JP5424530B2 - ジペプチドまたはジペプチド誘導体の製造法 - Google Patents
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化学合成法によるジペプチドの合成では、官能基の保護・脱保護などの操作が必要であり、またラセミ体も合成されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法とはいえない。また、化学合成法は大量の有機溶媒等を使うため環境衛生上も好ましい方法ではない。
しかし、タンパク質分解酵素の逆反応を利用した方法では、基質となるアミノ酸の官能基の保護・脱保護が必要であり、ペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解反応の阻止が困難といった問題点がある。耐熱性アミノアシルt−RNA合成酵素を利用する方法には、酵素の発現、目的産物以外の副生反応の阻止が困難という問題点がある。NRPSを利用する方法に関しては、酵素分子が巨大なためにDNA組換え法を用いて該酵素を発現することが困難であること、補酵素である4’−ホスフォパンテテイン(4’−phosphopantetheine)の供給が必要であり、効率的な製造法とはいえない。
非特許文献11参照)が報告されている。
(1)以下の[1]〜[7]のいずれかに記載の蛋白質、1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体、およびATPを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体[以下、ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)という]を生成、蓄積させ、該媒体中から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)の製造法[但し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)は、下記アミノ酸群Aから選ばれる同一のまたは異なるアミノ酸がペプチド結合によって結合した化合物ではない(アミノ酸群A:L−アラニン、L−グルタミン、L−グルタミン酸、L−バリン、L−ロイシン、L−イソロイシン、L−プロリン、L−フェニルアラニン、L−トリプトファン、L−メチオニン、L−セリン、L−スレオニン、L−システイン、L−アスパラギン、L−チロシン、L−リジン、L−アルギニン、L−ヒスチジン、L−アスパラギン酸、L−α−アミノ酪酸、L−アザセリン、L−テアニン、L−4−ヒドロキシプロリン、L−3−ヒドロキシプロリン、L−オルニチン、L−シトルリン、L−6−ジアゾ−5−オキソノルロイシン、グリシンおよびβ−アラニン)]。
[1]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質
[3]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列と65%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質
[4]配列番号17で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質
[5]配列番号37または38で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[6]配列番号37または38で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質
[7]配列番号37または38で表されるアミノ酸配列と65%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質
(2)以下の[1]〜[7]のいずれかに記載の蛋白質、1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体、およびATPを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成、蓄積させ、そのまま、または該媒体から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を修飾し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体[以下、ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)という]を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)の製造法[但し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)は、前記アミノ酸群Aから選ばれる同一のまたは異なるアミノ酸がペプチド結合によって結合した化合物ではない]。
[1]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質
[3]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列と65%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質
[4]配列番号17で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質
[5]配列番号37または38で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[6]配列番号37または38で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質
[7]配列番号37または38で表されるアミノ酸配列と65%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質
(3)以下の[1]〜[5]から選ばれるDNAを保持する細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成、蓄積させ、該媒体中から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)の製造法[但し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)は、前記アミノ酸群Aから選ばれる同一のまたは異なるアミノ酸がペプチド結合によって結合した化合物ではない]。
[1]配列番号9〜16および36のいずれかで表される塩基配列を有するDNA
[2]配列番号9〜16および36のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA
[3]配列番号18で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA
[4]配列番号39または40で表される塩基配列を有するDNA
[5]配列番号39または40で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA
(4)以下の[1]〜[5]から選ばれるDNAを保持する細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成、蓄積させ、そのまま、または該媒体から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を修飾し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)の製造法。
[1]配列番号9〜16および36のいずれかで表される塩基配列を有するDNA
[2]配列番号9〜16および36のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA
[3]配列番号18で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA
[4]配列番号39または40で表される塩基配列を有するDNA
[5]配列番号39または40で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA
(5)アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式(I)
R1aおよびR1bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表すか、またはR1aおよびR1bのいずれか一方が、隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該炭素原子上のR2aおよびR2bのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
R2aおよびR2bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはR1aR1bNに隣接する炭素原子上のR2aおよびR2bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子ならびにR1a及びR1bのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、n1が2または3である場合、2つまたは3つのR2aおよび2つまたは3つのR2bはそれぞれ同一でも異なっていてもよい)または式(II)
R3aおよびR3bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはR4HNに隣接する炭素原子上のR3aおよびR3bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子およびR4と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、n2が2または3である場合、2つまたは3つのR3aおよび2つまたは3つのR3bはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、
R4は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表すか、またはR4が隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該炭素原子上のR3aおよびR3bのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
R5はアミノ、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、モノ(置換もしくは非置換の低級アルキル)アミノ、ジ(置換もしくは非置換の低級アルキル)アミノまたは脂環式複素環基を表す]で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体[但し、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式(I)のみであるとき、R1a及びR1bの少なくとも一方は水素原子であり、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式(II)のみであるとき、R5はヒドロキシである]である、上記(1)〜(4)のいずれか1つの製造法。
(6)アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式(III)
R2cおよびR2dは同一または異なって水素原子または置換もしくは非置換の低級アルキルを表す)または式(IV)
R5は前記と同義である)で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体[但し、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式(III)のみであるとき、R1c及びR1dの少なくとも一方は水素原子であり、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式(IV)のみであるとき、R5はヒドロキシである]である、上記(1)〜(4)のいずれか1つの製造法。
(7)アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式(V)
(8)アミノ酸またはアミノ酸誘導体がL−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンからなる群より選ばれるアミノ酸またはその誘導体である、上記(1)〜(4)のいずれか1つの製造法。
(9)L−アミノ酸がL−アラニン、L−グルタミン、L−グルタミン酸、L−バリン、L−ロイシン、L−イソロイシン、L−プロリン、L−フェニルアラニン、L−トリプトファン、L−メチオニン、L−セリン、L−スレオニン、L−システイン、L−アスパラギン、L−チロシン、L−リジン、L−アルギニン、L−ヒスチジン、L−アスパラギン酸、L−α−アミノ酪酸、L−アザセリン、L−テアニン、L−4−ヒドロキシプロリン、L−3−ヒドロキシプロリン、L−オルニチン、L−シトルリンおよびL−6−ジアゾ−5−オキソノルロイシンから選ばれるL−アミノ酸である、上記(8)の製造法。
(10)ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)が式(VIIa)
R6aおよびR6bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表すか、またはR6aおよびR6bのいずれか一方が、隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該炭素原子上のR7aおよびR7bのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
R7aおよびR7bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはR6aR6bNに隣接する炭素原子上のR7aおよびR7bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子ならびにR6aおよびR6bのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、n3aが2または3である場合、2つまたは3つのR7aおよび2つまたは3つのR7bはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、
R8aは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表すか、またはR8aが隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接し、かつR9aおよびR9bと結合する炭素原子ならびに該炭素原子上のR9aおよびR9bのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
R9aおよびR9bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはR8aNに隣接する炭素原子上のR9aおよびR9bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子およびR8aと一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、n4aが2または3である場合、2つまたは3つのR9aおよび2つまたは3つのR9bはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、
R10aはアミノ、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、モノ(置換もしくは非置換の低級アルキル)アミノ、ジ(置換もしくは非置換の低級アルキル)アミノまたは脂環式複素環基を表す]で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記(1)〜(5)のいずれか1項に記載の製造法。
(11)ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)が式(VIIb)
R6AおよびR6Bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表すか、またはR6AおよびR6Bのいずれか一方が、隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該炭素原子上のR7AおよびR7Bのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
R7AおよびR7Bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはR6AR6BNに隣接する炭素原子上のR7AよびR7Bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子ならびにR6AおよびR6Bのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、n3Aが2または3である場合、2つまたは3つのR7Aおよび2つまたは3つのR7Bはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、
R8Aは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表すか、またはR8Aが隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接し、かつR9AおよびR9Bと結合する炭素原子ならびに該炭素原子上のR9AおよびR9Bのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
R9AおよびR9Bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはR8ANに隣接する炭素原子上のR9AおよびR9Bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子およびR8Aと一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、n4A層が2または3である場合、2つまたは3つのR9Aおよび2つまたは3つのR9Bはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、
R10Aは前記R10aと同義である]で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記(1)〜(5)のいずれか1つの製造法。
(12)ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)が式(VIIIa)
R7cおよびR7dは同一または異なって水素原子または置換もしくは非置換の低級アルキルを表し、
R9cおよびR9dは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換のアリールを表し、
R10aは前記と同義である)で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記(1)〜(6)のいずれか1つの製造法。
(13)ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)が式(VIIIb)
R10Aは前記と同義である)で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記(1)〜(6)のいずれか1つの製造法。
(14)ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)が式(IXa)
R9eは置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換のアリールを表す)で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記(1)〜(7)のいずれか1項に記載の製造法。
(15)ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)が式(IXb)
(16)ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)あるいはジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)がL−アミノ酸、グリシン、およびβ−アラニン、ならびにそれらの誘導体から選ばれる同一または異なるアミノ酸またはアミノ酸誘導体がペプチド結合したジペプチドまたはジペプチド誘導体である、上記(1)〜(8)のいずれか1つの製造法。
(17)L−アミノ酸がL−アラニン、L−グルタミン、L−グルタミン酸、L−バリン、L−ロイシン、L−イソロイシン、L−プロリン、L−フェニルアラニン、L−トリプトファン、L−メチオニン、L−セリン、L−スレオニン、L−システイン、L−アスパラギン、L−チロシン、L−リジン、L−アルギニン、L−ヒスチジン、L−アスパラギン酸、L−α−アミノ酪酸、L−アザセリン、L−テアニン、L−4−ヒドロキシプロリン、L−3−ヒドロキシプロリン、L−オルニチン、L−シトルリンおよびL−6−ジアゾ−5−オキソノルロイシンから選ばれるL−アミノ酸である、上記(16)の製造法。
(18)細胞が微生物の細胞である、上記(3)〜(17)のいずれか1つの製造法。
(19)微生物が原核生物である、上記(18)の製造法。
(20)原核生物が1種以上のペプチダーゼおよび1種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質(以下、ペプチド取込み蛋白質ともいう)の活性が低下または喪失した微生物である上記(19)の製造法。
(21)原核生物が3種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失した微生物である、上記(20)の製造法。
(22)ペプチダーゼが配列番号43〜46のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号43〜46のいずれかで表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質である、上記(20)または(21)の製造法。
(23)ペプチド取込み蛋白質が配列番号47〜51のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号47〜51のいずれかで表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有する蛋白質であり、かつペプチド取り込み活性を有する蛋白質である、上記(20)または(22)の製造法。
(24)原核生物がエシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物である、上記(19)〜(23)のいずれか1つの製造法。
(25)エシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物がエシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテイルム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィシェンス、バチルス・サチルスまたはバチルス・メガテリウムである上記(24)の製造法。
(26)培養物の処理物が培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する処理物であることを特徴とする、上記(3)〜(25)のいずれか1つの製造法。
Ptrp:トリプトファンプロモーター遺伝子
PT5:T5プロモーター
Ampr:アンピシリン耐性遺伝子
lacI q:ラクトースリプレッサー遺伝子
albC:albC遺伝子またはalbC類似遺伝子
本発明の方法で用いられる蛋白質としては、
[1]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
[2]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、
[3]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列と65%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、
[4]配列番号17で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、
[5]配列番号37または38で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
[6]配列番号37または38で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、および
[7]配列番号37または38で表されるアミノ酸配列と65%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、
などをあげることができる。
配列番号1〜8、37および38のいずれかで表されるアミノ酸配列において1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、1または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−アルギニン、L−グルタミン、L−グルタミン酸、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リジン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−セリン、L−スレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−システインなどがあげられる。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、O−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4−ジアミノブタン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸
E群:プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン
G群:フェニルアラニン、チロシン
また、本発明で用いられる蛋白質がジペプチドまたはジペプチド誘導体の合成活性を有するためには、配列番号1〜8、37および38のいずれかで表されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号1または37で表されるアミノ酸配列との相同性が65%以上、好ましくは75%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上の相同性を有していることが望ましい。
配列番号17で表されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質であり、かつジペプチドまたはジペプチド誘導体の合成活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である。
本発明で用いられる蛋白質が、ジペプチドまたはジペプチド誘導体の合成活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えばDNA組換え法を用いて本発明の蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて本発明で用いられる蛋白質を製造した後、該蛋白質、1種以上のL−アミノ酸またはアミノ酸誘導体、およびATPを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体が生成、蓄積するか否かをHPLC等により分析する方法をあげることができる。
2.本発明で用いられるDNA
本発明で用いられるDNAとしては、
[1]配列番号9〜16および36のいずれかで表される塩基配列を有するDNA、
[2]配列番号9〜16および36のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA、
[3]配列番号18で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA、
[4]配列番号39または40で表される塩基配列を有するDNA、および
[5]配列番号39または40で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA、などをあげることができる。
3.本発明で用いられるDNAの調製
本発明に用いられるDNAは、例えば、配列番号9〜16、18、36、39または40で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、バチルス属またはストレプトマイセス属に属する微生物の染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または配列番号9〜16、18、36、39または40で表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーDNAを用いた、バチルス属に属する微生物の染色体DNAを鋳型としたPCR[PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。
更に、決定されたDNAの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするDNAを調製することもできる。
本発明のDNAおよび本発明の製造法に用いられるDNAを組み込むベクターとしては、pBluescriptII KS(+)(ストラタジーン社製)、pDIRECT[Nucleic Acids Res.,18,6069(1990)]、pCR−Script Amp SK(+)(ストラタジーン社製)、pT7Blue(ノバジェン社製)、pCRII(インビトロジェン社製)およびpCR−TRAP(ジーンハンター社製)などをあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の製造法に用いられるDNAを保有する微生物としては、例えば配列番号1で表される配列を有するDNAを含有する組換え体DNAを保有する微生物であるエシェリヒア・コリNM522/pPE43をあげることができる。
4.本発明に用いられる細胞の調製
(1)本発明に用いられる細胞としては、i)上記3のDNAを染色体DNA上に有するバチルス属に属する細菌、好ましくはバシリシン合成活性を有するバチルス属に属する細菌、より好ましくはバチルス・サチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウムおよびバチルス・プミルスからなる群より選ばれる種に属する細菌、さらに好ましくは、バチルス・サチリスATCC15245、バチルス・サチリスATCC6633、バチルス・サチリスIAM1213、バチルス・サチリスIAM1107、バチルス・サチリスIAM1214、バチルス・サチリスATCC9466、バチルス・サチリスIAM1033、バチルス・サチリスATCC21555、バチルス・アミロリケファシエンスIFO3022およびバチルス・プミルスNRRL B−12025からなる群より選ばれる株である細菌、ii)上記3のDNAを染色体DNA上に有するストレプトマイセス属に属する細菌、好ましくはアルボノルシン合成活性を有するストレプトマイセス属に属する細菌、より好ましくはストレプトマイセス・アルボラスまたはストレプトマイセス・ノウルセイより選ばれる種に属する細菌、さらに好ましくは、ストレプトマイセス・アルボラスIFO14147、ストレプトマイセス・ノウルセイATCC11455またはIFO15452、iii)モレキュラー・クローニング第3版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記3の方法により取得したDNAを宿主細胞に導入することにより調製することができる形質転換体、をあげることができる。
該DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体DNAを作製する。
宿主細胞としては、原核生物および酵母等の微生物の細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができ、好ましくは微生物、より好ましくは原核生物、さらに好ましくは細菌をあげることができる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明に用いられるDNAを有する組換え体DNAは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のDNAまたは本発明の製造法に用いられるDNA、転写終結配列より構成された組換え体DNAであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター(P trp )、lacプロモーター(P lac )、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またPtrpを2つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
本発明に用いられるDNAを発現ベクターに結合させた組換え体DNAにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア(Serratia)属、バチルス属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ミクロバクテリウム属(Microbacterium)、シュードモナス(Pseudomonas)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アリシクロバチルス属(Alicyclobacillus)、アナベナ(Anabena)属、アナシスティス(Anacystis)属、アスロバクター(Arthrobacter)属、アゾトバクター(Azotobacter)属、クロマチウム(Chromatium)属、エルビニア(Erwinia)属、メチロバクテリウム(Methylobacterium)属、フォルミディウム(Phormidium)属、ロドバクター(Rhodobacter)属、ロドシュードモナス(Rhodopseudomonas)属、ロドスピリウム(Rhodospirillum)属、セネデスムス(Scenedesmus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、シネコッカス(Synechoccus)属、ザイモモナス(Zymomonas)属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリXL1−Blue、エシェリヒア・コリXL2−Blue、エシェリヒア・コリDH1、エシェリヒア・コリDH5α、エシェリヒア・コリMC1000
、エシェリヒア・コリKY3276、エシェリヒア・コリW1485、エシェリヒア・コリJM109、エシェリヒア・コリHB101、エシェリヒア・コリNo.49、エシェリヒア・コリW3110、エシェリヒア・コリNY49、エシェリヒア・コリMP347、エシェリヒア・コリNM522、バチルス・サチリスATCC33712、バチルス・メガテリウム、バチルス・エスピー(Bacillus sp.)FERM BP−6030、バチルス・アミロリケファスエンス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プミルス、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(Brevibacterium ammoniagenes)、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム(Brevibacterium immariophilum)ATCC14068、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)ATCC14067、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC14297、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC15354、セラチア・フィカリア(Serratia ficaria)、セラチア・フォンチコラ(Serratia fonticola)、セラチア・リケファシエンス(Serratia liquefaciens)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)D−0110、アグロバクテリウム・ラジオバクター(Agrobacterium radiobacter)、アグロバクテリウム・リゾジーンズ(Agrobacterium rhizogenes)、アグロバクテリウム・ルビ(Agrobacterium rubi)、アナベナ・シリンドリカ(Anabaena cylindrica)、アナベナ・ドリオルム(Anabaena doliolum)、アナベナ・フロスアクア(Anabaena flos−aquae)、アースロバクター・オーレッセンス(Arthrobacter aurescens)、アースロバクター・シトレウス(Arthrobacter citreus)、アースロバクター・グロブフォルミス(Arthrobacter globformis)、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス(Arthrobacter hydrocarboglutamicus)、アースロバクター・ミソレンス(Arthrobacter mysorens)、アースロバクター・ニコチアナ(Arthrobacter nicotianae)、アースロバクター・パラフィネウス(Arthrobacter paraffineus)、アースロバクター・プロトフォルミエ(Arthrobacter protophormiae)、アースロバクター・ロセオパラフィナス(Arthrobacter roseoparaffinus)、アース
ロバクター・スルフレウス(Arthrobacter sulfureus)、アースロバクター・ウレアファシエンス(Arthrobacter ureafaciens)、クロマチウム・ブデリ(Chromatium buderi)、クロマチウム・テピダム(Chromatium tepidum)、クロマチウム・ビノサム(Chromatium vinosum)、クロマチウム・ワーミンギ(Chromatium warmingii)、クロマチウム・フルビアタティレ(Chromatium fluviatile)、エルビニア・ウレドバラ(Erwiniauredovora)、エルビニア・カロトバラ(Erwinia carotovora)、エルビニア・アナス(Erwinia ananas)、エルビニア・ヘリコラ(Erwinia herbicola)、エルビニア・パンクタタ(Erwinia punctata)、エルビニア・テレウス(Erwinia terreus)、メチロバクテリウム・ロデシアナム(Methylobacterium rhodesianum)、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス(Methylobacterium extorquens)、フォルミディウム・エスピー(Phormidium sp.)ATCC29409、ロドバクター・カプスラタス(Rhodobacter capsulatus)、ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ロドシュードモナス・ブラスチカ(Rhodopseudomonas blastica)、ロドシュードモナス・マリナ(Rhod opseudomonas marina)、ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)、ロドスピリウム・リブラム(Rhodospirillum rubrum)、ロドスピリウム・サレキシゲンス(Rhodospirillum salexigens)、ロドスピリウム・サリナラム(Rhodospirillum alinarum)、ストレプトマイセス・アンボファシエンス(Streptomyces ambofaciens)、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス(Streptomyces aureofaciens)、ストレプトマイセス・アウレウス(Streptomyces aureus)、ストレプトマイセス・フンジシディカス(Streptomyces fungicidicus)、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス(Streptomyces griseochromogenes)、ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans、ストレプトマイセス・オリボグリセウス(Streptomyces olivogriseus)、ストレプトマイセス・ラメウス(Streptomyces rameus)、ストレプトマイセス・タナシエンシス(Streptomyces tanashiensis)、ストレプトマイセス・ビナセウス(Streptomyces vinaceus)、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)等をあげることがでる。好ましい原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属またはストレプトマイセス属等に属する細菌、例えば上記したエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属またはストレプトマイセス属等に属する種をあげることができ、より好ましい細菌としてはエシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテイルム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィシェンス、バチルス・サチルス、バチルス・メガテリウム、セラチア・マルセッセンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、ストレプトマイセス・セリカラーまたはストレプトミセス・リビダンスをあげることができ、特に好ましくはエシェリヒア・コリをあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等を用いることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、シワニオマイミセス(Schwanniomyces)属、ピチア(Pichia)属、またはキャンディダ(Candida)属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomy cespombe)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pullulans)、シワニオマイセス・アルビウス(Schwanniomyces alluvius)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、キャンディダ・ウティリス(Candida utilis)等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8(フナコシ社より市販)、pAGE107(特開平3−22979)、pAS3−3(特開平2−227075)、pCDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNAI/Amp(インビトロジェン社製)、pREP4(インビトロジェン社製)、pAGE103[J.Biochem,101,1307(1987)]、pAGE210、pAMo、pAMoA等を用いることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293(ATCC CRL−1573)、ヒト白血病細胞としてはBALL−1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはCOS−1、COS−7等をあげることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(いずれもインビトロジェン社製)等をあげることができる。
昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)の卵巣細胞、トリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)の卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法(特開平2−227075)、リポフェクション法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84,7413(1987)]等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーター、イネアクチン1プロモーター等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium)を用いる方法(特開昭59−140885、特開昭60−70080、WO94/00977)、エレクトロポレーション法(特開昭60−251887)、パーティクルガン(遺伝子銃)を用いる方法(特許第2606856、特許第2517813)等をあげることができる。
(2)本発明の製造法に用いられる微生物としては、上記(1)の方法により調製される微生物において、1種以上のペプチダーゼおよび1種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質(以下、ペプチド取込み蛋白質と略す)の活性が低下または喪失している微生物、または3種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物が好適に用いられる。
上記ペプチダーゼとしては、ペプチド分解活性を有する蛋白質であればいずれでもよく、好ましくはジペプチド分解活性が高い蛋白質、より好ましくはジペプチダーゼをあげることができる。
上記ペプチド取り込み蛋白質としては、染色体DNA上でオペロンを形成する遺伝子にコードされている蛋白質であり、細胞膜上で複合体を形成してペプチド取り込み活性を発現する蛋白質、および単独の蛋白質としてペプチド取り込み活性を有する蛋白質など、微生物のペプチド取り込みに関与している蛋白質であればいずれでもよく、好ましくはペプチド取り込み活性が高い蛋白質をあげることができる。
3種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物としては、該微生物が正常に生育できる限りにおいて、任意の3種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物をあげることができ、好ましくは3種以上9種以下、より好ましくは3種以上6種以下、さらに好ましくは3種または4種のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。
ペプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質の活性が低下または喪失した微生物は、該微生物を取得できる方法であれば、その取得方法に制限はないが、例えば以下に示す微生物の染色体DNAのペプチダーゼ遺伝子やペプチド取り込み蛋白質遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法により取得することができる。
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換または付加を導入する相同組換えを利用した方法としては、直鎖DNAを用いた方法をあげることができる。
相同組換えに用いられるDNAとしては、
(a)塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両端の外側に位置するDNAと相同性を有するDNAを、薬剤耐性遺伝子の両端に有する直鎖DNA、
(b)塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両端の外側に位置するDNAと相同性を有するDNAを直接連結したDNAを有する直鎖DNA、
(c)薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子の両端に、塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両端の外側に位置するDNAと相同性を有するDNAを有する直鎖DNA、
(d)上記(a)の直鎖DNAにおいて、薬剤耐性遺伝子と染色体DNA上の領域の両端の外側に位置するDNAと相同性を有するDNAの間に、さらに酵母由来のFlp recombinase〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,82,5875(1985)〕が認識する塩基配列を有するDNA、
をあげることができる。
酵母由来のFlp recombinaseが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号52で表される塩基配列を有するDNA、および該DNAにおいて1個〜数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来のFlp recombinaseが認識し、相同組換えを触媒する塩基配列を有するDNAをあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、上記したBLASTやFASTA等のプログラムを用いて決定することができる。
微生物の染色体DNAに塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、以下の方法1〜4があげられる。
方法1:上記(a)または(d)の直鎖DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖DNAが染色体DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。
方法2:上記方法1により取得された形質転換株に、上記(b)の直鎖DNAを導入し、該方法により染色体DNA上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体DNA上の領域を置換または欠失させる方法。
方法3:
[1]上記(c)の直鎖DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖DNAが染色体DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]染色体DNA上の置換または欠失の対象領域の両端の外側に位置するDNAと相同性を有するDNAを、染色体DNA上における方向と同一の方向で連結したDNAを合成し、上記[1]で得られた形質転換株に導入する、
[3]ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記[2]の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体DNA上から削除された株として選択する方法。
方法4:
[1]上記(d)の直鎖DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖DNAが染色体DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]上記[1]で得られた形質転換株にFlp recombinase遺伝子発現プラスミドを導入し、該遺伝子を発現させた後、上記[1]で用いた薬剤に感受性である株を取得する方法。
上記方法2〜4では、最終的に得られる形質転換株の染色体DNA上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法であるため、該方法を用いることにより、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、該方法の操作を繰り返すことにより、容易に染色体DNA上の位置の異なる2以上の領域に塩基の欠失、置換または付加を有する微生物を製造することができる。
5.本発明に用いられる蛋白質の製造法
上記4の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明に用いられる蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM−FH培地(ファーミンジェン社製)、Sf−900 II SFM培地(ライフ・テクノロジーズ社製)、EXCell400、ExCell405[いずれもJRHバイオサイエンシーズ社製]、Grace’s Insect Medium[Nature,195,788(1962)]等を用いることができる。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明に用いられるDNAを発現ベクターに連結した組換え体DNAを保有する微生物、昆虫細胞、動物細胞あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明で用いられる蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
本発明で用いられる蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法[J.Biol.Chem.,264,17619(1989)]、ロウらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990)]、または特開平05−336963、WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平2−227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
本発明で用いられる蛋白質を生産する形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成、蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
動物個体の場合は、例えば、本発明に用いられるDNAを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、本発明に用いられる蛋白質を該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の該蛋白質を生成、蓄積させる場所としては、例えば、該動物のミルク(特開昭63−309192)、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
例えば、本発明に用いられる蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
また、本発明に用いられる蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。
6.本発明のジペプチドまたはジペプチド誘導体の製造法
(1)酵素的製造法
ジペプチドまたはジペプチド誘導体の酵素的製造法としては、i)上記1の蛋白質、1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体、およびATPを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成、蓄積させ、該媒体中から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)の製造法、およびii)上記1の蛋白質、1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体、およびATPを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成、蓄積させ、そのまま、または該媒体から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を修飾し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)の製造法をあげることができる。
上記製造法において、基質に用いられる1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体は、上記1の蛋白質の基質になるアミノ酸またはアミノ酸誘導体であればいずれのアミノ酸およびアミノ酸誘導体を用いてもよい。
上記製造法で製造されるジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)としては式(VIIa)
上記製造法で製造されるジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)としては式(VIIb)
低級アルキニルとしては、例えば炭素原子数2から10の直鎖または分枝鎖状のアルキニルが挙げられ、より具体的にはエチニル、2−プロピニル、3−ブチニル、4−ペンチニル、5−ヘキシニル、9−デシニル等があげられる。
脂環式複素環基としては、例えば単環性または2つ以上の環が縮合した縮環性の脂環式複素環基があげられ、脂環式複素環基に含まれるヘテロ原子の種類及び個数は特に限定されないが、例えば窒素原子、硫黄原子及び酸素原子からなる群から選ばれるヘテロ原子を1または2個以上含んでいてもよく、より具体的には、例えばピロリジニル、2,5−ジオキソピロリジニル、チアゾリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジル、1,2−ジヒドロピリジル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピラゾリニル、オキサゾリニル、ジオキソラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、テトラヒドロキノキサリニル、オクタヒドロキノリル、ジヒドロインドリル、1,3−ジオキソイソインドリニル等があげられる。
隣接する窒素原子および該窒素原子に隣接する炭素原子と一緒になって形成される複素環基、ならびに隣接する炭素原子および該炭素原子に隣接する窒素原子と一緒になって形成される複素環基としては、例えば少なくとも1個の窒素原子を含む5員または6員の単環性脂環式複素環基(該単環性脂環式複素環基は、他の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含んでいてもよい)、3〜8員の環が縮合した二環または三環性で少なくとも1個の窒素原子を含む縮環性複素環基(該縮環性複素環基は、他の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含んでいてもよい)等があげられ、より具体的にはピロリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ホモピペリジニル、ホモピペラジニル、テトラヒドロピリジル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル等があげられる。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸またはアミノ酸誘導体は、0.1〜500g/L、好ましくは0.2〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
上記製造法で用いられる水性媒体としては、ジペプチド誘導体の生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。
(2)細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる製造法
細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いるジペプチドまたはジペプチド誘導体の製造法としては、i)上記4で得られる細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成、蓄積させ、該媒体中から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)の製造法、およびii)上記4で得られる細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成、蓄積させ、そのまま、または該媒体から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を修飾し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)の製造法をあげることができる。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸およびアミノ酸誘導体の種類、使用濃度および添加時期、並びに生産されるジペプチドまたはジペプチド誘導体は、上記6の(1)の酵素的製造法のものと同様である。
また上記製造法においては、必要に応じて、ATPの供給源として、ATPまたは細胞が代謝してATPを生産し得る化合物、例えばグルコースのような糖類、エタノールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などを水性媒体中に加えることができる。
ジペプチドまたはジペプチド誘導体の生成反応は水性媒体中、pH5〜11、好ましくはpH6〜10、20〜65℃、好ましくは25〜55℃、より好ましくは30〜45℃の条件で通常1分間〜150時間、好ましくは3分間〜120時間、より好ましくは30分間〜100時間行う。
(3)ジペプチドまたはジペプチド誘導体を修飾することによるジペプチド誘導体の製造法
上記6の(1)または(2)の製造法において得られたジペプチドまたはジペプチド誘導体を、公知の有機合成反応[例えば、コンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ(Comprehensive Organic Transformations)、R.C.ラロック(Larock)著、(1989年)等参照]またはそれらに準じた方法に付すことによって種々のジペプチド誘導体を得ることができる。
以下に実験例を示し、本発明に用いられるDNA、蛋白質および細胞の調製方法を説明するが、該調製方法は下記実験例に制限されるものではない。
実験例1 データベースを利用したジペプチド合成活性を有する蛋白質の検索
バチルス・サチリス168株由来のD−Ala−D−Alaリガーゼ遺伝子のアミノ酸配列[Nature,390,249−256(1997)]をクエリーとして、バチルス・サチリス168株のゲノムDNAのデータベースであるSubtilist(http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/)のホモロジー検索機能を用いて、バチルス・サチリス168株のゲノムDNA配列中に存在する相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子を検索した。
実験例2 ywfE遺伝子発現株の造成
実験例1で得られた塩基配列情報に従い、バチルス・サチリスのywfE遺伝子断片を以下のようにして取得した。
のである。またプライマーCは、trpプロモーターを含む発現ベクターpTrS30[エシェリヒア・コリJM109/pTrS30(FERM BP−5407)より調製]のtrpプロモーター領域の塩基配列の5’末端にEcoRI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーDは、trpプロモーターを含む発現ベクターpTrS30のtrpプロモーター領域の配列と相補的な配列の5’末端にXhoI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
上記で得られたywfEを含む1.4kb断片、trpプロモーター領域を含む0.3kb断片および4.5kbの断片をライゲーションキット(タカラバイオ社製)を用いて、16℃で16時間反応させ連結した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、trpプロモーター下流にywfEが連結された発現ベクターであるpPE43が取得されていることを確認した(図1)。
実験例3 ジペプチドの生産
実験例2で得られたpPE43を保有するエシェリヒア・コリNM522(エシェリヒア・コリNM522/pPE43株)を50μg/mlのアンピシリンを含む8mlのLB培地が入った太型試験管に接種し、28℃で17時間培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。
反応終了後、反応生成物をジニトロフェノール化法で誘導体化した後にHPLC法により分析した。HPLC法による分析は、分離カラムに関東化学社製のLichrosorb−RP−18カラムを用い、溶離液として1%(v/v)リン酸、25%(v/v)アセトニトリルを用い、0.7ml/分の流動速度で行った。その結果反応液中に120mg/LのL−アラニル−L−グルタミン(L−Ala−L−Gln)が生成蓄積していることを確認した。
実験例4 C末端Hisタグ付加型組換え型ジペプチド合成酵素の精製
上記DNA合成機を用いて、配列番号23および24で表される塩基配列を有するDNA(以下、それぞれプライマーE、プライマーFと呼ぶ)を合成した。プライマーEは、ywfEの開始コドン(atg)をNcoI認識配列(ccatgg)に置換した領域を含む塩基配列である。プライマーFは、ywfEの終止コドンをBamHI認識配列(ggatcc)に置換した領域を含む塩基配列である。
C末端Hisタグ付加型組換え体発現ベクターpQE60(キアゲン社製)0.2gを制限酵素NcoIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、上記と同様の方法により3.4kbのDNA断片を回収した。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で一晩培養した。
pQE60ywfEを保有するエシェリヒア・コリNM522(エシェリヒア・コリNM522/pQE60ywfE株)を、50μg/mlのアンピシリンを含む8mlのLB培地の入った太型試験管に接種し28℃で17時間培養した。該培養液を50μg/mlのアンピシリンを含む50mlのLB培地の入った250ml容三角フラスコに接種し30℃で3時間培養した後、終濃度が1mmol/Lになるようにイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加し、さらに30℃で4時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得し、該湿菌体から、His Trap(Hisタグ付加タンパク精製キット、Amersham Pharmasia Biotech社製)を用いて、説明書に従いHisタグ付加組換え型酵素を精製した。
実験例5 Hisタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産(1)
(i)実験例4で取得した精製したHisタグ付加組換え型酵素0.04mg、100mmol/LのTris−HCl(pH8.0)、60mmol/Lの塩化マグネシウム、60mmol/LのATP、30mmol/LのL−Ala、30mmol/LのL−Glnからなる0.1mlの反応液を調製し、37℃で16時間反応を行った。
(ii)酵素を0.01mg、L−Glnの代わりにL−Phe、L−Met、L−LeuまたはL−Valを含有する以外は、上記(i)の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記(i)の反応条件で反応させた。
(iii)酵素を0.01mg、L−Alaの代わりにGly、L−Glnの代わりにL−PheまたはL−Metを含有する以外は、上記(1)の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記(1)の反応条件で反応させた。
上記反応液組成からATPを除くとジペプチドは全く生成されなかった。
以上の結果から、ywfE遺伝子産物は、ATP存在下において、L−AlaとL−Gln、L−Phe、L−Met、L−LeuまたはL−Valとから、L−Ala−L−GlnおよびL−Ala−L−Ala、L−Ala−L−Phe、L−Ala−L−MetおよびL−Ala−L−Ala、L−Ala−L−LeuおよびL−Ala−L−Ala、またはL−Ala−L−ValおよびL−Ala−L−Alaを生成する活性、GlyとL−PheまたはL−MetとからGly−L−PheまたはGly−L−Metを生成する活性を有することが明らかになった。
実験例6 Hisタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産(2)
実験例4で得られた精製したHisタグ付加組換え型酵素0.04mg、100mmol/LのTris−HCl(pH8.0)、60mmol/Lの塩化マグネシウム、60mmol/LのATPからなる0.1mlの反応液を調製し、表1の第1行目と最左列のアミノ酸の組み合わせからなる各種L−アミノ酸、Glyまたはβ−Alaをそれぞれ30mmol/Lずつになるように反応液に添加し、37℃で16時間反応を行った。反応終了後、反応生成物をHPLC分析したところ、表1に示すジペプチドが生成していることが確認された。
実験例7 Hisタグ付加組換え型酵素発現株を用いたジペプチドの生産
実験例4で得られたエシェリヒア・コリNM522/pQE60ywfE株を50μg/mlのアンピシリンを含む8mlのLB培地の入った太型試験管に接種し、28℃で17時間培養した。該培養液を50μg/mlのアンピシリンを含む50mlのLB培地の入った250ml容三角フラスコに接種し30℃で3時間培養した後、終濃度が1mmol/LになるようにIPTGを添加し、さらに30℃で4時間培養した。該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。
実験例8 バチルス属に属する各種微生物からのywfE遺伝子に相当する遺伝子のクローニングとその解析
配列番号9で表される塩基配列に基づき、バチルス・サチリスATCC15245、ATCC6633、IAM1213、IAM1107、IAM1214、ATCC9466、IAM1033、ATCC21555、バチルス・アミロリケファシエンスIFO3022、およびバチルス・プミルスNRRL B−12025に存在するywfE遺伝子に相当する遺伝子を以下のようにして取得した。
り返すことにより行った。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で一晩培養した。
上記で調製したNRRL B−12025株の染色体DNAを鋳型にし、配列番号27および28で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いて、PCRを行った。PCRは、0.1μgの染色体DNA、0.5μmol/Lの各プライマー、2.5unitsのZ−taqポリメラーゼ(タカラバイオ社製)、5μLのZ−taqポリメラーゼ用×10緩衝液(タカラバイオ社製)、200μmol/Lの各dNTPを含む反応液50μLを調製し、98℃で5秒間、55℃で30秒間、72℃で1分間の工程を30回繰り返すことにより行った。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリDH5α株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で一晩培養した。
次に該プラスミドをEcoRIで切断した後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離した。該DNA断片をジーンクリーンIIキットを用いて精製した。約0.5μgの該精製DNA断片を、DIG−ハイプライムDNAラベリング&デテクション スターターキットI(ロシュ・ダイアグノスティクス社製)を用いて、DIGラベル化した。DIGラベル化は、該キット添付の説明書に従って行った。
NRRL B−12025株の染色体DNAをBamHI、EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、SacI、SalIおよびSphIを用いてそれぞれ完全消化し、アガロース電気泳動によりDNA断片を分離した後、常法に従いナイロンメンブレンプラスチャージ(ロシュ・ダイアグノスティクス社製)に転移させた。
ハイブリダイゼーションは、該プローブDNAと該ナイロン膜を65℃で16時間接触させ、その後該ナイロン膜を、0.1%SDSおよび2×SSCからなる溶液を用い、室温で5分間、2回洗浄し、さらに0.1%SDSおよび0.5×SSCからなる溶液を用い、65℃で15分間、2回洗浄することで行い、その他の操作、条件およびハイブリダイズしたDNAの検出は、上記したDIG−ハイプライムDNAラベリング&デテクション スターターキットIに添付されている説明書に準じて行った。
次に、NRRL B−12025株の染色体DNAをHindIIIおよびPstIを用いてそれぞれ完全消化し、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離した。それぞれの制限酵素消化DNAから3−4kbpの断片をジーンクリーンIIキットを用いて精製し、ライゲーションキットを用いて自己環化させた。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で一晩培養した。
上記で得られたpYWFE1〜pYWFE10に含まれるywfE遺伝子に相当する各遺伝子の塩基配列を塩基配列分析装置373A・DNAシークエンサーを用いて決定した。
pYWFE2、pYWFE3、pYWFE4、pYWFE5、pYWFE8、pYWFE9、pYWFE10およびpYWFE1とpYWFE7に含まれるywfE遺伝子に相当する遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号2〜8および1に、該遺伝子の塩基配列を配列番号10〜16および36にそれぞれ示した。
実験例9 C末端Hisタグ付加型組換え型ジペプチド合成酵素の精製
バチルス・サチルスATCC15245、ATCC6633、IAM1213、IAM1107、IAM1214、ATCC9466、IAM1033、ATCC21555、またはバチルス・アミロリケファシエンスIFO3022の染色体DNAを鋳型とし、実験例2記載のプライマーAおよびプライマーBをプライマーセットとして用いてPCRを行った。PCRは、0.1μgの染色体DNA、0.5μmol/Lの各プライマー、2.5unitsのPfu DNAポリメラーゼ、4μLのPfu DNAポリメラーゼ用×10緩衝液、200μmol/Lの各dNTPを含む反応液40μLを調製し、94℃で1分間、55℃で2分間、72℃で3分間の工程を30回繰り返すことにより行った。
該反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動し、ywfE断片に相当する約1.4kbのDNA断片がそれぞれ増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のTE飽和フェノール/クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、2倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−80℃に30分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたDNAの沈殿を20μLのTEに溶解した。
次にC末端Hisタグ付加型組換え体発現ベクターpQE60 0.2μgを制限酵素NcoIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、上記と同様の方法により3.4kbのDNA断片を回収した。
該反応液を用いて大腸菌NM522株をカルシウムイオンを用いる方法により形質転換した後、50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で一晩培養した。
実験例10 精製酵素を用いたジペプチドの生産
実験例9で得られた組換え型酵素0.04mg、100mmol/LのTris−HCl(pH8.0)、60mmol/Lの塩化マグネシウム、60mmol/LのATP、30mmol/LのL−Alaおよび30mmol/LのL−Glnからなる0.1mlの反応液を調製し、37℃で16時間反応を行った。
また、上記反応液組成からATPを除くとL−Ala−L−GlnおよびL−Ala−L−Alaは全く生成されなかった。
実験例11 albC遺伝子およびその類縁遺伝子の取得
ストレプトマイセス・ノウルセイのalbC遺伝子の塩基配列[Chemistry & Biol.,9,1355(2002)]に基づき、ストレプトマイセス・ノウルセイおよびストレプトマイセス・アルボラスよりalbC遺伝子およびその類縁遺伝子を、以下の方法で取得した。
albC遺伝子の塩基配列に基づき、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成機を用いて、配列番号41および42で表される塩基配列を有するDNA(以下、それぞれプライマーJ、プライマーKと呼ぶ)を合成した。プライマーJは、ストレプトマイセス・ノウルセイの染色体DNAのalbC遺伝子の開始コドンを含む領域の5’末端にNcoI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーKは、albC遺伝子の終止コドンを含む配列と相補的な塩基配列の5’末端にBglII認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
ファージT5プロモーターを含む発現ベクターpQE60 0.2μgを制限酵素NcoIおよびBglIIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、上記と同様の方法により3.4kbのDNA断片を回収した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で一晩培養した。
実験例12 菌体を酵素源に用いたジペプチドの製造
実験例11で得られたpAL−nouまたはpAL−albを保有するエシェリヒア・コリNM522(エシェリヒア・コリNM522/pAL−nou株またはNM522/pAL−alb株)およびプラスミドを保有しないNM522株を50μg/mlのアンピシリンを含む10mlのLB培地が入った試験管(プラスミドを持たない株の場合にはアンピシリンは無添加、以下同様)に接種し、30℃で17時間培養した。この培養液0.5mlを50mlのLB培地が入った250ml容の三角フラスコにそれぞれ植菌し、30℃で1時間振とう培養した後、IPTGを終濃度1mmol/Lになるように添加し、さらに4時間培養を継続した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。
このことから、実験例11で取得されたシクロジペプチド合成酵素はジペプチドを合成する能力をもつことが明らかになった。
実験例13 精製酵素を用いたジペプチドの製造(1)
実験例12と同様にエシェリヒア・コリNM522/pAL−nou株を培養した。培養終了後、遠心分離によって湿菌体を取得し、60mmol/Lのリン酸カリウムバッファー(pH7.2)で洗浄後、10mmol/Lイミダゾール含有20mmol/Lリン酸カリウムバッファーに懸濁した。この懸濁を4℃で超音波処理して菌体破砕液を取得した。この菌体破砕液(10ml、蛋白質0.863mgを含む)をアマシャム社製Hisタグ精製カラムに通塔し、10mmol/Lのイミダゾールを含有する20mmol/Lのリン酸カリウムバッファー15mlを通塔することによる洗浄を行い、HisタグつきalbC蛋白質をカラム内にて精製した。次にこのHisタグ付きのalbC蛋白質を保持するカラムに、実施例2と同組成の反応液(反応液組成:60mmol/Lのリン酸カリウムバッファー(pH7.2)、10mmol/Lの塩化マグネシウム、10mmol/LのATP、1g/LのL−Leu、1g/LのL−Pheからなる反応液)2mlを通塔し、カラム内に基質を保持した状態で、30℃にて、インキュベートした。24時間後、同組成の反応液3mlでカラム内の反応液を溶出し、実験例12と同様の方法により反応液中のシクロジペプチドおよびジペプチドを定量した。
実験例14 精製酵素を用いたジペプチドの製造(2)
基質のアミノ酸を他のアミノ酸に換える以外は実験例13と同様の方法で酵素反応を行い、生成物を分析した。反応液は、基質のアミノ酸を、1g/LのL−Ala、L−LeuまたはL−Pheに置き換えた以外は実験例13と同じ組成の溶液を用いた。
実験例15 ywfE遺伝子の発現を強化した大腸菌の造成
パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成機を用いて、配列番号82〜85に記載の配列をそれぞれ有するDNA(以下、それぞれプライマーL、プライマーM、プライマーN、プライマーO)を合成した。配列番号82の配列は、プラスミドpQE60ywfEのywfE遺伝子のリボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ配列を含む領域について5’側にXhoI認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号83の配列は、ywfE遺伝子の終始コドンを含む配列と相補的な配列の5’側にBamHI認識配列を含む配列を付加したものである。また配列番号84の配列は、trpプロモーターを含む発現ベクターpTrS30のtrpプロモーター領域の配列について5’側にEcoRI認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号85の配列は、trpプロモーターを含む発現ベクターpTrS30のtrpプロモーター領域の配列と相補的な配列の5’側にXhoI認識配列を含む配列を付加したものである。
上記で得られたywfE遺伝子を含む1.4kb断片、trpプロモーター領域を含む0.3kb断片および4.5kbの断片をライゲーションキットを用いて、16℃で16時間、連結反応を行った。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、trpプロモーター下流にywfE遺伝子を含む発現ベクターであるpPE56を得た。該ベクターの構造を制限酵素消化により確認した(図4)。
実験例16 pepD遺伝子、pepN遺伝子、pepB遺伝子、pepA遺伝子およびdppオペロン欠損株の作製
エシェリヒア・コリ染色体DNA上の特定遺伝子が欠損した菌株は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,6641−6645(2000)]に従って作製した。
(1)遺伝子欠損用DNA断片のクローニング
エシェリヒア・コリK12株の染色体DNA上に存在する配列番号53で表される塩基配列を有するpepD遺伝子、配列番号54で表される塩基配列を有するpepN遺伝子、配列番号55で表される塩基配列を有するpepB遺伝子、配列番号56で表される塩基配列を有するpepA遺伝子および配列番号57で表される塩基配列を有するdppA遺伝子、配列番号58で表される塩基配列を有するdppB、配列番号59で表される塩基配列を有するdppC遺伝子、配列番号60で表される塩基配列を有するdppD遺伝子および配列番号61で表される塩基配列を有するdppF遺伝子を欠損させることを目的に、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成機を用い、エシェリヒア・コリK12株の染色体DNA上における各々の欠損標的遺伝子の上流および下流に位置する36bpからなる塩基配列と相同な塩基配列、および配列番号52で表される酵母由来Flp recombinaseが認識する塩基配列を有するDNAを合成した。ただし、dppA遺伝子、dppB遺伝子、dppC遺伝子、dppD遺伝子およびdppF遺伝子は、オペロンを形成しているので、該オペロンの上流および下流に位置する塩基配列と相同な塩基配列を有するDNAを合成した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に2倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−80℃で30分間放置した。該溶液を遠心分離し、pepD遺伝子、pepN遺伝子、pepB遺伝子、pepA遺伝子およびdppオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有DNA断片を取得した。
(2)pepD遺伝子欠損エシェリヒア・コリJM101の作製
エシェリヒア・コリJM101株をpKD46で形質転換した後、100mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で培養することでpKD46を保持するエシェリヒア・コリJM101株(以下、エシェリヒア・コリJM101/pKD46と称す)を選択した。
プラスミドpCP20は、酵母由来Flp recombinase遺伝子を有し、該遺伝子の発現は42℃で誘導することができる。
また、上記で作製したpepD遺伝子、pepN遺伝子、pepB遺伝子、pepA遺伝子及びd ppオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有DNA断片の、クロラムフェニコール耐性遺伝子の両端にはFlp recombinaseが認識する塩基配列が存在するため、Flp recombinaseが触媒する相同組換えにより容易に該耐性遺伝子を脱落させることができる。
上記で取得したpCP20保有pKD46脱落株を薬剤無添加のLB寒天培地に植菌し、42℃で14時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを薬剤無添加LB寒天培地、25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地および100mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地にレプリカして、30℃で培養し、クロラムフェニコール感受性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。
(3)エシェリヒア・コリJM101の染色体DNA上のpepD遺伝子およびpepN遺伝子が欠損した株の作製
上記(2)で得られたエシェリヒア・コリJPD1株をpKD46で形質転換した後、100mg/lのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で培養することによりpKD46を保持するエシェリヒア・コリJPD1(以下、エシェリヒア・コリJPD1/pKD46と称す)を選択した。エシェリヒア・コリJPD1/pKD46に、電気パルス法によりpepN遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有DNA断片を導入し、エシェリヒア・コリJPD1/pKD46の染色体DNA上にpepN遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有DNA断片が相同組換えに
より組込まれた形質転換株を取得した。
(4)エシェリヒア・コリJM101の染色体DNA上のpepN遺伝子、pepA遺伝子、pepB遺伝子またはdppオペロンが欠損した株、および多重遺伝子欠損株の作製
pepN遺伝子、pepA遺伝子、pepB遺伝子またはdppオペロンの欠損株は、上記(1)で作製した各遺伝子またはオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有DNA断片を用い、上記(2)と同様の方法により作製した。
また、上記(3)の方法に準じて、pepD遺伝子、pepN遺伝子、pepA遺伝子、pepB遺伝子およびdppオペロンからなる群より選ばれる2以上の遺伝子またはオペロンの多重欠損株を作製した。多重欠損株が取得できたことの確認は、上記(2)と同様のPCRにより確認した。前記方法で取得されたpepD遺伝子およびdppオペロンが欠損した二重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリJPDP49株、pepB遺伝子、pepD遺伝子およびpepN遺伝子が欠損した三重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリJPDNB43株、pepD遺伝子、pepN遺伝子およびdppオペロンが欠損した三重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリJPNDDP36株、pepA遺伝子、pepD遺伝子、pepN遺伝子およびdppオペロンが欠損した四重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリJPNDAP5株、pepB遺伝子、pepD遺伝子、pepN遺伝子およびdppオペロンが欠損した四重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリJPNDBP7株と名づけた。表2は、各遺伝子欠損株における欠損遺伝子名を示す。
実験例16で得られた各種ペプチダーゼおよびジペプチド取り込み蛋白質をコードする遺伝子の欠損株を、実験例15で造成したプラスミドpPE56を用いて形質転換し、アンピシリン耐性を示す形質転換株を取得した。
実験例18 ペプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質の活性が喪失した大腸菌株を用いたL−アラニル−L−バリン(以下、L−Ala−L−Valと称す)の生産性の評価
実験例17と同様に、各種ペプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質をコードする遺伝子の欠損大腸菌株を、pPE56を用いて形質転換した。得られた形質転換株を50μg/mlのアンピシリンを含む8mlのLB培地の入った試験管に接種し、28℃で17時間培養した。該培養液を100μg/mlのアンピシリンおよびアミノ酸を含む8mlの水性媒体(リン酸水素二カリウム16g/l、リン酸二水素カリウム14g/l、硫酸アンモニウム5g/l、クエン酸(無水)1g/l、カザミノ酸(Difco社製)0.5g/l、L−Pro1g/l、L−Ala2.5g/l、L−Val2.5g/l、グルコース10g/l、ビタミンB110mg/l、硫酸マグネシウム・7水和物25mg/l、硫酸鉄・7水和物50mg/l、10mol/lの水酸化ナトリウム溶液でpH7.2に調整。グルコース、ビタミンB1、硫酸マグネシウム・7水和物、硫酸鉄・7水和物は別個に蒸煮後に添加)が入った試験管に1%添加し、30℃で24時間反応させた。該水性媒体を遠心分離し上清を取得した。
実験例19 ペプチダーゼおよびジペプチド取り込み系蛋白質の活性が喪失した大腸菌株を用いたグリシル−L−グルタミン(以下、Gly−L−Glnと称す)の生産性の評価
実験例17と同様に各種ペプチダーゼ遺伝子およびジペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンの欠損株を、pPE56を用いて形質転換した。得られた形質転換株を、50μg/mlのアンピシリンを含む8mlのLB培地の入った試験管に接種し、28℃で17時間培養した。
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実験例4で取得した精製したHisタグ付加組換え型酵素40mg/L、100mmol/LのTris−HCl(pH9.0)、30mmol/Lの塩化マグネシウム、10mmol/LのATP、各10mmol/Lの表6記載のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からなる0.1mlの反応液を調製し、37℃で2時間反応を行った。
反応終了後、反応液の100倍量の停止緩衝液(4mol/L尿素、100mmol/L EDTA・2ナトリウム塩)を反応液に加えて反応を停止し、酵素反応によりATPが消費される際に生じるADP量をHPLCを用いて分析することにより、反応が進行していることを確認した。HPLCによる分析は、カラムにDevelosil C30−UG−5(150×4.6mm、野村化学社製)、移動相に200mmol/Lの酢酸および200mmol/Lのトリエチルアミンからなる溶液(pH6.6)を用い、流速1.0ml/
分、室温、254nmの紫外吸収を測定する条件で行った。結果を表6に示す。
Ala :L‐アラニン
Phe :L‐フェニルアラニン
Glu :L‐グルタミン酸
Asp :L‐アスパラギン酸
Lys :L‐リジン
Cl‐Ala :β‐クロロ‐L‐アラニン
CN‐Ala :β‐シアノ‐L‐アラニン
cyc(5)Ala :β‐シクロペンチル‐DL‐アラニン
cyc(3)Ala :β‐シクロプロピルアラニン
cyc(6)Ala :β‐シクロヘキシルアラニン
Cl‐Phe :4‐クロロフェニルアラニン
F‐Phe :4‐フルオロフェニルアラニン
Ni‐Phe :p‐ニトロフェニルアラニン
NH2‐Phe :p‐アミノフェニルアラニン
Phe‐NH2 :フェニルアラニンアミド
Kynurenin :L‐キヌレニン
Glu(OMe) :グルタミン酸‐γ‐メチルエステル
Glu(OEt) :グルタミン酸‐γ‐エチルエステル
Glu(OtBu) :グルタミン酸‐γ‐t‐ブチルエステル
Glu(OBzl) :グルタミン酸‐γ‐ベンジルエステル
Asp(OMe) :アスパラギン酸‐β‐メチルエステル
Asp(OtBu) :アスパラギン酸‐β‐t‐ブチルエステル
Asp(OBzl) :アスパラギン酸‐β‐ベンジルエステル
Lys(Ac) :アセチルリジン
Lys(Boc) :Boc‐リジン
表6に示すように、コントロールである基質無添加区、およびL‐Ala、L‐Phe、L‐Glu、L‐Asp、L‐Lysをそれぞれ単独の基質に用いた試験区でのADP生成量は0.02〜0.16mmol/Lであったのに対し、表6に示すアミノ酸およびアミノ酸誘導体の組み合わせでは、0.54〜6.43mmol/LものADPが生成していた。
プロトンNMR分析は、Bruker社製のDMX500を用い、以下の条件下で行った。
温度:303K
標準物質:1mmol/Lの3−(Trimethylsilyl)−Propionic acid−D4 sodium salt(TSP)
媒体:反応液4、10および11は軽水、その他の反応液は重水
反応液中の化合物の構造は、α位のプロトンのケミカルシフトに基づき同定した。各化合物の濃度はTSPの面積を内部標準とし、α位のプロトンのシグナル面積を元に算出した(表7)。ただし、L−Ala−L−Alaは濃度が低く、α位のプロトンのシグナルが重なり合うため、β位のプロトンのシグナル面積を元に算出した。なお、括弧内は、各化合物のα位プロトンのケミカルシフト(単位はppm)を表す。
Cl−Ala(4.20)、Phe(4.02)、Cl−Ala−Phe(3.93,4.50)、Aziridine−2−carboxylic acid[Azc](2.73)、Azc−Phe(2.59,4.47)
CN−AlaおよびPheを基質に用いた反応液(反応液2)
CN−Ala(3.87)、Phe(4.00)、Cl−Ala−Phe(3.71,4.48)
AlaおよびCl−Pheを基質に用いた反応液(反応液3)
Ala(3.79)、Cl−Phe(3.97)、Ala−Cl−Phe(3.90,4.43)
AlaおよびNH2−Pheを基質に用いた反応液(反応液4)
Ala(3.78)、NH2−Phe(3.93)、Ala−NH2−Phe(3.95,4.39)、Ala−Ala(β;1.55,1.36)
AlaおよびKinurenineを基質に用いた反応液(反応液5)
Ala(3.79)、Kinurenine(4.16)、Ala−Kinurenine(3.96,4.64)
AlaおよびPhe−NH2を基質に用いた反応液(反応液6)
Ala(3.79)、Phe−NH2(4.02)、Ala−Phe−NH2(3.90,4.60)
AlaおよびGlu(OMe)を基質に用いた反応液(反応液7)
Ala(3.79)、Glu(OMe)(3.76)、Ala−Glu(OMe)(4.05,4.18)、Ala−Ala(β;1.55,1.36)
AlaおよびGlu(OtBu)を基質に用いた反応液(反応液8)
Ala(3.79)、Glu(OtBu)(3.76)、Ala−Glu(OtBu)(4.04,4.18)
AlaおよびAsp(OtBu)を基質に用いた反応液(反応液9)
Ala(3.81)、Asp(OtBu)(3.98)、Ala−Asp(OtBu)(4.04,4.46)
AlaおよびLys(Boc)を基質に用いた反応液(反応液10)
Ala(3.78)、Lys(Boc)(3.73)、Ala−Lys(Boc)(4.02,4.14)
Alaおよびcyc(3)Alaを基質に用いた反応液(反応液11)
Ala(3.78)、cyc(3)Ala(3.82)、Ala−cyc(3)Ala(4.08,4.24)
Alaおよびcyc(6)Alaを基質に用いた反応液(反応液12)
Ala(3.79)、cyc(6)Ala(3.76)、Ala−cyc(6)Ala(4.02,4.22)
上記結果から、本発明の製造法により、アミノ酸およびアミノ酸誘導体を基質として、直接アミノ酸とアミノ酸誘導体がペプチド結合したジペプチド誘導体が製造できることが明らかとなった。
実験例6で得られたL−Ala−L−phe(100mg,0.423mmol)を塩化メチレン(10mL)に懸濁し、室温でピリジン(10mL)及び無水酢酸(1mL,11mmol)を加える。室温で24時間撹拌した後、水を加えクロロホルムで3回抽出する。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去することにより、N−[2−(アセチルアミノ)プロピオニル]フェニルアラニンを得る。
実施例2で得られるN−[2−(アセチルアミノ)プロピオニル]フェニルアラニン(10mg,0.036mmol)をN,N−ジメチルホルムアミド(5mL)に懸濁し、室温で1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(14mg,0.073mmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(15mg,0.11mmol)及びピペリジン(40μL,0.40mmol)を加え50℃で24時間撹拌する。反応混合物に水を加え、クロロホルムで3回抽出する。有機層を10%塩酸及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去する。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、1−{2−[N−((アセチルアミノ)アセチル)アミノ]−3−フェニルプロピオニル}ピペリジンを得る。
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Claims (13)
- 以下の[1]〜[3]のいずれかに記載の蛋白質、L−Ala若しくはその誘導体とL−Ala、L−Gln、L−Glu、Gly、L−Val、L−Leu、L−Ile、L−Phe、L−Trp、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Cys、L−Asn、L−Tyr、L−Lys、L−Arg、L−His、L−Asp、L−α−アミノ酪酸、L−アザセリン、L−テアニン、およびL−シトルリンから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、Gly若しくはその誘導体とL−Gln、Gly、L−Phe、L−Trp、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Cys、L−Tyr、L−Lys、L−Arg、L−α−アミノ酪酸、およびL−シトルリンから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、L−Ser若しくはその誘導体とL−Gln、L−Phe、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Tyr、L−His、およびL−α−アミノ酪酸から選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、L−Thr若しくはその誘導体とL−Gln、L−Leu、L−Phe、L−Met、L−Thr、およびL−α−アミノ酪酸から選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、L−Met若しくはその誘導体とL−Cys、L−Met、L−Phe、L−Tyr、L−HisおよびL−Lysから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、β−Ala若しくはその誘導体とL−Met、L−Phe、L−HisおよびL−シトルリンから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、L−Gln若しくはその誘導体とL−Phe若しくはその誘導体、またはL−α−アミノ酪酸若しくはその誘導体とL−Gln、L−ArgおよびL−α−アミノ酪酸から選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体[但し、誘導体は式(I)
[1]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質
[3]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質 - 以下の[1]〜[3]のいずれかに記載の蛋白質、L−Ala若しくはその誘導体とL−Ala、L−Gln、L−Glu、Gly、L−Val、L−Leu、L−Ile、L−Phe、L−Trp、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Cys、L−Asn、L−Tyr、L−Lys、L−Arg、L−His、L−Asp、L−α−アミノ酪酸、L−アザセリン、L−テアニン、およびL−シトルリンから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、Gly若しくはその誘導体とL−Gln、Gly、L−Phe、L−Trp、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Cys、L−Tyr、L−Lys、L−Arg、L−α−アミノ酪酸、およびL−シトルリンから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、L−Ser若しくはその誘導体とL−Gln、L−Phe、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Tyr、L−His、およびL−α−アミノ酪酸から選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、L−Thr若しくはその誘導体とL−Gln、L−Leu、L−Phe、L−Met、L−Thr、およびL−α−アミノ酪酸から選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、L−Met若しくはその誘導体とL−Cys、L−Met、L−Phe、L−Tyr、L−HisおよびL−Lysから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、β−Ala若しくはその誘導体とL−Met、L−Phe、L−HisおよびL−シトルリンから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、L−Gln若しくはその誘導体とL−Phe若しくはその誘導体、またはL−α−アミノ酪酸若しくはその誘導体とL−Gln、L−ArgおよびL−α−アミノ酪酸から選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体[但し、誘導体は前記式(I)または前期式(II)で表されるアミノ酸誘導体である。]、およびATPを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成、蓄積させ、そのまま、または該媒体から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を修飾し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体[以下、ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)という]を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)の製造法[但し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)は、前記アミノ酸群Aから選ばれる同一のまたは異なるアミノ酸がペプチド結合によって結合した化合物ではない]。
[1]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質
[3]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質 - 以下の[1]または[2]記載のDNAを保持する細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、L−Ala若しくはその誘導体とL−Ala、L−Gln、L−Glu、Gly、L−Val、L−Leu、L−Ile、L−Phe、L−Trp、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Cys、L−Asn、L−Tyr、L−Lys、L−Arg、L−His、L−Asp、L−α−アミノ酪酸、L−アザセリン、L−テアニン、およびL−シトルリンから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、Gly若しくはその誘導体とL−Gln、Gly、L−Phe、L−Trp、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Cys、L−Tyr、L−Lys、L−Arg、L−α−アミノ酪酸、およびL−シトルリンから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、L−Ser若しくはその誘導体とL−Gln、L−Phe、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Tyr、L−His、およびL−α−アミノ酪酸から選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、L−Thr若しくはその誘導体とL−Gln、L−Leu、L−Phe、L−Met、L−Thr、およびL−α−アミノ酪酸から選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、L−Met若しくはその誘導体とL−Cys、L−Met、L−Phe、L−Tyr、L−HisおよびL−Lysから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、β−Ala若しくはその誘導体とL−Met、L−Phe、L−HisおよびL−シトルリンから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、L−Gln若しくはその誘導体とL−Phe若しくはその誘導体、またはL−α−アミノ酪酸若しくはその誘導体とL−Gln、L−ArgおよびL−α−アミノ酪酸から選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体[但し、誘導体は前記式(I)または前期式(II)で表されるアミノ酸誘導体である。]、を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成、蓄積させ、該媒体中から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)の製造法[但し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)は、前記アミノ酸群Aから選ばれる同一のまたは異なるアミノ酸がペプチド結合によって結合した化合物ではない]。
[1]配列番号9〜16および36のいずれかで表される塩基配列を有するDNA
[2]配列番号9〜16および36のいずれかで表される塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA - 以下の[1]または[2]記載のDNAを保持する細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、L−Ala若しくはその誘導体とL−Ala、L−Gln、L−Glu、Gly、L−Val、L−Leu、L−Ile、L−Phe、L−Trp、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Cys、L−Asn、L−Tyr、L−Lys、L−Arg、L−His、L−Asp、L−α−アミノ酪酸、L−アザセリン、L−テアニン、およびL−シトルリンから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、Gly若しくはその誘導体とL−Gln、Gly、L−Phe、L−Trp、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Cys、L−Tyr、L−Lys、L−Arg、L−α−アミノ酪酸、およびL−シトルリンから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、L−Ser若しくはその誘導体とL−Gln、L−Phe、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Tyr、L−His、およびL−α−アミノ酪酸から選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、L−Thr若しくはその誘導体とL−Gln、L−Leu、L−Phe、L−Met、L−Thr、およびL−α−アミノ酪酸から選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、L−Met若しくはその誘導体とL−Cys、L−Met、L−Phe、L−Tyr、L−HisおよびL−Lysから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、β−Ala若しくはその誘導体とL−Met、L−Phe、L−HisおよびL−シトルリンから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、L−Gln若しくはその誘導体とL−Phe若しくはその誘導体、またはL−α−アミノ酪酸若しくはその誘導体とL−Gln、L−ArgおよびL−α−アミノ酪酸から選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体[但し、誘導体は前記式(I)または前期式(II)で表されるアミノ酸誘導体である。]、を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成、蓄積させ、そのまま、または該媒体から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を修飾し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)の製造法。
[1]配列番号9〜16および36のいずれかで表される塩基配列を有するDNA
[2]配列番号9〜16および36のいずれかで表される塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA - 細胞が微生物の細胞である、請求項3または4に記載の製造法。
- 微生物が原核生物である、請求項5記載の製造法。
- 原核生物が1種以上のペプチダーゼおよび1種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質(以下、ペプチド取り込み蛋白質ともいう)の活性が低下または喪失した微生物である、請求項6記載の製造法。
- 原核生物が3種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失した微生物である、請求項6記載の製造法。
- ペプチダーゼが配列番号43〜46のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号43〜46のいずれかで表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質である、請求項7または8記載の製造法。
- ペプチド取込み蛋白質が配列番号47〜51のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号47〜51のいずれかで表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有する蛋白質であり、かつペプチド取り込み活性を有する蛋白質である、請求項7または9記載の製造法。
- 原核生物がエシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物である、請求項6〜10のいずれか1項に記載の製造法。
- エシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物が、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテイルム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィシェンス、バチルス・サチルスまたはバチルス・メガテリウムである、請求項11記載の製造法。
- 培養物の処理物が培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であり、かつ1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する処理物であることを特徴とする、請求項3〜12のいずれか1項に記載の製造法。
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