JP4931801B2 - ジペプチドの結晶およびその製造法 - Google Patents
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Description
Bull.Chem.Soc.Jpn.,34,739(1961) Bull.Chem.Soc.Jpn.,35,1966(1962) Org.Process Res.Dev.,4,147(2000)
(1)D−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、および3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを実質的に含まない、ジペプチドの結晶。
(2)D−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、および3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを実質的に含まない、L−アラニル−L−グルタミンの結晶。
(4)アミノ酸アミドを実質的に含まない上記(1)〜(3)のいずれか1つの結晶。
(6)L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸を生産する能力と、L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力とを有する微生物を培地に培養し、該培地中にジペプチドを生成、蓄積させる工程を含む上記(1)〜(5)のいずれか1つの結晶の製造法。
[1]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列と少なくとも65%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質
[3]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質
[4]配列番号18で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
(8)L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸がL−アラニンまたはL−グルタミンであり、ジペプチドがL−アラニル−L−グルタミンである、上記(6)または(7)の製造法。
[1]L−アラニル−L−グルタミンを含む培養物、または該培養物から調製されるL−アラニル−L−グルタミンを含む溶液を加熱処理する工程
[2]L−アラニル−L−グルタミンを含む培養物からL−アラニル−L−グルタミンを含む溶液を調製し、該溶液にメタノールを添加することによりL−アラニル−L−グルタミンの結晶を晶析させる工程
(10)L−アラニンとL−グルタミンとからL−アラニル−L−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質、該蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物、または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、L−アラニンおよびL−グルタミンを水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にL−アラニル−L−グルタミンを生成、蓄積させ、該水性媒体からL−アラニル−L−グルタミンを含有する溶液を調製した後、該溶液にメタノールを添加してL−アラニル−L−グルタミンの結晶を晶析させることを特徴とする上記(2)〜(5)のいずれか1つの結晶の製造法。
[1]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列と少なくとも65%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつL−アラニル−L−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質
[3]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつL−アラニル−L−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質
[4]配列番号18で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつL−アラニル−L−グルタミンの合成活性を有する蛋白質
本発明のD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、および3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを実質的に含まないジペプチドの結晶としては、目的とするジペプチドの結晶を構成するアミノ酸のD体のアミノ酸を構成成分に含む1種または2種以上のジペプチド、並びに目的とするジペプチドの結晶を構成するアミノ酸および/もしくは該アミノ酸のD体のアミノ酸を構成成分に含む3個以上のアミノ酸からなる1種または2種以上のポリペプチド、好ましくは1種または2種以上のトリペプチドを実質的に含まないジペプチドの結晶をあげることができる。
R1−R2 (I)
[ただし、R1がL−Ala、L−Met、L−Ser、L−Thrまたはβ−Alaであり、R2がL−Gln、L−Glu、Gly、L−Val、L−Leu、L−Ile、L−Pro、L−Phe、L−Trp、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Cys、L−Asn、L−Tyr、L−Lys、L−Arg、L−His、L−Asp、L−α−AB、4−L−HYP、3−L−HYP、L−Orn、L−CitまたはGlyである]で表されるジペプチドの結晶をあげることができ、より好ましくは、D−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドとして、D−Ala、D−Gln、D−Val、D−Leu、D−Ile、D−Phe、D−Trp、D−Met、D−Ser、D−Thr、D−Cys、D−Asn、D−Ttr、D−Lys、D−Arg、D−His、D−α−ABおよびD−Citなどから選ばれるD−アミノ酸を構成成分に含む1種または2種以上のジペプチド、並びに3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドとして、Ala、Gln、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met、Ser、Thr、Cys、Asn、Tyr、Lys、Arg、His、α−AB、Cit、Glyおよびβ−Alaなどから選ばれるアミノ酸を構成成分に含む3個以上のアミノ酸からなる1種または2種以上のポリペプチド、好ましくは1種または2種以上のトリペプチドを実質的に含まない、式(II)
R3−R4 (II)
[ただし、R3がL−Alaの場合は、R4はL−Gln、Gly、L−Val、L−Leu、L−Ile、L−Phe、L−Trp、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Cys、L−Asn、L−Tyr、L−Lys、L−Arg、L−His、L−α−ABまたはL−Citであり、R3がGlyの場合は、R4はL−Gln、Gly、L−Phe、L−Trp、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Cys、L−Tyr、L−Lys、L−Arg、L−α−ABまたはL−Citであり、R3がL−Metの場合は、R4はL−Phe、L−Met、L−Cys、L−Tyr、L−LysまたはL−Hisであり、R3がL−Serの場合は、R4はL−Gln、Gly、L−Phe、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Tyr、L−HisまたはL−α−ABであり、R3がL−Thrの場合は、R4はL−Gln、L−Leu、L−Phe、L−Met、L−Ser、L−ThrまたはL−α−ABであり、R3がL−Glnの場合は、R4はL−PheまたはL−α−ABであり、R3がL−Pheの場合は、R4はL−Glnであり、R3がL−Trpの場合は、R4はGlyであり、R3がL−Cysの場合は、R4はL−Ala、L−Gln、GlyまたはL−Metであり、R3がL−Lysの場合は、R4はL−Ala、GlyまたはL−Metであり、R3がL−Argの場合は、R4はL−α−ABであり、R3がL−Hisの場合は、R4はL−Metであり、R3がL−α−ABの場合は、R4はL−Ala、L−Gln、Gly、L−Ser、L−Thr、L−ArgまたはL−α−ABであり、R3がβ−Alaである場合は、R4はL−Hisである]で表されるジペプチドの結晶をあげることができる。
また、本発明のD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、および3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを実質的に含まない、ジペプチドの結晶としては、上記の結晶に加え、さらにアミノ酸アミドを実質的に含まない結晶をあげることができる。アミノ酸アミドとしては、アラニンアミド(AlaNH2)、グリシンアミドおよびアスパラギン酸−α−アミドから選ばれるアミノ酸アミドをあげることができ、好ましくは、AlaNH2をあげることがでる。
また、本発明のジペプチドの結晶はどのような結晶形でもよく、例えば針状結晶などをあげることができる。
(a)D−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.05重量%以下であり、かつ3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.014重量%未満、好ましくはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.05重量%以下であり、かつ3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.010重量%以下、より好ましくはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.05重量%以下であり、かつ3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.005重量%以下、さらに好ましくはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.05重量%以下であり、かつ3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.002重量%以下、またはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.004重量%未満であり、かつ3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.032重量%未満、好ましくはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.003重量%以下であり、かつ3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.020重量%以下、より好ましくはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.002重量%以下であり、かつ3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.010重量%以下、さらに好ましくはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.002重量%以下であり、かつ3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.005重量%以下、特に好ましくはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.002重量%以下であり、かつ3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.002重量%以下であること、をあげることができる。
(b)D−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.004重量%未満であり、3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.032重量%未満であり、かつアミノ酸アミドは0.023重量%未満であること、好ましくはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.003重量%以下であり、3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.020重量%以下であり、かつアミノ酸アミドは0.015重量%以下、より好ましくはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.002重量%以下であり、3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.010重量%以下であり、かつアミノ酸アミドは0.012重量%以下、さらに好ましくは、D−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.002重量%以下であり、3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.002重量%以下であり、かつアミノ酸アミドは0.009重量%以下であること、をあげることができる。
(c)D−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.05%以下であり、かつ3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.018%未満、好ましくはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.05%以下であり、かつ3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.013%以下、より好ましくはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.05%以下であり、かつ3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.006%以下、さらに好ましくはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.05%以下であり、かつ3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.003%以下であること、またはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.004%以下であり、かつ3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.032%未満、好ましくはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.003%以下であり、かつ3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.026%以下、より好ましくはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.002%以下であり、かつ3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.018%以下、さらに好ましくはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.002%以下であり、かつ3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.013%以下であること、をあげることができる。
(d)D−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.004%未満であり、3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.041%未満であり、かつアミノ酸アミドは0.005%未満であること、好ましくはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.003%以下であり、3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.026%以下であり、かつアミノ酸アミドは0.003%以下、より好ましくはD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.002%以下であり、3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.013%以下であり、かつアミノ酸アミドは0.003%以下、さらに好ましくは、D−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは0.002%以下であり、3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは0.002%以下であり、かつアミノ酸アミドは0.002%以下であること、をあげることができる。
HPLCの分析の条件としては、例えば下記の分析条件、
分析条件
カラム:Inertsil ODS−3V(GLサイエンス社製)
カラム温度:30℃
移動相:溶液A[0.01mol/lヘプタンスルホン酸ナトリウム、0.01mol/lリン酸一カリウム(pH2.5)]:メタノール=99:1
流量:1.2ml/min
検出:UV210nm
をあげることができるが、分析に供するジペプチドの試料中に含まれるD−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、3個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、およびアミノ酸アミドの種類に応じて、適宜、移動相の溶液組成の変更、複数の溶液を用いた濃度勾配溶液の使用、検出波長の変更等をすることができ、また試料中の物質をFMOC(fluorenylmethyl chloroformate)等で誘導体化し、その発光を検出する方法等もあげることができる
2.本発明のジペプチドの結晶の製造法
本発明の結晶は、i)L−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、該蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物、または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、並びにL−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる1種以上のアミノ酸を水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体からジペプチドの結晶を採取する方法、ii)L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸を生成、蓄積する能力、およびL−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、該培地中にジペプチドを生成、蓄積させ、該培地からジペプチドの結晶を採取する方法、などにより製造することができる。
(1)本発明の製造法に用いられる蛋白質
(a)本発明の製造法に用いられるL−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質としては、該活性を有する蛋白質であれば特に限定されないが、例えば以下の[1]〜[4]に記載の蛋白質、
[1]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
[2]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列と少なくとも65%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、
[3]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、
[4]配列番号18で表されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、
などをあげることができる。
よって、配列番号18で表されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質もまたジペプチドを生成する活性を有する蛋白質である。
配列番号1〜8で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質のいずれかにおいて1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、1個または複数のアミノ酸の欠失、置換または付加があってもよい。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、O−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4−ジアミノブタン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸
E群:プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン
G群:フェニルアラニン、チロシン
また、上記した1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加が導入される位置は、該変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛋白質がジペプチドの合成活性を有する限り、特に限定されず、例えば配列番号1〜8で表されるアミノ酸配列を公知のアライメントソフトウェアを用いて比較したときに、すべてのアミノ酸配列において保存されていないアミノ酸をあげることができる。公知のアライメントソフトウェアとしては、例えば遺伝子解析ソフトウェアGenetyx(ソフトウェア開発株式会社)に含まれるアライメント解析ソフトをあげることができる。該解析ソフトの解析パラメータとしては、デフォルト値を用いることができる。
(b)本発明のL−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質としては、該活性を有する蛋白質であれば特に限定されず、例えば以下の[5]〜[8]に記載の蛋白質、
[5]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
[6]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列と少なくとも65%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、
[7]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、
[8]配列番号18で表されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、
などをあげることができる。
よって、配列番号18で表されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質もまたジペプチドを生成する活性を有する蛋白質である。
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は、上記(a)と同様である。
配列番号1〜8で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質のいずれかにおいて1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、上記(a)と同意である。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は上記(a)と同様である。
また、上記した1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質としては、上記(a)と同様の蛋白質をあげることができる。
(2)本発明のジペプチドの結晶の製造に用いられる微生物
(a)本発明のL−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、上記(1)の(a)の蛋白質を生産する能力を有する微生物であれば特に限定されないが、例えば上記(1)の(a)の[1]〜[4]のいずれかに記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物をあげることができる。
[9]配列番号9〜17のいずれかで表される塩基配列を有するDNA、
[10]配列番号9〜17のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA、および
[11]配列番号19で表される塩基配列と少なくとも80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列を含み、かつ、ジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA、
をあげることができる。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、上記したいずれかのDNAの塩基配列と少なくとも80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNAをあげることができる。
上記したDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAが、ジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするDNAであることは、該DNAを発現する組換え体DNAを作製し、該組換え体DNAを宿主細胞に導入して得られる微生物を酵素源に用い、該酵素源、並びにL−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる1種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積するか否かをHPLC等により分析する方法によって確認することができる。
(b)本発明の製造法で用いられるL−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力と、L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸を生産する能力とを有する微生物としては、該能力を有する微生物であれば特に限定されないが、例えば上記(1)の(b)の[5]〜[8]のいずれかに記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物であり、かつL−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物をあげることができる。
[13]配列番号9〜17のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA、および
[14]配列番号19で表される塩基配列と少なくとも80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列を含み、かつ、ジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA、
をあげることができる。
上記したDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAが、L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするDNAであることは、該DNAを発現する組換え体DNAを作製し、該組換え体DNAを宿主細胞に導入して得られる微生物を酵素源に用い、該酵素源、L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積するか否かをHPLC等により分析する方法によって確認することができる。
(c)本発明の製造法で用いられるL−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する微生物、並びにL−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸を生産する能力と、L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生産する能力とを有する微生物は、上記(a)または(b)の微生物であるとともに、1)1種以上のペプチダーゼおよび1種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質(以下、ペプチド取込み蛋白質と略す)の活性が低下または喪失している微生物、または2)3種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物であってもよい。
上記ペプチダーゼとしては、ペプチド分解活性を有する蛋白質であればいずれでもよく、好ましくはジペプチド分解活性が高い蛋白質、より好ましくはジペプチダーゼをあげることができる。
また、ペプチド取込み蛋白質の活性が低下しているとは、上記した塩基の欠損、置換または挿入がないDNAにコードされるペプチド取込み蛋白質に比べ、ペプチド取り込み活性が低くなっていればよく、好ましくは上記した塩基の欠失、置換または付加がない、野生型の遺伝子にコードされているようなペプチド取込み蛋白質と比べたとき、ペプチド取込み活性が少なくとも20%以上、より好ましくは50%以上、さらに好ましくは80%以上、特に好ましくは90%以上、低下していることを意味する。
上記ペプチド取り込み蛋白質としては、染色体DNA上でオペロンを形成する遺伝子にコードされている蛋白質であり、細胞膜上で複合体を形成してジペプチド取り込み活性を発現する蛋白質、および単独の蛋白質としてペプチド取り込み活性を有する蛋白質など、微生物のペプチド取り込みに関与している蛋白質であればいずれでもよく、好ましくはペプチド取り込み活性が高い蛋白質をあげることができる。
3種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物としては、該微生物が正常に生育できる限りにおいて、任意の3種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物をあげることができ、好ましくは3種以上9種以下、より好ましくは3種以上6種以下、さらに好ましくは3種または4種のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。
(3)本発明の製造法に用いられる微生物の製造法
(a)L−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の製造法
WO2004/058960号に記載されているバシリシン合成酵素遺伝子を有するバチルス・サチルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コグランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・プミルス、具体的にはバチルス・サチリスATCC 23857、バチルス・サチリス ATCC15245、バチルス・サチリス ATCC6633、バチルス・サチリス IAM1213、バチルス・サチリス IAM1107、バチルス・サチリス IAM1214、バチルス・サチリス ATCC9466、バチルス・サチリス IAM1033、バチルス・サチリス ATCC21555、バチルス・アミロリケファシエンスIFO3022は、L−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有しているので、本発明の製造法に用いることができる。
[1]L−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするDNAの調製法
L−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有するDNAは、WO2004/058960号記載の方法で調製することができ、例えば配列番号9〜17で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、微生物、好ましくはバチルス属に属する微生物の染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または配列番号9〜17で表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーDNAを用いた、微生物、好ましくはバチルス属に属する微生物の染色体DNAを鋳型としたPCR[PCR Protocols,Academic Press(1990)]、および各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列と75%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体DNA、cDNAライブラリー等から上記した方法によりジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするDNAを取得することもできる。
更に、決定されたDNAの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするDNAを取得することもできる。
上記したDNAを組み込むベクターとしては、pBluescriptII KS(+)(ストラタジーン社製)、pDIRECT[Nucleic Acids Res.,18,6069(1990)]、pCR−Script Amp SK(+)(ストラタジーン社製)、pT7Blue(ノバジェン社製)、pCR II(インビトロジェン社製)およびpCR−TRAP(ジーンハンター社製)などをあげることができる。
[2]L−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするDNAで形質転換された微生物の製造法
上記[1]の方法により取得したDNAをもとにして、必要に応じて、ジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることができる。
該組換え体DNAを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌および酵母等、目的とする遺伝子を発現できる微生物であればいずれも用いることができる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、ジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするDNAを有する組換え体DNAは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするDNA、転写終結配列より構成された組換え体DNAであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ(Shine−Dalgarno)配列と開始コドンとの間を適当な距離(例えば6〜18核酸)に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
このような組換え体DNAとしては、WO2004/058960号に記載されているpPE43をあげることができる。
サッカロマイセス属に属する菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等を用いることができる。
組換え体DNAの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[Methods Enzymol.,194,182(1990)]、スフェロプラスト法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81,4889(1984)]、酢酸リチウム法[J.Bacteriol.,153,163(1983)]等をあげることができる。
[3]L−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質の製造法
L−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質は、上記の[1]の方法で調製することができる該蛋白質をコードするDNAで宿主細胞を形質転換して取得することができる形質転換体を培地に培養し、培養物から該蛋白質を分離、精製することにより製造することができる。
上記形質転換体を培地に培養する方法、および培養物から該蛋白質を分離、精製する方法としては、公知の方法、例えばWO2004/058960号に記載の方法をあげることができる。
(b)L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸を生産する能力と、L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力とを有する微生物の製造法
本発明の製造法で用いられるL−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸を生産する能力と、L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力とを有する微生物は、微生物が元来L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸を生産する能力を有している場合は、該微生物をL−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするDNAで形質転換する方法で取得することもできるが、例えば(i)L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の、L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸を生産する能力を、公知の方法により人為的に強化する方法、
(ii)L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸を生産する能力が強化されている微生物株を、L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするDNAで形質転換する方法、などにより取得することができる。
[1]L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも1つを緩和または解除する方法、
[2]該アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも1つを発現強化する方法、
[3]該アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも1つのコピー数を増加させる方法、
[4]該アミノ酸の生合成経路から該アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも1つを弱化または遮断する方法、および
[5]野生型株に比べ、該アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。
原核生物としては、エシェリヒア(Escherichia)属、セラチア(Serratia)属、バチルス属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ミクロバクテリウム属(Microbacterium)、シュードモナス(Pseudomonas)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アリシクロバチルス属(Alicyclobacillus)、アナベナ(Anabena)属、アナシスティス(Anacystis)属、アスロバクター(Arthrobacter)属、アゾトバクター(Azotobacter)属、クロマチウム(Chromatium)属、エルビニア(Erwinia)属、メチロバクテリウム(Methylobacterium)属、フォルミディウム(Phormidium)属、ロドバクター(Rhodobacter)属、ロドシュードモナス(Rhodopseudomonas)属、ロドスピリウム(Rhodospirillum)属、セネデスムス(Scenedesmus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、シネコッカス(Synechoccus)属、ザイモモナス(Zymomonas)属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリ、バチルス・サチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・コアギュランス(Bacillus coagulans)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(Brevibacterium ammoniagenes)、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム(Brevibacterium immariophilum)、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム(Corynebacterium acetoacidophilum)、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム(Microbacterium ammoniaphilum)、セラチア・フィカリア(Serratia ficaria)、セラチア・フォンチコラ(Serratia fonticola)、セラチア・リケファシエンス(Serratia liquefaciens)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、アグロバクテリウム・ラジオバクター(Agrobacterium radiobacter)、アグロバクテリウム・リゾジーンズ(Agrobacterium rhizogenes)、アグロバクテリウム・ルビ(Agrobacterium rubi)、アナベナ・シリンドリカ(Anabaena cylindrica)、アナベナ・ドリオルム(Anabaena doliolum)、アナベナ・フロスアクア(Anabaena flos−aquae)、アースロバクター・オーレッセンス(Arthrobacter auresce ns)、アースロバクター・シトレウス(Arthrobacter citreus)、アースロバクター・グロブフォルミス(Arthrobacter globformis)、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス(Arthrobacter hydrocarboglutamicus)、アースロバクター・ミソレンス(Arthrobacter mysorens)、アースロバクター・ニコチアナ(Arthrobacter nicotianae)、アースロバクター・パラフィネウス(Arthrobacter paraffineus)、アースロバクター・プロトフォルミエ(Arthrobacter protophormiae)、アースロバクター・ロセオパラフィナス(Arthrobacter roseoparaffinus)、アースロバクター・スルフレウス(Arthrobacter sulfureus)、アースロバクター・ウレアファシエンス(Arthrobacter ureafaciens)、クロマチウム・ブデリ(Chromatium buderi)、クロマチウム・テピダム(Chromatium tepidum)、クロマチウム・ビノサム(Chromatium vinosum)、クロマチウム・ワーミンギ(Chromatium warmingii)、クロマチウム・フルビアタティレ(Chromatium fluviatile)、エルビニア・ウレドバラ(Erwinia uredovora)、エルビニア・カロトバラ(Erwinia carotovora)、エルビニア・アナス(Erwinia ananas)、エルビニア・ヘリコラ(Erwinia herbicola)、エルビニア・パンクタタ(Erwinia punctata)、エルビニア・テレウス(Erwinia terreus)、メチロバクテリウム・ロデシアナム(Methylobacterium rhodesianum)、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス(Methylobacterium extorquens)、フォルミディウム・エスピー(Phormidium sp.)ATCC29409、ロドバクター・カプスラタス(Rhodobacter capsulatus)、ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ロドシュードモナス・ブラスチカ(Rhodopseudomonas blastica)、ロドシュードモナス・マリナ(Rhodopseudomonas marina)、ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)、ロドスピリウム・リブラム(Rhodospirillum rubrum)、ロドスピリウム・サレキシゲンス(Rhodospirillum salexigens)、ロドスピリウム・サリナラム(Rhodospirillum salinarum)、ストレプトマイセス・アンボファシエンス(Streptomyces ambofaciens)、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス(Streptomyces aureofaciens)、ストレプトマイセス・アウレウス(Streptomyces aureus)、ストレプトマイセス・フンジシディカス(Streptomyces fungicidicus)、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス(Streptomyces griseochromogenes)、ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)、ストレプトマイセス・オリボグリセウス(Streptomyces olivogriseus)、ストレプトマイセス・ラメウス(Streptomyces rameus)、ストレプトマイセス・タナシエンシス(Streptomyces tanashiensis)、ストレプトマイセス・ビナセウス(Streptomyces vinaceus)、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)等をあげることができ、好ましい原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属またはストレプトマイセス属等に属する細菌、例えば上記したエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属またはストレプトマイセス属等に属する種をあげることができ、より好ましい細菌としてはエシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテイルム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィカシス、バチルス・サチルス、バチルス・メガテリウム、セラチア・マルセッセンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、ストレプトマイセス・セリカラーまたはストレプトミセス・リビダンスをあげることができ、特に好ましくはエシェリヒア・コリをあげることができる。
(c)ペプチダーゼおよびペプチド取り込み活性を有する蛋白質の活性が低下または喪失した微生物の製造法
本発明の製造法に用いられる微生物としては、上記(a)または(b)の方法により製造される微生物において、1種以上のペプチダーゼおよび1種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質(以下、ペプチド取り込み蛋白質と略す)の活性が低下または喪失した微生物、または3種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失した微生物をあげることができる。
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換または付加を導入する相同組換えを利用した方法としては、直鎖DNAを用いた方法をあげることができる。
相同組換えに用いられるDNAとしては、
[1]塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両外側に存在するDNAまたは該DNAと相同性を有するDNAを、薬剤耐性遺伝子の両端に有する直鎖DNA、
[2]塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両外側に存在するDNAまたは該DNAと相同性を有するDNAを直接連結した直鎖DNA、
[3]塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両外側に存在するDNAまたは該DNAと相同性を有するDNAを、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子の両端に有する直鎖DNA、
[4]上記[1]の直鎖DNAにおいて、薬剤耐性遺伝子と染色体DNA上の領域の両外側に存在するDNAまたは該DNAと相同性を有するDNAの間に、さらに酵母由来のFlp recombinase[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,82,5875(1985)]が認識する塩基配列を有するDNA、
をあげることができる。
上記直鎖DNA断片は、PCRにより作製することができる。また上記直鎖DNAを含むDNAをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖DNAを得ることもできる。
方法1:上記[1]または[2]の直鎖DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖DNAが染色体DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。
方法2:上記方法1により取得された形質転換株に、塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両外側に存在するDNAまたは該DNAと相同性を有するDNAを直接連結したDNAを導入し、該方法により染色体DNA上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体DNA上の領域を置換または欠失させる方法。
方法3:
a)上記[3]の直鎖DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖DNAが染色体DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
b)染色体DNA上の置換または欠失の対象領域の両端の外側に位置するDNAと相同性を有するDNAを、染色体DNA上における方向と同一の方向で連結したDNAを合成し、上記a)で得られた形質転換株に導入する、
c)ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記b)の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体DNA上から削除された株として選択する方法。
方法4:
a)上記[4]の直鎖DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖DNAが染色体DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
b)上記a)で得られた形質転換株にFlp recombinase遺伝子発現プラスミドを導入し、該遺伝子を発現させた後、上記a)で用いた薬剤に感受性である株を取得する方法。
上記方法2〜4では、最終的に得られる形質転換株の染色体DNA上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法であるため、該方法を用いることにより、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、上記の操作を繰り返すことにより、容易に染色体DNA上の位置の異なる2以上の領域に塩基の欠失、置換または付加を有する微生物を製造することができる。
(4)本発明のジペプチドの結晶の製造法
(a)L−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、該蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物、または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、並びにL−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる1種以上のアミノ酸を水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体からジペプチドの結晶を採取することにより、本発明のジペプチドの結晶を製造することができる。
すなわち、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸は、0.1〜500g/L、好ましくは0.2〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
本発明の製造法に用いられる微生物の培養物の処理物としては、上記(2)の微生物を培養して得られる培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該微生物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいる培養物の処理物をあげることができる。
水性媒体中に生成、蓄積した本発明のジペプチドの結晶を採取する方法としては、D−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドおよび3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを実質的に含まないジペプチドの結晶、またはさらにアミノ酸アミドを実質的に含まないジペプチドの結晶が得られる限り特に限定されないが、例えば酵素源に蛋白質を用いた場合はそのまま、酵素源に培養物または該培養物の処理物を用いた場合は遠心分離または濾過によって菌体を除いた後、本発明のジペプチドを含む溶液を夾雑のアミノ酸やポリペプチドを分離するための合成吸着剤、陽イオン交換樹脂および陰イオン交換樹脂等のイオン交換樹脂、活性炭による処理、晶析処理、並びに特定の夾雑物を除去するための処理を必要に応じて単独または組み合わせて行った後、目的とするジペプチドを晶析する方法をあげることができる。
L-アラニル−L-グルタミンの結晶を採取する方法としては、例えば反応終了後、反応液に菌体が含まれている場合は菌体を遠心分離または濾過などにより除いた後、L-アラニル−L-グルタミンを含有する溶液を、強酸性陽イオン交換樹脂、例えばマラソンCに通塔し、L-アラニル−L-グルタミンが含まれる溶出画分を取得した後、該溶出画分を弱酸性陽イオン、例えばIRC50に通塔してL-アラニル−L-グルタミンが含まれる溶出画分を得、次に該溶出画分を強塩基性陰イオン交換樹脂(例えばPA412)に通塔して得られるL-アラニル−L-グルタミンが含まれる溶液を用いて、L-アラニル−L-グルタミンを結晶化する方法をあげることができる。
ジペプチドを晶析する方法としては、目的とするジペプチドを晶析できる方法であれば特に限定されないが、メタノール、エタノールおよびプロパノール等の低級アルコール、アセトン等のケトン類、およびテトラヒドロフラン等の溶媒をジペプチドを含有する水溶液に添加する方法をあげることができる。
例えば、L−アラニル−L−グルタミンを晶析する方法としては、L−アラニル−L−グルタミンを含む水溶液に、該水溶液の約2〜5倍容量、好ましくは3〜4倍容量のメタノールを、20〜70℃、好ましくは50〜70℃の温度下で該水溶液に添加した後、10〜30℃、好ましくは15〜25℃に冷却する方法をあげることができる。
(b)L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸を生産する能力と、L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力とを有する微生物を培地に培養し、該培地中にジペプチドを生成、蓄積させた後、該培地からジペプチドの結晶を採取することにより、本発明のジペプチドの結晶を取得することができる。
ただし、該微生物の培養に用いる培地には、目的とするジペプチドを構成するアミノ酸が含まれる必要はないが、天然培地、またはアミノ酸要求性株を培養するための培地には該アミノ酸が含まれている場合もある。本発明の製造法に用いられる培地には、本発明で用いられる微生物が、その成育に必要とする量のアミノ酸が含まれていてもよい。すなわち、通常の培地に含まれるアミノ酸の量は、用いられる微生物によって生成、蓄積される該アミノ酸の量に比べ非常に少ないので、通常の培地に含まれる該アミノ酸の量は、該アミノ酸の有無により、本願発明により製造されるジペプチドの生産量が変わるほどの量ではなく、よって本発明の製造法に用いられる培地にはその程度の該アミノ酸が含まれていてもよい。
また、L−アラニンまたはL−グルタミンを生産する能力と、L−アラニンとL−グルタミンとからL−アラニル−L−グルタミンを生成する能力とを有する微生物を培養し、培地中にL−アラニル−L−グルタミンを生成、蓄積させたとき、培地中に残存した夾雑物であるL−グルタミンを除去する方法としては、該培地を上記(a)の水性媒体と同様に処理する方法、好ましくは加熱処理する方法をあげることができる。
ジペプチドを晶析する方法としては、上記(a)と同様の方法をあげることができる。
具体的には、L−アラニル−L−グルタミンを晶析する方法としては、L−アラニル−L−グルタミンを含む水溶液に、該水溶液の約2〜5倍容量、好ましくは3〜4倍容量のメタノールを、20〜70℃、好ましくは50〜70℃の温度下で該水溶液に添加した後、10〜30℃、好ましくは15〜25℃に冷却する方法をあげることができる。
参考例 市販のL−アラニル−L−グルタミン結晶の分析
下記表1は、以下の条件下で各市販試薬をHPLC分析した結果であり、上段にHPLC分析したときのエリア%、下段に該エリア%から算出される重量%を示した。
分析条件
カラム:Inertsil ODS−3V(GLサイエンス社製)
温度:30℃
移動相:溶液A[0.01mol/lヘプタンスルホン酸ナトリウム、0.01mol/lリン酸一カリウム(pH2.5)]:メタノール=99:1
流量:1.2ml/min
検出:UV210nm
以下に、L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸を生産する能力と、L−アミノ酸およびグリシンから選ばれる1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力とを有し、かつ1種以上のペプチダーゼおよび1種以上のペプチド取り込み蛋白質の活性が低下または喪失した微生物、または3種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失した微生物の製造法の実験例を示すが、該微生物の製造法は該実験例に限定されるものではない。
実験例1 pepD遺伝子、pepN遺伝子、pepB遺伝子、pepA遺伝子およびdppオペロン欠損株の作製
エシェリヒア・コリ染色体DNA上の特定遺伝子が欠損した菌株は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,6641−6645(2000)]に従って作製した。
(1)遺伝子欠損用DNA断片のクローニング
エシェリヒア・コリK12株の染色体DNA上に存在する配列番号29で表される塩基配列を有するpepD遺伝子、配列番号30で表される塩基配列を有するpepN遺伝子、配列番号31で表される塩基配列を有するpepB遺伝子、配列番号32で表される塩基配列を有するpepA遺伝子および配列番号33で表される塩基配列を有するdppA遺伝子、配列番号34で表される塩基配列を有するdppB遺伝子、配列番号35で表される塩基配列を有するdppC遺伝子、配列番号36で表される塩基配列を有するdppD遺伝子および配列番号37で表される塩基配列を有するdppF遺伝子を欠損させることを目的に、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成機を用い、エシェリヒア・コリK12株の染色体DNA上における各々の欠損標的遺伝子の上流および下流に位置する36bpからなる塩基配列と相同な塩基配列、および配列番号38で表される酵母由来Flp recombinaseが認識する塩基配列を有するDNAを合成した。ただし、dppA遺伝子、dppB遺伝子、dppC遺伝子、dppD遺伝子およびdppF遺伝子は、オペロンを形成しているので、該オペロンの上流および下流に位置する塩基配列と相同な塩基配列を有するDNAを合成した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に2倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−80℃で30分間放置した。該溶液を遠心分離し、pepD遺伝子、pepN遺伝子、pepB遺伝子、pepA遺伝子およびdppオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有DNA断片を取得した。
(2)pepD遺伝子欠損エシェリヒア・コリJM101の作製
大腸菌JM101株をpKD46で形質転換し、100mg/lのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布し、30℃で培養することで選択した。
プラスミドpCP20には酵母由来Flp recombinase遺伝子が挿入されており、該遺伝子の発現は42℃で誘導されるよう設計されている。
また、上記で作製したpepD遺伝子、pepN遺伝子、pepB遺伝子、pepA遺伝子及びdppオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有DNA断片の、クロラムフェニコール耐性遺伝子の両端にはFlp recombinaseが認識する塩基配列が存在するため、Flp recombinaseが触媒する相同組換えにより容易に該耐性遺伝子を脱落させることができる。
上記で取得したpCP20保有pKD46脱落株を薬剤無添加のLB寒天培地に植菌し、42℃で14時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを薬剤無添加LB寒天培地、25mg/lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地および100mg/lのアンピシリンを含むLB寒天培地にレプリカして、30℃で培養し、クロラムフェニコール感受性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。
(3)エシェリヒア・コリJM101の染色体DNA上のpepD遺伝子およびpepN遺伝子が欠損した株の作製
上記(2)で得られたエシェリヒア・コリJPD1株をpKD46で形質転換し、100mg/lのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布し、30℃で培養することにより選択した。得られた形質転換株(エシェリヒア・コリJPD1/pKD46)に、電気パルス法によりpepN遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有DNA断片を導入し、エシェリヒア・コリJPD1/pKD46の染色体DNA上にpepN遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有DNA断片が相同組換えにより組込まれた形質転換株を取得した。
(4)エシェリヒア・コリJM101の染色体DNA上のpepN遺伝子、pepA遺伝子、pepB遺伝子またはdppオペロンが欠損した株、および多重遺伝子欠損株の作製
pepN遺伝子、pepA遺伝子、pepB遺伝子またはdppオペロンの欠損株は、上記(1)で作製した各遺伝子またはオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有DNA断片を用い、上記(2)と同様の方法により作製した。
また、上記(3)の方法に準じて、pepD遺伝子、pepN遺伝子、pepA遺伝子、pepB遺伝子およびdppオペロンからなる群より選ばれる2以上の遺伝子またはオペロンの多重欠損株を作製した。多重欠損株が取得できたことの確認は、上記(2)と同様のPCRにより確認した。前記方法で取得されたpepD遺伝子およびdppオペロンが欠損した二重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリJPDP49株、pepB遺伝子、pepD遺伝子およびpepN遺伝子が欠損した三重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリJPDNB43株、pepD遺伝子、pepN遺伝子およびdppオペロンが欠損した三重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリJPNDDP36株、pepA遺伝子、pepD遺伝子、pepN遺伝子およびdppオペロンが欠損した四重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリJPNDAP5株、pepB遺伝子、pepD遺伝子、pepN遺伝子およびdppオペロンが欠損した四重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリJPNDBP7株と名づけた。表2は、各遺伝子欠損株における欠損遺伝子名を示す。
エシェリヒア・コリの染色体DNA上の特定遺伝子の欠損は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 6641-6645(2000)]に従って行った。
(1)遺伝子欠損用薬剤耐性遺伝子断片のクローニング
エシェリヒア・コリK12株のL−グルタミンの生合成調節に関与するglnE遺伝子およびglnB遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている[Science, 5331, 1453-1474(1997)]。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に2倍容量の冷エタノールを加えて混合し、-80℃に30分間放置した。該溶液を遠心分離してDNAを沈殿させた後、該DNAを20μLのTEに溶解した。上記操作により、glnE遺伝子、glnB遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を取得した。
(2)染色体DNA上のglnE遺伝子が欠損したエシェリヒア・コリJPNDDP36株の作製
上記(1)で取得したエシェリヒア・コリJPNDDP36株をpKD46で形質転換した後、100mg/lのアンピシリンを含むLB寒天培地上でpKD46を保持するエシェリヒア・コリJPNDDP36株(以下、エシェリヒア・コリJPNDDP36/pKD46と称す)を選択した。10mmol/Lの L-アラビノースと50μg/mlのアンピシリン存在下で培養したエシェリヒア・コリJPNDDP36/pKD46を、電気パルス法によりglnE遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を用いて形質転換し、JPNDDP36株の染色体DNA上のglnE遺伝子にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入され、glnE構造遺伝子が欠損するように組換えられた株を25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地上で選択した。
(3)染色体DNA上のglnE遺伝子およびglnB遺伝子が欠損したエシェリヒア・コリJPNDDP36株の作製
上記(2)で得られたエシェリヒア・コリ JPNDDPGLE1株をpKD46で形質転換した後、100mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布し、30℃で一晩培養することによりpKD46を保持するエシェリヒア・コリ JPNDDPGLE1株(以下、エシェリヒア・コリJPNDDPGLE1/ pKD46と称す)を取得した。エシェリヒア・コリJPNDDPGLE1/ pKD46をglnB遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を用いて電気パルス法により形質転換し、染色体DNA上のglnB 遺伝子にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されglnB構造遺伝子が欠損するように組換えられた株を取得した。glnB遺伝子の内部配列を元に設計した、配列番号65および66で表される塩基配列からなるプライマーDNAを用いて、上記(2)の条件下でコロニーPCRを行った。該PCRにより遺伝子増幅が見られなかった株は、glnB遺伝子欠損株であることを確認し、エシェリヒア・コリ JPNDDPGBE1と命名した。
実験例4 L-アラニル−L-グルタミンを生成する活性を有する蛋白質を発現するプラスミドDNAの作製
パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成機を用いて、配列番号67〜70に記載の配列を有するDNA(以下、それぞれプライマーA、プライマーB、プライマーC、プライマーD)を合成した。配列番号67の配列は、WO 2004/058960号に記載の方法で製造したプラスミドpQE60ywfEのywfE遺伝子のリボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ配列を含む領域について5'側にXhoI認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号68の配列は、ywfE遺伝子の終始コドンを含む配列と相補的な配列の5'側にBamHI認識配列を含む配列を付加したものである。また配列番号69の配列は、trpプロモーターを含む発現ベクターpTrS30のtrpプロモーター領域の配列について5'側にEcoRI認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号70の配列は、trpプロモーターを含む発現ベクターpTrS30のtrpプロモーター領域の配列と相補的な配列の5'側にXhoI認識配列を含む配列を付加したものである。
上記で得られたywfE遺伝子を含む1.4kb断片、trpプロモーター領域を含む0.3kb断片および4.5kbの断片をライゲーションキットを用いて、16℃で16時間、連結反応を行った。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出した。該プラスミドは、trpプロモーター下流にywfE遺伝子を有する発現プラスミドであることを制限酵素消化により確認し、pPE56と命名した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成機を用いて、配列番号71および配列番号72で表される塩基配列を有するDNA(以下、それぞれプライマーE、プライマーFと称す)を合成した。配列番号71で表される塩基配列は、ald遺伝子のリボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ配列を含む領域の5’側にBamHI認識配列を含む塩基配列を付加した配列である。配列番号72で表される塩基配列は、ald遺伝子の終始コドンを含む配列と相補的な配列の5’側にBamHI認識配列を含む配列を付加した配列である。
pPE56 0.2μgを制限酵素BamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、上記と同様の方法により6.3kbのDNA断片を回収した。該6.3kbのDNA断片の末端脱リン酸化を、60℃で30分間、アルカリホスファターゼ(E.coliC75、タカラバイオ社製)処理することにより行った。反応液と等量のTE飽和フェノール/クロロホルムを添加、混合して遠心分離した後、得られた上層に2倍容量の冷エタノールを加えて混合し、-80℃に30分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたDNAの沈殿を20μLのTEに溶解した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、50μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で一晩培養した。
実験例5 ジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力、並びにL−アラニンおよびL−グルタミンを生成する能力を有し、かつジペプチダーゼおよびジペプチド取り込み遺伝子が欠損した微生物の作製
上記実験例2で取得したエシェリヒア・コリJPNDDPGBE1株を、上記実験例4で作製したpPE86で形質転換し、該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリJPNDDPGBE1/pPE86を取得した。
上記実験例5で取得したエシェリヒア・コリJPNDDPGBE1/pPE86を、50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地(10g/lトリプトン、5g/l イーストエキストラクト、5g/l 塩化ナトリウム)を含む試験管に接種し、28℃で17時間培養した。得られた培養液をアンピシリン100μg/mlを含むTF培地(16g/l リン酸水素2ナトリウム、14g/l リン酸2水素カリウム、5g/l 硫酸アンモニウム、1g/l クエン酸、0.5g/l カザミノ酸、1g/l プロリン、2.5g/l アラニン、2.5g/l グルタミン、10mg/l ビタミンB1、25mg/l 硫酸マグネシウム、50mg/l 硫酸鉄、10g/l グルコース)に1%添加し、30℃で24時間培養した。
リニアーグラジエントをかける条件で分析を行った。その結果培養上清中には1g/lのアラニルグルタミンが蓄積していることを確認した。
エシェリヒア・コリJPNDDPGBE1/pPE86を、50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地を含む三角フラスコに接種し、28℃で24時間培養した。得られた培養液50mlを1.95LのJF培地(6g/l リン酸1水素2ナトリウム、3g/l リン酸2水素1カリウム、5g/l 塩化ナトリウム、5g/l 酵母エキス、2g/l 硫酸マグネシウム、0.2g/l 硫酸第一鉄、0.01g/l 硫酸マンガン、1g/l 塩化アンモニウム、0.2g/l プロリン、0.01g/l チアミン塩酸塩、10g/l グルコース)を含む6L容のジャーに添加し、通気攪拌しつつ32℃で培養した。培養中適宜グルコース、L−グルタミンおよびL−アラニンを添加するとともにアンモニア水でpHを6.6−7.0に維持し、60時間培養し、L−アラニル−L−グルタミンを培養液中に蓄積させた。
該画分を強塩基性陰イオン交換樹脂であるPA412(三菱化学社製)を充填したカラムに23ml分画液/ml樹脂の負荷量で通塔し、L−アラニル−L−グルタミンを吸着させた後、水を通塔してL−アラニル−L−グルタミンを含む画分を分取した。
該画分を上記と同様に濃縮後、メタノールを添加して結晶を析出させた。得られた結晶を濾別後乾燥し、針状結晶のL−アラニル−L−グルタミンの精製標品を取得した。
精製標品の旋光度(20℃):+9.7°
粉末X線回折[回折角(2θ°)、( )内は相対強度比(I/I0を示す)]:6.80(4),11.10(2),13.70(100),18.60(4),19.55(5),20.65(75),21.36(17),21.60(9),22.45(14),23.25(8),24.05(4),24.75(3),25.45(12),26.00(2),27.55(6),29.85(3),30.45(2),32.40(2),32.95(2),33.95(2),34.80(25),35.15(3),36.45(7),36.80(3),42.55(2),43.40(2)
上記で得られたL−アラニル−L−グルタミンの結晶に含まれる不純物を参考例と同様の方法で分析した。結果を表3に示す。
実施例2で得られたL−アラニル−L−グルタミンの粗結晶(アラニルアラニルグルタミンが0.111%含まれている)を実施例2と同様に水に溶解後、WA30樹脂を用いて分画してから濃縮した。得られた濃縮液を2つに分け、一方には実施例2と同様にメタノールを添加し、他方にはメタノールの変わりにエタノールを用い、エタノール濃度が75%になるまでエタノールを添加する以外は実施例2と同様の方法でL−アラニル−L−グルタミンの結晶を析出させた。
表4に示すとおり、メタノールを用いてL−アラニル−L−グルタミンを晶析することにより、L−アラニル−L−グルタミンの結晶からアラニルアラニルグルタミンを効率的に除去できることが明らかになった。
配列番号39−人工配列の説明:合成DNA
配列番号40−人工配列の説明:合成DNA
配列番号41−人工配列の説明:合成DNA
配列番号42−人工配列の説明:合成DNA
配列番号43−人工配列の説明:合成DNA
配列番号44−人工配列の説明:合成DNA
配列番号45−人工配列の説明:合成DNA
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配列番号64−人工配列の説明:合成DNA
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配列番号71−人工配列の説明:合成DNA
配列番号72−人工配列の説明:合成DNA
Claims (7)
- D−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、および3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドの含量がそれぞれ0.002重量%以下である、L−アラニル−L−グルタミンの結晶。
- D−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドがD−アラニル−L−グルタミンであり、3個以上のアミノ酸からなるポリペプチドがアラニルアラニルグルタミンである、請求項1記載の結晶。
- アミノ酸アミドの含量が0.002重量%以下である、請求項1または2記載の結晶。
- アミノ酸アミドがアラニンアミドである、請求項3記載の結晶。
- L−アラニンまたはL−グルタミンを生産する能力と、以下の[1]〜[3]から選ばれる蛋白質を生産する能力とを有し、かつ、1種類以上のペプチダーゼおよび1種類以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質の活性が低下または喪失している微生物を培地に培養し、該培地中にL−アラニル−L−グルタミンを生成、蓄積させる工程を含む請求項1〜4のいずれか1項に記載の結晶の製造法。
[1]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
[2]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列と少なくとも95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつL−アラニル−L−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質
[3]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつL−アラニル−L−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質 - L−アラニンまたはL−グルタミンを生産する能力、および以下の[1]〜[3]から選ばれる蛋白質
[1]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
[2]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列と少なくとも95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつL−アラニル−L−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質
[3]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつL−アラニル−L−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質
を生産する能力を有し、かつ、1種類以上のペプチダーゼおよび1種類以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質の活性が低下または喪失している微生物を培地に培養し、培養物中にL−アラニル−L−グルタミンを生成、蓄積させた後、以下の[1]または[2]の工程を行うことを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の結晶の製造法。
[1]L−アラニル−L−グルタミンを含む培養物、または該培養物から調製されるL−アラニル−L−グルタミンを含む溶液を加熱処理する工程
[2]L−アラニル−L−グルタミンを含む培養物からL−アラニル−L−グルタミンを含む溶液を調製し、該溶液にメタノールを添加することによりL−アラニル−L−グルタミンの結晶を晶析させる工程 - 以下の[1]〜[3]から選ばれる蛋白質、該蛋白質を生産する能力を有し、かつ、1種類以上のペプチダーゼおよび1種類以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質の活性が低下または喪失している微生物の培養物、または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、L−アラニンおよびL−グルタミンを水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にL−アラニル−L−グルタミンを生成、蓄積させ、該水性媒体からL−アラニル−L−グルタミンを含有する溶液を調製した後、該溶液にメタノールを添加してL−アラニル−L−グルタミンの結晶を晶析させることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の結晶の製造法。
[1]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
[2]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列と少なくとも95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつL−アラニル−L−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質
[3]配列番号1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつL−アラニル−L−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質
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