiento durante la noche a 28°C. Streptomyces noursei IFO15452 y Streptomyces albulus IFO14147 fueron distribuidos por el National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Biological Resource Center (BRC) (2-58, Kazusakamatari, Kisarazu-shi. Chiba 292-0818 Japón).

Después de cultivar, se aislaron y purificaron los ADN cromosómicos de los respectivos microorganismos de acuerdo con el método descrito en Genetic Manipulation of Streptomyces: a Laboratory Manual: John Inne Foundation.

Basándose en la secuencia de nucleótidos del gen albC, se sintetizaron los ADN que tenían las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 41 y 42 (referidas en adelante como cebador J y cebador K, respectivamente) utilizando un sintetizador de ADN (Modelo 8905, PerSeptive Biosystems. Inc.). El cebador J tiene una secuencia en la que se añade una secuencia que contiene la secuencia de reconocimiento de NcoI al extremo 5' de una región que contiene el codón de iniciación del gen albC sobre el ADN cromosómico de Streptomyces noursei. El cebador K tiene una secuencia en la que se añade una secuencia que contiene la secuencia de reconocimiento de BglII al extremo 5' de una secuencia complementaria a una secuencia que contiene el codón de terminación del gen albC.

Se llevó a cabo la PCR utilizando cada uno de los ADN cromosómicos de Streptomyces noursei y Streptomyces albulus como molde y el cebador J y el cebador K anteriores como grupo de cebadores. Esto es, la PCR se llevó a cabo mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 30 segundos y una reacción a 72°C durante un minuto, utilizando 50 µl de una mezcla de reacción que comprendía 0,1 µg del ADN cromosómico como molde, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Ex Tag (Takara Bio Inc.), 5 µl de tampón para ADN polimerasa Ex Tag (10 x) (Takara Bio Inc.), 200 µmoles/l de cada uno de los dNTP y 5 µl de dimetilsulfóxido.

Se sometió un décimo de cada una de las mezclas de reacción resultantes a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado un fragmento de ADN de aprox. 0,7 kb. Después, la mezcla de reacción restante se mezcló con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE. La solución resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con el doble de volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó para precipitar el ADN, y el ADN obtenido se disolvió en 20 µl de TE.

Se sometió cada una de las soluciones obtenidas de este modo (5 µl) a reacción para escindir el ADN amplificado con las enzimas de restricción NcoI y BglII. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 700 pb utilizando el Kit GENECLEAN

II.

Con posterioridad, se escindieron 0,2 µg del vector de expresión pQE60 que contenía el promotor del fago T5 con las enzimas de restricción NcoI y BglII. Se separaron los fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 3,4 kb de la misma manera que antes.

Cada uno de los fragmentos de ADN de 0,7 kb derivados de actinomicetos y el fragmento de ADN de 3,4 kb derivado de pQE60 anterior se sometieron a reacción de ligación utilizando un kit de ligación a 16°C durante 16 horas.

Se transformó Escherichia coli NM522 utilizando cada una de las mezclas de reacción de acuerdo con el método en el que se utilizan iones calcio, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C.

Se extrajo un plásmido de una colonia de cada transformante que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido, y se analizó la estructura de cada plásmido utilizando enzimas de restricción. Como resultado, se confirmó que se habían obtenido el vector de expresión pAL-nou que contenía el ADN derivado de Streptomyces noursei en una posición aguas abajo del promotor del fago T5 y el vector de expresión pAL-alb que contenía el ADN derivado de Streptomyces albulus (Fig. 3).

La secuencia de nucleótidos de cada ADN derivado de actinomiceto insertado en el respectivo plásmido fue determinada utilizando un secuenciador de nucleótidos (373A DNA Sequencer), por medio de lo cual se confirmó que pAL-alb contenía ADN que codificaba una proteína que tenía la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 37, esto es, ADN que tenía la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 39, y pAL-nou contenía ADN que codificaba una proteína que tenía la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 38, esto es, ADN que tenía la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 40.

Ejemplo Experimental 12

Producción de Dipéptidos de Cadena Lineal mediante el Usode Células como Fuente de Enzima

Se inocularon respectivamente Escherichia coli NH522 que portaba pAL-nou o pAL-alb obtenidos en el Ejemplo Experimental 11 (Escherichia coli NM522/pAL-nou o NM522/pAL-alb) y Escherichia coli NM522 sin un plásmido en 10 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo (sin adición of ampicilina en el caso de una cepa que no portaba plásmido, en adelante se aplicará lo mismo), y se cultivaron a 30°C durante 17 horas. Se inoculó cada uno de los cultivos resultantes (0,5 ml) en 50 ml de medio LB en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se sometió a cultivo con sacudimiento a 30°C durante una hora. Después, se añadió IPTG para dar una concentración final de 1 mmol/l, seguido de un cultivo adicional durante 4 horas. El cultivo resultante se centrifugó para obtener las células húmedas.

Se preparó una mezcla de reacción (3,0 ml) que comprendía 100 mg/ml (concentración final) células húmedas, 60 mmoles/l de fosfato de potasio (pH 7,2), 10 mmoles/l de cloruro de magnesio, 10 mmoles/l de ATP, 1 g/l de L-Leu y 1 g/l de L-Phe, y se llevó a cabo la reacción a 30°C. Una hora después del inicio de la reacción, se tomaron muestras de la mezcla de reacción y se añadió acetonitrilo a esto a una concentración de 20% (v/v). Después, se analizó el producto de reacción obtenido mediante HPLC. Se llevó a cabo el análisis mediante HPLC utilizando una columna ODS-HA (YMC Co., Ltd.) como columna de separación y acetonitrilo al 30% (v/v) como eluyente a una velocidad de flujo de 0,6 ml/min, y midiendo la absorción ultravioleta a 215 nm.

Como resultado, se confirmó que se acumulaban 36,7 mg/l de ciclo(L-leucil-L-fenilalanina) [ciclo(L-Leu-L-Phe)] en la mezcla de reacción de Escherichia coli NM522/pAL-nou. No obstante, no se detectó ciclo(L-Leu-L-Phe) en la mezcla de reacción de Escherichia coli NM522. Se analizaron las mismas mezclas de reacción mediante HPLC en las siguiente condiciones para medir los dipéptidos de cadena lineal (en adelante "dipéptido de cadena lineal" es referido simplemente como "dipéptido") L-leucyl-L-fenilalanina (L-Leu-L-Phe) y L-fenilalanil-Lleucina (L-Phe-L-Leu).

Ambos dipéptidos fueron derivatizados mediante el método F-moc y después analizados mediante HPLC. El análisis HPLC se llevo a cabo utilizando ODS-HGS (Nomura Kagaku Co., Ltd.) como columna de separación y solución A (6 ml/l de ácido acético y acetonitrilo al 20% (v/v), pH ajustado a 4,8 con trietilamina) y solución B (6 ml/l de ácido acético y acetonitrilo al 70% (v/v), pH ajustado a 4,8 con trietilamina) como eluyentes a una velocidad de flujo de 0,6 ml/min, y detectando los dipéptidos a una longitud de onda de excitación de 254 nm y una longitud de onda de fluorescencia de 630 nm. La razón de solución A con respecto a solución B fue de 8:2 durante los primeros 5 minutos de elución y después de eso cambió a

1:1 a los 20 minutos del inicio de la elución.

Como resultado, se confirmó que se habían acumulado 21,9 mg/l de L-Leu-L-Phe y 12,0 mg/l de L-Phe-L-Leu en la mezcla de reacción de Escherichia coli NM522/pAL-nou y no se detectó dipéptido en la mezcla de reacción de Escherichia coli NM522 utilizada como cepa de control.

El resultado anterior reveló que la enzima sintetizadora de ciclodipéptido obtenida en el Ejemplo Experimental 11 tiene la capacidad de sintetizar dipéptidos.

Ejemplo Experimental 13

Producción de Dipéptidos Utilizando la Enzima Purificada

(1)

Se cultivó Escherichia coli NM522/pAL-nou de la misma manea que en el Ejemplo Experimental 12. Una vez completado el cultivo, se llevó a cabo la centrifugación para obtener las células húmedas. Las células húmedas obtenidas se lavaron con 60 mmoles/l de fosfato de potasio (pH 7,2) y se suspendieron en tampón fosfato de potasio de 20 mmoles/l que contenía 10 mmoles/l de imidazol. La suspensión resultante se sometió a ultrasonicación a 4°C para obtener una suspensión de células desorganizadas. La suspensión obtenida (10 ml: que contenía 0,863 mg de proteína) se hizo pasar a través de una columna de purificación con etiqueta His (Amersham Biosciences K.K.) y después se hicieron pasar 15 ml de tampón fosfato de potasio de 20 mmoles/l que contenía 10 mmoles/l de imidazol a través de la columna para lavar hasta purificar una proteína albC etiquetada con His en la columna. Después, se colocaron 2 ml de una mezcla de reacción que tenía la misma composición que en el Experimental Ejemplo 12 [composición: tampón fosfato de potasio de 60 mmoles/l (pH 7,2), 10 mmoles/l de cloruro de magnesio, 10 mmoles/l de ATP, 1 g/l de L-Leu, 1 g/l de L-Phe] en la columna que contenía la proteína albC etiquetada con His, seguido de incubación a 30°C, durante la cual los sustratos se mantuvieron en la columna. Después de 24 horas, la mezcla de reacción de la columna se hizo eluir con 3 ml de una mezcla de reacción que tenía la misma composición, y se determinaron el ciclodipéptido y los dipéptidos de la mezcla de reacción de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 12.

Como resultado, se confirmó que se habían formado 6,8 mg/l de ciclo(L-Leu-L-Phe), 28,7 mg/l de L-Leu-L-Phe y 18,5 mg/l de L-Phe-L-Leu. No se detectó ciclodipéptido

o dipéptido en la mezcla de reacción cuando se incubó de la misma manera sin ATP.

Ejemplo Experimental 14

Producción de Dipéptidos Utilizando la Enzima Purificada

(2)

Se llevó a cabo la reacción enzimática de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 13 excepto que se remplazaron los aminoácidos como sustrato por otro aminoácido, y se analizó el producto obtenido. En cuanto a la mezcla de reacción, se utilizó una mezcla que tenía la misma composición que la del Ejemplo Experimental 13 excepto que los aminoácidos como sustrato fueron remplazados por 1 g/l de L-Ala, L-Leu o L-Phe.

Como resultado, se reveló que se habían formado respectivamente 9,41 mg/l de L-Ala-L-Ala, 7,85 mg/l de L-Leu-L-Leu y 5,20 mg/l de L-Phe-L-Phe en 24 horas después del inicio de la reacción.

Ejemplo Experimental 15

Construcción de Escherichia coli para el Aumento deExpresión del Gen ywfE

Utilizando un sintetizador de ADN (Modelo 8905, PerSeptive Biosystems, Inc.), se sintetizaron los ADN que tenían las secuencias mostradas en los SEQ ID NOS: 84 a 87 (referidas en adelante como cebador L, cebador M, cebador N y cebador O, respectivamente). La secuencia de SEQ ID NO: 84 es una secuencia en la que una secuencia, que contiene la secuencia de reconocimiento de XhoI, es añadida al extremo 5' de una región que contiene la secuencia de Shine-Dalgarno (secuencia de unión al ribosoma) del gen ywfE en el plásmido pQE60ywfE. La secuencia de SEQ ID NO: 85 es una secuencia en la que una secuencia, que contiene el sitio de reconocimiento de BamHI, es añadida al extremo 5' de una secuencia complementaria a una secuencia que contiene el codón de terminación del gen ywfE. La secuencia de SEQ ID NO: 86 es una secuencia en la que una secuencia, que contiene la secuencia de reconocimiento de EcoRI, es añadida al extremo 5' de la secuencia de la región promotora trp del vector de expresión pTrS30 que contiene el promotor trp. La secuencia de SEQ ID NO: 87 es una secuencia en la que una secuencia que contiene la secuencia de reconocimiento de XhoI, es añadida al extremo 5' de una secuencia complementaria a la secuencia de la región promotora trp del vector de expresión pTrS30 que contiene el promotor trp.

Se amplificaron un fragmento del gen ywfE y un fragmento de la región promotora trp mediante PCR utilizando los cebadores anteriores L y M, y los cebadores N y O como grupo de cebadores, respectivamente, y el plásmido pQE60ywfE como molde. La PCR se llevó a cabo mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprendía 10 ng de pQE60ywfE, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200 µmoles/l de cada uno de los dNTP.

Se sometió un décimo de cada una de las mezclas de reacción resultantes a electroforesis en gel de agarosa para confirmar se habían amplificado respectivamente un fragmento de aprox. 1,4 kb correspondiente al fragmento del gen ywfE y un fragmento de aprox. 0,3 kb correspondiente al fragmento de la región promotora trp en la PCR en la que se utilizan el cebador L y el cebador M y la PCR en la que se utilizan el cebador N y el cebador O. Después, la mezcla de reacción restante se combinó con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE. La solución resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con el doble de volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó, y el ADN obtenido se disolvió en 20 µl de TE.

Las soluciones de ADN obtenidas de este modo (5 µl cada una) se sometieron respectivamente a reacción para escindir el ADN amplificado utilizando el cebador L y el cebador M con las enzimas de restricción XhoI y BamHI y a reacción para escindir el ADN amplificado utilizando el cebador N y el cebador O con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperaron un fragmento de 1,4 kb que contenía el gen ywfE y un fragmento de 0,3 kb que contenía la región promotora trp respectivamente utilizando el kit GENECLEAN II.

El vector de expresión pTrs30 que contenía el promotor trp (0,2 µg) fue escindido con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se recuperó un fragmento de ADN de 4,5 kb de la misma manera que antes.

El fragmento d 1,4 kb que contenía el gen ywfE, el fragmento de 0,3 kb que contenía la región promotora trp y un fragmento de ADN de 4,5 kb obtenido antes fueron sometidos a reacción de ligación utilizando un kit de ligación a 16°C durante 16 horas.

Se transformó Escherichia coli NM522 utilizando la mezcla de reacción de acuerdo con el método en el que se utilizan iones calcio, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C.

Se extrajo un plásmido de una colonia del transformante que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido, por medio de lo cual se obtuvo un vector de expresión pPB56 que contenía el gen ywfE en una posición aguas abajo del promotor trp. La estructura del vector se confirmó mediante digestión con enzimas de restricción (Fig. 4)

Ejemplo Experimental 16

Preparación de Cepas que Tienen Deleciones de los GenespepD, pepN, pepB y pepA y el Operón dpp

Se prepararon cepas en las cuales se habían suprimido genes específicos del ADN cromosómico de Escherichia coli de acuerdo con el método en el que se utiliza el sistema de recombinación homóloga del fago lambda [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645 (2000)].

Se prepararon los plásmidos pKD46, pKD3 y pCP20 utilizados más abajo mediante extracción, de acuerdo con un método conocido, a partir de cepas de Escherichia coli que los portan que se habían obtenido de Escherichia coli Genetic Stock Center, Yale University, EEUU.

(1) Clonación de Fragmentos de ADN para la Deleción deGenes

Con el fin de suprimir los siguientes genes existentes en el ADN cromosómico de Escherichia coli K12, se sintetizaron los ADN que tenían secuencias de nucleótidos homólogas a las secuencias de nucleótidos de 36 pb que se encuentran aguas arriba y aguas abajo de los respectivos genes que se van a suprimir en el ADN cromosómico de Escherichia coli K12 y la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 54 que es reconocida por la recombinasa Flp derivada de levadura utilizando un sintetizador de ADN (Modelo 8905, PerSeptive Biosystems. Inc.). Los genes a suprimir son el gen pepD que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 55, el gen pepN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 56, el gen pepB que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 57, el gen pepA que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 58, el gen dppA que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 59, el gen dppB que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 60, el gen dppC que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 61, el gen dppD que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 62 y el gen dppF gene que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 63. En el caso de los genes dppA, dppB, dppC, dppD y dppF, que forman un operón, se sintetizaron los ADN que tienen secuencias de nucleótidos homólogas a las secuencias de nucleótidos que se encuentran aguas arriba y aguas abajo del operón.

Esto es, se sintetizaron los ADN que consistían en las siguientes secuencias de nucleótidos como respectivos grupos de cebadores para la amplificación de fragmentos de ADN para la deleción de genes: SEQ ID NOS: 64 y 65 para la deleción del gen pepD; SEQ ID NOS: 66 y 67 para la deleción del gen pepN; SEQ ID NOS: 68 y 69 para la deleción del gen pepA; SEQ ID NOS: 70 y 71 para la deleción del gen pepB: y SEQ ID NOS: 72 y 73 para la deleción del operón dpp.

Con posterioridad, se llevó a cabo la PCR utilizando cada grupo de los ADN sintéticos anteriores como grupo de cebadores y el ADN pKD3 como molde. Esto es, se llevó a cabo la PCR mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprende 10 ng del ADN plasmídico, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu, (10 x) y 200 µmoles/l de cada uno de los desoxiNTP.

Se sometió un décimo de cada una de las mezclas de reacción resultantes a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado el fragmento deseado. Después, la mezcla de reacción restante se combinó con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE.

La mezcla resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con el doble de volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos, seguido de centrifugación. Mediante este procedimiento, se obtuvieron fragmentos de ADN que contenían el gen de resistencia a cloranfenicol para la deleción de los genes pepD, pepN, pepB y pepA y el operón dpp.

(2) Preparación de Escherichia coli JM101 Que Tiene la Deleción del Gen pepD

Se transformó Escherichia coli JM101 con pKD46, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 100 mg/l de ampicilina, y se cultivó a 30°C para seleccionar Escherichia coli JM101 que portaba pKD46 (referida en adelante como Escherichia coli JM101/pKD46).

El plásmido pKD46 porta el gen de la recombinasa Red de λ, cuya expresión puede ser inducida por L-arabinosa. Por consiguiente, cuando se transforma Escherichia coli que porta pKD46 desarrollada en presencia de L-arabinosa utilizando un ADN de cadena lineal, se produce con elevada frecuencia una recombinación homóloga. Adicionalmente, como pKD46 tiene un origen de replicación termosensible, se puede ocasionar fácilmente el curado del plásmido cultivando la cepa a 42°C.

Se introdujo el fragmento de ADN que contenía el gen de resistencia a cloranfenicol para la deleción del gen pepD obtenido antes en Escherichia coli JM101/pKD46 obtenida cultivando en presencia de 10 mmoles/l de Larabinosa y 50 µg/ml de ampicilina mediante electroporación. Las células resultantes se diseminaron sobre medio de agar LB (10 g/l de Bacto-triptona, 5 g/l de Bacto-extracto de levadura, 5 g/l de cloruro de sodio y 15 g/l de agar) que contenía 25 mg/l de cloranfenicol y se cultivaron a 30°C para seleccionar un transformante en el cual se había integrado el fragmento de ADN que contenía el gen de resistencia a cloranfenicol para la deleción del gen pepD en el ADN cromosómico de Escherichia coli JM101 mediante recombinación homóloga.

La cepa resistente a cloranfenicol seleccionada fue inoculada sobre un medio de agar LB que contenía 25 mg/l de cloranfenicol y se cultivó a 42°C durante 14 horas, seguido de aislamiento de colonias individuales. Se elaboraron réplicas de las colonias obtenidas sobre medio de agar LB que contenía 25 mg/l de cloranfenicol y medio de agar LB que contenía 100 mg/l de ampicilina, seguido de cultivo a 37°C. Seleccionando una colonia que mostraba resistencia a cloranfenicol y sensibilidad de ampicilina, se obtuvo una cepa curada con pKD46.

La cepa curada con pKD46 obtenida de este modo fue transformada utilizando pCP20, seguido de selección sobre un medio de agar LB que contenía 100 mg/l de ampicilina, para obtener una cepa curada con pKD46 que porta pup20.

El plásmido pCP20 porta un gen de recombinasa Flp derivado de levadura cuya expresión puede ser inducida a una temperatura de 42°C.

Los fragmentos de ADN que contienen el gen de resistencia a cloranfenicol para la deleción de los genes pepD, pepN, pepB y pepA y el operón dpp preparados más arriba contienen secuencias de nucleótidos reconocidas por la recombinasa Flp en ambos extremos del gen de resistencia a cloranfenicol. Por lo tanto, el gen de resistencia puede ser fácilmente suprimido mediante recombinación homóloga catalizada por recombinasa Flp.

Adicionalmente, como pCP20 tiene un origen de replicación termosensible, la expresión de la recombinasa Flp y el curado de pCP20 pueden ser inducidos simultáneamente cultivando la cepa que porta pCP20 a 42°C.

La cepa curada con pKD46 que porta pCP20 obtenida antes fue inoculada sobre un medio de agar LB sin fármaco y cultivada a 42°C durante 14 horas, seguido de aislamiento de colonias individuales. Se elaboraron réplicas de las colonias obtenidas sobre medio de agar LB sin fármaco, medio de agar LB que contenía 25 mg/l de cloranfenicol y medio de agar LB que contenía 100 mg/l de ampicilina, seguido de cultivo a 30°C. Después se seleccionaron colonias que mostraban sensibilidad a cloranfenicol y sensibilidad a ampicilina.

Se prepararon ADN cromosómicos a partir de las respectivas cepas seleccionadas antes de acuerdo con un método común [Seibutsukogaku Jikkensho (Experiments in Biotechnology), editado por The Society for Biotechnology, Japón, págs. 97-98, Baifukan (1992)]. La PCR se llevó a cabo utilizando, como grupo de cebadores, ADN que tenían las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 74 y 75 que fueron diseñados basándose en una secuencia de nucleótidos más interna del gen pepD que se va a suprimir, y utilizando cada uno de los ADN cromosómicos como molde. Esto es, se llevó a cabo la PCR mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprendía 0,1 µg del ADN cromosómico, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200 µmoles/l de cada uno de los desoxiNTP.

Una cepa en la que no se había detectado fragmento de ADN amplificado en la PCR anterior fue detectada e identificada como la cepa que tenía la deleción del gen pepD y fue denominada Escherichia coli JPD1.

(3) Preparación de una Cepa en la cual Están Suprimidoslos Genes pepD y pepN del ADN Cromosómico de Escherichia coli JM101

Se transformó la Escherichia coli JPD1 obtenida en el apartado (2) anterior con pKD46, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 100 mg/l de ampicilina, y se cultivó a 30°C para seleccionar Escherichia coli JPD1 que portaba pKD46 (referida en adelante como Escherichia coli JPD1/pKD46). Se introdujo el fragmento de ADN que contenía el gen de resistencia a cloranfenicol para la deleción del gen pepN en Escherichia coli JPD1/pKD46 mediante electroporación para obtener un transformante en el cual se había integrado el fragmento de ADN que contenía el gen de resistencia a cloranfenicol para la deleción del gen pepN en el ADN cromosómico de Escherichia coli JPD1/pRD46 mediante recombinación homóloga.

Con posterioridad, se llevó a cabo el mismo procedimiento que en el apartado (2) anterior para obtener una cepa en la cual se había suprimido el gen de resistencia a cloranfenicol del ADN cromosómico, que se denominó Escherichia coli JPDN2.

(4) Preparación de Cepas en las Cuales se han Suprimido el Gen pepN, pepA o pepB o el Operón dpp del ADN Cromosómico de Escherichia coli JM101 y Cepas que tienenuna Deleción de Múltiples Genes

Las cepas que tienen una deleción del gen pepN, pepA

o pepB o del operón dpp fueron preparadas de acuerdo con el mismo procedimiento que en el apartado (2) anterior utilizando los respectivos fragmentos de ADN que contienen el gen de resistencia a cloranfenicol para la deleción del gen o el operón preparado en el apartado (1) anterior.

La adquisición de las cepas que tienen deleciones de genes mediante el método anterior se confirmó llevando a cabo la PCR de la misma manera que en el apartado (2) anterior utilizando, como grupos de cebadores, los ADN que tienen las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 76 a 83 que se diseñan y se sintetizan basándose en las secuencias de nucleótidos internas de los respectivos genes que se van a suprimir. Esto es, se utilizaron los ADN que tenían las siguientes secuencias de nucleótidos como respectivos grupos de cebadores para la confirmación de la deleción del gen: SEQ ID NOS: 76 y 77 para la deleción de pepN: SEQ ID NOS: 78 y 79 para la deleción de pepA: SEQ ID NOS: 80 y 81 para la deleción de pepB; y SEQ ID NOS: 82 y 83 para la deleción del operón dpp.

La cepa con el operón dpp suprimido, la cepa con el gen pepN suprimido, la cepa con el gen pepA suprimido y la cepa con el gen pepB suprimido obtenidas de este modo fueron designadas Escherichia coli JDPP1, Escherichia coli JPN1, Escherichia coli JPA1 y Escherichia coli JPB7, respectivamente.

Adicionalmente, las cepas que tenían múltiples deleciones de genes, esto es, deleciones de dos o más genes u operones seleccionados del grupo que consiste en los genes pepD, pepN, pepA y pepB y el operón dpp fueron preparadas de acuerdo con el método del apartado (3) anterior. La adquisición de las cepas que tenían múltiples deleciones de genes fue confirmada mediante una PCR similar a la del apartado (2) anterior. La cepa con la doble deleción de genes obtenida de este modo que tenía deleciones del gen pepD y el operón dpp fue denominada Escherichia coli JPDP49, la cepa con la triple deleción de genes que tenía las deleciones de los genes

pepB, pepD y pepN, Escherichia coli JPDNB43, la cepa con la triple deleción de genes que tiene las deleciones de los genes pepD y pepN y el operón dpp, Escherichia coli JPNDDP36, la cepa con la cuádruple deleción de genes que 5 tiene las deleciones de los genes pepA, pepD y pepN y el operón dpp, Escherichia coli JPNDAP5, y la cepa con la cuádruple deleción de genes que tiene las deleciones de los genes pepB, pepD y pepN y el operón dpp, Escherichia coli JPNDBP7. Los genes suprimidos en las cepas con genes

10 suprimidos se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2

Cepa: Gen suprimido

JM101: ninguno

JDPP1: operón dpp

JPN1: pepN

JPA1: pepA

JPB7: pepB

JPD1: pepD

JPDN2: pepD, pepN

JPNDB43: pepB, pepD, pepN

JPDP49: operón pepD, dpp

JPNDDP36: operón pepD, pepN, dpp

JPNDAP5: operón pepA, pepD, pepN, dpp

JPNDBP7: operón pepB, pepD, pepN, dpp

Ejemplo Experimental 17

Evaluación de la Productividad de L-Ala-L-Gln y L-Ala-L-Ala por Cepas de Escherichia coli en las Cuales se han perdido las Actividades de la Peptidasa y la Proteínas de penetración/transporte de Dipéptidos

Las cepas que tienen deleciones de genes que codifican diferentes peptidasas y proteína de penetración/transporte de dipéptidos que se habían obtenido en el Ejemplo Experimental 16 fueron transformadas utilizando el plásmido pPE56 construido en el Ejemplo Experimental 15 para obtener transformantes resistentes a ampicilina.

Cada uno de los transformantes obtenidos fue inoculado en 8 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, en un tubo de ensayo y cultivado a 28°C durante 17 horas. El cultivo resultante se añadió a 8 ml de un medio acuoso [16 g/l de hidrogenofosfato de dipotasio, 14 g/l de dihidrogenofosfato de potasio, 5 g/l de sulfato de amonio, 1 g/l de ácido cítrico (anhidro), 0,5 g/l de Casaminoácido (Difco), 1 g/l de L-Pro, 2,5 g/l de L-Ala, 2,5 g/l de L-Gln, 10 g/l de glucosa, 10 mg/l de vitamina B1, 25 mg/l de sulfato de magnesio heptahidratado y 50 mg/l de sulfato ferroso heptahidratado; el pH se ajustó a 7,2 con 10 moles/l de solución de hidróxido de sodio: se añadió L-Gln después de la esterilización por filtración de una solución concentrada 10 veces: se añadieron glucosa, vitamina B1, sulfato de magnesio heptahidratado y sulfato ferroso heptahidratado tras la esterilización con vapor por separado] que contenía 100 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo en una cantidad de 1% y se sometió a reacción a 30°C durante 24 horas. El medio acuoso resultante se centrifugó para obtener un sobrenadante.

El producto del sobrenadante se derivatizó mediante el método F-moc y después se analizó mediante HPLC. El análisis HPLC se llevó a cabo utilizando ODS-HG5 (Nomura Kagaku Co., Ltd.) como columna de separación y solución A (6 ml/l de ácido acético y acetonitrilo al 20% (v/v), el pH se ajustó a 4,8 con trietilamina) y solución B (6 ml/l de ácido acético y acetonitrilo al 70% (v/v), pH ajustado a 4,8 con trietilamina) como eluyentes. La razón de

5 solución A con respecto a solución B fue de 8:2 durante los primeros 5 minutos de elución y después de eso se cambió con un gradiente lineal de manera que la razón fuera de 1:1 a los 20 minutos del inicio de la elución. Los resultados del análisis se muestran en la Tabla 3.

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Tabla 3

Cepa: Gen Suprimido L-Ala-L-Gln (g/l) L-Ala-L-Ala (g/l)

JM101: ninguno 0 0

JDPP1: operón dpp 0,02 0,01

JPN1: pepN 0,01 0,01

JPA1: pepA 0,01 0,01

JPB7: pepB 0,01 0,01

JPD1: pepD 0,01 0,01

JPDN2: pepD, pepN 0,02 0,03

JPNDB43: pepB, pepD, pepN 0,05 0,12

JPDP49: pepD, operón dpp 0,11 0,08

JPNDDP36: pepD, pepN, operón dpp 0,16 0,21

JPNDAPS: pepA, pepD, pepN, operón dpp 0,28 0,26

JPNDBP7: pepB, pepD, pepN, operón dpp 0,43 0,22

Como se puede observar a partir de la Tabla 3, se formaron pequeñas cantidades de dipéptidos y se acumularon mediante el uso de los microorganismos que tenían deleciones de dos o menos clases de genes de dipeptidasa o un operón que codifica una proteína de penetración/transporte de péptidos, mientras las cantidades de dipéptidos formados y acumulados aumentan enormemente por medio del uso de los microorganismos que tienen deleciones de una o más clases de genes de peptidasa y un operón que codifica una proteína de penetración/transporte de péptidos o microorganismos que tienen deleciones de tres o más clases de genes de peptidasa.

Ejemplo Experimental 18

Evaluación de la Productividad de L-Alanil-L-valina (referida en adelante como L-Ala-L-Val) por Cepas de Escherichia coli en las cuales se han Perdido las Actividades Peptidasa y de la proteína de penetración/transporte de Péptidos

De un modo similar al Ejemplo Experimental 17, se transformaron las cepas de Escherichia coli que tenían deleciones de los genes que codifican las diferentes peptidasas y proteínas de penetración/transporte de péptidos utilizando pPE56. Cada uno de los transformantes se añadió a 8 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo y se cultivó a 28°C durante 17 horas. El cultivo resultante se añadió a 8 ml de un medio acuoso [16 g/l de hidrogenofosfato de dipotasio, 14 g/l de dihidrogenofosfato de potasio, 5 g/l de sulfato de amonio, 1 g/l de ácido cítrico (anhidro), 0,5 g/l de Casaminoácido (Difco), 1 g/l de L-Pro, 2,5 g/l de L-Ala, 2,5 g/l de L-Val, 10 g/l de glucosa, 10 mg/l de vitamina B1, 25 mg/l de sulfato de magnesio heptahidratado y 50 mg/l de sulfato ferroso heptahidratado: pH ajustado a 7,2 con 10 moles/l de solución de hidróxido de sodio; se añadieron glucosa, vitamina B1, sulfato de magnesio heptahidratado y sulfato ferroso heptahidratado después de la esterilización con

5 vapor por separado] que contenía 100 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo en una cantidad de 1% y se sometió a reacción a 30°C durante 24 horas. El medio acuoso resultante se centrifugó para obtener un sobrenadante.

10 El producto del sobrenadante fue analizado mediante el método descrito en el Ejemplo Experimental 17. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4

Cepa: Gen suprimido L-Ala-L-Val (g/l)

JM101: ninguno 0

JDPP1: operón dpp 0

JPN1: pepN 0

JPA1: pepA 0

JPB7: pepB 0

JPD1: pepD 0

JPDN2: pepD, pepN 0

JPNDB43: pepB, pepD, pepN 0,04

JPDP49: pepD, operón dpp 0,11

JPNDDP36: pepD, pepN, operón dpp 0,22

JPNDBP7: pepB, pepD, pepN, operón dpp 0,20

Como se puede observar a partir de la Tabla 4, el dipéptido no fue producido mediante el uso de dos o menos clases de genes de peptidasa o un operón que codifica una proteína de penetración/transporte de péptidos, mientras el dipéptido fue producido mediante el uso de los microorganismos que tienen deleciones de tres o más clases de genes de peptidasa o microorganismos que tienen deleciones de una o más clases de genes de peptidasa y un operón que codifica una proteína de penetración/transporte de péptidos.

Ejemplo Experimental 19

Evaluación de la Productividad de Glicil-L-glutamina(referida en adelante como Gly-L-Gln) por Cepas de Escherichia coli en las cuales se han Perdido las Actividades Dipeptidasa y de la Proteína de penetración/transporte de Dipéptidos

De un modo similar al Ejemplo Experimental 17, se transformaron las cepas que tienen deleciones de diferentes genes de dipeptidasa y un operón que codifica una proteína de penetración/transporte de dipéptidos utilizando pPE56. Cada uno de los transformantes obtenidos fue inoculado en 8 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo y cultivado a 28°C durante 17 horas.

El cultivo resultante se añadió a 8 ml de un medio acuoso [16 g/l de hidrogenofosfato de dipotasio, 14 g/l de dihidrogenofosfato de potasio, 5 g/l de sulfato de amonio, 1 g/l de ácido cítrico (anhidro), 0,5 g/l de Casaminoácido (Difco), 1 g/l de L-Pro, 2,5 g/l de Gly, 2,5 g/l de L-Gln, 10 g/l de glucosa, 10 mg/l de vitamina B1, 25 mg/l de sulfato de magnesio heptahidratado y 50 mg/l de sulfato ferroso heptahidratado; pH ajustado a 7,2 con 10 moles/l de solución de hidróxido de sodio; se añadió L-Gln tras la esterilización por filtración de una solución conc. 10 veces; se añadieron glucosa, vitamina B1, sulfato de magnesio heptahidratado y sulfato ferroso heptahidratado después de la esterilización con vapor por separado] que contenía 100 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo en una cantidad de 1% y se sometió a reacción a

5 30°C durante 24 horas. El medio acuoso resultante se centrifugó para obtener un sobrenadante.

El producto del sobrenadante se analizó mediante el método descrito en el Ejemplo Experimental 17. Los 10 resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5

Cepa: Gen suprimido Gly-L-Gln (g/l)

JM101: ninguno 0

JDPP1: operón dpp 0

JPDN2: pepD, pepN 0

JPNDB43: pepB, pepD, pepN 0,01

JPNDDP36: pepD, pepN, operón dpp 0,02

JPNDBP7: pepB, pepD, pepN, operón dpp 0,03

Como se puede observar a partir de la Tabla 5, no se

15 produjo el dipéptido mediante el uso de los microorganismos que tenían deleciones de dos o menos clases de genes de peptidasa o un operón que codificaba una proteína de penetración/transporte de péptidos, mientras el dipéptido era producido mediante el uso de

20 los microorganismos que tenían deleciones de tres o más clases de genes de peptidasa o microorganismos que tenían deleciones de dos o más clases de genes de peptidasa y un operón que codificaba una proteína de penetración/transporte de péptidos.

25

Algunas realizaciones de la presente invención se ilustran en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no se deben considerar limitantes del alcance de la invención.

Ejemplo 1

Preparación de un Microorganismo que tiene Deleciones de los Genes glnE y glnB Implicados en la Regulación de laBiosíntesis de L-Glutamina

La deleción de los genes específicos del ADN cromosómico de Escherichia coli se llevó a cabo de acuerdo con el método en el que se utiliza el sistema de recombinación homóloga del fago lambda [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645 (2000)].

(1) Clonación de Fragmentos de ADN que contienen Genes deResistencia a Fármacos para la Deleción de Genes

Las secuencias de nucleótidos del gen glnE y el gen glnB de Escherichia coli K12 ya habían sido descritas [Science, 5331, 1453-1474 (1997)]. Basándose en las secuencias de nucleótidos referidas, se sintetizaron ADN que consistían en las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 88 y 89 que se van a utilizar como ADN cebadores para la deleción del gen glnE y ADN que consistían en las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 90 y 91 que se van a utilizar como ADN cebadores para la deleción del gen glnB utilizando un sintetizador de ADN (Modelo 8905, PerSeptive Biosystems, Inc.). Los ADN cebadores sintetizados se diseñaron basándose en las secuencias de nucleótidos de 36 pb que se encuentran aguas arriba y aguas abajo de los respectivos genes diana que se van a suprimir.

La PCR se llevó a cabo utilizando cada grupo de ADN sintéticos anteriores como grupo de cebadores y el ADN de pKD3 como molde. Esto es, la PCR se llevó a cabo mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprendía 10 ng del ADN plasmídico, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200 µmoles/l de cada uno de los desoxiNTP. Se sometió un décimo de cada mezcla de reacción resultante a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado el fragmento deseado. Después, la mezcla de reacción restante se combinó con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE.

La mezcla resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con el doble de volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos, seguido de centrifugación para precipitar el ADN. Después, se disolvió el producto precipitado de ADN en 20 µl de TE. Mediante este procedimiento, se obtuvieron fragmentos de ADN que contenían un gen de resistencia a cloranfenicol para la deleción del gen glnE y el gen glnB.

(2) Preparación de Escherichia coli JM101 en la cual se ha Suprimido el gen glnE del ADN Cromosómico

Se transformó Escherichia coli JM101 con pKD46, y se seleccionó la Escherichia coli JM101 que portaba pKD46 (referida en adelante como Escherichia coli JM101/pKD46) sobre medio agar LB que contenía 100 mg/l de ampicilina. Se transformó Escherichia coli JH101/pKD46 cultivada en presencia de 10 mmoles/l de L-arabinosa y 50 µg/ml de ampicilina mediante electroporación utilizando el fragmento de ADN que contenía un gen de resistencia a cloranfenicol para la deleción del gen glnE, y se seleccionó una cepa recombinante en la cual se había insertado el gen de resistencia a cloranfenicol en el gen glnE del ADN cromosómico de la cepa JM101 y se había suprimido el gen estructural glnE sobre medio de agar LB que contenía 25 mg/l de cloranfenicol.

Se elaboraron réplicas de la cepa resistente a cloranfenicol obtenida sobre medio de agar LB que contenía 25 mg/l de cloranfenicol, seguido de aislamiento de colonias individuales a 42°C. Después, las réplicas de las colonias obtenidas se elaboraron sobre medio de agar LB que contenía 25 mg/l de cloranfenicol y medio de agar LB que contenía 100 mg/l de ampicilina para seleccionar una colonia que mostraba resistencia a cloranfenicol y sensibilidad a ampicilina. La cepa curada con pKD46 seleccionada se transformó utilizando pCP20, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 100 mg/l de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C.

Se elaboraron réplicas de la cepa resistente a ampicilina que crecían sobre el medio sobre un medio de agar LB sin fármaco, seguido de aislamiento de colonias individuales a 42°C. Después, se elaboraron réplicas de las colonias obtenidas sobre un medio de agar LB sin fármaco, medio de agar LB que contenía 25 mg/l de cloranfenicol, medio de agar LB que contenía 100 mg/l de ampicilina para seleccionar las colonias que mostraban sensibilidad a cloranfenicol y sensibilidad a ampicilina. Se prepararon ADN cromosómicos a partir de las respectivas cepas obtenidas de este modo de acuerdo con el método habitual [Seibutsukogaku Jikkensho (Experiments in Biotechnology), editado por The Society for Biotechnology, Japón, págs. 97-98, Baifukan (1992)]. La PCR de la colonia se llevó a cabo utilizando ADN cebadores que consistían en las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 92 y 93 que fueron diseñadas basándose en la secuencia de nucleótidos interna del gen glnE que se va a suprimir. Esto es, se llevó a cabo la PCR de la colonia mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprende las células en una cantidad obtenida poniendo en contacto una punta de pipeta de 200µl con la colonia, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200 µmoles/l de cada uno de los desoxiNTP.

De las cepas sometidas a PCR, se identificó una cepa en la que no se había detectado amplificación del gen como cepa que tenía una deleción del gen glnE y se denominó Escherichia coli JGLE1.

(3) Preparación de Escherichia coli JM101 en la que sehan Suprimido los Genes glnE y glnB del ADN Cromosómico

Se transformó la Escherichia coli JGLE1 obtenida en el apartado (2) anterior con pKD46, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 100 mg/l ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C para obtener Escherichia coli JGLE1 que portaba pKD46 (referida en adelante como Escherichia coli JGLE1/pKD46). Se transformó la Escherichia coli JGLE1/pKD46 mediante electroporación utilizando el fragmento de ADN que contenía el gen de resistencia a cloranfenicol para la deleción del gen glnB para obtener una cepa recombinante en la cual se había insertado el gen de resistencia a cloranfenicol en el gen glnB del ADN cromosómico y se había suprimido el gen estructural glnB. La PCR de la colonia se llevó a cabo en las mismas condiciones que en el apartado (2) anterior utilizando ADN cebadores que consistían en las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 94 y 95 que fueron diseñadas basándose en una secuencia de nucleótidos interna del gen glnB. Una cepa en la cual no se había detectado amplificación del gen fue detectada en la PCR anterior como cepa que tenía una deleción del gen glnB y fue denominada Escherichia coli JGLBR1.

Ejemplo 2

Construcción de un Plásmido que Expresa el Gen ywfE y unGen de Alanina Deshidrogenasa (gen ald) Derivado deBacillus subtilis

Basándose en el plásmido de expresión del gen ywfE pPE56 construido en el Ejemplo Experimental 15, se construyó al mismo tiempo un plásmido de expresión que expresa constitutivamente un gen de alanina deshidrogenasa (gen ald) derivado de Bacillus subtilis mediante el método mostrado en la Fig. 5.

Utilizando un sintetizador de ADN (Modelo 8905, PerSeptive Biosystems. Inc.), se sintetizaron los ADN que tienen las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 96 y 97 (referidos en adelante como cebador P y cebador Q, respectivamente). La secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 96 es una secuencia en la que se añade una secuencia que contenía la secuencia de reconocimiento de BamHI al extremo 5' de una región que contenía la secuencia de Shine-Dalgarno (secuencia de unión al ribosoma) del gen ald. La secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 97 es una secuencia en la que se añade una secuencia que contenía la secuencia de reconocimiento de BamHI al extremo 5' de una secuencia complementaria a una secuencia que contenía el codón de terminación del gen ald.

Se llevó a cabo la PCR utilizando el ADN cromosómico de Bacillus subtilis obtenido en el Ejemplo Experimental 2 como molde y el cebador P y el cebador Q anteriores como grupo de cebadores. Esto es, se llevó a cabo la PCR mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprendía 0,1 µg del ADN cromosómico, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200 µmoles/l de cada uno de los dNTP.

Se sometió un décimo de la mezcla de reacción resultante a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado un fragmento de aprox. 1,2 kb correspondiente al fragmento del gen ald. Después, la mezcla de reacción restante se combinó con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE. La mezcla resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con el doble de volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó, y el producto precipitado de ADN obtenido se disolvió en 20 µl de TE.

La solución obtenida de este modo (5 µl) se sometió a reacción para escindir el ADN amplificado con la enzima de restricción BamHI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 1,2 kb que contenía el gen ald utilizando el kit GENECLEAN II.

Se escindió pPE56 (0,2 µg) con la enzima de restricción BamHI. Se separaron los fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 6,3 kb de la misma manera que antes. Se llevó a cabo la desfosforilación del extremo del fragmento de ADN de 6,3 kb mediante tratamiento con fosfatasa alcalina (E. coli C75, Takara Bio Inc.) a 60°C durante 30 minutos. La mezcla de reacción se mezcló con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE. La mezcla resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con el doble de volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó, y el producto precipitado de ADN obtenido se disolvió en 20 µl de TE.

El fragmento de ADN de 1,2 kb que contenía el gen ald y el fragmento de ADN de 6,3 kb tratado con fosfatasa alcalina obtenido antes se sometieron a una reacción de ligación utilizando un kit de ligación a 16°C durante 16 horas.

Se transformó la Escherichia coli NM522 utilizando la mezcla de reacción de ligación de acuerdo con el método en el que se utilizan iones calcio, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C.

Se extrajo un plásmido de una colonia del transformante que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido. Por medio de la digestión con enzimas de restricción, se confirmó que se había obtenido un plásmido en el que se había insertado el gen ald en la misma dirección que el gen ywfE, y el plásmido se denominó pPE86 (Fig. 5).

Ejemplo 3

Construcción de un Plásmido que Expresa un Gen pheA de resistencia a la retroalimentación y un Gen aroF de resistencia a la retroalimentación Derivados de Escherichia coli

(1) Construcción de un Plásmido que Expresa un Gen pheADesensibilizado

Se obtuvo un gen pheA resistente a la retroalimentación del plásmido pE pheA 22 que expresa el gen pheA desensibilizado a fenilalanina mediante la introducción de una mutación de resistencia a análogos de fenilalanina (Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada Núm. 260892/86) y se obtuvo un gen aroF resistente a la retroalimentación del plásmido pE aroF 18 que expresaba el gen aroF resistente a la retroalimentación de tirosina obtenido mediante la introducción de una mutación de resistencia a tirosina (Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada Núm. 65691/87), y se construyó un plásmido de expresión de la siguiente manera.

Utilizando un sintetizador de ADN (Modelo 8905, PerSeptive Biosystems, Inc.), se sintetizaron ADN que tenían las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 98 y 99 (referidos en adelante como cebador R y cebador S, respectivamente). La secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 98 es una secuencia en la que se añadía una secuencia que contenía la secuencia de reconocimiento de ClaI al extremo 5' de una región que contenía la secuencia de Shine-Dalgarno (secuencia de unión al ribosoma) del gen pheA. La secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 99 es una secuencia en la que se añadía una secuencia que contenía la secuencia de reconocimiento de BamHI al extremo 5' de una secuencia complementaria a una secuencia que contenía el codón de terminación del gen pheA. La PCR se llevó a cabo utilizando el plásmido pE pheA 22 como molde y el cebador R y el cebador S anteriores como grupo de cebadores. Esto es, la PCR se llevó a cabo mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprendía 10 ng del ADN plasmídico, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200 µmoles/l de cada uno de los dNTP.

Se sometió un décimo de la mezcla de reacción resultante a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado un fragmento de aprox. 1,1 kb correspondiente al fragmento del gen pheA. Después, la mezcla de reacción restante se mezcló con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE. La mezcla resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con el doble de volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó, y el producto precipitado de ADN obtenido se disolvió en 20 µl de TE.

La solución obtenida de este modo (5 µl) se sometió a reacción para escindir el ADN amplificado con las enzimas de restricción ClaI y BamHI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 1,1 kb que contenía el gen pheA utilizando el kit GENECLEAN II.

Se escindió el vector de expresión pTrS30 que contenía el promotor trp [preparable a partir de Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)] (0,2 µg) con las enzimas de restricción ClaI y BamHI. Se separaron los fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 4,6 kb de la misma manera que antes.

El fragmento de ADN de 1,1 kb que contenía el gen pheA y el fragmento de ADN de 4,6 kb obtenido antes se sometieron a una reacción de ligación utilizando un kit de ligación a 16°C durante 16 horas.

Se transformó Escherichia coli NM522 utilizando la mezcla de reacción de ligación de acuerdo con el método en el que se utilizan iones calcio, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C.

Se extrajo un plásmido de una colonia del transformante que había crecido sobre el medio de acuerdo con un método conocido. Mediante digestión con enzimas de restricción, se confirmó que se había obtenido un plásmido que expresaba el gen pheA de resistencia a la retroalimentación, y el plásmido se designó pPHEA1.

El pPHEA1 (0,2 µg) obtenido se escindió con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI. Los fragmentos de ADN se separaron electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 1,5 kb que contenía el promotor trp y el gen pheA de desensibilización utilizando el Kit GENECLEAN II.

Después, el vector plasmídico pSTV28 que tenía el origen de replicación de pACYC184 y que contenía un de resistencia a cloranfenicol (Takara Bio Inc.) (0,2 µg) se escindió con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 3,0 kb de la misma manera que antes.

El fragmento de ADN de 1,5 kb que contenía el promotor trp y el gen de resistencia a la retroalimentación pheA y el fragmento de ADN de 3,0 kb obtenido antes se sometieron a reacción de ligación utilizando un kit de ligación a 16°C durante 16 horas.

Se transformó Escherichia coli NM522 utilizando la mezcla de reacción de ligación de acuerdo con el método en el que se utilizan iones calcio, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 30 µg/ml cloranfenicol, y se cultivó durante la noche a 30°C.

Se extrajo un plásmido de una colonia del transformante que había crecido sobre el medio de acuerdo con un método conocido. Mediante digestión con enzimas de restricción, se confirmó que se había obtenido un vector que expresaba el gen de resistencia a la retroalimentación pheA, y el plásmido se denominó pPHEA2 (Fig. 6).

(2) Construcción de un Plásmido que Expresa el Gen deresistencia a la retroalimentación pheA y el Gen deresistencia a la retroalimentación aroF

Utilizando un sintetizador de ADN (Modelo 8905, PerSeptive Biosystems, Inc.), se sintetizaron los ADN que tenían las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 100 y 101 (referidas en adelante como cebador T y cebador U, respectivamente). La secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 100 es una secuencia en la que se añadía una secuencia que contenía la secuencia de reconocimiento de BglII que contenía la secuencia de Shine-Dalgarno (secuencia de unión al ribosoma) del gen aroF. La secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 101 es una secuencia en la que se añadía una secuencia que contenía la secuencia de reconocimiento de BamHI al extremo 5' de una secuencia complementaria a una secuencia que contenía el codón de terminación del gen aroF. La PCR se llevó a cabo utilizando el plásmido pE aroF 18 como molde y el cebador T y el cebador U anteriores como grupo de cebadores. Esto es, la PCR se llevó a cabo mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprendía 10 ng del plásmido pE aroF 18, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200 µmoles/l de cada uno de los dNTP.

Se sometió un décimo de la mezcla de reacción resultante a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado un fragmento de aprox. 1,1 kb correspondiente al fragmento del gen aroF. Después, la mezcla de reacción restante se combinó con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE. La mezcla resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con el doble de volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó, y el producto precipitado de ADN obtenido se disolvió en 20 µl de TE.

La solución obtenida de este modo (5 µl) se sometió a reacción para escindir el ADN amplificado con las enzimas de restricción BglII y BamHI. Los fragmentos de ADN fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 1,1 kb que contenía el gen desensibilizado aroF utilizando el Kit GENECLEAN II.

El plásmido pPHEA2 que expresaba el gen pheA resistente a la retroalimentación obtenido en el apartado

(1) anterior (0,2 µg) se escindió con la enzima de restricción BamHI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 4,5 kb de la misma manera que antes. Se llevó a cabo la desfosforilación del extremo del fragmento de ADN de 4,5 kb mediante tratamiento con fosfatasa alcalina a 60°C durante 30 minutos. La mezcla de reacción se mezcló con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE. La mezcla resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con el doble de volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó, y el producto precipitado de ADN obtenido se disolvió en 20 µl de TE.

El fragmento de ADN de 1,1 kb que contenía el gen de resistencia a la retroalimentación aroF y el fragmento de ADN de 4,5 kb tratado con fosfatasa alcalina obtenido antes se sometieron a reacción de ligación utilizando un kit de ligación a 16°C durante 16 horas.

Se transformó Escherichia coli NM522 utilizando la mezcla de reacción de ligación de acuerdo con el método en el que se utilizan iones calcio, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 30 µg/ml cloranfenicol, y

se cultivó durante la noche a 30°C.

Se extrajo un plásmido de una colonia del transformante que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido. Mediante digestión con enzimas de restricción, se confirmó que se había obtenido un plásmido que expresaba el gen aroF de resistencia a la retroalimentación y un gen pheA de resistencia a la retroalimentación en el cual se había insertado el gen aroF de resistencia a la retroalimentación en la misma dirección que se había obtenido el gen de resistencia a la retroalimentación pheA, y el plásmido se denominó pPHEAF2 (Fig. 6).

Ejemplo 4

Construcción de un Plásmido que Expresa un Operón aroFtyrA Que Muestra Resistencia a Tirosina Derivado de Escherichia coli

(1) Construcción de un Plásmido que Expresa un OperónaroF-tyrA Que Muestra Resistencia a Tirosina

Se obtuvo un operón aroF-tyrA que mostraba resistencia a tirosina a partir del plásmido pKmlaroFm-18 que expresaba el operón aroF-tyrA obtenido mediante introducción de una mutación de resistencia a tirosina (Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada Núm. 034197/85) y se construyó un plásmido de expresión de la siguiente manera.

Utilizando un sintetizador de ADN (Modelo 8905, PerSeptive Biosystems, Inc.), se sintetizaron los ADN que consistían en las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 102 y 103. La secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 102 es una secuencia en la que se añade una secuencia que contiene la secuencia de reconocimiento de ClaI al extremo 5' de una región que contiene la secuencia de Shine-Dalgarno (secuencia de unión al ribosoma) del gen aroF. La secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 103 es una secuencia en la que se añade una secuencia que contiene la secuencia de reconocimiento de SphI al extremo 5' de una secuencia complementaria a una secuencia que contiene el codón de terminación del gen tyrA.

Se llevó a cabo la PCR utilizando el plásmido pKmlaroFm-18 como molde y los ADN que consistían en las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 102 y 103 como grupo de cebadores. Esto es, se llevó a cabo la PCR mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprende 10 ng del ADN plasmídico, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidaes de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200 µmol/l de cada uno de los dNTP.

Se sometió un décimo de la mezcla de reacción resultante a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado un fragmento de aprox. 2,2 kb correspondiente al fragmento del gen aroF-tyrA. Después, la mezcla de reacción resultante se combinó con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE. La mezcla resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con el doble de volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó, y el producto precipitado de ADN obtenido se disolvió en 20 µl de TE.

La solución obtenida de este modo (5 µl) se sometió a reacción para escindir el ADN amplificado con las enzimas de restricción ClaI y SphI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 2,2 kb que contenía el operón aroF-tyrA utilizando el Kit GENECLEAN II.

El vector de expresión pTrS30 que contenía el promotor trp [preparable a partir de Escherichia coli JM109/pTrS30 (PERM BP-5407)] (0,2 µg) se escindió con las enzimas de restricción ClaI y SphI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 4,6 kb de la misma manera que antes.

El fragmento de ADN de 2,2 kb que contenía el operón aroF-tyrA y el fragmento de ADN de 4,6 kb anterior se sometieron a una reacción de ligación utilizando un kit de ligación a 16°C durante 16 horas.

Se transformó Escherichia coli NM522 utilizando la mezcla de reacción de ligación de acuerdo con el método en el que se utilizaban iones calcio, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C.

Se extrajo un plásmido de una colonia del transformante que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido. Mediante digestión con enzimas de restricción, se confirmó que se había obtenido un plásmido que expresaba el operón aroF-tyrA que muestra resistencia a tirosina, y el plásmido se denominó pty1.

El pty1 obtenido (0,2 µg) se escindió con las enzimas de restricción EcoRI y SphI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó el fragmento de ADN de 2,6 kb que contenía el promotor trp y el operón aroF-tyrA que mostraba resistencia a tirosina utilizando el Kit GENECLEAN II.

Después, se escindió el vector plasmídico pSTV28 que tenía el origen de replicación de pACYC184 y que contenía un gen de resistencia a cloranfenicol (Takara Bio Inc.) (0,2 µg) con las enzimas de restricción EcoRI y SphI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 3,0 kb de la misma manera que antes.

El fragmento de ADN de 2,6 kb que contenía el promotor trp y el operón aroF-tyrA que mostraba resistencia a tirosina y el fragmento de ADN de 3,0 kb obtenido antes se sometieron a una reacción de ligación utilizando un kit de ligación a 16°C durante 16 horas.

Se transformó Escherichia coli NM522 utilizando la mezcla de reacción de ligación de acuerdo con el método en el que se utilizaban iones calcio, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 30 µg/ml cloranfenicol, y se cultivó durante la noche a 30°C.

Se extrajo un plásmido de una colonia del transformante que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido. Mediante digestión con enzimas de restricción, se confirmó que se había obtenido un vector que expresaba el operón aroF-tyrA que muestra resistencia a tirosina, y el plásmido se denominó pTY2.

Ejemplo 5

Preparación de una Cepa que Tiene la Deleción del Gen metJ

(1) Clonación de un Fragmento de ADN que contiene un Gen de Resistencia a Fármacos para la Deleción del Gen metJ

La secuencia de nucleótidos del gen metJ de Escherichia coli K12 ya había sido descrita [Science, 5331, 1453-1474 (1997)].

El gen metJ codifica un represor del sistema de biosíntesis de L-metionina de Escherichia coli y se sabe que la capacidad de producción de L-metionina es incrementada introduciendo una mutación para inhibir la producción del represor (Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada Núm. 139471/00).

Basándose en la secuencia de nucleótidos referida, se sintetizaron los ADN que consistían en las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 104 y 105 que se van a utilizar como ADN cebadores para la preparación de una cepa que tenía una deleción del gen metJ utilizando un sintetizador de ADN (Modelo 8905, PerSeptive Biosystems. Inc.).

Los ADN tienen secuencias de nucleótidos homólogas a las secuencias de nucleótidos de 36 pb que se encuentran aguas arriba o aguas abajo del gen diana que se va a suprimir.

La PCR se llevó a cabo utilizando los ADN como grupo de cebadores y el ADN de pKD3 como molde para amplificar el fragmento de ADN que contiene el gen de resistencia a cloranfenicol para la preparación de una cepa que tiene una deleción del gen metJ. Esto es, la PCR se llevó a cabo mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprendía 10 ng del ADN plasmídico, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200 µmoles/l de cada uno de los desoxiNTP.

Un décimo de la mezcla de reacción resultante se sometió a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado el fragmento deseado. Después, la mezcla de reacción restante se combinó con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE. La mezcla resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con el doble de volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó, y el producto precipitado de ADN obtenido se disolvió en 20 µl de TE.

(2) Preparación de Escherichia coli JM101 en la cual se ha Insertado el Gen de Resistencia a Fármaco en el Gen metJ del ADN Cromosómico

Utilizando Escherichia coli JM101 y el fragmento de ADN que contenía el gen de resistencia a cloranfenicol para la preparación de una cepa que tenía una deleción del gen metJ obtenida en el apartado (1) anterior, se preparó un recombinante en el que se había insertado el gen de resistencia a cloranfenicol en el gen metJ del ADN cromosómico de Escherichia coli JM101 de la misma manera que en el Ejemplo 1 (2).

La inserción del gen de resistencia a cloranfenicol en el cromosoma se confirmó llevando a cabo la PCR de la colonia de la misma manera que en el Ejemplo 1 (2) utilizando, como grupo de cebadores, los ADN que consisten en las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 106 y 107, esto es, las secuencias de nucleótidos localizadas aproximadamente 400 pb aguas arriba y aguas abajo del sitio en el cual se había insertado el gen de resistencia a cloranfenicol.

De las cepas sometidas a la PCR de colonias, se identificó una cepa con la cual se había amplificado un fragmento de aprox. 2 kb que contenía el gen de resistencia a cloranfenicol como una cepa que tenía una deleción del gen metJ. Después, utilizando pCP20 que expresaba la recombinasa Flp, se preparó una cepa en la cual se había curado el gen de resistencia a cloranfenicol a partir del ADN cromosómico de la misma manera que en el Ejemplo 7 (3), y se denominó Escherichia coli JMJ1.

Ejemplo 6

Construcción de un Plásmido que Expresa el Gen ywfE y unGen de 3-Fosfoglicerato Deshidrogenasa Resistente a laRetroalimentación (gen serA) Derivado de Escherichia coli

Se sabe que la mutación del gen de la 3fosfoglicerato deshidrogenasa derivado de Escherichia coli (gen serA) para sustituir el codón de las posiciones 1096-1098 del gen estructural por el codón (TAA) produce un gen que codifica una 3-fosfoglicerato deshidrogenasa mutante en el que los 45 residuos de aminoácidos C-terminales son suprimidos y se mitiga la inhibición sustancial por serina (referido en adelante como gen serA de resistencia a la retroalimentación) (Patente Japonesa Núm. 2584409).

En cuanto a los cebadores para la amplificación del gen de resistencia a la retroalimentación serA, se utilizaron el ADN que consistía en la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 108 y el ADN que consistía en la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 109 que contenía la secuencia mutante con el codón sustituido.

La secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 108 es una secuencia en la que se añade una secuencia que contiene la secuencia de reconocimiento de ClaI al extremo 5' de una región que contiene la secuencia de Shine-Dalgarno (secuencia de unión al ribosoma) del gen serA. La secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 109 es una secuencia en la que se añade una secuencia que contiene la secuencia de reconocimiento de SphI al extremo 5' de una secuencia complementaria a una secuencia que contiene el codón de terminación para suprimir los 45 residuos de aminoácidos C-terminales del gen serA.

Se llevó a cabo la PCR para amplificar el gen de resistencia a la retroalimentación serA utilizando los ADN sintéticos anteriores como grupo de cebadores y el ADN cromosómico de Escherichia coli W3110 como molde. Esto es, se llevó a cabo la PCR mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprendía 0,1 µg del ADN cromosómico, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200 µmoles/l de cada uno de los desoxiNTP.

Un décimo de la mezcla de reacción resultante se sometió a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado un fragmento de aprox. 1,1 kb correspondiente al fragmento del gen de resistencia a la retroalimentación serA. Después, la mezcla de reacción restante se combinó con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE. La mezcla resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con el doble de volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó, y el producto precipitado de ADN obtenido se disolvió en 20 µl de TE.

La solución obtenida de este modo (5 µl) se sometió a una reacción para escindir el ADN amplificado con las enzimas de restricción ClaI y SphI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 1,1 kb que contenía el gen serA utilizando el kit GENECLEAN II.

El vector de expresión pTrS30 que contenía el promotor trp [preparable a partir de Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)] (0,2 µg) se escindió con las enzimas de restricción ClaI y SphI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 4,3 kb de la misma manera que antes.

El fragmento de ADN de 1,1 kb que contenía el gen serA y el fragmento de ADN de 4,3 kb obtenido antes se sometieron a una reacción de ligación utilizando un kit

de ligación a 16°C durante 16 horas.

Se transformó Escherichia coli NM522 utilizando la mezcla de reacción de ligación de acuerdo con el método en el que se utilizaban iones calcio, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C.

Se extrajo un plásmido de una colonia del transformante que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido y se denominó pSE15. La estructura del plásmido se confirmó mediante digestión con enzimas de restricción.

Se llevó a cabo la amplificación de un fragmento del gen serA de resistencia a la retroalimentación utilizando el plásmido pSE15 obtenido antes que expresaba el gen serA de resistencia a la retroalimentación derivado de Escherichia coli como molde y los ADN que consistían en las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 110 y 109 como grupo de cebadores.

Por separado, se llevó a cabo la amplificación de un fragmento del gen ywfE que contenía el promotor trp utilizando el plásmido pPB56 que expresaba el gen ywfE construido en el Ejemplo Experimental 15 como molde, y los ADN que consistían en las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 111 y 112 como grupo de cebadores. Ambas PCR se llevaron a cabo mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprendía 10 ng del ADN plasmídico, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200 µmoles/l de cada uno de los desoxiNTP.

Se sometió un décimo de cada una de las mezclas de reacción resultantes a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado el fragmento deseado. Después, mezcla de reacción restante se combinó con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE. La mezcla resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con dos veces el volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó, y el producto precipitado de ADN obtenido se disolvió en 20 µl de TE.

Mediante el procedimiento anterior, se obtuvieron un fragmento del gen serA de resistencia a la retroalimentación y un fragmento del gen ywfE que contenía el promotor trp. El fragmento del gen serA de resistencia a la retroalimentación fue escindido con las enzimas de restricción BglII y SphI. El fragmento del gen ywfE que contenía el promotor trp fue escindido con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperaron un fragmento de ADN de 1,1 kb que contenía el gen serA y un fragmento de ADN de 1,8 kb que contenía el promotor trp y el gen ywfE utilizando el Kit GENECLEAN II.

El vector de expresión pTrS30 que contenía el promotor trp (0,2 µg) fue escindido con las enzimas de restricción EcoRI y SphI. Se separaron los fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de 3,9 kb de la misma manera que antes.

El fragmento de ADN de 1,6 kb que contenía el gen serA, el fragmento de ADN de 1,8 kb que contenía el promotor trp y el gen ywfE y el fragmento de ADN de 3,9 kb obtenido antes se sometieron a una reacción de ligación utilizando un kit de ligación a 16°C durante 16 horas.

Se extrajo un plásmido de una colonia del transformante que crecía sobre el medio de acuerdo con un

método: conocido. Mediante digestión con enzimas de

restricción,: se confirmó que se había obtenido un

plásmido: en el que se había insertado el gen de

resistencia a la retroalimentación serA en la misma dirección que el gen ywfE, y el plásmido se denominó pPE212.

Ejemplo 7

Preparación de una Cepa que Tiene una Deleción del Gen ilvL y una Cepa que Tiene una Sustitución del Gen ilvGRevertiente

(1) Clonación de un Fragmento de ADN que Contiene un Gen de Resistencia a Fármaco para la Preparación de una Cepaque Tiene una Deleción del Gen ilvL y un Fragmento de ADNpara la Preparación de una Cepa que Tiene una Sustitución del gen ilvG Revertiente

Las secuencias de nucleótidos del gen ilvL y el gen

ilvG de Escherichia coli K12 ya habían sido descritas [Science. 5331, 1453-1474 (1997)].

La región atenuadora que regula la expresión del operón ilvGMEDA de Escherichia coli K12 se localiza en la región aguas arriba del operón y su secuencia de nucleótidos se describe en Nucleic Acids Res., 15, 2137 (1987). Se sabe que la eliminación de la región atenuadora desactiva la función atenuante, lo que conduce a la expresión constitutiva del operón ilvGMEDA (Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada Núm. 473979/96). Basándose en esta información, se preparó Escherichia coli K12 que expresa constitutivamente el operón ilvGMEDA de la siguiente manera.

Como Escherichia coli K12 de tipo salvaje tiene el gen ilvG que tiene una mutación por desplazamiento del marco, no expresa la isozima de ácido acetohidroxi sintasa II activa (AHASII) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78, 922 (1981)]. Se preparó Escherichia coli K12 en la cual se restaura la actividad de la acetohidroxi sintasa de la siguiente manera mediante introducción de una mutación para restaurar el marco insertando dos nucleótidos (AA) entre el 981o nucleótido y el 982o nucleótido del gen ilvG de Escherichia coli K12 remitiéndose a la secuencia del gen ilvG existente sobre el ADN cromosómico de Escherichia coli 0157:H7 en el cual funciona normalmente la AHASII (http://www.genome.wisc.edu/sequencing/o157.htm).

Basándose en la secuencia de nucleótidos referida, se sintetizaron los ADN que consistían en las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 113 y 114 como grupo de cebadores para amplificar un fragmento de ADN que contenía un gen de resistencia a fármaco para la preparación de una cepa que tenía una deleción del gen ilvL utilizando un sintetizador de ADN (Modelo 8905, PerSeptive Biosystems, Inc.).

Los ADN tienen secuencias de nucleótidos homólogas a las secuencias de nucleótidos de 36 pb que se encuentran aguas arriba y aguas abajo del gen diana que se va a suprimir.

Por separado, se sintetizaron el ADN que consistía en la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 115 y el ADN que consistía en la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 116 que contenía la secuencia mutante con los dos nucleótidos insertados como grupo de cebadores para la amplificación de una región aguas arriba del gen ilvG revertiente, y el ADN que consistía en la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 117 que contenía la secuencia mutante con los dos nucleótidos insertados mostrada en el SEQ ID NO: 118 como grupo de cebadores para la amplificación aguas abajo de una región que contenía el gen revertiente ilvG.

La PCR se llevó a cabo utilizando cada grupo de cebadores de los ADN anteriores como grupo de cebadores, para amplificar un fragmento de ADN que contenía un gen de resistencia a cloranfenicol para la deleción del gen ilvL utilizando ADN pKD3 como molde, y para amplificar regiones aguas arriba y aguas abajo del gen revertiente ilvG utilizando el ADN cromosómico de Escherichia coli W3110 como molde. Esto es, se llevó a cabo la PCR por medio de 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprendía 0,1 µg del ADN cromosómico o 10 ng del ADN plasmídico, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200 µmol/l de cada uno de los desoxiNTP.

Se sometió un décimo de cada una de las mezclas de reacción resultantes a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado el fragmento deseado. Después, la mezcla de reacción restante se mezcló con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE.

La mezcla resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con dos veces el volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos, seguido de centrifugación para precipitar el ADN. Después, se disolvió el producto precipitado de ADN en 20 µl de TE. Mediante este procedimiento, se obtuvieron un fragmento de ADN que contenía el gen de resistencia a cloranfenicol para la preparación de una cepa que tenía una deleción del gen ilvL, una región aguas arriba del gen ilvG revertiente y una región aguas abajo del gen ilvG revertiente.

Después, se llevó a cabo la PCR cruzada [A. J. Link,

D. Phillips, G. M. Church. J. Bacteriol., 179, 6228-6237 (1997)] utilizando la región aguas arriba del gen ilvG revertiente y la región aguas abajo del gen ilvG revertiente como moldes y los ADN que tienen las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 115 y 118 como grupo de cebadores. La PCR se llevó a cabo en las mismas condiciones que antes.

La PCR anterior produjo un fragmento de ADN para la preparación de una cepa con el gen ilvG revertiente sustituido en la cual la región aguas arriba del gen ilvG revertiente y la región aguas abajo del gen ilvG revertiente están ligadas.

(2) Preparación de Escherichia coli JM101 en la Cual el Gen ilvG del ADN Cromosómico está Sustituido por el GenilvG Revertiente

Se transformó Escherichia coli JM101 con pKD46 de acuerdo con un método conocido, se diseminó sobre un medio de agar LB, que contenía 100 mg/l de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C para obtener Escherichia coli JM101 que portaba pKD46 (referida en adelante como Escherichia coli JM101/pKD46).

Se transformó Escherichia coli JM101/pKD46 cultivada en presencia de 10 mmoles/l de L-arabinosa y 50 µg/ml de ampicilina mediante electroporación utilizando el fragmento de ADN para la preparación de una cepa con el gen ilvG revertiente sustituido obtenida en el apartado

(1) anterior, y se seleccionó una cepa en la que el gen ilvG del ADN cromosómico estaba sustituido por el gen ilvG revertiente sobre medio de agar que contenía medio M9 y glucosa, que contenía 200 mg/l de L-valina.

Se elaboraron réplicas de la cepa resistente a Lvalina obtenida sobre medio de agar que contenía medio M9 y glucosa, que contenía 200 mg/l de L-valina, seguido de aislamiento de colonias individuales a 42°C. Después, se elaboraron réplicas de las colonias obtenidas sobre medio de agar que contenía medio M9 y glucosa, que contenía 200 mg/l de L-valina y medio de agar LB que contenía 100 mg/l de ampicilina para seleccionar una colonia que mostraba resistencia a L-valina y sensibilidad a ampicilina. La cepa con el gen lvG revertiente sustituido obtenida se denominó Escherichia coli JM101G+1.

(3) Preparación de Escherichia coli JM101 en la Cual el Gen ilvG del ADN Cromosómico está Sustituido por el GenilvG Revertiente y el Gen ilvL Está Suprimido

Se transformó Escherichia coli JM101G+1 obtenida en el apartado (2) anterior con pKD46, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 100 mg/l de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C para obtener Escherichia coli JM101G+1 que portaba pKD46 (referida en adelante como Escherichia coli JM101G+1/pkD46).

Se transformó Escherichia coli JM101G+1/pKD46 mediante electroporación utilizando el fragmento de ADN que contenía el gen de resistencia a cloranfenicol para la preparación de una cepa que tenía una deleción del gen ilvL obtenida en el apartado (1) anterior, y una cepa recombinante en la cual se había insertado el gen de resistencia a cloranfenicol en el gen ilvL en el ADN cromosómico de la cepa JM101 se seleccionó sobre medio de agar LB que contenía 25 mg/l de cloranfenicol.

Se elaboraron réplicas de la cepa resistente a cloranfenicol obtenida sobre medio de agar LB que contenía 25 mg/l de cloranfenicol, seguido del aislamiento de colonias individuales a 42°C. Luego, se elaboraron réplicas de las colonias obtenidas sobre medio de agar LB que contenía 25 mg/mL de cloranfenicol y 100 mg/mL de ampicilina para seleccionar una cepa curada con pKD46 que mostraba resistencia a cloranfenicol y sensibilidad a la ampicilina.

La estructura del ADN cromosómico del transformante obtenido antes se confirmó sintetizando las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 119 y 120, esto es, las secuencias de nucleótidos localizadas aproximadamente 400 pb aguas arriba y aguas abajo del sitio en el cual se había insertado el gen de resistencia a cloranfenicol en el ADN cromosómico de Escherichia coli, y llevando a cabo después la PCR de colonias utilizando ADN sintéticos como grupo de cebadores. La PCR de colonias se llevó a cabo mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprendía las células en una cantidad obtenida poniendo en contacto una punta de pipeta de 200 µl con la colonia, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa de Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa de Pfu (10 x) y 200 µmoles/l de cada uno de los desoxiNTP.

De las cepas sometidas a PCR de colonias, se identificó una cepa en la cual un fragmento de aprox. 2 kb que contenía el gen de resistencia a cloranfenicol se había amplificado, como una cepa que tenía una deleción del gen ilvL y se denominó Escherichia coli JILG+Cm1.

Se transformó Escherichia coli JILG+Cm1 obtenida antes utilizando pCP20, seguido de selección sobre medio de agar LB que contenía 100 mg/l de ampicilina para obtener Escherichia coli JILG+Cml que portaba pCP20.

El fragmento de ADN que contenía el gen de resistencia a cloranfenicol para la preparación de una cepa que tenía una deleción del gen ilvL preparado en el apartado (1) anterior contiene las secuencias de nucleótidos reconocidas por la recombinasa Flp en ambos extremos del gen de resistencia a cloranfenicol. Por lo tanto, el gen de resistencia puede ser fácilmente suprimido mediante recombinación homóloga catalizada por recombinasa Flp.

Adicionalmente, como pCP20 tiene un origen de replicación termosensible, la expresión de la recombinasa Flp y el curado de pCP20 se pueden inducir simultáneamente cultivando la cepa que porta pCP20 a 42°C.

Se inoculó la Escherichia coli JILG+Cml obtenida antes en un medio de agar LB sin fármaco y se cultivó a 42°C durante 14 horas, seguido de aislamiento de colonias. Se elaboraron réplicas de las colonias individuales obtenidas en medio de agar LB sin fármaco, medio de agar LB que contenía 25 mg/l de cloranfenicol y medio de agar LB que contenía 100 mg/l de ampicilina, seguido de cultivo a 30°C. Después, se seleccionaron las colonias que muestran sensibilidad a cloranfenicol y sensibilidad a ampicilina.

Cada una de las colonias seleccionadas antes se sometieron a PCR de colonias utilizando ADN que consistían en las secuencias de nucleótidos mostrados en los SEQ ID NOS: 119 y 120 como grupo de cebadores. La PCR de colonias se llevó a cabo mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprendía las células en una cantidad obtenida poniendo en contacto una punta de pipeta de 200 µl con la colonia, 0,5 µmoles/l de da uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200 µmoles/l de cada uno de los desoxiNTP.

De las cepas sometidas a PCR de colonias, una cepa en la que se había amplificado un fragmento curado con el gen de resistencia a cloranfenicol de aprox. 0,7 kb fue identificada como una cepa que tenía la deleción del gen ilvL y se denominó Escherichia coli JILG+1.

Ejemplo 8

Preparación de una Cepa que Tiene Una Sustitución del Gen ilvA de Resistencia a la Retroalimentación

(1) Clonación de un Fragmento de ADN que Contiene un Gen de Resistencia a un Fármaco para la Preparación de unaCepa que Tiene una Deleción del Gen ilvA y un Fragmentode ADN para la Preparación de una cepa que Tiene UnaSustitución del Gen ilvA de Resistencia a la Retroalimentación

La secuencia de nucleótidos del gen ilvA de Escherichia coli K12 ya se había descrito [Science, 5331, 1453-1474 (1997)].

Se sabe que el gen ilvA 219 que codifica la treonina desaminasa del cual se ha eliminado esencialmente la inhibición por L-isoleucina (referido en adelante como gen ilvA de resistencia a la retroalimentación) tiene una mutación en la cual la leucina 447 está sustituida por fenilalanina [Biochemistry, 34, 9403 (1995)].

Basándose en la secuencia de nucleótidos referida, se sintetizaron los ADN que consistían en las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 121 y 122 como ADN cebadores para amplificar un fragmento de ADN que contenía un gen de resistencia a fármacos para la preparación de una cepa que tenía una deleción del gen ilvA utilizando un sintetizador de ADN (Modelo 8905, PerSeptive Biosystems. Inc.).

Por separado, se sintetizaron el ADN que consistía en la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 123 y el ADN que consistía en la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 124 que contenía la secuencia mutante con el codón sustituido como grupo de cebadores para la amplificación de una región aguas arriba del gen ilvA de resistencia a la retroalimentación, y se sintetizaron un ADN que consistía en la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 125 que contenía la secuencia mutante con el codón sustituido y un ADN que consistía en la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 126 como grupo de cebadores para la amplificación un una región aguas abajo del gen ilvA de de resistencia a la retroalimentación.

Se llevó a cabo la PCR utilizando cada grupo de los ADN anteriores como grupo de cebadores, para amplificar un fragmento de ADN que contenía un gen de resistencia a cloranfenicol para la preparación de una cepa que tenía una deleción del gen ilvA utilizando ADN de pKD3 como molde, y para amplificar las regiones aguas arriba y aguas abajo del gen ilvA de resistencia a la retroalimentación utilizando el ADN cromosómico de Escherichia coli W3110 como molde. Esto es, la PCR se llevó a cabo mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprendía 0,1 µg del ADN cromosómico o 10 ng del ADN plasmídico, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu, (10 x) y 200 µmoles/l de cada uno de los desoxiNTP.

Se sometió un décimo de las mezclas de reacción resultantes a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado el fragmento deseado. Después, la mezcla de reacción restante se mezcló con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE.

La mezcla resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con el doble de volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos, seguido de centrifugación para precipitar el ADN. Luego, el producto precipitado de ADN se disolvió en 20 µl de TE. Mediante este procedimiento, se obtuvieron un fragmento de ADN que contenía un gen de resistencia a cloranfenicol para la deleción del gen ilvA, una región aguas arriba del gen ilvA de resistencia a la retroalimentación y una región aguas abajo del gen ilvA de resistencia a la retroalimentación.

Después, se llevó a cabo una PCR cruzada utilizando, de los fragmentos amplificados por PCR anteriores, la región aguas arriba del gen ilvA de resistencia a la retroalimentación y la región aguas abajo del gen ilvA de resistencia a la retroalimentación como moldes y utilizando los ADN que consistían en las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 123 y 126 como grupo de cebadores. La PCR se llevó a cabo en las mismas condiciones que antes.

La PCR anterior produjo un fragmento de ADN para la preparación de una cepa con el gen ilvA de resistencia a la retroalimentación sustituido en la cual la región aguas arriba del gen ilvA de resistencia a la retroalimentación y la región aguas abajo del gen ilvA de resistencia a la retroalimentación están ligados.

(2) Preparación de Escherichia coli JM101 en la Cual se ha Insertado el Gen de Resistencia a Fármacos en el Gen ilvA Sobre el ADN Cromosómico de Escherichia coli

La Escherichia coli JM101/pKD46 cultivada en presencia de 10 mmoles/l de L-arabinosa y 50 µg/ml de ampicilina se transformó mediante electroporación utilizando el fragmento de ADN que contenía el gen de resistencia a cloranfenicol para la deleción del gen ilvA obtenido en el apartado (1) anterior. Se seleccionó una cepa recombinante, en la cual se había insertado el gen de resistencia a cloranfenicol en el gen ilvA del ADN cromosómico de Escherichia coli JM101 y el gen estructural ilvA se había suprimido, sobre medio de agar LB que contenía 25 mg/l cloranfenicol.

Se elaboraron réplicas de la cepa resistente a cloranfenicol obtenida sobre medio de agar LB que contenía 25 mg/l de cloranfenicol, seguido de aislamiento de colonias individuales a 30°C. Después, se elaboraron las réplicas de las colonias obtenidas sobre medio de agar LB que contenía 25 mg/l de cloranfenicol y 100 mg/l de ampicilina para seleccionar las colonias que mostraban resistencia a cloranfenicol y resistancia a ampicilina.

La PCR de colonias se llevó a cabo en las cepas obtenidas utilizando, como grupo de cebadores, los ADN que tienen las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 123 y 126, esto es, las secuencias de nucleótidos localizadas aproximadamente 400 pb aguas arriba y aguas abajo del sitio en el cual se había insertado el gen de resistencia a cloranfenicol en el ADN cromosómico. Esto es, se llevó a cabo la PCR de colonias mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprendía las células en una cantidad obtenida poniendo en contacto una punta de pipeta de 200-µl con la colonia, 0,5 µmoles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades of ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200 µmoles/l de cada uno de los desoxiNTP.

De las cepas sometidas a PCR de colonias, se identificó una cepa en la cual se había amplificado un fragmento de aprox. 2 kb que contenía el gen de resistencia a cloranfenicol como una cepa que tenía una deleción del gen ilvA y se denominó Escherichia coli JIACml/pRD46.

(3) Preparación de Escherichia coli JM101 en la Cual el Gen ilvA del ADN Cromosómico está Sustituido por el Gen ilvA de Resistencia a la Retroalimentación

Se cultivó la Escherichia coli JIACml/pKD46 preparada en el apartado (2) anterior en presencia de 10 mmoles/l de L-arabinosa y 50 µg/ml de ampicilina y después se transformó mediante electroporación utilizando los fragmentos de ADN para la preparación de una cepa con el gen ilvA de resistencia a la retroalimentación sustituido obtenida en el apartado (1) anterior. Se seleccionó una cepa en la cual se había sustituido el gen ilvA del ADN cromosómico de la cepa JIACm1 por el gen ilvA de resistencia a la retroalimentación sobre medio de agar que contenía medio M9 y glucosa utilizando la recuperación del requerimiento de isoleucina como marcador.

Se elaboraron réplicas de la cepa resistente a ampicilina que se había desarrollado sobre medio de agar sin fármacos que contenía medio M9 y glucosa, seguido de aislamiento de colonias individuales a 42°C. Después, se elaboraron réplicas de las colonias obtenidas sobre medio de agar LB sin fármaco, medio de agar LB que contenía 25 mg/l de cloranfenicol y medio de agar LB que contenía 100 mg/l de ampicilina para seleccionar una colonia que mostraba sensibilidad a cloranfenicol y sensibilidad a ampicilina. Se confirmó que la cepa obtenida era la cepa con el gen ilvA liberado de la inhibición sustituido, que se denominó Escherichia coli JIA1.

(4) Preparación de Escherichia coli JILG+1 en la Cual el Gen ilvA del ADN Cromosómico está Sustituido por el GenilvA Liberado de la Inhibición

Los procedimientos de los apartados (1) a (3) anteriores se llevaron a cabo utilizando, como cepa parental, Escherichia coli JILG+1 preparada en el Ejemplo 7 en lugar de Escherichia coli JM101 para obtener una cepa en la cual se había suprimido el gen ilvL, se había sustituido el gen ilvG por el gen ilvG revertiente y se había sustituido el gen ilvA por el gen ilvA de resistencia a la retroalimentación. La cepa obtenida se denominó Escherichia coli JILG+IAl.

Ejemplo 9

Preparación de una Cepa que Tiene una Sustitución del GenleuA Mutante

(1) Clonación de un Fragmento de ADN que Contiene un Gende Resistencia a Fármacos para la Preparación de una CepaQue Tiene una Deleción del Gen leuA y un Fragmento de ADNpara la Preparación de una Cepa Que Tiene una Sustitución del leuA Mutante

La secuencia de nucleótidos del gen leuA de Escherichia coli K12 ya se había descrito [Science, 5331, 1453-1474 (1997)].

La Escherichia coli PERM BP-4704 es una cepa productora de leucina seleccionada por su resistencia a un análogo de leucina (4-azaleucina) (Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada Núm. 70879/96) y se considera que tiene el gen leuA mutante que codifica la isopropil malato sintasa liberada esencialmente de la inhibición por L-leucina.

Basándose en la secuencia de nucleótidos referida, se sintetizaron los ADN que consistían en las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 127 y 128 como grupo de cebadores para amplificar un fragmento de ADN que contenía un gen de resistencia a fármaco para la preparación de una cepa que tenía una deleción del gen leuA utilizando un sintetizador de ADN (Modelo 8905. PerSeptive Biosystems. Inc.).

Los ADN tienen secuencias de nucleótidos homólogas a

las secuencias de nucleótidos de 36 pb que se encuentran aguas arriba y aguas abajo del gen diana que se va a suprimir.

Por separado, el ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 129, esto es, la secuencia de nucleótidos localizada aproximadamente 200 pb aguas arriba del codón de iniciación del gen leuA,y el DNA que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 130, esto es, la secuencia de nucleótidos localizada aproximadamente 200 pb aguas abajo del codón de terminación del gen leuA en orientación inversa fueron sintetizados como grupo de cebadores para amplificar un fragmento de ADN para la preparación de una cepa que tenía una sustitución del gen leuA mutante.

Se llevó a cabo la PCR, utilizando cada grupo de los ADN anteriores como grupo de cebadores, para amplificar un fragmento de ADN que contenía un gen de resistencia a cloranfenicol para la preparación de una cepa que tenía una deleción del gen leuA utilizando ADN de pKD3 como molde, y para amplificar un fragmento de ADN para la preparación de una cepa que tenía una sustitución del gen leuA mutante utilizando el ADN cromosómico de la cepa FERM BP-4704 preparada mediante un método común como molde.

Esto es, se llevó a cabo la PCR mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94°C durante un minuto, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 3 minutos, utilizando 40 µl de una mezcla de reacción que comprendía 0,1 µg del ADN cromosómico o 10 ng del ADN plasmídico, 0,5 µ moles/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 µl de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200

µmoles/l de cada uno de los desoxiNTP.

Un décimo de cada una de las mezclas de reacción resultantes se sometió a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado el fragmento deseado. Después, la mezcla de reacción restante se mezcló con una cantidad igual de fenol/cloroformo saturado con TE.

La mezcla resultante se centrifugó, y la capa superior obtenida se mezcló con el doble de volumen de etanol frío y se dejó reposar a -80°C durante 30 minutos, seguido de centrifugación para precipitar el ADN. Luego, se disolvió el producto precipitado de ADN en 20 µl de TE. Mediante este procedimiento, se obtuvieron un fragmento de ADN que contenía un gen de resistencia a cloranfenicol para la preparación de una cepa que tenía una deleción del gen leuA y un fragmento de ADN para la preparación de una cepa que tenía una sustitución del gen leuA mutante.

(2) Preparación de Escherichia coli JM101 en la Cual se Inserta el Gen de Resistencia a Fármacos en el Gen leuA del ADN Cromosómico

Se preparó una cepa mutante de Escherichia coli en la cual se había insertado el gen de resistencia a cloranfenicol en el gen leuA del ADN cromosómico de Escherichia coli JM101 mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 8 (2).

La inserción del gen de resistencia a cloranfenicol en el ADN cromosómico se confirmó llevando a cabo la PCR de colonias utilizando, como grupo de cebadores, ADN que consistían en las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NOS: 131 y 132, esto es, las secuencias de nucleótidos localizadas aproximadamente 200 pb aguas arriba y aguas abajo del sitio en el cual se había insertado el gen de resistencia a cloranfenicol.

Se llevó a cabo la PCR en las mismas condiciones que en el Ejemplo 8 (2). De las cepas sometidas a PCR de colonias, se identificó una cepa con la que se había amplificado un fragmento de aprox. 2 kb que contenía el gen de resistencia a cloranfenicol como cepa que tenía una deleción del gen leuA en la cual se había insertado el gen de resistencia a cloranfenicol en el gen leuA,y se denominó Escherichia coli JLACml/pKD46.

(3) Preparación de Escherichia coli JM101 en la Cual el Gen leuA del ADN Cromosómico es Sustituido por el Gen Mutante Derivado de Escherichia coli H-9070

Se llevó a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 8 (3) utilizando el fragmento de ADN para la preparación de una cepa que tenía una sustitución del gen leuA mutante obtenida en el apartado (1) anterior y Escherichia coli JLACm1/pKD46 obtenida en el apartado (2) anterior para obtener una cepa recombinante en la cual se había sustituido el gen leuA en el cual se había insertado el gen de resistencia a cloranfenicol en el ADN cromosómico de Escherichia coli JLAOnl/pKD46 por el gen leuA mutante. La cepa obtenida se denominó Escherichia coli JLA1.

(4) Preparación de Escherichia coli JILG+1 en la Cual el Gen leuA del ADN Cromosómico es Sustituido por el GenleuA Mutante

Se llevaron a cabo los procedimientos de los apartados (1) a (3) anteriores utilizando, como cepa parental, Escherichia coli JILG+1 preparada en el Ejemplo 7 en lugar de Escherichia coli JM101 para obtener una cepa en la cual se había suprimido el gen ilvL, después se sustituyó el gen ilvG por el gen ilvG revertiente y se sustituyó el gen leuA por el gen leuA mutante. La cepa obtenida se denominó Escherichia coli JILG+LA1.

Ejemplo 10

Producción Fermentativa de L-Ala-L-Ala Utilizando un Microorganismo que Tiene la Capacidad de Producir L-Alanina

Se transformó Escherichia coli JM101 con el plásmido pPE86 que expresaba el gen ywfE y el gen ald ambos derivados de Bacillus subtilis obtenido en el Ejemplo 2, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C. Se extrajo un plásmido de la cepa que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido. Mediante digestión con enzimas de restricción, se confirmó que se había obtenido Escherichia coli JM101 que portaba el plásmido pPE86 (referida en adelante como Escherichia coli JM101/pPE86). También se obtuvieron Escherichia coli JM101 que portaba el plásmido pTrS30 (referida en adelante como Escherichia coli JM101/pTrS30) y Escherichia coli JM101 que portaba el plásmido pPE56 (referida en adelante como Escherichia coli JM101/pPE56) de la misma manera.

Cada uno de los transformantes obtenidos se inoculó en 8 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo y se cultivó a 28°C durante 17 horas. El cultivo resultante se inoculó en 8 ml de un medio de producción [16 g/l de hidrogenofosfato de

dipotasio, 14 g/l de dihidrogenofosfato de potasio, 5 g/l de sulfato de amonio, 1 g/l de ácido cítrico (anhidro), 5 g/l de Casaminoácido (Difco), 10 g/l de glucosa, 10 mg/l de vitamina B1, 25 mg/l de sulfato de magnesio 5 heptahidratado y 50 mg/l de sulfato ferroso heptahidratado; pH ajustado a 7,2 con 10 moles/l de hidróxido de sodio; se añadieron glucosa, vitamina B1, sulfato de magnesio heptahidratado y sulfato ferroso heptahidratado después de una esterilización con vapor

10 por separado] que contenía 100 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo en una cantidad de 1% y se cultivó a 30°C durante 24 horas. El cultivo resultante se centrifugó para obtener un sobrenadante de cultivo.

15 El producto del sobrenadante de cultivo se derivatizó mediante el método de F-moc y después se analizó mediante HPLC. El análisis HPLC se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 17. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

20

Tabla 6

imagen1: L-Ala-L-Ala (mg/l) L-Ala (mg/l)

JM101/pTrS30: 0 0

JM101/pPE56: 0 1

JM101/pPE86: 7 667

Ejemplo 11

25 Producción Fermentativa de L-Ala-L-Gln Utilizando un Microorganismo que Tiene la Capacidad de Producir L-Ala yL-Gln

Se transformó Escherichia coli JGLBE1 que tenía la 30 doble deleción del gen glnE y el gen glnB obtenida en el Ejemplo 1 con el plásmido pPE86 obtenido en el Ejemplo 2, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C. Se extrajo un plásmido de una colonia que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido. Mediante digestión con enzimas de restricción, se confirmó que se había obtenido Escherichia coli JGLBE1 que portaba el plásmido, y la cepa se denominó Escherichia coli JGLBE1/pPB86. También se obtuvieron de la misma manera Escherichia coli JGLBB1 que portaba el plásmido pTrS30 (referida en adelante como Escherichia coli JGLBE1/pTrS30) y Escherichia coli JGLBB1 que portaba el plásmido pPB56 (referida en adelante como Escherichia coli JGLBE1/pPE56).

Cada uno de los transformantes obtenidos se inoculó en 8 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo y se cultivó a 28°C durante 17 horas. El cultivo resultante se inoculó en 8 ml del medio de producción descrito en el Ejemplo 10 que contenía 100 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo en una cantidad de 1% y se cultivó a 30°C durante 24 horas. El cultivo resultante se centrifugó para obtener un sobrenadante de cultivo.

El producto del sobrenadante de cultivo se derivatizó mediante el método de F-moc y después se analizó mediante HPLC. Se llevó a cabo el análisis de HPLC de la misma manera que en el Ejemplo Experimental

17. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7

imagen1: L-Ala-L-Gln (mg/l) L-Gln (mg/l)

JGLBE1/pTrS30: 0 183

JGLBB1/pPE56: 6 1063

JGLBB1/pPE86: 72 311

Ejemplo 12

5 Producción Fermentativa de L-Ala-L-Phe Utilizando un Microorganismo que Tiene la Capacidad de Producir L-Ala yL-Phe

Se transformó Escherichia coli JM101/pPB86 obtenida

10 en el Ejemplo 10 con cada uno de los plásmidos pPHBA2 que expresaban el gen pheA de resistencia a la retroalimentación derivado de Escherichia coli y el plásmido pPHEAF2 que expresaba el gen pheA de resistencia a la retroalimentación y el gen aroF de resistencia a la

15 retroalimentación derivado de Escherichia coli construido en el Ejemplo 3, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina y 30 µg/ml de cloranfenicol, y se cultivó durante la noche a 30°C. Se extrajo un plásmido de una colonia de cada cepa que

20 crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido, y se confirmó que se habían obtenido las cepas de Escherichia coli JM101/pPE86 que portaban respectivamente pPHEA2 y pPHEAP2 (referidas en adelante como Escherichia coli JM101/pPE86/pPHEA2 y Escherichia coli

25 JM101/pPE86/pPHBAF2, respectivamente). De la misma manera, se transformaron Escherichia coli JM101/pTrS30 y Escherichia coli JM101/pPE56 obtenidas en el Ejemplo 10 con cada uno pPHEA2 y pPHEAF2 para obtener Escherichia coli JM101/pTrS30 que portaba pPHEA2 (referida en

30 adelante como Escherichia coli JM101/pTrS30/pPHEA2), Escherichia coli JM101/pTrS30 que portaba pPHEAF2 (referida en adelante como Escherichia coli JM101/pTrS30/pPHEAP2), Escherichia coli JM101/pPE56 que portaba pPHEA2 (referida en adelante como Escherichia

5 coli JM101/pPE56/pPHBA2) y Escherichia coli JM101/pPE56 que portaba pPHEAF2 (referida en adelante como Escherichia coli JM101/pPE56/pPHEAF2).

Cada uno de los transformantes obtenidos se inoculó

10 en 8 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina y 30 µg/ml de cloranfenicol en un tubo de ensayo y se cultivó a 28°C durante 17 horas. El cultivo resultante se inoculó en 8 ml del medio de producción descrito en el Ejemplo 10 que contenía 100 µg/ml de ampicilina y 50

15 µg/ml de cloranfenicol en un tubo de ensayo en una cantidad de 1% y se cultivó a 30°C durante 24 horas. El cultivo resultante se centrifugó para obtener un sobrenadante de cultivo.

20 El producto del sobrenadante de cultivo se derivatizó mediante el método F-moc y después se analizó mediante HPLC. El análisis HPLC se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 17. Los resultados se muestran en la Tabla 8.

25

Tabla 8

imagen1: L-Ala-L-Phe(mg/l) L-Phe(mg/l)

JM101/pTrS30/pPHEA2: 0 37

JM101/pTrS30/pPHSAF2: 0 77

JM101/pPE56/pPHEA2: 129 54

JM101/pPE56/pPHEAF2: 294 104

JM101/pPE86/pPHBA2: 277 91

JM101/pPE86/pPHEAF2: 340 118

Ejemplo 13

Producción Fermentativa de L-Treonil-L-fenilalanina (L-Thr-L-Phe) Utilizando un Microorganismo que Tiene lacapacidad de Producir L-Thr y L-Phe

Se transformó Escherichia coli β IM-4 (ATCC 21277) que mostraba requerimiento de prolina, metionina, isoleucina y tiamina, transmitido con resistencia a ácido α-amino-β-hidroxivalerico y que tenía la capacidad de producir L-Thr con el plásmido de pPE56 con la expresión de ywfE intensificada obtenido en el Ejemplo Experimental 15, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C. Se extrajo un plásmido de una colonia que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido. Mediante digestión con enzimas de restricción, se confirmó que se había obtenido Escherichia coli ATCC 21277 que portaba pPB56 (referida en adelante como Escherichia coli ATCC 21277/pPB56).

Después, se transformó Escherichia coli ATCC 21277/pPE56 con cada uno de pSTV28 (Takara Bio Inc.), y pPHEA2 y pPHBAF2 obtenidos en el Ejemplo 3, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina y 30 µg/ml de cloranfenicol, y se cultivó durante la noche a 30°C. Se extrajo un plásmido de una colonia de cada cepa que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido. Mediante digestión con enzimas de restricción, se confirmó que se habían obtenido las cepas de Escherichia coli ATCC 21277/pPE56 que portaban respectivamente pSTV28, pPHEA2 y pPHEAF2 (referida en adelante como Escherichia coli ATCC 21277/pPE56/pSTV28. Escherichia coli ATCC 21277/pPE56/pPHEA2 y Escherichia coli ATCC 21277/pPE56/pPHEAF2, respectivamente). De la misma manera, se obtuvieron Escherichia coli ATCC 21277 que portaba pTrS30 y pSTV28 (referida en adelante como Escherichia coli ATCC 21277/pTrS30/pSTV28), Escherichia coli ATCC 21277 que portaba pTrS30 y pPHEA2 (referida en adelante como Escherichia coli ATCC 21277/pTrS30/pPHBA2) y Escherichia coli ATCC 21277 que portaba pTrS30 y pPHEAF2 (referida en adelante como Escherichia coli ATCC 21277/pTrS30/pPHEAF2).

Cada uno de los transformantes obtenidos se inoculó en 8 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina y 30 µg/ml de cloranfenicol en un tubo de ensayo y se cultivó a 28°C durante 17 horas. El cultivo resultante se inoculó en 8 ml del medio de producción descrito en el Ejemplo 10 que contenía 100 µg/ml de ampicilina y 50 µg/ml de cloranfenicol en un tubo de ensayo en una cantidad de 1% y se cultivó a 30°C durante 24 horas. El cultivo resultante se centrifugó para obtener un sobrenadante de cultivo.

El producto del sobrenadante de cultivo se derivatizó mediante el método de F-moc y después se analizó mediante HPLC. El análisis de HPLC se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo Experimental

17. Los resultados se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9

imagen1: L-Thr-L-Phe (mg/l) L-Thr (mg/l) L-Phe (mg/l)

ATCC21277/pTrS30/pSTV28: 0 180 80

ATCC21277/pTrS30/pPHEA2: 0 30 210

ATCC21277/pTrS30/pPHEAF2: 0 30 170

ATCC21277/pPE56/pSTV28: 230 300 70

ATCC21277/pPE56/pPHEA2: 410 250 110

ATCC21277/pPE56/pPHEAF2: 460 270 0

Ejemplo 14

5 Producción Fermentativa de L-Ala-L-Tyr Utilizando un Microorganismo que Tiene la Capacidad de Producir L-Ala yL-Tyr

Se transformó Escherichia coli JM101/pPE86 obtenida

10 en el Ejemplo 10 con el plásmido pTY2 que expresaba el operón aroF-tyrA mutante resistente a tirosina derivado de la Escherichia coli construida en el Ejemplo 4, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina y 30 µg/ml de cloranfenicol, y se cultivó

15 durante la noche a 30°C. Se extrajo un plásmido de una colonia de la cepa que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido, y se confirmó que se había obtenido Escherichia coli JM101/pPE86 que portaba pTY2 (referida en adelante como Escherichia coli

20 JM101/pPS86/pTY2). De la misma manera, se transformaron Escherichia coli JM101/pTrS30 y Escherichia coli JM101/pPE56 obtenidas en el Ejemplo 10 con pTY2 para obtener Escherichia coli JM101/pTrS30 que portaba pTY2 (referida en adelante como Escherichia coli

25 JM101/pTrS30/pTY2) y Escherichia coli JM101/pPE56 que portaba pTY2 (referida en adelante como Escherichia coli JM101/pPE56/pTY2).

Cada uno de los transformantes obtenidos se inoculó

5 en 8 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina y 30 µg/ml de cloranfenicol en un tubo de ensayo y se cultivó a 28°C durante 17 horas. El cultivo resultante se inoculó en 8 ml del medio de producción descrito en el Ejemplo 10 que contenía 100 µg/ml de ampicilina y 50

10 µg/ml de cloranfenicol en un tubo de ensayo en una cantidad de 1% y se cultivó a 30°C durante 24 horas. El cultivo resultante se centrifugó para obtener un sobrenadante de cultivo.

15 El producto del sobrenadante de cultivo se derivatizó mediante el método de F-moc y después se analizó mediante HPLC. El análisis de HPLC se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo Experimental

17. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

20

Tabla 10

imagen1: L-Ala-L-Tyr (mg/l) L-Tyr (mg/l)

JM101/pTrS30/pTY2: 0 1

JM101/pPE56/pTY2: 51 6

JM101/pPE86/pTY2: 63 7

Ejemplo 15

25 Producción Fermentativa de L-Alanil-L-metionina (L-Ala-L-Met) Utilizando un Microorganismo que Tiene la Capacidad de Producir L-Ala y L-Met

Se transformó Escherichia coli JMJ1 obtenida en el 30 Ejemplo 5 con pPES6 obtenido en el Ejemplo 2, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C. Se extrajo un plásmido de una colonia de la cepa que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido. Mediante digestión con enzimas de restricción, se confirmó que se había obtenido Escherichia coli JMJ1 que portaba pPE86, y la cepa se denominó Escherichia coli JMJ1/pPE86. De la misma manera, se obtuvieron Escherichia coli JMJ1 que portaba pTrS30 (referida en adelante como Escherichia coli JHJ1/pTrS30) y Escherichia coli JMJ1 que portaba pPE56 (referida en adelante como Escherichia coli JMJ1/pPB56).

El producto del sobrenadante de cultivo se derivatizó mediante el método F-moc y después se analizó mediante HPLC. El análisis de HPLC se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 17. Los resultados se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11

imagen1: L-Ala-L-Met (mg/l) L-Met (mg/l)

JMJ1/pTrS30: 0 16

JMJ1/pPE56: 0 61

JHJ1/pPE86: 113 180

Los resultados mostrados en los Ejemplos 10 a 15 revelaron que un microorganismo que tiene la capacidad de producir una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos y la capacidad de producir una o más clases de aminoácidos forma y acumula el dipéptido en un medio cuando se cultiva en él, y la capacidad para producir el dipéptido de un microorganismo que tiene la capacidad de producir dos aminoácidos es mayor que la de un microorganismo que tiene la capacidad de producir un aminoácido en el microorganismo anterior.

Ejemplo 16

Producción Fermentativa de L-Ala-L-Ala Utilizando un Microorganismo que Tiene la Capacidad de Producir L-Ala yque Tiene Deleciones de los Genes de Peptidasa y un Operón de la Proteína de penetración/transporte de Dipéptidos

Se transformó Escherichia coli JPNDDP36 que tenía deleciones de los genes pepD y pepN y el operón dpp obtenida en el Ejemplo Experimental 16 (4) con cada uno de pTrS30, y pPE56 y pPE86 obtenidos en el Ejemplo 2, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C. Se extrajo un plásmido de una colonia de cada una de las cepas que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido. Mediante digestión con enzimas de restricción, se confirmó que se habían obtenido las cepas de Escherichia coli JPNDDP36 que portaban respectivamente pTrS30, pPE56 y pPE86 (referidas en adelante como Escherichia coli JPNDDP36/pTrS30, Escherichia coli JPNDDP36/pPE56 y Escherichia coli JPNDDP36/pPE86, respectivamente).

Cada uno de los transformantes obtenidos se cultivó de la misma manera que en el Ejemplo 10 y el producto del sobrenadante de cultivo se analizó de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 17. Los resultados se muestran en la Tabla 12.

Tabla 12

imagen1: L-Ala-L-Ala (mg/l) L-Ala (mg/l)

JPNDDP36/pTrS30: 0 0

JPNDDP36/pPE56: 0 1

JPNDDP36/pPE86: 10 2

Ejemplo 17

10 Producción Fermentativa de L-Ala-L-Gln Utilizando un Microorganismo que Tiene la Capacidad de Producir L-Ala yL-Gln y que Tiene Deleciones de los Genes de Peptidasa yun Operón de la Proteína de penetración/transporte de

15 Dipéptidos

(1) Construcción de un Microorganismo que Tiene laCapacidad de Producir L-Ala y L-Gln y que Tiene Deleciones de los Genes de Peptidasa y un Operón de la

20 Proteína de penetración/transporte de Dipéptidos

De acuerdo con el mismo procedimiento que en el

Ejemplo 1, se introdujeron las deleciones del gen glnE y

el gen glnB en la Escherichia coli JPNDDP36 obtenida en

25 el Ejemplo Experimental 16 (4) para obtener Escherichia coli JPNDDPGBE1 que tiene la capacidad de producir L-Ala y L-Gln y que tiene las deleciones de los genes de peptidasa y un operón de la proteína de penetración/transporte de dipéptidos.

30

(2) Producción Fermentativa de L-Ala-L-Gln

Se transformó la Escherichia coli JPNDDPGBE1 obtenida en el apartado (1) anterior con cada uno de 5 pTrS30, pPE56 y pPE86 de la misma manera que en el Ejemplo 16 para obtener cepas de Escherichia coli JPNDDPGBE1 que portaban los respectivos plásmidos (referidas en adelante como Escherichia coli JPNDDPGBE1/pTrS30, Escherichia coli JPNDDPGBB1/pPB56 y 10 Escherichia coli JPNDDPGBR1/pPE86, respectivamente). Cada uno de los transformantes obtenidos se cultivó de la misma manera que en el Ejemplo 10 y el producto del sobrenadante de cultivo se analizó de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 17. Los resultados se muestran

15 en la Tabla 13.

Tabla 13

imagen1: L-Ala-L-Gln (mg/l) L-Gln (mg/l)

JPNDDPGHE1/pTrS30: 0 1329

JPNDDPGBB1/pPE56: 400 1625

JPNDDPGBE1/pPE86: 1053 504

Ejemplo 18

20 Producción Fermentativa de L-Ala-L-Tyr Utilizando un Microorganismo que Tiene la Capacidad de Producir L-Ala yL-Tyr y que Tiene Deleciones de los Genes de Peptidasa yun Operón de la Proteína de penetración/transporte de

25 Dipéptidos
Se transformó la Escherichia coli JPNDDP36 obtenida
en el Ejemplo Experimental 16 con pPE86 obtenido en el
Ejemplo 2, se diseminó sobre medio de agar LB que
30 contenía 50 µg/ml de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C. Se extrajo un plásmido de una colonia de la cepa que había crecido en el medio de acuerdo con un método conocido. Mediante digestión con enzimas de restricción, se confirmó que se había obtenido Escherichia coli JPNDDP36 que portaba pPE86, y la cepa se denominó Escherichia coli JPNDDP36/pPE86. De la misma manera, se obtuvieron Escherichia coli JPNDDP36 que portaba pTrS30 (referida en adelante como Escherichia coli JPNDDP36/pTrS30) y Escherichia coli JPNDDP36 que portaba pPE56 (referida en adelante como Escherichia coli JPNDDP36/pPE56).
Los transformantes obtenidos se transformaron con pTY2 obtenido en el Ejemplo 4 para obtener los siguientes transformantes que portaban pTY2: Escherichia coli JPNDDP36/pTrS30/pTY2, Escherichia coli JPNDDP36/pPE56/pTY2 y Escherichia coli JPNDDP36/pPE86/pTY2.
Cada uno de los transformantes obtenidos se inoculó en 8 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo en un tubo de ensayo y se cultivó a 28°C durante 17 horas. El cultivo resultante se inoculó en 8 ml del medio de producción descrito en el Ejemplo 10 que contenía 100 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo en una cantidad de 1% y se cultivó a 30°C durante 24 horas. El cultivo resultante se centrifugó para obtener un sobrenadante de cultivo.
El producto del sobrenadante de cultivo se derivatizó mediante el método F-moc y después se analizó mediante HPLC. El análisis de HPLC se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 17. Los resultados se muestran en la Tabla 14.
Tabla 14

imagen1: L-Ala-L-Tyr (mg/l) L-Tyr (mg/l)

JPNDDP36/pTrS30/pTY2: 0 41

JPNDDP36/PpE56/pTY2: 301 16

JPNDDP36/pPE86/pTY2: 367 8

Ejemplo 19
5 Producción Fermentativa de L-Ala-L-Val Utilizando un Microorganismo que Tiene la Capacidad de Producir L-Ala yL-Val y que tiene Deleciones de los Genes de Peptidasa yun Operón de la Proteína de penetración/transporte deDipéptidos
10 Se preparó Escherichia coli JPNDDPILG+1 en la cual se había suprimido el gen ilvL y se había revertido la mutación por desplazamiento del marco del gen ilvG utilizando, como cepa parental, la cepa mutante que tenía
15 deleciones de los genes de peptidasa y un operón de la proteína de penetración/transporte de péptidos obtenida en el Ejemplo Experimental 16 de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 7.
20 Se transformó Escherichia coli JPNDDPILG+1 con pPE86 obtenido en el Ejemplo 2, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C. Se extrajo un plásmido de la cepa que crecía sobre el medio de acuerdo con un método
25 conocido. Mediante digestión con enzimas de restricción, se confirmó que se había obtenido Escherichia coli JPNDDPILG+1 que portaba el plásmido pPE86 (referida en adelante como Escherichia coli JPNDDPILG+1/pPE86). De la misma manera, se obtuvieron Escherichia coli JPNDDPILG+1
30 que portaba el plásmido pTrS30 (referida en adelante como Escherichia coli JPNDDPILG+1/pTrS30) y Escherichia coli JPNDDPILG+1 que portaba el plásmido pPB56 (referida en adelante como Escherichia coli JPNDDPILG+1/pPE56).
Cada uno de los transformantes obtenidos se inoculó en 8 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo y se cultivó a 28°C durante 17 horas. El cultivo resultante se inoculó en 8 ml de un medio [16 g/l de hidrogenofosfato de dipotasio, 14 g/l de dihidrogenofosfato de potasio, 5 g/l de sulfato de amonio, 1 g/l de ácido cítrico (anhidro), 5 g/l de Casaminoácido (Difco), 10 g/l de glucosa, 10 mg/l de vitamina B1, 25 mg/l de sulfato de magnesio heptahidratado y 50 mg/l de sulfato ferroso heptahidratado; pH ajustado a 7,2 con 10 moles/l de hidróxido de sodio; se añadieron glucosa, vitamina B1, sulfato de magnesio heptahidratado y sulfato ferroso heptahidratado después de la esterilización con vapor por separado] que contenía 100 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo en una cantidad de 1% y se cultivó a 30°C durante 24 horas. El cultivo resultante se centrifugó para obtener un sobrenadante de cultivo.
El producto del sobrenadante de cultivo se derivatizó mediante el método F-moc y después se analizó mediante HPLC. El análisis de HPLC se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 17. Los resultados se muestran en la Tabla 15.
Tabla 15

imagen1: L-Ala-L-Va1 (mg/l) L-Val (mg/l)

JPNDDPILG+1/pTrS30: 0 220

JPNDDPILG+1/pPB56: 62 171

JPNDDPILG+1/pPE86: 300 240

Ejemplo 20
Producción Fermentativa de L-Ala-L-Ile Utilizando un Microorganismo que Tiene la Capacidad de Producir L-Ala yL-Ile y que Tiene Deleciones de los Genes de Peptidasa yun Operón de la Proteína de penetración/transporte deDipéptidos
Se preparó Escherichia coli JPNDDPILG+IA1 en la cual se había suprimido el gen ilvL, se había revertido la mutación por desplazamiento del marco del gen ilvG y se había sustituido el gen ilvA por el gen ilvA liberado de la inhibición utilizando, como cepa parental, Escherichia coli JPNDDP36, la cepa mutante que tenía deleciones de los genes de peptidasa y un operón de la proteína de penetración/transporte de péptidos obtenida en el Ejemplo Experimental 16 de acuerdo con los métodos descritos en los Ejemplos 7 y 8.
Se transformó Escherichia coli JPNDDPILG+IA1 con pPE86 obtenido en el Ejemplo 2, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C. Se extrajo un plásmido de una colonia de la cepa que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido. Mediante digestión con enzimas de restricción, se confirmó que se había obtenido Escherichia coli JPNDDPILG+IA1 que portaba pPB86, y la cepa se denominó Escherichia coli JPNDDPILG+IA1/pPB86. De la misma manera, se obtuvieron Escherichia coli JPNDDPILG+IA1 que portaba pTrS30 (referida en adelante como Escherichia coli JPNDDPILG+IA1/pTrS30) y Escherichia coli JPNDDPILG+IA1 que portaba pPB56 (referida en adelante como Escherichia coli JPNDDPILG+IA1/pPB56).
Cada uno de los transformantes obtenidos se inoculó en 8 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo y se cultivó a 28°C durante 17 horas. El cultivo resultante se inoculó en 8 ml del medio de producción descrito en el Ejemplo 10 que contenía 100
5 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo en una cantidad de 1% y se cultivó a 30°C durante 24 horas. El cultivo resultante se centrifugó para obtener un sobrenadante de cultivo.
10 El producto del sobrenadante de cultivo se derivatizó mediante el método F-moc y después se analizó mediante HPLC. El análisis de HPLC se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 17. Los resultados se muestran en la Tabla 16.
15
Tabla 16

imagen1: L-Ala-L-Ile (mg/l) L-Ile (mg/l)

JPNDDPILG+IA1/pTrS30: 0 124

JPNDDPILG+IA1/pPE56: 21 212

JPNDDPILG+IA1/pPE86: 159 189

Ejemplo 21
20 Producción Fermentativa de L-Ala-L-Leu Utilizando un Microorganismo que Tiene la Capacidad de Producir L-Ala yL-Leu y que Tiene Deleciones de los Genes de Peptidasa y un Operón de la Proteína de penetración/transporte deDipéptidos
25 Se preparó Escherichia coli JPNDDPILG+LA1 en la cual se había suprimido el gen ilvL, se había revertido la mutación por desplazamiento del marco del gen ilvG y se había sustituido el gen leuA por el gen leuA mutante
30 utilizando, como cepa parental, Escherichia coli JPNDDP36, la cepa mutante que tenía deleciones de los genes de peptidasa y un operón de la proteína de penetración/transporte de péptidos obtenida en el Ejemplo Experimental 16 de acuerdo con los métodos descritos en los Ejemplos 7 y 9. La cepa obtenida se transformó con pPB86 obtenido en el Ejemplo 2, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, y se cultivó durante la noche a 30°C. Se extrajo un plásmido de una colonia de la cepa que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido. Mediante digestión con enzimas de restricción, se confirmó que se había obtenido Escherichia coli JPNDDPILG+LA1 que portaba pPE86, y la cepa se denominó Escherichia coli JPNDDPILG+LA1/pPE86. De la misma manera, se obtuvieron Escherichia coli JPNDDPILG+LA1 que portaba pTrS30 (referida en adelante como Escherichia coli JPNDDPILG+LA1/pTrS30) y Escherichia coli JPNDDPILG+LA1 que portaba pPE56 (referida en adelante como Escherichia coli JPNDDPILG+LA1/pPE56).
Cada uno de los transformantes obtenidos se inoculó en 8 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo y se cultivó a 28°C durante 17 horas. El cultivo resultante se inoculó en 8 ml del medio de producción descrito en Ejemplo 10 que contenía 100 µg/ml ampicilina en un tubo de ensayo en una cantidad de 1% y se cultivó a 30°C durante 24 horas. El cultivo resultante se centrifugó para obtener un sobrenadante de cultivo.
El producto del sobrenadante de cultivo se derivatizó mediante el método F-moc y después se analizó mediante HPLC. El análisis de HPLC se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 17. Los resultados se muestran en la Tabla 17.
Tabla 17

imagen1: L-Ala-L-Leu (mg/l) L-Leu (mg/l)

JPNDDPILG+LA1/pTrS30: 0 12

JPNDDPILG+LA1/pPE56: 78 66

JPNDDPILG+LA1/pPE86: 110 25

Ejemplo 22
5 Producción Fermentativa de L-Ser-L-Phe Utilizando un Microorganismo que Tenía la Capacidad de Producir L-Ser yL-Phe y que Tenía deleciones de los Genes de Peptidasa yun Operón de la Proteína de penetración/transporte deDipéptidos
10 Se transformó la Escherichia coli JPNDDP36 obtenida en el Ejemplo Experimental 16 con pSE15 o pPE212 obtenido en el Ejemplo 3, se diseminó sobre medio de agar LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, y se cultivó durante la
15 noche a 30°C. Se extrajo un plásmido de una colonia de cada una de las cepas que crecía sobre el medio de acuerdo con un método conocido. Mediante digestión con enzimas de restricción, se confirmó que se habían obtenido Escherichia coli JPNDDP36 que portaba pSE15 y
20 Escherichia coli JPNDDP36 que portaba pPE212, y la cepa se denominó Escherichia coli JPNDDP36/pSE15 y Escherichia coli JPNDDP36/pPE212, respectivamente.
Los transformantes obtenidos se transformaron con el
25 plásmido pPHEAF2 que expresaba el gen pheA de resistencia a la retroalimentación y el gen aroF de resistencia a la retroalimentación derivado de Escherichia coli construida en el Ejemplo 3 para obtener los siguientes transformantes que portaban pPHEAF2: Escherichia coli
30 JPNDOF36/pSE15/pPHEAF2 y Escherichia coli
JPNDDP36/pPB212/pPHSAF2.
Se inocularon Escherichia coli JPNDDP36/pSE15/pPHEAF2 y Escherichia coli 5 JPNDDP36/pPE212/pPREAF2 en 8 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina y 30 µg/ml de cloranfenicol en un tubo de ensayo, respectivamente y se cultivaron a 28°C durante 17 horas. El cultivo resultante se inoculó en 8 ml del medio de producción descrito en Ejemplo 10 que
10 contenía 100 µg/ml de ampicilina en un tubo de ensayo en una cantidad de 1% y se cultivó a 30°C durante 24 horas. El cultivo resultante se centrifugó para obtener un sobrenadante de cultivo.
15 El producto del sobrenadante de cultivo se derivatizó mediante el método F-moc y después se analizó mediante HPLC. El análisis de HPLC se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 17. Los resultados se muestran en la Tabla 18.
20
Tabla 18

imagen1: L-Ala-L-Tyr (mg/l) L-Ser (mg/l) L-Tyr (mg/l)

JPMDDP36/pSE15/pPHEAF2: 0 7 31

JPNDDP36/pSE212/pPHSAF2: 7 7 10

Los resultados mostrados en los Ejemplos 16 a 22 revelaron que un microorganismo que tiene la capacidad de 25 producir una proteína que tiene actividad formadora de un dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos, que tiene la capacidad de producir una o más clases de aminoácidos, y en el cual las actividades de una o más clases de peptidasas y una o más clases de proteínas de 30 penetración/transporte de péptidos se pierden, o en el
cual las actividades de tres o más clases de peptidasas
se pierden, forma y acumula el dipéptido en un medio
cuando se cultiva en él, y la capacidad para producir el
dipéptido de dicho microorganismo es mayor que la de un
5 microorganismo que tiene la capacidad de producir la
proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a
partir de una o más clases de aminoácidos y la capacidad
de producir una o más clases de aminoácidos, pero en el
que las actividades de cuáquera de las peptidasas y la 10 proteína de penetración/transporte de péptidos no se
pierden.
TEXTO LIBRE DE LA LISTA DE SECUENCIAS
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5 SEQ ID NO: 20 -Descripción de la Secuencia Artificial: ADN Sintético
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15 SEQ ID NO: 25 -Descripción de la Secuencia Artificial: ADN Sintético
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<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. 5 <120> Procedimiento para producir dipéptidos
<130> 1000P11694EPO
<150> JP2004-1B9011
<151> 2004-06-25
<160> 132 10 <170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 472
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis 168 15 <400> 1 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 2
<211> 472
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis ATCC6633
<400> 2 imagen2 imagen1 imagen1
<210> 3
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<212> PRT
<213> Bacillus subtilis IAM1213
<400> 3 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1
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<211> 472
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis IAN1107
<400> 4 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1
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<212> PRT
<213> Bacillus subtilis IAM1214
<400> 5 imagen1 imagen1 imagen1
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<212> PAT
<213> Bacillus subtilis ATCC21555
<400> 6 imagen1 imagen1 imagen1
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<213> Bacillus amyloliquefaciens IF03022
<400> 7 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1
<210> B
<211> 476
<212> PRT
<213> Bacillus pumilus NRRL B-12025
<400> 26 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 9
<211> 1416
<212> ADN
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 9 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 10
<211> 1416
<212> ADN
<213> Bacillus subtilis ATCC6633
<400> 10 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 11
<211> 1416
<212> ADN
<213> Baci11us subtilis IAM1213
<400> 11 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 12
<211> 1416
<212> ADN
<213> Bacillus subtilis IAM1107
<400> 12 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 13
<211> 1416
<212> ADN
<213> Bacillus subtilis IAM1214
<400> 13 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 14
<211> 1416
<212> ADN
<213> Bacillus subtilis ATCC21555
<400> 14 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 15
<211> 1416
<212> ADN
<213> Bacillus amyloliquefaciens IF03022
<400> 15 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 16
<211> 1428
<212> ADN
<213> Bacillus pumilus NRRL B-12025
<400> 16 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 17
<211> 93
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 17 imagen1
<210> 18
<211> 279
<212> ADN
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 18 imagen2
<210> 19
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
10 <220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN Sintético
<400> 19 attctcgagt agagaaggag tgttttacat 30
<210> 20
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético
<400> 20 ttaggatcct catactggca gcacatactt 30
<210> 21
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético
<400> 21 caagaattct catgtttgac agct 24
<210> 22
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético
<400> 22 taactcgaga ttcccttttt acgtgaac 28
<210> 23
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético
<400> 23 ttaaccatgg agagaaaaac agtattg 27
<210> 24
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético
<400> 24 atatggatcc tactggcagc acatactttg 30
<210> 25 <211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
5 <223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético
<400> 25 caccgcagac ggaggataca c 21
<210> 26 10 <211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN15 Sintético
<400> 26 cggacgtcac ccaataatcg tg 22
<210> 27
<211> 23 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético
25 <400> 27 ccgatggcra aagcstgtra acg 23
<210> 28
<211> 21
<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético
<400> 28 10 cggcagatcr gcdtcttttc c 21
<210> 29
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial 15 <220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético
<400> 29
gctaggtctt gaacattgtg caaccc 26 20 <210> 30
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético
<400> 30 ggtgttccga tagactcaat ggc 23
<210> 31
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético
<400> 31 catgccatgg agaaaaaaac tgtacttgtcattgctgact tagg 44
<210> 32
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético
<400> 32 cgcggatccc ttcactaatt catccattaa ctgaatcg 38
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> INCIERTO
<222> (3).
5 <223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO 10 <222> (4)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido, seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220> 15 <221> INCIERTO
<222> (9)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile. Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
20 <220>
<221> INCIERTO
<222> (10)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Leu, Ile, Val, Met y Ala
25 <220>
<221> INCIERTO
<222> (11)
<223> Xaa representa Glu, Ser o Ala
<220>
<221> INCIERTO
<222> (12) 5 <223> Xaa representa Gly, Ser o Ala
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuenciade aminoácidos utilizada para la búsqueda de bases dedatos
10 <400> 33 imagen1
<210> 34
<211> 28
<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial
<220>
<221> INCIERTO
<222> (1)
<223> Xaa representa Leu Ile o Val 20 <220>
<221> INCIERTO
<222> (2)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionado
entre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, 25 Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val <220>
<221> INCIERTO
<222> (3)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (4)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gin, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (5)
<223> Xaa representa Gly o Ala
<220>
<221> INCIERTO
<222> (6)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (7)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Gly, Ser, Ala, Ile y Val <220>
<221> INCIERTO
<222> (9)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Leu, Ile. Val, Met, Cys y Ala
<220>
<221> INCIERTO
<222> (11)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Leu, Ile, Val, Met, Phe y Ala
<220>
<221> INCIERTO
<222> (12)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Leu, Ile, Val, Met, Phe y Ala
<220>
<221> INCIERTO
<222> (13)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (14)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val <220>
<221> INCIERTO
<222> (15)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (16)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (17)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (18)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu. Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (19) <223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (20)
<223> Xaa representa Leu, Ile o Val.
<220>
<221> INCIERTO
<222> (21)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (23)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Leu, Ile, Val, Ala y Pro <220>
<221> INCIERTO
<222> (25)
<223> Xaa representa Ser, Thr o Pro
<220>
<221> INCIERTO
<222> (26) <223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220> 5 <221> INCIERTO
<222> (28)
<223> Xaa representa Gly o Ala
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia
10 de aminoácidos utilizada para la búsqueda en bases dedatos
<400> 34 imagen1
<210> 35 15 <211> 30
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> INCIERTO 20 <222> (1)
<223> Xaa representa Leu Ile o Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (2)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (3)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp. Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (4)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (5)
<223> Xaa representa Gly o Ala
<220>
<221> INCIERTO
<222> (6)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (7)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Gly, Ser, Ala, Ile y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (9)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Leu, Ile, Val, Met, Cys y Ala
<220>
<221> INCIERTO
<222> (11)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Leu, Ile, Val, Met, Phe y Ala
<220>
<221> INCIERTO
<222> (12)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Leu, Ile, Val, Met, Phe y Ala
<220>
<221> INCIERTO
<222> (13)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu. Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220> <221> INCIERTO
<222> (14)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Tryp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (15)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (16)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (17)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (18) <223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222>
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys; Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys. Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (20)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys; Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (21)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (22)
<223> Xaa representa Leu, Ile o Val
<220>
<221> INCIERTO <222> (23)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp. Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (25)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Leu, Ile, Val, Ala y Pro
<220>
<221> INCIERTO
<222> (27)
<223> Xaa representa Ser, Thr o Pro
<220>
<221> INCIERTO
<222> (28)
<223> Xaa representa cualquier aminoácido seleccionadoentre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val
<220>
<221> INCIERTO
<222> (30)
<223> Xaa representa Gly o Ala
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuenciade aminoácidos utilizada para la búsqueda en bases dedatos
<400> 35 imagen1
<210> 36
<211> 1416
<212> ADN
<213> BaCillus subtilis ATCC 15245 y Bacillus subtilis IAM 1033
<400> 36 imagen3 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 37
<211> 239
<212> PRT
<213> Streptomyces noursei IF015452
<400> 37 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 38
<211> 239
<212> PRT
<213> Streptomyces alborus IF015452
<400> 38 imagen1 imagen1
<210> 39
<211> 717
<212> ADN
<213> Streptomyces noursei IF015452
<440> 39 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 40

<211> 717

<212> ADN

<213> Streptomyces alborus IF015452

<400> 40

imagen1

<210> 41

<211> 32 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

10 <400> 41 agagccatgg gacttgcagg cttagttccc gc 32

<210> 42

<211> 29

<212>: ADN 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 42

agagagatct ggccgcgtcg gccagctcc

<210> 43

<211> 1078

<212> PRT

<213> Brevibacillus brevis

<400> 43

<210> 44

<211> 3234

<212> ADN

<213> Brevibacillus brevis

<400> 44

<210> 45

<211> 503

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 45

<210> 46

<211> 427

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 46

<210> 41

<211> 485

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 47

<210> 48

<211> 870

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 48

<210> 49

<211> 535

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 49

<210> 50

<211> 339

<212> PRT

<213> Escherichia coli.

<400> 50

<210> 51

<211> 300

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 51

<210> 52

<211> 327

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 52

<210> 53

<211> 334

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 53

<210> 54

<211> 34

<212>: ADN 5 <213> Secuencia Artificial

imagen1

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 54 10 gaagttccta tactttctag agaataggaa cttc 34

<210> 55

<211> 1509

<212> ADN

<213> Escherichia coli 15 <400> 55

imagen1

<210> 56

<211> 1281

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<400> 56

imagen1

<210> 57

<211> 1455

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<400> 57

imagen1

<210> 58

<211> 2610

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<400> 58

imagen1

<210> 59

<211> 1605

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<400> 59

imagen1

<210> 60

<211> 1017

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<400> 60

imagen1

<210> 61

<211> 900

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<400> 61

imagen1

<210> 62

<211> 981

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<400> 62

imagen1

<210> 63

<211> 1002

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<400> 63

imagen1

<210> 64

<211> 56

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 64

10 ctaaccctgt gacctgcaat actgttttgc gggtgagtgtaggctggagc tgcttc 56

<210> 65

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 65

gaaactgccg gaaggcgatt aaacgccatc cggcagcatatgaatatcct ccttag 56

<210> 66

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 66

ttacgcaaca ggaatagact gaacaccaga ctctatgtgtaggctggagc tgcttc 56

<210> 67

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 67 agaaaacagg ggtaaattcc ccgaatggcg gcgctacatatgaatatcct ccttag 56

<210> 68

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 68

atggagttta gtgtaaaaag cggtagcccg gagaaagtgt aggctggagc tgcttc 56

<210> 69

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 69

ttactcttcg ccgttaaacc cagcgcggtt taacagcatatgaatatcct ccttag 56

<210> 70

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 70

atgacagaag cgatgaagat taccctctct acccaagtgtaggctggagc tgcttc 56

<210> 71

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 71

ttacgccgtt aacagattag ctatcgtgcg cacacccatatgaatatcct ccttag 56

<210> 72

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 72

geatccccac ctcataacgt tgacccgacc gggcaagtgtaggctggagc tgcttc 56

<210> 73

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 5 <220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 73

ctgtacgga ttttgctatg cttgtcgcca ctgttgcata10 tgaatatcct ccttag 56

<210> 74

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 15 <220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 74

gtgtctgaac tgtctcaatt a 21 20 <210> 75

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 75 cggaatttct ttcagcagtt c 21

<210> 76

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 76 atgactcaac agccacaagc c 21

<210> 77

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 77 tgctttagtt atcttctcgt a 21

<210> 78

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 78 agtgcctgca tcgtcgtggg c 21

<210> 79

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 79 ggcgcctttt gctttaccag a 21

<210> 80

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 80 gacgcgcgct ggggagaaaa a 21

<210> 81

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

5 <223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 81 cgtagcgccc gcagaccact g 21

<210> 82 10 <211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN15 Sintético

<400> 82 atgcgtattt ccttgaaaaa g 21

<210> 83

<211> 21 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 83

ttattcgata gagacgtttt c 21

<210> 84

<211> 29

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN Sintético

<400> 84 10 tacactcgag attaaagagg agaaattaa 29

<210> 85

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 15 <220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 85

ttaggatcct catactggca gcacatactt 30 20 <210> 86

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 86 caagaattct catgtttgac agct 24

<210> 87

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 87 taactcgaga ttcccttttt acgtgaac 28

<210> 88

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 88

gttgagcggc tgccagagcc tttagccgag gaatcagtgtaggctggagc tgcttc 56

<210> 89

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 89

ctgccagctt gcccgcacca gttcacgctc tgcggtcatatgaatatcct ccttag 56

<210> 90

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 90

ctggacgatg tccgcgaagc actggccgaa gtcggtgtgtaggctggagc tgcttc 56

<210> 91

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 91 tgccgcgtcg tcctcttcac cggtacggat gcgaatcatatgaatatcct ccttag 56

<210> 92

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 92 agccaaccgc cgcaggccga cgaatgg 27

<210> 93

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 93 ggtcagcgcc atcgcttcct gctcttc 27

<210> 94

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 94 tcccgacacg agctggatgc aaacgat 27

<210> 95

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 95 atggaaacat ccggcaaccc ttgacgc 27

<210> 96

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 96 aaaggatccc atatacagga ggagacagat 30

<210> 97

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 97 tatggatcct taagcacccg ccacagatga 30

<210> 98

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 98 tatatcgatc aaaaaggcaa cactatgaca tcg 33

<210> 99

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 99 ttaggatcct catcaggttg gatcaacagg cac 33

<210> 100

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

5 <223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 100 actagatcta acaggatcgc catcatgcaa 30

<210> 101 10 <211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN15 Sintético

<400> 101 ataggatcct taagccacgc gagccgtcag ctg 33

<210> 102

<211> 30 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 102

attatcgata acaggatcgc catcatgcaa 30

<210> 103

<211> 30

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 103 10 ttagcatgct tattactggc gattgtcatt 30

<210> 104

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 15 <220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 104

ggtctcaatt tattgacgaa gaggattaag tatctcgtgt20 aggctggagc tgcttc 56

<210> 105

<211> 56

<212> ADN

<213>: Secuencia Artificial 25 <220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 105

tgcggcgtga acgccttatc cggcctacaa gttcgtcatatgaatatcct ccttag

<210> 106

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 106 gacggtcgtt accaggtgaa tcgcgga 27

<210> 107

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 107 gaactctttc aacttctgct gctcgcc

<210> 108

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 108 aatatcgata aagacaggat tgggtaaatg 30

<210> 109

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 109 ttagcatgct tagaggacgc cctgctcggc gaagat 36

<210> 110

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 110 ccgcaagatc tcgtaaaaag ggtatcgat

<210> 111

<211> 24

<212> ADN

<213>: Secuencia Artificial 5 <220>

29 <223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 111

caagaattct catgtttgac agct 24 10 <210> 112

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

15 <223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 112 ttaggatcct catactggca gcacatactt 30

<210> 113 20 <211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN25 Sintético

<400> 113

ctttaggcat tccttcgaac aagatgcaag aaaagagtgtaggctggagc tgcttc 56

<210> 114

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 114

atagttagtt ccccgtcctg aatcttgaga aacagacatatgaatatcct ccttag 56

<210> 115

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN Sintético

<400> 115 gaagtgactt tcccacatgc cgaagtt 27

<210> 116

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 116 gtgttgctgc cagtcatttt gatttaacgg ctgctg 36

<210> 117

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 117 cagccgttaa atcaaaatga ctggcagcaa cactgc 36

<210> 118

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 118

gctggctaac atgaggaaat cggggtt

27

<210> 119 <211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

5 <223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 119 gtaagcccac catcgttaag ccgggta 27

<210> 120 10 <211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN15 Sintético

<400> 120 gaccagaacc ggaccaggac gacctga 27

<210> 121

<211> 56 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

25 <400> 121 ctctacagct tcgaattccc ggaatcaccg ggcgcggtgtaggctggagc tgcttc 56

<210> 122

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 122

gttccagtac gtacccagcg tgttgaggaa gcgcagcatatgaatatcct ccttag 56

<210> 123

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 123 gaacagcgtg aagcgttgtt g 21

<210> 124

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 124 gttgaggaag cgcaggaacg cgcccggtga ttccgg 36

<210> 125

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 125 gaatcaccgg gcgcgttcct gcgcttcctc aacacg 36

<210> 126

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 126 tttgagctgg gcgtgtgtgc g 21

<210> 127

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 127 aactctaaaa gcatatcgca ttcatctgga gctgatgtgt aggctggagc tgcttc 56

<210> 128

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 128

ctggctcatg gtttgggtcc ttgtctcttt tagagccatatgaatatcct ccttag 56

<210> 129

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN Sintético <400> 129

aacagccgcg tatgtgcgtt agctcgctgc gtggaagtgtaggctggagc tgcttc 56

<210> 130

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 130

sacttctgcg gcacgccaga tattgttcag aacgtgcatatgaatatcct ccttag 56

<210> 131

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

<400> 131 ttcatctgga gctgatttaa t 21

<210> 132

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADNSintético

5 <400> 132 caggcggcag tggttgcccg t 21

10

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para producir un dipéptido, que comprende: cultivar en un medio un microorganismo que tiene la capacidad de producir una proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos donde la proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos es una proteína seleccionada del grupo que consiste en los siguientes apartados [1] a [11]:

[1] una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 8;

[2] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos donde uno o más residuos de aminoácidos son suprimidos, sustituidos o añadidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 8 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[3] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 65% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 8 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[4] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 80% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 17 y que tiene actividad formadora del

dipéptido

a partir de una o más clases de

aminoácidos;

[5]

una proteína que tiene la secuencia de

aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 37 o 38;

[6] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos donde uno o más residuos de aminoácidos son suprimidos, sustituidos o añadidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 37 o 38 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[7] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 65% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 37 o 38 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[8] una proteína que no tiene actividad péptido

sintetasa

ribosomal (referida en adelante como

NRPS);

[9]

una proteína que tiene la secuencia de

aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 43;

[10] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos donde uno o más residuos de aminoácidos son suprimidos, sustituidos o añadidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 43 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos; y

[11] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 65% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 43 y que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos. y donde dicho microorganismo ha sido modificado genéticamente con el fin de que tenga la capacidad de producir al menos una de dichas una o más clases de aminoácidos; permitir que el dipéptido se forme y se acumule en el medio; y recuperar el dipéptido del medio.
2. El procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 1, donde la proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos es una proteína codificada por el ADN seleccionado del grupo que consiste en los siguientes apartados [1] a [8]:

[1] ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 9 a 16 y 36;

[2] ADN que hibrida con ADN que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 9 a 16 y 36 en condiciones restrictivas y que codifica una proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[3] ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de 80% o más con la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 18 y que codifica una proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[4] ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 39 o 40;

[5] ADN que hibrida con ADN que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 39 o 40 en condiciones restrictivas y que codifica una proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos;

[6]

ADN que codifica una proteína que tiene

actividad

NRPS;

[7]

ADN que tiene la secuencia de nucleótidos

mostrada en el SEQ ID NO: 44; y

[8] ADN que hibrida con ADN que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 44 en condiciones restrictivas y que codifica una proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos.
3.

El procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 1, donde el microorganismo que tiene la capacidad de producir una proteína que tiene actividad formadora del dipéptido a partir de una o más clases de aminoácidos es un microorganismo que porta un ADN recombinante que comprende el ADN seleccionado del grupo que consiste en los apartados [1] a [8] de la Reivindicación 2.
4.

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, donde la capacidad para producir un aminoácido se adquiere mediante un método seleccionado del grupo que consiste en los siguientes apartados [1] a [5]:

[1] un método en el que al menos uno de los mecanismos que regulan la biosíntesis del aminoácido se hace más flexible o se cancela;

[2] un método en el que la expresión de al menos una de las enzimas implicadas en la biosíntesis del aminoácido está intensificada;

[3] un método en el que el número de copias de al menos uno de los genes de las enzimas implicadas en la biosíntesis del aminoácido se incrementa;

[4] un método en el que al menos una de las rutas metabólicas que se ramifican a partir de la ruta biosintética del aminoácido a los metabolitos distintos del aminoácido se debilita o se bloquea; y

[5] un método en el que se selecciona una cepa celular que tiene una mayor resistencia a un análogo del aminoácido en comparación con la cepa de tipo salvaje.
5.

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, donde el microorganismo es un microorganismo perteneciente al género Escherichia, Corynebacterium, Bacillus, Serratia, Pseudomonas o Streptomyces.
6.

El procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 5, donde el microorganismo perteneciente al género Escherichia, Corynebacterium, Bacillus, Serratia, Pseudomonas o Streptomyces es Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium lactofermentum, Corynebacterium flavum, Corynebacterium efficiens, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Serratia marcescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Streptomyces coelicolor o Streptomyces lividans.
7.

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, donde el microorganismo es un microorganismo en el cual las actividades de una o más clases de peptidasas y una o más clases de proteínas que tienen actividad de penetración/transporte de péptidos (referidas en adelante también como proteínas de penetración/transporte de péptidos) se reducen o se pierden.
8.

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, donde el microorganismo es un microorganismo en el que las actividades de tres o más clases de peptidasas se reducen o se pierden.
9.

El procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 7 u 8, donde la peptidasa es una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 45 a 48, o una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 80%

o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 45 a 48 y que tiene actividad peptidasa.
10.

El procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 7 o 9, donde la proteína de penetración/transporte de péptidos es una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 49 a 53, o una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de 80% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 49 a 53 y que tieneactividad de penetración/transporte de péptidos.
11.

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 7 a 10, donde el microorganismo es un microorganismo perteneciente al género Escherichia, Bacillus o Corynebacterium.
12.

El procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 11, donde el microorganismo perteneciente al género Escherichia, Bacillus o Corynebacterium es Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium lactofermentum, Corynebacterium flavum, Corynebacterium efficiens, Bacillus subtilis o Bacillus megaterium.
13.

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 12, donde el aminoácido es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L

alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, glicina, Lvalina, L-leucina, L-isoleucina, L-prolina, Lfenilalanina, L-triptófano, L-metionina, L-serina, Ltreonina, L-cisteína, L-asparagina, L-tirosina, L-lisina,

5 L-arginina, L-histidina, ácido L-aspártico, ácido L-αaminobutírico, L-4-hidroxiprolina, L-3-hidroxiprolina, Lornitina y L-citrulina.
14. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de

10 las Reivindicaciones 1 a 13, donde el dipéptido es un dipéptido representado por la fórmula (I):

R1-R2 (I)

15 (donde R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, representan cada uno un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L-alanina, L-glutamina, ácido Lglutámico, glicina, L-valina, L-leucina, L-isoleucina, Lprolina, L-fenilalanina, L-triptófano, L-metionina, L

20 serina, L-treonina, L-cisteína, L-asparagina, L-tirosina, L-lisina, L-arginina, L-histidina, ácido L-aspártico, ácido L-α-aminobutírico, L-4-hidroxiprolina, L-3hidroxiprolina, L-ornitina y L-citrulina.

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