CN1973042B - 二肽的制造方法 - Google Patents

Abstract

根据本发明，可以提供二肽的制造方法，其特征是将具有生产具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的能力、而且具有生产该1种以上的氨基酸中的至少1种氨基酸能力的微生物在培养基中进行培养，使二肽该培养基中生成、蓄积，从该培养基回收二肽。

Description

二肽的制造方法

【技术领域】

 

本发明涉及二肽的制造方法，其特征是将具有生产具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质能力，而且具有生产该1种以上的氨基酸中的至少1种氨基酸能力的微生物在培养基中进行培养，使二肽在培养基中生成、蓄积，从该培养基回收二肽。     

【背景技术】

 

目前，很多氨基酸都是通过所谓的发酵法制造的(参照非专利文献1和2)。这里所谓的发酵法指的是在由葡萄糖、醋酸、甲醇、氨、硫酸铵、玉米浸渍液等便宜的物质构成的培养基中培养微生物，利用微生物的代谢活性获得目的氨基酸的方法。作为由便宜的原料通过环境负荷小的方法制造氨基酸的方法，发酵法是很好的制造方法。 

 

有关肽的大量合成法已知有化学合成法(液相法、固相法)、酶促合成法和使用DNA重组法的生物合成法。现在，对于50残基以上的长链肽使用酶促合成法或生物合成法，对于二肽主要使用化学合成法和酶促合成法。 

使用化学合成法合成二肽需要对官能团进行保护和去保护等操作，由于也合成消旋体，化学合成法不能说是经济、有效的方法。另外由于化学合成法使用大量的有机溶剂等，从环境卫生方面看也不是一个好的方法。 

 

通过酶法合成二肽已知有利用蛋白分解酶(蛋白水解酶)的逆反应的方法(参照非专利文献3)、利用耐热性氨酰t-RNA合成酶的方 法(参照专利文献1～4)、利用脯氨酸亚氨基肽酶的逆反应的方法(参照专利文献5)、利用非核糖体肽合成酶(以下称为NRPS)的方法(参照非专利文献4、5和专利文献6、7)。 

 

然而，就利用蛋白水解酶的逆反应的方法来说，需要对底物氨基酸的官能团进行保护和去保护，存在着提高肽形成反应效率和阻止肽分解反应困难的问题。至于利用耐热性氨酰t-RNA合成酶的方法，存在着酶的表达、阻止目的产物以外的副生物反应困难的问题。而利用脯氨酸亚氨基肽酶的方法存在着需要作为底物一方的氨基酸酰胺化的缺点。关于利用NRPS的方法需要供给作为辅酶的4’-磷酸泛酰巯基乙胺(4＇-phosphopantetheine)，不能说是有效的制造方法。 

 

除了这些缺点外，这些方法无论那一种由于作为底物都使用氨基酸或它的衍生物，具有制造成本增加的缺点。 

另外，已知酶分子量比NRPS小、不需要作为辅酶的4’-磷酸泛酰巯基乙胺(4＇-phosphopantetheine)的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase)、谷胱甘肽合成酶(glutathionesynthetase)、D-丙氨酰-D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)连接酶(D-Ala-D-Alaligase)、聚-γ-谷氨酸合成酶(poly-γ-glutamatesynthetase)等一组肽合成酶。几乎所有这些酶由于都具有使用D-氨基酸作为底物催化在γ位羧基形成肽键等特征，所以不能用于在L-氨基酸的α位羧基形成肽键的二肽的合成。 

 

另外，据报道在已知作为抗生物质アルボノルシン(albonoursin)的生产株的诺尔斯氏链霉菌(Streptomyces noursei)ATCC11455株中，与NRPS酶完全不相似的蛋白质(albC基因产物)负责环(L-苯丙氨酰-L-亮氨酸)[cyclo(L-phenylalanyl-L-leucine)]结构的合成，如果使环二肽氧化酶作用于导入了albC基因的大肠杆菌(Escherichia coli)和浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans) 的培养液，可以检测到albonoursin(参照非专利文献6)，但还没有 albC基因产物生成直链状二肽的报告。 

 

已知通过在L-氨基酸的α位羧基形成肽键活性生成二肽只有来自属于芽孢杆菌属的微生物的作为二肽抗生物质的杆菌溶素合成酶。已知杆菌溶素合成酶具有合成杆菌溶素(L-丙氨酰-L-anticapsin、L-Ala-L-anticapsin)和L-丙氨酰-L-丙氨酸(L-Ala-L-Ala)的活性，至于其它的二肽的合成活性还不知道(参照非专利文献7和8)。 

 

另外，有关全基因组情报已阐明的枯草芽孢杆茵(Bacillus subtilis )168株(参照非专利文献9)中的杆菌溶素生物合成酶基因组，已知如果对含有ywfA～F的ORF的杆菌溶素操纵子进行扩增，可增加杆菌溶素的产率(参照专利文献8)。然而，在这些ORF中还不知道是否含有编码具有通过肽键连接2种以上的氨基酸的活性的蛋白质的ORF，如果含有，哪一个ORF编码该蛋白质也不清楚。 

 

即，到目前为止也不了解通过发酵生产制造由1种以上的氨基酸构成的二肽的方法。 

【非专利文献1 】氨基酸发酵、学会出版中心、相田  浩等(1986) 

【非专利文献2】Biotechnology 2nd ed.，Vo1.6，Products ofPrimary Metabolism，VCHVerlagsgesellschaft mbH，Weinheim(1996) 

【非专利文献3】J.Biol.Chem.，119，707-720(1937) 

【非专利文献4】Chem.Biol.，7，373-384(2000) 

【非专利文献5】FEBS Lett.，b498.42-45(2001) 

【非专利文献6】Chemistry&Biol.，9，1355-1364(2002) 

【非专利文献7】J.I nd.Microbiol.，2，201-208(1987) 

【非专利文献8】Enzyme.Microbial.Technol.，29，400-406(2001) 

【非专利文献9】Nature，390，249-256(1997) 

【专利文献1】特开昭58-146539号公报 

【专利文献2】特开昭58-209991号公报 

【专利文献3 】特开昭58-209992号公报 

【专利文献4】特开昭59-106298号公报 

【专利文献5 】国际公开专利第03-010307号小册子 

【专利文献6】美国专利第5795738号 

【专利文献7】美国专利第5652116号 

【专利文献8 】国际公开专利第00-03009号小册子 

【发明内容】

【发明要解决的课题】 

 

本发明的目的在于提供供二肽的制造方法，其特征是将具有生产具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的能力，而且具有生产、蓄积该1种以上的氨基酸中的至少1种氨基酸的能力的微生物在培养基中进行培养，使二肽该培养基中生成、蓄积，从该培养基回收二肽。 

【用于解决课题的手段】 

 

本发明涉及到以下(1)～(15)内容。 

(1)二肽的制造方法，其特征是将具有生产具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的能力，而且具有生产该1种以上的氨基酸中的至少1种氨基酸的能力的微生物在培养基中进行培养，使二肽在该培养基中生成、蓄积，从该培养基回收二肽 

(2)上述(1)所述的制造方法，其中具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质是选自以下[1]～[11]中的蛋白质： 

具有序列号1～8中的任一个表示的氨基酸序列的蛋白质 

由在序列号1～8中的任一个表示的氨基酸序列缺失、置换或 附加1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成、而且具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质 

由与序列号1～8中的任一个表示的氨基酸序列具有65％以上同源性的氨基酸序列构成，而且具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质 

具有与序列号17表示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列，而且具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质 

具有由序列号37或38表示的氨基酸序列的蛋白质 

由在序列号37或38表示的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，而且具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质 

由与序列号37或38表示的氨基酸序列具有65％以上同源性的氨基酸序列构成，而且具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质 

具有非核糖体肽合成酶(以下称为NRPS)活性的蛋白质 

具有序列号43表示的氨基酸序列的蛋白质 

由在序列号43表示的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，而且具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质 

由与序列号43表示的氨基酸序列具有65％以上同源性的氨基酸序列构成，而且具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质。 

(3)上述(1)或(2)所述的制造方法，其中具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质是由选自以下[1]～[8]中的DNA编码的蛋白质： 

具有序列号9～16和36中的任一个表示的碱基序列的DNA 

和具有与序列号9～16和36中的任一个表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交，而且编码具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的DNA 

和具有与序列号18表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在 严格的条件下杂交，而且编码具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的DNA 

具有序列号39或40表示的碱基序列的DNA 

和具有与序列号39或40表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交，而且编码具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的DNA 

编码具有NRPS活性的蛋白质的DNA 

具有序列号44表示的碱基序列的DNA 

和具有与序列号44表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交，而且编码具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的DNA。 

(4)上述(1)所述的制造方法，其中具有生产具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的能力的微生物是带有重组DNA的微生物，该重组DNA含有上述(3)的[1]～[8]中任一个DNA。 

(5)上述(1)～(4)中的任一个制造方法，其中生产氨基酸的能力是通过选自以下[1]～[5]中的方法获得的： 

缓和或解除至少一个控制该氨基酸生物合成的结构的方法 

对至少一个参与该氨基酸生物合成的酶表达增强的方法 

使至少一个参与该氨基酸生物合成的酶基因的拷贝数增加的方法 

对至少一个由该氨基酸生物合成途径到该氨基酸以外的代谢产物旁路的代谢途径进行弱化或阻断的方法 

与野生型株相比，选择对该氨基酸的类似物抗性高的细胞株的方法。 

(6)上述(1)～(5)中的任一个制造方法，其中微生物是属于埃希氏菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、沙雷氏茵属、假单孢茵属或链霉菌属的微生物。 

(7)上述(6)所述的制造方法，其中属于埃希氏菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、假单孢茵属或链霉菌属的微生物是大 肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、产氨棒杆菌、乳酸发酵棒杆菌、黄色棒杆菌、Corynebacterium efficiens、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、粘质沙雷氏茵、恶臭假单胞茵、铜绿假单胞茵、天蓝色链霉菌或浅青紫链霉菌。 

(8)上述(1)～(5)中的任一个制造方法，其中微生物是1种以上的肽酶和具有1种以上肽转运活性的蛋白质(以下也称为肽转运蛋白质)的活性低下或丧失的微生物。 

(9)上述(1)～(5)中的任一个制造方法，其中微生物是3种以上肽酶的活性低下或丧失的微生物。 

(10)上述(8)或(9)所述的制造方法，其中肽酶是具有序列号45～48中的任一个表示的氨基酸序列的蛋白质、或具有与序列号45～48中的任一个表示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列，而且具有肽酶活性的蛋白质。 

(11)上述(8)或(10)所述的制造方法，其中肽转运蛋白质是具有序列号49～53中的任一个表示的氨基酸序列的蛋白质、或由与序列号49～53中的任一个表示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，而且具有肽转运活性的蛋白质。 

(12)上述(8)～(11)中的任一个制造方法，其中微生物是属于埃希氏菌属、芽孢杆菌属或棒杆菌属的微生物。 

(13)上述(12)所述的制造方法，其中属于埃希氏茵属、芽孢杆菌属或棒杆菌属的微生物是大肠杆菌、谷氨酸棒杆茵、产氨棒杆菌、乳酸发酵棒杆茵、黄色棒杆菌、Corynebacterium efficiens、枯草芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌。 

(14)上述(1)～(13)中的任一个制造方法，其中氨基酸是选自L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-α-氨基丁酸、L-4-羟基脯氨酸、L-3-羟基脯氨酸、L-鸟氨酸和L-瓜氨酸的氨基酸。 

(15)上述(1)～(14)中的任一个制造方法，其中二肽是式(I)表示的二肽； 

R¹-R²    (I) 

(式中，R¹和R²可以相同或不同，表示选自L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-α-氨基丁酸、L-4-羟基脯氨酸、L-3-羟基脯氨酸、L-鸟氨酸和L-瓜氨酸的氨基酸)。 

【发明的效果】 

 

根据本发明可以提供二肽的制造方法，其特征是将具有生产具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的能力，而且具有生产该1种以上的氨基酸中的至少1种氨基酸能力的微生物在培养基中进行培养，使二肽在培养基中生成、蓄积，从该培养基回收二肽。 

【附图说明】

 

图1是表示质粒pPE43的构建过程的图。 

图2是表示质粒pQE60ywfE的构建过程的图。 

图3是表示作为具有直链二肽的合成活性的蛋白质的表达质粒载体pAL-nou和pAL-alb的构建过程的图。 

【图4】图4是表示作为ywfE基因表达强化型载体的pPE56的构建过程的图。 

【图5】图5是表示作为ywfE基因和ald基因表达载体的pPE86的构建过程的图。 

【图6】图6是表示作为抗反馈型pheA基因表达载体的pPHEA2、以及抗反馈型pheA基因和抗反馈型aroF基因表达质粒载体的pPHEAF2的构建过程的图。 

【符号说明】 

 

ywfE：来自枯草芽孢杆菌168株的ywfE基因 

Ptrp：色氨酸启动子基因 

PT5：T5启动子 

Amp^r：氨苄青霉素抗性基因 

lacI ^q：乳糖阻遏蛋白基因 

albC：albC基因或albC类似基因 

ald：ald基因 

pheA ^fbr ：抗反馈型pheA基因 

aroF ^fbr ：抗反馈型aroF基因 

【具体实施方式】

 

本发明制造方法中使用的具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质只要是具有由1种以上的氨基酸生成同一或不同氨基酸通过肽键生成二肽的活性的蛋白质，可以是任一种蛋白质，作为该蛋白质，例如、 

具有序列号1～8中任一个序列表示的氨基酸序列的蛋白质 

由在序列号1～8中的任一个表示的氨基酸序列缺失、置换或附加1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，而且具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质 

由与序列号1～8中的任一个表示的氨基酸序列具有65％以上同源性的氨基酸序列构成，而且具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质 

具有与序列号17表示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列，而且具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质 

具有由序列号37或38表示的氨基酸序列的蛋白质 

由在序列号37或38表示的氨基酸序列中缺失、置换或附加1 个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，而且具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质 

由与序列号37或38表示的氨基酸序列具有65％以上同源性的氨基酸序列构成，而且具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质 

具有非核糖体肽合成酶(以下称为NRPS)活性的蛋白质 

具有序列号43表示的氨基酸序列的蛋白质 

由在序列号43表示的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，而且具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质 

由与序列号43表示的氨基酸序列具有65％以上同源性的氨基酸序列构成，而且具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质。 

 

本发明中所说的氨基酸，是下面本发明制造方法中使用的微生物生产的氨基酸，优选L-氨基酸和甘氨酸，更优选L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-α-氨基丁酸、L-4-羟基脯氨酸、L-3-羟基脯氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸和甘氨酸，再优选L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-α-氨基丁酸和甘氨酸。 

 

在上述中，由缺失、置换或附加1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，而且具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质可以通过使用Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)(以下、略为Molecular Cloning第3版)、Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons(1987-1997)(以下、略为Current Protocols inMolecular Biology)、Nucleic Acids Research，10，6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)、Gene，34，315(1985)、Nucleic Acids Research，13，4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)等所述的定点突变导入法，例如通过在编码序列号1～8、37、38或43中的任一个表示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA中导入定点突变，可以取得。 

缺失、置换或附加的氨基酸的数目没有特别限定，是通过上述的定点突变法等众所周知的方法能够缺失、置换或附加程度的数目，从1个至数十个、优选1～20个、更优选1～10个、再优选1～5个。 

所谓在序列号1～8、37、38或43中的任一个表示的氨基酸序列缺失、置换或附加1个以上的氨基酸可以在同一序列中的任意位置缺失、置换或附加1个或多个氨基酸。 

 

作为可置换的氨基酸，例如对序列号1～8、序列号37和38、或众所周知的NRPS与序列号43表示的氨基酸序列分别使用众所周知的序列比对软件进行比较时，在比较的所有的氨基酸序列中不保守的氨基酸。作为众所周知的序列比对软件，例如基因解析软件Genetyx(软件开发株式会社)中含有的序列比对解析软件。作为该解析软件的解析参数，可以使用default值。 

 

另外作为可进行氨基酸缺失或附加的氨基酸位置，例如序列号1～8、37、38和43中的任一个表示的氨基酸序列的N末端侧和C末端侧。 

缺失、置换或附加可以同时出现，被置换或附加的氨基酸无论天然型，还是非天然型都可以。作为天然型氨基酸，如L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-精氨酸、 L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸等。 

 

以下给出了可相互置换的氨基酸的例子。同一组中含有的氨基酸可相互置换。 

A群：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、环己基丙氨酸 

B群：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸 

C群：天冬酰胺、谷氨酰胺 

D群：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸 

E群：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸 

F群：丝氨酸、苏氨酸、同型丝氨酸 

G群：苯丙氨酸、酪氨酸 

另外，为了使本发明的蛋白质具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性，希望是序列号1～8、37、38和43中的任一个表示的氨基酸序列，优选与序列号1表示的氨基酸序列的同源性具有65％以上、优选75％以上、更优选85％以上、再优选90％以上、特别优选95％以上、最好优选98％以上的同源性。 

 

氨基酸序列或碱基序列的同源性可以使用Karlin and Altschul的算法BLAST[Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993)]或FASTA[Methods Enzymol.，183，63(1990)]决定。通过根据这个算法BLAST开发了称为BLASTN和BLASTX的程序[J.Mol.Biol.，215，403(1990)]。当根据BLAST通过BLASTN对碱基序列进行解析时，参数 定为例如Score＝100、wordlength＝12。另外当根据BLAST通过BLASTX对氨基酸序列进行解析时，参数定为例如score＝50、wordlength＝3。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的default参数。这些解析方法的具体手法众所周知(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。 

 

序列号17表示的氨基酸序列是被保存在具有序列号1～7表示的氨基酸序列的蛋白质间的区域，而且是对应于各种微生物的具有Ala-Ala连接酶活性的蛋白质公有序列的区域。 

作为具有与序列号17表示的氨基酸序列有80％以上、优选90％以上、再优选95％以上同源性的氨基酸序列的蛋白质，而且具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质也是通过本发明的制造方法中使用的微生物生产的蛋白质。 

 

具有与序列号17表示的氨基酸序列有80％以上、优选90％以上、再优选95％以上同源性的氨基酸序列的蛋白质为了作为具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质，希望该蛋白质的氨基酸序列与序列号1～8中的任一个表示的氨基酸序列的同源性至少具有80％以上、通常为90％以上、最好是具有95％以上的同源性。 

 

氨基酸序列的同源性可以象上述那样使用BLAST或FASTA决定。 

作为确认上述[1]～[11]的蛋白质是具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的手段，例如使用DNA重组法制作表达该蛋白质的转化体，使用该转化体制造本发明的蛋白质后，使本发明的蛋白质、1种以上的氨基酸、和ATP存在于水性介质中，通过HPLC等分析二肽是否在该水性介质中生成、蓄积的方法。 

 

本发明的制造方法使用的DNA只要是编码具有由1种以上的氨基酸生成同一或不同氨基酸通过肽键结合形成二肽的活性的蛋白质的 DNA，任一种都可以，例如 

具有序列号9～16和36中任一个表示的碱基序列的DNA、 

和具有与序列号9～16和36任一个表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交，而且编码具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的DNA、 

和具有与序列号18表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交，而且编码具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的DNA、 

具有序列号39或40表示的碱基序列的DNA、 

和具有与序列号39或40表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交，而且编码具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的DNA、 

编码具有NRPS活性的蛋白质的DNA、 

具有序列号44表示的碱基序列的DNA、和 

和具有与序列号44表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交，而且编码具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的DNA。 

 

所谓在上述严格的条件下可杂交的DNA指的是以具有与序列号9～16、18、36、39、40或44中的任一个表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA的一部分、或全部作为探针，通过使用菌落杂交法、噬斑杂交法或Southern blot杂交法等得到的DNA，具体来说，使用固定了来自茵落或噬斑的DNA的滤器，在0.7～1.0mol/L、优选0.9mol/L氯化钠存在下、于65℃下进行杂交后、使用0.1～2倍、优选0.1倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液组成由150mmol/l氯化钠、15mmol/l柠檬酸钠构成)，于65℃条件下，通过清洗滤器能够鉴定的DNA。杂交可以根据Molecular Cloning第3版、Current Protocolsin Molecular Biology、Current Protocols in Molecular Biology、DNA Cloning 1：Core Techniques，A Practical Approach，Second Edition，Oxford University(1995)等记载的方法进行。作为可杂交的DNA，例如使用上述的BLAST和FASTA等，在根据上述参数计算时，与序列号9～16、18、36、39、40或44中的任一个表示的碱基序列至少具有75％以上、优选85％以上、再优选90％以上、特别优选95％以上同源性的DNA。 

 

另外，作为供杂交的DNA样品，例如与在其染色体DNA上具有序列号9～16、18、36、39、40或44中的任一个表示的碱基序列的微生物同属、优选属于同种的微生物的染色体DNA。 

在严格的条件下与具有序列号9～16、18、36、39、40或44中的任一个表示的碱基序列的DNA杂交的DNA是编码具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的DNA，例如象上述那样可以通过使用重组DNA法制造该DNA编码的蛋白质，测定该蛋白质的活性来确认。 

(i)本发明制造方法中使用的DNA的制备 

本发明的制造方法中使用的DNA可以通过以下(a)～(c)取得： 

(a)使用根据序列号9～16和36表示的碱基序列设计的探针，可对微生物、优选属于芽孢杆菌属的微生物的染色体DNA文库进行Southern杂交、或使用根据序列号9～16和36表示的碱基序列设计的引物DNA，以微生物、优选属于芽孢杆茵属的微生物的染色体DNA作为模板的PCR[PCR Protocols，Academic Press(1990)]、 

(b)使用根据序列号39或40表示的碱基序列设计的探针可对微生物、优选属于链霉茵属的微生物的染色体DNA文库进行Southern杂交、或使用可根据序列号3或4表示的碱基序列设计的引物DNA，以微生物、优选属于链霉菌属的微生物的染色体DNA作为模板的PCR、和 

(c)使用众所周知的编码NRPS的DNA、例如Eur.J.Biochem.， 270，4555(2003)、特表2003-512835、美国专利5795738或美国专利5652116所述的编码NRPS的DNA、或可根据序列号44表示的碱基序列设计的探针对微生物、优选属于芽孢杆菌属、链霉菌属、假单孢茵属 或黄单孢茵属等的微生物的染色体DNA文库进行Southern杂交、或使用根据上述的编码NPRS的DNA的碱基序列设计的引物DNA，以微生物、优选属于芽孢杆菌属、链霉菌属、假单孢茵属或黄单孢茵属等的微生物的染色体DNA作为模板的PCR取得。 

 

另外，对于各种基因序列数据库，与编码序列号1～8、17、37、38和43中的任一个表示的氨基酸序列的DNA的碱基序列具有75％以上、优选85％以上、更优选90％以上、再优选95％以上、特别优选98％以上同源性的序列进行检索，根据通过该检索得到的碱基序列，由具有该碱基序列的生物的染色体DNA、cDNA文库等通过上述方法也可以取得本发明制造方法中使用的DNA。 

 

取得的DNA可以直接、或用适当的限制酶等进行酶切，通过常法转运到载体，然后将得到的的重组DNA导入宿主细胞后，通过使用通常用的碱基序列解析方法、例如双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74，5463(1977)]或373A·DNA序列仪(Perkin-Elmer公司生产)等碱基序列分析装置进行分析，可以决定该DNA的碱基序列。 

 

决定碱基序列的结果表明当取得的DNA为部分长时，可以通过使用该部分长DNA作为探针，对染色体DNA文库的Southern杂交法等取得全长DNA。 

然后根据决定的DNA的碱基序列，通过使用PerSeptiveBiosystems公司制造的8905型DNA合成装置等进行化学合成，也可以制备目的DNA。 

 

作为象上述那样取得的DNA，例如、具有序列号9～16、36、39、40和44表示的碱基序列的DNA。 

作为转运上述的DNA的载体，如pBluescriptII KS(+)(Straaagene公司生产)、pDIRECT[Nucleic Acids Res.，18，6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)(Stratagene公司生产)、pT7Blue(Novagen公司生产)、pCRII(Invitrogen公司生产)和pCR-TRAP(Genhunter公司生产)等。 

 

作为上述宿主细胞，如属于埃希氏茵属的微生物等。作为属于埃希氏菌属的微生物，例如大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌ATCC 12435、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522、大肠杆菌ME8415等。 

 

作为重组DNA的导入方法，只要是将DNA导入到上述宿主细胞的方法，可以使用任一种方法，例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)]、原生质体法(特开昭63-248394)、电穿孔法[Nucleic Acids Res.，16，6127(1988)]等。 

作为通过上述方法得到的用于本发明制造方法的带有DNA的微生物，例如带有重组DNA的微生物的大肠杆菌NM522/pPE43，该重组DNA含有序列号1表示的序列的DNA。 

(ii)具有生产氨基酸能力的微生物的制备 

本发明的二肽的制造方法中使用的具有生产氨基酸能力的微生物只要是具有生产1种以上的氨基酸的能力的微生物，无论那一种都可以，为该微生物如从自然界分离的菌株自身具有该能力的该菌株本身、通过众所周知方法人为赋予生产构成目的二肽的氨基酸中的至少1种氨基酸能力的微生物等。 

 

作为众所周知的方法，如 

(a)缓和或解除至少一个控制氨基酸生物合成的结构的方法、 

(b)对至少一个参与氨基酸生物合成的酶表达增强的方法、 

(c)使至少一个参与氨基酸生物合成的酶基因的拷贝数增加的方 法、 

(d)对至少一个由氨基酸生物合成途径向该氨基酸以外的代谢产物的旁路代谢途径进行弱化或阻断的方法，和 

(e)野生型株相比，选择对氨基酸的类似物抗性高的细胞株的方法等，上述众所周知的方法可以单独或组合使用。 

 

关于上述(a)，例如Agric.Biol.Chem.，43，105-111(1979)、J.Bacteriol.，110，761-763(1972)和Appl.Microbiol.Biotechnol.，39，318-323(1993)等所述，关于上述(b)，例如Agric.Biol.Chem.，43，105-111(1979)和J.Bacteriol.，110，761-763(1972)等所述、关于上述(c)，例如Appl.Microbiol.Biotechnol.，39，318-323(1993)和Agric.Biol.Chem.，39，371-377(1987)等所述，关于上述(d)，例如Appl.Environ.Micribiol.，38，181-190(1979)和Agric.Biol.Chem.，42，1773-1778(1978)等所述，关于上述(e)，例如Agric.Biol.Chem.， 36，1675-1684(1972)、Agric.Biol.Chem.，41，109-116(1977)、Agric.Biol.Chem.，37，2013-2023(1973)和Agric.Biol.Chem.， 51，2089-2094(1987)等所述。参考上述文献等可以制备具有生产各种氨基酸能力的微生物。 

 

另外，有关通过上述(a)～(e)中的任一个、或组合的方法制备具有生产氨基酸能力的微生物的制备方法，在Biotechnology 2nded.，Vo1.6，Products  of  Primary  Metabolism(VCHVerlagsgEesellschaft mbH，Weinheim，1996)sec tion 14a，14b和Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79，1-35(2003)、氨基酸发酵、学会出版中心、相田浩等(1986)中记载了很多例子，另外除了上述以外，其它的具体的具有生产氨基酸能力的微生物的制备方法有特开2003-164297、Agric.Biol.Chem.，39，153-160(1975)、Agric.Biol.Chem.，39，1149-1153(1975)、特 开昭5 8-13599、J.Gen.Appl.Microbiol.，4，272-283(1958)、特开昭63-94985、Agric.Biol.Chem.，37，2013-2023(1973)、WO97/15673、特开昭56-18596、特开昭56-144092和特表2003-511086等很多报告，通过参照上述文献等可以制备具有生产1种以上的氨基酸能力的微生物。 

 

作为通过上述方法可以制备的具有生产氨基酸能力的微生物，例如作为L-谷氨酰胺生产菌，可例举glnE基因和/或glnB基因缺失的微生物，作为L-丙氨酸生产菌，可例举丙氨酸脱氢酶基因(ald基因)的表达被增强的微生物，作为L-脯氨酸生产微生物，可例举表达苯丙氨酸的抗反馈型pheA基因和/或酪氨酸的抗反馈型aroF基因的微生物等。 

 

作为上述的生成、蓄积氨基酸的微生物，只要是可以适用上述(a)～(e)方法的微生物或具有上述遗传性状的微生物，可以是任一种微生物，优选原核生物、更优选细菌。 

作为原核生物，如属于埃希氏茵(Escherichia)属、沙雷氏茵(Serratia)属、芽孢杆菌属、短杆菌(Brevibacterium)属、棒杆菌(Corynebacterium)属、微芽孢杆菌属(Microbacterium)、假单胞茵(Pseudomonas)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、鱼腥蓝细菌(Anabaena)属、组囊蓝细菌(Anacystis)属、节杆菌(Arthrobacter)属、固氮菌(Azotobacter)属、着色茵(Chromatium)属、欧文氏茵(Erwinia)属、甲基杆菌(Methylobacterium)属、席蓝细菌(Phormidium)属、红细菌(Rhodobacter)属、红假单胞茵(Rhodopseudomonas)属、红螺茵(Rhodospirillum)属、七ネデスムス(Scenedesmus)属、链霉菌(Streptomyces)属、聚球蓝细菌(Synechoccus)属、发酵单胞菌(Zymomonas)属等的微生物、例如、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyioliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)、ブレビバクテリウム·イマ リ才フイルム(Brevibacterium immariophilum)、解糖短杆菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)、无花果沙雷氏茵(Serratiaficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratiafonticola)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、铜绿假单胞茵(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞茵(Pseudomonas putida)、放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)、悬钩子土壤杆菌(Agrobacterium rubi)、柱孢鱼腥蓝细菌(Anabaenacylindrica)、桶形鱼腥蓝细菌(Anabaena doliolum)、水华鱼腥蓝细菌(Anabaenaflos-aquae)、金黄节杆菌(Arthrobacteraurescens)、柠檬节杆茵(Arthrobacter citreus)、球形节杆菌(Arthrobacter globformis)、ア一スロバクタ一·  ヒ ドロ力一ボグルタミ力ス(Arthrobacter hydrocarboglutamicus)、迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)、烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)、石蜡节杆菌(Arthrobacter paraffineus)、原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacter protophormiae)、玫瑰色石蜡节杆菌(Arthrobacter roseoparaffinus)、硫磺节杆菌(Arthrobactersulfureus)、产尿节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)、巴氏着色菌(Chromatium buderi)、微温着色茵(Chromatium tepidum)、酒色着色茵(Chromatium vinosum)、沃氏着色茵(Chromatiumwarmingii)クロマチウム·フルビアタテイレ(Chromatiumfluviatile)、噬夏孢欧文氏茵(Erwinia uredovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、波萝欧文氏茵(Erwinia ananas)、草生欧文氏茵(Erwinia herbicola)、工ルビニア·パンクタタ(Erwinia punctata)、工ルビニア·テレウス(Erwinia terreus)  、罗得西亚甲基杆菌(Methylobacterium rhodesianum)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、フ才ルミデイウム·エスピ一(Phormidium sp.)ATCC29409、夹膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、生芽红细菌(Rhodopseudomonas blastica)、海红茵(Rhodops eudomonasmarina)、血色红假单胞茵(Rhodopseudomonas palustris)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)需盐红螺菌(Rhodospirillumsalexigens)、盐场红螺菌(Rhodospirillum salinarum)、产二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)、金霉素链霉茵(Streptomycesaureofaciens)、金色链霉菌(Streptomyces aureus)、杀真菌素链霉菌( Streptomyces fungicidicus)、灰产色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、橄榄灰链霉菌(Streptomycesolivogriseus)、枝链霉茵(Streptomyces rameus)、田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)、酒红链霉菌(Streptomycesvinaceus)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)等；作为理想的原核生物，如属于埃希氏茵属、沙雷氏茵属、芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、棒杆菌属、假单孢茵属或链霉菌属等的细菌，例如上述的属于埃希氏菌属、沙雷氏茵属、芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、棒杆茵属、假单孢茵属或链霉菌属等细菌；作为更理想的细菌，如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、产氨棒杆菌、乳酸发酵棒杆菌、黄色棒杆菌、Corynebacterium efficiens、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、粘质沙雷氏茵、恶臭假单胞菌、铜绿假单胞茵、天蓝色链霉菌或浅青紫链霉菌，特别优选大肠杆菌。 

 

作为生产氨基酸的微生物的具体例子，作为L-谷氨酰胺生产株，如大肠杆菌JGLE1和大肠杆菌JGLBE1等、作为L-丙氨酸生产株，如保持ald基因表达质粒的大肠杆菌JM10 株等、作为L-苯丙氨酸生产株，如带有pPHEA2和/或aroF基因表达质粒的大肠杆菌JM101株等、作为L-谷氨酰胺和L-丙氨酸生产株，如保持ald基因表达质粒的大肠杆菌JGLE1和大肠杆菌JGLBE1等、作为L-丙氨酸和L-苯丙氨酸生产株，如保持ald基因表达质粒和抗反馈型pheA基因和/或抗反馈型aroF基因表达质粒的大肠杆菌JM101等、作为L-苏氨酸和L-苯丙氨酸生产株，如保持抗反馈型pheA基因和/或抗反馈型aroF基因表达质粒的ATCC21277株等。 

 

另外，作为具有生产氨基酸能力的微生物的具体例子，作为L-谷氨酸生产株，如FERMBP-5807和ATCC13032等、作为L-谷氨酰胺生产株，如FERM P-4806和ATCC14751等、作为L-苏氨酸生产株，如ATCC21148、ATCC21277和ATCC21650等、作为L-赖氨酸生产株，如FERM P-5084和ATCC13286等、作为L-蛋氨酸生产株，如FERM P-5479、VKPM B-2175和ATCC21608等、作为L-异亮氨酸生产株，如FERMBP-3757和ATCC14310等、作为L-缬氨酸生产株，如ATCC13005和ATCC19561等、作为L-亮氨酸生产株，如FERMBP-4704和ATCC21302等、作为L-丙氨酸生产株，如FERM BP-4121和ATCC15108等、作为L-丝氨酸生产株，如ATCC21523和FERM BP-6576等、作为L-脯氨酸生产株，如FERM BP-2807和ATCC19224等、作为L-精氨酸生产株，如FERM P-5616和ATCC21831等、作为L-鸟氨酸生产株，如ATCC1322等、作为L-组氨酸生产株，如FERM BP-6674和ATCC21607等、作为L-色氨酸生产株，如DSM10118、DSM10121、DSM10123和FERM BP-1777等、作为L-苯丙氨酸生产株，如ATCC13281和ATCC21669等、作为L-酪氨酸生产株，如ATCC21652等、作为L-半胱氨酸生产株，如W3110/pHC34(特表2003-511086记载)等、作为L-4-羟基脯氨酸生产株，如WO96/27669记载的大肠杆菌SOLR/pRH71等、作为L-3-羟基脯 氨酸生产株，如FERM BP-5026和FERM BP-5409等、作为L-瓜氨酸生产株，如FERM P-5643和FERM P-1645等。 

 

而上述的FERM编号表示的菌株可以从独立行政法人产业技术综合研究所专利生物寄托中心(日本)、ATCC编号表示的菌株可以从American Type Culture Collection(美国)、VKPM编号表示的菌株可以从Russian National Collectio of Industril Microorganisms(俄罗斯)、DSM编号表示的菌株可以从Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(德国)分别获得。 

(iii)具有生产具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质能力，而且具有生产该1种以上的氨基酸中的至少1种氨基酸的能力的微生物的制备 

具有生产具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质能力，而且具有生产该1种以上的氨基酸中的至少1种氨基酸的能力的微生物可以通过以下(a)～(d)的方法等可以制备。 

(a)在可用上述(ii)方法制备的具有生产1种以上的氨基酸能力的微生物导入可以通过上述(i)方法制备的编码具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的DNA的方法、 

(b)通过上述(ii)的方法赋予导入了通过上述(i)方法制备的编码具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的DNA微生物生产1种以上的氨基酸的能力的方法、 

(c)通过上述(i)的方法向原来具有生产1种以上的氨基酸能力的微生物导入编码具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的DNA的方法、或 

(d)通过上述(ii)方法赋予原来具有生产具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质能力的微生物生产1种以上的氨基酸能力的方法。 

 

通过将能够用上述(i)的方法制备的编码具有由1种以上的氨基 酸生成二肽活性的蛋白质的DNA导入微生物，可以赋予该微生物生产具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的能力。作为赋予微生物生产具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的能力的方法，可以使用Molecular Cloning第3版、Current Protocols inMolecular Biology等记载的方法等，例如通过以下方法使在用上述(i)的方法制备的DNA在宿主细胞中表达的方法。 

 

以用上述(i)的方法制备的DNA作为基础，根据需要，制备含有编码蛋白质的部分的适当长度的DNA片段。另外，通过将编码该蛋白质部分的碱基序列置换成最适于宿主表达的密码，可以使该蛋白质的产率提高。 

通过将该DNA片段插入到适当的表达载体的启动子的下游，可以制作重组DNA。 

 

通过将该重组DNA导入适合该表达载体的宿主细胞可以获得生产该蛋白质的转化体。 

作为宿主细胞，只要是能够表达目的基因的微生物，可以使用任一种，优选原核生物、更优选细菌。作为理想的原核生物如上述(ii)的原核生物。 

 

该微生物可以具有生产1种以上的氨基酸的能力，也可以不具有该能力。当使用不具有该能力的微生物作为宿主细胞时，通过下面的方法将用上述方法得到的重组DNA导入该微生物制备转化体后，通过用上述(ii)的方法赋予该转化体生产1以上的氨基酸的能力，可以获得本发明制造方法中使用的微生物。 

 

作为表达载体，使用可在微生物细胞中自我复制或转运到染色体中，在能够转录本发明制造方法中使用的DNA的位置含有启动子的载体。 

使用原核生物作为宿主细胞时，具有本发明制造方法中使用的DNA的重组DNA最好是在原核生物中可自我复制，同时由启动子、核糖体结合序列、本发明的制造方法中使用的DNA、转录终止序列构成的重组DNA。也可以含有调控启动子的基因。 

 

作为表达载体，例如pBTrp2、pBTacl、pBTac2(都是BoehringerMannheim公司生产)、pHelixl(Roche Diagnostics公司生产)、pKK233-2(Amersham Pharmacia Biotech公司生产)、pSE280(Invitrogen公司生产)、pGEMEX-1(Promega公司生产)、pQE-8(Qiagen公司生产)、pET-3(Novagen公司生产)、pKYP10(特开昭58-110600)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.，48，669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53，2771989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82，4306(1985)]、pBluescriptIISK(+)、pBluescriptIIKS(-)(Stratagene公司生产)、pTrS30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrS32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERMBP-5408)制备]、pPAC31(WO98/12343)、pUC19[Gene，33，103(1985)]、pSTV28(TakaraBio公司生产)、pUC118(Takara Bio公司生产)、pPA1(特开昭63-233798)、pWH1520(MoBiTec社制)、pCS299P(WO00/63388)、pVLT31[Gene，123，17(1993)]和pIJ702(Genetic Manipulation of Streptomyces：a LaboratoryManual：John Innes Foundation)等。 

 

使用属于埃希氏菌属的微生物作为宿主细胞时，作为启动子只要是可在大肠杆菌内发挥功能的，无论那一种都可以，例如来自大肠茵的trp启动子(P _trp )  、lac启动子(P _lac )、P_L启动子、P_R启动子、P_SE 启动子等，或来自噬茵体等的启动子，例如SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等。也可以使用人为设计使P_trp改变为两个串联的启动子、tac启动子、lacT7启动子、letI启动子那样的启动子等。 

 

另外也可以使用用于使基因在属于芽孢杆菌属的微生物中表达的 xy1A启动子[Appl.Microbiol.Biotechnol.，35，594-599(1991)]、用于使基因在属于棒杆菌属的微生物中表达的P54-6启动子[Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，674-679(2000)]、用于使基因在属于假单孢菌属的微生物中表达的tac启动子[Gene，123，17-24(1993)]、用于使基因在属于链霉菌属的微生物中表达的xylA启动子(Genetic  Manipulation  of  Streptomyces：a LaboratoryManual：John Innes Foundation)等。 

 

优选使用将作为核糖体结合序列的Shine-Dalgarno序列与起始密码子之间距离调节到适当距离(例如6～18碱基)的质粒。 

在使本发明制造方法中使用的DNA与表达载体结合的重组DNA中，不一定需要转录终止序列，但最好是在紧靠结构基因的下面配置转录终止序列。 

 

作为这样的重组DNA，例如pPE43。 

作为将重组DNA导入微生物细胞的导入方法，只要是将DNA导入该细胞的方法，可以使用任一种方法，例如、使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)]、原生质体法(特开昭63-248394)、电穿孔法[Nucleic Acids Res.，16，6127(1988)]等。 

 

另外，作为在上述(c)方法中使用的原来具有生产1种以上的氨基酸能力的微生物，可例举具有生产上述(ii)的氨基酸能力的众所周知的菌株等。 

作为在上述(d)方法中使用的原来具有生产具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质能力的微生物，如(A)属于芽孢杆菌属的微生物、更优选具有杆菌溶素合成活性的属于芽孢杆茵属的微生物、再优选枯草芽孢杆茵、解淀粉芽孢杆茵、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌等属于各种属的微生物、最好是枯 草芽孢杆菌ATCC15245、枯草芽孢杆菌ATCC6633、枯草芽孢杆菌IAM1213、枯草芽孢杆菌IAM1107、枯草芽孢杆菌IAM1214、枯草芽孢杆菌ATCC9466、枯草芽孢杆菌IAM1033、枯草芽孢杆菌ATCC21555、解淀粉芽孢杆菌IFO3022和短小芽孢杆菌NRRL B-12025中的任一菌株的微生物、和(B)属于链霉茵属的微生物、优选具有生产albonoursin能力的属于链霉菌属的微生物、更优选属于小白链霉菌(Streptomyces albulus)或诺尔斯氏链霉菌(Streptomycesnoursei)的微生物。 

(iv)肽酶和具有肽转运活性的蛋白质的活性低下或丧失的微生物 

作为本发明的制造方法使用的微生物，如在通过上述(iii)的方法制备的微生物中，1种以上肽酶和1种以上肽转运蛋白质的活性低下或丧失的微生物、或3种以上肽酶的活性低下或丧失的微生物。 

 

该微生物可以通过例如如下的方法获得，(a)通过上述(iii)的方法赋予1种以上肽酶和1种以上肽转运蛋白质的功能低下或丧失的微生物、或3种以上肽酶的功能低下或丧失的微生物具有生产具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质能力、和生产该1种以上的氨基酸中的至少1种氨基酸的能力的方法，(b)使通过上述(iii)的方法能够制备的微生物的a)1种以上肽酶和1种以上肽转运蛋白质、或b)3种以上肽酶的功能低下或丧失的方法，该微生物具有生产具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的能力、和具有生产该1种以上的氨基酸中的至少1种氨基酸的能力。 

 

作为1种以上肽酶和1种以上肽转运蛋白质的活性低下或丧失的微生物，只要是该微生物能正常生长繁殖，如任意1种以上肽酶和任意1种以上肽转运蛋白质的活性低下或丧失的微生物，优选1种以上9种以下、更优选1种以上7种以下、再优选1种以上4种以下的肽酶的活性低下或丧失，而且优选1种以上5种以下、更优选1种以上3种以下、再优选1种以上2种以下、特别优选1种的肽转运蛋白质 活性低下或丧失的微生物。 

 

作为该微生物，更具体讲，如在该微生物的基因组DNA上存在的编码肽酶的基因(以下、略为肽酶基因)和编码肽转运蛋白质的基因(以下、肽转运蛋白质基因)中，由于在1种以上肽酶基因的碱基序列和1种以上肽转运蛋白质基因的碱基序列中缺失该碱基序列的全部或一部分，或由于在该碱基序列中存在碱基的置换或附加，该肽酶和该肽转运蛋白质的活性低下或丧失的微生物。 

 

所谓肽酶的活性低下指的是与上述的碱基没有缺失、置换或附加的基因编码的肽酶相比，肽分解活性低下，通常低至80％以下、优选50％以下、更优选30％以下、再优选20％以下、特别优选10％以下、最好优选5％以下。 

 

微生物的肽分解活性可以使作为底物的肽和微生物茵体在水性介质中共存，进行肽分解反应后，通过众所周知的方法、例如使用HPLC等的分析法对残存的肽量进行定量来测定。 

作为上述肽酶，只要是具有肽分解活性的蛋白质就可以，优选二肽分解活性高的蛋白质、更优选二肽酶。 

 

作为更具体的肽酶，例如存在于大肠杆茵的具有序列号45表示的氨基酸序列的PepA、具有序列号46表示的氨基酸序列的PepB、具有序列号47表示的氨基酸序列的PepD、具有序列号48表示的氨基酸序列的PepN、PepP[GenBank accession no.(以下略为GenBank)AAC75946]、PepQ(GenBank AAC76850)、PepE(GenBank AAC76991)、PepT(GenBank AAC74211)、Dcp(GenBank AAC74611)和IadA(GenBankAAC77284)等；存在于枯草芽孢杆菌的AmpS(GenBank AF012285)、PepT(GenBank X99339)、YbaC(GenBankZ99104)、YcdD(GenBankZ99105)、YjbG(GenBank Z99110)、YkvY(GenBank Z99111)、YqjE (GenBank Z99116)、YwaD(GenBank Z99123)等；存在于谷氨酸棒杆菌的具有BAB97732、BAB97858、BAB98080、BAB98880、BAB9882、BAB99013、BAB99598和BAB99819(都是日本DNA数据库的登录号)表示的氨基酸序列的蛋白质等；作为二肽酶，如具有序列号45～48表示的氨基酸序列的PepA、PepB、PepD和PepN、以及PepQ、PepE、IadA。另外与序列号45～48中的任一个氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上同源性，而且具有肽酶活性的蛋白质也可以作为二肽分解活性高的蛋白质。氨基酸序列或碱基序列的同源性可以使用上述的BLAST和FASTA等来决定。 

 

而所谓肽转运蛋白质的活性低下指的是与编码上述的没有进行碱基缺失、置换或附加的基因的肽转运蛋白质相比，肽转运活性变低通常指的是降低到80％以下、优选50％以下、更优选30％以下、再优选20％以下、特别优选10％以下、最好优选5％以下。 

 

微生物的肽转运活性可以通过使作为底物的肽和微生物茵体共存于水性介质中进行肽转运反应后，利用众所周知的方法、例如使用HPLC等分析法对残存于水性介质中的肽量进行定量来测定。 

作为上述肽转运蛋白质，是由染色体DNA上形成操纵子的基因编码的蛋白质，在细胞膜上形成复合体后表达肽转运活性的蛋白质、和作为单独的蛋白质具有肽转运活性的蛋白质等只要是参与微生物的肽转运的蛋白质，任一种都可以，优选二肽转运活性高的蛋白质。 

 

作为更具体的肽转运蛋白质，例如存在于大肠杆菌的具有序列号49表示的氨基酸序列的DppA、具有序列号50表示的氨基酸序列的DppB、具有序列号51表示的氨基酸序列的DppC、具有序列号52表示的氨基酸序列的DppD、具有序列号53表示的氨基酸序列的DppF、OppA(GenBank AAC76569)、OppB(GenBank AAC76568)、OppC(GenBankAAC76567)、OppD(GenBank AAC76566)、OppF(GenBank AAC76565)、 YddO(GenBank AAC74556)、YddP(GenBank AAC74557)、YddQ(GenBankAAC74558)、YddR(GenBank AAC74559)、YddS(GenBank AAC74560)、YbiK(GenBank AAC73915)、MppA(GenBank AAC74411)、SapA(GenBankAAC74376)、SapB(GenBank AAC74375)、SapC(GenBank AAC7474)、SapD(GenBank AAC74373)、和SapF(GenBank AAC74372)等；存在于枯草芽孢杆菌的DppA(GenBank CAA40002)、DppB(GenBankCAA40003)、DppC(GenBank CAA40004)、DppD(GenBank CAA40005)、DppE(GenBank CAA40006)、OppA(GenBank CAA39787)、OppB(GenBankCAA39788)、OppC(GenBank CAA39789)、OppD(GenBank CAA39790)、OppF(GenBank CAA39791)、AppA(GenBank CAA62358)、AppB(GenBankCAA62359)、AppC(GenBank CAA62360)、AppD(GenBank CAA62356)、AppF(GenBank CAA62357)、YclF(GenBank CAB12175)和YkfD(GenSankCAB13157)等；存在于谷氨酸棒杆菌的具有BAB99048、BAB99983、BAB99384、BAB99385、BAB99713、BAB99714、BAB99715、BAB99830、BAB99831、BAB99832(都是日本DNA数据库的登录号)表示的氨基酸序列的蛋白质等；另外作为二肽转运活性高的蛋白质，如具有序列号49～53表示的氨基酸序列的DppA、DppB、DppC、DppD、DppF和与它们中任一个的氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上同源性的蛋白质也可作为肽转运活性高的肽转运蛋白质。 

 

上述氨基酸序列的同源性可以使用上述的BLAST或FASTA等程序决定。 

作为3种以上肽酶的活性低下或丧失的微生物，以该微生物能正常生长繁殖为限，如任意3种以上肽酶的活性低下或丧失的微生物，优选3种以上9种以下、更优选3种以上6种以下、再优选3种或4种肽酶的活性低下或丧失的微生物。 

 

作为具体的肽酶，如存在于上述的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌的肽酶和二肽酶。而由与序列号45～48中的任一个氨基酸 序列有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上同源性的氨基酸序列构成、而且具有肽酶活性的蛋白质也可以作为二肽分解活性高的蛋白质。 

 

上述氨基酸序列的同源性可以使用上述的BLAST或FASTA等程序决定。 

(v)肽酶和肽转运蛋白质的活性低下或丧失的微生物的制备 

肽酶和肽转运蛋白质的活性低下或丧失的微生物只要是能够取得该微生物的方法，其取得方法没有限制，例如通过在以下所示的微生物的染色体DNA的肽酶基因或肽转运蛋白质基因导入碱基的缺失、置换或附加的方法可以取得。 

 

作为在微生物的染色体DNA的基因导入碱基缺失、置换或附加的方法，如利用同源重组的方法。作为利用一般的同源重组的方法，如使用将导入了碱基缺失、置换或附加的突变基因与在希望导入碱基缺失等的宿主细胞内含有不能自我复制的抗药性基因的质粒DNA连接制作的同源重组用质粒的方法。 

 

通过常法将该同源重组用质粒导入宿主细胞后，以抗药性作为指标，选择通过同源重组在染色体DNA上转运了该同源重组用质粒的转化株。通过将得到的转化株于不含有该药剂的培养基中培养数小时～1天后，涂布于含有该药剂琼脂培养基和不含有该药剂的琼脂培养基，选择在前者培养基中不生长繁殖，而在后者培养基能够生长繁殖的株，可以取得在染色体DNA上发生第2次同源重组的株。通过决定染色体DNA上导入缺失等的基因存在区域的碱基序列，可以确认染色体DNA上的目的基因中导入碱基的缺失、置换或附加。 

 

作为通过上述方法，能够在染色体DNA上的目的基因中导入碱基的缺失、置换或附加的微生物，例如属于埃希氏茵属、芽孢杆菌属或 棒杆菌属的微生物。 

而作为利用向多个基因有效导入碱基的缺失、置换或附加的同源重组的方法，如使用直链DNA的方法。 

 

具体来说，是使含有希望导入碱基缺失、置换或附加的基因的直链DNA转运到细胞内，在染色体DNA与导入的直链DNA之间发生同源重组的方法。本方法只要是可有效地转运直链DNA的微生物，也可以适用于任一种微生物，作为理想的微生物，如属于埃希氏菌属或芽孢杆菌属的微生物、更优选大肠杆茵、再优选表达来自入噬茵体的重组蛋白质组(Red重组系)的大肠杆菌。 

 

作为表达入Red重组系的大肠杆菌，如带有含入Red重组系基因的质粒DNA的pKD46[可从大肠杆菌基因储备中心(美国耶鲁大学)获得]的大肠杆菌JM101株等。 

作为可用于同源重组的DNA，如可例举：   

(a)在抗药性基因的两端含有与位于存在于作为碱基的缺失、置换或附加的导入对象的染色体DNA上区域的两外侧的DNA具有同源性的DNA的直链DNA、 

(b)直接连接了与存在于作为碱基的缺失、置换或附加的导入对象的染色体DNA上区域的两外侧的DNA具有同源性的DNA的直链DNA、 

(c)在含有抗药性基因和能够用于负选择的基因的DNA的两端含有与存在于作为碱基的缺失、置换或附加的导入对象的染色体DNA上的区域的两外侧的DNA具有同源性的DNA的直链DNA、 

(d)在上述(a)的直链DNA中，在抗药性基因和与存在于染色体DNA上区域的两外侧的DNA具有同源性的DNA之间，还含有来自酵母的Flp重组酶〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，82，5875(1985)〕识别碱基序列的DNA。 

 

作为抗药性基因，只要是对于宿主微生物表现出敏感性的药剂， 赋予抗药性的抗药性基因，也可以使用任一种抗药性基因。作为宿主微生物使用大肠杆菌时，作为抗药性基因，例如、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、大观霉素抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因等。 

 

所谓能够用于负选择的基因指的是当在宿主微生物中使该基因表达时，在一定培养条件下，使该微生物致死的的基因，作为该基因，例如来自属于芽孢杆茵属的微生物的sacB基因〔Appl.Environ.Microbiol.，59，1361-1366(1993)〕、和来自属于埃希氏菌属的微生物的rpsL基因〔Genomics，72.99-104(2001)〕等。 

 

存在于上述的直链DNA的两末端的、与存在于成为染色体DNA上的置换或缺失的导入对象的区域两端外侧的DNA具有同源性的DNA在直链DNA中被配置在与染色体DNA上的方向相同方向，其长度优选10bp～100bp左右，更优选bp～50bp左右、进一步优选30～40bp左右。 

所谓来自酵母的Flp重组酶识别的碱基序列只要是该蛋白质识别、催化同源重组的碱基序列，没有特别限定，优选具有序列号54表示的碱基序列的DNA、和具有在该DNA中缺失、置换或附加了1个～数个碱基的碱基序列、而且来自酵母的Flp重组酶识别的、催化同源重组的碱基序列的DNA。 

 

所谓具有同源性是上述直链DNA在染色体DNA上的目的区域，具有发生同源重组的程度的同源性，作为具体的同源性，如80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、最优选100％的同源性。 

上述碱基序列的同源性可以使用上述的BLAST或FASTA等程序决定。 

 

上述直链DNA可以通过PCR制作。另外将含有上述直链DNA的DNA 构建在质粒上后，经限制酶处理也可以得到目的直链DNA。 

作为在微生物的染色体DNA中导入碱基的缺失、置换或附加的方法，如以下的方法1～4。 

方法1：将上述(a)或(d)的直链DNA导入宿主微生物，以抗药性为指标选择通过同源重组该直链DNA被插入到染色体DNA上的转化株的方法。 

方法2：向通过上述方法1取得的转化株导入上述(b)的直链DNA，通过消除经该方法插入到染色体DNA上的药剂基因，使微生物的染色体DNA上的区域置换或缺失的方法。 

方法3： 

将上述(c)的直链DNA导入宿主微生物，以抗药性为指标选择通过同源重组该直链DNA被插入到染色体DNA上的转化株、 

合成在与染色体DNA上方向同一方向连接了与位于染色体DNA上的置换或缺失的对象区域两端外侧的DNA具有同源性的DNA的DNA，导入到上述[1]中得到的转化株， 

在可用于负选择的基因表达的条件下，对进行了上述[2]操作的转化株进行培养，选择在该培养条件下可生长繁殖的株作为从染色体DNA上削除了抗药性基因和可用于负选择的基因的菌株的方法。 

方法4： 

将上述(d)的直链DNA导入宿主微生物，以抗药性为指标选择通过同源重组该直链DNA被插入到染色体DNA上的转化株、 

向上述[1]中得到的转化株导入Flp重组酶基因表达质粒，使该基因表达后，取得对上述[1]中使用的药剂有敏感性的菌株的方法。 

 

作为将在上述方法中使用的直链DNA导入宿主微生物的方法，只要是将DNA导入该微生物的方法，可以使用任一种方法，例如、使用钙离子的方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)〕、原生质体法(特开昭63-248394)、电穿孔法〔Nucleic Acids Res.， 16，6127(1988)〕等。 

 

在方法2或方法3[2]中使用的直链DNA中，通过使用在该DNA的中央部附近转运希望插入到染色体DNA上的任意基因的直链DNA，在削除抗药性基因等的同时，可以将任意基因插入到染色体DNA上。 

上述方法2～4由于是对于最终得到的转化株的染色体DNA上不保留抗药性基因和可用于负选择的基因等外源基因的方法，所以通过使用同一抗药性基因和可用于负选择的基因，反复进行该方法的操作，容易制造在染色体DNA上位置不同的2个以上区域带有碱基的缺失、置换或附加的微生物。 

(vi)本发明的二肽的制造方法 

通过对用上述(iii)和(v)的方法得到的微生物在培养基中培养，使二肽在培养物中生成、蓄积，从该培养物中回收二肽，可以制造二肽。 

  

将该微生物在培养基中进行培养的方法可以根据微生物培养中使用的通常方法来进行。 

即，只要是含有该微生物可利用的碳源、氮源、无机盐类等的可有效进行该微生物培养的培养基，可以使用天然培养基、合成培养基中的任一种。 

在该培养基中虽然不需要含有构成目的二肽的氨基酸，但在天然培养基、或用于培养氨基酸需求性菌株的培养基中有时也含有该氨基酸。在本发明制造方法中使用的培养基中也可以含有本发明使用的微生物生长繁殖所必需的量的氨基酸。即，通常培养基中含有的氨基酸量由于与通过本发明制造方法中使用的微生物生产的该氨基酸量相比非常少，所以通常培养基中含有的该氨基酸量并不是由于该氨基酸的有无导致本申请发明制造的二肽产量变化那样程度的量，因此在本发明的制造方法中使用的培养基中也可以含有如此程度的该氨基酸。 

 

作为本发明中使用的培养基中含有的氨基酸量，例如如果是天然 培养基，通常含不足2.5g/L、优选0.5g/L以下、更优选0.1g/L以下、再优选20mg/L以下的该氨基酸；如果是合成培养基，通常含1g/L以下、优选50mg/L以下、更优选1mg/L以下、再优选0.5mg/L以下的该氨基酸。但是，当通过本申请发明的制造方法制造2种不同氨基酸构成的二肽时，当使用的微生物只有生产构成该二肽的氨基酸中的1种氨基酸的能力时，也可以向本发明中使用的培养基中添加该微生物不能生产的另外1种氨基酸。此时添加的氨基酸量通常为0.5g/L～100g/L、优选2g/L～50g/L。 

 

作为碳源，只要是该微生物可利用的就可以，可以使用葡萄糖、乳糖、蔗糖、含有这些糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等碳水化合物，醋酸、丙酸等有机酸，乙醇、丙醇等醇类等 

作为氮源可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其它的含氮化合物、以及胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浸渍液、酪蛋白水解物、大豆粕和大豆粕加水分解物、各种发酵茵体、及其消化物等。 

 

作为无机盐，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。 

培养在通常振荡培养或深部通气搅拌培养等好氧条件下进行。培养温度为15～40℃比较好、培养时间通常为5小时～7日间。培养中pH保持3.0～9.0。pH的调整使用无机或有机的酸、碱性溶液、尿素、碳酸钙、氨等进行。 

 

另外根据培养中需要，也可以向培养基中添加氨苄青霉素或四环素等抗生素。 

当对用作为启动子使用诱导性的启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，根据需要也可以向培养基中添加诱导物。例如、对用使用了lac启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，可以添加异丙 基-β-D-硫代半乳糖苷等，当用使用了trp启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，也可以向培养基添加吲哚丙烯酸等。 

 

作为用上述方法制造的二肽，如1种或2种的氨基酸经α键形成的二肽，优选该氨基酸是L-氨基酸或甘氨酸的二肽、更优选在式(I) 

R¹-R²    (I) 

表示的二肽中，R¹和R²为相同或不同、从L-丙氨酸(L-Ala)、L-谷氨酰胺(L-Gln)、L-谷氨酸(L-Glu)、甘氨酸(Gly)、L-缬氨酸(L-Val)、L-亮氨酸(L-Leu)、L-异亮氨酸(L-Ile)、L-脯氨酸(L-Pro)、L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-色氨酸(L-Trp)、L-蛋氨酸(L-Met)、L-丝氨酸(L-Ser)、L-苏氨酸(L-Thr)、L-半胱氨酸(L-Cys)、L-天冬酰胺(L-Asn)、L-酪氨酸(L-Tyr)、L-赖氨酸(L-Lys)、L-精氨酸(L-Arg)、L-组氨酸(L-His)、L-天冬氨酸(L-Asp)、L-α-氨基丁酸(L-α-AB)、L-4-羟基脯氨酸(L-4-HYP)、L-3-羟基脯氨酸(L-3-HYP)、L-鸟氨酸(L-Orn)和L-瓜氨酸(L-Cit)选出来的氨基酸的二肽、再优选R¹为L-Ala、Gly、L-Met、L-Ser或L-Thr时、R²为L-Gln、L-Glu、Gly、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-AB、L-4-HYP、L-3-HYP、L-Orn或L-Cit的二肽、特别优选R¹为L-Ala时，R²为L-Gln、Gly、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-α-AB或L-Cit的二肽、R¹为Gly时，R²为L-Gln、Gly、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-α-AB或L-Cit的二肽、R¹为L-Met时，R²是L-Phe、L-Met、L-Cys、L-Tyr、L-Lys或L-His的二肽、R¹为L-Ser时，R²是L-Gln、Gly、L-Phe、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Tyr、L-His或L-α-AB的二肽、R¹为L-Thr时，R²是L-Gln、L-Leu、L-Phe、L-Met、L-Ser、L-Thr或L-α-AB的二肽、R¹为L-Gln时，R²是L-Phe或L-α-AB的二肽、R¹为L-Phe时，R²是L-Gln的二肽、R¹为L-Trp时，R²是Gly的二肽、 R¹是L-Cys时，R²是L-Ala、L-Gln、Gly、或L-Met的二肽、R¹为L-Lys时，R²是L-Ala、Gly或L-Met的二肽、R¹为L-Arg时，R²是L-α-AB的二肽、R¹为L-His时，R²是L-Met的二肽、和R¹为L-α-AB时，R² 是L-Ala、L-Gln、Gly、L-Ser、L-Thr、L-Arg或L-α-AB的二肽，最好优选L-丙氨酰-L-丙氨酸(L-Ala-L-Ala)、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-Ala-L-Gln)、L-丙氨酰-L-苯丙氨酸(L-Ala-L-Phe)、L-苏氨酰-L-苯丙氨酸(L-Thr-L-Phe)、L-丙氨酰-L-酪氨酸(L-Ala-L-Tyr)、L-丙氨酰-L-蛋氨酸(L-Ala-L-Met)、L-丙氨酰-L-缬氨酸(L-Ala-L-Val)、L-丙氨酰-异亮氨酸(L-Ala-L-Ile)、L-丙氨酰-L-亮氨酸(L-Ala-L-Leu)和L-丝氨酰-L-苯丙氨酸(L-Ser-L-Phe)。 

 

培养物中生成、蓄积的二肽的回收可以通过使用活性炭或离子交换树脂等通常的方法、或通过利用有机溶剂萃取、结晶、薄层层析、高效液相层析等进行。 

以下给出了编码具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的DNA取得方法等实验例，该DNA的取得方法等并不限定于该实验例。 

实验例1利用数据库检索具有二肽合成活性的蛋白质 

以来自枯草芽孢杆菌168株的D-Ala-D-Ala连接酶基因的氨基酸序列[Nature，390，249-256(1997)]作为质询，使用作为枯草芽孢杆茵168株的基因组DNA的数据库的Subtilist(http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/)的同源性检索功能，对存在于枯草芽孢杆茵168株的基因组DNA序列中的编码具有同源性的蛋白质的基因进行检索。 

 

结果在提取的序列中，将编码作为D-Ala-D-Ala连接酶基序[Biochemistry，30，1673(1991)]的序列号33、34或35表示的氨基酸序列，同时编码其功能已经被鉴定的蛋白质的基因排除后，选择表现出与D-Ala-D-Ala连接酶基序最高同源性(29.1％)的序列作为 功能未知基因ywfE。 

 

ywfE的碱基序列如序列号9所示，由该碱基序列编码的蛋白质的氨基酸序列如序列号1所示。 

验例2ywfE基因表达株的构建 

根据实验例1得到的碱基序列信息，象以下那样操作可以取得枯草芽孢杆菌的ywfE基因片段。 

 

首先将枯草芽孢杆菌168株(ATCC 23857)接种于LB培养基[10g/l细菌培养用胰化蛋白胨(Difco公司生产)、5g/l酵母提取物(Difco公司生产)、5g/l氯化钠]，于30℃下静置培养过夜。培养后通过使用Current Protocols in Molecular Biology所述的饱和酚方法，对该微生物的染色体DNA进行分离纯化。 

 

使用Perseptive Biosys tems公司制造8905型DNA合成仪，合成具有序列号19～22表示的碱基序列的DNA(以下分别称之为引物A、引物B、引物C和引物D)。引物A是附加在枯草芽孢杆菌染色体DNA的含有ywfE起始密码子的区域5＇端的含有XhoI识别序列的碱基序列。引物B是附加在与含有ywfE的终止密码子的序列互补的碱基序列号5＇端的含有BamHI识别序列的碱基序列。引物C是附加在含有trp 启动子的表达载体pTrS30[从大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]的 trp启动子区域的碱基序列号5＇端的含有EcoRI识别序列的碱基序列。引物D是附加在与含有trp启动子的表达载体pTrS30的 trp 启动子区域的序列互补的序列号5＇端的含有XhoI识别序列的碱基序列。 

 

在ywfE基因片段的扩增中使用上述引物A和引物B、枯草芽孢杆菌的染色体DNA作为模板，在trp启动子区域的片段扩增中使用引物C和引物D、pTrS30作为模板进行PCR。PCR通过制备含有作为模板的 0.1μg的染色体DNA或10ng的pTrS30、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶(Stratagene公司生产)、4μL的PfuDNA聚合酶用×10缓冲液(Stratagene公司生产)、各200μmol/L的dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)的反应液40μL，按照94 ℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认在使用引物A和引物B的PCR中扩增了相当于ywfE基因片段的约1.4kb、在使用引物C和引物D的反应中扩增了相当于trp启动子区域的DNA片段的约0.3kb的DNA片段后，添加与剩下反应液等量的TE[10mmol/LTris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA]饱和酚/氯仿(lvol/lvol)溶液，并混合。向该溶液经离心分离后得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃ 下放置30分钟。将该溶液离心分离使DNA 沉淀后，将该DNA溶解于20μL的TE。 

 

使用各个该溶液各5μL，将用引物A和引物B扩增的DNA用限制酶XhoI和BamHI进行酶切，而使用引物C和引物D扩增的DNA用限制酶EcoRI和XhoI进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，使用genecleanII试剂盒(GENECLEANIIkit、BIO101社制)，分别回收含有 ywfE的1.4kb和含有trp启动子区域的0.3kb的DNA片段。 

 

将含有trp启动子的表达载体pTrS30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]0.2μg用限制酶EcoRI和BamHI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，通过与上述同样的方法，回收4.5 kb的DNA片段。 

使用连接试剂盒(Takara Bio公司生产)，使上述得到的含有ywfE 的1.4kb片段、含有trp启动子区域的0.3kb片段和4.5kb的片段于16℃下反应16小时，进行连接。 

 

通过使用钙离子的方法[ProG.Natl.Acad.Sci.，USA，69.2110(1972)]用该反应液转化大肠杆菌NM522株(Stratagene公司生产)后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。 

根据众所周知的方法从生长繁殖下来的转化体菌落提取质粒，通过使用限制酶解析其构造，确认取得了在trp启动子下游连接了ywfE 的表达载体pPE43(图1)。 

实验例3二肽的生产 

将实验例2得到的带有pPE43的大肠杆茵NM522(大肠杆茵NM522/pPE43株)接种在加入了含有50μg/ml氨苄青霉素的8ml LB培养基的大型试管中，于28℃下培养17小时。对该培养液进行离心分离、取得湿菌体。 

 

制备由终浓度60mg/ml的该湿菌体、120mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH7.4)、60mmol/L的氯化镁、60mmol/L的ATP、30mmol/L的L-Ala、30mmol/L的L-Gln、0.4％的NymeenS-215构成的0.1ml的反应液，于37℃下反应3分钟。 

反应结束后，将反应生成物用二硝基酚化法衍生后，通过HPLC法进行分析。在通过HPLC法进行的分析中，分离柱使用关东化学社制的Lichrosorb-RP-18柱，洗脱液使用1％(v/v)磷酸、25％(v/v)乙腈，以0.7ml/分钟的流速进行。其结果确认反应液中生成蓄积120mg/L的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-Ala-L-Gln)。 

 

在作为对照菌株只含有载体的大肠杆菌NM522/pTrS30株的菌体中没有确认L-Ala-L-Gln的生成。 

实验例4C末端附加His-tag重组型二肽合成酶的纯化 

使用上述DNA合成仪，合成具有序列号23和24表示的碱基序列的DNA(以下、分别称为引物E、引物F)。引物E是含有将ywfE的 起始密码子(atg)置换为NcoI识别序列(ccatgg)的区域的碱基序列。引物F是含有将ywfE的终止密码子置换为BamHI识别序列(ggatcc)的区域的碱基序列。 

以枯草芽孢杆菌168株(ATCC23857)的染色体DNA作为模板，使用上述引物E和引物F作为引物组进行PCR。PCR通过制备含有0.1μg的染色体DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μL的PfuDNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各dNTP的反应液40μL，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认扩增了相当于 ywfE片段的约1.4kb后，添加与剩下反应液等量的TE饱和酚/氯仿溶液，并混合。向该溶液经离心分离后得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置3分钟。将该溶液离心分离得到的DNA沉淀溶解于20μL的TE。 

 

使用各个该溶液各5μL，将扩增的DNA用限制酶NcoI和BamHI进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，使用GENECLEANII试剂盒回收含有ywfE的1.4kb的DNA片段。 

将C末端附加His-tag重组体表达载体pQE60(Qiagen公司生产)0.2g用限制酶NcoI和BamHI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，使用与上述同样的方法回收3.4kb的DNA片段。 

 

使用连接试剂盒，使上述得到的含有ywfE的1.4kb DNA片段和3.4kb DNA片段于16℃下反应1小时，进行连接。 

通过使用钙离子的方法用该连接反应液转化大肠杆菌NM522株后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。 

 

通过众所周知的方法从生长繁殖的转化体茵落提取质粒，使用限 制酶对其构造进行解析，确认取得了C末端附加His-tag型ywfE表达载体的pQE60ywfE(图2)。 

将带有pQE60ywfE的大肠杆茵  NM522(大肠杆菌NM522/pQE60ywfE株)接种在加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8ml的LB培养基的大型试管，于28℃下培养17小时。将该培养液接种在加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的50ml的LB培养基的250ml容量三角烧瓶，于30℃下培养3小时后，按照终浓度达到1mmol/L那样添加异丙醇-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，再于30℃下培养4小时。对该培养液进行离心分离取得湿茵体，使用HisTrap(附加His-tag蛋白质纯化试剂盒、Amersham Pharmasia Biotech社制)，根据说明书从该湿茵体纯化附加His-tag重组型酶。 

实验例5使用附加His-tag重组型酶生产二肽(1) 

(i)制备由实验例4中取得的纯化了的附加His-tag重组型酶0.04mg、100mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)、60mmol/L的氯化镁、60mmol/L的ATP、30mmol/L的L-Ala、30mmol/L的L-Gln构成的0.1ml反应液，于37℃进行16小时反应。 

 

反应结束后，通过与上述实验例3同样的方法分析反应生成物，确认反应液中生成蓄积3.7g/L的L-Ala-L-Gln和0.3g/L的L-丙氨酰-L-丙氨酸(L-Ala-L-Ala)。 

(ii)除了酶为0.01mg、取代L-Gln含有L-Phe、L-Met、L-Leu或L-Val以外，制备与上述(i)的反应液组成相同的反应液，于上述(i)的反应条件下进行反应。 

 

反应结束后，通过与上述实验例3同样的方法对反应生成物进行分析，确认反应液中分别生成蓄积7.0g/L的L-丙氨酰-L-苯丙氨酸(L-Ala-L-Phe)、7.0g/L的L-丙氨酰-L-蛋氨酸(L-Ala-L-Met)和0.03g/L的L-Ala-L-Ala、5.0g/L的L-丙氨酰-L-亮氨酸(L-Ala-L-Leu)和0.2g/L的L-Ala-L-Ala、或1.6g/L的L-丙氨酰-L-缬氨酸(L-Ala-L-Val)和0.3g/L的L-Ala-L-Ala。 

(iii)除了酶为0.01mg、取代L-Ala含有Gly、取代L-Gln含有L-Phe或L-Met以外，制备与上述(i)的反应液的组成相同的反应液，在上述(i)的反应条件使其反应。 

 

反应结束后，通过与上述实验例3同样的方法对反应生成物进行分析，确认反应液中分别生成蓄积5.2g/L的甘氨酰-L-苯丙氨酸(Gly-L-Phe)或1.1g/L的甘氨酰-L-蛋氨酸(Gly-L-Met)。 

如果从上述反应液组成中去除ATP，完全不能生成二肽。 

以上结果表明ywfE基因产物在ATP存在下具有生成L-Ala和L-Gln、由L-Phe、L-Me t、L-Leu或L-Val生成L-Ala-L-Gln和L-Ala-L-Ala、L-Ala-L-Phe、L-Ala-L-Met和L-Ala-L-Ala、L-Ala-L-Leu和L-Ala-L-Ala、或L-Ala-L-Val和L-Ala-L-Ala的活性、由Gly和L-Phe或L-Met生成Gly-L-Phe或Gly-L-Met的活性。 

实验例6使用附加His-tag重组型酶生产二肽(2) 

制备由实验例4中得到的纯化了的附加His-tag重组型酶0.04mg、100mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)、60mmol/L的氯化镁、60mmol/L的ATP构成的0.1ml反应液，按照分别达到30mmol/L那样向反应液中添加由表1的第1行和最左列的氨基酸的组合构成的各种L-氨基酸、Gly或β-Ala，于37 ℃下进行16小时反应。反应结束后，对反应生成物进行HPLC分析，确认生成表1所示的二肽。 

 

【表1-1】 

 

【表1-2】 

 

【表1-3】 

 

以表1的第1行和最左列所述的2种(或1种)L-氨基酸、Gly或β-Ala作为底物反应时生成的二肽分别表示在表格内。○表示生成了二肽，但序列未确定，×表示不能确认二肽的生成，而空栏表示未实施。 

实验例7使用附加His-tag重组型酶表达株生产二肽 

将实验例4得到的大肠杆菌NM522/pQE60ywfE株接种在加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8ml的LB培养基的大型试管，于28℃下培养17小时。将该培养液接种在加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的50ml的LB培养基的250ml容量三角烧瓶，于30℃下培养3小时后，按照终浓度达到1mmo/L那样添加IPTG，再于30℃下培养4小时。对该培养液进行离心分离取得湿茵体。 

 

将由200g/L的湿菌体、50g/L的葡萄糖、5g/L的肌醇六磷酸(使用33％的浓氢氧化钠溶液稀释成中性)、15g/L的磷酸二氢钾、5g/L的硫酸镁·7水合物、4g/L的NymeenS-215、10ml/L的二甲苯、200mmol/L的L-Ala、200mmo l/L的L-Gln构成的20ml反应液(pH7.2)加入到50ml容量的烧杯、于32℃、900rpm的条件下进行2小时反应。反应中使用2mol/L的氢氧化钾将反应液的pH保持在7.2。 

 

将反应生成物用与实验例3所述方法同样的方法进行分析，确认25mg/L的L-Ala-L-Gln的蓄积。 

实验例8从属于芽孢杆菌属的各种微生物中克隆相当于ywfE基因的基因和该基因的解析 

根据序列号9表示的碱基序列，象以下那样操作取得相当于存在于枯草芽孢杆菌ATCC15245、ATCC6633、IAM1213、IAM1107、IAM1214、ATCC9466、IAM1033、ATCC21555、解淀粉芽孢杆菌IFO3022、和短小芽孢杆菌NRRLB-12025的ywfE基因的基因。 

 

首先，将枯草芽孢杆菌ATCC15245、ATCC6633、IAM1213、IAM1107、IAM1214、ATCC9466、IAM1033、ATCC21555、解淀粉芽孢杆茵IFO3022、和短小芽孢杆菌NRRLB-12025分别接种于LB培养基，于30℃下静置培养过夜。培养后，通过使用Current Protocols in MolecularBiology所述的饱和酚的方法，对于各个微生物的染色体DNA分别进行分离纯化。 

 

使用PerSeptive Biosystems公司制造8905型DNA合成仪，合成具有序列号25和26表示的碱基序列的DNA(以下、分别称为引物G、引物H)。引物G是含有存在于枯草芽孢杆菌168株的染色体DNA上的ywfE的起始密码子的上游区域的序列。引物H是与含有ywfE的终止密码子的下游序列互补的序列。 

 

以枯草芽孢杆菌ATCC15245、ATCC6633、IAM1213、IAM1107、IAM1214、ATCC9466、IAM1033、ATCC21555、或解淀粉芽孢杆菌IF03022的染色体DNA作为模板，使用上述引物G和引物H作为引物组进行PCR。PCR通过制备含有0.1μg的染色体DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μL的PfuDNA聚合酶用×l0缓冲液、200μmol/L的各dNTP的反应液40μL，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认扩增了相当于 ywfE基因片段的约1.4kb后，添加与剩下反应液等量的TE饱和酚/氯仿溶液，并混合。向该溶液经离心分离后得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。将该溶液离心分离得到的DNA沉淀溶解于20μL的TE。 

 

使用连接试剂盒，将上述得到的来自各菌株染色体DNA的1.4kb片段和pCR-blunt(Invitrogen公司生产)于16℃下反应16小时，进行连接。 

通过使用钙离子的方法用该反应液转化大肠杆菌NM522株后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。 

 

通过根据众所周知的方法从生长繁殖的转化体的茵落提取质粒， 用限制酶对各个构造进行解析，确认取得含有相当于ywfE基因的基因的质粒pYWFE1(来自ATCC15245株，具有序列号36表示的碱基序列的DNA)、pYWFE2(来自ATCC6633株，具有序列号10表示的碱基序列的DNA)、pYWFE3(来自IAM1213株，具有序列号11表示的碱基序列的DNA)、pYWFE4(来自IAM1107株，具有序列号12表示的碱基序列的DNA)、pYWFE5(来自IAM1214株，具有序列号13表示的碱基序列的DNA)、pYWFE6(来自ATCC9466株，具有序列号9表示的碱基序列的DNA)、pYWFE7(来自IAM1033株，具有序列号36表示的碱基序列的DNA)、pYWFE8(来自ATCC21555株，具有序列号14表示的碱基序列的DNA)、pYWFE9(来自IFO3022株，具有序列号15表示的碱基序列的DNA)。 

 

而相当于来自短小芽孢杆菌NRRL B-12025的ywfE的基因(具有序列号16表示的碱基序列的DNA)象以下那样取得。 

以上述制备的NRRL B-12025株的染色体DNA作为模板，使用序列号27和28表示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR。PCR通过制备含有0.1μg的染色体DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的Z-taq聚合酶(Takara Bio公司生产)、5μL的Z-taq聚合酶用×10缓冲液(Takara Bio公司生产)、200μmol/L的各dNTP的反应液50μL，按照98℃下5秒钟、55℃下30秒钟、72℃下1分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认约0.8kb的片段扩增后，添加与剩下反应液等量的TE饱和酚/氯仿溶液，并混合。向该溶液经离心分离后得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。将该溶液离心分离得到的DNA沉淀溶解于20μL的TE。 

 

使用连接试剂盒将上述得到的0.8kb片段和pGEM T-easy (Promega公司生产)于16℃下反应16小时，进行连接。 

通过使用钙离子的方法用该反应液转化大肠杆菌DH5α株后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。 

 

从上述得到的转化体提取质粒，决定约0.8kb的插入DNA片段的碱基序列，确认是由序列号16表示的碱基序列中的第358～1160位碱基构成的碱基序列。 

然后将该质粒用EcoRI进行酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离。使用geneclean II试剂盒纯化该DNA片段。使用DIG-HighPrime DNA Labeling&Detection Starter KitI(Roche Diagnostics公司生产)对约0.5μg该纯化DNA片段进行DIG标记。DIG标记根据该试剂盒附带的说明书进行。 

 

使用上述得到的DIG标记的DNA，进行NRRLB-12025株的染色体DNA的Southern解析。 

将NRRL B-12025株的染色体DNA分别使用BamHI、EcoRI、HindIII、 KpnI、PstI、SacI、SalI和SphI完全消化，通过琼脂糖电泳将DNA片段分离后，根据常法转移到nylon membrane plus charge(RocheDiagnostics公司生产)。 

 

通过照射UV，将DNA片段固定在该尼龙膜后，使用上述探针DNA和该尼龙膜进行Southern杂交。 

杂交通过使该探针DNA和该尼龙膜在65℃下接触16小时，然后使用0.1％SDS和2×SSC构成的溶液将该尼龙膜于室温下清洗5分钟，清洗2次，再用0.1％SDS和0.5×SSC构成的溶液，于65℃下15分钟、清洗2次进行，其它操作、条件和杂交的DNA的检测根据上述的DIG-High Prime DNA Labeling&Detection Starter Kit I附带的说明书进行。 

 

该结果表明在HindIII和PstI完全消化片段3.5kbp附近看到发色。 

然后将NRRL B-12025株的染色体DNA使用HindIII和PstI分别完全消化，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段。使用genecleanII试剂盒从各个限制酶消化的DNA中纯化3-4kbp片段，使用连接试剂盒使其自环化。 

 

根据上述决定的0.8kb的DNA片段的碱基序列，设计、合成序列号29和30表示的碱基序列，以上述取得的环化DNA作为模板进行PCR。PCR通过制备含有10ng的环化DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的pyrobest聚合酶(Takara Bio公司生产)、5μL的pyrobest聚合酶用×10缓冲液(Takara Bio公司生产)、200μmol/L的各dNTP的反应液50μL，按照98℃下5秒钟、55℃下30秒钟、72℃下3分30秒钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认约3.0kb片段扩增后，添加与剩下反应液等量的TE饱和酚/氯仿溶液，并混合。向该溶液经离心分离后得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。将该溶液离心分离得到的DNA沉淀溶解于20μL的TE。 

 

使用连接试剂盒对上述得到的DNA片段和Zero Blunt PCRCloning Kit(Invi trogen公司生产)进行连接。 

通过使用钙离子的方法用该反应液转化大肠杆菌NM522株后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。 

 

根据众所周知的方法从生长繁殖的转化体茵落提取质粒，通过使 用限制酶对其构造进行解析，确认得到了含有相当于ywfE基因的基因的质粒pYWFE10(来自NRRL B-12025株、具有序列号16表示的碱基序列的DNA)。 

使用碱基序列分析装置373A·DNA序列仪决定上述得到的相当于含有pYWFE1～pYWFE10的ywfE基因的各基因的碱基序列。 

 

虽然由pYWFE1、pYWFE6和pYWFE7中含有的基因编码的蛋白质的氨基酸序列与ywfE基因编码的蛋白质的氨基酸序列相同，但由pYWFE2、pYWFE3、pYWFE4、pYWFE5、pYWFE8、pYWFE9和pYWFE10中含有的基因编码的蛋白质的氨基酸序列与ywfE基因编码的蛋白质的氨基酸序列却不同。 

由相当于pYWFE2、pYWFE3、pYWFE4、pYWFE5、pYWFE8、pYWFE9、pYWFE10以及pYWFE1和pYWFE7中含有的ywfE基因的基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列号2～8以及1所示，而该基因的碱基序列分别如序列号10～16以及36所示。 

实验例9C末端附加His-tag型重组型二肽合成酶的纯化 

以枯草芽孢杆菌ATCC15245、ATCC6633、IAM1213、IAM1107、IAM1214、ATCC9466、IAM1033、ATCC21555、或解淀粉芽孢杆菌IFO3022的染色体DNA为模板，使用实验例2所述的引物A和引物B作为引物组进行PCR。PCR通过制备含有0.1μg的染色体DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μL的PfuDNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各dNTP的反应液40μL，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

当以短小芽孢杆菌NRRL B-12025的染色体DNA作为模板时，使用具有序列号31和32表示的碱基序列的DNA作为引物组，在与上述同样的条件下进行PCR。 

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认分别扩增了相当 于ywfE片段的约1.4kb的DNA片段后，添加与剩下反应液等量的TE饱和酚/氯仿溶液，并混合。向该溶液经离心分离后得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。将该溶液离心分离得到的DNA沉淀溶解于20μL的TE。 

 

使用各个该溶液5μL，将扩增的DNA用限制酶NcoI和BamHI酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段后，使用genecleanII试剂盒，回收含有相当于ywfE基因的基因的1.4kb的DNA片段。 

然后将C末端附加His-tag型重组体表达载体pQE600.2μg用限制酶NcoI和BamHI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，通过与上述同样的方法回收3.4kb的DNA片段。 

 

使用连接试剂盒使上述得到的含有相当于枯草芽孢杆菌168株的ywfE基因的基因的1.4kb的DNA片段和3.4kb的DNA片段于16℃下反应16小时，进行连接。 

通过使用钙离子的方法用该反应液转化大肠茵NM522株后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。 

 

根据众所周知的方法从生长繁殖的转化体茵落提取质粒，通过使用限制酶对它们的构造进行解析，确认取得了作为C末端附加His-tag型基因表达载体的pQE60ywfE1(含有来自ATCC15245的基因的载体)、pQE60ywfE2(含有来自ATCC6633的基因的载体)、pQE60ywfE3(含有来自IAM1213的基因的载体)、pQE6 0ywfE4(含有来自IAM1107的基因的载体)、pQE60ywfE5(含有来自IAM1214的基因的载体)、pQE60ywfE6(含有来自ATCC9466的基因的载体)、pQE60ywfE7(含有来自IAM1033的基因的载体)、pQE60ywfE8(含有来自ATCC21555的基因的载体)、pQE6 0ywfE9(含有来自IFO3022的基因的载体)、和pQE60ywfE10(含有来自NRRL B-12025的基因的载体)。 

 

将上述得到的大肠杆菌NM522/pQE60ywfE1～NM522/pQE60ywfE10株分别接种在加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8ml的LB培养基的大型试管，于28℃下培养17小时。将该培养液接种于加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的50ml的LB培养基的250ml容量的三角烧瓶，于30℃下培养3小时后，按照终浓度达到1mmol/L那样添加IPTG，再于30℃下培养4小时。使用HisTrap，根据其使用说明书，从对该培养液进行离心分离得到的湿菌体纯化附加His-tag重组型酶。 

实验例10  使用纯化酶生产二肽 

制备由实验例9得到的重组型酶0.04mg、100mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)、60mmol/L的氯化镁、60mmol/L的ATP、30mmol/L的L-Ala和30mmol/L的L-Gln构成的0.1ml反应液，于37℃下反应16小时。 

 

反应结束后，通过实验例3所述的方法对反应液进行分析，结果确认3.0～3.5g/L的L-Ala-L-Gln和0.25～0.3g/L的L-Ala-L-Ala生成蓄积。 

而如果从上述反应液组成除去ATP，完全不能生成L-Ala-L-Gln和L-Ala-L-Ala。 

 

以上结果表明实验例8得到的基因产物无论那一个都具有在ATP存在下由L-Ala和L-Gln生成L-Ala-L-Gln和L-Ala-L-Ala的活性。 

实验例11albC基因和其类似基因的取得 

根据诺尔斯氏链霉菌的albC基因的碱基序列[Chemistry&Biol.， 9，1355(2002)]，通过以下方法从诺尔斯氏链霉菌和小白链霉菌取得 albC基因和其类似基因。 

 

首先将诺尔斯氏链霉菌IFO15452株和小白链霉菌IFO14147株分别接种于添加了1％甘氨酸的KM73培养基[2g/l酵母提取液(Difco 公司生产)、10g/1可溶性淀粉(和光纯药工业社制)]、KP培养基[15g/l葡萄糖、10g/1甘油、10g/1多胨(日本制药株式会社制)、10g/1肉提取物(极东制药工业株式会社生产)、4g/1碳酸钙]，于28℃下振荡培养过夜。而诺尔斯氏链霉菌IF015452株和小白链霉菌IF014147株购自独立行政法人制品评价技术基盘机构生物资源部门[Na tional Institute of Technology and Evaluation(NITE)Biological Resource Center(BRC)]( 

292—0818千蕖果木更津市かずさ缣足2-5-8)。 

 

培养后根据Genetic Manipulation of Streptomyces：aLaboratory Manual：John Innes Foundation所述的方法对该微生物的染色体DNA进行分离纯化。 

根据albC基因的碱基序列，使用PerSeptive Biosystems公司制造8905型DNA合成仪，合成具有序列号41和42表示的碱基序列的DNA(以下、分别称为引物J、引物K)。引物J是附加在诺尔斯氏链霉菌染色体DNA的含有albC基因起始密码子的区域5′端的含有NcoI识别序列的碱基序列。引物K是附加在与含有albC基因的终止密码子的序列互补的碱基序列的5′端的含有．BgiII识别序列的碱基序列。 

 

使用上述的引物J和引物K作为引物组，使用诺尔斯氏链霉菌或小白链霉茵的染色体DNA作为模板进行PCR。PCR通过制备含有作为模板的0.1μg的染色体DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的Ex TaqDNA聚合酶(Takara Bi0公司生产)、5μL的ExTaq DNA聚合酶用xlO缓冲液(Takara Bio公司生产)、各200μmol/L的dNTP、5μL的二甲基亚砜的反应液50μL，按照94℃下1分钟、55℃下30秒钟、72℃下1分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

将该反应液的1/1O量进行琼脂糖凝胶电泳，确认约0.7kb的DNA片段扩增后，添加与剩下反应液等量的TE饱和酚/氯仿溶液，并混合。 向该溶液经离心分离后得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。将该溶液离心分离得到的DNA沉淀分别溶解于20μL的TE。 

 

使用各个该溶液各5μL，将扩增了的DNA用限制酶NcoI和BglII进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，使用geneclean II试剂盒分别回收700bp的DNA片段。 

将0.2μg含有噬茵体T5启动子的表达载体pQE60用限制酶NcoI和BglII酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，使用与上述同样的方法回收3.4kb的DNA片段。 

 

使用连接试剂盒，使含有上述得到的来自各放线茵的0.7kb片段和来自pQE60的3.4kb片段于16℃下反应16小时，进行连接。 

通过使用钙离子的方法用该连接反应液转化大肠杆菌NM522株后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。 

 

通过众所周知的方法从生长繁殖的转化体茵落提取质粒，使用限制酶对其构造进行解析，确认取得了作为在噬茵体T5启动子下游连接了来自诺尔斯氏链霉菌的DNA的表达载体pAL-nou、和连接了来自小白链霉菌的DNA的表达载体pAL-alb(图3)。 

 

当使用碱基序列决定装置373A·DNA序列仪决定插入到各个质粒的来自放线茵的DNA部分的碱基序列时，确认pAL-alb中含有编码具有序列号37表示的氨基酸序列的蛋白质的DNA、即含有序列号39表示的碱基序列的DNA，在pAL-nou含有编码具有序列号38表示的氨基酸序列的蛋白质的DNA、即具有序列号40表示的碱基序列的DNA。 

实验例12  使用茵体作为酶源制造二肽 

将实验例11得到的带有pAL-nou或pAL-alb的大肠杆菌NM522 (大肠杆菌NM522/pAL-nou株或NM522/pAL-alb株)和不带有质粒的NM522株接种于加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的10ml的LB培养基的试管(对于不带有质粒的株的情况，不添加氨苄青霉素，以下相同)，于30℃下培养17小时。将该培养液0.5ml分别接种于加入了50ml的LB培养基的250ml容量的三角烧瓶，于30℃下振荡培养1小时后，按照终浓度达到1mmol/L那样添加IPTG，再继续培养4小时。对该培养液进行离心分离，取得湿菌体。 

 

制备由终浓度100mg/ml的该湿茵体、60mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH7.2)、10mmol/L的氯化镁、10mmOl/L的ATP、1g/L的L-Leu、1g/L的L-Phe构成的3.0ml反应液，于30℃下进行反应。反应1小时后取样，按照终浓度达到20％(v/v)那样加乙腈后，使用HPLC分析反应生成物。通过HPLC进行的分析，分离柱使用ODS-HA柱(YMC社制)、作为洗脱液使用30％(v/v)乙腈，以流速0.6ml/min、测定215nm的紫外吸收的条件进行。 

 

分析结果确认在大肠杆茵NM522/pAL-nou株的反应液中有36.7mg/l的环(L-亮氨酰-L-苯丙氨酸)[cyclo(L-Leu-L-Phe)]的蓄积，但在大肠杆茵NM522株的反应液中完全没有检测到cyclo(L-Leu-L-Phe)。将同样反应液在以下的条件下用HPLC进行分析，测定到作为直链二肽(以下、“直链二肽”简单称为“二肽”)的L-亮氨酰-L-苯丙氨酸(L-Leu-L-Phe)和L-苯丙氨酰-L-亮氨酸(L-Phe-L-Leu)。 

 

两二肽用F-moc化法进行衍生后，使用HPLC进行分析。通过HPLC进行的分析，分离柱使用ODS-HG5(野村化学社制)、作为洗脱液使用A液(醋酸6ml/l、20％(v/v)乙腈、用三乙胺调整至pH4.8)和B液(醋酸6ml/1、70％(v/v)乙腈、用三乙胺调整到pH4.8)，分析开始后5分钟之前A液∶B液＝8∶2、5分钟～20分钟之前加线性梯度， 在达到20分钟时使A液∶B液＝1∶1，在流速0.6ml/分钟、激发波长254nm、荧光波长630nm检测二肽的条件下进行。 

 

结果确认在大肠杆菌NM522/pAL-nou株的反应液中有21.9mg/L的L-Leu-L-Phe和12.0mg/L的L-Phe-L-Leu蓄积。而在作为对照株使用的大肠杆菌NM522株的反应液中没有检测到任何二肽。 

这表明实验例11中取得的环二肽合成酶具有合成二肽的能力。 

实验例13  使用纯化酶制造二肽(1) 

与实验例12同样培养大肠杆菌NM522/pAL-nou株。培养结束后通过离心分离取得湿茵体，用60mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH7.2)清洗后，悬浮于含有10mmol/L咪唑的20mmol/L磷酸钾缓冲液。将该悬浮液于4℃下进行超声处理，取得茵体裂解液。将该茵体裂解液(10ml、含蛋白质0.863mg)加到Amersham公司生产的His-tag纯化柱，通过加含有10mmol/L的咪唑的20mmol/L的磷酸钾缓冲液15ml进行清洗，于柱内对附带His-tag的albC蛋白质进行纯化。然后向保持这个附带His-tag的albC蛋白质的柱加与实验例12同组成的反应液(反应液组成：60mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH7.2)、10mmol/L的氯化镁、10mmol/L的ATP、1g/L的L-Leu、1g/L的L-Phe构成的反应液)2ml，在柱内保持底物的状态下，于30℃进行温育。24小时后用同组成的反应液3ml对柱内的反应液进行洗脱，通过与实验例12同样的方法对反应液中的环二肽和二肽进行定量。 

 

由结果可知生成了cyclo(L-Leu-L-Phe)6.8mg/L、L-Leu-L-Phe28.7mg/L和L-Phe-L-Leu 18.5mg/L。当用不含有ATP的反应液进行同样温育时，环二肽、二肽都没有检测到。 

实验例14  使用纯化酶制造二肽(2) 

除了将底物氨基酸换成其它的氨基酸以外，用与实验例13同样的方法进行酶反应，对生成物进行分析。反应液除了将底物氨基酸换成为1g/L的L-Ala、L-Leu或L-Phe以外，使用与实验例13同样组成 的溶液。 

 

由该结果可知在反应开始后24小时内，分别生成了9.41mg/L的L-Ala-L-Ala、7.85mg/L的L-Leu-L-Leu、或5.20mg/L的L-Phe-L-Phe。 

实验例15  强化ywfE基因表达的大肠茵的制备 

使用PerSeptive Biosystems公司制造8905型DNA合成仪，合成分别具有序列号84～87所述的序列的DNA(以下、分别称为引物L、引物M、引物N、引物0)。序列号84的序列是附加在质粒pQE60ywfE的含有作为ywfE基因的核糖体结合序列的Shine-Dalgarno序列的区域的5＇端的含有XhoI识别序列的序列。序列号85的序列是附加在与含有ywfE基因的终止密码子的序列互补的序列的5＇端的含有BamHI识别序列的序列。而序列号86的序列是附加在含有trp启动子的表达载体pTrS30的trp启动子区域序列的5＇端的含有EcoRI识别序列的序列。序列号87的序列是附加在与含有trp启动子的表达载体pTrS30的trp启动子区域的序列互补的序列的5＇端的含有XhoI识别序列的序列。 

 

以质粒pQE60ywfE作为模板，在ywfE基因片段的扩增中，使用上述的引物L和引物M，在trp启动子区域的片段的扩增中使用引物N和引物0作为引物组进行PCR。PCR通过制备含有10ng的pQE60ywfE、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μL的PfuDNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各dNTP的40μL的反应液，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认在使用引物L和引物M的PCR中扩增了相当于ywfE基因片段的约1.4kb、在使用引物N和引物0的反应中扩增了相当于trp启动子区域的片段的约0.3kb 的片段后，添加与剩下反应液等量的TE饱和酚/氯仿溶液，并混合。向该溶液经离心分离后得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。将该溶液离心分离得到的DNA溶解于20μL的TE。 

 

使用上述得到的各个DNA溶液5μL，将用引物L和引物M扩增了的DNA用限制酶XhoI和BamHI进行酶切，而使用引物N和引物0扩增了的DNA用限制酶EcoRI和XhoI进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，使用geneclean II试剂盒，分别回收含有ywfE的1.4kb和含有trp启动子区域的0.3kb的DNA片段。 

 

将含有0.2μg的trp启动子的表达载体pTrS30用限制酶EcoRI和BamHI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样回收4.5kb的DNA片段。 

使用连接试剂盒，使上述得到的含有ywfE的1.4kb片段、含有 trp启动子区域的0.3kb片段和4.5kb的片段于16℃下反应16小时，进行连接。 

 

通过使用钙离子的方法用该反应液转化大肠杆菌NM522株后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。 

根据众所周知的方法从生长繁殖下来的转化体茵落提取质粒，得到在trp启动子下游含有ywfE基因的表达载体pPE56。通过限制酶消化确认了该载体的结构(图4)。 

实验例16pepD基因、pepN基因、pepB基因、pepA基因和dpp 操纵子缺失株的制作 

大肠杆菌染色体DNA上的特定基因缺失的菌株根据利用入噬茵体的同源重组系的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，6641-6645(2000)]制作。 

以下所述的质粒pKD46、pKD3和pCP20是从大肠杆菌基因贮存中心(美国耶鲁大学)获得保持该质粒的大肠杆菌株，通过众所周知的方法从该株提取使用。 

(1)基因缺失用DNA片段的克隆 

以使存在于大肠杆菌K12株的染色体DNA上的具有序列号55表示的碱基序列的pepD基因、具有序列号56表示的碱基序列的pepN基因、具有序列号57表示的碱基序列的pepB基因、具有序列号58表示的碱基序列的pepA基因和具有序列号59表示的碱基序列的dppA基因、具有序列号60表示的碱基序列的dppB、具有序列号61表示的碱基序列的dppC基因、具有序列号62表示的碱基序列的dppD基因和具有序列号63表示的碱基序列的dppF基因缺失为目的，使用PerSeptiveBiosystems公司制造8905型DNA合成仪，合成与位于大肠杆菌K12株的染色体DNA上的各个缺失靶基因的上游和下游的由36bp构成的碱基序列同源的碱基序列、和具有序列号54表示的来自酵母的Flp重组酶识别碱基序列的DNA。但是dppA基因、dppB基因、dppC基因、 dppD基因和dppF基因因为形成操纵子，合成与位于该操纵子的上游和下游的碱基序列同源的碱基序列的DNA。 

 

即，分别合成由作为pepD基因缺失用DNA片段扩增用引物组的序列号64和65、作为pepN基因缺失用DNA片段扩增用引物组的序列号66和67、作为pepA基因缺失用DNA片段扩增用引物组的序列号68和69、作为pepB基因缺失用DNA片段扩增用引物组的序列号70和71、作为dpp操纵子缺失用DNA片段扩增用引物组的序列号72和73表示的碱基序列构成的DNA。 

 

然后使用上述合成DNA作为引物组，pKD3DNA作为模板进行PCR。PCR通过使用含有10ng的质粒DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μL的PfuDNA聚合酶用×10缓冲液、 200μmol/L的各deoxyNTP的40μL反应液，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

将各个反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认目的片段扩增后，添加与剩下的反应液等量的TE饱和酚/氯仿，并进行混合。 

将该混合液离心分离后，向得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。对该溶液进行离心分离，取得pepD 基因、pepN基因、pepB基因、pepA基因和dpp操纵子缺失用的含有氯霉素抗性基因的DNA片段。 

(2)pepD基因缺失大肠杆菌JM101的制作 

用pKD46转化大肠杆菌JM101株后，涂布于含有100mg/L的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，通过于30℃下进行培养，选择保持pKD46的大肠杆菌JM101株(以下、称为大肠杆菌JM101/pKD46)。 

 

质粒pKD46含有λRed重组酶基因，该基因的表达可以通过L-阿拉伯糖诱导。因此如果将在L-阿拉伯糖存在下能够生长繁殖的带有pKD46的大肠茵用直链状DNA进行转化，会发生高频率同源重组。另外pKD46由于具有温度敏感性的复制起点，通过在42℃下使其生长繁殖，可以很容易地使质粒脱落。 

 

通过电脉冲法将上述取得的pepD基因缺失用含有氯霉素抗性基因的DNA片段导入在10mmol/L的L-阿拉伯糖和50μg/ml的氨苄青霉素存在下培养得到的大肠杆茵JM101/pKD46，将pepD基因缺失用含有氯霉素抗性基因的DNA片段通过同源重组转运在大肠菌JM101的染色体DNA上的转化株涂布于含有25mg/L的氯霉素的LB琼脂培养基(细菌培养用胰化蛋白胨10g/L、细菌培养用酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L、琼脂15g/L)，通过于30℃下培养进行选择。 

 

将选择的氯霉素抗性株接种于含有25mg/L的氯霉素的LB琼脂培 养基，于42℃下培养14小时后，进行单菌落分离。将得到的各菌落影印在含有25mg/L的氯霉素的LB琼脂培养基、以及含有100mg/l的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于37℃培养，通过选择表现出氯霉素抗性，而且表现出氨苄青霉素敏感性的茵落，取得pKD46脱落株。 

 

然后用pCP20转化上述得到的pKD46脱落株，通过在含有100mg/l的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上进行选择，取得保持pCP20的pKD46脱落株。 

质粒pCP20具有来自酵母的Flp重组酶基因，该基因的表达可以在42℃下进行诱导。 

另外，由于在上述制作的pepD基因、pepN基因、pepB基因、pepA 基因以及dpp操纵子缺失用的含有氯霉素抗性基因的DNA片段的氯霉素抗性基因的两端存在Flp重组酶识别的碱基序列，通过Flp重组酶催化的同源重组可以很容易地使该抗性基因脱落。 

另外，由于pCP20含有温度敏感性的复制起点，通过使pCP20保持株在42℃下生长繁殖，可以同时诱导Flp重组酶的表达和pCP20的脱落。 

将上述取得的保有pCP20的pKD46脱落株接种于没有添加药剂的LB琼脂培养基，于42℃下培养14小时后，进行单茵落分离。将得到的各茵落影印在没有添加药剂的LB琼脂培养基、含有25mg/L氯霉素的LB琼脂培养基和含有100mg/L的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养，选择表现出氯霉素敏感性，而且表现出氨苄青霉素敏感性的菌落。 

 

根据常法(生物工学实验书、日本生物工学会编97～98页、培风馆、1992年)从上述选择的各株制备各个染色体DNA。使用根据缺失靶基因的pepD基因的内部碱基序列设计的具有序列号74和75表示的碱基序列的DNA作为引物组，以染色体DNA作为模板进行PCR。PCR通过 使用含有0.1g的染色体DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的Pfu DNA聚合酶、4μL的PfuDNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各deoxyNTP的40μL反应液，  按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

在上述PCR中，将没有检测到扩增DNA片段的菌株作为pepD基因缺失株，命名为大肠杆菌JPD1株。 

(3)大肠杆菌JM101的染色体DNA上的pepD基因和pepN基因缺失株的制作 

将上述(2)得到的大肠杆菌JPD1株用pKD46转化后，涂布于含有100mg/l的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，通过于30℃ 下进行培养，选择保持pKD46的大肠杆菌JPD1(以下、称为大肠杆菌JPD1/pKD46)。通过电脉冲法将pepN基因缺失用含有氯霉素抗性基因的DNA片段导入大肠杆菌JPD1/pKD46，通过同源重组取得在大肠杆菌JPD1/pKD46的染色体DNA上转运了pepN基因缺失用含有氯霉素抗性基因的DNA片段的转化株。 

 

然后通过进行与上述(2)同样的操作，取得氯霉素抗性基因从染色体DNA上脱落的茵株，将该株命名为大肠杆菌JPDN2。 

(4)大肠杆菌JM101的染色体DNA上的pepN基因、pepA基因、 pepB基因或dpp操纵子缺失株、和多重基因缺失株的制作 

pepN基因、pepA基因、pepB基因或dpp操纵子缺失株使用上述(1)制作的各基因或操纵子缺失用的含有氯霉素抗性基因的DNA片段，通过与上述(2)同样的方法进行制作。 

 

通过上述方法取得的各个基因缺失株可以通过使用根据各个缺失基因的内部碱基序列设计、合成的具有序列号76～83表示的碱基序列的DNA作为引物组，通过与上述(2)同样的PCR进行确认。其中由序列号76和77表示的碱基序列构成的DNA是确认pepN缺失用的引物组、 由序列号78和79表示的碱基序列构成的DNA是确认pepA缺失用的引物组、由序列号80和81表示的碱基序列构成的DNA是确认pepB缺失用的引物组、由序列号82和83表示的碱基序列构成的DNA是确认dpp 操纵子缺失用的引物组。 

 

将上述方法取得的dpp操纵子缺失株取名为大肠杆菌JDPP1株、 pepN基因缺失株取名为大肠杆菌JPN1株、pepA基因缺失株取名为大肠杆菌JPA1株、pepB基因缺失株取名为大肠杆菌JPB7株。 

另外根据上述(3)的方法，制作由pepD基因、pepN基因、pepA 基因、pepB基因和dpp操纵子选出的2个以上基因或操纵子的多重缺失株。能够取得的多重缺失株的确认通过与上述(2)同样的PCR进行确认。将用上述方法取得的pepD基因和dpp操纵子缺失的二重基因缺失株命名为大肠杆菌JPDP49株，将pepB基因、pepD基因和pepN基因缺失的三重基因缺失株命名为大肠杆菌JPDNB43株，将pepD基因、 pepN基因和dpp操纵子缺失的三重基因缺失株命名为大肠杆茵JPNDDP36株，将pepA基因、pepD基因、pepN基因和dpp操纵子缺失的四重基因缺失株命名为大肠杆菌JPNDAP5株，将pepB基因、pepD 基因、pepN基因和dpp操纵子缺失的四重基因缺失株命名为大肠杆菌JPNDBP7株。表2给出了各基因缺失株中缺失基因名。 

 

【表2】 

菌株名称	缺失基因
		JM101	无
JDPP1	dpp操纵子
		JPN1	pepN
JPA1	pepA
		JPB7	pepB
JPD1	pepD
		JPDN2	pepD，pepN
JPNDB43	pepB，pepD，pepN
		JPDP49	pepD，dpp操纵子
JPNDDP36	pepD，pepN，dpp操纵子
		JPNDAP5	pepA，pepD，pepN，dpp操纵子
JPNDBP7	pepB，pepD，pepN，dpp操纵子

 

实验例17  使用肽酶和二肽转运活性丧失的大肠杆菌生产的L-Ala-L-Gln和L-Ala-L-Ala产率的评价 

用实验例15制作的质粒pPE56转化实验例16得到的编码各种肽酶和二肽转运蛋白质的基因缺失株，取得表现出氨苄青霉素抗性的转化株。 

 

将得到的转化株接种于加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8ml的LB培养基的试管，于28℃下培养17小时。该培养液1％添加到加人了含有100μg/ml的氨苄青霉素和氨基酸的8ml的水性介质(磷酸氢二钾16g/L、磷酸二氢钾14g/L、硫酸铵5g/L、柠檬酸(无水)1g/L、CasaminO acid(Difco社制)0.5g/L、L-Pro1g/L、L-Ala2.5g/L、L-Gln 2.5g/L、葡萄糖10g/l、维生素B₁10mg/L、硫酸镁·7水合物 25mg/l、硫酸铁7水合物50mg/l、使用10mol/l的氢氧化钠溶液调整到pH7.2。L-Gln在将10倍浓缩液经滤膜过滤灭菌后，葡萄糖、维生素B₁、硫酸镁·7水合物、硫酸铁·7水合物分别蒸气灭菌后添加)的试管中，于30℃下反应24小时。将该水性介质进行离心分离，取得上清。 

 

该上清中的产物用F-moc化法进行衍生后，使用HPLC法进行分析。通过HPLC法进行的分析，分离柱使用ODS-HG5(野村化学社制)、作为洗脱液使用A液(醋酸6ml/l、20％(v/v)乙腈、用三乙胺调整到pH4.8)和B液(醋酸6ml/l、70％(v/v)乙腈、用三乙胺调整到pH4.8)，直至分析开始后5分钟之前A液∶B液＝8∶2、5分钟～20分钟之前进行线性梯度洗脱，到达20分钟时使A液∶B液＝1∶1的条件下进行。分析结果如表3所示。 

 

【表3】 

菌株名称	缺失基因	L-Ala-L-Gln  (g/l)	L-Ala-L-Aln  (g/l)
				JM101	无	0	0
JDPP1	dpp操纵子	0.02	0.01
				JPN1	pepN	0.01	0.01
JPA1	pepA	0.01	0.01
				JPB7	pepB	0.01	0.01
JPD1	pepD	0.01	0.01
				JPDN2	pepD，pepN	0.02	0.03
JPNDB43	pepB，pepD，pepN	0.05	0.12
				JPDP49	pepD，dpp操纵子	0.11	0.08
JPNDDP36	pepD，pepN，dpp操纵子	0.16	0.21
				JPNDAP5	pepA，pepD，pepN，dpp操纵子	0.28	0.26
JPNDBP7	pepB，pepD，pepN，dpp操纵子	0.43	0.22

[0598]  

由表3可知在2种以下编码肽酶的基因缺失的微生物、仅1种编码肽转运蛋白质的操纵子缺失的微生物中，二肽的生成、蓄积量低，而在1种以上编码肽酶的基因和1种编码肽转运蛋白质的操纵子缺失的微生物、或3种以上编码肽酶的基因的活性丧失的微生物中，二肽的生成、蓄积量大幅度增加。 

实验例18  使用肽酶和肽转运蛋白质活性丧失的大肠菌株生产的L-丙氨酰-L-缬氨酸(以下称为L-Ala-L-Val)产率的评价 

与实验例17同样，用pPE56转化编码各种肽酶的基因和编码肽转运蛋白质的操纵子缺失的大肠菌株。将得到的转化株接种于加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8ml的LB培养基的试管，与28℃下培养17小时。将该培养液1％添加到加入了含100μg/ml氨苄青霉素和氨基酸的8ml的水性介质(磷酸氢二钾16g/1、磷酸二氢钾14g/l、硫酸铵5g/l、柠檬酸(无水)1g/l、Casamino acid(Difco社制)0.5g/l、L-Pro1g/l、L-Ala2.5g/l、L-Val2.5g/l、葡萄糖10g/l、维生素B₁10mg/l、硫酸镁·7水合物25mg/l、硫酸铁·7水合物50mg/l、用10mol/l的氢氧化钠溶液调整到pH7.2。葡萄糖、维生素B₁、硫酸镁·7水合物、硫酸铁·7水合物分别蒸煮后添加)的试管，于30℃下反应24小时。对该水性介质进行离心分离，取得上清。 

 

通过实验例17所述的方法对该上清中的生成物进行分析。结果如表4所示。 

 

【表4】 

菌株名称	缺失基因	L-Ala-L-Val(g/l)
			JM101	无	0
JDPP1	dpp操纵子	0
			JPN1	pepN	0
JPA1	pepA	0
			JPB7	pepB	0
JPD1	pepD	0
			JPDN2	pepD，pepN	0
JPNDB43	pepB，pepD，pepN	0.04
			JPDP49	pepD，dpp操纵子	0.11
JPNDDP36	pepD，pepN，dpp操纵子	0.22
			JPNDBP7	pepB，pepD，pepN，dpp操纵子	0.20

 

由表4可知2种以下编码肽酶的基因缺失的微生物、和只1种编码肽转运蛋白质的操纵子缺失的微生物不生产二肽，但3种以上的肽酶基因缺失的微生物、或1种以上的编码肽酶的基因和1种编码肽转运蛋白质的操纵子缺失的微生物生产二肽。 

实验例19  使用肽酶和二肽转运系蛋白质活性丧失的大肠菌株生产的甘氨酰-L-谷氨酰胺(以下、称为Gly-L-Gln)的产率的评价 

与实验例17同样，用pPE56转化编码各种肽酶的基因和编码二肽转运蛋白质的操纵子的缺失株。将得到的转化株接种于加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8ml的LB培养基的试管，于28℃下培养17小时。 

 

将该培养液1％添加到加入了含100μg/ml氨苄青霉素和氨基酸的8ml的水性介质(磷酸氢二钾16g/l、磷酸二氢钾14g/l、硫酸铵5g/l、 柠檬酸(无水)1g/l、Casaminoacid(Difco社制)0.5g/L、L-Pro1g/L、Gly 2.5g/L、L-Gln 2.5g/L、葡萄糖10g/l、维生素B₁10mg/l、硫酸镁·7水合物25mg/l、硫酸铁·7水合物50mg/l、用10mol/l的氢氧化钠溶液调整到pH7.2。L-Gln在将10倍浓缩液经滤膜过滤灭茵后添加，葡萄糖、维生素B₁、硫酸镁·7水合物、硫酸铁·7水合物分别蒸煮后添加)的试管，于30℃下反应24小时。对该水性介质进行离心分离，取得上清。 

 

通过实验例17所述的方法对该该上清中的生成物进行分析。结果如表5所示。 

 

【表5】 

菌株名称	缺失基因	Gly-L-Gln(g/l)
			JM101	无	0
JDPP1	dpp操纵子	0
			JPDN2	pepD，pepN	0
JPNDB4 3	pepB，pepD，pepN	0.01
			JPNDDP36	pepD，pepN，dpp操纵子	0.02
JPNDBP7	pepB，pepD，pepN，dpp操纵子	0.03

 

由表5可知2种以下的编码肽酶的基因缺失的微生物、和只1种编码肽转运蛋白质的操纵子缺失的微生物不生产二肽，但3种以上的编码肽酶的基因缺失的微生物、以及2种以上的编码肽酶的基因和1种编码肽转运蛋白质的操纵子缺失的微生物生产二肽。 

 

以下给出了实施例，但本发明并不受下面实施例限定。 

【实施例1】 

 

参与L-谷氨酰胺的生物合成调节的glnE基因、glnB基因缺失的微生物的制作 

大肠杆菌的染色体DNA上的特定基因的缺失根据利用λ噬茵体的同源重组系的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，97，6641-6645(2000)]进行。 

(1)基因缺失用抗药性基因片段的克隆 

大肠杆菌K12株的glnE、glnB的各基因的碱基序列已阐明[Science，5331，1453-1474(1997)]。根据报告的碱基序列，使用PerSeptive Biosystems公司制造8905型DNA合成仪合成作为glnE 基因缺失用的引物DNA，具有由序列号88和89表示的碱基序列构成的DNA、合成作为glnB基因缺失用的引物DNA，由序列号90和91表示的碱基序列构成的DNA。合成的引物DNA是根据由位于各个缺失的靶基因的上游和下游的36bp构成的碱基序列设计的。 

 

分别使用上述合成DNA作为引物组，以pKD3DNA作为模板进行PCR。PCR通过使用含有质粒DNA10ng、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μL的PfuDNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各deoxyNTP的40μL反应液，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认目的片段扩增后，添加与剩下的反应液等量的TE饱和酚/氯仿，并混合。 

将该混合液离心分离后，向得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。对该溶液进行离心分离，使DNA 沉淀后，将该DNA溶解于20μL的TE。通过上述操作，取得glnE基因、 glnB基因缺失用氯霉素抗性基因片段。 

(2)染色体DNA上的glnE基因缺失的大肠杆菌JM101株的制作 

用pKD46转化大肠杆菌JM101株后，于含有100mg/l的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上选择保持pKD46的大肠杆菌JM101(以下、称为 大肠杆菌JM101/pKD46)。通过电脉冲法用glnE基因缺失用氯霉素抗性基因片段转化在10mmol/L的L-阿拉伯糖和50μg/ml的氨苄青霉素存在下培养的大肠杆菌JM101/pKD46，在含有25mg/L的氯霉素的LB琼脂培养基上选择已经在JM101株的染色体DNA上的glnE基因插入了氯霉素抗性基因，glnE结构基因缺失的重组的株。 

 

将取得的氯霉素抗性株影印在含有25mg/L的氯霉素的LB琼脂培养基，于42℃保温的状态下实施单茵落分离。将得到的各茵落影印于含有25mg/L的氯霉素的LB琼脂培养基和含有100mg/L的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，选择既表现出氯霉素抗性，而且又表现出氨苄青霉素敏感性的菌落。然后用pCP20转化该pKD46脱落株，涂布于含有100mg/L的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。 

 

将生长繁殖的氨苄青霉素抗性株影印到没有添加药剂的LB琼脂培养基，在42℃保温的状态下实施单茵落分离。将得到的各茵落分别影印到没有添加药剂、含有25mg/L的氯霉素的LB琼脂培养基和含有100mg/L的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，选择既表现出氯霉素敏感性，又表现出氨苄青霉素敏感性的茵落。通过常法(生物工学实验书、日本生物工学会编97～98页、培风馆、1992年)从得到的各株制备各个染色体DNA。使用以缺失的靶glnE基因的内部序列为基础设计的由序列号92和93表示的碱基序列构成的引物DNA，进行茵落PCR。茵落PCR是通过使用含有用200μl的移液管头接触茵落取得的茵体量、引物各0.5μmol/L、PfuDNA聚合酶2.5units、PfuDNA聚合酶用×10缓冲液4μL、deoxyNTP各200μmol/L的反应液40μl，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。在进行PCR的菌株中，没有发现基因扩增的菌株确认是glnE基因缺失株，命名为大肠杆菌JGLE1。 

(3)染色体DNA上的glnE基因和glnB基因缺失的大肠杆茵JM101株的制作 

用pKD46转化上述(2)得到的大肠杆菌JGLE1株后，涂布于含有l00mg/L的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，通过于30℃下培养过夜，取得保持pKD46的大肠杆菌JGLE1株(以下、称为大肠杆菌JGLE1/pKD46)。通过电脉冲法使用glnB基因缺失用氯霉素抗性基因片段转化大肠杆菌JGLE1/pKD46，取得在染色体DNA上的glnB基因中已经插入了氯霉素抗性基因，glnB结构基因缺失的重组株。使用以 glnB基因的内部序列为基础设计的由序列号94和95表示的碱基序列构成的引物DNA，在上述(2)的条件下进行菌落PCR。通过该PCR确认没有看到基因扩增的菌株是 glnB基因缺失株，命名为大肠杆菌JGLBE1。 

【实施例2】 

 

ywfE基因和来自枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶基因(ald基因)表达质粒的构建 

以实验例15制作的 ywfE基因表达质粒pPE56为基础，通过图5所示方法构建同时组成型表达来自枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶基因(ald基因)表达质粒。 

 

使用PerSeptive Biosystems公司制造8905型DNA合成仪，合成具有序列号96和97表示的碱基序列的DNA(以下、分别称为引物P、引物Q)。序列号96表示的碱基序列是附加在含有作为ald基因的核糖体结合序列的Shine-Dalgarno序列的区域5＇端的含有BamHI识别序列的序列。序列号97表示的碱基序列是附加在与含有ald基因的终止密码子的序列互补的碱基序列的5＇端的含有BamHI识别序列的序列。 

 

使用实验例2取得的枯草芽孢杆菌的染色体DNA作为模板，用上述引物P和引物Q作为引物组进行PCR。PCR通过制备含有0.1μg的染色体DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4 μL的PfuDNA聚合酶用×l0缓冲液、200μmol/L的各dNTP的40μL反应液，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认相当于ald基因片段的约1.2kb的片段扩增后，添加与剩下的反应液等量的TE饱和酚/氯仿，并混合。将该混合液离心分离后，向得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。对该溶液进行离心分离，取得DNA沉淀，溶解于20μL的TE。 

 

使用该溶液5μL，将扩增了的DNA用限制酶BamHI进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，通过geneclean II试剂盒回收含有ald基因的1.2kb的DNA片段。 

将pPE56 0.2μg用限制酶BamHI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，使用与上述同样的方法回收6.3kb的DNA片段。于60℃通过碱性磷酸酶(E.coliC75、Takara Bio公司生产)处理30分钟将该6.3kb的DNA片段的末端去磷酸化。添加与反应液等量的TE饱和酚/氯仿，混合，离心分离后，向得到的上层加2倍容量的冷乙醇并混合，于-80℃下放置30分钟。将该溶液离心分离，将得到的DNA沉淀溶解于20μL的TE。     

 

使用连接试剂盒使上述得到的含有ald基因1.2kb的DNA片段和碱性磷酸酶处理的6.3kb的DNA片段于16℃下反应16小时，进行连接。 

通过使用钙离子的方法用该反应液转化大肠杆菌NM522株后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。 

 

根据众所周知的方法从生长繁殖的转化体菌落提取质粒，通过限 制酶消化确认取得了ald基因与ywfE基因顺向插入的质粒，将该质粒命名为pPE86(图5)。 

【实施例3】 

 

来自大肠杆菌的抗反馈型pheA基因和抗反馈型aroF基因表达质粒的构建 

(1)抗反馈型pheA基因表达质粒的造成 

从通过苯丙氨酸类似物抗性突变导入得到的表达苯丙氨酸的抗反馈型pheA基因的质粒pEpheA22(特开昭61-260892)取得抗反馈型 pheA基因，从通过酪氨酸抗性突变导入得到的表达酪氨酸的抗反馈型 aroF基因的质粒DE aroF 18(特开昭62-65691)取得抗反馈型aroF基因，通过以下的方法构建表达质粒。 

 

使用PerSeptive Biosystems公司制造8905型DNA合成仪，合成具有序列号98和99表示的碱基序列的DNA(以下、分别称为引物R、引物S)。序列号98表示的碱基序列是附加在含有pheA基因的核糖体结合序列的Shine-Dalgarno序列的区域5＇末端的含有ClaI识别序列的序列。序列号99表示的碱基序列是附加在与含有pheA基因的终止密码子的序列互补的序列的5＇末端的含有BamHI识别序列的序列。使用质粒pE pheA 22作为模板，用上述引物R和引物S作为引物组进行PCR。PCR通过制备含有10ng的质粒DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μL的PfuDNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各dNTP的40μL反应液，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认相当于pheA 基因片段的约1.1kb的片段扩增后，添加与剩下的反应液等量的TE饱和酚/氯仿，并混合。将该混合液离心分离后，向得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。对该溶液进行离 心分离，取得DNA沉淀，溶解于20μL的TE。 

 

使用该溶液5μL，将扩增了的DNA用限制酶ClaI和BamHI进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，通过geneclean II试剂盒回收含有pheA基因的1.1kb的DNA片段。 

将含有trp启动子的表达载体pTrS30〔可从大肠茵JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备〕0.2μg用限制酶 ClaI和BamHI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，通过与上述同样的方法，回收4.6kb的DNA片段。 

 

使用连接试剂盒，使上述得到的含有pheA基因的1.1kb的DNA片段和4.6kb的DNA片段于16℃下反应16小时，进行连接。 

通过使用钙离子的方法用该反应液转化大肠杆菌NM522株后，涂布于含有50μg/ml的氯霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。 

 

根据众所周知的方法从生长繁殖的转化体茵落提取质粒，通过限制酶消化确认取得了抗反馈型pheA基因表达质粒，将该质粒命名为pPHEA1。 

将上述得到的pPHEA10.2μg用限制酶EcoRI和BamHI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段后，通过genecleanII试剂盒合成含有trp启动子和抗反馈型pheA基因的1.5kb的DNA片段。 

 

然后将带pACYC184的复制起点，含有氯霉素抗性基因的质粒载体pSTV28(Takara Bio公司生产)0.2μg用限制酶EcoRI和BamHI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用与上述同样的方法回收3.0kb的DNA片段。 

使用连接试剂盒，使上述得到的含有trp启动子和抗反馈型pheA 基因的1.5kb的DNA片段与3.0kb的DNA片段在16℃下反应16小时，进行连接。 

通过使用钙离子的方法用该反应液转化大肠杆菌NM522株后，涂布于含有30μg/ml的氯霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。 

根据众所周知的方法从生长繁殖的转化体茵落提取质粒，通过限制酶消化确认取得了抗反馈型pheA基因表达质粒，将该质粒命名为pPHEA2(图6)。 

(2)抗反馈型pheA基因和抗反馈型aroF基因表达质粒的构建 

使用PerSeptive Biosystems公司制造8905型DNA合成仪，合成具有序列号100和101表示的序列的DNA(以下、分别称为引物T、引物U)。序列号100表示的碱基序列是附加在含有作为aroF基因的核糖体结合序列的Shine-Dalgarno序列的区域5＇端的含有BglII识别序列的序列。序列号101表示的碱基序列是附加在与含有aroF基因的终止密码子的序列互补的序列的5＇端的含有BamHI识别序列的序列。以质粒pEaroF18为模板，使用上述引物T和引物U作为引物组进行PCR。PCR通过制备含有l0ng的质粒pE aroF 18、0.5μmol/L的各引物、2.5units的Pfu DNA聚合酶、4μL的Pfu DNA聚合酶用×l0缓冲液、200μmol/L的各dNTP反应液40μL，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认相当于aroF 基因片段的约1.1kb的片段扩增后，添加与剩下的反应液等量的TE饱和酚/氯仿，并混合。将该混合液离心分离后，向得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。对该溶液进行离心分离，将得到的DNA沉淀溶解于20μL的TE。 

 

使用该溶液5μL，将扩增了的DNA用限制酶BglII和BamHI进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，通过geneclean II试剂盒回收含有抗反馈型aroF基因的1.1kb的DNA片段。 

然后将上述(1)取得的抗反馈型pheA基因表达质粒pPHEA2 0.2μg用限制酶BamHI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用与上述同样的方法回收4.5kb的DNA片段。通过于60℃下碱性磷酸酶处理30分钟，进行该4.5kb的DNA片段的末端去磷酸化。添加与反应液等量的TE饱和酚/氯仿并混合，离心分离后，向得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。将该溶液离心分离得到的DNA的沉淀溶解于20μL的TE。 

 

使用连接试剂盒，使上述得到的含有抗反馈型aroF基因的1.1kb的DNA片段与碱性磷酸酶处理的4.5kb的DNA片段于16℃下反应16小时，进行连接。 

通过使用钙离子的方法用该反应液转化大肠杆菌NM522株后，涂布于含有30μg/ml的氯霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。 

 

根据众所周知的方法从生长繁殖的转化体茵落提取质粒，通过限制酶消化确认取得了抗反馈型aroF基因与抗反馈型pheA基因顺向插入的抗反馈型aroF基因和抗反馈型pheA基因表达质粒，将该质粒命名为pPHEAF2(图6)。 

 

 

来自大肠杆菌的表现出酪氨酸抗性的aroF-tyrA操纵子表达质粒的构建 

(1)表现出酪氨酸抗性的aroF-tyrA操纵子表达质粒的制作由通过酪氨酸抗性突变导入得到的表达aroF-tyrA操纵子的质粒pKmlaroFm-18(特开昭60-034197)取得表现出酪氨酸抗性的 aroF-tyrA操纵子，用以下的方法制作表达质粒。 

 

使用PerSeptive Biosystems公司制造8905型DNA合成仪，合成具有序列号102和103表示的碱基序列的DNA。序列号102表示的 碱基序列是附加在含有作为aroF基因的核糖体结合序列的Shine-Dalgarno序列的区域5＇端的含有ClaI识别序列的序列。序列号103表示的序列是附加在与含有tyrA基因的终止密码子的序列互补的序列的5＇端的含有SphI识别序列的序列。 

 

以质粒pKmlaroFm-18作为模板，使用由序列号102和103表示的碱基序列构成的DNA作为引物组进行PCR。 

PCR通过制备含有10ng的质粒DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μL的Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各dNTP的40μL反应液，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认相当于 aroF-tyrA基因片段的约2.2kb的片段扩增后，添加与剩下的反应液等量的TE饱和酚/氯仿，并混合。将该混合液离心分离后，向得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。对该溶液进行离心分离，将得到的DNA的沉淀溶解于20μL的TE。 

 

使用该溶液5μL，将扩增了的DNA用限制酶ClaI和SphI进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，通过geneclean II试剂盒回收含有aroF-tyrA操纵子的2.2kb的DNA片段。 

将含有0.2μg的trp启动子的表达载体pTrS30用限制酶ClaI和SphI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用与上述同样的方法回收4.6kb的DNA片段。 

 

使用连接试剂盒，使上述得到的含有aroF-tyrA操纵子的2.2kbDNA片段和4.6kb的DNA片段于16℃下进行16小时反应，进行连接。 

通过使用钙离子的方法用该反应液转化大肠杆菌NM522株后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过 夜。 

 

根据众所周知的方法从生长繁殖的转化体茵落提取质粒，通过限制酶消化确认取得了表现出酪氨酸抗性的aroF-tyrA操纵子表达质粒，将该质粒命名为pTY1。 

将上述得到的pTY1 0.2μg用限制酶EcoRI和BamHI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段后，使用geneclean II试剂盒回收含有trp启动子和含有表现出酪氨酸抗性的aroF-tyrA操纵子的2.6kb的DNA片段。 

 

然后将带有pACYC184的复制起点，含有氯霉素抗性基因的质粒载体pSTV28(Takara Bio公司生产)0.2μg用限制酶EcoRI和SphI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用与上述同样的方法回收3.0kb的DNA片段。 

使用连接试剂盒，使上述得到的trp启动子和表现出酪氨酸抗性的aroF-tyrA操纵子的2.6kb的DNA片段和3.0kb的DNA片段于16℃下反应16小时，进行连接。 

 

通过使用钙离子的方法用该反应液转化大肠杆菌NM522株后，涂布于含有30μg/ml的氯霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。 

根据众所周知的方法从生长繁殖的转化体茵落提取质粒，通过限制酶消化确认取得了表现出酪氨酸抗性的aroF-tyrA操纵子表达载体，将该质粒命名为pTY2。 

【实施例5】 

 

metJ基因缺失株的制作 

(1)metJ基因缺失用抗药性基因片段的克隆 

大肠杆菌K12株的metJ基因的碱基序列已经阐明[Science，5331，1453-1474(1997)]。 

metJ基因编码大肠杆菌的L-蛋氨酸生物合成系的阻遏物，已知通过导入不能产生该阻遏物的突变，可以提高L-蛋氨酸生产能能力(特开2000-139471)。 

 

根据报告的碱基序列使用PerSeptive Biosystems公司制造8905型DNA合成仪，作为metJ基因缺失株制作用的引物组，合成由序列号104和105表示的碱基序列构成的DNA。 

该DNA根据由位于各个缺失的靶基因的上游和下游的36bp构成的碱基序列设计。 

 

使用该DNA作为引物组，以pKD 3DNA为模板，通过PCR扩增metJ 基因缺失株制作用氯霉素抗性基因片段。 

PCR通过使用含有质粒DNA 10ng、0.5μmol/L的各引物、2.5units的Pfu DNA聚合酶、4μL的Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各deoxyNTP的40μL反应液，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认目的片段扩增后，添加与剩下的反应液等量的TE饱和酚/氯仿，并混合。将该混合液离心分离后，向得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。对该溶液进行离心分离，将得到的DNA的沉淀溶解于20μL的TE。 

(2)在染色体DNA上的metJ基因插入了抗药性基因的大肠杆菌JM101株的制作 

使用大肠杆菌JM101和上述(1)得到的metJ基因缺失株制作用氯霉素抗性基因片段，通过与实施例1(2)同样的操作，制作在大肠杆菌JM101的染色体DNA上的metJ基因插入了氯霉素抗性基因的重组体。 

 

氯霉素抗性基因插入到染色体上的确认通过使用由具有位于氯霉素抗性基因插入部位的上游和下游的大约400bp的碱基序列的序列号106和107表示的碱基序列构成的DNA作为引物组的茵落PCR进行。茵落PCR在与实施例1(2)相同的条件下进行。 

确认在进行茵落PCR的菌株中得到的含有氯霉素抗性基因的大约2kb大小的扩增片段的菌株是metJ基因缺失株后，通过与实施例7(3)同样的操作，使用表达Flp重组酶的pCP20，制作从染色体DNA脱落了氯霉素抗性基因的菌株，命名为大肠杆菌JMJ1。 

【实施例6】 

 

ywfE基因和来自大肠杆菌的抗反馈型3-磷酸甘油酸脱氢酶基因(serA基因)表达质粒的构建 

在来自大肠杆菌的3-磷酸甘油酸脱氢酶基因(serA基因)中，已知将结构基因的第1096～1098位的密码子置换为终止密码子(TAA)的突变可给出编码3-磷酸甘油酸脱氢酶的C末端的45个氨基酸残基缺失的由丝氨酸导致的实质性抑制被解除的突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶的基因(以下、称为抗反馈型serA基因)(日本专利第2584409号)。 

 

对于抗反馈型serA基因扩增用引物使用由序列号108表示的碱基序列构成的DNA和由含有密码子置换突变序列的序列号109表示的碱基序列构成的DNA。 

序列号108表示的碱基序列是附加在含有作为serA基因的核糖体结合序列的Shine-Dalgarno序列区域5＇端的含有ClaI识别序列的序列，序列号109表示的碱基序列是附加在与含有使serA基因的C末端45氨基酸残基缺失的终止密码子的序列互补的序列的5＇端的含有 SphI识别序列的序列。 

 

分别使用上述合成DNA作为引物组，以大肠杆茵W3110株的染色 体DNA为模板进行扩增抗反馈型serA基因的PCR。PCR通过制备含有0.1μg的染色体DNA、0.5mol/L的各引物、2.5units的Pfu DNA聚合酶、4μL的Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各deoxyNTP的40μL反应液，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认相当于抗反馈型serA基因片段的约1.1kb的片段扩增后，添加与剩下的反应液等量的TE饱和酚/氯仿，并混合。将该混合液离心分离后，向得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。对该溶液进行离心分离，将得到的DNA的沉淀溶解于20μL的TE。 

 

使用该溶液5μL，将扩增了的DNA用限制酶ClaI和SphI进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，通过geneclean II试剂盒回收含有serA的1.1kb的DNA片段。 

然后含有0.2μg的trp启动子的表达载体pTrS30〔可从大肠茵JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备〕限制酶ClaI和SphI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样回收4.3kb的DNA片段。 

 

使用连接试剂盒，使上述得到的含有serA基因的1.1kb的DNA片段和4.3kb的DNA片段于16℃下反应16小时，使它们连接。 

通过使用钙离子的方法用该反应液转化大肠杆菌NM522株后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。 

 

根据众所周知的方法从生长繁殖的转化体茵落提取质粒，将该质粒命名为pSE15。通过限制酶消化确认该载体的构造。 

以上述得到的大肠杆菌由来抗反馈型serA基因表达质粒pSE15为模板，使用由序列号110和109表示的碱基序列构成的DNA作为引 物组，进行抗反馈型serA基因片段的扩增。 

 

以实验例15制作的ywfE基因表达质粒pPE56为模板，使用由序列号111和112表示的碱基序列构成的DNA引物组进行含有trp启动子的ywfE基因片段的扩增。PCR通过制备含有任一种质粒DNA 10ng、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μL的Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各deoxyNTP的40μL反应液，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

将各反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认目的片段扩增后，添加与剩下的反应液等量的TE饱和酚/氯仿，并混合。 

将该混合液离心分离后，向得到的上层中加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。对该溶液进行离心分离，使DNA沉淀后，溶解于20μL的TE中。 

 

通过上述操作取得了抗反馈型serA基因片段和含有trp启动子的 ywfE基因片段。抗反馈型serA基因片段用限制酶BglII和SphI进行酶切，含有trp启动子的ywfE基因片段用限制酶EcoRI和BamHI进行酶切，分别通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段后，使用genecleanII试剂盒回收含有serA基因的1.1kb和含有trp启动子和ywfE基因的1.8kb的DNA片段。 

 

将0.2μg含有trp启动子的表达载体pTrS30用限制酶EcoRI和 SphI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用与上述同样的方法回收3.9kb的DNA片段。 

使用连接试剂盒，使上述得到的含有serA基因的1.1kb的DNA片段、含有ywfE基因的1.8kb的DNA片段和3.9kb的DNA片段于16℃下反应16小时，进行连接。 

 

通过使用钙离子的方法用该反应液转化大肠杆菌NM522株后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。 

根据众所周知的方法从生长繁殖的转化体菌落提取质粒，通过限制酶消化确认取得了抗反馈型serA基因与ywfE基因顺向插入的质粒，将该质粒命名为pPE212。 

【实施例7】 

 

ilvL基因缺失株和回复型ilvG基因置换株的制作 

(1)ilvL基因缺失株制作用抗药性基因片段和回复型ilvG基因置换株制作用DNA片段的克隆 

大肠杆菌K12株的ilvL、ilvG的各基因的碱基序列已经阐明[Science，5331，1453-1474(1997)]。 

 

调节大肠杆菌K12株的ilvGMEDA操纵子表达的衰减区域位于该操纵子的5’端上游区，该碱基序列记载于Nucleic.Acids Res.15，2137(1987)。而由于已知通过除去这个衰减区域，衰减功能丧失，ilvGMEDA 操纵子进行组成型表达(特开平8-473979)，所以通过以下方法制作 ilvGMEDA操纵子组成型表达型的大肠杆菌K12株。 

 

而大肠杆菌K12株的野生株由于ilvG基因带有移码突变，具有活性的乙酰羟酸合酶的同功酶II(AHASII)不能表达[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，922，(1981)]。因此，参考存在于AHASII正常发挥功能的大肠杆菌0157：H7 株的染色体DNA(http://www.genome.wisc.edu/sequencing/o157.htm)上的ilvG基因序列，用以下的方法通过在大肠杆菌K12株的ilvG基因的第981位和982位之间插入称为AA的2个碱基，导入读框恢复的突变，做成乙酰羟酸合酶的活性恢复的大肠杆菌K12株。 

 

根据报告的碱基序列，使用PerSeptive Biosystems公司制造8905型DNA合成仪，合成由序列号113和114表示的碱基序列构成的DNA作为用于扩增ilvL基因缺失株制作用抗药性基因的引物组。 

该DNA含有位于各个缺失靶基因的上游和下游的36bp的同源序列。 

 

另外作为回复型ilvG基因上游区域扩增用引物组，合成由序列号115表示的碱基序列构成的DNA、和含有二碱基插入突变序列的由序列号116表示的碱基序列构成的DNA、作为回复型ilvG基因下游区域扩增用引物组合成含有二碱基突变序列的由序列号117表示的碱基序列构成的DNA、和由序列号118表示的碱基序列构成的DNA。 

 

分别使用上述DNA作为引物组，以pKD3DNA作为模板通过PCR对 ilvL基因缺失用氯霉素抗性基因片段进行扩增，以大肠杆菌W3110株的染色体DNA为模板通过PCR对回复型ilvG上游区域、和回复型ilvG 下游区域进行扩增。PCR通过使用含有染色体DNA0.1μg、或质粒DNA10ng、0.5μmol/L的各引物、2.5unis的PfuDNA聚合酶、4μL的Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各deoxyNTP的40μL反应液，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

将各反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认目的片段扩增后，添加与剩下的反应液等量的TE饱和酚/氯仿，并混合。 

向该混合液经离心分离后得到的上层加2倍容量的冷乙醇并混合，于-80℃下放置30分钟。对该溶液进行离心分离，使DNA沉淀后，将该DNA溶解于20μL的TE。通过上述操作取得ilvL基因缺失株制作用氯霉素抗性基因片段、和回复型ilvG基因上游区、回复型ilvG 基因下游区。 

 

然后以回复型ilvG基因上游区和回复型ilvG基因下游区作为模板，使用具有序列号115和118表示的碱基序列的DNA作为引物组进行交叉PCR[A.J.Link，D.Phillips，G.M.Church，J.Bacteriol.，179，6228-6237(1997)]。PCR在与上述同样的条件下进行。通过上述PCR取得了连接了回复型ilvG基因上游区和回复型 ilvG基因下游区的回复型ilvG置换株制作用DNA片段。 

(2)染色体DNA上的ilvG基因置换为回复型ilvG基因的大肠杆菌JM101株的制作 

通过常法用pKD46转化大肠杆菌JM101株后，涂布于含有100mg/l的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，通过于30℃下培养过夜，选择保持pKD46的大肠杆菌JM101株(以下、称为大肠杆菌JM101/pKD46)。 

 

通过电脉冲法用上述(1)中取得的回复型ilvG基因置换株制作用DNA片段转化在10mmol/LL-阿拉伯糖和50μg/ml的氨苄青霉素存在下培养的大肠杆菌JM101/pKD46，在含有200mg/L的L-缬氨酸的M9培养基添加了葡萄糖的琼脂培养基上选择染色体DNA上的ilvG基因置换为回复型ilvG的菌株。 

 

将取得的L-缬氨酸抗性株再度影印在含有200mg/L的L-缬氨酸的M9培养基中添加了葡萄糖的琼脂培养基，于42℃保温的状态下实施单茵落分离。将得到的各茵落影印在含有200mg/L的L-缬氨酸的M9培养基中添加了葡萄糖的琼脂培养基和含有100mg/L的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，选择表现出L-缬氨酸抗性，而且氨苄青霉素敏感性的茵落，将取得的回复型ilvG基因置换株命名为大肠杆菌JM101G+1。 

(3)染色体DNA上的ilvG基因置换为回复型ilvG基因、ilvL 基因缺失的大肠杆茵JM101株的制作 

用pKD46转化上述(2)得到的大肠杆茵JM101G+1株后，涂布于含有100mg/L的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，通过于30℃下培养过 夜，取得保持pKD46的大肠杆菌JM101G+1株(以下、称为大肠杆菌JM101G+1/pKD46)。 

 

然后，通过电脉冲法用上述(1)中取得的ilvL基因缺失株制作用氯霉素抗性基因片段转化大肠杆菌JM101G+1/pKD46，在含有25mg/L的氯霉素的LB琼脂培养基上在选择JM101株的染色体DNA上的ilvL基因插入了氯霉素抗性基因的重组株。 

将取得的氯霉素抗性株落影印在含有25mg/L的L-氯霉素的LB琼脂培养基，于42℃保温的状态下实施单菌落分离。将得到的各茵落影印在含有25mg/L的氯霉素的LB琼脂培养基和含有100mg/L的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，选择表现出氯霉素抗性和氨苄青霉素敏感性的pKD46脱落株。     

 

合成具有位于大肠杆菌的染色体DNA上的氯霉素抗性基因插入部位的上游和下游的大约400bp碱基序列的序列号119和120表示的碱基序列，通过使用该合成DNA作为引物组进行的茵落PCR，确认上述取得的转化株的染色体DNA的结构。茵落PCR通过使用含有用200μl的移液管吸头接触茵落取得的茵体量、引物各0.5μmol/L、Pfu DNA聚合酶2.5units、Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液4μL、deoxyNTP各200μmol/L的反应液，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

在进行茵落PCR的菌株中得到的含有氯霉素抗性基因大约2kb大小的扩增片段的菌株确认是ilvL基因缺失株，命名为大肠杆菌JILG+Cml。 

然后用pCP20转化上述得到的大肠杆菌JILG+Cml，通过在含有100mg/l的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上进行选择，取得了保持pCP20的大肠杆菌JILG+Cml。 

 

质粒pCP20含有来自酵母的Flp重组酶基因，该基因的表达可以在42℃进行诱导。 

另外在上述(1)中制作的ilvL基因缺失株制作用氯霉素抗性基因片段中的氯霉素抗性基因的两端，由于存在Flp重组酶识别的碱基序列，所以通过Flp重组酶催化的同源重组容易使该抗性基因脱落。 

 

另外由于pCP20含有温度敏感性的复制起点，所以通过使pCP20保持株在42℃下生长繁殖，可以同时诱导Flp重组酶的表达和pCP20的脱落。 

将上述取得的大肠杆茵JILG+Cml接种在没有添加药剂的LB琼脂培养基，于42℃下培养14小时后，进行单茵落分离。将得到的各茵落影印在没有添加药剂的LB琼脂培养基、含有25mg/L的氯霉素的LB琼脂培养基和含有100mg/L的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养，选择表现出氯霉素敏感性和氨苄青霉素敏感性的菌落。 

 

对于上述选择的各菌株，使用由序列号119和120表示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行菌落PCR。茵落PCR通过使用通过200μl的移液管吸头接触菌落取得的茵体量、0.5μmol/L的各引物、2.5units的Pfu DNA聚合酶、4μL的Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各deoxyNTP的40μL反应液，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

在进行PCR的株中得到的氯霉素抗性基因脱落的大约0.7kb大小扩增片段的菌株确认是ilvL基因缺失株，命名为大肠杆菌JILG+1。 

【实施例8】 

 

抗反馈型ilvA置换株的制作 

(1)ilvA基因缺失株制作用抗药性基因片段和抗反馈型ilvA基置换株制作用DNA片段的克隆 大肠杆菌K12株的ilvA基因的碱基序列已经阐明[Science，5331，1453-1474(1997)]。 

 

已知编码由L-异亮氨酸导致的抑制实质上解除的苏氨酸脱氨酶的ilvA219基因(以下、称为抗反馈型ilvA基因)具有第447位的亮氨酸置换为苯丙氨酸的突变[Biochemistry，34，9403(1995)]。 

根据报告的碱基序列，使用PerSeptive Biosystms公司制造8905型DNA合成仪，合成由序列号121和122表示的碱基序列构成的DNA作为用于扩增ilvL基因缺失株制作用抗药性基因的引物组。 

 

该DNA含有与位于各个缺失靶基因的上游和下游的36bp同一的碱基序列。 

另外作为抗反馈型ilvA基因上游区扩增用的引物组合成由序列号123表示的碱基序列构成的DNA、含有密码子置换突变序列的具有序列号124表示的碱基序列的DNA，作为抗反馈型ilvA基因下游区扩增用引物组，合成含有密码子置换突变序列的由序列号125表示的碱基序列构成的DNA、由序列号126表示的碱基序列构成的DNA。 

 

分别使用上述合成DNA作为引物组，以pKD3DNA作为模板通过PCR扩增ilvA基因缺失株制作用氯霉素抗性基因片段，以大肠杆菌W3110株的染色体DNA为模板通过PCR扩增抗反馈型ilvA基因上游区、和抗反馈型ilvA基因下游区。PCR通过使用含有染色体DNA 0.1μg、或质粒DNA 10ng、0.5μmol/L的各引物、2.5units的Pfu DNA聚合酶、4μL的Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各deoxyNTP的40μL反应液，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

 

将各反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认目的片段扩增后，添加与剩下的反应液等量的TE饱和酚/氯仿，并混合。 

将该混合液离心分离后，向得到的上层加2倍容量的冷乙醇并混合，于-80℃下放置30分钟。对该溶液进行离心分离，使DNA沉淀后，将该DNA溶解于20μL的TE中。通过上述操作取得了ilvA基因缺失用氯霉素抗性基因片段、抗反馈型ilvA基因上游区、和抗反馈型ilvA基因下游区。 

 

然后在上述PCR扩增片段中，以抗反馈型ilvA基因上游区、和抗反馈型ilvA基因下游区为模板，使用由序列号123和126表示的碱基序列构成的DNA作为引物组进行交叉PCR。PCR在与上述同样的条件下进行。 

通过上述PCR，取得了连接了抗反馈型ilvA基因上游区和抗反馈型ilvA基因下游区的抗反馈型ilvA基因置换株制作用DNA片段。 

(2)在大肠杆菌的染色体DNA上的ilvA基因插入抗药性基因的大肠杆菌JM101株的制作 

通过电脉冲法用上述(1)中取得的ilvA基因缺失用氯霉素抗性基因片段转化在10mmol/L的L-阿拉伯糖和50μg/ml的氨苄青霉素存在下培养的大肠杆菌JM101/pKD46，在含有25mg/L的氯霉素的LB琼脂培养基上选择在JM101株的染色体DNA上的ilvA基因插入了氯霉素抗性基因、ilvA结构基因缺失的重组株。 

 

将取得的氯霉素抗性株影印在含有25mg/L的氯霉素的LB琼脂培养基，于30℃保温的状态下实施单茵落分离。将得到的各茵落影印在含有25mg/L的氯霉素和100mg/L的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，选择表现出氯霉素抗性且氨苄青霉素抗性的菌落。 

对于得到的各株，以具有位于染色体DNA上的氯霉素抗性基因插入部位的上游和下游的大约400bp的碱基序列的序列号123和具有126表示的碱基序列的DNA作为引物组，进行菌落PCR。 

 

茵落PCR通过使用含有通过200μl的移液管吸头接触菌落取得的 菌体量、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μL的Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各deoxyNTP的40μL反应液，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实施。 

在进行PCR的菌株中得到的含有氯霉素抗性基因的大约2kb大小的扩增片段的菌株确认是ilvA基因缺失株，命名为大肠杆菌JIACml/pKD46。 

(3)染色体DNA上的ilvA基因置换为抗反馈型ilvA基因的大肠杆菌JM101株的制作 

将上述(2)中制作的大肠杆菌JIACml/pKD46株在10mmol/L的L-阿拉伯糖和50μg/ml的氨苄青霉素存在下培养后，通过电脉冲法用上述(1)中取得的抗反馈型ilvA基因置换株制作用DNA片段进行转化，以异亮氨酸需求性作为回复指標，在M9培养基中添加了葡萄糖的琼脂培养基上选择JIACml株的染色体DNA上的ilvA基因置换为抗反馈型 ilvA基因的茵株。 

 

将生长繁殖的氨苄青霉素抗性株影印在没有添加药剂的M9培养基中添加了葡萄糖的琼脂培养基，于42℃保温的状态下实施单茵落分离。将得到的各茵落分别影印在没有添加药剂、含有25mg/L的氯霉素的LB琼脂培养基、和含有100mg/L的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，选择表现出氯霉素敏感性且氨苄青霉素敏感性的菌落。确认得到的株是抗反馈型ilvA基因置换株，命名为大肠杆菌JIA1。 

(4)染色体DNA上的ilvA基因置换为抗反馈型ilvA基因的大肠杆菌JILG+1的制作 

取代大肠杆菌JM101作为亲本株使用实施例7中制作的大肠杆茵JILG+1，通过进行上述(1)～(3)的操作，取得ilvL基因缺失、ilvG 基因置换为回复型ilvG基因，而且ilvA基因置换为抗反馈型ilvA 基因的株，命名为大肠杆菌JILG+IA1。 

【实施例9】 

 

突变型leuA基因置换株的制作 

(1)leuA基因缺失株制作用抗药性基因片段和突变型leuA基因置换株制作用DNA片段的克隆 

大肠杆菌K12株的leuA基因碱基序列已经阐明[Science，5331，1453-1474(1997)]。 

 

大肠杆菌FERM BP-4704是通过亮氨酸类似物(4-氮亮氨酸)抗性选拔的亮氨酸生产茵(特开平8-70879)，认为具有编码实质上可解除L-亮氨酸导致的抑制的异丙基苹果酸合酶的突变型leuA基因。 

使用PerSeptive Biosystems公司制造8905型DNA合成仪，根据报告的碱基序列，作为用于扩增leuA基因缺失株制作用抗药性基因片段的引物组，合成序列号127和128表示的碱基序列构成的DNA。 

 

该DNA具有与位于各个缺失的靶基因的上游和下游的36bp同一的碱基序列。 

另外作为用于扩增突变型leuA基因置换株制作用DNA片段的引物组，合成具有位于从leuA基因的起始密码子开始上游大约200bp的碱基序列的序列号129表示的DNA、和与位于从终止密码子开始的下游大约200bp碱基序列反方向的序列的序列号130表示的DNA。 

 

分别将上述的DNA作为引物组使用，以pKD3DNA作为模板通过PCR扩增leuA基因缺失株制作用氯霉素抗性基因片段，另外以通过常法制备的FERM BP-4704染色体DNA作为模板通过PCR扩增突变型leuA基因置换株制作用DNA片段。 

PCR通过使用含有染色体DNA0.1μg、或质粒DNA 10ng、引物各0.5μmol/L、Pfu DNA聚合酶2.5units、Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液4μL、deoxyNTP各200μmol/L的反应液40μL，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次来实 施。 

 

将各反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认目的片段扩增后，添加与剩下的反应液等量的TE饱和酚/氯仿，并混合。 

将该混合液离心分离后，向得到的上层中加2倍容量的冷乙醇并混合，于-80℃放置30分钟。将该溶液离心分离，使DNA沉淀后，将该DNA溶解于20μL的TE。通过上述操作可取得leuA基因缺失株制作用氯霉素抗性基因片段、和突变型leuA基因置换株制作用DNA片段。 

(2)在染色体DNA上的leuA基因插入了抗药性基因的大肠杆茵JM101株的制作 

通过与实施例8(2)同样的操作，制作在大肠杆菌JM101株的染色体DNA上的leuA基因插入了氯霉素抗性基因的大肠杆菌突变株。 

 

染色体DNA上插入了氯霉素抗性基因的确认通过使用具有位于氯霉素抗性基因插入部位的上游和下游的大约200bp的碱基序列的序列号131和132表示的碱基序列构成的DNA作为引物组的茵落PCR进行。 

PCR在与实施例8(2)同样的条件下进行。在进行茵落PCR的茵株中得到含有氯霉素抗性基因的大约2kb大小扩增片段的茵株确认是氯霉素抗性基因插入到leuA基因中的leuA基因缺失株，命名为JLACml/pKD46。 

(3)染色体DNA上的leuA基因置换为来自大肠杆菌H-9070株的突变型基因的大肠杆菌JM101株的制作 

使用上述(1)制作的突变型leuA基因置换株制作用DNA片段和上述(2)制作的大肠杆菌JLACml/pKD46株，通过与实施例8(3)同样的操作制作大肠杆菌JLACml/pKD46的染色体DNA上插入了氯霉素抗性基因的leuA基因置换为突变型leuA基因的重组株，命名为大肠杆菌JLA1。 

(4)染色体DNA上的leuA基因置换为突变型leuA基因的大肠杆菌JILG+1的制作 

取代大肠杆菌JM101使用实施例7制作的大肠杆菌JILG+1作为亲本株，通过上述(1)～(3)的操作，取得ilvL基因缺失、ilvG 基因置换为回复型ilvG基因，而且leuA基因置换为突变型leuA基因的菌株，命名为大肠杆菌JILG+LA1。 

【实施例10】 

 

使用具有生产L-丙氨酸能力的微生物发酵生产L-Ala-L-Ala用实施例2得到的来自枯草芽孢杆菌的ywfE基因和来自枯草芽孢杆菌的ald基因表达质粒pPE86转化大肠杆菌JM101株后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。通过众所周知的手法从生长繁殖的菌株提取质粒，对该质粒进行限制酶处理，确认取得了保持质粒pPE86的大肠杆菌JM101株(以下、称为大肠杆茵JM101/pPE86)。用同样的方法也取得了保持质粒pTrS30的大肠杆菌JM101株(以下、称为大肠杆菌JM101/pTrS30)、保持质粒pPE56的大肠杆茵JM101株(以下、称为大肠杆菌JM101/pPE56)。 

 

将上述的转化株分别接种于加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8ml的LB培养基的试管，于28℃下培养17小时。将该培养液1％接种于加入了8ml含有100μg/ml的氨苄青霉素的生产培养基[16g/L磷酸氢二钾、14g/L磷酸二氢钾、5g/L硫酸铵、1g/L柠檬酸(无水)、5g/L Casamino acid(Difco公司生产)、l0g/L葡萄糖、10mg/L维生素B₁、25mg/L硫酸镁·7水合物、50mg/L硫酸铁·7水合物、用10mol/L的氢氧化钠调整到pH7.2、葡萄糖、维生素B₁、硫酸镁·7水合物、硫酸铁·7水合物分别蒸气灭菌后添加]的试管，于30℃下培养24小时后，对该培养液进行离心分离取得培养上清。 

 

将培养上清中的培养生成物通过F-moc化法衍生后，使用HPLC对该生成物进行分析。HPLC法分析用与实验例17同样的方法进行。结果表示在表6中。 

[表6] 

[实施例11] 

利用具有生产L-Ala和L-Gln能力的微生物发酵生产L-Ala-L-GIn 

用实施例2得到的pPE86转化实施例1得到的glnE基因和slnB 基因双重缺失株大肠杆菌JGLBEl后，涂布于含有50μg/m1的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。通过众所周知的手法从生长繁殖的菌株提取质粒，对该质粒进行限制酶处理，确认取得了保持质粒pPE86的大肠杆菌JGLBEl株，将该株命名为大肠杆菌JGLBEl/pPE86。用同样的方法也取得了保持质粒pTrS30的大肠杆菌JGLBEl株(以下、称为大肠杆菌JGLBEl/pTrS30)、保持质粒pPE56的大肠杆菌JGLBE1株(称为大肠杆菌JGLBEl/pPE56)。 

将上述的转化株分别接种于加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8ml的LB培养基的试管，于28℃下培养17小时。将该培养液1％接种于加入了8ml含有100μg/ml的氨苄青霉素的实施例10所述的生产培养基的试管，于30℃下培养24小时后，对该培养液进行离心分离取得培养上清。 

将培养上清中的培养生成物通过F-moc化法衍生后，使用HPLC对该生成物进行分析。HPLC法分析用与实验例17同样的方法进行。结果表示在袁7中。 

[表7] 

[实施例12] 

使用具有生产L-Ala和L-Phe的能力的微生物发酵生产L-Ala-L-Phe 

用实施例3中制作的来自大肠杆菌的抗反馈型pheA基因表达质粒pPHEA2、或来自大肠杆茵的抗反馈型pheA基因和抗反馈型aroF 基因表达质粒pPHEAF2转化实施例1O取得的大肠杆菌JMl01/pPE86后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素和30μg/m1的氯霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。通过众所周知的手法从生长繁殖的菌株提取质粒，对该质粒进行限制酶处理，确认取得了保持pPHEA2或pPHEAF2的大肠杆菌  JMl01/pPE86(分别称为大肠杆菌JMl01/pPE86/pPHEA2、大肠杆茵JMl01/pPE86/pPHEAF2)。用同样的方法通过用pPHEA2或pPHEAF2转化实施例10中取得的大肠杆菌JM101/pTrS30和大肠杆菌JMl01/pPE56，取得了保持pPHEA2的大肠杆茵JMl01/pTrS30(以下称为大肠杆菌JMl01/pTrS30/pPHEA2)、保持pPHEAF2的大肠杆菌  JMl01/pTrS30(以下称为大肠杆菌JMl01/pTrS30/pPHEAF2)、保持pPHEA2的大肠杆茵JMl01/pPE56(以下称为大肠杆菌JM101/pPE56/pPHEA2)、保持pPHEAF2的大肠杆菌JM101/pPE56(以下称为大肠杆菌JM101/pPE56/pPHEAF2)。 

 

将上述的转化株分别接种于加入了含有50ug/m1的氨苄青霉素和3Oμg/mL的氯霉素的8ml的LB培养基的试管，于28℃下培养17小时。将该培养液1％接种于加入了8ml含有100g/ml的氨苄青霉素和50μg/m1的氯霉素的上述实施例10所述的生产培养基的试管，于 30℃下培养24小时后，对该培养液进行离心分离取得培养上清。 

将培养上清中的培养生成物通过F-moc化法衍生后，使用HPLc对该生成物进行分析。HPLC分析用与实验例17同样的方法进行。结果表示在表8中。     

[表8] 

[实施例13] 

使用具有生产L-Thr和L-Phe能力的微生物发酵生产L-苏氨酰-L-苯丙氨酸(L-Thr-L-Phe) 

用实验例15得到的强化来自枯草芽孢杆茵的芝wfE基因表达的质粒pPE56转化表现出脯氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸和硫胺素需求性、赋予α-氨基-β-羟基吉草酸抗性的具有生产L-Thr能力的大肠杆菌βIM-4株(ATCC21277)后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。通过众所周知的手法从生长繁殖的菌株提取质粒，通过限制酶处理确认取得了保持pPE56的大肠杆菌ATCC21277(以下称为大肠杆菌ATCC21277/pPE56)。 

然后用pSTV28(Takara Bi0公司生产)、实施例3得到的pPHEA2或pPHEAF2转化大肠杆菌ATCC21277/pPE56后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素和30μg/m1的氯霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。通过众所周知的手法从生长繁殖的茵株提取质粒，对该质粒进行限制酶处理，确认取得了保持pSTV28、pPHEA2或pPHEAF2的大肠杆 菌ATCC21277/pPE56(以下分别称为大肠杆菌ATCC21277/pPE56/pSTV28、大肠杆菌ATCC21277/pPE56/pPHEA2和大肠杆菌ATCC21277/pPE56/pPHEAF2)。通过同样方法，取得了保持pTrS30和pSTV28的大肠杆茵ATCC21277(以下称为大肠杆菌ATCC21277/pTrS30/pSTV28)、保持pTrS30和pPHEA2的大肠杆菌ATCC21277(以下称为大肠杆菌ATCC21277/pTrS30/pPHEA2)、保持pTrS30和pPHEAF2的大肠杆菌ATCC21277(以下称为大肠杆菌ATCC21277/pTrS30/pPHEAF2)。 

将上述的转化株分别接种于加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素和30ug/mL的氯霉素的8ml的LB培养基的试管，于28℃下培养17小时。将该培养液1％接种于加入了8ml含有100/m1的氨苄青霉素和50ug/ml的氯霉素的上述实施例4所述的生产培养基的试管，于30℃下培养24小时后，对该培养液进行离心分离取得培养上清。 

 

将培养上清中的培养生成物通过F-moc化法衍生后，使用HPLC对该生成物进行分析。HPLC分析用与实验例17同样的方法进行。结果表示在表9中。 

[表9] 

[实施例14] 

利用具有生产L-Ala和L-Tyr能力的微生物发酵生产L-Ala-L-Tyr 

用实施例4中制作的来自大肠杆菌的酪氨酸抗性突变型aroF-tyrA操纵子表达质粒pTY2转化实施例10中取得的大肠杆菌JMl01/pPE86后，涂布于含有5Oμg/ml的氨苄青霉素和30μg/m1的氯霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。通过众所周知的手法从生长繁殖的菌株提取质粒，确认取得了保持pTY2的大肠杆菌JMl01/pPE86(以下称为大肠杆菌JMl01/pPE86/pTY2)。用同样的方法通过用pTY2转化实施例10中取得的大肠杆菌JMl01/pTrS30和大肠杆菌JMl01/pPE56，取得了保持pTY2的大肠杆菌JMl01/pTrS30(以下称为大肠杆菌JMl01/pTrS30/pTY2)、保持pTY2的大肠杆菌JMl01/pPE56(以下称为大肠杆菌JMl01/pPE56/pTY2)。 

 

将上述的各转化株分别接种于加入了含有50μg/m1的氨苄青霉素和30μg/ml的氯霉素的8ml的LB培养基的试管，于28℃下培养17小时。将该培养液1％接种于加入了8ml含有100μg/ml的氨苄青霉素和50μg/m1的氯霉素的实施例10所述的生产培养基的试管，于3O℃下培养24小时后，对该培养液进行离心分离取得培养上清。 

 

将培养上清中的培养生成物通过F-moc化法衍生后，使用HPLC对该生成物进行分析。HPLC分析用与实验例17同样的方法进行。结果表示在表10中。 

 

【表10】 

【实施例15】 

 

利用具有生产L-Ala和L-Met能力的微生物发酵生产L-丙氨酰-L-蛋氨酸(L-Ala-L-Met) 

用实施例2得到的pPE86基因转化实施例5中取得的大肠杆菌JMJ1后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。通过众所周知的手法从生长繁殖的菌株提取质粒，通过限制酶处理确认取得了保持pPE86的大肠杆菌JMJ1株，将该株命名为大肠杆菌JMJ1/pPE86。用同样的方法也取得了保持质粒pTrS30的大肠杆菌JMJ1株(以下称为大肠杆菌JMJ1/pTrS30)、保持质粒pPE56的大肠杆菌JMJ1株(以下称为大肠杆菌JMJ1/pPE56)。 

 

将上述的转化株分别接种于加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8ml的LB培养基的试管，于28℃下培养17小时。将该培养液1％接种于加入了8ml含有100μg/ml的氨苄青霉素的实施例10所述的生产培养基的试管，于30℃下培养24小时后，对该培养液进行离心分离取得培养上清。 

将培养上清中的培养生成物通过F-moc化法衍生后，使用HPLC对该生成物进行分析。HPLC法分析用与实验例17同样的方法进行。结果表示在表11中。 

 

【表11】 

	L-Ala-L-Met(mg/l)	L-Met(mg/l)
			JMJl/pTrS30	0	16
JMJl/pPE56	0	61
			JUMJ1/pPE86	113	180

 

实施例10～15示出的结果表明通过将具有生产具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的能力，而且具有生产该1种以上的氨基酸中的至少1种氨基酸的能力的微生物在培养基中进行培养，可以使二肽在该培养基中生成、蓄积，和与具有生产1种氨基酸能力的上述微生物相比，具有生产2种氨基酸能力的上述微生物一方的二肽生产能力高。 

【 实施例16 】 

 

利用具有生产L-Ala能力，而且肽酶基因和二肽转运蛋白质基因缺失的微生物发酵生产L-Ala-L-Ala 

用pTrS30、实施例2得到的pPE56或pPE86转化实验例16(4)得到的pepD基因、pepN基因和dpp操纵子基因缺失的大肠杆菌JPNDDP36株后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。通过众所周知的手法从生长繁殖的菌株提取质粒，通过限制酶处理确认取得了保持pTrS30、pPE56或pPE86的大肠杆茵JPNDDP36株(以下分别称为大肠杆菌JPNDDP36/pTrS30、大肠杆菌JPNDDP36/pPE56和大肠杆菌JPNDDP36/pPE86)。 

 

将上述的转化株分别用与实施例10同样的方法进行培养，表12示出了通过与实验例17同样的方法对培养上清中的生成物分析的结果。 

 

【表12】 

	L-Ala-L-Ala(mg/L)	L-Ala(mg/L)
			JPNDDP36/pTrS30JPNDDP36/pPE56JPNDDP36/pPE86	0010	0l2

【实施例17】 

 

利用具有生产L-Ala和L-Gln能力，而且肽酶基因和二肽转运蛋白质基因缺失的微生物发酵生产L-Ala-L-Gln 

(1)具有生产L-Ala和L-Gln能力，而且肽酶基因和二肽转运蛋白质基因缺失的微生物的制作 

通过使用实验例16(4)得到的大肠杆菌JPNDDP36株，进行与实施例1相同的操作，向大肠杆菌JPNDDP36株导入glnE基因缺失和glnB 基因缺失，取得了具有生产L-Ala和L-Gln能力、而且肽酶基因和二肽转运蛋白质基因缺失的微生物大肠杆茵JPNDDPGBE1株。 

(2)L-Ala-L-Gln的发酵生产 

使用与实施例16同样的方法用pTrS30、pPE56或pPE86转化上述(1)得到的大肠杆菌JPNDDPGBE1株，取得了保持该质粒的大肠杆菌JPNDDPGBE1株(以下分别称为大肠杆菌JPNDDPGBE1/pTrS30、大肠杆菌$PNDDPGBE1/pPE56和大肠杆菌JPNDDPGBE1/pPE86)。 

 

将大肠杆菌JPNDDPGBE1/pTrS30、大肠杆菌JPNDDPGBEl/pPE56和大肠杆菌JPNDDPGBEl/pPE86用与实施例10同样的方法进行培养，表13示出了通过与实验例17同样的方法对培养上清中的生成物分析的结果。 

 

【表13】 

【实施例18】 

 

使用具有生产L-Ala和L-Tyr能力、而且肽酶基因和二肽转运蛋白质基因缺失的微生物发酵生产L-Ala-L-Tyr 

用实施例2取得的pPE86转化实验例16中取得的JPNDDP36株后，涂布于含有50ug/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于3O℃下培养过夜。通过众所周知的手法从生长繁殖的菌株提取质粒，通过限制酶处理确认取得了保持pPE86的大肠杆菌JPNDDP36株，将该株命名为大肠杆菌JPNDDP36/pPE86。通过同样的方法，也取得了保持pTrS30的大肠杆菌JPNDDP36株(以下称为大肠杆菌JPNDDP36/pTrS30)、保持pPE56的大肠杆菌JPNDDP36株(称为大肠杆菌JPNDDP36/pPE56)。 

 

然后通过用实施例4取得的pTY2分别转化上述得到的转化株，取得保持pTY2的转化株大肠杆菌JPNDDP36/pTrS30/pTY2、大肠杆茵 JPNDDP36/pPE56/pTY2和大肠杆菌JPNDDP36/pPE86/pTY2。 

将上述的转化株分别接种于加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8ml的LB培养基的试管，于28℃下培养17小时。将该培养液1％接种于加入了8ml含有100μg/ml的氨苄青霉素的实施例10所述的生产培养基的试管，于30℃下培养24小时后，对该培养液进行离心分离取得培养上清。 

 

将培养上清中的培养生成物通过F-moc化法衍生后，使用HPLC对该生成物进行分析。HPLC法分析用与实验例17同样的方法进行。结果表示在表14中。 

 

【表14】 

	L-Ala-L-Tyr(mg/l)	L-Tyr(mg/l)
			JPNDDP36/pTrS30/pTY2	0	41
JPNDDP36/pPE56/pTY2	301	16
			JPNDDP36/pPE86/pTY2	367	8

【实施例19】 

 

使用具有生产L-Ala和L-Val能力，而且肽酶基因和二肽转运蛋白质基因缺失的微生物发酵生产L-Ala-L-Val 

使用实验例16中取得的肽酶基因和编码肽转运蛋白质的操纵子缺失突变株作为亲本株，根据实施例7所述的方法，制作缺失ilvL基因，且ilvG基因的移码突变回复的大肠杆菌JPNDDPILG+1株。 

 

使用实施例2中取得的pPE86转化大肠杆菌JPNDDPILG+1株后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。通过众所周知的手法从生长繁殖的茵株提取质粒，通过对质粒进行限制酶处理确认取得了保持质粒pPE86的大肠杆菌JPNDDPILG+1株(以下称为大肠杆茵JPNDDPILG+1/pPE86)。同样取得了保持质粒pTrS30的大肠杆菌JPNDDPILG+1株(以下称为大肠杆茵 JPNDDPILG+1/pTrS30)、保持质粒pPE56的大肠杆菌JPNDDPILG+1株(以下称为大肠杆菌JPNDDPILG+1/pPE56)。 

 

将上述的转化株分别接种于加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8ml的LB培养基的试管，于28℃下培养17小时。将该培养液1％接种于加入了8ml含有100μg/ml的氨苄青霉素的培养基[16g/L磷酸氢二钾、14g/L磷酸二氢钾、5g/L硫酸铵、1g/L柠檬酸(无水)、5g/L Casamino acid(Difco公司生产)、10g/L葡萄糖、10mg/L维生素B₁、25mg/L硫酸镁·7水合物、50mg/L硫酸铁·7水合物、用10mol/L的氢氧化钠调整到pH7.2、葡萄糖、维生素B₁、硫酸镁·7水合物、硫酸铁·7水合物分别蒸气灭菌后添加]的试管，于30℃下培养24小时后，对该培养液进行离心分离取得培养上清。 

 

将培养上清中的培养生成物通过F-moc化法衍生后，使用HPLC对该生成物进行分析。HPLC法分析用与实验例17同样的方法进行。结果表示在表15中。 

 

【表15】 

	L-Ala-L-Val(mg/l)	L-Val(mg/l)
			JPNDDPILG+1/pTrS30	0	220
JPNDDPILG+1/pPE56	62	171
			JPNDDPILG+1/pPE86	300	240

【实施例20】 

 

使用具有生产L-Ala和L-Ile能力、而且肽酶基因和二肽转运蛋白质基因缺失的微生物发酵生产L-Ala-L-Ile 

以实验例16中取得的肽酶基因和编码肽转运蛋白质的操纵子的缺失突变株大肠杆茵JPNDDP 36株作为亲本株，根据实施例7和8所述的方法制作ilvL基因缺失、ilvG基因的移码突变回复、以及ilvA基因置换为抗反馈型ilvA基因的大肠杆菌JPNDDPILG+IA1株。 

 

使用实施例2中取得的pPE86转化大肠杆菌JPNDDPILG+IA1株后，涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，于30℃ 下培养过夜。通过众所周知的手法从生长繁殖的菌株提取质粒，通过限制酶处理确认取得了保持质粒pPE86的大肠杆菌JPNDDPILG+IA1株，将该株命名为大肠杆菌JPNDDPILG+IA1/pPE86。用同样方法取得了保持pTrS30的大肠杆菌JPNDDPILG+IA1株(以下、称为大肠杆菌JPNDDPILG+IA1/pTrS30)、保持pPE56的大肠杆菌JPNDDPILG+IA1株(称为大肠杆菌JPNDDPILG+IA1/pPE56)。 

 

将上述的转化株分别接种于加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8ml的LB培养基的试管，于28℃下培养17小时。将该培养液1％接种于加入了8ml含有100μg/ml的氨苄青霉素的实施例10所述的生产培养基的试管，于30℃下培养24小时后，对该培养液进行离心分离取得培养上清。 

将培养上清中的培养生成物通过F-moc化法衍生后，使用HPLC对该生成物进行分析。HPLC法分析用与实验例17同样的方法进行。结果表示在表16中。 

 

【表16】 

	L-Ala-L-Ile(mg/l)	L-Ile(mg/l)
			JPNDDPILG+IA1/pTrS30	0	124
JPNDDPILG+IA1/pPE56	21	212
			JPNDDPILG+IA1/pPE86	159	189

【实施例21】 

 

使用具有生产L-Ala和L-Leu能力、而且肽酶基因和二肽转运蛋白质基因缺失的微生物发酵生产L-Ala-L-Leu 

用实施例2中取得的pPE86转化以实验例16中取得的肽酶基因和编码肽转运蛋白质的操纵子的缺失突变株大肠杆菌JPNDDP36株作为 亲本株，根据实施例7和9所述的方法制作ilvL基因缺失、ilvG基因的移码突变回复、以及leuA基因置换为突变型leuA基因的大肠杆菌JPNDDPILG+LA1后，涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，于30℃下培养过夜。通过众所周知的手法从生长繁殖的菌株提取质粒，通过限制酶处理确认取得了保持pPE86的大肠杆菌JPNDDPILG+LA1株，将该株命名为大肠杆菌JPNDDPILG+LA1/pPE86。用同样的方法也取得了保持pTrS30的大肠杆菌JPNDDPILG+LA1株(以下称为大肠杆菌JPNDDPILG+LA1/pTrS30)、保持pPE56的大肠杆菌JPNDDPILG+LA1株(称为大肠杆菌JPNDDPILG+LA1/pPE56)。 

 

将上述的转化株分别接种于加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8ml的LB培养基的试管，于28℃下培养17小时。将该培养液1％接种于加入了8ml含有100μg/ml的氨苄青霉素的实施例10所述的生产培养基的试管，于30℃下培养24小时后，对该培养液进行离心分离取得培养上清。 

将培养上清中的培养生成物通过F-moc化法衍生后，使用HPLC对该生成物进行分析。HPLC法分析用与实验例17同样的方法进行。结果表示在表17中。 

 

【表17】 

	L-Ala-L-Leu(mg/l)	L-Leu(mg/l)
			JPNDDPILG+LA1/pTrS30	0	12
JPNDDPILG+LA1/pPE56	78	66
			JPNDDPILG+LA1/pPE86	110	25

【实施例22】 

 

使用具有生产L-Ser和L-Phe能力，而且肽酶基因和二肽转运蛋白质基因缺失的微生物发酵生产L-Ser-L-Phe 

将作为编码实验例16取得的肽酶基因和肽转运蛋白质的操纵子的缺失突变株的大肠杆茵JPNDDP36株用实施例6取得的pSE15或 pPE212转化后，涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，于30℃下培养过夜。通过众所周知的手法从生长繁殖的菌株提取质粒，通过限制酶处理确认取得了保持pSE15的大肠杆菌JPNDDP36株、和保持pPE212的大肠杆菌JPNDDP36株，分别命名为大肠杆菌JPNDDP36/pSE15和大肠杆菌JPNDDP36/pPE121。

再通过对上述得到的转化株分别用实施例3取得的来自大肠杆菌的抗反馈型pheA基因和抗反馈型aroF基因表达质粒pPHEAF2进行转化，取得保持pPHEAF2的大肠杆菌JPNDDP36/pSE15、和大肠杆菌JPNDDP36/pPE121，它们分别被命名为大肠杆菌JPNDDP36/pSE15/pPHEAF2、和大肠杆菌JPNDDP36/pPE121/pPHEAF2。

将大肠杆菌JPNDDP36/pSE15/pPHEAF2、和大肠杆菌JPNDDP36/pPE121/pPHEAF2分别接种在加入了各含50μg/ml的氨苄青霉素和30μg/ml的氯霉素的8ml的LB培养基的试管，于28℃下培养17小时。将1％该培养液接种在加入了含有100μg/ml的氨苄青霉素和50μg/ml的氯霉素的实施例4所述生产培养基8ml的试管，于30℃下培养24小时后，通过对该培养液进行离心分离取得培养上清。

将培养上清中的培养生成物通过F-moc化法衍生后，使用HPLC对该生成物进行分析。HPLC分析用与实验例17同样的方法进行。结果表示在表18中。

【表18】

	L-Ser-L-Phe(mg/L)	L-Ser(mg/L)	L-Phe(mg/L)
				JPNDDP36/pSE15/pPHEAF2	0	7	31
JPNDDP36/pSE212/pPHEAF2	7	7	10

 [1025]

实施例16～22示出的结果表明通过对具有生产具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的能力、具有生产该1种以上的氨基酸中的至少1种氨基酸的能力，而且1种以上肽酶和1种以上肽转运蛋白质的活性丧失，或3种以上的肽酶活性丧失的微生物在培养基中进行培养，可以使二肽在该培养基中生成、蓄积，还有该微生物具有生产具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的能力，和具有生产该1种以上的氨基酸中的至少1种氨基酸的能力，与没有丧失肽酶和肽转运蛋白质的活性的微生物相比，显然二肽的生产能力高。 

【产业上利用的可能性】 

 

通过本发明可以有效地制造各种二肽。 

【序列表FREE TEXT】 

 

序列号19-人工序列的说明：合成DNA 

序列号20-人工序列的说明：合成DNA 

序列号21-人工序列的说明：合成DNA 

序列号22-人工序列的说明：合成DNA 

序列号23-人工序列的说明：合成DNA 

序列号24-人工序列的说明：合成DNA 

序列号25-人工序列的说明：合成DNA 

序列号26-人工序列的说明：合成DNA 

序列号27-人工序列的说明：合成DNA 

序列号28-人工序列的说明：合成DNA 

序列号29-人工序列的说明：合成DNA 

序列号30-人工序列的说明：合成DNA 

序列号31-人工序列的说明：合成DNA 

序列号32-人工序列的说明：合成DNA 

序列号33-人工序列的说明：在数据库检索中使用的氨基酸序列 

序列号34-人工序列的说明：在数据库检索中使用的氨基酸序列 

序列号35-人工序列的说明：在数据库检索中使用的氨基酸序列 

序列号41-人工序列的说明：合成DNA 

序列号42-人工序列的说明：合成DNA 

序列号54-人工序列的说明：合成DNA 

序列号64-人工序列的说明：合成DNA 

序列号65-人工序列的说明：合成DNA 

序列号66-人工序列的说明：合成DNA 

序列号67-人工序列的说明：合成DNA 

序列号68-人工序列的说明：合成DNA 

序列号69-人工序列的说明：合成DNA 

序列号70-人工序列的说明：合成DNA 

序列号71-人工序列的说明：合成DNA 

序列号72-人工序列的说明：合成DNA 

序列号73-人工序列的说明：合成DNA 

序列号74-人工序列的说明：合成DNA 

序列号75-人工序列的说明：合成DNA 

序列号76-人工序列的说明：合成DNA 

序列号77-人工序列的说明：合成DNA 

序列号78-人工序列的说明：合成DNA 

序列号79-人工序列的说明：合成DNA 

序列号80-人工序列的说明：合成DNA 

序列号81-人工序列的说明：合成DNA 

序列号82-人工序列的说明：合成DNA 

序列号83-人工序列的说明：合成DNA 

序列号8-人工序列的说明：合成DNA 

序列号8-人工序列的说明：合成DNA 

序列号86-人工序列的说明：合成DNA 

序列号87-人工序列的说明：合成DNA 

序列号88-人工序列的说明：合成DNA 

序列号89-人工序列的说明：合成DNA 

序列号90-人工序列的说明：合成DNA 

序列号91-人工序列的说明：合成DNA 

序列号92-人工序列的说明：合成DNA 

序列号93-人工序列的说明：合成DNA 

序列号94-人工序列的说明：合成DNA 

序列号95-人工序列的说明：合成DNA 

序列号96-人工序列的说明：合成DNA 

序列号97-人工序列的说明：合成DNA 

序列号98-人工序列的说明：合成DNA 

序列号99-人工序列的说明：合成DNA 

序列号100-人工序列的说明：合成DNA 

序列号101-人工序列的说明：合成DNA 

序列号102-人工序列的说明：合成DNA 

序列号103-人工序列的说明：合成DNA 

序列号104-人工序列的说明：合成DNA 

序列号105-人工序列的说明：合成DNA 

序列号106-人工序列的说明：合成DNA 

序列号107-人工序列的说明：合成DNA 

序列号108-人工序列的说明：合成DNA 

序列号109-人工序列的说明：合成DNA 

序列号110-人工序列的说明：合成DNA 

序列号111-人工序列的说明：合成DNA 

序列号112-人工序列的说明：合成DNA 

序列号113-人工序列的说明：合成DNA 

序列号114-人工序列的说明：合成DNA 

序列号115-人工序列的说明：合成DNA 

序列号116-人工序列的说明：合成DNA 

序列号117-人工序列的说明：合成DNA 

序列号118-人工序列的说明：合成DNA 

序列号119-人工序列的说明：合成DNA 

序列号120-人工序列的说明：合成DNA 

序列号121-人工序列的说明：合成DNA 

序列号122-人工序列的说明：合成DNA 

序列号123-人工序列的说明：合成DNA 

序列号124-人工序列的说明：合成DNA 

序列号125-人工序列的说明：合成DNA 

序列号126-人工序列的说明：合成DNA 

序列号127-人工序列的说明：合成DNA 

序列号128-人工序列的说明：合成DNA 

序列号129-人工序列的说明：合成DNA 

序列号130-人工序列的说明：合成DNA 

序列号131-人工序列的说明：合成DNA 

序列号132-人工序列的说明：合成DNA 

序列表

<110>协和发酵工业株式会社

<120>二肽的制造方法

<130>1000P11694WO0

<150>JP2004-189011

<151>2004-06-25

<160>132

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>472

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)

<400>1

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

  1               5                  10                  15

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

            20                  25                  30

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

         35                  40                  45

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

     50                  55                  60

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

 65                  70                  75                  80

His Asn Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

                 85                  90                  95

Glu Met Phe Gly Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

            100                 105                 110

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

        115                 120                 125

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

    130                 135                 140

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145                 150                 155                 160

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

                165                 170                 175

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

            180                 185                 190

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

        195                 200                 205

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

    210                 215                 220

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225                 230                 235                 240

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

                245                 250                 255

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

            260                 265                 270

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

        275                 280                 285

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

    290                 295                 300

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305                 310                 315                 320

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

                325                 330                 335

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

            340                 345                 350

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

        355                 360                 365

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

    370                 375                 380

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

385                 390                 395                 400

Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

                405                 410                 415

Ser Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

            420                 425                 430

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

        435                 440                 445

Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu

    450                 455                 460

Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465                 470

<210>2

<211>472

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌ATCC6633

<400>2

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

  1               5                  10                  15

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

            20                  25                  30

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

         35                  40                  45

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Gln Ser

     50                  55                  60

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

65                  70                  75                  80

His Asp Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

                85                  90                  95

Gln Met Phe Glu Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

            100                 105                 110

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

        115                 120                 125

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

    130                 135                 140

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145                 150                 155                 160

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

                165                 170                 175

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

            180                 185                 190

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

        195                 200                 205

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

    210                 215                 220

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225                 230                 235                 240

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

                245                 250                 255

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

            260                 265                 270

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

        275                 280                 285

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

    290                 295                 300

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305                 310                 315                 320

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

                325                 330                 335

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

            340                 345                 350

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

        355                 360                 365

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

    370                 375                 380

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

385                 390                 395                 400

Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

                405                 410                 415

Thr Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

            420                 425                 430

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

        435                 440                 445

Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu

    450                 455                 460

Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465                 470

<210>3

<211>472

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌IAM1213

<400>3

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

  1               5                  10                  15

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

            20                  25                  30

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

         35                  40                  45

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

     50                  55                  60

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

65                  70                  75                  80

His Asn Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

                 85                  90                  95

Glu Met Phe Gly Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

            100                 105                 110

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

        115                 120                 125

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

    130                 135                 140

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145                 150                 155                 160

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

                165                 170                 175

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

            180                 185                 190

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

        195                 200                 205

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

    210                 215                 220

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225                 230                 235                 240

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

                245                 250                 255

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

            260                 265                 270

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

        275                 280                 285

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

    290                 295                 300

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305                 310                 315                 320

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

                325                 330                 335

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

            340                 345                 350

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

        355                 360                 365

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

    370                 375                 380

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

385                 390                 395                 400

Ala Ile Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

                405                 410                 415

Ser Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

            420                 425                 430

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

        435                 440                 445

Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu

    450                 455                 460

Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465                 470

<210>4

<211>472

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌IAM1107

<400>4

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

  1               5                  10                  15

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

             20                  25                  30

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

         35                  40                  45

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Val Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

     50                  55                  60

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

 65                  70                  75                  80

His Asn Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

                 85                  90                  95

Glu Met Phe Gly Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

            100                 105                 110

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

        115                 120                 125

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

    130                 135                 140

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145                 150                 155                 160

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

                165                 170                 175

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

            180                 185                 190

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

        195                 200                 205

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

    210                 215                 220

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225                 230                 235                 240

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

                245                 250                 255

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

            260                 265                 270

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

        275                 280                 285

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

    290                 295                 300

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Val Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305                 310                 315                 320

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

                325                 330                 335

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

            340                 345                 350

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

        355                 360                 365

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

     370                 375                 380

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

385                 390                 395                 400

Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Phe

                405                 410                 415

Ser Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

            420                 425                 430

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

        435                 440                 445

Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu

    450                 455                 460

Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465                 470

<210>5

<211>472

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌IAM1214

<400>5

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

  1               5                  10                  15

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

             20                  25                  30

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

         35                  40                  45

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Gln Ser

     50                  55                  60

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

 65                  70                  75                  80

His Asp Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

                85                  90                  95

Gln Met Phe Glu Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

            100                 105                 110

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

        115                 120                 125

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

    130                 135                 140

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145                 150                 155                 160

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

                165                 170                 175

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

            180                 185                 190

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

        195                 200                 205

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

    210                 215                 220

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225                 230                 235                 240

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

                245                 250                 255

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

            260                 265                 270

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

        275                 280                 285

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

    290                 295                 300

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305                 310                 315                 320

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

                325                 330                 335

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

            340                 345                 350

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

        355                 360                 365

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

    370                 375                 380

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

385                 390                 395                 400

Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

                405                 410                 415

Thr Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

            420                 425                 430

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

        435                 440                 445

Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu

    450                 455                 460

Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465                 470

<210>6

<211>472

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌ATCC21555

<400>6

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

  1               5                  10                  15

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

             20                  25                  30

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

         35                  40                  45

Glu Lys Tyr Ser Ile Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

     50                  55                  60

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

 65                  70                  75                  80

His Asp Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Glu Ile Val Lys Val Ala

                 85                  90                  95

Asp Met Phe Gly Val Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

            100                 105                 110

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Lys Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

        115                 120                 125

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Ala Ala

    130                 135                 140

Phe Asn Arg Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145                 150                 155                 160

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Gln Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

                165                 170                 175

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Lys

            180                 185                 190

Glu Met Glu Thr Ala Glu Ala Glu Phe Asn Arg Val Asn Glu Tyr Leu

        195                 200                 205

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

    210                 215                 220

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Asp Asp Trp Tyr Glu Thr Ser

225                 230                 235                 240

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

                245                 250                 255

Tyr Phe Pro Val Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

            260                 265                 270

Glu Thr Ala His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Asp Asp Ala Lys Arg

        275                 280                 285

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Glu

    290                 295                 300

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Ala

305                 310                 315                 320

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

                325                 330                 335

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Val Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

            340                 345                 350

Val Leu Cys Tyr Gly Lys Glu Ala Asp Leu Pro Lys Gly Leu Leu Glu

        355                 360                 365

Gln Glu Pro Cys Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

    370                 375                 380

Lys Glu Asn Gly Gln Leu Pro Glu Thr Val Val Asp Phe Val Ile Glu

385                 390                 395                 400

Ser Ile Glu Ile Pro Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Thr Glu Leu Val

                405                 410                 415

Ser Phe Ser Ala Ala Glu Ala Gly Thr Ser Val Asp Leu Arg Leu Phe

            420                 425                 430

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

        435                 440                 445

Asn Asp Val Ala Glu Ser Ile Lys Gln Ile Gln Gln Gln Ala Lys Leu

    450                 455                 460

Thr Ala Lys Tyr Ala Leu Ser Val

465                 470

<210>7

<211>472

<212>PRT

<213>解淀粉芽孢杆菌IFO3022(Bacillus amyloliquefaciens IFO3022)

<400>7

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

  1               5                  10                  15

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

             20                  25                  30

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

         35                  40                  45

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

     50                  55                  60

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

 65                  70                  75                  80

His Asp Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Glu Ile Val Lys Val Ala

                 85                  90                  95

Gly Met Phe Ala Val Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

            100                 105                 110

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

        115                 120                 125

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Ala Ala

    130                 135                 140

Phe Asn Arg Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Arg Arg Val Thr Thr

145                 150                 155                 160

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Gln Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

                165                 170                 175

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Lys

            180                 185                 190

Glu Arg Glu Thr Ala Glu Ala Glu Phe Asn Arg Val Asn Glu Tyr Leu

        195                 200                 205

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

    210                 215                 220

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Asp Asp Trp Tyr Glu Thr Ser

225                 230                 235                 240

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

                245                 250                 255

Tyr Phe Pro Val Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

            260                 265                 270

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Asp Asp Ala Lys Arg

        275                 280                 285

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Glu

    290                 295                 300

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Ala

305                 310                 315                 320

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

                325                 330                 335

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Val Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

            340                 345                 350

Val Leu Cys Phe Gly Lys Glu Ala Asp Leu Pro Lys Gly Leu Leu Glu

        355                 360                 365

Gln Glu Pro Cys Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

    370                 375                 380

Lys Glu Asn Gly Gln Leu Pro Glu Thr Ala Val Asp Phe Val Ile Glu

385                 390                 395                 400

Ser Ile Asp Ile Pro Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

                405                 410                 415

Ser Phe Ser Ala Ala Glu Ala Gly Thr Ser Val Asp Leu Arg Leu Phe

            420                 425                 430

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

        435                 440                 445

Gly Asp Val Ala Glu Ser Ile Lys Gln Ile Gln Gln Gln Ala Lys Leu

    450                 455                 460

Thr Ala Lys Tyr Ala Leu Pro Val

465                 470

<210>8

<211>476

<212>PRT

<213>短小芽孢杆菌NRRL B-12025(Bacillus pumilus NRRL B-12025)

<400>26

Val Leu Ser Leu Ser Lys Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly

  1               5                  10                  15

Gly Cys Pro Pro His Met Phe Tyr Glu Ser Val Ala Ala Ser Tyr His

             20                  25                  30

Ile Val Ser Tyr Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Lys Gly His Ala

         35                  40                  45

Glu Leu Ile Glu Lys Tyr Ser Ile Ala Val Ile Lys Asp Arg Asp Tyr

     50                  55                  60

Phe Glu Thr His Pro Ser Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala

65                  70                  75                  80

His Asp Asp Tyr Pro Lys Ser Glu Glu Glu Val Val Glu Asp Phe Ile

                 85                  90                  95

Arg Val Ala Ser Phe Phe Lys Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu

            100                 105                 110

Leu Phe Ile Ala Pro Met Ala Lys Ala Ala Glu Arg Leu Gly Leu Arg

        115                 120                 125

Gly Ala Gly Val Lys Ala Ala Glu Met Ala Arg Asp Lys Ser Gln Met

    130                 135                 140

Arg Ala Ala Phe Asn Ala Ser Gly Val Lys Ala Val Lys Thr Gln Pro

145                 150                 155                 160

Val Thr Thr Leu Ser Asp Phe Gln Gln Ala Ile Glu Ser Ile Gly Thr

                165                 170                 175

Pro Leu Ile Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr

            180                 185                 190

Leu Phe His Asp Lys Ala Gly Ser Asp Asp Leu Phe Leu Gln Val Gln

        195                 200                 205

Ser Tyr Leu Glu Thr Ile Pro Val Pro Asp Ala Val Thr Tyr Glu Ala

    210                 215                 220

Pro Phe Val Ala Glu Thr Tyr Leu Glu Gly Ala Tyr Glu Asp Trp Tyr

225                 230                 235                 240

Glu Asp Glu Gly Tyr Ala Asp Tyr Val Ser Val Glu Gly Leu Val Val

                245                 250                 255

Glu Gly Glu Tyr Leu Pro Phe Val Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile

            260                 265                 270

Gly Phe Thr Glu Thr Ala His Ile Thr Pro Thr Ile Leu Asp Asn Glu

        275                 280                 285

Ala Lys Gln Ile Ile Ile Glu Ala Ala Arg Lys Ala Asn Glu Gly Leu

    290                 295                 300

Gly Leu Glu His Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn

305                 310                 315                 320

Arg Glu Thr Gly Leu Ile Glu Ala Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn

                325                 330                 335

Met Ile Pro Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Val Asp Met Ala Lys Leu

            340                 345                 350

Leu Ile Asp Val Leu Val Asp Gly Lys Lys Ala Val Leu Pro Lys Gln

        355                 360                 365

Leu Leu Ser Gly His Thr Phe Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro

    370                 375                 380

Gln His Phe Lys Glu Ser Gly Leu Ile Pro Pro Glu Ala Thr His Ile

385                 390                 395                 400

Thr Ile Asp His Val Ser Ile Pro Gln Glu Ala Phe Val Gly Asp Thr

                405                 410                 415

Ala Ile Val Ser Gln Ser Phe Pro Ala Lys Gly Thr Ile Val Asp Leu

            420                 425                 430

Glu Leu Phe Glu Ala Phe Asn Gly Ile Val Ser Leu Glu Leu Lys Gly

        435                 440                 445

Ser Ser Ser Gln Asp Val Ala Ala Ser Ile Arg Asn Ile Gln Lys Gln

    450                 455                 460

Ala Thr Ile Gln Leu Met Asp Glu Leu Val Lys Gly

465                 470                 475

<210>9

<211>1416

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌168

<400>9

atg gag aga aaa aca gta ttg gtc atc gct gat ctt gga ggc tgc ccg  48

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

  1               5                  10                  15

ccg cac atg ttt tat aaa agc gct gct gaa aaa tat aac ctg gtc agc  96

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

             20                  25                  30

ttt att cca aga cct ttt gca att aca gcc tcc cat gca gca ttg att  144

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

         35                  40                  45

gaa aaa tac tcg gtc gcg gtc ata aaa gat aaa gac tat ttt aag agt  192

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

     50                  55                  60

tta gct gat ttt gaa cac cct gat tcc att tat tgg gcg cat gaa gat  240

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

 65                  70                  75                  80

cat aac aag cct gag gaa gag gtc gtc gag caa atc gtc aag gtt gcc  288

His Asn Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

                 85                  90                  95

gaa atg ttt ggg gcg gat gcc atc aca aca aac aat gaa tta ttc att  336

Glu Met Phe Gly Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

            100                 105                 110

gct ccg atg gcg aaa gcc tgt gaa cgt ctg ggc ttg aga ggt gcc ggc  384

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

        115                 120                 125

gtg cag gca gcc gaa aat gcc aga gat aaa aat aaa atg agg gac gct  432

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

    130                 135                 140

ttt aat aag gcc gga gtc aaa tcg atc aaa aac aaa cga gtc aca act  480

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145                 150                 155                 160

ctt gaa gat ttc cgt gct gct ctt gaa gag atc ggc aca cct ctt atc  528

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

                165                 170                 175

tta aag cct aca tac tta gcg agt tct atc ggt gta acg ctg att acg  576

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

            180                 185                 190

gac act gag acg gca gaa gat gaa ttt aac aga gtc aat gac tat ctg  624

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

        195                 200                 205

aaa tca att aac gtg cca aag gcg gtt acg ttt gaa gcg ccg ttt atc  672

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

    210                 215                 220

gct gaa gaa ttt tta cag ggt gag tac gga gac tgg tat caa aca gaa  720

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225                 230                 235                 240

ggg tac tcc gac tat atc agt ata gaa ggc atc atg gct gac ggt gag  768

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

                245                 250                 255

tat ttc ccg atc gcc att cat gat aaa acg ccg caa atc ggg ttt aca  816

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

            260                 265                 270

gag aca tcc cac att acg ccg tcc att ctg gat gaa gag gca aaa aag  864

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

        275                 280                 285

aaa att gtc gaa gct gcc aaa aag gca aat gaa ggg ctt gga ctg caa  912

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

    290                 295                 300

aat tgc gca aca cat aca gag atc aag cta atg aaa aac aga gaa ccg    960

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305                 310                 315                 320

ggt tta ata gag tcg gca gcc aga ttt gcc ggc tgg aat atg atc ccc    1008

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

                325                 330                 335

aat att aaa aag gtc ttt ggc ctt gat atg gcg caa tta tta tta gat    1056

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

            340                 345                 350

gtc ctc tgt ttc gga aaa gac gcc gat ctg ccg gac gga tta ttg gat    1104

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

        355                 360                 365

caa gag cct tat tat gtt gcc gac tgc cat ttg tac ccg cag cat ttc    1152

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

    370                 375                 380

aaa caa aat ggc caa att cct gaa act gct gag gat ttg gtc att gaa    1200

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

385                 390                 395                 400

gcg atc gat att ccg gac ggg ctt tta aaa ggg gat act gaa atc gtt    1248

Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

                405                 410                 415

tct ttt tcg gcc gca gca cca ggc act tca gtt gat ttg aca ttg ttt    1296

Ser Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

            420                 425                 430

gaa gct ttc aat tcc att gct gca ttt gaa ctg aaa ggc agt aat tca    1344

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

        435                 440                 445

cag gat gtg gct gaa tca atc aga caa att cag cag cat gcg aag ctg    1392

Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu

    450                 455                 460

acg gca aag tat gtg ctg cca gta                                    1416

Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465                 470

<210>10

<211>1416

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌ATCC6633

<400>10

atg gag aga aaa aca gta ttg gtc atc gct gat ctt gga ggc tgc ccg  48

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

  1               5                  10                  15

ccg cac atg ttt tat aaa agc gct gct gaa aaa tat aac ctg gtt agc  96

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

             20                  25                  30

ttt att ccg aga cct ttt gca ata aca gcc tcc cat gca gca ctg att  144

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

         35                  40                  45

gaa aaa tac tcg gtc gcg gtc ata aaa gat aaa gac tat ttt cag agc  192

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Gln Ser

     50                  55                  60

tta gct gat ttt gag cat ccc gat tca att tat tgg gcg cat gag gat  240

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

 65                  70                  75                  80

cat gac aag cct gaa gaa gag gtt gtc gag caa atc gtc aag gtt gcc  288

His Asp Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

                 85                  90                  95

caa atg ttt gag gcg gac gcc atc aca aca aac aat gaa tta ttc att  336

Gln Met Phe Glu Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

            100                 105                 110

gcc ccg atg gcg aaa gcc tgt gaa cgc ctt ggc ctg agg ggc gcc gga  384

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

        115                 120                 125

gtg cag gca gcg gaa aat gcc aga gat aaa aat aaa atg agg gac gct  432

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

    130                 135                 140

ttt aat aag gcg gga gtc aaa tcg atc aaa aac aaa cga gtc aca act  480

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145                 150                 155                 160

ctt gag gat ttt cgt gct gca ctt gaa gag atc ggc aca cct cta atc    528

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

                165                 170                 175

tta aag cct aca tac tta gcg agt tca atc ggc gta acg ctg att acc    576

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

            180                 185                 190

gac acg gag acg gca gaa gat gaa ttt aac aga gtc aat gac tac ctg    624

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

        195                 200                 205

aaa tcg att aac gtg ccg aag gcg gtc aca ttt gaa gca ccg ttt att    672

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

    210                 215                 220

gct gag gaa ttt tta cag ggt gag tac gga gac tgg tat caa aca gaa    720

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225                 230                 235                 240

ggg tac tcc gac tat atc agc ata gaa ggc att atg gca gat ggt gag    768

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

                245                 250                 255

tat ttt ccg atc gcc att cat gac aaa acg ccg caa att gga ttt aca    816

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

            260                 265                 270

gag aca tca cat att acg cca tcc att ctg gat gaa gag gcg aaa aag    864

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

        275                 280                 285

aaa att gtc gaa gcg gct aaa aag gca aat gaa ggg ctt gga ctg caa    912

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

    290                 295                 300

aat tgc gca aca cat aca gaa atc aag cta atg aaa aac aga gaa ccg    960

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305                 310                 315                 320

ggt tta ata gag tcg gct gcc aga ttc gca ggc tgg aat atg att cct    1008

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

                325                 330                 335

aac att aaa aag gtt ttc ggc ctt gat atg gcg caa tta tta tta gat  1056

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

            340                 345                 350

gtt ctc tgt ttc gga aaa gat gct gat ctg ccg gac ggg tta ttg gat  1104

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

        355                 360                 365

caa gag cct tac tat gtt gct gac tgc cat ctg tac cct cag cat ttc  1152

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

    370                 375                 380

aaa caa aat ggc cag atc cct gaa act gcc gag gat ttg gta atc gaa  1200

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

385                 390                 395                 400

gcg atc gat att ccg gat ggg ctt ttg aag ggt gat aca gaa atc gtt  1248

Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

                405                 410                 415

act ttt tcg gct gcg gca cca gga aca tca gtt gat ttg aca ctg ttt  1296

Thr Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

            420                 425                 430

gaa gcc ttc aac tcc att gct gca ttt gaa ctg aaa ggc agc aat tca  1344

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

        435                 440                 445

cag gat gtg gct gaa tca atc aga caa att cag cag cat gcg aag ctg  1392

Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu

    450                 455                 460

acg gca aag tat gtg ctg cca gta                                  1416

Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465                 470

<210>11

<211>1416

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌IAM1213

<400>11

atg gag aga aaa aca gta ttg gtc atc gct gat ctt gga ggc tgc ccg    48

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

                  5                  10                  15

ccg cac atg ttt tat aaa agc gct gct gaa aaa tat aac ctg gtc agc    96

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

             20                  25                  30

ttt att cca aga cct ttt gca att aca gcc tcc cat gca gca ttg att    144

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

         35                  40                  45

gaa aaa tac tcg gtc gcg gtc ata aaa gat aaa gac tat ttt aag agt    192

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

     50                  55                  60

tta gct gat ttt gag cat cct gac tcc att tat tgg gcg cat gag gat    240

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

 65                  70                  75                  80

cat aac aag cct gag gaa gag gtc gtc gag caa atc gtc aag gtt gcc    288

His Asn Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

                 85                  90                  95

gaa atg ttt ggg gcg gat gcc atc aca aca aac aat gaa tta ttc att    336

Glu Met Phe Gly Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

            100                 105                 110

gct ccg atg gcg aaa gcc tgt gaa cgt ctg ggc ctg aga ggt gcc ggc    384

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

        115                 120                 125

gtg cag gca gcc gaa aat gcc aga gat aaa aat aaa atg agg gac gct    432

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

    130                 135                 140

ttt aat aag gcc gga gtc aaa tcg atc aaa aac aaa cga gtc aca act    480

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145                 150                 155                 160

ctc gaa gat ttc cgt gct gct ctt gaa gag atc ggc aca cct ctt atc    528

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

                165                 170                 175

tta aag cct aca tac tta gcg agt tca atc ggt gta acg ctg att acg    576

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

            180                 185                 190

gac act gag acg gca gaa gat gaa ttt aac aga gtc aat gac tat ctg    624

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

        195                 200                 205

aaa tca att aac gtg cca aag gcg gtt acg ttt gaa gcg ccg ttt atc    672

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

    210                 215                 220

gct gaa gaa ttt tta cag ggt gag tac gga gac tgg tat caa aca gaa    720

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225                 230                 235                 240

ggg tac tcc gac tat atc agt ata gaa ggc atc atg gct gac ggt gag    768

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

                245                 250                 255

tat ttc ccg atc gcc att cat gat aaa acg ccg caa atc ggg ttt aca    816

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

            260                 265                 270

gag aca tcc cac att acg ccg tcc att ctg gat gaa gag gca aaa aag    864

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

        275                 280                 285

aaa att gtc gaa gct gcc aaa aag gca aat gaa ggt ctt ggc ctg caa    912

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

    290                 295                 300

aat tgc gca aca cat aca gag atc aag cta atg aaa aat aga gaa ccg    960

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305                 310                 315                 320

ggt tta att gaa tcg gca gcc aga ttc gcc ggc tgg aat atg atc ccc    1008

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

                325                 330                 335

aat att aaa aag gtc ttt ggc ctt gat atg gcg caa tta tta tta gat    1056

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

            340                 345                 350

gtc ctt tgt ttc gga aaa gac gcc gat ctg ccg gac gga tta ttg gat    1104

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

        355                 360                 365

caa gag cct tat tat gtt gcc gac tgc cat ttg tac ccg caa cat ttc    1152

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

    370                 375                 380

aaa caa aat ggc cag att cca gaa act gct gag gat ttg gtc att gaa  1200

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

385                 390                 395                 400

gcg atc gat ctg cct gac ggg ctt tta aaa ggg gat act gag atc gtt  1248

Ala Ile Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

                405                 410                 415

tct ttt tcg gcc gca gca cca gga act tca gtt gat ttg aca ttg ttt  1296

Ser Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

            420                 425                 430

gaa gct ttc aat tcc att gct gca ttt gaa ctg aaa ggc agt aat tca  1344

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

        435                 440                 445

cag gat gtg gct gaa tca atc aga caa att cag cag cat gcg aag ctg  1392

Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu

    450                 455                 460

acg gca aag tat gtg ctg cca gta                                  1416

Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465                 470

<210>12

<211>1416

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌IAM1107

<400>12

atg gag aga aaa aca gta ttg gtc atc gct gat ctt gga ggc tgc ccg  48

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

  1               5                  10                  15

ccg cac atg ttt tat aaa agc gct gct gaa aaa tat aac ctg gtc agc  96

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

             20                  25                  30

ttt att cca aga cct ttt gca att aca gcc tcc cat gca gca ttg att  144

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

         35                  40                  45

gaa aaa tac tcg gtc gcg gtc gta aaa gat aaa gac tat ttt aag agt  192

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Val Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

     50                  55                  60

tta gct gat ttt gag cat cct gac tcc att tat tgg gcg cat gag gat    240

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

 65                  70                  75                  80

cat aac aag cct gag gaa gag gtc gtc gag caa atc gtc aag gtt gcc    288

His Asn Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

                 85                  90                  95

gaa atg ttc ggg gcg gat gcc atc aca aca aac aat gaa tta ttc att    336

Glu Met Phe Gly Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

            100                 105                 110

gct ccg atg gcg aaa gcc tgt gaa cgt ctg ggc ttg aga ggt gcc ggc    384

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

        115                 120                 125

gtg cag gca gcc gaa aat gcc aga gat aaa aat aaa atg agg gac gct    432

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

    130                 135                 140

ttt aat aag gcc gga gtc aaa tcg atc aaa aac aaa cga gtc aca act    480

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145                 150                 155                 160

ctt gaa gat ttc cgt gct gct ctt gaa gag atc ggc aca cct ctt atc    528

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

                165                 170                 175

tta aag cct aca tac tta gcg agt tct atc ggt gta acg ctg att acg    576

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

            180                 185                 190

gac act gag acg gca gaa gat gaa ttt aac aga gtc aat gac tat ctg    624

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

        195                 200                 205

aaa tca att aac gtg cca aag gcg gtt acg ttt gaa gcg ccg ttt atc    672

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

    210                 215                 220

gct gaa gaa ttt tta cag ggt gag tac gga gac tgg tat caa aca gaa    720

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225                 230                 235                 240

ggg tac tcc gac tat atc agt ata gaa ggc atc atg gct gac ggt gag    768

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

                245                 250                 255

tat ttc ccg atc gcc att cat gat aaa acg ccg caa atc ggg ttt aca    816

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

            260                 265                 270

gag aca tcc cac att acg ccg tcc att ctg gat gaa gag gca aaa aag    864

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

        275                 280                 285

aaa att gtc gaa gct gcc aaa aag gca aat gaa ggg ctt ggc ctg caa    912

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

    290                 295                 300

aat tgc gca aca cat aca gag gtc aag cta atg aaa aac aga gaa ccg    960

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Val Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305                 310                 315                 320

ggt tta att gaa tcg gca gcc aga ttt gcc ggc tgg aat atg atc cct    1008

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

                325                 330                 335

aac att aaa aag gtt ttc ggc ctt gat atg gcg caa tta tta tta gat    1056

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

            340                 345                 350

gtc ctc tgt ttc gga aaa gat gcc gat ctg ccg gac gga tta ttg gat    1104

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

        355                 360                 365

caa gag cct tac tat gtc gcc gac tgc cat ttg tac ccg cag cat ttc    1152

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

    370                 375                 380

aaa caa aat ggc cag att cca gaa acc gct gag gat ttg gtc att gaa    1200

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

385                 390                 395                 400

gcg atc gat att ccg gac ggg ctt tta aaa ggg gat act gaa atc ttt    1248

Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Phe

                405                 410                 415

tct ttt tcg gcc gca gca cca ggc act tca gtt gat ttg aca ttg ttt  1296

Ser Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

            420                 425                 430

gaa gct ttc aat tcc att gct gca ttt gaa ctg aaa ggc agt aat tca  1344

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

        435                 440                 445

cag gat gtg gct gaa tca atc aga caa att cag cag cat gcg aag ctg  1392

Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu

    450                 455                 460

acg gca aag tat gtg ctg cca gta                                  1416

Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465                 470

<210>13

<211>1416

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌IAM1214

<400>13

atg gag aga aaa aca gta ttg gtc atc gct gat ctt gga ggc tgc ccg  48

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

  1               5                  10                  15

ccg cac atg ttt tat aaa agc gct gct gaa aaa tat aac ctg gtt agc  96

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

             20                  25                  30

ttt att ccg aga cct ttt gca ata aca gcc tcc cat gca gca ctg att  144

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

         35                  40                  45

gaa aaa tac tcg gtc gcg gtc ata aaa gat aaa gac tat ttt cag agc  192

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Gln Ser

     50                  55                  60

tta gct gat ttt gag cat ccc gat tca att tat tgg gcg cat gag gat  240

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

 65                  70                  75                  80

cat gac aag cct gaa gaa gag gtt gtc gag caa atc gtc aag gtt gcc  288

His Asp Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

                 85                  90                  95

caa atg ttt gag gcg gac gcc atc aca aca aac aat gaa tta ttc att    336

Gln Met Phe Glu Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

            100                 105                 110

gcc ccg atg gcg aaa gcc tgt gaa cgc ctt ggc ctg agg ggc gcc gga    384

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

        115                 120                 125

gtg cag gca gcg gaa aat gcc aga gat aaa aat aaa atg agg gac gct    432

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

    130                 135                 140

ttt aat aag gcg gga gtc aaa tcg atc aaa aac aaa cga gtc aca act    480

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145                 150                 155                 160

ctt gag gat ttt cgt gct gca ctt gaa gag atc ggc aca cct cta atc    528

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

                165                 170                 175

tta aag cct aca tac tta gcg agt tca atc ggc gta acg ctg att acc    576

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

            180                 185                 190

gac acg gag acg gca gaa gat gaa ttt aac aga gtc aat gac tac ctg    624

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

        195                 200                 205

aaa tcg att aac gtg ccg aag gcg gtc aca ttt gaa gca ccg ttt att    672

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

    210                 215                 220

gct gag gaa ttt tta cag ggt gag tac gga gac tgg tat caa aca gaa    720

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225                 230                 235                 240

ggg tac tcc gac tat atc agc ata gaa ggc att atg gca gat ggt gag    768

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

                245                 250                 255

tat ttt ccg atc gcc att cat gac aaa acg ccg caa att gga ttt aca    816

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

            260                 265                 270

gag aca tca cat att acg cca tcc att ctg gat gaa gag gcg aaa aag    864

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

        275                 280                 285

aaa att gtc gaa gcg gct aaa aag gca aat gaa ggg ctt gga ctg caa    912

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

    290                 295                 300

aat tgc gca aca cat aca gaa atc aag cta atg aaa aac aga gaa ccg    960

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305                 310                 315                 320

ggt tta ata gag tcg gct gcc aga ttc gca ggc tgg aat atg att cct    1008

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

                325                 330                 335

aac att aaa aag gtt ttc ggc ctt gat atg gcg caa tta tta tta gat    1056

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

            340                 345                 350

gtt ctc tgt ttc gga aaa gat gct gat ctg ccg gac ggg tta ttg gat    1104

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

        355                 360                 365

caa gag cct tac tat gtt gct gac tgc cat ctg tac cct cag cat ttc    1152

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

    370                 375                 380

aaa caa aat ggc cag atc cct gaa act gcc gag gat ttg gta atc gaa    1200

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

385                 390                 395                 400

gcg atc gat att ccg gat ggg ctt ttg aag ggt gat aca gaa atc gtt    1248

Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

                405                 410                 415

act ttt tcg gct gcg gca cca gga aca tca gtt gat ttg aca ctg ttt    1296

Thr Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

            420                 425                 430

gaa gcc ttc aac tcc att gct gca ttt gaa ctg aaa ggc agc aat tca    1344

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

        435                 440                 445

cag gat gtg gct gaa tca atc aga caa att cag cag cat gcg aag ctg    1392

Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu

    450                 455                 460

acg gca aag tat gtg ctg cca gta                                    1416

Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465                 470

<210>14

<211>1416

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌ATCC21555

<400>14

atg gag aga aaa aca gta ttg gtt atc gct gat ctt ggg ggc tgc ccg    48

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

  1               5                  10                  15

ccg cat atg ttt tac aaa agc gca gcc gaa aaa tac aac ctc gtc agc    96

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

             20                  25                  30

ttt att ccg aga ccc ttt gca att aca gcc tct cat gcg gcc tta att    144

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

         35                  40                  45

gaa aaa tac tcg att gcg gtc att aaa gat aaa gac tat ttt aag agt    192

Glu Lys Tyr Ser Ile Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

     50                  55                  60

ctg gct gat ttt gaa cat ccc gat tcg att tat tgg gct cat gaa gat    240

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

 65                  70                  75                  80

cat gac aaa cct gag gaa gaa gtc gtc gaa gaa atc gtg aaa gtg gcc    288

His Asp Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Glu Ile Val Lys Val Ala

                 85                  90                  95

gac atg ttt ggg gtt gac gcc att acg acc aac aat gaa ctg ttt atc    336

Asp Met Phe Gly Val Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

            100                 105                 110

gct ccg atg gca aaa gcg tgt aaa cgt ctc ggc ctg cgg gga gcg ggc    384

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Lys Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

        115                 120                 125

gta cag gcc gct gaa aac gcc aga gat aaa aat aaa atg aga gcc gcc    432

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Ala Ala

    130                 135                 140

ttc aac cgg gcc ggc gtc aaa tcc atc aaa aac aaa cgg gtg acg acc    480

Phe Asn Arg Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145                 150                 155                 160

ctg gaa gat ttc cgc gcc gcg ctt cag gaa atc gga acg ccg ctt att    528

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Gln Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

                165                 170                 175

ctg aag cct aca tat ctg gca agc tcg atc ggc gtg acg ctt att aaa    576

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Lys

            180                 185                 190

gag atg gaa acg gcc gaa gct gaa ttc aac aga gtc aat gag tac ttg    624

Glu Met Glu Thr Ala Glu Ala Glu Phe Asn Arg Val Asn Glu Tyr Leu

        195                 200                 205

aaa tcg att aat gta ccg aaa gcg gtg acg ttt gaa gcg ccg ttt atc    672

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

    210                 215                 220

gcg gaa gaa ttc ttg cag ggc gag tat gat gac tgg tac gaa aca agc    720

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Asp Asp Trp Tyr Glu Thr Ser

225                 230                 235                 240

ggt tat tcc gac tat atc agc atc gaa ggc atc atg gcc gac gga gaa    768

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

                245                 250                 255

tac ttc ccc gtt gcg atc cat gat aaa aca ccg caa atc gga ttc acg    816

Tyr Phe Pro Val Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

            260                 265                 270

gag aca gcg cat att acg ccg tcc atc ctg gat gat gac gcc aag cgg    864

Glu Thr Ala His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Asp Asp Ala Lys Arg

        275                 280                 285

aaa atc gtc gaa gct gcc aag aag gcg aat gaa gga ctc ggc ctc gaa    912

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Glu

    290                 295                 300

aac tgt gca acg cat aca gaa ata aaa tta atg aaa aac cgg gaa gcc    960

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Ala

305                 310                 315                 320

gga ctg att gag tca gcg gcc aga ttc gcg gga tgg aat atg att ccg    1008

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

                325                 330                 335

aat att aaa aag gtc ttc ggc gtt gat atg gcg cag cta tta ttg gat    1056

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Val Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

        340                 345                 350

gtt ctc tgt tac gga aaa gaa gct gat ctg ccg aaa gga tta ttg gag    1104

Val Leu Cys Tyr Gly Lys Glu Ala Asp Leu Pro Lys Gly Leu Leu Glu

        355                 360                 365

cag gag cca tgc tat gtc gca gac tgc cac ttg tat cct cag cat ttc    1152

Gln Glu Pro Cys Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

    370                 375                 380

aaa gag aac ggc cag ctg cct gag acg gtt gtc gat ttc gtc att gaa    1200

Lys Glu Asn Gly Gln Leu Pro Glu Thr Val Val Asp Phe Val Ile Glu

385                 390                 395                 400

agc att gaa att cct gac ggc gtc tta aag gga gac act gaa ctc gtt    1248

Ser Ile Glu Ile Pro Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Thr Glu Leu Val

                405                 410                 415

tct ttc tca gcg gct gag gcg ggt acg tca gtg gat ctg cgg ctg ttc    1296

Ser Phe Ser Ala Ala Glu Ala Gly Thr Ser Val Asp Leu Arg Leu Phe

            420                 425                 430

gaa gcg ttc aac agc att gcg gcg ttt gag ctg aaa gga agc aat tcg    1344

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

        435                 440                 445

aac gac gtg gcc gaa tca atc aaa caa att cag cag cag gcg aag ctg    1392

Asn Asp Val Ala Glu Ser Ile Lys Gln Ile Gln Gln Gln Ala Lys Leu

    450                 455                 460

act gca aag tat gcg tta tcg gta                                    1416

Thr Ala Lys Tyr Ala Leu Ser Val

<210>15

<211>1416

<212>DNA

<213>解淀粉芽孢杆菌IFO3022

<400>15

atg gag aga aaa aca gta ttg gtt atc gct gac ctt ggg gga tgc ccg  48

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

  1               5                  10                  15

ccg cat atg ttt tac aaa agc gca gcc gaa aaa tac aac ctc gtc agc  96

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

             20                  25                  30

ttt att ccg aga cct ttt gca att aca gcc tct cat gcg gca tta att  144

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

         35                  40                  45

gaa aaa tac tcg gtc gcg gtc ata aaa gat aaa gac tat ttt aag agt  192

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

     50                  55                  60

ctg gct gat ttt gag cat ccc gat tcg att tac tgg gct cat gaa gat  240

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

 65                  70                  75                  80

cat gac aaa cct gag gaa gaa gta gtc gaa gaa atc gtc aag gtg gcc  288

His Asp Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Glu Ile Val Lys Val Ala

                 85                  90                  95

ggc atg ttc gcg gtt gac gcc att acg acc aac aat gaa ctg ttt atc  336

Gly Met Phe Ala Val Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

            100                 105                 110

gct ccg atg gca aaa gcg tgt gaa cgt ctc ggc ctg cgg gga gcg ggc  384

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

        115                 120                 125

gta cag gcc gct gaa aat gcc aga gat aaa aac aaa atg aga gcc gct  432

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Ala Ala

    130                 135                 140

ttc aac cgg gcc ggc gtc aag tct atc aaa aac aga cgg gtg acg acg  480

Phe Asn Arg Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Arg Arg Val Thr Thr

145                 150                 155                 160

ctg gaa gat ttc cgc gcc gcg ctt cag gaa atc gga acg ccg ctc att  528

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Gln Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

                165                 170                 175

ctg aag cct aca tat ctg gcg agc tcc atc ggc gtg acg ctc atc aaa    576

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Lys

            180                 185                 190

gag agg gaa acg gcc gaa gcc gaa ttt aac aga gtc aat gaa tac ctg    624

Glu Arg Glu Thr Ala Glu Ala Glu Phe Asn Arg Val Asn Glu Tyr Leu

        195                 200                 205

aag tcg atc aac gta ccg aaa gcg gtc acg ttt gaa gcg ccg ttt atc    672

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

    210                 215                 220

gcg gaa gaa ttt ttg cag ggc gag tat gac gac tgg tac gaa aca agc    720

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Asp Asp Trp Tyr Glu Thr Ser

225                 230                 235                 240

ggt tat tcc gac tat atc agc ata gaa ggc atc atg gcc gac gga gaa    768

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

                245                 250                 255

tac ttc cct gtc gca att cat gat aaa aca ccg caa atc gga ttc acg    816

Tyr Phe Pro Val Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

            260                 265                 270

gag aca tcg cat att acg ccg tcc atc ctg gat gat gac gcg aag cgg    864

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Asp Asp Ala Lys Arg

        275                 280                 285

aaa atc gtc gaa gca gcc aaa aag gcg aat gaa gga ctc ggc ctc gaa    912

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Glu

    290                 295                 300

aac tgc gca acc cat aca gag att aaa tta atg aaa aac cgg gaa gcc    960

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Ala

305                 310                 315                 320

gga ctg att gaa tca gcg gca cga ttt gcg ggc tgg aac atg att ccg    1008

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

                325                 330                 335

aat att aaa aag gtc ttc ggc gtc gat atg gcg cag ctg tta ttg gat    1056

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Val Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

            340                 345                 350

gtt ctc tgt ttc gga aaa gaa gcc gat ctg ccg aaa gga tta ttg gag  1104

Val Leu Cys Phe Gly Lys Glu Ala Asp Leu Pro Lys Gly Leu Leu Glu

        355                 360                 365

cag gag ccg tgc tat gtc gcc gac tgc cac ttg tat cct cag cat ttc  1152

Gln Glu Pro Cys Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

    370                 375                 380

aaa gag aac ggc cag ctg cct gag acg gct gtc gat ttc gtc att gaa  1200

Lys Glu Asn Gly Gln Leu Pro Glu Thr Ala Val Asp Phe Val Ile Glu

385                 390                 395                 400

agc att gac att ccc gac ggc gtc tta aag gga gac acc gaa atc gtt  1248

Ser Ile Asp Ile Pro Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

                405                 410                 415

tct ttc tcg gcg gcc gag gcg ggt aca tcc gtg gat ctg cgg ctg ttc  1296

Ser Phe Ser Ala Ala Glu Ala Gly Thr Ser Val Asp Leu Arg Leu Phe

            420                 425                 430

gaa gcg ttc aac agc att gcg gcg ttc gag ctg aaa gga agc aat tcg  1344

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

        435                 440                 445

ggt gac gtg gcc gaa tca atc aaa caa att cag cag cag gcg aag ctg  1392

Gly Asp Val Ala Glu Ser Ile Lys Gln Ile Gln Gln Gln Ala Lys Leu

    450                 455                 460

act gca aag tat gcg tta ccg gta                                  1416

Thr Ala Lys Tyr Ala Leu Pro Val

<210>16

<211>1428

<212>DNA

<213>短小芽孢杆菌NRRL B-12025

<400>16

gtg ctt tca ttg agt aaa aaa act gta ctt gtc att gct gac tta gga    48

Val Leu Ser Leu Ser Lys Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly

  1               5                  10                  15

ggg tgc ccg ccc cat atg ttt tat gaa agc gtg gcg gca tca tac cat    96

Gly Cys Pro Pro His Met Phe Tyr Glu Ser Val Ala Ala Ser Tyr His

             20                  25                  30

atc gtt tct tat atc cca aga ccc ttt gcg att aca aag gga cat gcc    144

Ile Val Ser Tyr Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Lys Gly His Ala

         35                  40                  45

gag cta atc gaa aaa tac tcc att gcc gtc atc aaa gac cgt gat tat    192

Glu Leu Ile Glu Lys Tyr Ser Ile Ala Val Ile Lys Asp Arg Asp Tyr

     50                  55                  60

ttt gag aca cac cct tct ttt gaa cac cct gat tct att tac tgg gca    240

Phe Glu Thr His Pro Ser Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala

 65                  70                  75                  80

cat gat gat tat cca aaa tca gaa gaa gaa gtt gtg gaa gac ttc att    288

His Asp Asp Tyr Pro Lys Ser Glu Glu Glu Val Val Glu Asp Phe Ile

                 85                  90                  95

cga gta gct tcc ttt ttc aaa gca gat gca atc acg acc aat aat gaa    336

Arg Val Ala Ser Phe Phe Lys Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu

            100                 105                 110

tta ttc att gca ccg atg gca aag gcc gct gaa cgt ctt ggg cta cga    384

Leu Phe Ile Ala Pro Met Ala Lys Ala Ala Glu Arg Leu Gly Leu Arg

        115                 120                 125

ggt gcc ggt gtc aag gca gcc gaa atg gcg cgt gat aaa agc caa atg    432

Gly Ala Gly Val Lys Ala Ala Glu Met Ala Arg Asp Lys Ser Gln Met

    130                 135                 140

agg gct gca ttc aat gcc tct ggc gtc aaa gcg gtg aaa act cag cct    480

Arg Ala Ala Phe Asn Ala Ser Gly Val Lys Ala Val Lys Thr Gln Pro

145                 150                 155                 160

gtc acg act tta tct gat ttc caa caa gcc att gag tct atc gga aca    528

Val Thr Thr Leu Ser Asp Phe Gln Gln Ala Ile Glu Ser Ile Gly Thr

                165                 170                 175

ccg ctc att tta aag cct aca tat tta gcc agt tct att ggc gtc acc    576

Pro Leu Ile Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr

            180                 185                 190

ttg ttt cat gac aaa gcc gga agt gat gac ttg ttt tta caa gta caa    624

Leu Phe His Asp Lys Ala Gly Ser Asp Asp Leu Phe Leu Gln Val Gln

        195                 200                 205

tcg tat ttg gaa acc ata cca gtc cca gac gct gtc acg tat gaa gca    672

Ser Tyr Leu Glu Thr Ile Pro Val Pro Asp Ala Val Thr Tyr Glu Ala

    210                 215                 220

ccg ttt gtc gct gaa aca tat tta gag ggt gct tac gaa gat tgg tat    720

Pro Phe Val Ala Glu Thr Tyr Leu Glu Gly Ala Tyr Glu Asp Trp Tyr

225                 230                 235                 240

gaa gac gaa gga tat gct gat tat gtc agt gta gaa ggg ctg gtc gta    768

Glu Asp Glu Gly Tyr Ala Asp Tyr Val Ser Val Glu Gly Leu Val Val

                245                 250                 255

gag ggc gaa tat ctc cct ttt gtc ata cat gat aaa acc cct caa atc    816

Glu Gly Glu Tyr Leu Pro Phe Val Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile

            260                 265                 270

ggc ttt aca gaa acg gct cat atc act ccg acg atc tta gac aat gaa    864

Gly Phe Thr Glu Thr Ala His Ile Thr Pro Thr Ile Leu Asp Asn Glu

        275                 280                 285

gcc aag caa atc atc att gaa gca gca agg aag gca aat gaa ggg cta    912

Ala Lys Gln Ile Ile Ile Glu Ala Ala Arg Lys Ala Asn Glu Gly Leu

    290                 295                 300

ggt ctt gaa cat tgt gca acc cat aca gaa atc aaa ctc atg aaa aat    960

Gly Leu Glu His Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn

305                 310                 315                 320

cga gaa act gga ctg atc gag gca gcg gct cga ttc gct ggc tgg aat    1008

Arg Glu Thr Gly Leu Ile Glu Ala Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn

                325                 330                 335

atg atc ccg aat att aaa aaa gtc ttt ggc gtc gat atg gcg aag cta    1056

Met Ile Pro Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Val Asp Met Ala Lys Leu

            340                 345                 350

ttg att gat gta tta gtt gat ggt aaa aag gct gta ctg cca aaa cag    1104

Leu Ile Asp Val Leu Val Asp Gly Lys Lys Ala Val Leu Pro Lys Gln

        355                 360                 365

ctg ctt tct gga cat aca ttt tat gta gcg gac tgc cac ctg tac cct    1152

Leu Leu Ser Gly His Thr Phe Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro

    370                 375                 380

cag cat ttt aaa gag agt ggg ctt atc ccg cct gaa gcc aca cat att    1200

Gln His Phe Lys Glu Ser Gly Leu Ile Pro Pro Glu Ala Thr His Ile

385                 390                 395                 400

acc att gat cat gtg tct att ccg cag gaa gca ttc gtt gga gat act  1248

Thr Ile Asp His Val Ser Ile Pro Gln Glu Ala Phe Val Gly Asp Thr

                405                 410                 415

gcg att gtc agt caa tca ttc cct gcc aaa ggg act att gtg gat ctt  1296

Ala Ile Val Ser Gln Ser Phe Pro Ala Lys Gly Thr Ile Val Asp Leu

            420                 425                 430

gaa tta ttt gaa gct ttt aat gga atc gta tct ctt gaa tta aaa gga  1344

Glu Leu Phe Glu Ala Phe Asn Gly Ile Val Ser Leu Glu Leu Lys Gly

        435                 440                 445

tca tcc tca caa gat gtt gcc gcg tcc atc cgc aac att cag aaa cag  1392

Ser Ser Ser Gln Asp Val Ala Ala Ser Ile Arg Asn Ile Gln Lys Gln

    450                 455                 460

gca acg att cag tta atg gat gaa tta gtg aag gga                  1428

Ala Thr Ile Gln Leu Met Asp Glu Leu Val Lys Gly

465                 470                 475

<210>17

<211>93

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌168

<400>17

Gly Ala Gly Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met

  1               5                  10                  15

Arg Asp Ala Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg

             20                  25                  30

Val Thr Thr Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr

         35                  40                  45

Pro Leu Ile Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr

     50                  55                  60

Leu Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn

 65                  70                  75                  80

Asp Tyr Leu Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr

                 85                  90

<210>18

<211>279

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌168

<400>18

ggt gcc ggc gtg cag gca gcc gaa aat gcc aga gat aaa aat aaa atg  48

Gly Ala Gly Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met

  1               5                  10                  15

agg gac gct ttt aat aag gcc gga gtc aaa tcg atc aaa aac aaa cga  96

Arg Asp Ala Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg

             20                  25                  30

gtc aca act ctt gaa gat ttc cgt gct gct ctt gaa gag atc ggc aca  144

Val Thr Thr Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr

         35                  40                  45

cct ctt atc tta aag cct aca tac tta gcg agt tct atc ggt gta acg  192

Pro Leu Ile Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr

     50                  55                  60

ctg att acg gac act gag acg gca gaa gat gaa ttt aac aga gtc aat  240

Leu Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn

 65                  70                  75                  80

gac tat ctg aaa tca att aac gtg cca aag gcg gtt acg              279

Asp Tyr Leu Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr

                 85                  90

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>19

attctcgagt agagaaggag tgttttacat                       30

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>20

ttaggatcct catactggca gcacatactt        30

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>21

caagaattct catgtttgac agct              24

<210>22

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>22

taactcgaga ttcccttttt acgtgaac          28

<210>23

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>23

ttaaccatgg agagaaaaac agtattg           27

<210>24

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>24

atatggatcc tactggcagc acatactttg        30

<210>25

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>25

caccgcagac ggaggataca c                 21

<210>26

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>26

cggacgtcac ccaataatcg tg                22

<210>27

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>27

ccgatggcra aagcstgtra acg               23

<210>28

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>28

cggcagatcr gcdtcttttc c                 21

<210>29

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>29

gctaggtctt gaacattgtg caaccc            26

<210>30

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>30

ggtgttccga tagactcaat ggc               23

<210>31

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>31

catgccatgg agaaaaaaac tgtacttgtc attgctgact tagg       丂丂丂44

<210>32

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>32

cgcggatccc ttcactaatt catccattaa ctgaatcg    丂丂丂38

<210>33

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>UNSURE

<222>(3)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(4)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(9)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(10)

<223>Xaa表示选自Leu、Ile、Val、Met和Ala中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(11)

<223>Xaa表示Glu、Ser或Ala

<220>

<221>UNSURE

<222>(12)

<223>Xaa表示Gly、Ser或Ala

<220>

<223>人工序列的描述：用于数据库查找的氨基酸序列

<400>33

His Gly Xaa Xaa Gly Gln Asp Gly Xaa Xaa Xaa Xaa

5 10

<210>34

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>UNSURE

<222>(1)

<223>Xaa表示Leu Ile或Val

<220>

<221>UNSURE

<222>(2)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(3)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(4)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(5)

<223>Xaa表示Gly或Ala

<220>

<221>UNSURE

<222>(6)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(7)

<223>Xaa表示选自Gly、Ser、Ala、Ile和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(9)

<223>Xaa表示选自Leu、Ile、Val、Met、Cys和Ala中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(11)

<223>Xaa表示选自Leu、Ile、Val、Met、Phe和Ala中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(12)

<223>Xaa表示选自Leu、Ile、Val、Met、Phe和Ala中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(13)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(14)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(15)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(16)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(17)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(18)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(19)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(20)

<223>Xaa表示Leu、Ile或Val

<220>

<221>UNSURE

<222>(21)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(23)

<223>Xaa表示选自Leu、Ile、Val、Ala和Pro中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(25)

<223>Xaa表示Ser、Thr或Pro

<220>

<221>UNSURE

<222>(26)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(28)

<223>Xaa表示Gly或Ala

<220>

<223>人工序列的描述：用于数据库查找的氨基酸序列

<400>34

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

                  5                  10                  15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Asn Xaa Xaa Pro Xaa

             20                  25

<210>35

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>UNSURE

<222>(1)

<223>Xaa表示Leu Ile或Val

<220>

<221>UNSURE

<222>(2)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(3)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(4)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(5)

<223>Xaa表示Gly或Ala

<220>

<221>UNSURE

<222>(6)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(7)

<223>Xaa表示选自Gly、Ser、Ala、Ile和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(9)

<223>Xaa表示选自Leu、Ile、Val、Met、Cys和Ala中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(11)

<223>Xaa表示选自Leu、Ile、Val、Met、Phe和Ala中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(12)

<223>Xaa表示选自Leu、Ile、Val、Met、Phe和Ala中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(13)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(14)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(15)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(16)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(17)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(18)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(19)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(20)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(21)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(22)

<223>Xaa表示Leu、Ile或Val

<220>

<221>UNSURE

<222>(23)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(25)

<223>Xaa表示选自Leu、Ile、Val、Ala和Pro中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(27)

<223>Xaa表示Ser、Thr或Pro

<220>

<221>UNSURE

<222>(28)

<223>Xaa表示选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、

Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的任何氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(30)

<223>Xaa表示Gly或Ala

<220>

<223>人工序列的描述：用于数据库查找的氨基酸序列

<400>35

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

                  5                  10                  15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Asn Xaa Xaa Pro Xaa

         20                  25                  30

<210>36

<211>1416

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌ATCC 15245和枯草芽孢杆菌IAM 1033

<400>36

atg gag aga aaa aca gta ttg gtc atc gct gat ctt gga ggc tgc ccg    48

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

  1               5                  10                  15

ccg cac atg ttt tat aaa agc gct gct gaa aaa tat aac ctg gtc agc    96

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

             20                  25                  30

ttt att cca aga cct ttt gca att aca gcc tcc cat gca gca ttg att    144

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

         35                  40                  45

gaa aaa tac tcg gtc gcg gtc ata aaa gat aaa gac tat ttt aag agt    192

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

     50                  55                  60

tta gct gat ttt gag cat cct gat tcc att tat tgg gcg cat gag gat    240

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

 65                  70                  75                  80

cat aac aag cct gag gaa gag gtc gtc gag caa atc gtc aag gtt gcc    288

His Asn Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

                 85                  90                  95

gaa atg ttt ggg gcg gat gcc atc aca aca aac aat gaa tta ttc att    336

Glu Met Phe Gly Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

            100                 105                 110

gct ccg atg gcg aaa gcc tgt gaa cgt ctg ggc ctg aga ggt gcc ggc    384

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

        115                 120                 125

gtg cag gca gcc gaa aat gcc aga gat aaa aat aaa atg agg gac gct    432

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

    130                 135                 140

ttt aat aag gcc gga gtc aaa tcg atc aaa aac aaa cga gtc aca act    480

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145                 150                 155                 160

ctt gaa gat ttc cgt gct gct ctt gaa gag atc ggc aca cct ctt atc    528

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

                165                 170                 175

tta aag cct aca tac tta gcg agt tca atc ggt gta acg ctg att acg    576

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

            180                 185                 190

gac act gag acg gca gaa gat gaa ttt aac aga gtc aat gac tat ctg    624

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

        195                 200                 205

aaa tca att aac gtg cca aag gcg gtt acg ttt gaa gcg ccg ttt atc    672

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

    210                 215                 220

gct gaa gaa ttt tta cag ggt gag tac gga gac tgg tat caa aca gaa    720

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225                 230                 235                 240

ggg tac tcc gac tat atc agt ata gaa ggc atc atg gct gac ggt gag    768

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

                245                 250                 255

tat ttc ccg atc gcc att cat gat aaa acg ccg caa atc ggg ttt aca    816

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

            260                 265                 270

gag aca tcc cac att acg ccg tcc att ctg gat gaa gag gca aaa aag    864

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

        275                 280                 285

aaa att gtc gaa gct gcc aaa aag gca aat gaa ggg ctt ggc ctg caa    912

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

    290                 295                 300

aat tgc gca aca cat aca gag atc aag cta atg aaa aac aga gaa ccg    960

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305                 310                 315                 320

ggt tta ata gag tcg gca gcc aga ttc gca ggc tgg aat atg att cct    1008

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

                325                 330                 335

aat att aaa aag gtc ttt ggc ctt gat atg gcg caa tta tta tta gat    1056

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

            340                 345                 350

gtc ctc tgt ttc gga aaa gac gcc gat ctg ccg gac gga tta ttg gat  1104

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

        355                 360                 365

caa gag cct tat tat gtt gcc gac tgc cat ttg tac ccg cag cat ttc  1152

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

    370                 375                 380

aaa caa aat ggc cag att cca gaa acc gct gag gat ttg gtc att gaa  1200

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

385                 390                 395                 400

gcg atc gat att ccg gac ggg ctt tta aaa ggg gat act gaa atc gtt  1248

Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

                405                 410                 415

tca ttt tca gcc gca gca cca ggc act tca gtt gat ttg aca ttg ttt  1296

Ser Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

            420                 425                 430

gaa gct ttc aat tcc att gct gca ttt gaa ctg aaa ggc agt aat tca  1344

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

        435                 440                 445

cag gat gtg gct gaa tca atc aga caa att cag cag cat gca aag ctg  1392

Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu

    450                 455                 460

acg gca aag tat gtg ctg cca gta                                  1416

Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465                 470

<210>37

<211>239

<212>PRT

<213>诺尔斯氏链霉菌IFO 15452(Streptomyces noursei IFO15452)

<400>37

Met Leu Ala Gly Leu Val Pro Ala Pro Asp His Gly Met Arg Glu Glu

  1               5                  10                  15

Ile Leu Gly Asp Arg Ser Arg Leu Ile Arg Gln Arg Gly Glu His Ala

             20                  25                  30

Leu Ile Gly Ile Ser Ala Gly Asn Ser Tyr Phe Ser Gln Lys Asn Thr

         35                  40                  45

Val Met Leu Leu Gln Trp Ala Gly Gln Arg Phe Glu Arg Thr Asp Val

     50                  55                  60

Val Tyr Val Asp Thr His Ile Asp Glu Met Leu Ile Ala Asp Gly Arg

 65                  70                  75                  80

Ser Ala Gln Glu Ala Glu Arg Ser Val Lys Arg Thr Leu Lys Asp Leu

                 85                  90                  95

Arg Arg Arg Leu Arg Arg Ser Leu Glu Ser Val Gly Asp His Ala Glu

            100                 105                 110

Arg Phe Arg Val Arg Ser Leu Ser Glu Leu Gln Glu Thr Pro Glu Tyr

        115                 120                 125

Arg Ala Val Arg Glu Arg Thr Asp Arg Ala Phe Glu Glu Asp Ala Glu

    130                 135                 140

Phe Ala Thr Ala Cys Glu Asp Met Val Arg Ala Val Val Met Asn Arg

145                 150                 155                 160

Pro Gly Asp Gly Val Gly Ile Ser Ala Glu His Leu Arg Ala Gly Leu

                165                 170                 175

Asn Tyr Val Leu Ala Glu Ala Pro Leu Phe Ala Asp Ser Pro Gly Val

            180                 185                 190

Phe Ser Val Pro Ser Ser Val Leu Cys Tyr His Ile Asp Thr Pro Ile

        195                 200                 205

Thr Ala Phe Leu Ser Arg Arg Glu Thr Gly Phe Arg Ala Ala Glu Gly

    210                 215                 220

Gln Ala Tyr Val Val Val Arg Pro Gln Glu Leu Ala Asp Ala Ala

225                 230                 235

<210>38

<211>239

<212>PRT

<213>Streptomyces alborus IFO15452

<400>38

Met Leu Ala Gly Leu Val Pro Ala Leu Asp His Ser Met Arg Glu Glu

  1               5                  10                  15

Ile Leu Gly Asn Arg Gly Arg Lys Ile Arg Gln Arg Gly Glu His Ala

             20                  25                  30

Leu Ile Gly Ile Ser Ala Gly Asn Ser Tyr Phe Ser Gln Lys Asn Val

         35                  40                  45

Thr Met Leu Leu Gln Trp Ala Gly Gln His Phe Glu Arg Thr Asp Val

     50                  55                  60

Val Tyr Val Asp Thr His Ile Asp Asp Met Leu Met Ala Asp Gly Arg

 65                  70                  75                  80

Ser Ala Gln Glu Ala Glu Lys Ser Val Lys Arg Thr Leu Lys Asp Leu

                 85                  90                  95

Arg Arg Arg Leu Arg Arg Ser Leu Glu Ser Val Gly Asp His Ser Glu

            100                 105                 110

Arg Phe Arg Val Arg Ser Leu Ser Glu Ile Gln Glu Thr Pro Glu Tyr

        115                 120                 125

Arg Ala Ala Arg Glu Ser Thr Asp Arg Ala Phe Arg Glu Asp Gly Glu

    130                 135                 140

Phe Ala Thr Val Cys Glu Glu Met Val Arg Ala Val Val Met Asn Arg

145                 150                 155                 160

Pro Gly Asp Gly Val Asp Ile Ser Glu Glu His Leu Arg Ala Gly Leu

                165                 170                 175

Asn Tyr Val Leu Ala Glu Ala Pro Leu Phe Ala Asp Ser Pro Gly Val

            180                 185                 190

Phe Ser Val Pro Ser Ser Val Leu Cys Tyr His Ile Pro Thr Pro Val

        195                 200                 205

Ser Thr Phe Leu Ala His Arg Glu Thr Gly Phe Gln Ala Ala Gln Gly

    210                 215                 220

Gln Ala Tyr Val Val Val Arg Pro Gln Glu Leu Ala Asp Ala Ala

225                 230                 235

<210>39

<211>717

<212>DNA

<213>诺尔斯氏链霉菌IFO 15452

<400>39

atg ctt gca ggc tta gtt ccc gcg ccg gac cac gga atg cgg gaa gaa  48

Met Leu Ala Gly Leu Val Pro Ala Pro Asp His Gly Met Arg Glu Glu

  1               5                  10                  15

ata ctt ggc gac cgc agc cga ttg atc cgg caa cgc ggt gag cac gcc  96

Ile Leu Gly Asp Arg Ser Arg Leu Ile Arg Gln Arg Gly Glu His Ala

             20                  25                  30

ctc atc gga atc agt gcg ggc aac agt tat ttc agc cag aag aac acc  144

Leu Ile Gly Ile Ser Ala Gly Asn Ser Tyr Phe Ser Gln Lys Asn Thr

         35                  40                  45

gtc atg ctg ctg caa tgg gcc ggg cag cgt ttc gag cgc acc gat gtc  192

Val Met Leu Leu Gln Trp Ala Gly Gln Arg Phe Glu Arg Thr Asp Val

     50                  55                  60

gtc tat gtc gac acc cac atc gac gag atg ctg atc gcc gac ggc cgc  240

Val Tyr Val Asp Thr His Ile Asp Glu Met Leu Ile Ala Asp Gly Arg

 65                  70                  75                  80

agc gcg cag gag gcc gag cgg tcg gtc aaa cgc acg ctc aag gat ctg  288

Ser Ala Gln Glu Ala Glu Arg Ser Val Lys Arg Thr Leu Lys Asp Leu

                 85                  90                  95

cgg cgc aga ctc cgg cgc tcg ctg gag agc gtg ggc gac cac gcc gag  336

Arg Arg Arg Leu Arg Arg Ser Leu Glu Ser Val Gly Asp His Ala Glu

            100                 105                 110

cgg ttc cgt gtc cgg tcc ctg tcc gag ctc cag gag acc cct gag tac  384

Arg Phe Arg Val Arg Ser Leu Ser Glu Leu Gln Glu Thr Pro Glu Tyr

        115                 120                 125

cgg gcc gta cgc gag cgc acc gac cgg gcc ttc gag gag gac gcc gaa  432

Arg Ala Val Arg Glu Arg Thr Asp Arg Ala Phe Glu Glu Asp Ala Glu

    130                 135                 140

ttc gcc acc gcc tgc gag gac atg gtg cgg gcc gtg gtg atg aac cgg  480

Phe Ala Thr Ala Cys Glu Asp Met Val Arg Ala Val Val Met Asn Arg

145                 150                 155                 160

ccc ggt gac ggc gtc ggc atc tcc gcg gaa cac ctg cgg gcc ggt ctg  528

Pro Gly Asp Gly Val Gly Ile Ser Ala Glu His Leu Arg Ala Gly Leu

                165                 170                 175

aac tac gtg ctg gcc gag gcc ccg ctc ttc gcg gac tcg ccc gga gtc    576

Asn Tyr Val Leu Ala Glu Ala Pro Leu Phe Ala Asp Ser Pro Gly Val

            180                 185                 190

ttc tcc gtc ccc tcc tcg gtg ctc tgc tac cac atc gac acc ccg atc    624

Phe Ser Val Pro Ser Ser Val Leu Cys Tyr His Ile Asp Thr Pro Ile

        195                 200                 205

acg gcg ttc ctg tcc cgg cgc gag acc ggt ttc cgg gcg gcc gag gga    672

Thr Ala Phe Leu Ser Arg Arg Glu Thr Gly Phe Arg Ala Ala Glu Gly

    210                 215                 220

cag gcg tac gtc gtc gtc agg ccc cag gag ctg gcc gac gcg gcc        717

Gln Ala Tyr Val Val Val Arg Pro Gln Glu Leu Ala Asp Ala Ala

225                 230                 235

<210>40

<211>717

<212>DNA

<213>Streptomyces alborus IFO15452

<400>40

atg ctt gca ggc tta gtt ccc gcg ctg gac cac agc atg cgg gaa gaa    48

Met Leu Ala Gly Leu Val Pro Ala Leu Asp His Ser Met Arg Glu Glu

  1               5                  10                  15

ata ctt ggc aat cgc ggc cga aag atc cgg caa cgc ggt gag cac gct    96

Ile Leu Gly Asn Arg Gly Arg Lys Ile Arg Gln Arg Gly Glu His Ala

             20                  25                  30

ctc att gga atc agt gcg ggc aac agt tat ttc agc cag aag aac gtc    144

Leu Ile Gly Ile Ser Ala Gly Asn Ser Tyr Phe Ser Gln Lys Asn Val

         35                  40                  45

acc atg ctg ctg caa tgg gcc ggg cag cat ttc gag cgc acg gat gtc    192

Thr Met Leu Leu Gln Trp Ala Gly Gln His Phe Glu Arg Thr Asp Val

     50                  55                  60

gtc tac gtg gac acg cac atc gac gac atg ctg atg gcg gac ggc cgc    240

Val Tyr Val Asp Thr His Ile Asp Asp Met Leu Met Ala Asp Gly Arg

 65                  70                  75                  80

agc gcg cag gaa gcc gag aag tcg gtc aag cgc acg ctc aag gat ctg  288

Ser Ala Gln Glu Ala Glu Lys Ser Val Lys Arg Thr Leu Lys Asp Leu

                 85                  90                  95

cgg cgc agg ctg cgg cgc tcg ttg gaa agc gtg ggc gac cac agc gag  336

Arg Arg Arg Leu Arg Arg Ser Leu Glu Ser Val Gly Asp His Ser Glu

            100                 105                 110

cgg ttc cgc gtc cgg tcc ctg tcc gag atc cag gag acc cct gag tac  384

Arg Phe Arg Val Arg Ser Leu Ser Glu Ile Gln Glu Thr Pro Glu Tyr

        115                 120                 125

cgg gcc gca cgc gag tcc acc gac cgg gcc ttc cgc gag gac ggc gag  432

Arg Ala Ala Arg Glu Ser Thr Asp Arg Ala Phe Arg Glu Asp Gly Glu

    130                 135                 140

ttc gcc acc gtc tgc gag gag atg gtg cgc gcc gtg gtg atg aac cgg  480

Phe Ala Thr Val Cys Glu Glu Met Val Arg Ala Val Val Met Asn Arg

145                 150                 155                 160

ccc ggt gac ggc gtc gac atc tcg gag gaa cac ctg cgg gcc ggt ctg  528

Pro Gly Asp Gly Val Asp Ile Ser Glu Glu His Leu Arg Ala Gly Leu

                165                 170                 175

aac tac gtg ctc gcc gag gcc ccg ctc ttc gcg gac tcg ccc ggc gtg  576

Asn Tyr Val Leu Ala Glu Ala Pro Leu Phe Ala Asp Ser Pro Gly Val

            180                 185                 190

ttc tcc gtc ccc tcg tcg gtg ctc tgc tac cac atc ccc acc ccg gta  624

Phe Ser Val Pro Ser Ser Val Leu Cys Tyr His Ile Pro Thr Pro Val

        195                 200                 205

tcg acg ttc ctg gcc cat cgc gag acc ggt ttc cag gcg gct cag ggt  672

Ser Thr Phe Leu Ala His Arg Glu Thr Gly Phe Gln Ala Ala Gln Gly

    210                 215                 220

cag gca tac gtc gtc gtc agg ccg cag gag ctg gcc gac gcg gcc      717

Gln Ala Tyr Val Val Val Arg Pro Gln Glu Leu Ala Asp Ala Ala

225                 230                 235

<210>41

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>41

agagccatgg gacttgcagg cttagttccc gc     32

<210>42

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>42

agagagatct ggccgcgtcg gccagctcc         29

<210>43

<211>1078

<212>PRT

<213>Brevibacillus brevis

<400>43

Met Leu Asn Ser Ser Lys Ser Ile Leu Ile His Ala Gln Asn Lys Asn

  1               5                  10                  15

Gly Thr His Glu Glu Glu Gln Tyr Leu Phe Ala Val Asn Asn Thr Lys

             20                  25                  30

Ala Glu Tyr Pro Arg Asp Lys Thr Ile His Gln Leu Phe Glu Glu Gln

         35                  40                  45

Val Ser Lys Arg Pro Asn Asn Val Ala Ile Val Cys Glu Asn Glu Gln

     50                  55                  60

Leu Thr Tyr His Glu Leu Asn Val Lys Ala Asn Gln Leu Ala Arg Ile

 65                  70                  75                  80

Phe Ile Glu Lys Gly Ile Gly Lys Asp Thr Leu Val Gly Ile Met Met

                 85                  90                  95

Glu Lys Ser Ile Asp Leu Phe Ile Gly Ile Leu Ala Val Leu Lys Ala

            100                 105                 110

Gly Gly Ala Tyr Val Pro Ile Asp Ile Glu Tyr Pro Lys Glu Val His

        115                 120                 125

Leu Ile His Asn Ile Gln Phe Asn Gly Gln Val Glu Ile Phe Glu Glu

    130                 135                 140

Asp Thr Ile Lys Ile Arg Glu Gly Thr Asn Leu His Val Pro Ser Lys

145                 150                 155                 160

Ser Thr Asp Leu Ala Tyr Val Ile Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Asn

                165                 170                 175

Pro Lys Gly Thr Met Leu Glu His Lys Gly Ile Ser Asn Leu Lys Val

            180                 185                 190

Phe Phe Glu Asn Ser Leu Asn Val Thr Glu Lys Asp Arg Ile Gly Gln

        195                 200                 205

Phe Ala Ser Ile Ser Phe Asp Ala Ser Val Trp Glu Met Phe Met Ala

    210                 215                 220

Leu Leu Thr Gly Ala Ser Leu Tyr Ile Ile Leu Lys Asp Thr Ile Asn

225                 230                 235                 240

Asp Phe Val Lys Phe Glu Gln Tyr Ile Asn Gln Lys Glu Ile Thr Val

                245                 250                 255

Ile Thr Leu Pro Pro Thr Tyr Val Val His Leu Asp Pro Glu Arg Ile

            260                 265                 270

Leu Ser Ile Gln Thr Leu Ile Thr Ala Gly Ser Ala Thr Ser Pro Ser

        275                 280                 285

Leu Val Asn Lys Trp Lys Glu Lys Val Thr Tyr Ile Asn Ala Tyr Gly

    290                 295                 300

Pro Thr Glu Thr Thr Ile Cys Ala Thr Thr Cys Val Ala Thr Lys Glu

305                 310                 315                 320

Thr Ile Gly His Ser Val Pro Ile Gly Ala Pro Ile Gln Asn Thr Gln

                325                 330                 335

Ile Tyr Ile Val Asp Glu Asn Leu Gln Leu Lys Ser Val Gly Glu Ala

            340                 345                 350

Gly Glu Leu Cys Ile Gly Gly Glu Gly Leu Ala Arg Gly Tyr Trp Lys

        355                 360                 365

Arg Pro Glu Leu Thr Ser Gln Lys Phe Val Asp Asn Pro Phe Val Pro

    370                 375                 380

Gly Glu Lys Leu Tyr Lys Thr Gly Asp Gln Ala Arg Trp Leu Ser Asp

385                 390                 395                 400

Gly Asn Ile Glu Tyr Leu Gly Arg Ile Asp Asn Gln Val Lys Ile Arg

                405                 410                 415

Gly His Arg Val Glu Leu Glu Glu Val Glu Ser Ile Leu Leu Lys His

            420                 425                 430

Met Tyr Ile Ser Glu Thr Ala Val Ser Val His Lys Asp His Gln Glu

        435                 440                 445

Gln Pro Tyr Leu Cys Ala Tyr Phe Val Ser Glu Lys His Ile Pro Leu

    450                 455                 460

Glu Gln Leu Arg Gln Phe Ser Ser Glu Glu Leu Pro Thr Tyr Met Ile

465                 470                 475                 480

Pro Ser Tyr Phe Ile Gln Leu Asp Lys Met Pro Leu Thr Ser Asn Gly

                485                 490                 495

Lys Ile Asp Arg Lys Gln Leu Pro Glu Pro Asp Leu Thr Phe Gly Met

            500                 505                 510

Arg Val Asp Tyr Glu Ala Pro Arg Asn Glu Ile Glu Glu Thr Leu Val

        515                 520                 525

Thr Ile Trp Gln Asp Val Leu Gly Ile Glu Lys Ile Gly Ile Lys Asp

    530                 535                 540

Asn Phe Tyr Ala Leu Gly Gly Asp Ser Ile Lys Ala Ile Gln Val Ala

545                 550                 555                 560

Ala Arg Leu His Ser Tyr Gln Leu Lys Leu Glu Thr Lys Asp Leu Leu

                565                 570                 575

Lys Tyr Pro Thr Ile Asp Gln Leu Val His Tyr Ile Lys Asp Ser Lys

            580                 585                 590

Arg Arg Ser Glu Gln Gly Ile Val Glu Gly Glu Ile Gly Leu Thr Pro

        595                 600                 605

Ile Gln His Trp Phe Phe Glu Gln Gln Phe Thr Asn Met His His Trp

    610                 615                 620

Asn Gln Ser Tyr Met Leu Tyr Arg Pro Asn Gly Phe Asp Lys Glu Ile

625                 630                 635                 640

Leu Leu Arg Val Phe Asn Lys Ile Val Glu His His Asp Ala Leu Arg

                645                 650                 655

Met Ile Tyr Lys His His Asn Gly Lys Ile Val Gln Ile Asn Arg Gly

            660                 665                 670

Leu Glu Gly Thr Leu Phe Asp Phe Tyr Thr Phe Asp Leu Thr Ala Asn

        675                 680                 685

Asp Asn Glu Gln Gln Val Ile Cys Glu Glu Ser Ala Arg Leu Gln Asn

    690                 695                 700

Ser Ile Asn Leu Glu Val Gly Pro Leu Val Lys Ile Ala Leu Phe His

705                 710                 715                 720

Thr Gln Asn Gly Asp His Leu Phe Met Ala Ile His His Leu Val Val

                725                 730                 735

Asp Gly Ile Ser Trp Arg Ile Leu Phe Glu Asp Leu Ala Thr Ala Tyr

            740                 745                 750

Glu Gln Ala Met His Gln Gln Thr Ile Ala Leu Pro Glu Lys Thr Asp

        755                 760                 765

Ser Phe Lys Asp Trp Ser Ile Glu Leu Glu Lys Tyr Ala Asn Ser Glu

    770                 775                 780

Leu Phe Leu Glu Glu Ala Glu Tyr Trp His His Leu Asn Tyr Tyr Thr

785                 790                 795                 800

Glu Asn Val Gln Ile Lys Lys Asp Tyr Val Thr Met Asn Asn Lys Gln

                805                 810                 815

Lys Asn Ile Arg Tyr Val Gly Met Glu Leu Thr Ile Glu Glu Thr Glu

            820                 825                 830

Lys Leu Leu Lys Asn Val Asn Lys Ala Tyr Arg Thr Glu Ile Asn Asp

        835                 840                 845

Ile Leu Leu Thr Ala Leu Gly Phe Ala Leu Lys Glu Trp Ala Asp Ile

    850                855                 860

Asp Lys Ile Val Ile Asn Leu Glu Gly His Gly Arg Glu Glu Ile Leu

865                 870                 875                 880

Glu Gln Met Asn Ile Ala Arg Thr Val Gly Trp Phe Thr Ser Gln Tyr

                885                 890                 895

Pro Val Val Leu Asp Met Gln Lys Ser Asp Asp Leu Ser Tyr Gln Ile

            900                 905                 910

Lys Leu Met Lys Glu Asn Leu Arg Arg Ile Pro Asn Lys Gly Ile Gly

        915                 920                 925

Tyr Glu Ile Phe Lys Tyr Leu Thr Thr Glu Tyr Leu Arg Pro Val Leu

    930                 935                 940

Pro Phe Thr Leu Lys Pro Glu Ile Asn Phe Asn Tyr Leu Gly Gln Phe

945                 950                 955                 960

Asp Thr Asp Val Lys Thr Glu Leu Phe Thr Arg Ser Pro Tyr Ser Met

                965                 970                 975

Gly Asn Ser Leu Gly Pro Asp Gly Lys Asn Asn Leu Ser Pro Glu Gly

            980                 985                 990

Glu Ser Tyr Phe Val Leu Asn Ile Asn Gly Phe Ile Glu Glu Gly Lys

        995                 1000                1005

Leu His Ile Thr Phe Ser Tyr Asn Glu Gln Gln Tyr Lys Glu Asp Thr

    1010                1015                1020

Ile Gln Gln Leu Ser Arg Ser Tyr Lys Gln His Leu Leu Ala Ile Ile

1025                1030                1035                1040

Glu His Cys Val Gln Lys Glu Asp Thr Glu Leu Thr Pro Ser Asp Phe

                1045                1050                1055

Ser Phe Lys Glu Leu Glu Leu Glu Glu Met Asp Asp Ile Phe Asp Leu

            1060                1065                1070

Leu Ala Asp Ser Leu Thr

        1075

<210>44

<211>3234

<212>DNA

<213>Brevibacillus brevis

<400>44

atg tta aac agt tct aaa agt ata ttg att cat gct caa aat aaa aat    48

Met Leu Asn Ser Ser Lys Ser Ile Leu Ile His Ala Gln Asn Lys Asn

  1               5                  10                  15

gga acg cat gaa gag gag cag tat ctc ttt gct gtg aac aac acc aaa    96

Gly Thr His Glu Glu Glu Gln Tyr Leu Phe Ala Val Asn Asn Thr Lys

             20                  25                  30

gcg gag tat cca cgt gat aag acg atc cat cag tta ttt gaa gag cag    144

Ala Glu Tyr Pro Arg Asp Lys Thr Ile His Gln Leu Phe Glu Glu Gln

         35                  40                  45

gtt agt aag aga cca aac aat gta gcc att gta tgt gaa aat gag caa    192

Val Ser Lys Arg Pro Asn Asn Val Ala Ile Val Cys Glu Asn Glu Gln

     50                  55                  60

ctt acc tac cat gag ctt aat gtg aaa gcc aat caa cta gca cgg att    240

Leu Thr Tyr His Glu Leu Asn Val Lys Ala Asn Gln Leu Ala Arg Ile

 65                  70                  75                  80

ttt ata gaa aaa ggg att gga aaa gac act ctt gtt gga att atg atg    288

Phe Ile Glu Lys Gly Ile Gly Lys Asp Thr Leu Val Gly Ile Met Met

                 85                  90                  95

gag aaa tct atc gat tta ttt ata ggc ata tta gcc gtt tta aaa gca    336

Glu Lys Ser Ile Asp Leu Phe Ile Gly Ile Leu Ala Val Leu Lys Ala

            100                 105                 110

ggt gga gca tat gtt ccg att gat att gaa tat cct aag gaa gtt cat    384

Gly Gly Ala Tyr Val Pro Ile Asp Ile Glu Tyr Pro Lys Glu Val His

        115                 120                 125

tta att cat aat att caa ttt aat ggg caa gtg gaa att ttt gaa gaa    432

Leu Ile His Asn Ile Gln Phe Asn Gly Gln Val Glu Ile Phe Glu Glu

    130                 135                 140

gat act atc aaa att aga gaa gga act aat cta cat gta cca agt aaa    480

Asp Thr Ile Lys Ile Arg Glu Gly Thr Asn Leu His Val Pro Ser Lys

145                 150                 155                 160

tca acc gat ctt gct tat gtt att tat act tct ggt aca aca ggc aat    528

Ser Thr Asp Leu Ala Tyr Val Ile Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Asn

                165                 170                 175

cca aaa ggt aca atg ctg gag cat aaa gga ata agt aat cta aag gta    576

Pro Lys Gly Thr Met Leu Glu His Lys Gly Ile Ser Asn Leu Lys Val

            180                 185                 190

ttt ttc gaa aat agt ctt aac gtg act gaa aag gat aga att ggt caa    624

Phe Phe Glu Asn Ser Leu Asn Val Thr Glu Lys Asp Arg Ile Gly Gln

        195                 200                 205

ttt gcc agc atc tct ttt gat gca tct gta tgg gag atg ttt atg gct    672

Phe Ala Ser Ile Ser Phe Asp Ala Ser Val Trp Glu Met Phe Met Ala

    210                 215                 220

ttg tta acg ggg gct agc ctg tat att atc ctg aag gat aca atc aat    720

Leu Leu Thr Gly Ala Ser Leu Tyr Ile Ile Leu Lys Asp Thr Ile Asn

225                 230                 235                 240

gat ttt gtg aag ttt gaa caa tac att aac caa aag gaa atc act gtt    768

Asp Phe Val Lys Phe Glu Gln Tyr Ile Asn Gln Lys Glu Ile Thr Val

                245                 250                 255

att acg tta cca cct acc tat gta gtt cat ctt gat cca gaa cgt att    816

Ile Thr Leu Pro Pro Thr Tyr Val Val His Leu Asp Pro Glu Arg Ile

            260                 265                 270

tta tcg ata caa acg tta att aca gca ggc tca gct acc tcg cct tcc    864

Leu Ser Ile Gln Thr Leu Ile Thr Ala Gly Ser Ala Thr Ser Pro Ser

        275                 280                 285

tta gta aac aag tgg aag gag aaa gta act tac ata aat gcc tat ggc    912

Leu Val Asn Lys Trp Lys Glu Lys Val Thr Tyr Ile Asn Ala Tyr Gly

    290                 295                 300

cct acg gaa aca act att tgt gcg act aca tgc gta gcc acc aaa gaa    960

Pro Thr Glu Thr Thr Ile Cys Ala Thr Thr Cys Val Ala Thr Lys Glu

305                 310                 315                 320

aca ata ggt cat tca gtt cca atc gga gca cca att caa aat aca caa    1008

Thr Ile Gly His Ser Val Pro Ile Gly Ala Pro Ile Gln Asn Thr Gln

                325                 330                 335

att tat att gtc gat gaa aat ctt caa tta aaa tcg gtt ggt gaa gct    1056

Ile Tyr Ile Val Asp Glu Asn Leu Gln Leu Lys Ser Val Gly Glu Ala

            340                 345                 350

ggt gaa ttg tgt att ggt gga gaa ggg tta gca agg gga tat tgg aag    1104

Gly Glu Leu Cys Ile Gly Gly Glu Gly Leu Ala Arg Gly Tyr Trp Lys

        355                 360                 365

cga ccg gaa tta act tcc cag aag ttc gtt gat aac ccg ttt gtt cca    1152

Arg Pro Glu Leu Thr Ser Gln Lys Phe Val Asp Asn Pro Phe Val Pro

    370                 375                 380

gga gag aag ttg tat aaa aca gga gat cag gca aga tgg cta tct gat    1200

Gly Glu Lys Leu Tyr Lys Thr Gly Asp Gln Ala Arg Trp Leu Ser Asp

385                 390                 395                 400

gga aat att gaa tat ctc gga aga ata gat aac cag gta aag att aga    1248

Gly Asn Ile Glu Tyr Leu Gly Arg Ile Asp Asn Gln Val Lys Ile Arg

                405                 410                 415

ggt cac cga gtt gaa cta gaa gaa gtt gag tct att ctt cta aag cat    1296

Gly His Arg Val Glu Leu Glu Glu Val Glu Ser Ile Leu Leu Lys His

            420                 425                 430

atg tat att agc gaa act gca gta agt gtg cat aaa gat cac caa gaa    1344

Met Tyr Ile Ser Glu Thr Ala Val Ser Val His Lys Asp His Gln Glu

        435                 440                 445

cag ccg tat ttg tgc gct tat ttt gta tcg gaa aag cat ata cca cta    1392

Gln Pro Tyr Leu Cys Ala Tyr Phe Val Ser Glu Lys His Ile Pro Leu

    450                 455                 460

gaa cag tta aga caa ttc tca tca gaa gaa ctg cca acg tat atg atc    1440

Glu Gln Leu Arg Gln Phe Ser Ser Glu Glu Leu Pro Thr Tyr Met Ile

465                 470                 475                 480

cct tct tat ttt atc cag tta gac aaa atg ccg ctt aca tca aat ggg    1488

Pro Ser Tyr Phe Ile Gln Leu Asp Lys Met Pro Leu Thr Ser Asn Gly

                485                 490                 495

aag att gat cga aag cag ttg ccg gaa cct gat tta act ttc ggg atg    1536

Lys Ile Asp Arg Lys Gln Leu Pro Glu Pro Asp Leu Thr Phe Gly Met

            500                 505                 510

agg gta gac tat gaa gcg ccg cga aat gaa atc gag gaa acg ctt gtt    1584

Arg Val Asp Tyr Glu Ala Pro Arg Asn Glu Ile Glu Glu Thr Leu Val

        515                 520                 525

act atc tgg cag gat gta tta ggt att gag aaa atc ggt att aaa gat    1632

Thr Ile Trp Gln Asp Val Leu Gly Ile Glu Lys Ile Gly Ile Lys Asp

    530                 535                 540

aat ttc tat gca tta ggt gga gat tct att aaa gca ata cag gtt gct    1680

Asn Phe Tyr Ala Leu Gly Gly Asp Ser Ile Lys Ala Ile Gln Val Ala

545                 550                 555                 560

gct cgc ctg cat tcc tac caa tta aag cta gaa aca aaa gat tta tta    1728

Ala Arg Leu His Ser Tyr Gln Leu Lys Leu Glu Thr Lys Asp Leu Leu

                565                 570                 575

aag tat cca aca atc gat caa ctc gtt cat tat ata aaa gat agt aaa    1776

Lys Tyr Pro Thr Ile Asp Gln Leu Val His Tyr Ile Lys Asp Ser Lys

            580                 585                 590

aga aga agt gag caa ggt att gtg gaa ggt gag att gga ctt aca cct    1824

Arg Arg Ser Glu Gln Gly Ile Val Glu Gly Glu Ile Gly Leu Thr Pro

        595                 600                 605

att cag cat tgg ttc ttt gaa caa caa ttt aca aat atg cac cat tgg    1872

Ile Gln His Trp Phe Phe Glu Gln Gln Phe Thr Asn Met His His Trp

    610                 615                 620

aac caa tcg tat atg ttg tat aga cca aat ggg ttt gat aaa gag atc    1920

Asn Gln Ser Tyr Met Leu Tyr Arg Pro Asn Gly Phe Asp Lys Glu Ile

625                 630                 635                 640

ttg cta agg gta ttt aat aaa att gtt gag cat cat gat gca tta cgt    1968

Leu Leu Arg Val Phe Asn Lys Ile Val Glu His His Asp Ala Leu Arg

                645                 650                 655

atg ata tac aaa cat cat aac gga aag atc gtg cag ata aat cgg ggg    2016

Met Ile Tyr Lys His His Asn Gly Lys Ile Val Gln Ile Asn Arg Gly

            660                 665                 670

ctt gaa ggt acg ttg ttt gat ttt tat acc ttt gat tta act gca aat    2064

Leu Glu Gly Thr Leu Phe Asp Phe Tyr Thr Phe Asp Leu Thr Ala Asn

        675                 680                 685

gat aat gag caa cag gtg att tgt gaa gaa tct gct cga tta caa aat    2112

Asp Asn Glu Gln Gln Val Ile Cys Glu Glu Ser Ala Arg Leu Gln Asn

    690                 695                 700

agt ata aac ttg gaa gta ggc cct cta gta aag ata gcg ctg ttt cat    2160

Ser Ile Asn Leu Glu Val Gly Pro Leu Val Lys Ile Ala Leu Phe His

705                 710                 715                 720

act cag aat gga gat cac ctg ttt atg gct att cat cat ttg gtt gtg    2208

Thr Gln Asn Gly Asp His Leu Phe Met Ala Ile His His Leu Val Val

                725                 730                 735

gat ggt att tct tgg agg att ttg ttt gag gat ttg gcc aca gct tat    2256

Asp Gly Ile Ser Trp Arg Ile Leu Phe Glu Asp Leu Ala Thr Ala Tyr

            740                 745                 750

gaa caa gca atg cat cag caa acg att gct tta cca gag aaa aca gat    2304

Glu Gln Ala Met His Gln Gln Thr Ile Ala Leu Pro Glu Lys Thr Asp

        755                 760                 765

tca ttt aag gac tgg tct att gaa tta gaa aaa tat gcg aac agc gaa    2352

Ser Phe Lys Asp Trp Ser Ile Glu Leu Glu Lys Tyr Ala Asn Ser Glu

    770                 775                 780

tta ttc cta gaa gaa gct gaa tat tgg cat cat ttg aat tat tat acc    2400

Leu Phe Leu Glu Glu Ala Glu Tyr Trp His His Leu Asn Tyr Tyr Thr

785                 790                 795                 800

gag aac gtt caa att aag aaa gat tat gtc acc atg aac aat aaa caa    2448

Glu Asn Val Gln Ile Lys Lys Asp Tyr Val Thr Met Asn Asn Lys Gln

                805                 810                 815

aag aat ata cgt tat gta gga atg gag tta aca ata gaa gag aca gaa    2496

Lys Asn Ile Arg Tyr Val Gly Met Glu Leu Thr Ile Glu Glu Thr Glu

            820                 825                 830

aaa tta ttg aaa aat gta aat aaa gcg tat cga aca gaa att aat gat    2544

Lys Leu Leu Lys Asn Val Asn Lys Ala Tyr Arg Thr Glu Ile Asn Asp

        835                 840                 845

att tta tta acg gca ctt ggc ttt gca ctc aaa gaa tgg gcc gat att    2592

Ile Leu Leu Thr Ala Leu Gly Phe Ala Leu Lys Glu Trp Ala Asp Ile

    850                 855                 860

gat aaa att gta att aac tta gag gga cac gga cgg gaa gaa ata ctg    2640

Asp Lys Ile Val Ile Asn Leu Glu Gly His Gly Arg Glu Glu Ile Leu

865                 870                 875                 880

gaa cag atg aac att gca agg acg gta ggc tgg ttt act tcc cag tat    2688

Glu Gln Met Asn Ile Ala Arg Thr Val Gly Trp Phe Thr Ser Gln Tyr

                885                 890                 895

cct gtt gta ctt gat atg caa aaa tcg gat gat ttg tct tat caa atc    2736

Pro Val Val Leu Asp Met Gln Lys Ser Asp Asp Leu Ser Tyr Gln Ile

            900                 905                 910

aaa tta atg aaa gaa aat tta cgc aga ata cct aac aaa gga atc gga    2784

Lys Leu Met Lys Glu Asn Leu Arg Arg Ile Pro Asn Lys Gly Ile Gly

        915                 920                 925

tat gaa att ttt aag tat tta aca act gaa tat tta cgg cct gtt tta    2832

Tyr Glu Ile Phe Lys Tyr Leu Thr Thr Glu Tyr Leu Arg Pro Val Leu

    930                 935                 940

ccc ttt aca tta aag ccg gaa att aac ttt aac tac tta gga cag ttc    2880

Pro Phe Thr Leu Lys Pro Glu Ile Asn Phe Asn Tyr Leu Gly Gln Phe

945                 950                 955                 960

gat acg gac gtg aag act gaa ttg ttt act cgt tct cct tat agc atg    2928

Asp Thr Asp Val Lys Thr Glu Leu Phe Thr Arg Ser Pro Tyr Ser Met

                965                 970                 975

ggt aat tca tta gga cca gat gga aaa aat aat tta agc cca gaa ggg    2976

Gly Asn Ser Leu Gly Pro Asp Gly Lys Asn Asn Leu Ser Pro Glu Gly

            980                 985                 990

gaa agt tat ttt gta ctc aat att aat ggt ttt att gaa gaa ggt aag    3024

Glu Ser Tyr Phe Val Leu Asn Ile Asn Gly Phe Ile Glu Glu Gly Lys

        995                 1000                1005

ctt cac atc acc ttt tct tat aat gaa cag cag tat aag gag gat acc    3072

Leu His Ile Thr Phe Ser Tyr Asn Glu Gln Gln Tyr Lys Glu Asp Thr

    1010                1015                1020

att cag caa ttg agc cgg agc tat aag caa cat ctt ttg gce atc att    3120

Ile Gln Gln Leu Ser Arg Ser Tyr Lys Gln His Leu Leu Ala Ile Ile

1025                1030                1035                1040

gaa cat tgt gta cag aag gaa gat act gag tta act cca agt gat ttc    3168

Glu His Cys Val Gln Lys Glu Asp Thr Glu Leu Thr Pro Ser Asp Phe

                1045                1050                1055

agt ttc aag gaa ctt gaa tta gaa gag atg gat gat att ttc gat ttg    3216

Ser Phe Lys Glu Leu Glu Leu Glu Glu Met Asp Asp Ile Phe Asp Leu

            1060                1065                1070

ttg gcc gat tca tta acg                 3234

Leu Ala Asp Ser Leu Thr

        1075

<210>45

<211>503

<212>PRT

<213>大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)

<400>45

Met Glu Phe Ser Val Lys Ser Gly Ser Pro Glu Lys Gln Arg Ser Ala

  1               5                  10                  15

Cys Ile Val Val Gly Val Phe Glu Pro Arg Arg Leu Ser Pro Ile Ala

             20                  25                  30

Glu Gln Leu Asp Lys Ile Ser Asp Gly Tyr Ile Ser Ala Leu Leu Arg

         35                  40                  45

Arg Gly Glu Leu Glu Gly Lys Pro Gly Gln Thr Leu Leu Leu His His

     50                  55                  60

Val Pro Asn Val Leu Ser Glu Arg Ile Leu Leu Ile Gly Cys Gly Lys

 65                  70                  75                  80

Glu Arg Glu Leu Asp Glu Arg Gln Tyr Lys Gln Val Ile Gln Lys Thr

                 85                  90                  95

Ile Asn Thr Leu Asn Asp Thr Gly Ser Met Glu Ala Val Cys Phe Leu

            100                 105                 110

Thr Glu Leu His Val Lys Gly Arg Asn Asn Tyr Trp Lys Val Arg Gln

        115                 120                 125

Ala Val Glu Thr Ala Lys Glu Thr Leu Tyr Ser Phe Asp Gln Leu Lys

    130                 135                 140

Thr Asn Lys Ser Glu Pro Arg Arg Pro Leu Arg Lys Met Val Phe Asn

145                 150                 155                 160

Val Pro Thr Arg Arg Glu Leu Thr Ser Gly Glu Arg Ala Ile Gln His

                165                 170                 175

Gly Leu Ala Ile Ala Ala Gly Ile Lys Ala Ala Lys Asp Leu Gly Asn

            180                 185                 190

Met Pro Pro Asn Ile Cys Asn Ala Ala Tyr Leu Ala Ser Gln Ala Arg

        195                 200                 205

Gln Leu Ala Asp Ser Tyr Ser Lys Asn Val Ile Thr Arg Val Ile Gly

    210                 215                 220

Glu Gln Gln Met Lys Glu Leu Gly Met His Ser Tyr Leu Ala Val Gly

225                 230                 235                 240

Gln Gly Ser Gln Asn Glu Ser Leu Met Ser Val Ile Glu Tyr Lys Gly

                245                 250                 255

Asn Ala Ser Glu Asp Ala Arg Pro Ile Val Leu Val Gly Lys Gly Leu

            260                 265                 270

Thr Phe Asp Ser Gly Gly Ile Ser Ile Lys Pro Ser Glu Gly Met Asp

        275                 280                 285

Glu Met Lys Tyr Asp Met Cys Gly Ala Ala Ala Val Tyr Gly Val Met

    290                 295                 300

Arg Met Val Ala Glu Leu Gln Leu Pro Ile Asn Val Ile Gly Val Leu

305                 310                 315                 320

Ala Gly Cys Glu Asn Met Pro Gly Gly Arg Ala Tyr Arg Pro Gly Asp

                325                 330                 335

Val Leu Thr Thr Met Ser Gly Gln Thr Val Glu Val Leu Asn Thr Asp

            340                 345                 350

Ala Glu Gly Arg Leu Val Leu Cys Asp Val Leu Thr Tyr Val Glu Arg

        355                 360                 365

Phe Glu Pro Glu Ala Val Ile Asp Val Ala Thr Leu Thr Gly Ala Cys

    370                 375                 380

Val Ile Ala Leu Gly His His Ile Thr Gly Leu Met Ala Asn His Asn

385                 390                 395                 400

Pro Leu Ala His Glu Leu Ile Ala Ala Ser Glu Gln Ser Gly Asp Arg

                405                 410                 415

Ala Trp Arg Leu Pro Leu Gly Asp Glu Tyr Gln Glu Gln Leu Glu Ser

            420                 425                 430

Asn Phe Ala Asp Met Ala Asn Ile Gly Gly Arg Pro Gly Gly Ala Ile

        435                 440                 445

Thr Ala Gly Cys Phe Leu Ser Arg Phe Thr Arg Lys Tyr Asn Trp Ala

    450                 455                 460

His Leu Asp Ile Ala Gly Thr Ala Trp Arg Ser Gly Lys Ala Lys Gly

465                 470                 475                 480

Ala Thr Gly Arg Pro Val Ala Leu Leu Ala Gln Phe Leu Leu Asn Arg

                485                 490                 495

Ala Gly Phe Asn Gly Glu Glu

            500

<210>46

<211>427

<212>PRT

<213>大肠埃希氏杆菌

<400>46

Met Thr Glu Ala Met Lys Ile Thr Leu Ser Thr Gln Pro Ala Asp Ala

  1               5                  10                  15

Arg Trp Gly Glu Lys Ala Thr Tyr Ser Ile Asn Asn Asp Gly Ile Thr

             20                  25                  30

Leu His Leu Asn Gly Ala Asp Asp Leu Gly Leu Ile Gln Arg Ala Ala

         35                  40                  45

Arg Lys Ile Asp Gly Leu Gly Ile Lys His Val Gln Leu Ser Gly Glu

     50                  55                  60

Gly Trp Asp Ala Asp Arg Cys Trp Ala Phe Trp Gln Gly Tyr Lys Ala

 65                  70                  75                  80

Pro Lys Gly Thr Arg Lys Val Val Trp Pro Asp Leu Asp Asp Ala Gln

                 85                  90                  95

Arg Gln Glu Leu Asp Asn Arg Leu Met Ile Ile Asp Trp Val Arg Asp

            100                 105                 110

Thr Ile Asn Ala Pro Ala Glu Glu Leu Gly Pro Ser Gln Leu Ala Gln

        115                 120                 125

Arg Ala Val Asp Leu Ile Ser Asn Val Ala Gly Asp Arg Val Thr Tyr

    130                 135                 140

Arg Ile Thr Lys Gly Glu Asp Leu Arg Glu Gln Gly Tyr Met Gly Leu

145                 150                 155                 160

His Thr Val Gly Arg Gly Ser Glu Arg Ser Pro Val Leu Leu Ala Leu

                165                 170                 175

Asp Tyr Asn Pro Thr Gly Asp Lys Glu Ala Pro Val Tyr Ala Cys Leu

            180                 185                 190

Val Gly Lys Gly Ile Thr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Ser Ile Lys Gln

        195                 200                 205

Thr Ala Phe Met Asp Ser Met Lys Ser Asp Met Gly Gly Ala Ala Thr

    210                 215                 220

Val Thr Gly Ala Leu Ala Phe Ala Ile Thr Arg Gly Leu Asn Lys Arg

225                 230                 235                 240

Val Lys Leu Phe Leu Cys Cys Ala Asp Asn Leu Ile Ser Gly Asn Ala

                245                 250                 255

Phe Lys Leu Gly Asp Ile Ile Thr Tyr Arg Asn Gly Lys Lys Val Glu

            260                 265                 270

Val Met Asn Thr Asp Ala Glu Gly Arg Leu Val Leu Ala Asp Gly Leu

        275                 280                 285

Ile Asp Ala Ser Ala Gln Lys Pro Glu Met Ile Ile Asp Ala Ala Thr

    290                 295                 300

Leu Thr Gly Ala Ala Lys Thr Ala Leu Gly Asn Asp Tyr His Ala Leu

305                 310                 315                 320

Phe Ser Phe Asp Asp Ala Leu Ala Gly Arg Leu Leu Ala Ser Ala Ala

                325                 330                 335

Gln Glu Asn Glu Pro Phe Trp Arg Leu Pro Leu Ala Glu Phe His Arg

            340                 345                 350

Ser Gln Leu Pro Ser Asn Phe Ala Glu Leu Asn Asn Thr Gly Ser Ala

        355                 360                 365

Ala Tyr Pro Ala Gly Ala Ser Thr Ala Ala Gly Phe Leu Ser His Phe

    370                 375                 380

Val Glu Asn Tyr Gln Gln Gly Trp Leu His Ile Asp Cys Ser Ala Thr

385                 390                 395                 400

Tyr Arg Lys Ala Pro Val Glu Gln Trp Ser Ala Gly Ala Thr Gly Leu

                405                 410                 415

Gly Val Arg Thr Ile Ala Asn Leu Leu Thr Ala

            420                 425

<210>47

<211>485

<212>PRT

<213>大肠埃希氏杆菌

<400>47

Met Ser Glu Leu Ser Gln Leu Ser Pro Gln Pro Leu Trp Asp Ile Phe

  1               5                  10                  15

Ala Lys Ile Cys Ser Ile Pro His Pro Ser Tyr His Glu Glu Gln Leu

             20                  25                  30

Ala Glu Tyr Ile Val Gly Trp Ala Lys Glu Lys Gly Phe His Val Glu

         35                  40                  45

Arg Asp Gln Val Gly Asn Ile Leu Ile Arg Lys Pro Ala Thr Ala Gly

     50                  55                  60

Met Glu Asn Arg Lys Pro Val Val Leu Gln Ala His Leu Asp Met Val

 65                  70                  75                  80

Pro Gln Lys Asn Asn Asp Thr Val His Asp Phe Thr Lys Asp Pro Ile

                 85                  90                  95

Gln Pro Tyr Ile Asp Gly Glu Trp Val Lys Ala Arg Gly Thr Thr Leu

            100                 105                 110

Gly Ala Asp Asn Gly Ile Gly Met Ala Ser Ala Leu Ala Val Leu Ala

        115                 120                 125

Asp Glu Asn Val Val His Gly Pro Leu Glu Val Leu Leu Thr Met Thr

    130                 135                 140

Glu Glu Ala Gly Met Asp Gly Ala Phe Gly Leu Gln Gly Asn Trp Leu

145                 150                 155                 160

Gln Ala Asp Ile Leu Ile Asn Thr Asp Ser Glu Glu Glu Gly Glu Ile

                165                 170                 175

Tyr Met Gly Cys Ala Gly Gly Ile Asp Phe Thr Ser Asn Leu His Leu

            180                 185                 190

Asp Arg Glu Ala Val Pro Ala Gly Phe Glu Thr Phe Lys Leu Thr Leu

        195                 200                 205

Lys Gly Leu Lys Gly Gly His Ser Gly Gly Glu Ile His Val Gly Leu

    210                 215                 220

Gly Asn Ala Asn Lys Leu Leu Val Arg Phe Leu Ala Gly His Ala Glu

225                 230                 235                 240

Glu Leu Asp Leu Arg Leu Ile Asp Phe Asn Gly Gly Thr Leu Arg Asn

                245                 250                 255

Ala Ile Pro Arg Glu Ala Phe Ala Thr Ile Ala Val Ala Ala Asp Lys

            260                 265                 270

Val Asp Val Leu Lys Ser Leu Val Asn Thr Tyr Gln Glu Ile Leu Lys

        275                 280                 285

Asn Glu Leu Ala Glu Lys Glu Lys Asn Leu Ala Leu Leu Leu Asp Ser

    290                 295                 300

Val Ala Asn Asp Lys Ala Ala Leu Ile Ala Lys Ser Arg Asp Thr Phe

305                 310                 315                 320

Ile Arg Leu Leu Asn Ala Thr Pro Asn Gly Val Ile Arg Asn Ser Asp

                325                 330                 335

Val Ala Lys Gly Val Val Glu Thr Ser Leu Asn Val Gly Val Val Thr

            340                 345                 350

Met Thr Asp Asn Asn Val Glu Ile His Cys Leu Ile Arg Ser Leu Ile

        355                 360                 365

Asp Ser Gly Lys Asp Tyr Val Val Ser Met Leu Asp Ser Leu Gly Lys

    370                 375                 380

Leu Ala Gly Ala Lys Thr Glu Ala Lys Gly Ala Tyr Pro Gly Trp Gln

385                 390                 395                 400

Pro Asp Ala Asn Ser Pro Val Met His Leu Val Arg Glu Thr Tyr Gln

                405                 410                 415

Arg Leu Phe Asn Lys Thr Pro Asn Ile Gln Ile Ile His Ala Gly Leu

            420                 425                 430

Glu Cys Gly Leu Phe Lys Lys Pro Tyr Pro Glu Met Asp Met Val Ser

        435                 440                 445

Ile Gly Pro Thr Ile Thr Gly Pro His Ser Pro Asp Glu Gln Val His

    450                 455                 460

Ile Glu Ser Val Gly His Tyr Trp Thr Leu Leu Thr Glu Leu Leu Lys

465                 470                 475                 480

Glu Ile Pro Ala Lys

                485

<210>48

<211>870

<212>PRT

<213>大肠埃希氏杆菌

<400>48

Met Thr Gln Gln Pro Gln Ala Lys Tyr Arg His Asp Tyr Arg Ala Pro

  1               5                  10                  15

Asp Tyr Gln Ile Thr Asp Ile Asp Leu Thr Phe Asp Leu Asp Ala Gln

             20                  25                  30

Lys Thr Val Val Thr Ala Val Ser Gln Ala Val Arg His Gly Ala Ser

         35                  40                  45

Asp Ala Pro Leu Arg Leu Asn Gly Glu Asp Leu Lys Leu Val Ser Val

     50                  55                  60

His Ile Asn Asp Glu Pro Trp Thr Ala Trp Lys Glu Glu Glu Gly Ala

 65                  70                  75                  80

Leu Val Ile Ser Asn Leu Pro Glu Arg Phe Thr Leu Lys Ile Ile Asn

                 85                  90                  95

Glu Ile Ser Pro Ala Ala Asn Thr Ala Leu Glu Gly Leu Tyr Gln Ser

            100                 105                 110

Gly Asp Ala Leu Cys Thr Gln Cys Glu Ala Glu Gly Phe Arg His Ile

        115                 120                 125

Thr Tyr Tyr Leu Asp Arg Pro Asp Val Leu Ala Arg Phe Thr Thr Lys

    130                 135                 140

Ile Ile Ala Asp Lys Ile Lys Tyr Pro Phe Leu Leu Ser Asn Gly Asn

145                 150                 155                 160

Arg Val Ala Gln Gly Glu Leu Glu Asn Gly Arg His Trp Val Gln Trp

                165                 170                 175

Gln Asp Pro Phe Pro Lys Pro Cys Tyr Leu Phe Ala Leu Val Ala Gly

            180                 185                 190

Asp Phe Asp Val Leu Arg Asp Thr Phe Thr Thr Arg Ser Gly Arg Glu

        195                 200                 205

Val Ala Leu Glu Leu Tyr Val Asp Arg Gly Asn Leu Asp Arg Ala Pro

    210                 215                 220

Trp Ala Met Thr Ser Leu Lys Asn Ser Met Lys Trp Asp Glu Glu Arg

225                 230                 235                 240

Phe Gly Leu Glu Tyr Asp Leu Asp Ile Tyr Met Ile Val Ala Val Asp

                245                 250                 255

Phe Phe Asn Met Gly Ala Met Glu Asn Lys Gly Leu Asn Ile Phe Asn

            260                 265                 270

Ser Lys Tyr Val Leu Ala Arg Thr Asp Thr Ala Thr Asp Lys Asp Tyr

        275                 280                 285

Leu Asp Ile Glu Arg Val Ile Gly His Glu Tyr Phe His Asn Trp Thr

    290                 295                 300

Gly Asn Arg Val Thr Cys Arg Asp Trp Phe Gln Leu Ser Leu Lys Glu

305                 310                 315                 320

Gly Leu Thr Val Phe Arg Asp Gln Glu Phe Ser Ser Asp Leu Gly Ser

                325                 330                 335

Arg Ala Val Asn Arg Ile Asn Asn Val Arg Thr Met Arg Gly Leu Gln

            340                 345                 350

Phe Ala Glu Asp Ala Ser Pro Met Ala His Pro Ile Arg Pro Asp Met

        355                 360                 365

Val Ile Glu Met Asn Asn Phe Tyr Thr Leu Thr Val Tyr Glu Lys Gly

    370                 375                 380

Ala Glu Val Ile Arg Met Ile His Thr Leu Leu Gly Glu Glu Asn Phe

385                 390                 395                 400

Gln Lys Gly Met Gln Leu Tyr Phe Glu Arg His Asp Gly Ser Ala Ala

                405                 410                 415

Thr Cys Asp Asp Phe Val Gln Ala Met Glu Asp Ala Ser Asn Val Asp

            420                 425                 430

Leu Ser His Phe Arg Arg Trp Tyr Ser Gln Ser Gly Thr Pro Ile Val

        435                 440                 445

Thr Val Lys Asp Asp Tyr Asn Pro Glu Thr Glu Gln Tyr Thr Leu Thr

    450                 455                 460

Ile Ser Gln Arg Thr Pro Ala Thr Pro Asp Gln Ala Glu Lys Gln Pro

465                 470                 475                 480

Leu His Ile Pro Phe Ala Ile Glu Leu Tyr Asp Asn Glu Gly Lys Val

                485                 490                 495

Ile Pro Leu Gln Lys Gly Gly His Pro Val Asn Ser Val Leu Asn Val

            500                 505                 510

Thr Gln Ala Glu Gln Thr Phe Val Phe Asp Asn Val Tyr Phe Gln Pro

        515                 520                 525

Val Pro Ala Leu Leu Cys Glu Phe Ser Ala Pro Val Lys Leu Glu Tyr

    530                 535                 540

Lys Trp Ser Asp Gln Gln Leu Thr Phe Leu Met Arg His Ala Arg Asn

545                 550                 555                 560

Asp Phe Ser Arg Trp Asp Ala Ala Gln Ser Leu Leu Ala Thr Tyr Ile

                565                 570                 575

Lys Leu Asn Val Ala Arg His Gln Gln Gly Gln Pro Leu Ser Leu Pro

            580                 585                 590

Val His Val Ala Asp Ala Phe Arg Ala Val Leu Leu Asp Glu Lys Ile

        595                 600                 605

Asp Pro Ala Leu Ala Ala Glu Ile Leu Thr Leu Pro Ser Val Asn Glu

    610                 615                 620

Met Ala Glu Leu Phe Asp Ile Ile Asp Pro Ile Ala Ile Ala Glu Val

625                 630                 635                 640

Arg Glu Ala Leu Thr Arg Thr Leu Ala Thr Glu Leu Ala Asp Glu Leu

                645                 650                 655

Leu Ala Ile Tyr Asn Ala Asn Tyr Gln Ser Glu Tyr Arg Val Glu His

            660                 665                 670

Glu Asp Ile Ala Lys Arg Thr Leu Arg Asn Ala Cys Leu Arg Phe Leu

        675                 680                 685

Ala Phe Gly Glu Thr His Leu Ala Asp Val Leu Val Ser Lys Gln Phe

    690                 695                 700

His Glu Ala Asn Asn Met Thr Asp Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Ala

705                 710                 715                 720

Val Ala Ala Gln Leu Pro Cys Arg Asp Ala Leu Met Gln Glu Tyr Asp

                725                 730                 735

Asp Lys Trp His Gln Asn Gly Leu Val Met Asp Lys Trp Phe Ile Leu

            740                 745                 750

Gln Ala Thr Ser Pro Ala Ala Asn Val Leu Glu Thr Val Arg Gly Leu

        755                 760                 765

Leu Gln His Arg Ser Phe Thr Met Ser Asn Pro Asn Arg Ile Arg Ser

    770                 775                 780

Leu Ile Gly Ala Phe Ala Gly Ser Asn Pro Ala Ala Phe His Ala Glu

785                 790                 795                 800

Asp Gly Ser Gly Tyr Leu Phe Leu Val Glu Met Leu Thr Asp Leu Asn

                805                 810                 815

Ser Arg Asn Pro Gln Val Ala Ser Arg Leu Ile Glu Pro Leu Ile Arg

            820                 825                 830

Leu Lys Arg Tyr Asp Ala Lys Arg Gln Glu Lys Met Arg Ala Ala Leu

        835                 840                 845

Glu Gln Leu Lys Gly Leu Glu Asn Leu Ser Gly Asp Leu Tyr Glu Lys

    850                 855                 860

Ile Thr Lys Ala Leu Ala

865                 870

<210>49

<211>535

<212>PRT

<213>大肠埃希氏杆菌

<400>49

Met Arg Ile Ser Leu Lys Lys Ser Gly Met Leu Lys Leu Gly Leu Ser

  1               5                  10                  15

Leu Val Ala Met Thr Val Ala Ala Ser Val Gln Ala Lys Thr Leu Val

             20                  25                  30

Tyr Cys Ser Glu Gly Ser Pro Glu Gly Phe Asn Pro Gln Leu Phe Thr

         35                  40                  45

Ser Gly Thr Thr Tyr Asp Ala Ser Ser Val Pro Leu Tyr Asn Arg Leu

     50                  55                  60

Val Glu Phe Lys Ile Gly Thr Thr Glu Val Ile Pro Gly Leu Ala Glu

 65                  70                  75                  80

Lys Trp Glu Val Ser Glu Asp Gly Lys Thr Tyr Thr Phe His Leu Arg

                 85                  90                  95

Lys Gly Val Lys Trp His Asp Asn Lys Glu Phe Lys Pro Thr Arg Glu

            100                 105                 110

Leu Asn Ala Asp Asp Val Val Phe Ser Phe Asp Arg Gln Lys Asn Ala

        115                 120                 125

Gln Asn Pro Tyr His Lys Val Ser Gly Gly Ser Tyr Glu Tyr Phe Glu

    130                 135                 140

Gly Met Gly Leu Pro Glu Leu Ile Ser Glu Val Lys Lys Val Asp Asp

145                 150                 155                 160

Asn Thr Val Gln Phe Val Leu Thr Arg Pro Glu Ala Pro Phe Leu Ala

                165                 170                 175

Asp Leu Ala Met Asp Phe Ala Ser Ile Leu Ser Lys Glu Tyr Ala Asp

            180                 185                 190

Ala Met Met Lys Ala Gly Thr Pro Glu Lys Leu Asp Leu Asn Pro Ile

        195                 200                 205

Gly Thr Gly Pro Phe Gln Leu Gln Gln Tyr Gln Lys Asp Ser Arg Ile

    210                 215                 220

Arg Tyr Lys Ala Phe Asp Gly Tyr Trp Gly Thr Lys Pro Gln Ile Asp

225                 230                 235                 240

Thr Leu Val Phe Ser Ile Thr Pro Asp Ala Ser Val Arg Tyr Ala Lys

                245                 250                 255

Leu Gln Lys Asn Glu Cys Gln Val Met Pro Tyr Pro Asn Pro Ala Asp

            260                 265                 270

Ile Ala Arg Met Lys Gln Asp Lys Ser Ile Asn Leu Met Glu Met Pro

        275                 280                 285

Gly Leu Asn Val Gly Tyr Leu Ser Tyr Asn Val Gln Lys Lys Pro Leu

    290                 295                 300

Asp Asp Val Lys Val Arg Gln Ala Leu Thr Tyr Ala Val Asn Lys Asp

305                 310                 315                 320

Ala Ile Ile Lys Ala Val Tyr Gln Gly Ala Gly Val Ser Ala Lys Asn

                325                 330                 335

Leu Ile Pro Pro Thr Met Trp Gly Tyr Asn Asp Asp Val Gln Asp Tyr

            340                 345                 350

Thr Tyr Asp Pro Glu Lys Ala Lys Ala Leu Leu Lys Glu Ala Gly Leu

        355                 360                 365

Glu Lys Gly Phe Ser Ile Asp Leu Trp Ala Met Pro Val Gln Arg Pro

    370                 375                 380

Tyr Asn Pro Asn Ala Arg Arg Met Ala Glu Met Ile Gln Ala Asp Trp

385                 390                 395                 400

Ala Lys Val Gly Val Gln Ala Lys Ile Val Thr Tyr Glu Trp Gly Glu

                405                 410                 415

Tyr Leu Lys Arg Ala Lys Asp Gly Glu His Gln Thr Val Met Met Gly

            420                 425                 430

Trp Thr Gly Asp Asn Gly Asp Pro Asp Asn Phe Phe Ala Thr Leu Phe

        435                 440                 445

Ser Cys Ala Ala Ser Glu Gln Gly Ser Asn Tyr Ser Lys Trp Cys Tyr

    450                 455                 460

Lys Pro Phe Glu Asp Leu Ile Gln Pro Ala Arg Ala Thr Asp Asp His

465                 470                 475                 480

Asn Lys Arg Val Glu Leu Tyr Lys Gln Ala Gln Val Val Met His Asp

                485                 490                 495

Gln Ala Pro Ala Leu Ile Ile Ala His Ser Thr Val Phe Glu Pro Val

            500                 505                 510

Arg Lys Glu Val Lys Gly Tyr Val Val Asp Pro Leu Gly Lys His His

        515                 520                 525

Phe Glu Asn Val Ser Ile Glu

    530                 535

<210>50

<211>339

<212>PRT

<213>大肠埃希氏杆菌

<400>50

Met Leu Gln Phe Ile Leu Arg Arg Leu Gly Leu Val Ile Pro Thr Phe

  1               5                  10                  15

Ile Gly Ile Thr Leu Leu Thr Phe Ala Phe Val His Met Ile Pro Gly

             20                  25                  30

Asp Pro Val Met Ile Met Ala Gly Glu Arg Gly Ile Ser Pro Glu Arg

         35                  40                  45

His Ala Gln Leu Leu Ala Glu Leu Gly Leu Asp Lys Pro Met Trp Gln

     50                  55                  60

Gln Tyr Leu His Tyr Ile Trp Gly Val Met His Gly Asp Leu Gly Ile

 65                  70                  75                  80

Ser Met Lys Ser Arg Ile Pro Val Trp Glu Glu Phe Val Pro Arg Phe

                 85                  90                  95

Gln Ala Thr Leu Glu Leu Gly Val Cys Ala Met Ile Phe Ala Thr Ala

            100                 105                 110

Val Gly Ile Pro Val Gly Val Leu Ala Ala Val Lys Arg Gly Ser Ile

        115                 120                 125

Phe Asp His Thr Ala Val Gly Leu Ala Leu Thr Gly Tyr Ser Met Pro

    130                 135                 140

Ile Phe Trp Trp Gly Met Met Leu Ile Met Leu Val Ser Val His Trp

145                 150                 155                 160

Asn Leu Thr Pro Val Ser Gly Arg Val Ser Asp Met Val Phe Leu Asp

                165                 170                 175

Asp Ser Asn Pro Leu Thr Gly Phe Met Leu Ile Asp Thr Ala Ile Trp

            180                 185                 190

Gly Glu Asp Gly Asn Phe Ile Asp Ala Val Ala His Met Ile Leu Pro

        195                 200                 205

Ala Ile Val Leu Gly Thr Ile Pro Leu Ala Val Ile Val Arg Met Thr

    210                 215                 220

Arg Ser Ser Met Leu Glu Val Leu Gly Glu Asp Tyr Ile Arg Thr Ala

225                 230                 235                 240

Arg Ala Lys Gly Leu Thr Arg Met Arg Val Ile Ile Val His Ala Leu

                245                 250                 255

Arg Asn Ala Met Leu Pro Val Val Thr Val Ile Gly Leu Gln Val Gly

            260                 265                 270

Thr Leu Leu Ala Gly Ala Ile Leu Thr Glu Thr Ile Phe Ser Trp Pro

        275                 280                 285

Gly Leu Gly Arg Trp Leu Ile Asp Ala Leu Gln Arg Arg Asp Tyr Pro

    290                 295                 300

Val Val Gln Gly Gly Val Leu Leu Val Ala Thr Met Ile Ile Leu Val

305                 310                 315                 320

Asn Leu Leu Val Asp Leu Leu Tyr Gly Val Val Asn Pro Arg Ile Arg

                325                 330                 335

His Lys Lys

<210>51

<211>300

<212>PRT

<213>大肠埃希氏杆菌

<400>51

Met Ser Gln Val Thr Glu Asn Lys Val Ile Ser Ala Pro Val Pro Met

  1               5                  10                  15

Thr Pro Leu Gln Glu Phe Trp His Tyr Phe Lys Arg Asn Lys Gly Ala

             20                  25                  30

Val Val Gly Leu Val Tyr Val Val Ile Val Leu Phe Ile Ala Ile Phe

         35                  40                  45

Ala Asn Trp Ile Ala Pro Tyr Asn Pro Ala Glu Gln Phe Arg Asp Ala

     50                  55                  60

Leu Leu Ala Pro Pro Ala Trp Gln Glu Gly Gly Ser Met Ala His Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Gly Thr Asp Asp Val Gly Arg Asp Val Leu Ser Arg Leu Met Tyr

                 85                  90                  95

Gly Ala Arg Leu Ser Leu Leu Val Gly Cys Leu Val Val Val Leu Ser

            100                 105                 110

Leu Ile Met Gly Val Ile Leu Gly Leu Ile Ala Gly Tyr Phe Gly Gly

        115                 120                 125

Leu Val Asp Asn Ile Ile Met Arg Val Val Asp Ile Met Leu Ala Leu

    130                 135                 140

Pro Ser Leu Leu Leu Ala Leu Val Leu Val Ala Ile Phe Gly Pro Ser

145                 150                 155                 160

Ile Gly Asn Ala Ala Leu Ala Leu Thr Phe Val Ala Leu Pro His Tyr

                165                 170                 175

Val Arg Leu Thr Arg Ala Ala Val Leu Val Glu Val Asn Arg Asp Tyr

            180                 185                 190

Val Thr Ala Ser Arg Val Ala Gly Ala Gly Ala Met Arg Gln Met Phe

        195                 200                 205

Ile Asn Ile Phe Pro Asn Cys Leu Ala Pro Leu Ile Val Gln Ala Ser

    210                 215                 220

Leu Gly Phe Ser Asn Ala Ile Leu Asp Met Ala Ala Leu Gly Phe Leu

225                 230                 235                 240

Gly Met Gly Ala Gln Pro Pro Thr Pro Glu Trp Gly Thr Met Leu Ser

                245                 250                 255

Asp Val Leu Gln Phe Ala Gln Ser Ala Trp Trp Val Val Thr Phe Pro

            260                 265                 270

Gly Leu Ala Ile Leu Leu Thr Val Leu Ala Phe Asn Leu Met Gly Asp

        275                 280                 285

Gly Leu Arg Asp Ala Leu Asp Pro Lys Leu Lys Gln

    290                 295                 300

<210>52

<211>327

<212>PRT

<213>大肠埃希氏杆菌

<400>52

Met Ala Leu Leu Asn Val Asp Lys Leu Ser Val His Phe Gly Asp Glu

  1               5                  10                  15

Ser Ala Pro Phe Arg Ala Val Asp Arg Ile Ser Tyr Ser Val Lys Gln

             20                  25                  30

Gly Glu Val Val Gly Ile Val Gly Glu Ser Gly Ser Gly Lys Ser Val

         35                  40                  45

Ser Ser Leu Ala Ile Met Gly Leu Ile Asp Tyr Pro Gly Arg Val Met

     50                  55                  60

Ala Glu Lys Leu Glu Phe Asn Gly Gln Asp Leu Gln Arg Ile Ser Glu

 65                  70                  75                  80

Lys Glu Arg Arg Asn Leu Val Gly Ala Glu Val Ala Met Ile Phe Gln

                 85                  90                  95

Asp Pro Met Thr Ser Leu Asn Pro Cys Tyr Thr Val Gly Phe Gln Ile

            100                 105                 110

Met Glu Ala Ile Lys Val His Gln Gly Gly Asn Lys Ser Thr Arg Arg

        115                 120                 125

Gln Arg Ala Ile Asp Leu Leu Asn Gln Val Gly Ile Pro Asp Pro Ala

    130                 135                 140

Ser Arg Leu Asp Val Tyr Pro His Gln Leu Ser Gly Gly Met Ser Gln

145                 150                 155                 160

Arg Val Met Ile Ala Met Ala Ile Ala Cys Arg Pro Lys Leu Leu Ile

                165                 170                 175

Ala Asp Glu Pro Thr Thr Ala Leu Asp Val Thr Ile Gln Ala Gln Ile

            180                 185                 190

Ile Glu Leu Leu Leu Glu Leu Gln Gln Lys Glu Asn Met Ala Leu Val

        195                 200                 205

Leu Ile Thr His Asp Leu Ala Leu Val Ala Glu Ala Ala His Lys Ile

    210                 215                 220

Ile Val Met Tyr Ala Gly Gln Val Val Glu Thr Gly Asp Ala His Ala

225                 230                 235                 240

Ile Phe His Ala Pro Arg His Pro Tyr Thr Gln Ala Leu Leu Arg Ala

                245                 250                 255

Leu Pro Glu Phe Ala Gln Asp Lys Glu Arg Leu Ala Ser Leu Pro Gly

            260                 265                 270

Val Val Pro Gly Lys Tyr Asp Arg Pro Asn Gly Cys Leu Leu Asn Pro

        275                 280                 285

Arg Cys Pro Tyr Ala Thr Asp Arg Cys Arg Ala Glu Glu Pro Ala Leu

    290                 295                 300

Asn Met Leu Ala Asp Gly Arg Gln Ser Lys Cys His Tyr Pro Leu Asp

305                 310                 315                 320

Asp Ala Gly Arg Pro Thr Leu

                325

<210>53

<211>334

<212>PRT

<213>大肠埃希氏杆菌

<400>53

Met Ser Thr Gln Glu Ala Thr Leu Gln Gln Pro Leu Leu Gln Ala Ile

  1               5                  10                  15

Asp Leu Lys Lys His Tyr Pro Val Lys Lys Gly Met Phe Ala Pro Glu

             20                  25                  30

Arg Leu Val Lys Ala Leu Asp Gly Val Ser Phe Asn Leu Glu Arg Gly

         35                  40                  45

Lys Thr Leu Ala Val Val Gly Glu Ser Gly Cys Gly Lys Ser Thr Leu

     50                  55                  60

Gly Arg Leu Leu Thr Met Ile Glu Met Pro Thr Gly Gly Glu Leu Tyr

 65                  70                  75                  80

Tyr Gln Gly Gln Asp Leu Leu Lys His Asp Pro Gln Ala Gln Lys Leu

                 85                  90                  95

Arg Arg Gln Lys Ile Gln Ile Val Phe Gln Asn Pro Tyr Gly Ser Leu

            100                 105                 110

Asn Pro Arg Lys Lys Val Gly Gln Ile Leu Glu Glu Pro Leu Leu Ile

        115                 120                 125

Asn Thr Ser Leu Ser Lys Glu Gln Arg Arg Glu Lys Ala Leu Ser Met

    130                 135                 140

Met Ala Lys Val Gly Leu Lys Thr Glu His Tyr Asp Arg Tyr Pro His

145                 150                 155                 160

Met Phe Ser Gly Gly Gln Arg Gln Arg Ile Ala Ile Ala Arg Gly Leu

                165                 170                 175

Met Leu Asp Pro Asp Val Val Ile Ala Asp Glu Pro Val Ser Ala Leu

            180                 185                 190

Asp Val Ser Val Arg Ala Gln Val Leu Asn Leu Met Met Asp Leu Gln

        195                 200                 205

Gln Glu Leu Gly Leu Ser Tyr Val Phe Ile Ser His Asp Leu Ser Val

    210                 215                 220

Val Glu His Ile Ala Asp Glu Val Met Val Met Tyr Leu Gly Arg Cys

225                 230                 235                 240

Val Glu Lys Gly Thr Lys Asp Gln Ile Phe Asn Asn Pro Arg His Pro

                245                 250                 255

Tyr Thr Gln Ala Leu Leu Ser Ala Thr Pro Arg Leu Asn Pro Asp Asp

            260                 265                 270

Arg Arg Glu Arg Ile Lys Leu Ser Gly Glu Leu Pro Ser Pro Leu Asn

        275                 280                 285

Pro Pro Pro Gly Cys Ala Phe Asn Ala Arg Cys Arg Arg Arg Phe Gly

    290                 295                 300

Pro Cys Thr Gln Leu Gln Pro Gln Leu Lys Asp Tyr Gly Gly Gln Leu

305                 310                 315                 320

Val Ala Cys Phe Ala Val Asp Gln Asp Glu Asn Pro Gln Arg

                325                 330

<210>54

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>54

gaagttccta tactttctag agaataggaa cttc        34

<210>55

<211>1509

<212>DNA

<213>大肠埃希氏杆菌

<400>55

atg gag ttt agt gta aaa agc ggt agc ccg gag aaa cag cgg agt gcc  48

Met Glu Phe Ser Val Lys Ser Gly Ser Pro Glu Lys Gln Arg Ser Ala

  1               5                  10                  15

tgc atc gtc gtg ggc gtc ttc gaa cca cgt cgc ctt tct ccg att gca  96

Cys Ile Val Val Gly Val Phe Glu Pro Arg Arg Leu Ser Pro Ile Ala

             20                  25                  30

gaa cag ctc gat aaa atc agc gat ggg tac atc agc gcc ctg cta cgt  144

Glu Gln Leu Asp Lys Ile Ser Asp Gly Tyr Ile Ser Ala Leu Leu Arg

         35                  40                  45

cgg ggc gaa ctg gaa gga aaa ccg ggg cag aca ttg ttg ctg cac cat  192

Arg Gly Glu Leu Glu Gly Lys Pro Gly Gln Thr Leu Leu Leu His His

     50                  55                  60

gtt ccg aat gta ctt tcc gag cga att ctc ctt att ggt tgc ggc aaa  240

Val Pro Asn Val Leu Ser Glu Arg Ile Leu Leu Ile Gly Cys Gly Lys

 65                  70                  75                  80

gaa cgt gag ctg gat gag cgt cag tac aag cag gtt att cag aaa acc  288

Glu Arg Glu Leu Asp Glu Arg Gln Tyr Lys Gln Val Ile Gln Lys Thr

                 85                  90                  95

att aat acg ctg aat gat act ggc tca atg gaa gcg gtc tgc ttt ctg  336

Ile Asn Thr Leu Asn Asp Thr Gly Ser Met Glu Ala Val Cys Phe Leu

            100                 105                 110

act gag ctg cac gtt aaa ggc cgt aac aac tac tgg aaa gtg cgt cag  384

Thr Glu Leu His Val Lys Gly Arg Asn Asn Tyr Trp Lys Val Arg Gln

        115                 120                 125

gct gtc gag acg gca aaa gag acg ctc tac agt ttc gat cag ctg aaa  432

Ala Val Glu Thr Ala Lys Glu Thr Leu Tyr Ser Phe Asp Gln Leu Lys

    130                 135                 140

acg aac aag agc gaa ccg cgt cgt ccg ctg cgt aag atg gtg ttc aac  480

Thr Asn Lys Ser Glu Pro Arg Arg Pro Leu Arg Lys Met Val Phe Asn

145                 150                 155                 160

gtg ccg acc cgc cgt gaa ctg acc agc ggt gag cgc gcg atc cag cac  528

Val Pro Thr Arg Arg Glu Leu Thr Ser Gly Glu Arg Ala Ile Gln His

                165                 170                 175

ggt ctg gcg att gcc gcc ggg att aaa gca gca aaa gat ctc ggc aat    576

Gly Leu Ala Ile Ala Ala Gly Ile Lys Ala Ala Lys Asp Leu Gly Asn

            180                 185                 190

atg ccg ccg aat atc tgt aac gcc gct tac ctc gct tca caa gcg cgc    624

Met Pro Pro Asn Ile Cys Asn Ala Ala Tyr Leu Ala Ser Gln Ala Arg

        195                 200                 205

cag ctg gct gac agc tac agc aag aat gtc atc acc cgc gtt atc ggc    672

Gln Leu Ala Asp Ser Tyr Ser Lys Asn Val Ile Thr Arg Val Ile Gly

    210                 215                 220

gaa cag cag atg aaa gag ctg ggg atg cat tcc tat ctg gcg gtc ggt    720

Glu Gln Gln Met Lys Glu Leu Gly Met His Ser Tyr Leu Ala Val Gly

225                 230                 235                 240

cag ggt tcg caa aac gaa tcg ctg atg tcg gtg att gag tac aaa ggc    768

Gln Gly Ser Gln Asn Glu Ser Leu Met Ser Val Ile Glu Tyr Lys Gly

                245                 250                 255

aac gcg tcg gaa gat gca cgc cca atc gtg ctg gtg ggt aaa ggt tta    816

Asn Ala Ser Glu Asp Ala Arg Pro Ile Val Leu Val Gly Lys Gly Leu

            260                 265                 270

acc ttc gac tcc ggc ggt atc tcg atc aag cct tca gaa ggc atg gat    864

Thr Phe Asp Ser Gly Gly Ile Ser Ile Lys Pro Ser Glu Gly Met Asp

        275                 280                 285

gag atg aag tac gat atg tgc ggt gcg gca gcg gtt tac ggc gtg atg    912

Glu Met Lys Tyr Asp Met Cys Gly Ala Ala Ala Val Tyr Gly Val Met

    290                 295                 300

cgg atg gtc gcg gag cta caa ctg ccg att aac gtt atc ggc gtg ttg    960

Arg Met Val Ala Glu Leu Gln Leu Pro Ile Asn Val Ile Gly Val Leu

305                 310                 315                 320

gca ggc tgc gaa aac atg cct ggc gga cga gcc tat cgt ccg ggc gat    1008

Ala Gly Cys Glu Asn Met Pro Gly Gly Arg Ala Tyr Arg Pro Gly Asp

                325                 330                 335

gtg tta acc acc atg tcc ggt caa acc gtt gaa gtg ctg aac acc gac    1056

Val Leu Thr Thr Met Ser Gly Gln Thr Val Glu Val Leu Asn Thr Asp

            340                 345                 350

gct gaa ggc cgc ctg gta ctg tgc gac gtg tta act tac gtt gag cgt  1104

Ala Glu Gly Arg Leu Val Leu Cys Asp Val Leu Thr Tyr Val Glu Arg

        355                 360                 365

ttt gag ccg gaa gcg gtg att gac gtg gcg acg ctg acc ggt gcc tgc  1152

Phe Glu Pro Glu Ala Val Ile Asp Val Ala Thr Leu Thr Gly Ala Cys

    370                 375                 380

gtg atc gcg ctg ggt cat cat att act ggt ctg atg gcg aac cat aat  1200

Val Ile Ala Leu Gly His His Ile Thr Gly Leu Met Ala Asn His Asn

385                 390                 395                 400

ccg ctg gcc cat gaa ctg att gcc gcg tct gaa caa tcc ggt gac cgc  1248

Pro Leu Ala His Glu Leu Ile Ala Ala Ser Glu Gln Ser Gly Asp Arg

                405                 410                 415

gca tgg cgc tta ccg ctg ggt gac gag tat cag gaa caa ctg gag tcc  1296

Ala Trp Arg Leu Pro Leu Gly Asp Glu Tyr Gln Glu Gln Leu Glu Ser

            420                 425                 430

aat ttt gcc gat atg gcg aac att ggc ggt cgt cct ggt ggg gcg att  1344

Asn Phe Ala Asp Met Ala Asn Ile Gly Gly Arg Pro Gly Gly Ala Ile

        435                 440                 445

acc gca ggt tgc ttc ctg tca cgc ttt acc cgt aag tac aac tgg gcg  1392

Thr Ala Gly Cys Phe Leu Ser Arg Phe Thr Arg Lys Tyr Asn Trp Ala

    450                 455                 460

cac ctg gat atc gcc ggt acc gcc tgg cgt tct ggt aaa gca aaa ggc  1440

His Leu Asp Ile Ala Gly Thr Ala Trp Arg Ser Gly Lys Ala Lys Gly

465                 470                 475                 480

gcc acc ggt cgt ccg gta gcg ttg ctg gca cag ttc ctg tta aac cgc  1488

Ala Thr Gly Arg Pro Val Ala Leu Leu Ala Gln Phe Leu Leu Asn Arg

                485                 490                 495

gct ggg ttt aac ggc gaa gag                                      1509

Ala Gly Phe Asn Gly Glu Glu

            500

<210>56

<211>1281

<212>DNA

<213>大肠埃希氏杆菌

<400>56

atg aca gaa gcg atg aag att acc ctc tct acc caa cct gcc gac gcg    48

Met Thr Glu Ala Met Lys Ile Thr Leu Ser Thr Gln Pro Ala Asp Ala

  1               5                  10                  15

cgc tgg gga gaa aaa gca act tac agc att aat aat gac ggc att acc    96

Arg Trp Gly Glu Lys Ala Thr Tyr Ser Ile Asn Asn Asp Gly Ile Thr

             20                  25                  30

ctg cat ttg aac ggg gca gac gat ctg ggg ctg atc cag cgt gcg gcg    144

Leu His Leu Asn Gly Ala Asp Asp Leu Gly Leu Ile Gln Arg Ala Ala

         35                  40                  45

cgc aag att gac ggt ctg ggc atc aag cat gtt cag tta agc ggt gaa    192

Arg Lys Ile Asp Gly Leu Gly Ile Lys His Val Gln Leu Ser Gly Glu

     50                  55                  60

ggc tgg gat gcg gat cgc tgc tgg gca ttc tgg caa ggt tac aaa gcc    240

Gly Trp Asp Ala Asp Arg Cys Trp Ala Phe Trp Gln Gly Tyr Lys Ala

 65                  70                  75                  80

ccg aaa ggc acg cgt aaa gtg gtg tgg ccg gat ctg gac gat gcc cag    288

Pro Lys Gly Thr Arg Lys Val Val Trp Pro Asp Leu Asp Asp Ala Gln

                 85                  90                  95

cgc cag gaa ctg gat aac cgc ctg atg atc atc gac tgg gtg cgt gac    336

Arg Gln Glu Leu Asp Asn Arg Leu Met Ile Ile Asp Trp Val Arg Asp

            100                 105                 110

acc atc aac gca ccg gca gaa gaa ttg gga cca tcg caa ctg gca cag    384

Thr Ile Asn Ala Pro Ala Glu Glu Leu Gly Pro Ser Gln Leu Ala Gln

        115                 120                 125

cgt gct gtt gat ctg atc agc aac gtc gcg ggc gat cgt gtg act tat    432

Arg Ala Val Asp Leu Ile Ser Asn Val Ala Gly Asp Arg Val Thr Tyr

    130                 135                 140

cgg atc acc aaa ggc gaa gat ctg cgt gag caa ggt tat atg ggg ctg    480

Arg Ile Thr Lys Gly Glu Asp Leu Arg Glu Gln Gly Tyr Met Gly Leu

145                 150                 155                 160

cac aca gtc gga cgc ggt tca gaa cgt tct ccg gta ttg ctg gcg ctg    528

His Thr Val Gly Arg Gly Ser Glu Arg Ser Pro Val Leu Leu Ala Leu

                165                 170                 175

gat tac aac cca act ggc gat aaa gaa gcg cca gtg tac gcg tgc ctg    576

Asp Tyr Asn Pro Thr Gly Asp Lys Glu Ala Pro Val Tyr Ala Cys Leu

            180                 185                 190

gta ggt aaa ggt atc act ttt gac tcc ggc ggc tac agc atc aaa cag    624

Val Gly Lys Gly Ile Thr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Ser Ile Lys Gln

        195                 200                 205

act gcg ttt atg gac tcg atg aag tcg gac atg ggc ggc gcg gca acg    672

Thr Ala Phe Met Asp Ser Met Lys Ser Asp Met Gly Gly Ala Ala Thr

    210                 215                 220

gtt acc ggg gcg ctg gca ttt gcc att acg cgc gga ctg aac aag cgc    720

Val Thr Gly Ala Leu Ala Phe Ala Ile Thr Arg Gly Leu Asn Lys Arg

225                 230                 235                 240

gtg aag ctg ttc ctc tgc tgt gcg gat aac ctg att agc ggc aat gcg    768

Val Lys Leu Phe Leu Cys Cys Ala Asp Asn Leu Ile Ser Gly Asn Ala

                245                 250                 255

ttc aag ctg ggc gat atc atc acc tat cgc aac ggt aaa aaa gtt gaa    816

Phe Lys Leu Gly Asp Ile Ile Thr Tyr Arg Asn Gly Lys Lys Val Glu

            260                 265                 270

gtg atg aac act gat gcc gaa ggg cgt ctg gtg ctt gcc gat ggt ctg    864

Val Met Asn Thr Asp Ala Glu Gly Arg Leu Val Leu Ala Asp Gly Leu

        275                 280                 285

att gat gcc agt gcg cag aaa ccg gaa atg atc att gat gcg gcg acc    912

Ile Asp Ala Ser Ala Gln Lys Pro Glu Met Ile Ile Asp Ala Ala Thr

    290                 295                 300

ctc acc ggg gcg gcg aaa act gcg ctg ggt aat gat tat cac gcg ctg    960

Leu Thr Gly Ala Ala Lys Thr Ala Leu Gly Asn Asp Tyr His Ala Leu

305                 310                 315                 320

ttc agt ttt gac gat gcg ctg gcc ggt cgc ttg ctg gcg agt gcc gcg    1008

Phe Ser Phe Asp Asp Ala Leu Ala Gly Arg Leu Leu Ala Ser Ala Ala

                325                 330                 335

cag gag aac gaa ccg ttc tgg cgt ctg ccg ctg gcg gag ttc cac cgc    1056

Gln Glu Asn Glu Pro Phe Trp Arg Leu Pro Leu Ala Glu Phe His Arg

            340                 345                 350

agc cag ctg ccg tct aac ttt gcc gaa ctg aac aat acc gga agc gcg    1104

Ser Gln Leu Pro Ser Asn Phe Ala Glu Leu Asn Asn Thr Gly Ser Ala

        355                 360                 365

gcg tat ccg gca ggc gcg agc acg gcg gcg ggc ttc ctg tcg cac ttt  1152

Ala Tyr Pro Ala Gly Ala Ser Thr Ala Ala Gly Phe Leu Ser His Phe

    370                 375                 380

gtt gag aac tat cag caa ggc tgg ctg cat atc gac tgc tcg gcg act  1200

Val Glu Asn Tyr Gln Gln Gly Trp Leu His Ile Asp Cys Ser Ala Thr

385                 390                 395                 400

tac cgt aaa gcg ccg gtt gaa cag tgg tct gcg ggc gct acg gga ctt  1248

Tyr Arg Lys Ala Pro Val Glu Gln Trp Ser Ala Gly Ala Thr Gly Leu

                405                 410                 415

ggt gtg cgc acg ata gct aat ctg tta acg gcg                      1281

Gly Val Arg Thr Ile Ala Asn Leu Leu Thr Ala

            420                 425

<210>57

<211>1455

<212>DNA

<213>大肠埃希氏杆菌

<400>57

gtg tct gaa ctg tct caa tta tct cca cag ccg ctg tgg gat att ttt  48

Val Ser Glu Leu Ser Gln Leu Ser Pro Gln Pro Leu Trp Asp Ile Phe

  1               5                  10                  15

gcc aaa atc tgt tct att cct cac ccg tcc tat cat gaa gag caa ctc  96

Ala Lys Ile Cys Ser Ile Pro His Pro Ser Tyr His Glu Glu Gln Leu

             20                  25                  30

gct gaa tac att gtt ggt tgg gca aaa gag aaa ggt ttc cat gtc gaa  144

Ala Glu Tyr Ile Val Gly Trp Ala Lys Glu Lys Gly Phe His Val Glu

         35                  40                  45

cgc gat cag gta ggt aat atc ctg att cgt aaa cct gct acc gca ggt  192

Arg Asp Gln Val Gly Asn Ile Leu Ile Arg Lys Pro Ala Thr Ala Gly

     50                  55                  60

atg gaa aat cgt aaa ccg gtc gtc tta cag gcc cac ctc gat atg gtg  240

Met Glu Asn Arg Lys Pro Val Val Leu Gln Ala His Leu Asp Met Val

 65                  70                  75                  80

ccg cag aaa aat aac gac acc gtg cat gac ttc acg aaa gat cct atc  288

Pro Gln Lys Asn Asn Asp Thr Val His Asp Phe Thr Lys Asp Pro Ile

                 85                  90                  95

cag cct tat att gat ggc gaa tgg gtt aaa gcg cgc ggc acc acg ctg    336

Gln Pro Tyr Ile Asp Gly Glu Trp Val Lys Ala Arg Gly Thr Thr Leu

            100                 105                 110

ggt gcg gat aac ggc att ggt atg gcc tct gcg ctg gcg gtt ctg gct    384

Gly Ala Asp Asn Gly Ile Gly Met Ala Ser Ala Leu Ala Val Leu Ala

        115                 120                 125

gac gaa aac gtg gtt cac ggc ccg ctg gaa gtg ctg ctg acc atg acc    432

Asp Glu Asn Val Val His Gly Pro Leu Glu Val Leu Leu Thr Met Thr

    130                 135                 140

gaa gaa gcc ggt atg gac ggt gcg ttc ggc tta cag ggc aac tgg ttg    480

Glu Glu Ala Gly Met Asp Gly Ala Phe Gly Leu Gln Gly Asn Trp Leu

145                 150                 155                 160

cag gct gat att ctg att aac acc gac tcc gaa gaa gaa ggt gaa atc    528

Gln Ala Asp Ile Leu Ile Asn Thr Asp Ser Glu Glu Glu Gly Glu Ile

                165                 170                 175

tac atg ggt tgt gcg ggg ggt atc gac ttc acc tcc aac ctg cat tta    576

Tyr Met Gly Cys Ala Gly Gly Ile Asp Phe Thr Ser Asn Leu His Leu

            180                 185                 190

gat cgt gaa gcg gtt cca gct ggt ttt gaa acc ttc aag tta acc tta    624

Asp Arg Glu Ala Val Pro Ala Gly Phe Glu Thr Phe Lys Leu Thr Leu

        195                 200                 205

aaa ggt ctg aaa ggc ggt cac tcc ggc ggg gaa atc cac gtt ggg ctg    672

Lys Gly Leu Lys Gly Gly His Ser Gly Gly Glu Ile His Val Gly Leu

    210                 215                 220

ggt aat gcc aac aaa ctg ctg gtg cgc ttc ctg gcg ggt cat gcg gaa    720

Gly Asn Ala Asn Lys Leu Leu Val Arg Phe Leu Ala Gly His Ala Glu

225                 230                 235                 240

gaa ctg gat ctg cgc ctt atc gat ttc aac ggc ggc aca ctg cgt aac    768

Glu Leu Asp Leu Arg Leu Ile Asp Phe Asn Gly Gly Thr Leu Arg Asn

                245                 250                 255

gcc atc ccg cgt gaa gcc ttt gcg acc att gct gtc gca gct gat aaa    816

Ala Ile Pro Arg Glu Ala Phe Ala Thr Ile Ala Val Ala Ala Asp Lys

            260                 265                 270

gtc gac gtc ctg aaa tct ctg gtg aat acc tat cag gag atc ctg aaa    864

Val Asp Val Leu Lys Ser Leu Val Asn Thr Tyr Gln Glu Ile Leu Lys

        275                 280                 285

aac gag ctg gca gaa aaa gag aaa aat ctg gcc ttg ttg ctg gac tct    912

Asn Glu Leu Ala Glu Lys Glu Lys Asn Leu Ala Leu Leu Leu Asp Ser

    290                 295                 300

gta gcg aac gat aaa gct gcc ctg att gcg aaa tct cgc gat acc ttt    960

Val Ala Asn Asp Lys Ala Ala Leu Ile Ala Lys Ser Arg Asp Thr Phe

305                 310                 315                 320

att cgt ctg ctg aac gcc acc ccg aac ggt gtg att cgt aac tcc gat    1008

Ile Arg Leu Leu Asn Ala Thr Pro Asn Gly Val Ile Arg Asn Ser Asp

                325                 330                 335

gta gcc aaa ggt gtg gtt gaa acc tcc ctg aac gtc ggt gtg gtg acc    1056

Val Ala Lys Gly Val Val Glu Thr Ser Leu Asn Val Gly Val Val Thr

            340                 345                 350

atg act gac aat aac gta gaa att cac tgc ctg atc cgt tca ctg atc    1104

Met Thr Asp Asn Asn Val Glu Ile His Cys Leu Ile Arg Ser Leu Ile

        355                 360                 365

gac agc ggt aaa gac tac gtg gtg agc atg ctg gat tcg ctg ggt aaa    1152

Asp Ser Gly Lys Asp Tyr Val Val Ser Met Leu Asp Ser Leu Gly Lys

    370                 375                 380

ctg gct ggc gcg aaa acc gaa gcg aaa ggc gca tat cct ggc tgg cag    1200

Leu Ala Gly Ala Lys Thr Glu Ala Lys Gly Ala Tyr Pro Gly Trp Gln

385                 390                 395                 400

ccg gac gct aat tct ccg gtg atg cat ctg gta cgt gaa acc tat cag    1248

Pro Asp Ala Asn Ser Pro Val Met His Leu Val Arg Glu Thr Tyr Gln

                405                 410                 415

cgc ctg ttc aac aag acg ccg aac atc cag att atc cac gcg ggc ctg    1296

Arg Leu Phe Asn Lys Thr Pro Asn Ile Gln Ile Ile His Ala Gly Leu

            420                 425                 430

gaa tgt ggt ctg ttc aaa aaa ccg tat ccg gaa atg gac atg gtt tct    1344

Glu Cys Gly Leu Phe Lys Lys Pro Tyr Pro Glu Met Asp Met Val Ser

        435                 440                 445

atc ggg cca act atc acc ggt cca cac tct ccg gat gag caa gtt cac    1392

Ile Gly Pro Thr Ile Thr Gly Pro His Ser Pro Asp Glu Gln Val His

    450                 455                 460

atc gaa agc gta ggt cat tac tgg aca ctg ctg act gaa ctg ctg aaa  1440

Ile Glu Ser Val Gly His Tyr Trp Thr Leu Leu Thr Glu Leu Leu Lys

465                 470                 475                 480

gaa att ccg gcg aag                                              1455

Glu Ile Pro Ala Lys

               485

<210>58

<211>2610

<212>DNA

<213>大肠埃希氏杆菌

<400>58

atg act caa cag cca caa gcc aaa tac cgt cac gat tat cgt gcg ccg  48

Met Thr Gln Gln Pro Gln Ala Lys Tyr Arg His Asp Tyr Arg Ala Pro

  1               5                  10                  15

gat tac cag att act gat att gac ttg acc ttt gac ctc gac gcg caa  96

Asp Tyr Gln Ile Thr Asp Ile Asp Leu Thr Phe Asp Leu Asp Ala Gln

             20                  25                  30

aag acg gtc gtt acc gcg gtc agc cag gct gtc cgt cat ggt gca tca  144

Lys Thr Val Val Thr Ala Val Ser Gln Ala Val Arg His Gly Ala Ser

         35                  40                  45

gat gct ccc ctt cgt ctc aac ggc gaa gac ctc aaa ctg gtt tct gtt  192

Asp Ala Pro Leu Arg Leu Asn Gly Glu Asp Leu Lys Leu Val Ser Val

     50                  55                  60

cat att aat gat gag ccg tgg acc gcc tgg aaa gaa gaa gag ggc gca  240

His Ile Asn Asp Glu Pro Trp Thr Ala Trp Lys Glu Glu Glu Gly Ala

 65                  70                  75                  80

ctg gtt atc agt aat ttg ccg gag cgt ttt acg ctt aag atc att aat  288

Leu Val Ile Ser Asn Leu Pro Glu Arg Phe Thr Leu Lys Ile Ile Asn

                 85                  90                  95

gaa ata agc ccg gcg gcg aat acc gcg ctg gaa ggg ctt tat cag tca  336

Glu Ile Ser Pro Ala Ala Asn Thr Ala Leu Glu Gly Leu Tyr Gln Ser

            100                 105                 110

ggc gat gcg ctt tgc acc cag tgt gaa gcc gaa ggt ttc cgc cat att    384

Gly Asp Ala Leu Cys Thr Gln Cys Glu Ala Glu Gly Phe Arg His Ile

        115                 120                 125

acg tat tat ctc gac cgc ccg gac gtg ctg gcg cgt ttt acc acc aaa    432

Thr Tyr Tyr Leu Asp Arg Pro Asp Val Leu Ala Arg Phe Thr Thr Lys

    130                 135                 140

att att gcc gat aaa atc aaa tat ccc ttc ctg ctt tcc aat ggt aac    480

Ile Ile Ala Asp Lys Ile Lys Tyr Pro Phe Leu Leu Ser Asn Gly Asn

145                 150                 155                 160

cgc gtt gcg caa ggc gaa ctg gaa aac gga cgc cat tgg gta cag tgg    528

Arg Val Ala Gln Gly Glu Leu Glu Asn Gly Arg His Trp Val Gln Trp

                165                 170                 175

cag gac ccg ttc ccg aaa ccg tgc tac ctg ttt gcg ctg gtg gca ggc    576

Gln Asp Pro Phe Pro Lys Pro Cys Tyr Leu Phe Ala Leu Val Ala Gly

            180                 185                 190

gac ttt gat gta ctg cgc gat acc ttt acc acg cgt tct ggt cgc gaa    624

Asp Phe Asp Val Leu Arg Asp Thr Phe Thr Thr Arg Ser Gly Arg Glu

        195                 200                 205

gta gca ctg gag ctg tac gtc gat cgc ggc aac ctt gat cgc gcg ccg    672

Val Ala Leu Glu Leu Tyr Val Asp Arg Gly Asn Leu Asp Arg Ala Pro

    210                 215                 220

tgg gcg atg acc tcg ctg aaa aac tcc atg aaa tgg gat gaa gaa cgc    720

Trp Ala Met Thr Ser Leu Lys Asn Ser Met Lys Trp Asp Glu Glu Arg

225                 230                 235                 240

ttt ggc ctg gag tat gac ctc gac atc tat atg atc gtc gcg gtg gat    768

Phe Gly Leu Glu Tyr Asp Leu Asp Ile Tyr Met Ile Val Ala Val Asp

                245                 250                 255

ttc ttc aat atg ggc gca atg gag aat aag ggg ctg aat atc ttt aac    816

Phe Phe Asn Met Gly Ala Met Glu Asn Lys Gly Leu Asn Ile Phe Asn

            260                 265                 270

tcc aaa tat gtg ctg gcc cgc acc gac acc gcc acc gac aaa gat tac    864

Ser Lys Tyr Val Leu Ala Arg Thr Asp Thr Ala Thr Asp Lys Asp Tyr

        275                 280                 285

ctc gat att gaa cgc gtt atc ggc cat gaa tat ttc cat aac tgg acc    912

Leu Asp Ile Glu Arg Val Ile Gly His Glu Tyr Phe His Asn Trp Thr

    290                 295                 300

ggt aac cga gtg acc tgt cgc gac tgg ttc cag ctc agc ctg aaa gaa    960

Gly Asn Arg Val Thr Cys Arg Asp Trp Phe Gln Leu Ser Leu Lys Glu

305                 310                 315                 320

ggt tta acc gtc ttc cgc gat cag gag ttc agc tct gac ctt ggt tcc    1008

Gly Leu Thr Val Phe Arg Asp Gln Glu Phe Ser Ser Asp Leu Gly Ser

                325                 330                 335

cgc gca gtt aac cgc atc aat aat gta cgc acc atg cgc gga ttg cag    1056

Arg Ala Val Asn Arg Ile Asn Asn Val Arg Thr Met Arg Gly Leu Gln

            340                 345                 350

ttt gca gaa gac gcc agc ccg atg gcg cac ccg atc cgc ccg gat atg    1104

Phe Ala Glu Asp Ala Ser Pro Met Ala His Pro Ile Arg Pro Asp Met

        355                 360                 365

gtc att gag atg aac aac ttc tac acc ctg acc gtt tac gag aag ggc    1152

Val Ile Glu Met Asn Asn Phe Tyr Thr Leu Thr Val Tyr Glu Lys Gly

    370                 375                 380

gcg gaa gtg att cgc atg atc cac acc ctg ctt ggc gaa gaa aac ttc    1200

Ala Glu Val Ile Arg Met Ile His Thr Leu Leu Gly Glu Glu Asn Phe

385                 390                 395                 400

cag aaa ggg atg cag ctt tat ttc gag cgt cat gat ggt agt gca gcg    1248

Gln Lys Gly Met Gln Leu Tyr Phe Glu Arg His Asp Gly Ser Ala Ala

                405                 410                 415

acc tgt gac gac ttt gtg cag gcg atg gaa gat gcg tcg aat gtc gat    1296

Thr Cys Asp Asp Phe Val Gln Ala Met Glu Asp Ala Ser Asn Val Asp

            420                 425                 430

ctc tcc cat ttc cgc cgt tgg tac agc cag tcc ggt aca ccg att gtg    1344

Leu Ser His Phe Arg Arg Trp Tyr Ser Gln Ser Gly Thr Pro Ile Val

        435                 440                 445

acc gtc aaa gac gac tac aat ccg gaa acc gag cag tac acc ctg acc    1392

Thr Val Lys Asp Asp Tyr Asn Pro Glu Thr Glu Gln Tyr Thr Leu Thr

    450                 455                 460

atc agc cag cgc acg cca gcc acg ccg gat cag gca gaa aaa cag ccg    1440

Ile Ser Gln Arg Thr Pro Ala Thr Pro Asp Gln Ala Glu Lys Gln Pro

465                 470                 475                 480

ctg cat att ccg ttt gcc atc gaa ctg tat gat aac gaa ggc aaa gtg    1488

Leu His Ile Pro Phe Ala Ile Glu Leu Tyr Asp Asn Glu Gly Lys Val

                485                 490                 495

atc ccg ttg cag aaa ggc ggt cat ccg gtg aat tcc gtg ctg aac gtc    1536

Ile Pro Leu Gln Lys Gly Gly His Pro Val Asn Ser Val Leu Asn Val

            500                 505                 510

act cag gcg gaa cag acc ttt gtc ttt gat aat gtc tac ttc cag ccg    1584

Thr Gln Ala Glu Gln Thr Phe Val Phe Asp Asn Val Tyr Phe Gln Pro

        515                 520                 525

gtg cct gcg ctg ctg tgc gaa ttc tct gcg cca gtg aaa ctg gaa tat    1632

Val Pro Ala Leu Leu Cys Glu Phe Ser Ala Pro Val Lys Leu Glu Tyr

    530                 535                 540

aag tgg agc gat cag caa ctg acc ttc ctg atg cgt cat gcg cgt aat    1680

Lys Trp Ser Asp Gln Gln Leu Thr Phe Leu Met Arg His Ala Arg Asn

545                 550                 555                 560

gat ttc tcc cgc tgg gat gcg gcg caa agt ttg ctg gca acc tac atc    1728

Asp Phe Ser Arg Trp Asp Ala Ala Gln Ser Leu Leu Ala Thr Tyr Ile

                565                 570                 575

aag ctg aac gtc gcg cgt cat cag caa ggt cag ccg ctg tct ctg ccg    1776

Lys Leu Asn Val Ala Arg His Gln Gln Gly Gln Pro Leu Ser Leu Pro

            580                 585                 590

gtg cat gtg gct gat gct ttc cgc gcg gta ctg ctt gat gag aag att    1824

Val His Val Ala Asp Ala Phe Arg Ala Val Leu Leu Asp Glu Lys Ile

        595                 600                 605

gat cca gcg ctg gcg gca gaa atc ctg acg ctg cct tct gtc aat gaa    1872

Asp Pro Ala Leu Ala Ala Glu Ile Leu Thr Leu Pro Ser Val Asn Glu

    610                 615                 620

atg gct gaa ttg ttc gat atc atc gac ccg att gct att gcc gaa gta    1920

Met Ala Glu Leu Phe Asp Ile Ile Asp Pro Ile Ala Ile Ala Glu Val

625                 630                 635                 640

cgc gaa gca ctc act cgt act ctg gcg act gaa ctg gcg gat gag cta    1968

Arg Glu Ala Leu Thr Arg Thr Leu Ala Thr Glu Leu Ala Asp Glu Leu

                645                 650                 655

ctg gct att tac aac gcg aat tac cag agc gag tac cgt gtt gag cat    2016

Leu Ala Ile Tyr Asn Ala Asn Tyr Gln Ser Glu Tyr Arg Val Glu His

            660                 665                 670

gaa gat att gca aaa cgc act ctg cgt aat gcc tgc ctg cgt ttc ctc    2064

Glu Asp Ile Ala Lys Arg Thr Leu Arg Asn Ala Cys Leu Arg Phe Leu

        675                 680                 685

gct ttt ggt gaa acg cat ctg gct gat gtg ctg gtg agc aag cag ttc    2112

Ala Phe Gly Glu Thr His Leu Ala Asp Val Leu Val Ser Lys Gln Phe

    690                 695                 700

cac gaa gca aac aat atg act gat gcg ctg gcg gcg ctt tct gcg gcg    2160

His Glu Ala Asn Asn Met Thr Asp Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Ala

705                 710                 715                 720

gtt gcc gca cag ctg cct tgc cgt gac gcg ctg atg cag gag tac gac    2208

Val Ala Ala Gln Leu Pro Cys Arg Asp Ala Leu Met Gln Glu Tyr Asp

                725                 730                 735

gac aag tgg cat cag aac ggt ctg gtg atg gat aaa tgg ttt atc ctg    2256

Asp Lys Trp His Gln Asn Gly Leu Val Met Asp Lys Trp Phe Ile Leu

            740                 745                 750

caa gcc acc agc ccg gcg gcg aat gtg ctg gag acg gtg cgc ggc ctg    2304

Gln Ala Thr Ser Pro Ala Ala Asn Val Leu Glu Thr Val Arg Gly Leu

        755                 760                 765

ttg cag cat cgc tca ttt acc atg agc aac ccg aac cgt att cgt tcg    2352

Leu Gln His Arg Ser Phe Thr Met Ser Asn Pro Asn Arg Ile Arg Ser

    770                 775                 780

ttg att ggc gcg ttt gcg ggc agc aat ccg gca gcg ttc cat gcc gaa    2400

Leu Ile Gly Ala Phe Ala Gly Ser Asn Pro Ala Ala Phe His Ala Glu

785                 790                 795                 800

gat ggc agc ggt tac ctg ttc ctg gtg gaa atg ctt acc gac ctc aac    2448

Asp Gly Ser Gly Tyr Leu Phe Leu Val Glu Met Leu Thr Asp Leu Asn

                805                 810                 815

agc cgt aac ccg cag gtg gct tca cgt ctg att gaa ccg ctg att cgc    2496

Ser Arg Asn Pro Gln Val Ala Ser Arg Leu Ile Glu Pro Leu Ile Arg

            820                 825                 830

ctg aaa cgt tac gat gcc aaa cgt cag gag aaa atg cgc gcg gcg ctg    2544

Leu Lys Arg Tyr Asp Ala Lys Arg Gln Glu Lys Met Arg Ala Ala Leu

        835                 840                 845

gaa cag ttg aaa ggg ctg gaa aat ctc tct ggc gat ctg tac gag aag  2592

Glu Gln Leu Lys Gly Leu Glu Asn Leu Ser Gly Asp Leu Tyr Glu Lys

    850                 855                 860

ata act aaa gca ctg gct                                          2610

Ile Thr Lys Ala Leu Ala

865                 870

<210>59

<211>1605

<212>DNA

<213>大肠埃希氏杆菌

<400>59

atg cgt att tcc ttg aaa aag tca ggg atg ctg aag ctt ggt ctc agc  48

Met Arg Ile Ser Leu Lys Lys Ser Gly Met Leu Lys Leu Gly Leu Ser

  1               5                  10                  15

ctg gtg gct atg acc gtc gca gca agt gtt cag gct aaa act ctg gtt  96

Leu Val Ala Met Thr Val Ala Ala Ser Val Gln Ala Lys Thr Leu Val

             20                  25                  30

tat tgc tca gaa gga tct ccg gaa ggg ttt aac ccg cag ctg ttt acc  144

Tyr Cys Ser Glu Gly Ser Pro Glu Gly Phe Asn Pro Gln Leu Phe Thr

         35                  40                  45

tcc ggc acc acc tat gac gcc tct tcc gtc ccg ctt tat aac cgt ctg  192

Ser Gly Thr Thr Tyr Asp Ala Ser Ser Val Pro Leu Tyr Asn Arg Leu

     50                  55                  60

gtt gaa ttt aaa atc ggc acc acc gaa gtg atc ccg ggc ctc gct gaa  240

Val Glu Phe Lys Ile Gly Thr Thr Glu Val Ile Pro Gly Leu Ala Glu

 65                  70                  75                  80

aag tgg gaa gtc agc gaa gac ggt aaa acc tat acc ttc cat ctg cgt  288

Lys Trp Glu Val Ser Glu Asp Gly Lys Thr Tyr Thr Phe His Leu Arg

                 85                  90                  95

aaa ggt gtg aag tgg cac gac aat aaa gaa ttc aaa ccg acg cgt gaa  336

Lys Gly Val Lys Trp His Asp Asn Lys Glu Phe Lys Pro Thr Arg Glu

            100                 105                 110

ctg aac gcc gat gat gtg gtg ttc tcg ttc gat cgt cag aaa aac gcg  384

Leu Asn Ala Asp Asp Val Val Phe Ser Phe Asp Arg Gln Lys Asn Ala

        115                 120                 125

caa aac ccg tac cat aaa gtt tct ggc ggc agc tac gaa tac ttc gaa    432

Gln Asn Pro Tyr His Lys Val Ser Gly Gly Ser Tyr Glu Tyr Phe Glu

    130                 135                 140

ggc atg ggc ttg cca gag ctg atc agt gaa gtg aaa aag gtg gac gac    480

Gly Met Gly Leu Pro Glu Leu Ile Ser Glu Val Lys Lys Val Asp Asp

145                 150                 155                 160

aac acc gtt cag ttt gtg ctg act cgc ccg gaa gcg ccg ttc ctc gct    528

Asn Thr Val Gln Phe Val Leu Thr Arg Pro Glu Ala Pro Phe Leu Ala

                165                 170                 175

gac ctg gca atg gac ttc gcc tct att ctg tca aaa gaa tat gct gat    576

Asp Leu Ala Met Asp Phe Ala Ser Ile Leu Ser Lys Glu Tyr Ala Asp

            180                 185                 190

gcg atg atg aaa gcc ggt aca ccg gaa aaa ctg gac ctc aac cca atc    624

Ala Met Met Lys Ala Gly Thr Pro Glu Lys Leu Asp Leu Asn Pro Ile

        195                 200                 205

gga acc ggt ccg ttc cag tta cag cag tat caa aaa gat tcc cgt atc    672

Gly Thr Gly Pro Phe Gln Leu Gln Gln Tyr Gln Lys Asp Ser Arg Ile

    210                 215                 220

cgc tac aaa gcg ttt gat ggc tac tgg ggc acc aaa ccg cag atc gat    720

Arg Tyr Lys Ala Phe Asp Gly Tyr Trp Gly Thr Lys Pro Gln Ile Asp

225                 230                 235                 240

acg ctg gtt ttc tct att acc cct gac gct tcc gtg cgt tac gcg aaa    768

Thr Leu Val Phe Ser Ile Thr Pro Asp Ala Ser Val Arg Tyr Ala Lys

                245                 250                 255

ttg cag aag aat gaa tgc cag gtg atg ccg tac ccg aac ccg gca gat    816

Leu Gln Lys Asn Glu Cys Gln Val Met Pro Tyr Pro Asn Pro Ala Asp

            260                 265                 270

atc gct cgc atg aag cag gat aaa tcc atc aat ctg atg gaa atg ccg    864

Ile Ala Arg Met Lys Gln Asp Lys Ser Ile Asn Leu Met Glu Met Pro

        275                 280                 285

ggg ctg aac gtc ggt tat ctc tcg tat aac gtg cag aaa aaa cca ctc    912

Gly Leu Asn Val Gly Tyr Leu Ser Tyr Asn Val Gln Lys Lys Pro Leu

    290                 295                 300

gat gac gtg aaa gtt cgc cag gct ctg acc tac gcg gtg aac aaa gac    960

Asp Asp Val Lys Val Arg Gln Ala Leu Thr Tyr Ala Val Asn Lys Asp

305                 310                 315                 320

gcg atc atc aaa gcg gtt tat cag ggc gcg ggc gta tca gcg aaa aac    1008

Ala Ile Ile Lys Ala Val Tyr Gln Gly Ala Gly Val Ser Ala Lys Asn

                325                 330                 335

ctg atc ccg cca acc atg tgg ggc tat aac gac gac gtt cag gac tac    1056

Leu Ile Pro Pro Thr Met Trp Gly Tyr Asn Asp Asp Val Gln Asp Tyr

            340                 345                 350

acc tac gat cct gaa aaa gcg aaa gcc ttg ctg aaa gaa gcg ggt ctg    1104

Thr Tyr Asp Pro Glu Lys Ala Lys Ala Leu Leu Lys Glu Ala Gly Leu

        355                 360                 365

gaa aaa ggt ttc tcc atc gac ctg tgg gcg atg ccg gta caa cgt ccg    1152

Glu Lys Gly Phe Ser Ile Asp Leu Trp Ala Met Pro Val Gln Arg Pro

    370                 375                 380

tat aac ccg aac gct cgc cgc atg gcg gag atg att cag gca gac tgg    1200

Tyr Asn Pro Asn Ala Arg Arg Met Ala Glu Met Ile Gln Ala Asp Trp

385                 390                 395                 400

gcg aaa gtc ggc gtg cag gcc aaa att gtc acc tac gaa tgg ggt gag    1248

Ala Lys Val Gly Val Gln Ala Lys Ile Val Thr Tyr Glu Trp Gly Glu

                405                 410                 415

tac ctc aag cgt gcg aaa gat ggc gag cac cag acg gta atg atg ggc    1296

Tyr Leu Lys Arg Ala Lys Asp Gly Glu His Gln Thr Val Met Met Gly

            420                 425                 430

tgg act ggc gat aac ggg gat ccg gat aac ttc ttc gcc acc ctg ttc    1344

Trp Thr Gly Asp Asn Gly Asp Pro Asp Asn Phe Phe Ala Thr Leu Phe

        435                 440                 445

agc tgc gcc gcc tct gaa caa ggc tcc aac tac tca aaa tgg tgc tac    1392

Ser Cys Ala Ala Ser Glu Gln Gly Ser Asn Tyr Ser Lys Trp Cys Tyr

    450                 455                 460

aaa ccg ttt gaa gat ctg att caa ccg gcg cgt gct acc gac gac cac    1440

Lys Pro Phe Glu Asp Leu Ile Gln Pro Ala Arg Ala Thr Asp Asp His

465                 470                 475                 480

aat aaa cgc gtt gaa ctg tac aaa caa gcg cag gtg gtg atg cac gat    1488

Asn Lys Arg Val Glu Leu Tyr Lys Gln Ala Gln Val Val Met His Asp

                485                 490                 495

cag gct ccg gca ctg atc atc gct cac tcc acc gtg ttt gaa ccg gta  1536

Gln Ala Pro Ala Leu Ile Ile Ala His Ser Thr Val Phe Glu Pro Val

            500                 505                 510

cgt aaa gaa gtt aaa ggc tat gtg gtt gat cca tta ggc aaa cat cac  1584

Arg Lys Glu Val Lys Gly Tyr Val Val Asp Pro Leu Gly Lys His His

        515                 520                 525

ttc gaa aac gtc tct atc gaa                                      1605

Phe Glu Asn Val Ser Ile Glu

    530                 535

<210>60

<211>1017

<212>DNA

<213>大肠埃希氏杆菌

<400>60

atg ttg cag ttt att ctc cga cgt ttg gga ctc gtc atc ccc acg ttt  48

Met Leu Gln Phe Ile Leu Arg Arg Leu Gly Leu Val Ile Pro Thr Phe

  1               5                  10                  15

atc ggt att acc ctt ctc aca ttt gcc ttt gtc cac atg atc ccg ggc  96

Ile Gly Ile Thr Leu Leu Thr Phe Ala Phe Val His Met Ile Pro Gly

             20                  25                  30

gat ccg gtg atg atc atg gcg ggc gaa cgt ggg atc tcc cca gag cgt  144

Asp Pro Val Met Ile Met Ala Gly Glu Arg Gly Ile Ser Pro Glu Arg

         35                  40                  45

cac gcg cag ctg ctg gct gaa ctc ggc tta gat aaa ccg atg tgg cag  192

His Ala Gln Leu Leu Ala Glu Leu Gly Leu Asp Lys Pro Met Trp Gln

     50                  55                  60

cag tat ctc cat tac att tgg ggc gtt atg cat ggc gat cta ggc att  240

Gln Tyr Leu His Tyr Ile Trp Gly Val Met His Gly Asp Leu Gly Ile

 65                  70                  75                  80

tca atg aaa agc cgc atc ccg gtt tgg gaa gag ttc gtg ccg cgc ttc  288

Ser Met Lys Ser Arg Ile Pro Val Trp Glu Glu Phe Val Pro Arg Phe

                 85                  90                  95

cag gcc acg ctg gaa ctt ggc gtc tgc gcg atg att ttt gct acg gca    336

Gln Ala Thr Leu Glu Leu Gly Val Cys Ala Met Ile Phe Ala Thr Ala

            100                 105                 110

gtc ggt att ccg gtc ggc gtg ctg gct gcg gtt aaa cgc ggt tcc att    384

Val Gly Ile Pro Val Gly Val Leu Ala Ala Val Lys Arg Gly Ser Ile

        115                 120                 125

ttc gat cac aca gcg gtt ggc ctg gcg ctg aca ggt tat tca atg cct    432

Phe Asp His Thr Ala Val Gly Leu Ala Leu Thr Gly Tyr Ser Met Pro

    130                 135                 140

atc ttc tgg tgg ggc atg atg ctg atc atg ctg gtt tcg gtg cac tgg    480

Ile Phe Trp Trp Gly Met Met Leu Ile Met Leu Val Ser Val His Trp

145                 150                 155                 160

aac ctg acg ccc gtc tcc ggt cgc gtg agc gat atg gtg ttc ctc gat    528

Asn Leu Thr Pro Val Ser Gly Arg Val Ser Asp Met Val Phe Leu Asp

                165                 170                 175

gac tcc aat ccg tta acc ggt ttt atg cta atc gac acc gcc atc tgg    576

Asp Ser Asn Pro Leu Thr Gly Phe Met Leu Ile Asp Thr Ala Ile Trp

            180                 185                 190

ggt gaa gac ggc aac ttt atc gat gcc gtc gcc cat atg atc ttg cct    624

Gly Glu Asp Gly Asn Phe Ile Asp Ala Val Ala His Met Ile Leu Pro

        195                 200                 205

gcc att gtg ctg ggt act att ccg ctg gcg gtc att gtg cgt atg aca    672

Ala Ile Val Leu Gly Thr Ile Pro Leu Ala Val Ile Val Arg Met Thr

    210                 215                 220

cgc tcc tcg atg ctg gaa gtg ctg ggc gag gat tac atc cgc acc gcg    720

Arg Ser Ser Met Leu Glu Val Leu Gly Glu Asp Tyr Ile Arg Thr Ala

225                 230                 235                 240

cgc gcc aaa ggg cta acc cgc atg cgg gtg att atc gtc cat  gcg ctg    768

Arg Ala Lys Gly Leu Thr Arg Met Arg Val Ile Ile Val His Ala Leu

                245                 250                 255

cgt aac gcg atg ctg ccg gtg gtg acc gtt atc ggc ctg cag gtg gga    816

Arg Asn Ala Met Leu Pro Val Val Thr Val Ile Gly Leu Gln Val Gly

            260                 265                 270

aca ttg ctg gcg ggg gcg att ctg acc gaa acc atc ttc tcg tgg ccc    864

Thr Leu Leu Ala Gly Ala Ile Leu Thr Glu Thr Ile Phe Ser Trp Pro

        275                 280                 285

ggt ctg gga cgc tgg ttg att gac gca ctg caa cgc cgc gac tat ccg  912

Gly Leu Gly Arg Trp Leu Ile Asp Ala Leu Gln Arg Arg Asp Tyr Pro

    290                 295                 300

gta gtg cag ggc ggc gta ttg ctg gtg gcg acg atg att atc ctc gtc  960

Val Val Gln Gly Gly Val Leu Leu Val Ala Thr Met Ile Ile Leu Val

305                 310                 315                 320

aac ttg ctg gtc gat ctg ctg tac ggc gtg gtg aac ccg cgt att cgt  1008

Asn Leu Leu Val Asp Leu Leu Tyr Gly Val Val Asn Pro Arg Ile Arg

                325                 330                 335

cat aag aag                                                      1017

His Lys Lys

<210>61

<211>900

<212>DNA

<213>大肠埃希氏杆菌

<400>61

atg tca cag gtt act gaa aat aaa gtg att agc gca ccg gtg ccg atg  48

Met Ser Gln Val Thr Glu Asn Lys Val Ile Ser Ala Pro Val Pro Met

  1               5                  10                  15

acc ccg tta cag gag ttc tgg cac tat ttt aaa cgc aac aaa ggc gcg  96

Thr Pro Leu Gln Glu Phe Trp His Tyr Phe Lys Arg Asn Lys Gly Ala

             20                  25                  30

gtc gtc ggg ctg gtt tac gtc gtc atc gtg ctg ttc atc gcg atc ttt  144

Val Val Gly Leu Val Tyr Val Val Ile Val Leu Phe Ile Ala Ile Phe

         35                  40                  45

gcc aac tgg att gca ccc tat aac ccg gcg gaa cag ttc cgc gat gca  192

Ala Asn Trp Ile Ala Pro Tyr Asn Pro Ala Glu Gln Phe Arg Asp Ala

     50                  55                  60

ctg ctc gcc ccg cca gcc tgg cag gaa ggc ggc agc atg gcg cac ttg  240

Leu Leu Ala Pro Pro Ala Trp Gln Glu Gly Gly Ser Met Ala His Leu

 65                  70                  75                  80

ctg ggc acc gat gac gta ggc cgt gat gtg ctg tcg cgc ctg atg tac  288

Leu Gly Thr Asp Asp Val Gly Arg Asp Val Leu Ser Arg Leu Met Tyr

                 85                  90                  95

ggt gcg cgc ctg tcg ctg ctg gtt ggc tgt ctg gta gtt gtg tta tcg    336

Gly Ala Arg Leu Ser Leu Leu Val Gly Cys Leu Val Val Val Leu Ser

            100                 105                 110

ctg att atg ggc gtt att ctc ggc ctg atc gcc ggt tac ttt ggc ggc    384

Leu Ile Met Gly Val Ile Leu Gly Leu Ile Ala Gly Tyr Phe Gly Gly

        115                 120                 125

ctg gtc gat aac atc att atg cgc gtg gtc gat atc atg ctg gcg ctg    432

Leu Val Asp Asn Ile Ile Met Arg Val Val Asp Ile Met Leu Ala Leu

    130                 135                 140

cca agt ctg ctg ctg gcg ctg gtg ctg gtg gca att ttc ggc ccg tcg    480

Pro Ser Leu Leu Leu Ala Leu Val Leu Val Ala Ile Phe Gly Pro Ser

145                 150                 155                 160

att ggt aac gcc gcg ctg gca ctg acc ttc gtt gcc ttg ccg cac tat    528

Ile Gly Asn Ala Ala Leu Ala Leu Thr Phe Val Ala Leu Pro His Tyr

                165                 170                 175

gtg cgc tta acc cgc gcc gcc gtg ctg gtg gaa gtt aac cgc gat tac    576

Val Arg Leu Thr Arg Ala Ala Val Leu Val Glu Val Asn Arg Asp Tyr

            180                 185                 190

gtc acc gcg tct cgc gtg gcg ggt gcc ggg gcg atg cgt cag atg ttt    624

Val Thr Ala Ser Arg Val Ala Gly Ala Gly Ala Met Arg Gln Met Phe

        195                 200                 205

att aac atc ttc ccg aac tgc ctt gcg ccg ctg att gtt cag gcg tcg    672

Ile Asn Ile Phe Pro Asn Cys Leu Ala Pro Leu Ile Val Gln Ala Ser

    210                 215                 220

ctc ggt ttc tct aac gcc att ctc gat atg gct gct ctt ggt ttc ctc    720

Leu Gly Phe Ser Asn Ala Ile Leu Asp Met Ala Ala Leu Gly Phe Leu

225                 230                 235                 240

ggc atg ggg gca cag ccg cca acg cct gag tgg ggc acc atg ctc tcc    768

Gly Met Gly Ala Gln Pro Pro Thr Pro Glu Trp Gly Thr Met Leu Ser

                245                 250                 255

gac gtg ttg cag ttc gcg caa agc gcc tgg tgg gtc gtg acc ttc ccg    816

Asp Val Leu Gln Phe Ala Gln Ser Ala Trp Trp Val Val Thr Phe Pro

            260                 265                 270

ggt ctg gcg atc ctg ctg acg gtg ctg gca ttt aac ctg atg ggt gac  864

Gly Leu Ala Ile Leu Leu Thr Val Leu Ala Phe Asn Leu Met Gly Asp

        275                 280                 285

ggt ctg cgt gac gcg ctc gat ccc aaa ctg aag cag                  900

Gly Leu Arg Asp Ala Leu Asp Pro Lys Leu Lys Gln

    290                 295                 300

<210>62

<211>981

<212>DNA

<213>大肠埃希氏杆菌

<400>62

atg gcg tta tta aat gta gat aaa tta tcg gtg cat ttc ggc gac gaa  48

Met Ala Leu Leu Asn Val Asp Lys Leu Ser Val His Phe Gly Asp Glu

  1               5                  10                  15

agc gcg ccg ttc cgc gcc gta gac cgc atc agc tac agc gta aaa cag  96

Ser Ala Pro Phe Arg Ala Val Asp Arg Ile Ser Tyr Ser Val Lys Gln

             20                  25                  30

ggc gaa gtg gtc ggg att gtg ggt gag tcc ggc tcc ggt aag tcg gtc  144

Gly Glu Val Val Gly Ile Val Gly Glu Ser Gly Ser Gly Lys Ser Val

         35                  40                  45

agt tca ctg gcg att atg ggg ctg att gat tat ccg ggc cgc gta atg  192

Ser Ser Leu Ala Ile Met Gly Leu Ile Asp Tyr Pro Gly Arg Val Met

     50                  55                  60

gca gaa aaa ctg gag ttt aac ggc cag gat ttg cag cgt atc tca gaa  240

Ala Glu Lys Leu Glu Phe Asn Gly Gln Asp Leu Gln Arg Ile Ser Glu

 65                  70                  75                  80

aaa gag cgc cgc aac ctg gtg ggt gcc gaa gtg gcg atg atc ttc cag  288

Lys Glu Arg Arg Asn Leu Val Gly Ala Glu Val Ala Met Ile Phe Gln

                 85                  90                  95

gac ccg atg acc agc ctt aac ccg tgc tac acc gtg ggt ttc cag att  336

Asp Pro Met Thr Ser Leu Asn Pro Cys Tyr Thr Val Gly Phe Gln Ile

            100                 105                 110

atg gaa gcg att aag gtg cat cag ggc ggc aac aaa agt acc cgc cgt    384

Met Glu Ala Ile Lys Val His Gln Gly Gly Asn Lys Ser Thr Arg Arg

        115                 120                 125

cag cga gcg att gac ctg ctg aat cag gtc ggt att ccc gat ccg gca    432

Gln Arg Ala Ile Asp Leu Leu Asn Gln Val Gly Ile Pro Asp Pro Ala

    130                 135                 140

tcg cgt ctg gat gtt tac ccg cat cag ctt tcc ggc ggc atg agc cag    480

Ser Arg Leu Asp Val Tyr Pro His Gln Leu Ser Gly Gly Met Ser Gln

145                 150                 155                 160

cgc gtg atg atc gcc atg gcg att gcc tgt cgg cca aaa ctg ctg att    528

Arg Val Met Ile Ala Met Ala Ile Ala Cys Arg Pro Lys Leu Leu Ile

                165                 170                 175

gcc gat gaa ccg acc acc gcg ctg gac gtg acc att cag gcg caa atc    576

Ala Asp Glu Pro Thr Thr Ala Leu Asp Val Thr Ile Gln Ala Gln Ile

            180                 185                 190

atc gaa cta ctg ctg gag cta cag cag aaa gag aac atg gcg ctg gtg    624

Ile Glu Leu Leu Leu Glu Leu Gln Gln Lys Glu Asn Met Ala Leu Val

        195                 200                 205

tta att acc cat gac ctg gcg ctg gtg gcg gaa gcg gca cat aaa atc    672

Leu Ile Thr His Asp Leu Ala Leu Val Ala Glu Ala Ala His Lys Ile

    210                 215                 220

atc gtg atg tat gca ggc cag gtg gtg gaa acc ggt gat gcg cac gcc    720

Ile Val Met Tyr Ala Gly Gln Val Val Glu Thr Gly Asp Ala His Ala

225                 230                 235                 240

atc ttc cat gcg ccg cgt cac ccg tat act cag gca ttg ctg cgt gcg    768

Ile Phe His Ala Pro Arg His Pro Tyr Thr Gln Ala Leu Leu Arg Ala

                245                 250                 255

ctg cca gaa ttt gct cag gac aaa gaa cgt ctg gcg tcg ttg cca ggt    816

Leu Pro Glu Phe Ala Gln Asp Lys Glu Arg Leu Ala Ser Leu Pro Gly

            260                 265                 270

gtc gtt ccc ggc aag tac gac cgc ccg aac ggc tgc ctg ctt aac ccg    864

Val Val Pro Gly Lys Tyr Asp Arg Pro Asn Gly Cys Leu Leu Asn Pro

        275                 280                 285

cgc tgc ccc tat gcc act gac aga tgt cgc gct gaa gaa ccg gcg ctg  912

Arg Cys Pro Tyr Ala Thr Asp Arg Cys Arg Ala Glu Glu Pro Ala Leu

    290                 295                 300

aat atg ctc gct gac ggg cgt cag tcc aaa tgc cat tac cca ctt gat  960

Asn Met Leu Ala Asp Gly Arg Gln Ser Lys Cys His Tyr Pro Leu Asp

305                 310                 315                 320

gat gcc ggg agg ccg aca cta                                      981

Asp Ala Gly Arg Pro Thr Leu

                325

<210>63

<211>1002

<212>DNA

<213>大肠埃希氏杆菌

<400>63

atg agt acg caa gag gcc acc ctg caa caa ccg ctg ttg cag gct atc  48

Met Ser Thr Gln Glu Ala Thr Leu Gln Gln Pro Leu Leu Gln Ala Ile

  1               5                  10                  15

gac ctg aaa aaa cat tat ccg gtg aag aaa ggc atg ttc gcg ccg gaa  96

Asp Leu Lys Lys His Tyr Pro Val Lys Lys Gly Met Phe Ala Pro Glu

             20                  25                  30

cgt ctg gtt aaa gcg ctg gat ggc gtt tcg ttt aac ctt gaa cgt ggc  144

Arg Leu Val Lys Ala Leu Asp Gly Val Ser Phe Asn Leu Glu Arg Gly

         35                  40                  45

aaa acg ctg gca gta gtg ggc gaa tct ggc tgc ggt aaa tcg acc ctc  192

Lys Thr Leu Ala Val Val Gly Glu Ser Gly Cys Gly Lys Ser Thr Leu

     50                  55                  60

ggt cgg ttg ctg acg atg att gaa atg ccc acc ggt ggc gag ctg tat  240

Gly Arg Leu Leu Thr Met Ile Glu Met Pro Thr Gly Gly Glu Leu Tyr

 65                  70                  75                  80

tac cag ggg cag gat ctg ctt aag cac gat ccg cag gcg cag aag ctg  288

Tyr Gln Gly Gln Asp Leu Leu Lys His Asp Pro Gln Ala Gln Lys Leu

                 85                  90                  95

cgt cgg cag aaa atc cag atc gtc ttc cag aac cct tac ggt tcg ctg  336

Arg Arg Gln Lys Ile Gln Ile Val Phe Gln Asn Pro Tyr Gly Ser Leu

            100                 105                 110

aat ccg cgt aaa aaa gtc ggg caa att ctt gaa gag ccg ctg ctg atc    384

Asn Pro Arg Lys Lys Val Gly Gln Ile Leu Glu Glu Pro Leu Leu Ile

        115                 120                 125

aac acc agc tta agc aaa gaa cag cgt cgg gaa aaa gcc ctg tcg atg    432

Asn Thr Ser Leu Ser Lys Glu Gln Arg Arg Glu Lys Ala Leu Ser Met

    130                 135                 140

atg gcg aaa gtc ggc ctg aaa acc gag cac tat gac cgc tat ccg cat    480

Met Ala Lys Val Gly Leu Lys Thr Glu His Tyr Asp Arg Tyr Pro His

145                 150                 155                 160

atg ttc tcc ggc ggt cag cgt cag cgt atc gcc atc gcc cgt ggt ctg    528

Met Phe Ser Gly Gly Gln Arg Gln Arg Ile Ala Ile Ala Arg Gly Leu

                165                 170                 175

atg ctc gac ccg gat gtg gtg att gcc gat gaa ccg gtt tcc gcg ctg    576

Met Leu Asp Pro Asp Val Val Ile Ala Asp Glu Pro Val Ser Ala Leu

            180                 185                 190

gat gtt tca gtg cgc gcg cag gtg ctg aat ctg atg atg gat ttg cag    624

Asp Val Ser Val Arg Ala Gln Val Leu Asn Leu Met Met Asp Leu Gln

        195                 200                 205

cag gag ttg ggg ctg tct tat gtc ttt atc tcc cac gac ctg tcg gtg    672

Gln Glu Leu Gly Leu Ser Tyr Val Phe Ile Ser His Asp Leu Ser Val

    210                 215                 220

gtg gag cac att gct gat gaa gtg atg gtg atg tac ctg ggc cgc tgc    720

Val Glu His Ile Ala Asp Glu Val Met Val Met Tyr Leu Gly Arg Cys

225                 230                 235                 240

gtg gag aag gga acg aaa gac caa atc ttc aat aac ccg cgc cat ccg    768

Val Glu Lys Gly Thr Lys Asp Gln Ile Phe Asn Asn Pro Arg His Pro

                245                 250                 255

tac act cag gcg cta ctt tcc gcg acg ccg cgc ctg aac ccg gac gat    816

Tyr Thr Gln Ala Leu Leu Ser Ala Thr Pro Arg Leu Asn Pro Asp Asp

            260                 265                 270

cgc cgc gag cgc atc aag ctc agc ggt gaa cta cca agc cca ctg aat    864

Arg Arg Glu Arg Ile Lys Leu Ser Gly Glu Leu Pro Ser Pro Leu Asn

        275                 280                 285

cca ccg ccg ggt tgc gcc ttc aac gcc cgc tgt cgt cgg cgc ttc ggc  912

Pro Pro Pro Gly Cys Ala Phe Asn Ala Arg Cys Arg Arg Arg Phe Gly

    290                 295                 300

ccc tgc acc cag ttg cag ccg cag cta aaa gac tac ggc ggt caa ctg  960

Pro Cys Thr Gln Leu Gln Pro Gln Leu Lys Asp Tyr Gly Gly Gln Leu

305                 310                 315                 320

gta gct tgt ttt gct gtt gat cag gat gaa aat ccg cag cgt          1002

Val Ala Cys Phe Ala Val Asp Gln Asp Glu Asn Pro Gln Arg

                325                 330

<210>64

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>64

ctaaccctgt gacctgcaat actgttttgc gggtgagtgt aggctggagc tgcttc    56

<210>65

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>65

gaaactgccg gaaggcgatt aaacgccatc cggcagcata tgaatatcct ccttag    56

<210>66

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>66

ttacgcaaca ggaatagact gaacaccaga ctctatgtgt aggctggagc tgcttc    56

<210>67

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>67

agaaaacagg ggtaaattcc ccgaatggcg gcgctacata tgaatatcct ccttag    56

<210>68

<211>56

    <212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>68

atggagttta gtgtaaaaag cggtagcccg gagaaagtgt aggctggagc tgcttc    56

<210>69

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>69

ttactcttcg ccgttaaacc cagcgcggtt taacagcata tgaatatcct ccttag    56

<210>70

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>70

atgacagaag cgatgaagat taccctctct acccaagtgt aggctggagc tgcttc    56

<210>71

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>71

ttacgccgtt aacagattag ctatcgtgcg cacacccata tgaatatcct ccttag    56

<210>72

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>72

gcatccccac ctcataacgt tgacccgacc gggcaagtgt aggctggagc tgcttc  56

<210>73

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>73

ctgtacggca ttttgctatg cttgtcgcca ctgttgcata tgaatatcct ccttag  56

<210>74

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>74

gtgtctgaac tgtctcaatt a                 21

<210>75

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>75

cggaatttct ttcagcagtt c                 21

<210>76

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>76

atgactcaac agccacaagc c                 21

<210>77

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>77

tgctttagtt atcttctcgt a                 21

<210>78

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>78

agtgcctgca tcgtcgtggg c                 21

<210>79

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>79

ggcgcctttt gctttaccag a                 21

<210>80

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>80

gacgcgcgct ggggagaaaa a                 21

<210>81

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>81

cgtagcgccc gcagaccact g                 21

<210>82

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>82

atgcgtattt ccttgaaaaa g                 21

<210>83

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>83

ttattcgata gagacgtttt c                 21

<210>84

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>84

tacactcgag attaaagagg agaaattaa         29

<210>85

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>85

ttaggatcct catactggca gcacatactt        30

<210>86

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>86

caagaattct catgtttgac agct              24

<210>87

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>87

taactcgaga ttcccttttt acgtgaac          28

<210>88

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>88

gttgagcggc tgccagagcc tttagccgag gaatcagtgt aggctggagc tgcttc    56

<210>89

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>89

ctgccagctt gcccgcacca gttcacgctc tgcggtcata tgaatatcct ccttag    56

<210>90

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>90

ctggacgatg tccgcgaagc actggccgaa gtcggtgtgt aggctggagc tgcttc    56

<210>91

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>91

tgccgcgtcg tcctcttcac cggtacggat gcgaatcata tgaatatcct ccttag    56

<210>92

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>92

agccaaccgc cgcaggccga cgaatgg                                    27

<210>93

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>93

ggtcagcgcc atcgcttcct gctct tc          27

<210>94

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>94

tcccgacacg agctggatgc aaacgat           27

<210>95

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>95

atggaaacat ccggcaaccc ttgacgc           27

<210>96

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>96

aaaggatccc atatacagga ggagacagat        30

<210>97

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>97

tatggatcct taagcacccg ccacagatga        30

<210>98

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>98

tatatcgatc aaaaaggcaa cactatgaca tcg    33

<210>99

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>99

ttaggatcct catcaggttg gatcaacagg cac    33

<210>100

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>100

actagatcta acaggatcgc catcatgcaa        30

<210>101

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>101

ataggatcct taagccacgc gagccgtcag ctg    33

<210>102

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>102

attatcgata acaggatcgc catcatgcaa        30

<210>103

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>103

ttagcatgct tattactggc gattgtcatt        30

<210>104

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>104

ggtctcaatt tattgacgaa gaggattaag tatctcgtgt aggctggagc tgcttc    56

<210>105

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>105

tgcggcgtga acgccttatc cggcctacaa gttcgtcata tgaatatcct ccttag    56

<210>106

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>106

gacggtcgtt accaggtgaa tcgcgga                                    27

<210>107

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>107

gaactctttc aacttctgct gctcgcc                                    27

<210>108

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>108

aatatcgata aagacaggat tgggtaaatg        30

<210>109

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>109

ttagcatgct tagaggacgc cctgctcggc gaagat 36

<210>110

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>110

ccgcaagatc tcgtaaaaag ggtatcgat         29

<210>111

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>111

caagaattct catgtttgac agct              24

<210>112

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>112

ttaggatcct catactggca gcacatactt                               30

<210>113

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>113

ctttaggcat tccttcgaac aagatgcaag aaaagagtgt aggctggagc tgcttc  56

<210>114

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>114

atagttagtt ccccgtcctg aatcttgaga aacagacata tgaatatcct ccttag  56

<210>115

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>115

gaagtgactt tcccacatgc cgaagtt                                  27

<210>116

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>116

gtgttgctgc cagtcatttt gatttaacgg ctgctg      36

<210>117

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>117

cagccgttaa atcaaaatga ctggcagcaa cactgc      36

<210>118

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>118

gctggctaac atgaggaaat cggggtt                27

<210>119

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>119

gtaagcccac catcgttaag ccgggta                27

<210>120

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>120

gaccagaacc ggaccaggac gacctga                                  27

<210>121

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>121

ctctacagct tcgaattccc ggaatcaccg ggcgcggtgt aggctggagc tgcttc  56

<210>122

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>122

gttccagtac gtacccagcg tgttgaggaa gcgcagcata tgaatatcct ccttag  56

<210>123

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>123

gaacagcgtg aagcgttgtt g                                        21

<210>124

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>124

gttgaggaag cgcaggaacg cgcccggtga ttccgg      36

<210>125

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>125

gaatcaccgg gcgcgttcct gcgcttcctc aacacg      36

<210>126

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>126

tttgagctgg gcgtgtgtgc g                      21

<210>127

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>127

aactctaaaa gcatatcgca ttcatctgga gctgatgtgt aggctggagc tgcttc    56

<210>128

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>128

ctggctcatg gtttgggtcc ttgtctcttt tagagccata tgaatatcct ccttag    56

<210>129

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>129

aacagccgcg tatgtgcgtt agctcgctgc gtggaagtgt aggctggagc tgcttc    56

<210>130

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>130

gacttctgcg gcacgccaga tattgttcag aacgtgcata tgaatatcct ccttag    56

<210>131

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>131

ttcatctgga gctgatttaa t            21

<210>132

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>132

caggcggcag tggttgcccg t            21

Claims (7)

1.二肽的制造方法，其特征是将具有生产具有由1种以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白质的能力，而且具有生产该1种以上的氨基酸中的至少1种氨基酸的能力的微生物在培养基中进行培养，使二肽在该培养基中生成、蓄积，从该培养基回收二肽，

其中在微生物只能生产1种氨基酸时，所述培养基是添加另外1种氨基酸的培养基，

其中微生物是属于埃希氏菌属(Escherichia)的微生物，以及

其中具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质是由选自以下[1]～[2]中的DNA编码的蛋白质：

[1]由序列号9～16和36中的任一个表示的碱基序列构成的DNA，

[2]由序列号39或40表示的碱基序列构成的DNA，

其中，

(1)当具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质是由由序列号9表示的碱基序列构成的DNA编码的蛋白质时，二肽是式R¹-R²表示的二肽：

式中，

R¹为L-Ala时，R²为L-Gln、Gly、L-Val、L-Leu、L-Iie、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-Tyr、L-Arg或L-His；

R¹为Gly时，R²为Gly、L-Phe、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Tyr或L-Arg；

R¹为L-Met时，R²为L-Phe、L-Met或L-Tyr；

R¹为L-Ser时，R²为L-Gln、Gly、L-Phe、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Tyr或L-His；以及

R¹为L-Thr时，R²为L-Gln、L-Leu、L-Phe、L-Met、L-Ser或L-Thr；

(2)当具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质是由由序列号10～16和36中的任一个表示的碱基序列构成的DNA编码的蛋白质时，二肽是L-Ala-L-Gln或L-Ala-L-Ala；

(3)当具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质是由由序列号39或40表示的碱基序列构成的DNA编码的蛋白质时，二肽是cyclo(L-Leu-L-Phe)、L-Leu-L-Phe、L-Phe-L-Leu、L-Ala-L-Ala、L-Leu-L-Leu或L-Phe-L-Phe。

2.权利要求1所述的制造方法，其中生产氨基酸的能力是通过选自以下[1]～[5]中的方法获得的：

[1]缓和或解除至少一个调控该氨基酸生物合成的结构的方法，

[2]对至少一个参与该氨基酸生物合成的酶表达增强的方法，

[3]使至少一个参与该氨基酸生物合成的酶基因的拷贝数增加的方法，

[4]对至少一个由该氨基酸生物合成途径到该氨基酸以外的代谢产物的旁路的代谢途径进行弱化或阻断的方法，

[5]与野生型株相比，选择对该氨基酸的类似物的抗性高的细胞株的方法。

3.权利要求1所述的制造方法，其中属于埃希氏菌属(Escherichia)的微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)。

4.权利要求1～3中的任一项所述的制造方法，其中微生物是选自下述[1]的1种以上的肽酶和选自下述[2]的具有1种以上肽转运活性的蛋白质的活性低下或丧失的微生物，

[1]肽酶是由序列号45～48中的任一个表示的氨基酸序列构成的蛋白质、

[2]由序列号49～53中的任一个表示的氨基酸序列构成的蛋白质。

5.权利要求1～3中的任一项所述的制造方法，其中微生物是选自下述[1]的3种以上肽酶的活性低下或丧失的微生物，

[1]肽酶是由序列号45～48中的任一个表示的氨基酸序列构成的蛋白质。

6.权利要求4或5所述的制造方法，其中微生物是属于埃希氏菌属(Escherichia)的微生物。

7.权利要求6所述的制造方法，其中属于埃希氏菌属(Escherichia)的微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)。

Images