CN102190705B

CN102190705B - 精-鸟二肽合成方法

Info

Publication number: CN102190705B
Application number: CN 201110073099
Authority: CN
Inventors: 侯洁; 高智慧
Original assignee: Tianjin Qiren Medical Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Tianjin Qiren Medical Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2011-03-25
Filing date: 2011-03-25
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2031-03-25
Also published as: CN102190705A

Abstract

精-鸟二肽合成方法，涉及一种含氨基酸的二肽合成方法。合成步骤为N端保护的鸟氨酸在N-羟基琥珀酰亚胺作用下生成活性酯；活性酯与胍基保护的精氨酸在碱作用下反应形成肽键；随后分别用酸、碱脱去保护基团得到精-鸟二肽。本发明首次提供了一种合成工艺和设备简单、成本低、产率高、产物容易分离提纯的精-鸟二肽合成方法，该方法具有良好的应用价值。

Description

精-鸟二肽合成方法

技术领域

本发明涉及一种精-鸟二肽合成方法，属于肽类合成领域。

背景技术

肽类由于其在生物体内具有良好的吸收性，吸收效率比氨基酸和蛋白质都高，具有独特的生理调节功能，因此，肽类化合物特别是短肽类化合物的开发得到了广泛关注。精氨酸、鸟氨酸均是人体必需的氨基酸，在生物体代谢中起重要作用。

精氨酸（Arginine, Arg）最初由Schlus于1886年从植物羽扇豆苗中分离提取得到，1895年Hedin发现精氨酸存在于哺乳动物的蛋白质中。精氨酸是幼龄哺乳动物的必需氨基酸，是组织蛋白中最丰富的氮载体。精氨酸是碱性氨基酸，在动物体内具备重要的生理生化功能，它不仅是细胞质、核酸蛋白的主要成分，还是向天门冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、聚胺(腐胺、精脒、精胺)等转换为高能磷酸化合物肌酸磷酸的中间体，是肌酐酸唯一的氨来源；还作为尿素循环的中间体，通过尿素循环解除氨中毒，避免由于氨过量造成的代谢紊乱。在机体的匀质代谢方面起着重要的作用，可用于多种代谢途径，包括精氨酸酶、一氧化氮合酶、精氨酸/甘氨酸胍基转移酶、精氨酰-tRNA合成酶等。在体内，精氨酸是最丰富的氮运输者，并通过多种代谢途径加以利用。

L-鸟氨酸学名为α, δ-二氨基戊酸，分子式为C₅H₁₂N₂O₂，结构式为NH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CHNH₂-COOH。L-鸟氨酸存在于生物体多种组织和细胞中，在生物体代谢中起到重要作用，是尿素生成的中间产物，精氨酸、瓜氨酸等多种氨基酸代谢的前体物质，主要参与产尿素的鸟氨酸循环，对体内集聚的氨具有解毒作用，因而鸟氨酸对人体肝脏细胞具有重大意义。在近代医药行业中，L-鸟氨酸除用于制备保肝、护肝、治疗肝病、抗疲劳、抗虚弱等各种复方氨基酸输液外，还常和精氨酸一起用于配制恢复疲劳的发泡饮料。近几年研究发现鸟氨酸还可刺激脑垂体分泌生长激素，促进蛋白质合成及糖与脂肪的分解代谢，在结合运动情况下摄食鸟氨酸可减少体内脂肪堆积，增强肌肉和体力，起到减肥保健的作用；此外, 鸟氨酸能增加聚乙烯胺的合成，促进细胞增殖，在提高免疫功能和抗癌功能上有一定作用；L-鸟氨酸添加在运动员保健品支链氨基酸中，具有脱苦作用。在欧洲，鸟氨酸液作为膳食药物来销售；日本将L-鸟氨酸与L-肉碱、谷氨酸等作为食品调料来看待。L-鸟氨酸因其多功能的保健作用而引起世人的特别关注。

二肽是由两个氨基酸残基通过肽键连接形成的肽，在体内二肽可被二肽酶水解而成两个游离氨基酸。在体内肠粘膜细胞上存在着吸收二肽的耗能主动运转体系，因此二肽比氨基酸更易于被吸收。由于以肽形式吸收时，吸收率高，并且具有一定的生理功能，二肽的研究受到了广泛关注，例如丙谷二肽、甘氨酰脯氨酸二肽、谷氨酰胺二肽、赖氨酸谷氨酸二肽等已被开发成为药物或药物前体。但目前还尚未有文献报道关于精-鸟二肽的制备。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能大批量生产，经济合理，操作简单且产品收率和纯度均高的新的二肽化合物精-鸟二肽（Arg-Orn）的合成方法。

本发明提供的精-鸟二肽合成方法的具体步骤：

1）N端保护的鸟氨酸与N-羟基琥珀酰亚胺在有机溶剂中反应30 min~10 h，反应温度-5~30 ℃，反应结束后，水洗，分离有机溶剂层，旋蒸，真空干燥，形成N端保护的鸟氨酸活泼酯；其中N端保护鸟氨酸与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为0.70~2.50。

2）将1）步中得到的N端保护的鸟氨酸活泼酯与胍基保护的精氨酸, 在有机溶剂中反应10 min~15 h，反应温度-5~30 ℃，形成酰胺键，反应结束后，水洗，分离有机溶剂层，旋蒸，真空干燥，得到N端及胍基保护的精-鸟二肽；其中N端保护的鸟氨酸活泼酯与胍基保护的精氨酸摩尔比为：0.80~3.0。

3）将2）步中得到的N端及胍基保护的精-鸟二肽溶于有机溶剂中，加入无机酸，反应温度10~60 ℃，反应1~5 h，脱除胍基保护基，用乙醚沉淀，过滤得到N端保护的精-鸟二肽；其中N端及胍基保护的精-鸟二肽与无机酸的摩尔比为：0.5~10。

4）将3）步中得到的N端保护的精-鸟二肽溶于有机溶剂中，加入有机碱，室温，反应20 min~12 h，反应温度-5~30 ℃，反应液水洗，分离有机层，旋蒸，干燥，乙醚研磨，过滤，得到精-鸟二肽，产率为30~85%；其中N端精-鸟二肽与有机碱的摩尔比为：0.5~3.0。

其中，

（I）所述的有机溶剂选自二氯甲烷、甲醇、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、二甲基亚砜或氯仿中的一种。

（II）步骤1）中所述的N端保护的鸟氨酸为Fmoc-Orn-OH或 Fmoc-Orn(Boc)-OH。

（III）步骤1）中所述的N端保护鸟氨酸与N-羟基琥珀酰亚胺的反应优选时间范围为1~6 h，优选反应温度-5~10 ℃。

（IV）步骤2）中所述的N端保护的鸟氨酸活泼酯与胍基保护的精氨酸反应的优选时间范围为3~7 h，优选反应温度 -5~10 ℃。

（ Ⅴ）步骤3）中所述的N端及胍基保护的精-鸟二肽与无机酸反应的优选时间范围为2~3 h, 优选反应温度为20~40 ℃。

（Ⅵ）步骤4）中所述的N端精-鸟二肽与有机碱的反应优选时间为1.5~5h，优选反应温度为-5~10 ℃。

（Ⅶ）步骤3）中所述的无机酸选自盐酸、三氟乙酸、含氯化氢的冰乙酸溶液、含溴化氢的冰乙酸溶液、含氯化氢的二氧六环溶液或含溴化氢的二氧六环溶液中的一种。

（Ⅷ）步骤4）中所述的有机碱选自六氢吡啶、三乙胺、乙二胺、甲胺、乙胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺或异丙胺中的一种。

本发明的优点及有益效果：

本发明首次采用化学合成方法得到精鸟二肽，并且该工艺合成路线短，生产工艺合理，成本低，有良好的应用价值。

附图说明

图1是精-鸟二肽的液相分析及质谱，

(A)：液相分析，分析条件：乙腈：水 = 85 ：15；流速：1 mL/min；检测波长：254nm

(B)：质谱正离子模式：[M+H]⁺= 288.90, [M+Na]⁺= 310.80

(C)：质谱负离子模式：[M-H]^- = 286.75 。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

1、Fmoc-Orn（boc）-OH 50 mmol用20 mL 二氯甲烷溶解，加入NHS 35 mmol, 室温反应1小时，反应结束后，水洗，析出固体，过滤，得白色固体Fmoc-Orn（boc）-NHS。产率95%。

2、将Arg（Pbf）-OH 20 mmol，Fmoc-Orn（boc）-NHS 16 mmol溶于30mL氯仿，于10℃反应过夜，反应结束后，水洗，收集有机相，旋蒸，得淡黄色泡状固体Fmoc-Orn（boc）-Arg（Pbf）-OH。产率80%。

3、将Fmoc-Orn（boc）-Arg（Pbf）-OH 7 mmol溶于20 mL二氧六环，滴加3 mL三氟乙酸，室温反应2小时，反应结束后加入乙醚，析出白色固体，抽滤，得到Fmoc-Orn-Arg-OH。产率65%。

4、将Fmoc-Orn-Arg-OH 5 mmol溶于15 ml 甲醇中，滴加7.5 mL 哌啶，-5℃下反应5小时，反应结束后，加入乙醚，析出白色固体，抽滤，得到精-鸟二肽Orn-Arg。产率50%。

实施例2

1、Fmoc-Orn（boc）-OH 40 mmol用40 mL 乙酸乙酯溶解，加入NHS 65 mmol, 20℃反应2.5 h，反应结束后，水沉，析出固体，过滤，得白色固体Fmoc-Orn（boc）-NHS。产率85%。

2、将Arg（Pbf）-OH 20 mmol，Fmoc-Orn（boc）-NHS 32 mmol溶于50 mL1，2-二氯乙烷，30℃反应4 h，反应结束后，水洗，收集有机相，旋蒸，得淡黄色泡状固体Fmoc-Orn（boc）-Arg（Pbf）-OH。产率70%。

3、将Fmoc-Orn（boc）-Arg（Pbf）-OH 15 mmol溶于40mL乙腈，滴加10 mL溴化氢/冰乙酸溶液，室温反应3 h，反应结束后加入乙醚，析出白色固体，抽滤，得到Fmoc-Orn-Arg-OH。产率75%。

4、将Fmoc-Orn-Arg-OH 10 mmol溶于35 mL N，N-二甲基甲酰胺(或二甲基亚砜)中，滴加15 mL环己胺，室温反应4 h，反应结束后，加入乙醚，析出白色固体，抽滤，得到精-鸟二肽Orn-Arg。产率60%。

实施例3：

1、Fmoc-Orn-OH 60 mmol用100 mL二氧六环溶解，加入NHS 129 mmol, 室温反应2 h，反应结束后，水沉，析出固体，过滤，得白色固体Fmoc-Orn（boc）-NHS。产率95%。

2、将Arg（Pbf）-OH 40 mmol，Fmoc-Orn（boc）-NHS 106 mmol溶于50 mL乙腈，室温反应过夜，反应结束后，水洗，收集有机相，旋蒸，得淡黄色泡状固体Fmoc-Orn（boc）-Arg（Pbf）-OH。产率75%。

3、将Fmoc-Orn（boc）-Arg（Pbf）-OH 15 mmol溶于40mL甲醇中，滴加60 mL氯化氢/二氧六环溶液，室温反应过夜，反应结束后加入乙醚，析出白色固体，抽滤，得到Fmoc-Orn-Arg-OH。产率65%。

4、将Fmoc-Orn-Arg-OH 20 mmol溶于30 mL中二氯甲烷，滴加40 mL甲胺，室温反应1 h，反应结束后加入乙醚，析出白色固体，抽滤，得到精-鸟二肽Orn-Arg（¹HNMR(DMSO),400MHz):δ2.93 (2H, t, J=7.302), 1.32 (2H, tt, J=7.302, J=6.960), 1.39 (2H, tt, J=7.365, J=6.960), 1.82 (2H, tt, J=7.434, J=7.427), 2.73 (2H, t, J=7.427), 1.67 (2H, dt, J=7.567, J=7.365), 1.87 (2H, dt, J=7.517, J=7.434), 3.45 (1H, t, J=7.567), 4.22 (1H, t, J=7.517)，10.83 (1H, s)。产率50%。产品液相分析及质谱见附图。

Claims

1.精-鸟二肽合成方法，其特征在于该方法的步骤为：

1）N端保护的鸟氨酸与N-羟基琥珀酰亚胺在有机溶剂中反应30min~10h，反应温度-5~30℃，反应结束后，水洗，分离有机溶剂层，旋蒸，真空干燥，形成N端保护的鸟氨酸活泼酯；其中N端保护鸟氨酸与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为0.70~2.50；

2）将1）步中得到的N端保护的鸟氨酸活泼酯与胍基保护的精氨酸,在有机溶剂中反应10min~15h，反应温度-5~30℃，形成酰胺键，反应结束后，水洗，分离有机溶剂层，旋蒸，真空干燥，得到N端及胍基保护的精-鸟二肽；其中N端保护的鸟氨酸活泼酯与胍基保护的精氨酸摩尔比为：0.80~3.0；

3）将2）步中得到的N端及胍基保护的精-鸟二肽溶于有机溶剂中，加入无机酸，反应温度10~60℃，反应1~5h，脱除胍基保护基，用乙醚沉淀，过滤得到N端保护的精-鸟二肽；其中N端及胍基保护的精-鸟二肽与无机酸的摩尔比为：0.5~10；

4）将3）步中得到的N端保护的精-鸟二肽溶于有机溶剂中，加入有机碱，室温，反应20min~12h，反应温度-5~30℃，反应液水洗，分离有机层，旋蒸，干燥，乙醚研磨，过滤，得到精-鸟二肽，产率为30~85%；其中N端精-鸟二肽与有机碱的摩尔比为：0.5~3.0；

其中，所述的有机溶剂选自二氯甲烷、甲醇、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、二甲基亚砜或氯仿中的一种；步骤1）中所述的N端保护的鸟氨酸为Fmoc-Orn-OH或Fmoc-Orn(Boc)-OH；步骤3）中所述的无机酸选自盐酸、三氟乙酸、含氯化氢的冰乙酸溶液、含溴化氢的冰乙酸溶液、含氯化氢的二氧六环溶液、含溴化氢的二氧六环溶液中的一种；步骤4）中所述的有机碱选自六氢吡啶、三乙胺、乙二胺、甲胺、乙胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺或异丙胺中的一种。

2.如权利要求1所述的精-鸟二肽合成方法，其特征在于步骤1）中所述的N端保护鸟氨酸与N-羟基琥珀酰亚胺的反应优选时间范围为1~6h，优选反应温度-5~10℃。

3.如权利要求1所述的精-鸟二肽合成方法，其特征在于步骤2）中所述的N端保护的鸟氨酸活泼酯与胍基保护的精氨酸反应的优选时间范围为3~7h，优选反应温度-5~10℃。

4.如权利要求1所述的精-鸟二肽合成方法，其特征在于步骤3）中所述的N端及胍基保护的精-鸟二肽与无机酸反应的优选时间范围为2~3h,优选反应温度为20~40℃。

5.如权利要求1所述的精-鸟二肽合成方法，其特征在于步骤4）中所述的N端精-鸟二肽与有机碱的反应优选时间为1.5~5h，优选反应温度为-5~10℃。