CN109481691A - 吉西他滨-羧甲基多糖共轭物、制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种吉西他滨‑羧甲基多糖共轭物、制备方法及制备抗肿瘤药物中的应用，本发明以羧甲基多糖作为药物载体，将不同的氨基酸连接体通过酯键或酰胺键连接至吉西他滨上，再将带有氨基酸连接体的吉西他滨偶联至羧甲基多糖的羧基上，得到吉西他滨‑羧甲基多糖共轭物，其可以显著增强吉西他滨的抗肿瘤活性，且在生理pH下稳定，在肿瘤部位的酸性微环境下水解缓慢释放吉西他滨，增强吉西他滨在肿瘤部位的富集，从而发挥被动靶向抗肿瘤作用，具有较高的安全性。本发明制备方法简单，产率高,因此在抗肿瘤方面具有广阔的开发前景。

Description

吉西他滨-羧甲基多糖共轭物、制备方法及其用途
【技术领域】
本发明属于医药技术领域，具体是指吉西他滨-羧甲基多糖共轭物、制备方法及其用途。
【背景技术】
恶性肿瘤严重威胁人类的健康和生命安全，临床上虽有多种抗肿瘤药物可供使用，但由于肿瘤病因的复杂性、肿瘤的耐药性及抗肿瘤药物的毒副作用等因素，现有药物仍然不能满足治疗的需要。因此，寻找药效高、靶向性强、毒副作用小的新型抗肿瘤药物具有重要意义。
β-葡聚糖具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗辐射、降血糖等多种生物活性，且在生物体内可降解，对人和动物无毒副作用。羧甲基葡聚糖(carboxymethylated glucan，CMG)是β-葡聚糖的羧甲基化衍生物，通过水溶性的改变，其免疫和抗肿瘤活性都较葡聚糖有较大的提升。研究表明，羧甲基葡聚糖具有激活免疫系统，增加白细胞计数和直接杀伤肿瘤细胞的作用。
吉西他滨(吉西他滨citabine,dFdC,吉西他滨zar)是1996年美国FDA批准的抗代谢类抗肿瘤药物，其化学名为2'-脱氧-2',2'-盐酸二氟胞苷，临床上主要用于非小细胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌及其他实体肿瘤的治疗。吉西他滨虽然抗肿瘤范围广，但其水溶性差、生物利用度低、易产生耐药性等。因此，通过对吉西他滨进行结构修饰与改造，期望获得不仅增加吉西他滨的脂溶性、防止脱氨酶的水解、延长其在体内的半衰期，而且能够提高其生物利用度、降低机体产生的毒副作用。
基于化疗药物对肿瘤细胞缺少选择性，体内半衰期短且可能产生全身毒性的情况，将化疗药物小分子同大分子载体通过连接体进行连接形成共轭物可有效解决或者是改善以上的问题。
现有技术中并没有将吉西他滨和羧甲基多糖制备成共轭物的相关报道。
【发明内容】
本发明提出了一种吉西他滨-羧甲基多糖共轭物、制备方法及制备抗肿瘤药物中的应用。
为了解决上述存在的技术问题，本发明采用下述技术方案：
一种吉西他滨-羧甲基多糖共轭物，其由吉西他滨、氨基酸连接体、羧甲基多糖组成，氨基酸连接体通过酯键或者酰胺键同吉西他滨进行连接，通过酰胺键同羧甲基多糖连接。
在进一步的改进方案中，氨基酸连接体同吉西他滨的C-4位氨基，C-3’和C-5’羟基相连，氨基酸连接体的氨基与羧甲基葡聚糖上的羧基通过酰胺键相连。
在进一步的改进方案中，所述羧甲基多糖选自羧甲基右旋糖酐、羧甲基葡聚糖、羧甲基脱乙酰壳多糖、羧甲基壳多糖、羧甲基黄芪多糖、羧甲基淀粉、羧甲基茯苓多糖和羧甲基纤维素中的其中一种。
在进一步的改进方案中，所述氨基酸连接体为甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(Gly-Gly-Gly)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、γ-氨基丁酸和组氨酸中的一种或多种。
在进一步的改进方案中，所述羧甲基葡聚糖为酵母细胞的细胞壁，其分子量为240～260KDA，取代度为0.5～0.7。
在进一步的改进方案中，所述羧甲基多糖的分子量为150～300KDA，取代度为0.3～0.7。
在进一步的改进方案中，所述吉西他滨-羧甲基多糖共轭物，选自下述的任意一种：
一种吉西他滨-羧甲基多糖共轭物的制备方法，包括有如下步骤：
(1)吉西他滨中不参与反应的羟基和氨基的保护：通过依次加入不同碱性的无机碱对氨基和羟基进行逐步的选择性保护，反应时间为24h～48h，优选时间为48h，反应温度为20～40℃，优选温度为37℃，在反应完成后得到保护反应液，保护反应液经水洗、盐水洗、有机溶剂萃取、无水Na2SO4干燥后，再经硅胶柱色谱纯化，即可得带有保护基的吉西他滨；
(2)氨基酸同吉西他滨缩合：氨基酸与带有保护基的吉西他滨在加入催化剂条件下进行缩合，反应时间为0.5～3h，优选时间为2h，反应温度为20～30℃，优选温度为25℃，反应完成后得到缩合反应液；缩合反应液经水洗、盐水洗、有机溶剂萃取、无水Na2SO4干燥后，再经硅胶柱色谱纯化，即可得带氨基酸连接体的吉西他滨；
(3)吉西他滨保护基的脱去：利用三氟乙酸溶液在冰浴下进行吉西他滨脱保护基反应，三氟乙酸溶液中三氟乙酸的比例为10％～25％，优选比例为18％，反应温度为0～8℃，优选温度为5℃，反应完成后得到脱保护基反应液，脱保护基反应液经减压后除去三氟乙酸和有机溶剂；
(4)共轭物的合成：采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)联合催化吉西他滨-氨基酸的连接物和羧甲基葡聚糖产生共轭反应，反应时间为24～48h，优选时间为24h，反应温度为20～30℃，优选温度为28℃，反应完成后得到共轭反应液；共轭反应液经透析膜纯化后除去小分子化合物，透析膜的截留分子量为100-170KDA,优选截留分子量为140KDA，再经冷冻干燥即得共轭物。
在进一步的改进方案中，步骤(1)中所述的无机碱为碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、强氧化钾中的任意一种；保护基为二碳酸二叔丁酯((Boc)2O)
在进一步的改进方案中，步骤(2)中所述催化剂包括有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，氨基酸连接体同带保护基的吉西他滨以酯键相连接时，还需要少量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)辅助EDC催化，而两者以酰胺键相连时，需要1-羟基苯并三唑(HOBT)辅助催化。
在进一步的改进方案中，步骤(2)中所述的有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、丙酮中的任意一种。
在进一步的改进方案中，步骤(4)中所述的透析膜为再生纤维素膜。
所述的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物可以和药学上可接受的载体制备成药物组合物。
所述的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物可用于非小细胞肺癌治疗中的应用。
所述的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物用作治疗型聚合物前药，可通过静脉注射给药，腹腔注射给药或灌胃给药。
本发明的积极效果在于：
〔1〕本发明以氨基酸/短肽作为连接体，分别通过酰胺键和酯键偶联羧甲基多糖和吉西他滨，得到一种被动靶向型的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物。所述的共轭物的载药量为4％-7％。本发明所制备的共轭物可显著增强吉西他滨的抗肿瘤活性，降低毒副作用，促进吉西他滨在肿瘤部位聚集；
〔2〕本发明制备的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物可在肿瘤部位酸性微环境下水解释放吉西他滨，释药后的药物载体没有潜在的毒性基团。此外，羧甲基多糖能被一降解并通过肾小球滤过后从尿液中排出，不会在体内蓄积，安全性高；
〔3〕本发明提供的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物制备方法便于操作和控制，操作简单，条件温和，最终产物吉西他滨-羧甲基多糖共轭物质量有保障。
以下结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。
【附图说明】
图1为本发明制备5'-吉西他滨-羧甲基多糖共轭物的合成路线；
图2为本发明制备4-吉西他滨-羧甲基多糖共轭物的合成路线；
图3为本发明制备3'-吉西他滨-羧甲基多糖共轭物的合成路线；
图4为羧甲基葡聚糖，吉西他滨及吉西他滨-羧甲基葡聚糖共轭物6a-6d的红外图谱；
图5为(A)吉西他滨、(B)吉西他滨-羧甲基葡聚糖共轭物6a-6d、(C)羧甲基葡聚糖的核磁共振氢谱(400MHZ)。
【具体实施方式】
下面阐述5'-吉西他滨-羧甲基多糖共轭物、4'-吉西他滨-羧甲基多糖共轭物、3'-吉西他滨-羧甲基多糖共轭物的合成路线。
一、5'-吉西他滨-羧甲基多糖共轭物(氨基酸连接体)的合成(合成路线见图1)，具体步骤如下：
1)4位氨基和3'羟基的保护：吉西他滨在碳酸钠的作用下，加入二氧六环和蒸馏水，搅拌溶解后再加入(BOC)2O，得到化合物ML-B-1，化合物ML-B-1再与(BOC)2O，即可得到化合物ML-B-2。
2)化合物ML-B-2同氨基酸/短肽的连接：化合物ML-B-2和氨基酸/短肽在催化剂EDC和DMAP的作用下，以二氯甲烷为溶剂合成化合物ML-B-3-AA。
3)脱Boc反应：ML-B-3-AA在二氯甲烷中，利用反应浓度为12％-15％的三氟乙酸进行Boc的脱除，反应完毕后减压除去溶剂和三氟乙酸即可得化合物ML-B-4-AA。
4)化合物ML-B-4-AA同羧甲基多糖的共轭：使用NHS和EDC对该反应进行催化，反应液经截留分子量为140KDA的透析膜在去离子水中透析纯化处理，75％醇沉后冷冻干燥，所得共轭物GG-B-AA保存在4℃备用。
二、4-吉西他滨-羧甲基多糖共轭物的合成(合成路线见图2)，具体步骤如下：
1)3'和5'羟基的保护：吉西他滨在KOH水溶液作用下的作用下，缓慢滴加BOC酸酐和二氧六环的混合液，得到5'羟基的保护的化合物ML-A-1，化合物ML-A-1再与(BOC)2O和KOH反应，即可得到化合物ML-A-2。
2)化合物ML-A-2同氨基酸/短肽的连接：化合物ML-A-2和氨基酸/短肽在催化剂EDC和HOBT的作用下，以二氯甲烷为溶剂合成化合物ML-A-3-AA。
3)其余步骤参照共轭物GG-B-AA的合成步骤，最终得到共轭物GG-A-AA。
三、3'-吉西他滨-羧甲基多糖共轭物的合成(合成路线见图3)，具体步骤如下：
1)4和5'羟基的保护：吉西他滨在KOH水溶液作用下的作用下，缓慢滴加BOC酸酐和二氧六环的混合液，得到5'羟基的保护的化合物ML-A-1，化合物ML-A-1再与(BOC)2O和KOH反应，即可得到化合物ML-A-2。
2)化合物ML-A-2同氨基酸/短肽的连接：化合物ML-A-2和氨基酸/短肽在催化剂EDC和HOBT的作用下，以二氯甲烷为溶剂合成化合物ML-A-3-AA。
3)其余步骤参照共轭物GG-B-AA的合成步骤，最终得到共轭物GG-A-AA。
下面通过详细具体的制备实施例进行充分说明：
制备实施例1
按照如下步骤制备抗癌药物吉西他滨-Gly-Gly-Gly-羧甲基葡聚糖共轭物，其中羧甲基葡聚糖的分子量约为250KDA，取代度为0.6。
(1)称取吉西他滨60mg，碳酸钠106mg于圆底烧瓶中，加入4mL二氧六环(50mL量筒量取)和1mL蒸馏水(移液枪移取)，置于磁力搅拌起器上搅拌使其溶解(转速使反应液中心产生旋涡即可)，此时加入(Boc)2O 44mg。室温下反应48h，反应毕，得到反应液；而后，反应液加入乙酸乙酯萃取，分液漏斗分层取有机层，有机层用无水MgSO4干燥，过滤取滤液，减压回收试剂得粗品产物，经硅胶柱色谱,用二氯甲烷：甲醇(25:1，40:1，60:1)洗脱，得到化合物ML-B-1(72.5％)；
(2)称取ML-B-1 73mg于50mL圆底烧瓶中，加入8mL二氧六环溶解，置于磁力搅拌器上搅拌，此时加入(Boc)2O 436mg，在37℃下反应70h，反应毕，得到反应液；反应液加入乙酸乙酯萃取，分液漏斗分层取有机层，有机层用无水MgSO4干燥，过滤取滤液，减压回收试剂得粗品产物。经硅胶柱色谱,用二氯甲烷：甲醇(90:1，40:1，15:1)洗脱，得到化合物ML-B-2(65％)。
(3)称取ML-B-2 46mg，EDC 42mg，Gly-Gly-Gly 28.9mg于50mL圆底烧瓶中，加入5mL二氯甲烷置于磁力搅拌器上搅拌溶解，然后再加入DMAP 2mg，室温反应2h；反应毕，反应液加入乙酸乙酯萃取，分液漏斗分层取有机层，有机层用无水MgSO4干燥，过滤取滤液，减压回收试剂得粗品产物。经硅胶柱色谱,用二氯甲烷：甲醇(25:1，40:1，60:1)洗脱，得到化合物ML-B-3-3G(60％)。
(4)称取ML-B-3 10mg于50mL圆底烧瓶中，加入1mL的二氯甲烷，置于磁力搅拌器上搅拌溶解，之后加入三氟乙酸180μL，反应总时间约为15min，反应毕，减压旋蒸除去三氟乙酸可得ML-B-4-3G(98％)。
(5)将羧甲基葡聚糖置于50mL的容量瓶中，加入6mL的纯净水放置于磁力搅拌器上搅拌，(以多糖溶解为标准，可超声)，此时加入EDC和NHS，活化30min，再加入ML-B-4-3G，于28℃下搅拌反应24h。
(6)反应毕，反应液在超纯水中透析48h，期间每8h更换一次透析液，透析完成后加入75％乙醇溶液进行沉淀，冷冻干燥6h后得到吉西他滨-Gly-Gly-Gly-羧甲基葡聚糖共轭物，其中透析袋的截留分子量为140KDA。
制备实施例2
按照如下步骤制备抗癌药物吉西他滨-Ala-羧甲基葡聚糖共轭物
(1)称取吉西他滨60mg，碳酸钠106mg于圆底烧瓶中，加入4mL二氧六环(50mL量筒量取)和1mL蒸馏水(移液枪移取)，置于磁力搅拌起器上搅拌使其溶解(转速使反应液中心产生旋涡即可)，此时加入(Boc)2O 44mg，室温下反应48h。反应毕，反应液加入乙酸乙酯萃取，分液漏斗分层取有机层，有机层用无水MgSO4干燥，过滤取滤液，减压回收试剂得粗品产物。经硅胶柱色谱,用二氯甲烷：甲醇(25:1，40:1，60:1)洗脱，得到化合物ML-B-1(72.5％)。
(2)称取ML-B-1 73mg于50mL圆底烧瓶中，加入8mL二氧六环溶解，置于磁力搅拌器上搅拌，此时加入(Boc)2O 436mg，于37℃下反应70h，反应毕，反应液加入乙酸乙酯萃取，分液漏斗分层取有机层，有机层用无水MgSO4干燥，过滤取滤液，减压回收试剂得粗品产物。经硅胶柱色谱,用二氯甲烷：甲醇(90:1，40:1，15:1)洗脱，得到化合物ML-B-2(65％)。
(3)称取ML-B-2 46mg，EDC 42mg，Ala 19mg于50mL圆底烧瓶中，加入5mL二氯甲烷置于磁力搅拌器上搅拌溶解，然后再加入DMAP2mg，室温反应2h；反应毕，反应液加入乙酸乙酯萃取，分液漏斗分层取有机层，有机层用无水MgSO4干燥，过滤取滤液，减压回收试剂得粗品产物。经硅胶柱色谱,用二氯甲烷：甲醇(25:1，40:1，60:1)洗脱，得到化合物ML-B-3-Ala(62％)。
(4)称取ML-B-3-Ala 10mg于50mL圆底烧瓶中，加入1mL的二氯甲烷，置于磁力搅拌器上搅拌溶解，之后加入三氟乙酸180μL，反应总时间为15min，反应毕，减压旋蒸除去三氟乙酸可得ML-B-4-Ala(99％)。
(5)将羧甲基葡聚糖置于50mL的容量瓶中，加入6mL的纯净水放置于磁力搅拌器上搅拌，(以多糖溶解为标准，可超声)，此时加入EDC和NHS，活化30min。再加入ML-B-4-Ala，于28℃下搅拌反应24h。
(6)反应毕，反应液在超纯水中透析48h，期间每8h更换一次透析液，透析完成后加入75％乙醇溶液进行沉淀，冷冻干燥6h后得到吉西他滨-Ala-羧甲基葡聚糖共轭物，其中透析袋的截留分子量为140KDA。
制备实施例3
按照如下步骤制备抗癌药物吉西他滨-Phe-羧甲基葡聚糖共轭物
(1)称取吉西他滨60mg，碳酸钠106mg于圆底烧瓶中，加入4mL二氧六环(50mL量筒量取)和1mL蒸馏水(移液枪移取)，置于磁力搅拌起器上搅拌使其溶解(转速使反应液中心产生旋涡即可)，此时加入(Boc)2O 44mg。室温下反应48h；反应毕，反应液加入乙酸乙酯萃取，分液漏斗分层取有机层，有机层用无水MgSO4干燥，过滤取滤液，减压回收试剂得粗品产物。经硅胶柱色谱,用二氯甲烷：甲醇(25:1，40:1，60:1)洗脱，得到化合物ML-B-1(72.5％)。
(2)称取ML-B-1 73mg于50mL圆底烧瓶中，加入8mL二氧六环溶解，置于磁力搅拌器上搅拌，此时加入(Boc)2O4 36mg，于37℃下反应70h；反应毕，反应液加入乙酸乙酯萃取，分液漏斗分层取有机层，有机层用无水MgSO4干燥，过滤取滤液，减压回收试剂得粗品产物。经硅胶柱色谱,用二氯甲烷：甲醇(90:1，40:1，15:1)洗脱，得到化合物ML-B-2(65％)。
(3)称取ML-B-2 46mg，EDC 42mg，Phe 26.5mg于50mL圆底烧瓶中，加入5mL二氯甲烷置于磁力搅拌器上搅拌溶解，然后再加入DMAP2mg，室温反应2h；反应毕，反应液加入乙酸乙酯萃取，分液漏斗分层取有机层，有机层用无水MgSO4干燥，过滤取滤液，减压回收试剂得粗品产物。经硅胶柱色谱,用二氯甲烷：甲醇(25:1，40:1，60:1)洗脱，得到化合物ML-B-3-Phe(61％)。
(4)称取ML-B-3-Phe 10mg于50mL圆底烧瓶中，加入1mL的二氯甲烷，置于磁力搅拌器上搅拌溶解，之后加入三氟乙酸180μL，反应总时间为15min，反应毕，减压旋蒸除去三氟乙酸可得ML-B-4-Phe(97％)。
(5)将羧甲基葡聚糖置于50mL的容量瓶中，加入6mL的纯净水放置于磁力搅拌器上搅拌，(以多糖溶解为标准，可超声)，此时加入EDC和NHS，活化30min，再加入ML-B-4-Phe，于28℃下搅拌反应24h。
(6)反应毕，反应液在超纯水中透析48h，期间每8h更换一次透析液，透析完成后加入75％乙醇溶液进行沉淀，冷冻干燥6h后得到吉西他滨-Phe-羧甲基葡聚糖共轭物。其中透析袋的截留分子量为140KDA。
制备实施例4
按照如下步骤制备抗癌药物吉西他滨-Gly-羧甲基葡聚糖共轭物
(1)称取吉西他滨60mg，碳酸钠106mg于圆底烧瓶中，加入4mL二氧六环(50mL量筒量取)和1mL蒸馏水(移液枪移取)，置于磁力搅拌起器上搅拌使其溶解(转速使反应液中心产生旋涡即可)，此时加入(Boc)2O 44mg，室温下反应48h；反应毕，反应液加入乙酸乙酯萃取，分液漏斗分层取有机层，有机层用无水MgSO4干燥，过滤取滤液，减压回收试剂得粗品产物，经硅胶柱色谱,用二氯甲烷：甲醇(25:1，40:1，60:1)洗脱，得到化合物ML-B-1(72.5％)。
(2)称取ML-B-1 73mg于50mL圆底烧瓶中，加入8mL二氧六环溶解，置于磁力搅拌器上搅拌，此时加入(Boc)2O4 36mg，于37℃下反应70h；反应毕，反应液加入乙酸乙酯萃取，分液漏斗分层取有机层，有机层用无水MgSO4干燥，过滤取滤液，减压回收试剂得粗品产物，经硅胶柱色谱,用二氯甲烷：甲醇(90:1，40:1，15:1)洗脱，得到化合物ML-B-2(65％)。
(3)称取ML-B-2 46mg，EDC 42mg，Gly 7.5mg于50mL圆底烧瓶中，加入5mL二氯甲烷置于磁力搅拌器上搅拌溶解，然后再加入DMAP2mg，室温反应2h；反应毕，反应液加入乙酸乙酯萃取，分液漏斗分层取有机层，有机层用无水MgSO4干燥，过滤取滤液，减压回收试剂得粗品产物。经硅胶柱色谱,用二氯甲烷：甲醇(25:1，40:1，60:1)洗脱，得到化合物ML-B-3-Gly(60％)。
(4)称取ML-B-3-Gly 10mg于50mL圆底烧瓶中，加入1mL的二氯甲烷，置于磁力搅拌器上搅拌溶解，之后加入三氟乙酸180μL，反应总时间为15min，反应毕，减压旋蒸除去三氟乙酸可得ML-B-4-Gly(97％)。
(5)将羧甲基葡聚糖置于50mL的容量瓶中，加入6mL的纯净水放置于磁力搅拌器上搅拌，(以多糖溶解为标准，可超声)，此时加入EDC和NHS，活化30min，再加入ML-B-4-Gly，于28℃下搅拌反应24h。
(6)反应毕，反应液在超纯水中透析48h，期间每8h更换一次透析液，透析完成后加入75％乙醇溶液进行沉淀，冷冻干燥6h后得到吉西他滨-Gly-羧甲基葡聚糖共轭物，其中透析袋的截留分子量为140KDA。
吉西他滨-羧甲基葡聚糖共轭物的结构确认
采用红外光谱和核磁共振氢谱确认实施例制备的吉西他滨-羧甲基葡聚糖共轭物的化学结构。
图4和图5为本发明制备实施例1、制备实施例2、制备实施例3、制备实施例4的吉西他滨-羧甲基葡聚糖共轭物的红外光谱图和核磁共振氢谱图。由图可知，羧甲基葡聚糖的红外吸收在3440cm-1,2924cm-1,1631cm-1和1421cm-1处有红外吸收峰，其中3440cm-1和2924cm-1分别是-OH和-CH2的伸缩振动峰，1631cm-1和1421cm-1分别为-COO-的不对称伸缩振动和伸缩振动峰，同羧甲基葡聚糖的红外吸收光谱相比，吉西他滨-羧甲基葡聚糖共轭物在1615cm-1和1500cm-1处显示出了酰胺键的新吸收峰，这表明吉西他滨成功偶联到了羧甲基葡聚糖上。
由图可知,与羧甲基葡聚糖的核磁谱图相比，吉西他滨-羧甲基葡聚糖共轭物在δ7.48-7.72ppm和δ6.00-6.17ppm处出现了吉西他滨的C-5，C-6和C-1＇位的特征氢信号，此外，为排除未偶联成功的吉西他滨对于共轭物的核磁氢谱影响，同时证明透析除去小分子的彻底性，将吉西他滨同羧甲基葡聚糖的物理混合物进行和吉西他滨-羧甲基葡聚糖共轭物同样的处理，然后物理混合物测定的氢谱并未显示出任何有关吉西他滨的氢信号，由此证明吉西他滨已成功连接至羧甲基葡聚糖上且透析可以有效除去小分子。
将质量为W1的吉西他滨-羧甲基葡聚糖共轭物在1M盐酸溶液中于40℃条件下充分水解12h，水解液经RP-UV-HPLC测定共轭物中吉西他滨的质量W2。吉西他滨载药量公式为式Wt(％)＝W2/W1×100％。
实施例 1 2 3 4
载药量(％) 6.63 2.4 4.7 3.33
吉西他滨-羧甲基葡聚糖的药物释放行为：
药物溶液的配制：将上述实施例制备的GG-B-Gly-Gly-Gly(6a)，GG-B-Gly(6b)，GG-B-Phe(6c)，GG-B-Ala(6d)(所含吉西他滨为1mg)溶解在25mL纯水中。
释放液的配制：
(1)释放液Ⅰ：取磷酸二氢钾1.36g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液79ml，用水稀释至200ml，后用氢氧化钠溶液调节pH至7.4；
释放液Ⅱ：取磷酸二氢钾8.34g与磷酸氢二钾0.87g,加水使溶解成1000ml，后用磷酸调节pH至5.5；
将药物溶液装入透析袋中分子量截留,密封,然后将装有药物溶液的透析袋浸没在的释放液中，再置于摇床中震荡,温度为25℃,转速为150rmp，分别在0,2,4,8,12,24,48,72和96h时间点取出释放液,再补充相应新鲜的释放液。每种释放液中的药物释放实验平行做三组。药物释放实验全程在避光的条件下进行，取出的释放液通过HPLC测定药物浓度并计算累积释放量。由实验可知，母药吉西他滨在两种不同pH的释放液中在8h内的累积释放量达到90％，表明其释放量与pH无关。但吉西他滨-羧甲基葡聚糖共轭物在两种释放液中的释放速度却较母药吉西他滨缓慢，且共轭物pH 5.5中的释放速率及释放量要显著高于pH7.4，48h内，共轭物在pH 5.5中的累积释药量为21.3％-52％，但在pH 7.4中为12.5％-18.4％。由此表明，吉西他滨-羧甲基葡聚糖共轭物在pH 5.5条件同母药吉西他滨相比具有缓释作用。
吉西他滨-羧甲基葡聚糖的体外抗肿瘤活性
取对数生长期的肿瘤细胞制成单细胞悬液，以1×104/孔的密度接种于96孔板上，培养终体积为100μL/well，37℃5％CO2的培养箱内培养，24h待细胞贴壁开始加药，结果见下表：
表1吉西他滨-羧甲基葡聚糖共轭物和吉西他滨抗肿瘤活性(IC50，μM，n＝3,mean±SD).
由表可知,共轭物6a-6d对A549和HeLa细胞有显著的抗肿瘤活性，同母药吉西他滨相比，共轭物对Caco-2细胞无效。此外，A549细胞对共轭物6a-6d更加敏感，其中共轭物6c的活性最好，IC50值为0.086±0.012μM。
实验药物的配制
将本发明制备实施例1-4的吉西他滨一羧甲基葡聚糖共轭物分别溶解在水中配制成14.9mg/mL的吉西他滨一羧甲基葡聚糖共轭物水溶液(其中吉西他滨含量为1mg/mL)；将母药吉西他滨溶解在水中配制成的吉西他滨水溶液。
按文献方法，建立小鼠肝癌皮下瘤模型。当小鼠肝癌皮下瘤长到体积为0.09-0.12cm3时，随机将荷有A549肺癌皮下瘤的小鼠(20-26g)分为三个组，吉西他滨-羧甲基葡聚糖共轭物实验组、阿霉素实验组和生理盐水组各5只，将吉西他滨-羧甲基葡聚糖共轭物水溶液和吉西他滨水溶液以4mg/kg(吉西他滨当量)的给药量，100μL的剂量于第0、4、8天分别通过尾静脉注射到相应的实验组，生理盐水组注射100μL的生理盐水，每两天用游标卡尺测量肿瘤的最长处(L)和最宽处(W)，计算肿瘤体积V＝L×W2/2。第十二天将各实验组和生理盐水组的小鼠处死，剥出皮下瘤并称重。吉西他滨-羧甲基葡聚糖实验组、吉西他滨实验组和生理盐水组不同时间点相对肿瘤体积结果见表3。
表3不同时间点实验组和生理盐水组相对肿瘤体积结果
由表可知,与生理盐水组相比，吉西他滨-羧甲基葡聚糖共轭物组和吉西他滨组的相对肿瘤体积显著降低，抑制肿瘤生长作用明显。相比吉西他滨组,吉西他滨-羧甲基葡聚糖共轭物在第四天以后具有更低的相对肿瘤体积。在第十二天,吉西他滨-羧甲基葡聚糖组的抑瘤率为81.0％，高于吉西他滨组的72.4％。
抑瘤率的计算公式为：(生理盐水组相对瘤体积-给药组相对瘤体积)/生理盐水组相对瘤体积×100％。
本发明以羧甲基多糖作为药物载体，将不同的氨基酸连接体通过酯键或酰胺键连接至吉西他滨上，再将带有氨基酸连接体的吉西他滨偶联至羧甲基多糖的羧基上，得到吉西他滨-羧甲基多糖共轭物。该吉西他滨-羧甲基多糖共轭物其可以显著增强吉西他滨的抗肿瘤活性，且在生理pH下稳定，在肿瘤部位的酸性微环境下水解缓慢释放吉西他滨，增强吉西他滨在肿瘤部位的富集，从而发挥被动靶向抗肿瘤作用。此外多糖本身也具有良好的免疫增强作用,可以减轻肿瘤化疗过程中产生的毒副作用，释放吉西他滨后的药物载体没有潜在的毒性基团并可经代谢排出，具有较高的安全性。本发明制备方法简单，产率高,因此在抗肿瘤方面具有广阔的开发前景。
尽管参照上面实施例详细说明了本发明，但是通过本公开对于本领域技术人员显而易见的是，而在不脱离所述的权利要求限定的本发明的原理及精神范围的情况下，可对本发明做出各种变化或修改。因此，本公开实施例的详细描述仅用来解释，而不是用来限制本发明，而是由权利要求的内容限定保护的范围。凡与本申请方案雷同、近似或以此为基础作出的技术推演、替换、改进等，均应视为本专利的保护范围。

Claims (15)

1.一种吉西他滨-羧甲基多糖共轭物，其特征在于，其由吉西他滨、氨基酸连接体、羧甲基多糖组成，氨基酸连接体通过酯键或者酰胺键同吉西他滨进行连接，通过酰胺键同羧甲基多糖连接。
2.根据权利要求1所述的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物，其特征在于，氨基酸连接体同吉西他滨的C-4位氨基，C-3’和C-5’羟基相连，氨基酸连接体的氨基与羧甲基葡聚糖上的羧基通过酰胺键相连。
3.根据权利要求1或2所述的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物，其特征在于，所述羧甲基多糖选自羧甲基右旋糖酐、羧甲基葡聚糖、羧甲基脱乙酰壳多糖、羧甲基壳多糖、羧甲基黄芪多糖、羧甲基淀粉、羧甲基茯苓多糖和羧甲基纤维素中的其中一种。
4.根据权利要求1或2所述的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物，其特征在于，所述氨基酸连接体为甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、γ-氨基丁酸和组氨酸中的一种或多种。
5.根据权利要求1或2所述的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物，其特征在于，所述羧甲基多糖的分子量为150～300KDA，取代度为0.3～0.7。
6.根据权利要求1或2所述的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物，其特征在于，所述羧甲基葡聚糖为酵母细胞的细胞壁，其分子量为240～260KDA，取代度为0.5～0.7。
7.根据权利要求1或2所述的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物，其特征在于，选自下述的任意一种：
8.一种吉西他滨-羧甲基多糖共轭物的制备方法，其特征在于，包括有如下步骤：
(1)吉西他滨中不参与反应的羟基和氨基的保护：通过依次加入不同碱性的无机碱对氨基和羟基进行逐步的选择性保护，反应时间为24h～48h，反应温度为20～40℃，在反应完成后得到保护反应液，保护反应液经水洗、盐水洗、有机溶剂萃取、无水Na2SO4干燥后，再经硅胶柱色谱纯化，即可得带有保护基的吉西他滨；
(2)氨基酸同吉西他滨缩合：氨基酸与带有保护基的吉西他滨在加入催化剂条件下进行缩合，反应时间为0.5～3h，反应温度为20～30℃，反应完成后得到缩合反应液；缩合反应液经水洗、盐水洗、有机溶剂萃取、无水Na2SO4干燥后，再经硅胶柱色谱纯化，即可得带氨基酸连接体的吉西他滨；
(3)吉西他滨保护基的脱去：利用三氟乙酸溶液在冰浴下进行吉西他滨脱保护基反应，三氟乙酸溶液中三氟乙酸的比例为10％～25％，反应温度为0～8℃，反应完成后得到脱保护基反应液，脱保护基反应液经减压后除去三氟乙酸和有机溶剂；
(4)共轭物的合成：采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)联合催化吉西他滨-氨基酸的连接物和羧甲基葡聚糖产生共轭反应，反应时间为24～48h，反应温度为20～30℃，反应完成后得到共轭反应液；共轭反应液经透析膜纯化后除去小分子化合物，透析膜的截留分子量为100-170KDA,再经冷冻干燥即得共轭物。
9.根据权利要求8所述的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的无机碱为碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、强氧化钾中的任意一种。
10.根据权利要求8所述的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述催化剂包括有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三唑(HOBT)。
11.根据权利要求8所述的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、丙酮中的任意一种。
12.根据权利要求8所述的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的透析膜为再生纤维素膜。
13.根据权利要求1至7任意一项所述的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物，其特征在于，其可以和药学上可接受的载体制备成药物组合物。
14.根据权利要求1至7任意一项所述的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物，其特征在于，其可用于非小细胞肺癌治疗中的应用。
15.根据权利要求1至7任意一项所述的吉西他滨-羧甲基多糖共轭物，其特征在于，其用作治疗型聚合物前药，可通过静脉注射给药，腹腔注射给药或灌胃给药。
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