CN103936945A - 一类新型高效抗肿瘤靶向药物载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类高效抗肿瘤靶向药物载体及其制备方法。该载体是由链段A和B组成的二嵌段共聚物，其中，链段A为PEG，链段B为下述三种单体形成的无规共聚物：HPMA、MAGG和BHMAGG。采用可逆加成断裂转移聚合方法，得到共聚组分及分子量可控、分子量分布窄(分子量分布PDI＜1.4)的共聚物。通过对聚合物中MAGG和BHMAGG的侧链官能团进行修饰，得到了一种具有明显靶向性和控制药物释放功能的水溶性高分子载药体系。此类高分子载药体系可以应用于抗肿瘤药物的高效运输，不仅具有高的靶向性和良好的生物相容性，还具有载药量可调和药物释放具有pH响应性的优点，是一种性能优良的抗肿瘤靶向药物载体。
Description
技术领域
本发明涉及一类新型高效抗肿瘤靶向药物载体及其制备方法。
背景技术
肿瘤一直是威胁人类健康的重大疾病，目前对于肿瘤的治疗，主要有手术、化疗和放疗三类主要方法，但是各种治疗手段依然存在治愈率低、复发和死亡率高等问题。目前，临床常用一些化疗药物对肿瘤进行治疗，如阿霉素(Doxorubicin)、表阿霉素(Epirubicin)、柔红霉素(Daunorubicin)、卡铂(Carboplatin)、氮芥(Chlormethine)以及紫杉醇(Paclitaxel)等这些药物在肿瘤的治疗中已经显示出显著的疗效，但是还存在很多问题，主要是由于药物本身缺乏靶向性，很难有效的到达病灶部位。同时这些药物在杀死肿瘤细胞的同时，也会非选择性地杀死正常组织细胞，因而存在治疗效率低下和毒副作用严重等问题，严重影响癌症的治疗效果。随着高分子科学和纳米技术的发展，高分子逐渐被应用在抗肿瘤药物的输送材料。目前常用的药物载体主要有水溶性高分子、纳米尺寸的胶束和囊泡等，这些高分子载药体系由于具有数十到数百的纳米尺寸，因而具有一种被动靶向性，即由于其纳米尺寸而导致其在肿瘤组织部位具有增强的渗透与停留效应(即EPR效应)[H.Maeda，Y. Matsumura，Tumoritropic andLymphotropic Principles of Macromolecular Drugs，Crit Rev Ther Drug，6(1989)193-210.]。
水溶性高分子聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PHPMA)作为靶向药物载体具有明显的优缺点：它是一种水溶性聚合物；具有很好的生物相容性，不会与人体发生免疫反应；大分子量的PHPMA具有EPR效应，有利于其在肿瘤部位的聚集。但是PHPMA载体也有明显的不足：它功能单一，不具有防止蛋白非特异性吸附的功能，导致药物在血液循环过程中会在非病灶部位吸附和富积，造成药物载体在体内的循环时间不足，影响药物的治疗效果；此外，由于目前PHPMA载体的制备普遍采用普通自由基聚合，分子量不可控，分子量分布很宽，严重影响载体的EPR效应以及药物从载体上的释放，从而进一步影响到药物的治疗效果。聚乙二醇(PEG)具有良好的生物相容性和抗蛋白非特异性吸附的功能，在药物载体的制备中得到广泛应用。最重要的一点是两种聚合物都是临床可用于人体内的高分子材料，因而，合成PEG与PHPMA的共聚物，能够发挥两种聚合物的优点，具有主要的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一类新型高效抗肿瘤靶向聚合物药物载体及其制备方法。通过这种方法制备的聚合物载体组成可调、分子量可控，分子量分布窄(PDI＜1.4)，并且具有防止蛋白非特异性吸附、以及载药量和靶向分子含量可调的功能。
本发明所提供的聚合物载体，是由链段A和链段B组成的二嵌段共聚物，其中，所述链段A为聚乙二醇(PEG)链段，所述链段B为下述三种单体聚合形成的无规共聚物链段：N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸(MAGG)和N-甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酰-N`-叔丁氧羰基肼(BHMAGG)。该聚合物简称为PEG-b-P(HPMA-co-MAGG-co-BHMAGG)，其结构式如式I所示：
式I中，R表示不易水解的基团，具体可选自下述基团中的任意一种：甲基、乙基和叔丁基，优选甲基；Z表示一种一端以酯基或酰胺基与右侧PEG链段相连，另一端与左侧P(HPMA-co-MAGG-BHMAGG)相连的基团；具体选自下述任意一种基团：-C(CN)(CH3)-CH2CH2-CO-，-CH2CH2-CO-，-C(CH3)(CH3)-CO-，优选为-C(CN)(CH3)-CH2CH2-CO-，Z链段为链转移试剂与PEO连接的部分，聚合之后，二硫代酯或者三硫代酯转移到聚合物链末端上，此部分仍与PEO相连；Y代表一种具有可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合活性的基团，该基团可以是含有一个或一个以上二硫代酯基(Dithioester)的基团、三硫代碳酸盐(Trithiocarbonate)、磺酸盐(Xanthate)或二硫代氨基甲酸盐(Dithiocarbamate)的各种基团，优选含有一个或一个以上二硫代酯基的基团，其由链转移试剂带入聚合物链中；R`代表羟基。
本发明所提供的嵌段共聚物的数均分子量可以在2,000至100,000的范围内精确调控，其中，PEG链段的分子量为1,000～15,000，由PHPMA及PMAGG和PBHMAGG无规共聚物构成的另一个嵌段的分子量在1,000～99,000之间。P(HPMA-co-MAGG-BHMAGG)链段中HPMA的摩尔含量(为40～100％，但不包括100％；MAGG在该嵌段中含量为0～20％，但不包括0％；BHMAGG含量为0～40％，但不包括0％。
数均分子量以DMF为流动相采用凝胶渗透色谱(GPC)测量，或者通过1H核磁共振光谱(1HNMR)测量结果来计算。
上述嵌段共聚物可作为抗肿瘤药物靶向药物载体应用。
由于式I所示聚合物中PMAGG重复单元的侧链含有羧基基团，通过这些羧基基团可以同时键合不同的功能分子，如具有靶向功能的环状RGD和叶酸，具有标记核素功能的酪氨酸等。羧酸基团也可以进一步转化为氨基，使聚合物带有不同的电荷。聚合物中的PBHMAGG重复单元的侧链含有叔丁氧羰基(Boc)保护的肼键，脱保护之后形成的酸敏感的腙键能与含有醛或酮的抗肿瘤药物，如阿霉素(Doxorubicin)、表阿霉素(Epirubicin)和柔红霉素(Daunorubicin)等反应，从而实现药物的负载，更重要的是所负载的药物能在肿瘤内部偏酸性环境下(pH＝5～6)实现快速释放以提高疗效，同时在正常生理环境下药物释放缓慢从而有效减小毒副作用。此外，肼键还能作为氨基与含有羧基的化合物反应，例如1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)等。
在聚合物主链上含有不同含量的MAGG重复结构单元，通过调节MAGG的含量可以调节所连靶向分子的数目。在聚合物主链上含有不同含量的BHMAGG重复结构单元，脱去Boc保护之后得到N-甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酰肼(HMAGG)通过调节BHMAGG的含量可以调节键合药物的含量。
本发明提供的聚合物载体的制备方法，包括下述步骤：
1)在N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的催化作用下，使端羟基或端氨基的PEG与含羧基的可逆加成断裂链转移试剂进行反应，得到PEG大分子链转移剂；
2)在无氧条件下，以4，4’-偶氮二(4-腈基戊酸)(V501)为引发剂，使PEG大分子链转移剂与下述三种单体进行聚合反应，得到所述聚合物；所述单体为HPMA、MAGG和BHMAGG。
其中，步骤1)中所述端羟基或端氨基的PEG为一末端基团为羟基或氨基、另一末端基团为不易水解的基团的PEG；所述不易水解的基团具体选自下述基团中的任意一种：甲基、乙基和叔丁基；所述端羟基或端氨基的PEG的数均分子量为1000～10000；所述含羧基的可逆加成断裂链转移试剂为至少含一个羧基和一个二硫代苯甲酸酯基的化合物，优选4-二硫代苯甲酸酯基-4-腈基戊酸(CPAD)及其衍生物；
步骤1)中所述反应的反应温度为室温，反应时间为48-96小时；所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为甲苯、二氯甲烷或三氯甲烷；所述端羟基或端氨基的PEG与含羧基的可逆加成断裂链转移试剂的摩尔比为1∶(3-10)。
步骤2)中所述聚合反应的反应介质为二甲基亚砜或甲醇。
步骤2)中所述聚合反应的反应温度为50-70℃，反应时间为24-72小时。
通过调节反应时间、单体与链转移剂的摩尔比以及各组分的相对摩尔比，可以得到不同嵌段长度、组成含量的两嵌段共聚物，共聚物具有分子量可控以及分子量分布窄的特点。反应完成后迅速放入液氮中终止反应，丙酮中沉淀除去其中未反应的小分子，最后蒸干溶剂得到所需的产物。
用上述方法制备的两嵌段共聚物的组分可以通过改变各组分在加料时的摩尔比来精确调控，共聚物的摩尔组成可以通过1H核磁共振波谱(1HNMR)来定量确定。
本发明的另一个目的是提供一种肿瘤靶向性高分子载体。
该肿瘤靶向性高分子载体是由式I所示嵌段共聚物中MAGG侧链羧基与含氨基或羟基的靶向功能分子反应形成酯键或者酰胺键得到的。所述靶向功能分子具体可为氨基修饰的叶酸、环状RGD或抗体。
当靶向功能分子为氨基修饰的叶酸时，其与式I所示嵌段共聚物在无水DMSO中，以EDC和NHS作为催化剂，37℃反应48h，之后用体积排出色谱分离，即得到含叶酸的肿瘤靶向性高分子载体。其中，所述氨基修饰的叶酸是由叶酸与乙二醇双2-氨基乙基醚在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺催化下于二甲基亚砜中合成的。
本发明的再一个目的是提供一种抗肿瘤靶向性载药体系。
所述抗肿瘤靶向性载药体系的结构式如式II所示：
式II中，R`表示一种通过酯键或者酰胺键与MAGG的侧链羧基相连的靶向功能分子；R``为任一含有醛或酮结构的抗肿瘤药物；所述靶向功能分子具体为氨基修饰的叶酸、环状RGD或抗体；所示抗肿瘤药物具体为阿霉素、表阿霉素或柔红霉素；
式II中，R表示不易水解的基团；Z表示一种一端以酯基或酰胺基与右侧PEG链段相连，另一端与左侧P(HPMA-co-MAGG-BHMAGG)相连的基团；Y代表一种具有可逆加成-断裂链转移聚合活性的基团；R′代表羟基；
所述R具体选自下述基团中的任意一种：甲基、乙基和叔丁基，优选甲基；所述Z具体选自下述任意一种基团：-C(CN)(CH3)-CH2CH2-CO-，-CH2CH2-CO-，-C(CH3)(CH3)-CO-，优选为-C(CN)(CH3)-CH2CH2-CO-；所述Y具体选自下述基团中的任意一种：含有至少一个二硫代酯基的基团、三硫代碳酸盐、磺酸盐和二硫代氨基甲酸盐，优选为二硫代酯。
上述抗肿瘤靶向性载药聚合物的制备方法，包括下述步骤：将所述肿瘤靶向性高分子载体中BHMAGG结构单元上的肼键脱去叔丁氧羰基脱保护后，通过肼键与含醛或酮的抗肿瘤药物反应，得到所述抗肿瘤靶向性载药体系。
其中，所述肼键脱去叔丁氧羰基的方法为与三氟乙酸进行反应，反应时间10-60分钟；所述肼键与含醛或酮的抗肿瘤药物反应的反应介质为DMSO，所采的催化剂为冰乙酸，反应时间为24-72小时。
通过上述步骤得到含有靶向分子叶酸和抗肿瘤药物阿霉素的靶向载药聚合物，在体外与人类膀胱癌细胞(T24)共培养，研究该体系对膀胱肿瘤细胞的靶向性以及杀灭能力。
本发明采用可逆加成断裂转移(RAFT)聚合方法，得到了共聚组分及分子量可控、分子量分布窄(分子量分布PDI＜1.4)的共聚物，其通式为：PEG-b-P(HPMA-co-MAGG-co-BHMAGG)。通过对聚合物中MAGG和BHMAGG的侧链官能团进行修饰，得到了一种具有明显靶向性和控制药物释放功能的水溶性高分子载药体系。此类高分子载药体系可以应用于抗肿瘤药物的高效运输，不仅具有高的靶向性和良好的生物相容性，还具有载药量可调和药物释放具有pH响应性的优点，是一种性能优良的抗肿瘤靶向药物载体。
根据将来的应用要求，用上述方法制备的共聚物既可以携带化疗药物作为治疗肿瘤化疗药物载体，也可以结合放射性核素作为放疗药物载体。所制备的共聚物载体通过结合多肽、抗体等具有靶向作用的生物活性分子，或者依赖共聚物的分子尺寸效应，来实现抗肿瘤药物的高效输送和靶向释放。
附图说明
图1是通过本发明方法合成的PEG-b-P(HPMA-co-MAGG-co-BHMAGG)两嵌段共聚物以及结合靶向分子叶酸和药物分子阿霉素PEG-b-P(HPMA-co-MAGG(Folate)-co-HMAGG(Dox))载药体系的化学结构式。
图2是通过本发明方法制备的靶向载药体系的GPC曲线。
图3是通过本发明方法制备的靶向高分子载药体系的1HNMR谱图。
图4是通过本发明方法制备的PEG-b-P(HPMA-co-MAGG(Folate)-co-HMAGG(Dox))载药体系的体外药物释放曲线。
图5是通过本发明方法制备的PEG-b-P(HPMA-co-MAGG(Folate)-co-HMAGG(Dox))载药体系对T24细胞靶向作用的共聚焦表征结果；其中，a1为PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k(Folate)-co-BHMAGG8k)培养4小时；a2为PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k-co-BHMAGG8k)培养4小时；b1为PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k(Folate)-co-HMAGG8k(Dox))培养24小时；b2为PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k-co-HMAGG8k(Dox))培养24小时。
图6是通过本发明方法制备的PEG-b-P(HPMA-co-MAGG(Folate)-co-HMAGG(Dox))载药体系被T24细胞内吞的流式细胞术实验结果。
图7是通过本发明方法制备的PEG-b-P(HPMA-co-MAGG(Folate)-co-HMAGG(Dox))载药体系对T24细胞的毒性实验结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所使用的MAGG、N-叔丁氧酰肼及BHMAGG按照如下方法制备得到：
将6.6g甘氨酸二肽和4.0g氢氧化钠溶于50ml二次水中，在冰水浴下缓慢滴加5.56ml甲基丙烯酰氯，待滴加完毕后在室温反应24小时。反应完毕后用盐酸调节pH＝2，过滤收集白色沉淀，在水/乙醇(50/50，v/v)的混合溶液中重结晶，所得产物为MAGG。
将32.5g80％水合肼溶于100ml异丙醇中，冰浴下滴加50g二碳酸二叔丁酯的50ml异丙醇溶液，滴加完毕后在室温下继续反应2小时。待反应完毕后旋蒸除去溶剂，残留物溶于二氯甲烷并用无水硫酸镁干燥。旋蒸除去二氯甲烷后产物在正己烷中重结晶。所得产物为N-叔丁氧酰肼。
将4g MAGG和3.168g N-叔丁氧酰肼溶于30ml无水DMF中，加入4.944g DCC和2.76g NHS，冰浴下反应30分钟后升至室温，继续反应24小时。过滤除去副产物环己基脲(DCU)，滤液浓缩后在乙醚中沉淀3次，沉淀真空干燥即得产物BHMAGG。
实施例1、制备PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k-co-BHMAGG8k)
将2.4g数均分子量为5000的单端羟基或氨基PEG溶于40mL干燥甲苯，加入0.68gCPAD和0.041g DMAP，待完全溶解后加入0.74g DCC，室温下搅拌反应96小时。抽滤，将滤液倾入过量乙醚中，再抽滤，所得沉淀溶于少量甲苯，再用乙醚沉淀，如此重复三次。将沉淀物在40℃真空干燥24小时，所得产物为PEG的大分子链转移剂。
取52mg大分子链转移剂、312.5mg HPMA、52mg MAGG、83mg BHMAGG、1mg4，4’-偶氮二(4-腈基戊酸)、5mL DMSO于史莱克管内，在冷冻下抽真空，然后恢复至室温，充入氩气，将此冷冻-溶化-充氩气过程重复三次，最后在氩气保护下将反应管置于70℃油浴中反应。终止反应时将反应管迅速放入液氮中，然后在乙醚中沉淀除去其中的小分子，最后真空干燥得到产物。该产物的分子量和组成分别通过GPC和1HNMR来确认。
调控反应时间以及HPMA、MAGG和BHMAGG与PEG的摩尔比可以得到分子量和嵌段长度不同的两嵌段共聚物产物。按照上述HPMA、MAGG和BHMAGG与PEG的投料比，反应48小时，所得到的嵌段共聚物的数均分子量为45,000，分子量分布为1.08，结果如图2所示、图3所示。
实施例2、制备PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k(Folate)-co-BHMAGG8k)
Folate-NH2的制备：将4.41g叶酸与10倍过量的乙二醇双2-氨基乙基醚以无水DMSO为溶剂，在与叶酸等当量的EDC和NHS催化下于35℃反应48小时。反应完毕后将反应液倾入水中沉淀。收集滤液冷冻干燥，产物通过半制备型液相色谱(岛津LC-6AD，日本)进行纯化处理。
PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k(Folate)-co-BHMAGG8k)的制备：将实施例1制备的PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k-co-BHMAGG8k)与Folate-NH2以无水DMSO为溶剂，在EDC和NHS催化下反应制得。
具体步骤为：取0.5g PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k-co-BHMAGG8k)溶于20ml无水DMSO中，加入0.3g EDC和0.15g NHS，35℃下活化24小时。24小时后加入0.4g Folate-NH2和0.5ml三乙胺，继续反应48小时。反应完毕后产物通过凝胶色谱柱(HW-40F，TOSOH，日本)纯化处理。所得最终产物的分子量和组成通过水相GPC和1HNMR来共同确认，结果如图2和图3所示。所得到的嵌段共聚物的数均分子量为58,000，分子量分布为1.18。
实施例3、PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k(Folate)-co-HMAGG8k(Dox))的制备
将100mg实施例2制备的PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k(Folate)-co-BHMAGG8k)首先在15ml纯三氟乙酸中脱去Boc保护，反应时间为30分钟，反应完毕后旋蒸除去三氟乙酸即得到PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k(Folate)-co-HMAGG5.4k)。将该产物溶于20ml无水DMSO中，加入100mg的Dox和0.2ml的冰醋酸，37℃下反应48小时。反应完毕后，将所得反应液用凝胶色谱柱纯化，表征结果如图2和图3所示。
实施例4、PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k(Folate)-co-HMAGG5.4k(Dox))的体外药物释放实验
取15mg PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k(Folate)-co-HMAGG5.4k(Dox))溶于5ml纯水后封装于截留分子量为14kDa的透析袋中，分别在10ml、pH＝5，6.5和7.4的PBS缓冲液中进行药物释放。按预先设计的不同时间点(1h、2h、4h、6h、8h、20h、24h、32h、48h、72h、96h、120h)取出5ml释放液通过紫外光谱仪(UV-2450，岛津，日本)测定吸光度值，根据标准曲线计算对应的药物含量，与此同时补加5ml新鲜的缓冲液。每个样品重复3次释放实验，计算结果取3次的平均值，结果如图4所示。由图4可知，该载药聚合物体系在弱酸性条件(pH＝5-6，模拟肿瘤组织内部环境)下能够迅速释放药物，但是在中性条件(pH＝7.4，模拟血液中环境)下基本不会发生药物的释放。这种特点使得该聚合物体系能够适应血液循化并能在肿瘤部位将所负载的药物释放，从而能够减小药物毒副作用，提高对肿瘤细胞的杀灭能力。
实施例5、PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k(Folate)-co-HMAGG5.4k(Dox))细胞内吞和靶向性实验
选用人膀胱肿瘤细胞T24细胞进行体外实验，细胞培养在F-12培养基中(添加10％胎牛血清和1％的青霉素、链霉素)于37℃和5％CO2孵箱中孵育。实验时，取生长状态良好的细胞以1×105个/孔的密度种于24孔板或者35毫米玻璃底培养皿中。待细胞铺展至70％时，吸弃旧培养基，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗三遍后，加入新鲜的培养基，同时分别加入2mg/ml的未经修饰的PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k-co-BHMAGG8k)或靶向分子修饰的PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k(Folate)-co-BHMAGG8k)以及PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k(Folate)-co-HMAGG5.4k(Dox))继续培养。细胞培养一定时间后，吸弃胶束溶液与旧的培养基，PBS冲洗三遍以去除细胞外的胶束。加入70％的甘油封片。利用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察胶束对T24细胞的靶向吸附以及进入细胞的过程。所得结果见图5及图6(图中P-F0、P-F3、P-F7、P-F10分别代表叶酸在嵌段(P(HPMA30k-co-MAGG5k(Folate)-co-BHMAGG8k))中摩尔含量分别为0％、3％、7％和10％的聚合物药物载体)。由图5可知，靶向分子叶酸对T24细胞具有明显的靶向作用，能够大大提高聚合物进入肿瘤细胞的量。由图6可知，随着叶酸含量的增加，其介导聚合物进入细胞内部的能力增强，靶向能力增加。
实施例7、PEG5k-b-P(HPMA30k-co-MAGG5k(Folate)-co-HMAGG5.4k(Dox))细胞毒性实验
取生长状态良好的人膀胱肿瘤细胞(T24细胞)以5×103个/孔的密度种于96孔板中。待细胞铺展至70％时，吸弃旧培养基，加入新鲜的培养基，同时分别加入一定量的带有靶向分子或不带靶向分子的聚合物载药体系继续培养。24，48以及72小时后，每孔加入20ul浓度为5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液，作用0.5-4小时后，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，结果如图7所示(图中P-F0、P-F3、P-F7、P-F10分别代表叶酸在嵌段(P(HPMA30k-co-MAGG5k(Folate)-co-BHMAGG8k))中摩尔含量分别为0％、3％、7％和10％的聚合物药物载体；P-F-H代表脱去Boc保护但是未连接Dox的靶向药物载体；P-F0-D为不具备靶向作用的载药聚合物；P-F10-D为具备靶向作用载药聚合物。)。由图7可知，在未键合化疗药物Dox前，靶向聚合物本身不具有细胞毒性；在键和Dox之后，细胞毒性大大提高，甚至超过游离的阿霉素。但是不具备靶向的载药聚合物的细胞毒性却远低于游离的阿霉素，而具备靶向作用的载药聚合物的细胞毒性在第一天后却明显高于游离的阿霉素，说明靶向分子叶酸在载药聚合物的内吞过程中起着至关重要的作用。上述结果表明所合成的靶向载药聚合物能够高效地杀灭肿瘤细胞，在临床上具备很好的应用前景。
Claims (11)
1.一种嵌段共聚物，是由链段A和链段B组成的二嵌段共聚物，其中，所述链段A为PEG链段，所述链段B为下述三种单体聚合形成的无规共聚物链段：HPMA、MAGG和BHMAGG；所述PEG代表聚乙二醇，所述HPMA代表N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺，所述MAGG代表甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸，所述BHMAGG代表N-甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酰-N`-叔丁氧羰基肼。
2.根据权利要求1所述的嵌段共聚物，其特征在于：所述嵌段共聚物的结构式如式I所示：
式I中，R表示不易水解的基团；Z表示一种一端以酯基或酰胺基与右侧PEG链段相连，另一端与左侧P(HPMA-co-MAGG-BHMAGG)相连的基团；Y代表一种具有可逆加成-断裂链转移聚合活性的基团；R′代表羟基；
所述R具体选自下述基团中的任意一种：甲基、乙基和叔丁基，优选甲基；所述Z具体选自下述任意一种基团：-C(CN)(CH3)-CH2CH2-CO-，-CH2CH2-CO-，-C(CH3)(CH3)-CO-，优选为-C(CN)(CH3)-CH2CH2-CO-；所述Y具体选自下述基团中的任意一种：含有至少一个二硫代酯基的基团、三硫代碳酸盐、磺酸盐和二硫代氨基甲酸盐，优选为二硫代酯。
3.根据权利要求1或2所述的嵌段共聚物，其特征在于：所述嵌段共聚物的数均分子量为2,000～100,000，分子量分布指数PDI＜1.4，其中，PEG链段的分子量为1,000～15,000，P(HPMA-co-MAGG-BHMAGG)链段的分子量为1,000～99,000；
所述P(HPMA-co-MAGG-BHMAGG)链段中HPMA的摩尔含量为40～100％，但不包括100％；MAGG在该嵌段中含量为0～20％，但不包括0％；BHMAGG含量为0～40％，但不包括0％。
4.一种肿瘤靶向性高分子载体，其为权利要求2或3所述的式I所示嵌段共聚物中的R`为通过酯键或者酰胺键与MAGG的侧链羧基相连的靶向功能分子；所述靶向功能分子具体为氨基修饰的叶酸、环状RGD或抗体。
5.一种抗肿瘤靶向性载药聚合物，其结构式如式II所示：
式II中，R`表示一种通过酯键或者酰胺键与MAGG的侧链羧基相连的靶向功能分子；R``为任一含有醛或酮结构的抗肿瘤药物；所述靶向功能分子具体为氨基修饰的叶酸、环状RGD或抗体；所示抗肿瘤药物具体为阿霉素、表阿霉素或柔红霉素；所述MAGG代表甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸；
式II中，R表示不易水解的基团；Z表示一种一端以酯基或酰胺基与右侧PEG链段相连，另一端与左侧P(HPMA-co-MAGG-BHMAGG)相连的基团；Y代表一种具有可逆加成-断裂链转移聚合活性的基团；R′代表羟基；
所述R具体选自下述基团中的任意一种：甲基、乙基和叔丁基，优选甲基；所述Z具体选自下述任意一种基团：-C(CN)(CH3)-CH2CH2-CO-，-CH2CH2-CO-，-C(CH3)(CH3)-CO-，优选为-C(CN)(CH3)-CH2CH2-CO-；所述Y具体选自下述基团中的任意一种：含有至少一个二硫代酯基的基团、三硫代碳酸盐、磺酸盐和二硫代氨基甲酸盐，优选为二硫代酯。
6.制备权利要求1-3中任一项所述嵌段共聚物的方法，包括下述步骤：
1)在N，N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的催化作用下，使端羟基或端氨基的PEG与含羧基的可逆加成断裂链转移试剂进行反应，得到PEG大分子链转移剂；
2)在无氧条件下，以4，4’-偶氮二(4-腈基戊酸)为引发剂，使PEG大分子链转移剂与单体进行聚合反应，得到所述聚合物；所述三种单体为HPMA、MAGG和BHMAGG；所述HPMA代表N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺，所述MAGG代表甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸，所述BHMAGG代表N-甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酰-N`-叔丁氧羰基肼。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述端羟基或端氨基的PEG为一末端基团为羟基或氨基、另一末端基团为不易水解的基团的PEG；所述不易水解的基团具体选自下述基团中的任意一种：甲基、乙基和叔丁基；
所述端羟基或端氨基的PEG的数均分子量为1000～10000；所述含羧基的可逆加成断裂链转移试剂为至少含一个羧基和一个二硫代苯甲酸酯基的化合物，优选4-二硫代苯甲酸酯基-4-腈基戊酸及其衍生物；
步骤1)中所述反应的反应温度为室温，反应时间为48-96小时；所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为甲苯、二氯甲烷或三氯甲烷；所述端羟基或端氨基的PEG与含羧基的可逆加成断裂链转移试剂的摩尔比为1∶(3-10)；
步骤2)中所述聚合反应的反应介质为二甲基亚砜或甲醇；
步骤2)中所述聚合反应的反应温度为50-70℃，反应时间为24-72小时。
8.制备权利要求4所述的肿瘤靶向性高分子载体的方法，包括下述步骤：将权利要求1-3中任一项所述的嵌段聚合物中MAGG结构单元侧链羧基与含氨基或羟基的靶向功能分子反应形成酯键或者酰胺键，得到所述肿瘤靶向性高分子载体；所述MAGG代表甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述靶向功能分子为氨基修饰的叶酸，所述氨基修饰的叶酸是由叶酸与乙二醇双2-氨基乙基醚在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺催化下于二甲基亚砜中合成的。
10.制备权利要求5所述的抗肿瘤靶向性载药聚合物的方法，包括下述步骤：将权利要求4所述的肿瘤靶向性高分子载体中BHMAGG结构单元上的肼键脱去叔丁氧羰基脱保护后，通过肼键与含醛或酮的抗肿瘤药物反应，得到所述抗肿瘤靶向性载药聚合物；所述BHMAGG代表N-甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酰-N`-叔丁氧羰基肼。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述肼键脱去叔丁氧羰基的方法为与三氟乙酸进行反应，反应时间10-60分钟；
所述肼键与含醛或酮的抗肿瘤药物反应的反应介质为二甲基亚砜，所采的催化剂为冰乙酸，反应时间为24-72小时。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106995516A (zh) * | 2016-01-22 | 2017-08-01 | 北京化工大学 | 肿瘤特异性富集的纳米载药体系及其制备方法 |
| CN108066771A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-05-25 | 北京思如诺科技有限公司 | 一种具有高载药量环境响应型抗肿瘤纳米药物、载体以及制备方法 |
| CN110183636A (zh) * | 2019-05-24 | 2019-08-30 | 中国科学院化学研究所 | 一种共聚物载体及其制备方法与应用 |
| CN110559274A (zh) * | 2019-09-04 | 2019-12-13 | 浙江理工大学 | 一种叶酸修饰纳米MOF-Al具有靶向功能的响应性药物载体的制备方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007028347A2 (en) * | 2005-09-05 | 2007-03-15 | Zentiva, A.S. | Method for the preparation of polymeric conjugates of doxorubicin with ph- controlled release of the drug |
| WO2007086943A2 (en) * | 2005-09-01 | 2007-08-02 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Wortmannin conjugates and uses thereof |
| CN101265331A (zh) * | 2007-03-12 | 2008-09-17 | 中国科学院化学研究所 | Peg改性phpma材料及其制备方法 |
| US20090306004A1 (en) * | 2006-09-18 | 2009-12-10 | Tomas Etrych | Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation |
| US20100190928A1 (en) * | 2006-08-09 | 2010-07-29 | Tomas Etrych | Polymeric conjugates of doxorubicin with ph-regulated release of the drug and a method of preparing |
-
2013
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007086943A2 (en) * | 2005-09-01 | 2007-08-02 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Wortmannin conjugates and uses thereof |
| WO2007028347A2 (en) * | 2005-09-05 | 2007-03-15 | Zentiva, A.S. | Method for the preparation of polymeric conjugates of doxorubicin with ph- controlled release of the drug |
| US20100190928A1 (en) * | 2006-08-09 | 2010-07-29 | Tomas Etrych | Polymeric conjugates of doxorubicin with ph-regulated release of the drug and a method of preparing |
| US20090306004A1 (en) * | 2006-09-18 | 2009-12-10 | Tomas Etrych | Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation |
| CN101265331A (zh) * | 2007-03-12 | 2008-09-17 | 中国科学院化学研究所 | Peg改性phpma材料及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 喻青松等: "新型水溶性靶向放疗体系的制备及体外靶向性研究", 《2011年全国高分子学术论文报告会》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106995516A (zh) * | 2016-01-22 | 2017-08-01 | 北京化工大学 | 肿瘤特异性富集的纳米载药体系及其制备方法 |
| CN106995516B (zh) * | 2016-01-22 | 2019-08-02 | 北京化工大学 | 肿瘤特异性富集的纳米载药体系及其制备方法 |
| CN108066771A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-05-25 | 北京思如诺科技有限公司 | 一种具有高载药量环境响应型抗肿瘤纳米药物、载体以及制备方法 |
| CN110183636A (zh) * | 2019-05-24 | 2019-08-30 | 中国科学院化学研究所 | 一种共聚物载体及其制备方法与应用 |
| CN110559274A (zh) * | 2019-09-04 | 2019-12-13 | 浙江理工大学 | 一种叶酸修饰纳米MOF-Al具有靶向功能的响应性药物载体的制备方法 |
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