CN106349340A

CN106349340A - 吡啶并吲哚并咪唑酮丁酰-Asp-氨基葡萄糖，其制备，活性和应用

Info

Publication number: CN106349340A
Application number: CN201510409749.6A
Authority: CN
Inventors: 彭师奇; 赵明; 王玉记; 吴建辉; 李泽
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2015-07-13
Filing date: 2015-07-13
Publication date: 2017-01-25

Abstract

本发明公开了下式的[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Asp(OBzl)-氨基葡萄糖，公开了它的制备方法，公开了它的抗肿瘤活性以及抗炎活性，因而本发明公开了它在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用。

Description

吡啶并吲哚并咪唑酮丁酰-Asp-氨基葡萄糖，其制备，活性和应用

技术领域

本发明涉及[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Asp(OBzl)-氨基葡萄糖，涉及它的制备方法，涉及它对荷S180小鼠肿瘤生长的抑制作用，以及涉及它对ICR小鼠炎症的抑制作用。因而本发明涉及它在制备抗肿瘤药物和抗炎药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

技术背景

肿瘤是局部组织的细胞异常增生而形成的新生物。所有的恶性肿瘤总称为癌症。恶性肿瘤严重威胁着人类健康。在临床肿瘤的手术治疗、放疗和化疗中，化疗应用最广泛，发明疗效好和毒副作用低的抗肿瘤新药一直是药物研究的热点。在抗肿瘤新药研究中，发明人曾公开下面结构的化合物(式中AA为氨基酸残基)按1μmol/kg剂量腹腔单次给药，每天一次，连续给药7天具有抗肿瘤作用。发明人并不满意这种疗效。

经过5年研究，发明人发现上面构中的AA-OBzl用侧链羧基OBzl保护的Asp-氨基葡萄糖代替，不仅可以增强抗肿瘤活性，而且可以获得额外的抗炎活性。根据这些研究结果，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供下式代表的[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Asp(OBzl)-氨基葡萄糖。

本发明的第二个内容是提供[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Asp(OBzl)-氨基葡萄糖的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将L-色氨酸在硫酸的催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合得到2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3- 羧酸(1)；

(2)冰浴下向2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸与N，N-二甲基甲酰胺，DMF，的溶液中加入二碳酸二叔丁酯，Boc₂O，N-甲基吗啉催化得到N-Boc-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)；

(3)在二环己基碳二亚胺，DCC，和N-羟基苯并三唑，HOBt，存在下N-Boc-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸在无水THF(四氢呋喃)中与L-Leu-OMe缩合为N-Boc-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Leu-OMe(3)；

(4)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中N-Boc-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Leu-OMe脱去Boc生成2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Leu-OMe(4)；

(5)三乙胺催化下2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Leu-OMe在甲醇和丙酮溶液中避光反应得到2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰甲酯(4)；

(6)在甲醇溶液中2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰甲酯在2N NaOH溶液中水解生成2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酸(5)；

(7)在DCC和HOBt存在下α-氨基Boc保护-侧链OBzl保护的Asp在无水DMF中与氨基葡萄糖缩合为α-氨基Boc保护-侧链OBzl保护的Asp-氨基葡萄糖(6)；

(8)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中α-氨基Boc保护-侧链OBzl保护的Asp-氨基葡萄糖脱去Boc生成侧链OBzl保护的Asp-氨基葡萄糖(7)；

(9)在DCC和HOBt存在下2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酸与侧链OBzl保护的Asp-氨基葡萄糖在无水DMF中缩合为2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰-侧链OBzl保护的Asp-氨基葡萄糖(8)。

本发明的第三个内容是评价[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Asp(OBzl)-氨基葡萄糖抑制S180肿瘤小鼠肿瘤生长的作用。

本发明的第四个内容是评价[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Asp(OBzl)-氨基葡萄糖对ICR小鼠炎症的抑制作用。

附图说明

图1化合物8的合成路线.i)稀硫酸，37％-40％甲醛；ii)(Boc)₂O，DMF，三乙胺；iii)DCC，HOBt，NMM，无水THF；iv)4N氯化氢/乙酸乙酯，甲醇，丙酮，三乙胺；v)THF/CH₃OH，2N NaOH；vi)4N氯化氢-乙酸乙酯溶液。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1)

将2500mL蒸馏水置于2500mL反应瓶中，缓慢加入1.3mL浓硫酸，搅拌2min，再向得到的稀硫酸中加入32.6g(159mmol)L-色氨酸，超声至完全溶解，再加入65mL40％甲醛溶液，室温搅拌7h TLC(CH₂Cl₂∶CH₃OH，5∶1)监测终止反应。向反应液中缓慢滴加浓氨水，调pH至6，静置半小时，过滤，滤饼分别用蒸馏水，丙酮洗涤3次，收集滤饼转移至表面皿中晾干，最后得到31.5g(91％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)215[M-H]-。

实施例2制备N-Boc-(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)

将41.9g(193.9mmol)(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸加到300mL DMF中，冰浴搅拌下向悬浮液中加50.8g(233mmol)(Boc)₂O，然后滴加三乙胺调反应液pH至10，室温反应48h，每8h水泵抽气1次，TLC(CH₂Cl₂∶CH₃OH，5∶1)显示原料点消失，终止反应。减压浓缩，残留物用300mL乙酸乙酯溶解，用5％KHSO₄溶液洗3次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h，过滤，滤液减压浓缩。残留物加入少量CH₂Cl₂超声为悬浮液后过滤，收集滤饼。滤液浓缩后重复上述步骤，直至溶液内无悬浮物终止。收集滤饼得33.94g(55％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)315[M-H]-。

实施例3制备N-Boc-(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-亮氨酸甲酯(3)

冰浴下将31.35g(99.7mmol)N-Boc-(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸溶解于250mL无水THF并加13.39g(99.7mmol)HOBt，然后加24.51g(119.6mmol)DCC与150mL无水THF的溶液，反应30min；再加19.87g(99.7mmol)L-亮氨酸甲酯，用NMM调反应液pH至9，室温反应24h。TLC(石油醚∶丙酮，3∶1)显示原料点消失，终止反应。过滤，滤液减压浓缩。残留物用250mL乙酸乙酯溶解，依次用饱和NaHCO₃溶液洗3次，饱和NaCl溶液洗3次，5％KHSO₄溶液洗3次，饱和NaCl溶液洗3次，5％NaHCO₃溶液洗3次，饱和NaCl溶液洗3次。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h，过滤，滤液减压浓缩得43.42g(99％)标题化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e)444[M+H]+。

实施例4制备[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酸甲酯(4)

冰浴搅拌下向21.0g(48.4mmol)N-Boc-(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-亮氨酸甲酯滴入220mL氯化氢-乙酸乙酯溶液(4N)，冰浴下反应4h TLC(石油醚∶丙酮，3∶ 1)监测原料点消失。抽干溶剂，残留物用110mL CH₃OH溶解，加入110mL丙酮，用三乙胺调反应液pH至9，室温避光反应2周。TLC(石油醚∶丙酮，3∶1)显示原料点消失，终止反应。反应液过滤，滤液减压浓缩有沉淀析出。再过滤，滤液减压浓缩又有沉淀析出。重复此步骤，直至无沉淀析出。收集滤饼。滤液浓缩后用400mL乙酸乙酯溶解，用饱和NaCl溶液洗8次，合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h后过滤，滤液减压浓缩，残留物用少量CH₃OH悬浮，过滤，收集滤饼。滤液重复此步骤，直至无沉淀析出。合并收集的所有滤饼，晾干得11.75g(65％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)384[M+H]+。

实施例5制备[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酸(5)

向10.32g(26.9mmol)[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酸甲酯加入300mL THF和100mL CH₃OH。冰浴搅拌下用4N NaOH调反应液的pH至12。冰浴反应48h TLC(石油醚∶丙酮，3∶1)监测原料点消失，终止反应。冰浴下用饱和KHSO₄溶液将反应液pH调至7。减压浓缩去除THF和CH₃OH后，冰浴下用5％KHSO₄溶液将残留物液的pH调至2，使析出大量无色沉淀。过滤，滤饼用少量蒸馏水洗涤，将滤饼晾干得9.45g(95％)标题化合物，为浅黄色固体。ESI-MS(m/e)368[M-H]-。

实施例6制备Boc-Asp(OBzl)-氨基葡萄糖(6)

冰浴和搅拌下向2.0g(6.19mmol)Boc-Asp(OBzl)与70mL无水DMF的溶液中加836mg(6.19mmol)HOBt及1.53g(7.42mmol)DCC，反应30min，加2.64g(24.7mmol)盐酸氨基葡萄糖，然后用NMM将反应液的pH调至9，室温搅拌24h，TLC(CH₂Cl₂∶CH₃OH∶CH₃CO₂H，15∶1∶1.5)监测原料点消失，终止反应。反应液过滤，滤液减压浓缩，残留物用少量CH₃OH溶解，用MILLEX GP 0.22μm滤膜过滤，滤液用C18反相柱层析进行纯化(CH₃CN∶H₂O，40∶60)，得1.54g(52％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)483[M-H]-。

实施例10制备Asp(OBzl)-氨基葡萄糖(7)

将1.54g(3.16mmol)Boc-Asp(OBzl)酰-氨基葡萄糖于100mL反应瓶中，冰浴搅拌下加入50mL 4N HCl/EtOAc，加上干燥管，反应7h后点TLC板监测原料点消失，有新点产生(CH₂Cl₂∶CH₃OH∶CH₃CO₂H，15∶1∶1.5)，终止反应。水泵减压抽干剩余溶剂，加入少量乙醚后再次抽干，重复2次，得1.2g(90.98％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m /e)385[M+H]+。

实施例11制备[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Asp(OBzl)-氨基葡萄糖(8)

冰浴和搅拌下将200mg(0.54mmol)[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酸用50mL无水DMF溶解。向得到的溶液中加74mg(0.54mmol)HOBt及136mg(0.648mmol)DCC，反应30min，加226mg(0.54mmol)Asp(OBzl)-氨基葡萄糖，然后用NMM将反应液的pH调至9，室温避光反应36h，TLC(CH ₂Cl₂∶CH₃OH∶CH₃CO₂H，15∶1∶1.5)监测原料点消失，终止反应。过滤，滤液减压浓缩，残留物用20mL CH₃OH和20mL蒸馏水的混合溶剂溶解。超声后，用MILLEX GP 0.22μm滤膜过滤，滤液用HPLC纯化，冻干后得34mg(8.5％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)736[M+H]+；Mp 164-165℃；[α]＝3.0(c＝0.06，CH₃OH)；¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ/ppm：10.875(s，1H，H12)，8.046(d，J＝8.1Hz，1H)，7.616(d，J＝8.1Hz，1H)，7.348(m，7H)，7.002(m，2H)，6.476(s，1H)，5.051(s，2H)，4.871(m，4H)，4.539(m，1H)，4.426(m，1H)，3.936(m，1H)，3.566(m，2H)，3.467(m，4H)，3.056(m，2H)，2.869(m，2H)，2.657(m，2H)，1.977(m，2H)，1.554(m，1H)，1.357(s，3H)，1.248(s，3H)，0.91(s，6H)。

实验例1评价化合物8抑制S180小鼠肿瘤生长的活性

测定前将本发明衍生物用生理盐水将样品溶解；将阿霉素溶于生理盐水。无菌条件下取接种于ICR小鼠7-10天的S180肉瘤，加入适量生理盐水配制成瘤细胞悬液，细胞数为1×10⁷个/mL，接种于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2mL。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日腹腔注射0.2mL本发明衍生物的水溶液，连续给药9天，剂量为0.01μmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2mL生理盐水。以阿霉素(剂量为2μmol/kg)作阳性对照。实验进行至第10天，称小鼠体重，并剖取各组小鼠的肿瘤称重，最后统计各组动物的抑瘤率。实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示，计算如下：瘤重抑制率％＝[1-(给药组瘤重/空白组瘤重)]×100％。结果列入表1。数据表明，化合物8治疗小鼠的瘤重明显小于生理盐水治疗小鼠的瘤重。说明化合物8具有好的抗肿瘤活性。与发明背景中提到的已经公开的化合物相比，有效剂量降低了100倍，获得了意想不到的技术效果。

表1 化合物8对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

n＝15；a)与生理盐水比p＜0.05。

实验例2评价化合物8的抗炎活性

20±2g ICR雄性小鼠随机分为空白对照组、阳性用药组及给药组，小鼠使用前静息1天，操作间保持室内温度22℃，每组小鼠10只。一次口服生理盐水(剂量为0.2mL/20g)或阿司匹林的生理盐水溶液(剂量为1.11mmol/kg)或化合物8的生理盐水溶液给(剂量为1μmol/kg)30分钟后，往小白鼠的左耳外廓涂二甲苯(0.045mL)，1小时后将小鼠麻醉，颈椎脱臼处死。将小鼠的左和右耳剪下，用直径7mm的打孔器在两耳的相同位置，取圆形耳片，分别称重，求出两圆耳片的重量差作为肿胀度，以mg表示。本实验数据统计均采用t检验和方差分析。结果见表2。可以看出化合物8治疗组的鼠耳肿胀度与生理盐水组相比具有显著性差异，表明化合物8在发挥体内抗肿瘤作用下，还具有抗炎作用。与发明背景中提到的已经公开的化合物相比，抗炎症活性是意想不到的技术效果。

表2化合物8的抗炎活性评价

n＝10；a)与生理盐水比p＜0.05。

Claims

1.下式的2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰-侧链OBzl保护的Asp-氨基葡萄糖

2.权利要求1的2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰-侧链OBzl保护的Asp-氨基葡萄糖的制备方法，该方法包括：

(1)将L-色氨酸在硫酸的催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合得到2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸；

(2)冰浴下向2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸与N，N-二甲基甲酰胺，DMF，的溶液中加入二碳酸二叔丁酯，Boc₂O，N-甲基吗啉催化得到N-Boc-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸；

(3)在二环己基碳二亚胺，DCC，和N-羟基苯并三唑，HOBt，存在下N-Boc-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸在无水THF(四氢呋喃)中与L-Leu-OMe缩合为N-Boc-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Leu-OMe；

(4)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中N-Boc-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Leu-OMe脱去Boc生成2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Leu-OMe；

(5)三乙胺催化下2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Leu-OMe在甲醇和丙酮溶液中避光反应得到2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰甲酯；

(6)在甲醇溶液中2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰甲酯在2N NaOH溶液中水解生成2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酸；

(7)在DCC和HOBt存在下α-氨基Boc保护-侧链OBzl保护的Asp在无水DMF中与氨基葡萄糖缩合为α-氨基Boc保护-侧链OBzl保护的Asp-氨基葡萄糖；

(8)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中α-氨基Boc保护-侧链OBzl保护的Asp-氨基葡萄糖脱去Boc生成侧链OBzl保护的Asp-氨基葡萄糖；

(9)在DCC和HOBt存在下2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酸与侧链OBzl保护的Asp-氨基葡萄糖在无水DMF中缩合为2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰-侧链OBzl保护的Asp-氨基葡萄糖。

3.权利要求1的2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰-侧链OBzl保护的Asp-氨基葡萄糖在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.权利要求1的2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并吲哚并-2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基-2-甲基丁酰-侧链OBzl保护的Asp-氨基葡萄糖在制备抗炎药物中的应用。