JP4796495B2 - ジペプチドの製造法 - Google Patents

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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Description

本発明は、１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有し、かつ該１種以上のアミノ酸のうちの少なくとも１種のアミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培地中にジペプチドを生成、蓄積させ、該培地からジペプチドを採取ることを特徴とするジペプチドの製造法に関する。
今日、アミノ酸の多くがいわゆる発酵法によって製造されている（非特許文献１および２参照）。ここでいう発酵法とは、グルコース、酢酸、メタノール、アンモニア、硫酸アンモニア、コーンスティープリカー等の安価な物質からなる培地に微生物を培養し、該微生物の代謝活性を利用して目的のアミノ酸を得る方法を意味する。安価な原料から環境負荷の少ない方法でアミノ酸を製造する方法として発酵法は優れた製法である。
ペプチドの大量合成法については、化学合成法（液相法、固相法）、酵素的合成法およびＤＮＡ組換え法を用いた生物学的合成法が知られている。現在、５０残基以上の長鎖のペプチドに関しては酵素的合成法あるいは生物学的合成法が用いられ、ジペプチドに関しては化学合成法と酵素的合成法が主に用いられている。
化学合成法によるジペプチドの合成では、官能基の保護・脱保護などの操作が必要であり、またラセミ体も合成されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法とはいえない。また、化学合成法は大量の有機溶媒等を使うため環境衛生上も好ましい方法ではない。
酵素法によるジペプチドの合成に関しては、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の逆反応を利用した方法（非特許文献３参照）、耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法（特許文献１〜４参照）、プロリンイミノペプチダーゼの逆反応を利用する方法（特許文献５参照）、非リボゾームペプチドシンセターゼ（以下、ＮＲＰＳと称す）を利用する方法（非特許文献４、５および特許文献６、７参照）が知られている。
しかし、タンパク分解酵素の逆反応を利用した方法では、基質となるアミノ酸の官能基の保護・脱保護が必要であり、ペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解反応の阻止が困難といった問題点がある。耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法には、酵素の発現、目的産物以外の副生反応の阻止が困難という問題点がある。プロリンイミノペプチダーゼを利用する方法では、基質となる片方のアミノ酸のアミド化が必要であるという欠点がある。ＮＲＰＳを利用する方法に関しては、補酵素である４’−ホスフォパンテテイン（４’−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｅ）の供給が必要であり、効率的な製造法とはいえない。
こうした欠点に加え、これらの方法はいずれもアミノ酸もしくはその誘導体を基質として用いるため、製造コストがかさむという欠点を持っている。
一方、酵素分子量がＮＲＰＳより小さく、補酵素である４’−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｅを必要としないγ−グルタミルシステインシンセターゼ（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、グルタチオンシンセターゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ）リガーゼ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ ｌｉｇａｓｅ）、ポリ−γ−グルタミン酸シンセターゼ（ｐｏｌｙ−γ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）等の一群のペプチドシンセターゼも知られている。これらの酵素の殆どはＤ−アミノ酸を基質に用いる、またはγ位のカルボキシル基でのペプチド結合の形成を触媒する等の特徴を有するため、Ｌ−アミノ酸のα位カルボキシル基でペプチド結合するジペプチドの合成に用いることはできない。
また、抗生物質であるアルボノルシン（ａｌｂｏｎｏｕｒｓｉｎ）の生産株として知られているストレプトマイセス・ノウルセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｏｕｒｓｅｉ）ＡＴＣＣ１１４５５株ではＮＲＰＳ酵素とは全く類似性のない蛋白質（ａｌｂＣ遺伝子産物）がシクロ（Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシン）［ｃｙｃｌｏ（Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ）］構造の合成を担っていること、ａｌｂＣ遺伝子を導入したエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）およびストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）の培養液にシクロジペプチドオキシダーゼを作用させるとアルボノルシンが検出されたとの報告はある（非特許文献６参照）が、ａｌｂＣ遺伝子産物が直鎖状のジペプチドを生成するとの報告はない。
Ｌ−アミノ酸のα位カルボキシル基でのペプチド結合形成活性によるジペプチド生成が知られているのはバチルス属に属する微生物由来のジペプチド抗生物質であるバシリシン合成酵素のみである。バシリシン合成酵素は、バシリシン（Ｌ−アラニル−Ｌ−アンチカプシン、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ａｎｔｉｃａｐｓｉｎ）およびＬ−アラニル−Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ）を合成する活性を有することは知られているが、その他のジペプチドの合成活性については知られていない（非特許文献７および８参照）。
一方、全ゲノム情報の解明されたバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８株（非特許文献９参照）におけるバシリシン生合成酵素遺伝子群に関しては、ｙｗｆＡ〜ＦのＯＲＦを含むバシリシンオペロンを増幅するとバシリシンの生産性が増加することが知られている（特許文献８参照）。しかしこれらのＯＲＦの中に２種以上のアミノ酸をペプチド結合で連結する活性を有する蛋白質をコードするＯＲＦが含まれているか、含まれているとすれば、どのＯＲＦが該蛋白質をコードするかについては知られていない。
すなわち、１種以上のアミノ酸からなるジペプチドを発酵生産によって製造する方法はこれまで知られていない。
アミノ酸発酵、学会出版センター、相田 浩ら（１９８６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｖｏｌ．６，Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（１９９６） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１１９，７０７−７２０（１９３７） Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，７，３７３−３８４（２０００） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４９８，４２−４５（２００１） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌ．，９，１３５５−１３６４（２００２） Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２，２０１−２０８（１９８７） Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２９，４００−４０６（２００１） Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６（１９９７） 特開昭５８−１４６５３９号公報 特開昭５８−２０９９９１号公報 特開昭５８−２０９９９２号公報 特開昭５９−１０６２９８号公報 国際公開特許第０３−０１０３０７号パンフレット 米国特許第５７９５７３８号 米国特許第５６５２１１６号 国際公開特許第００−０３００９号パンフレット
本発明の目的は、１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有し、かつ該１種以上のアミノ酸のうちの少なくとも１種のアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を培地に培養し、該培地中にジペプチドを生成、蓄積させ、該培地からジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法を提供することにある。
本発明は、以下の（１）〜（１５）に関する。
（１）１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有し、かつ該１種以上のアミノ酸のうちの少なくとも１種のアミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、該培地中にジペプチドを生成、蓄積させ、該培地からジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法。
（２）１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質が以下の［１］〜［１１］から選ばれる蛋白質である、上記（１）の製造法。
［１］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質
［４］配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質
［５］配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［６］配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質
［７］配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質
［８］非リボゾームペプチドシンセターゼ（以下、ＮＲＰＳと称す）活性を有する蛋白質
［９］配列番号４３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［１０］配列番号４３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質
［１１］配列番号４３で表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質
（３）１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質が以下の［１］〜［８］から選ばれるＤＮＡにコードされる蛋白質である、上記（１）または（２）の製造法。
［１］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［２］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［３］配列番号１８で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号３９または４０で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［５］配列番号３９または４０で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［６］ＮＲＰＳ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［７］配列番号４４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［８］配列番号４４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（４） １種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物が上記（３）の［１］〜［８］から選ばれるＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有する微生物である、上記（１）の製造法。
（５） アミノ酸を生産する能力が以下の［１］〜［５］から選ばれる方法で得られる、上記（１）〜（４）のいずれか１つの製造法。
［１］該アミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法
［２］該アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法
［３］該アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
［４］該アミノ酸の生合成経路から該アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法
［５］野生型株に比べ、該アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
（６）微生物がエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、シュードモナス属またはストレプトマイセス属に属する微生物である、上記（１）〜（５）のいずれか１つの製造法。
（７）エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、シュードモナス属またはストレプトマイセス属に属する微生物がエシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテイルム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィシェンス、バチルス・サチルス、バチルス・メガテリウム、セラチア・マルセッセンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、ストレプトマイセス・セリカラーまたはストレプトミセス・リビダンスである、上記（６）の製造法。
（８） 微生物が１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質（以下、ペプチド取込み蛋白質ともいう）の活性が低下または喪失した微生物である、上記（１）〜（５）のいずれか１つの製造法。
（９） 微生物が、３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失した微生物である上記（１）〜（５）のいずれか１つの製造法。
（１０） ペプチダーゼが配列番号４５〜４８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号４５〜４８のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質である、上記（８）または（９）の製造法。
（１１） ペプチド取込み蛋白質が配列番号４９〜５３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号４９〜５３のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつペプチド取り込み活性を有する蛋白質である、上記（８）または（１０）の製造法。
（１２） 微生物がエシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物である、上記（８）〜（１１）のいずれか１つの製造法。
（１３） エシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物がエシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテイルム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィシェンス、バチルス・サチルスまたはバチルス・メガテリウムである、上記（１２）の製造法。
（１４） アミノ酸がＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−オルニチンおよびＬ−シトルリンから選ばれるアミノ酸である、上記（１）〜（１３）のいずれか１つの製造法。
（１５） ジペプチドが、式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なって、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−オルニチンおよびＬ−シトルリンから選ばれるアミノ酸を表す）で表されるジペプチドである上記（１）〜（１４）のいずれか１つの製造法。
本発明によれば、１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有し、かつ該１種以上のアミノ酸のうちの少なくとも１種のアミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、該培地中にジペプチドを生成、蓄積させ、該培地からジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法を提供することができる。
図１はプラスミドｐＰＥ４３の構築過程を示す図である。 図２はプラスミドｐＱＥ６０ｙｗｆＥの構築過程を示す図である。 図３は、直鎖ジペプチドの合成活性を有する蛋白質の発現プラスミドベクターであるｐＡＬ−ｎｏｕおよびｐＡＬ−ａｌｂの構築過程を示す図である。 図４は、ｙｗｆＥ遺伝子発現強化型ベクターであるｐＰＥ５６の構築過程を示す図である。 図５は、ｙｗｆＥ遺伝子およびａｌｄ遺伝子発現ベクターであるｐＰＥ８６の構築過程を示す図である。 図６は、脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子発現ベクターであるｐＰＨＥＡ２、および脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子と脱感作型ａｒｏＦ遺伝子発現プラスミドベクターであるｐＰＨＥＡＦ２の構築過程を示す図である。
符号の説明
ｙｗｆＥ：バチルス・サチリス１６８株由来のｙｗｆＥ遺伝子
Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロモーター遺伝子
ＰＴ５：Ｔ５プロモーター
Ａｍｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子
ｌａｃＩ ｑ：ラクトースリプレッサー遺伝子
ａｌｂＣ：ａｌｂＣ遺伝子またはａｌｂＣ類似遺伝子
ａｌｄ：ａｌｄ遺伝子
ｐｈｅＡ ｆｂｒ ：脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子
ａｒｏＦ ｆｂｒ ：脱感作型ａｒｏＦ遺伝子
本発明の製造法で用いられる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質は、１種以上のアミノ酸から、同一または異なるアミノ酸がペプチド結合したジペプチドを生成する活性を有する蛋白質であればいずれの蛋白質であってもよく、該蛋白質としては例えば、
［１］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、
［４］配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、
［５］配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［６］配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、
［７］配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、
［８］ＮＲＰＳ活性を有する蛋白質、
［９］配列番号４３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［１０］配列番号４３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、および
［１１］配列番号４３で表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、
などをあげることができる。
本発明においてアミノ酸とは、後述する本発明の製造法で用いられる微生物が生産するアミノ酸であり、好ましくはＬ−アミノ酸およびグリシン、より好ましくはＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリンおよびグリシン、さらに好ましくはＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−α−アミノ酪酸およびグリシンをあげることができる。
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１〜８、３７、３８または４３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号１〜８、３７、３８または４３のいずれかで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
アミノ酸の置換が可能なアミノ酸としては、例えば配列番号１〜８、配列番号３７および３８、または公知のＮＲＰＳと配列番号４３で表されるアミノ酸配列を、それぞれ公知のアライメントソフトウェアを用いて比較したときに、比較したすべてのアミノ酸配列において保存されていないアミノ酸をあげることができる。公知のアライメントソフトウェアとしては、例えば遺伝子解析ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ（ソフトウェア開発株式会社）に含まれるアライメント解析ソフトをあげることができる。該解析ソフトの解析パラメータとしては、デフォルトイ値を用いることができる。
また、アミノ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号１〜８、３７、３８おおび４３のいずれかで表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側をあげることができる。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、本発明の蛋白質が１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有するためには、配列番号１〜８、３７、３８および４３のいずれかで表されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号１で表されるアミノ酸配列との相同性が６５％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有していることが望ましい。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
配列番号１７で表されるアミノ酸配列は、配列番号１〜７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の間で保存されている領域であり、かつ各種微生物のＡｌａ−Ａｌａリガーゼ活性を有する蛋白質のコンセンサス配列に対応する領域である。
配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質であり、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質もまた本発明の製造法で用いられる微生物が生産する蛋白質である。
配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質が、１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質であるためには、該蛋白質のアミノ酸配列と配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が、少なくとも８０％以上、通常は９０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、上記したようにＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡを用いて決定することができる。
上記［１］〜［１１］の蛋白質が、１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて該蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて本発明の蛋白質を製造した後、本発明の蛋白質、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法をあげることができる。
本発明の製造法で用いられるＤＮＡは、１種以上のアミノ酸から、同一または異なるアミノ酸がペプチド結合したジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよく、例えば
［１２］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［１３］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［１４］配列番号１８で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［１５］配列番号３９または４０で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［１６］配列番号３９または４０で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［１７］ＮＲＰＳ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［１８］配列番号４４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および
［１９］配列番号４４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることができる。
上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、配列番号９〜１６、１８、３６、３９、４０または４４のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡの一部、または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．９ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍、好ましくは０．１倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等を用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号９〜１６、１８、３６、３９、４０または４４のいずれかで表される塩基配列と少なくとも７５％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
また、ハイブリダイゼーションに供するＤＮＡ試料としては、例えば配列番号９〜１６、１８、３６、３９、４０または４４のいずれかで表される塩基配列をその染色体ＤＮＡ上に有する微生物と同属、好ましくは同種に属する微生物の染色体ＤＮＡをあげることができる。
配列番号９〜１６、１８、３６、３９、４０または４４のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、例えば上記したように、組換えＤＮＡ法を用いて該ＤＮＡにコードされる蛋白質を製造し、該蛋白質の活性を測定することにより確認することができる。
（ｉ）本発明の製造法に用いられるＤＮＡの調製
本発明の製造法に用いられるＤＮＡは、
（ａ）配列番号９〜１６および３６で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、微生物、好ましくはバチルス属に属する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または配列番号９〜１６および３６で表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはバチルス属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］、
（ｂ）配列番号３９または４０で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、微生物、好ましくはストレプトマイセス属に属する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または配列番号３または４で表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはストレプトマイセス属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ、および
（ｃ）公知のＮＲＰＳをコードするＤＮＡ、例えばＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０，４５５５（２００３）、特表２００３−５１２８３５、米国特許５７９５７３８もしくは米国特許５６５２１１６に記載されているＮＲＰＳをコードするＤＮＡ、または配列番号４４で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、微生物、好ましくはバチルス属、ストレプトマイセス属、シュードモナス属またはキサントモナス属等に属する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または上記したＮＰＲＳをコードするＤＮＡの塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはバチルス属、ストレプトマイセス属、シュードモナス属またはキサントモナス属等に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得することができる。
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１〜８、１７、３７、３８および４３のいずれかで表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法により本発明の製造法に用いられるＤＮＡを取得することもできる。
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号９〜１６、３６、３９、４０および４４で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
上記したＤＮＡを組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲ ＩＩ（インビトロジェン社製）およびｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
上記宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などをあげることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＭＣ１０００、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ １２４３５、エシェリヒア・コリＷ１４８５、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＮｏ．４９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＮＹ４９、エシェリヒア・コリＭＰ３４７、エシェリヒア・コリＮＭ５２２、エシェリヒア・コリＭＥ８４１５等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の製造法に用いられるＤＮＡを保有する微生物としては、例えば配列番号１で表される配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有する微生物であるエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＰＥ４３をあげることができる。
（ｉｉ）アミノ酸を生産する能力を有する微生物の調製
本発明のジペプチドの製造法で用いられるアミノ酸を生産する能力を有する微生物は、１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、該微生物としては自然界から分離された株自身が該能力を有する場合は該株そのもの、公知の方法により所望のジペプチドを構成するアミノ酸のうちの少なくとも１種のアミノ酸を生産する能力を人為的に付与した微生物などをあげることができる。
当該公知の方法としては、
（ａ）アミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
（ｂ）アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）アミノ酸の生合成経路から該アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
（ｅ）野生型株に比べ、アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。
上記（ａ）については、例えばＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１０５−１１１（１９７９）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１０，７６１−７６３（１９７２）およびＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３９，３１８−３２３（１９９３）などに、上記（ｂ）については、例えばＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１０５−１１１（１９７９）およびＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１０，７６１−７６３（１９７２）などに、上記（ｃ）については、例えばＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３９，３１８−３２３（１９９３）およびＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９，３７１−３７７（１９８７）などに、上記（ｄ）については、例えばＡｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．，３８，１８１−１９０（１９７９）およびＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４２，１７７３−１７７８（１９７８）などに、上記（ｅ）については、例えばＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６，１６７５−１６８４（１９７２）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４１，１０９−１１６（１９７７）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，２０１３−２０２３（１９７３）およびＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，２０８９−２０９４（１９８７）などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。
さらに上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか、または組み合わせた方法によるアミノ酸を生産する能力を有する微生物の調製方法については、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｖｏｌ．６，Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９９６）ｓｅｃｔｉｏｎ １４ａ，１４ｂやＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７９，１−３５（２００３）、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田 浩ら（１９８６）に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生産する能力を有する微生物の調製方法は、特開２００３−１６４２９７、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９，１５３−１６０（１９７５）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９，１１４９−１１５３（１９７５）、特開昭５８−１３５９９、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４，２７２−２８３（１９５８）、特開昭６３−９４９８５、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，２０１３−２０２３（１９７３）、ＷＯ９７／１５６７３、特開昭５６−１８５９６、特開昭５６−１４４０９２および特表２００３−５１１０８６など数多くの報告があり、上記文献等を参照することにより１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。
上記方法によって調製することができるアミノ酸を生産する能力を有する微生物としては、例えばＬ−グルタミン生産菌として、ｇｌｎＥ遺伝子および／またはｇｌｎＢ遺伝子が欠損した微生物、Ｌ−アラニン生産菌として、アラニン脱水素酵素遺伝子（ａｌｄ遺伝子）の発現が強化された微生物、Ｌ−プロリン生産微生物として、フェニルアラニンの脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子および／またはチロシンの脱感作型ａｒｏＦ遺伝子を発現する微生物などをあげることができる。
上記したアミノ酸を生成、蓄積する微生物としては、上記（ａ）〜（ｅ）の方法が適用することができる微生物または上記遺伝的形質を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌をあげることができる。
原核生物としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）属、アナシスティス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）属、アスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フォルミディウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シネコッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリ、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・リケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アナベナ・シリンドリカ（Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）、アナベナ・ドリオルム（Ａｎａｂａｅｎａ ｄｏｌｉｏｌｕｍ）、アナベナ・フロスアクア（Ａｎａｂａｅｎａｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ）、アースロバクター・オーレッセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、アースロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）、アースロバクター・グロブフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）、アースロバクター・ミソレンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｍｙｓｏｒｅｎｓ）、アースロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、アースロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ）、アースロバクター・スルフレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、クロマチウム・ブデリ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｂｕｄｅｒｉ）、クロマチウム・テピダム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、クロマチウム・ワーミンギ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｗａｒｍｉｎｇｉｉ）、クロマチウム・フルビアタティレ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｅ）、エルビニア・ウレドバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）、エルビニア・カロトバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルビニア・アナス（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｎａｎａｓ）、エルビニア・ヘリコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、エルビニア・パンクタタ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）、エルビニア・テレウス（Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｅｒｒｅｕｓ）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｏｄｅｓｉａｎｕｍ）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、フォルミディウム・エスピー（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ ｓｐ．）ＡＴＣＣ２９４０９、ロドバクター・カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｌａｓｔｉｃａ）、ロドシュードモナス・マリナ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｉｎａ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドスピリウム・リブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ）、ロドスピリウム・サリナラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ラメウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｅｕｓ）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｎａｃｅｕｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）等をあげることができ、好ましい原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属またはストレプトマイセス属等に属する細菌、例えば上記したエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属またはストレプトマイセス属等に属する種をあげることができ、より好ましい細菌としてはエシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテリウム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィシェンス、バチルス・サチルス、バチルス・メガテリウム、セラチア・マルセッセンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、ストレプトマイセス・セリカラーまたはストレプトミセス・リビダンスをあげることができ、特に好ましくはエシェリヒア・コリをあげることができる。
アミノ酸を生産する微生物の具体例としては、Ｌ−グルタミン生産株としてエシェリヒア・コリＪＧＬＥ１およびエシェリヒア・コリＪＧＬＢＥ１など、Ｌ−アラニン生産株としてａｌｄ遺伝子発現プラスミドを保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１株など、Ｌ−フェニルアラニン生産株としてｐＰＨＥＡ２および／またはａｒｏＦ遺伝子発現プラスミドを保有するエシェリヒア・コリＪＭ１０１株など、Ｌ−グルタミンおよびＬ−アラニン生産株としてａｌｄ遺伝子発現プラスミドを保持するエシェリヒア・コリＪＧＬＥ１およびエシェリヒア・コリＪＧＬＢＥ１など、Ｌ−アラニンおよびＬ−フェニルアラニン生産株としてａｌｄ遺伝子発現プラスミドおよび脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子および／または脱感作型ａｒｏＦ遺伝子発現プラスミドを保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１など、Ｌ−スレオニンおよびＬ−フェニルアラニン生産株として脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子および／または脱感作型ａｒｏＦ遺伝子発現プラスミドを保持するＡＴＣＣ２１２７７株などをあげることができる。
さらに、アミノ酸を生産する能力を有する微生物の具体的例としては、Ｌ−グルタミン酸生産株としてＦＥＲＭ ＢＰ−５８０７およびＡＴＣＣ１３０３２など、Ｌ−グルタミン生産株としてＦＥＲＭ Ｐ−４８０６およびＡＴＣＣ１４７５１など、Ｌ−スレオニン生産株としてＡＴＣＣ２１１４８、ＡＴＣＣ２１２７７およびＡＴＣＣ２１６５０など、Ｌ−リジン生産株としてＦＥＲＭ Ｐ−５０８４およびＡＴＣＣ１３２８６など、Ｌ−メチオニン生産株としてＦＥＲＭ Ｐ−５４７９、ＶＫＰＭ Ｂ−２１７５およびＡＴＣＣ２１６０８など、Ｌ−イソロイシン生産株としてＦＥＲＭ ＢＰ−３７５７およびＡＴＣＣ１４３１０など、Ｌ−バリン生産株としてＡＴＣＣ１３００５およびＡＴＣＣ１９５６１など、Ｌ−ロイシン生産株としてＦＥＲＭ ＢＰ−４７０４およびＡＴＣＣ２１３０２など、Ｌ−アラニン生産株としてＦＥＲＭ ＢＰ−４１２１およびＡＴＣＣ１５１０８など、Ｌ−セリン生産株としてＡＴＣＣ２１５２３およびＦＥＲＭ ＢＰ−６５７６など、Ｌ−プロリン生産株としてＦＥＲＭ ＢＰ−２８０７およびＡＴＣＣ１９２２４など、Ｌ−アルギニン生産株としてＦＥＲＭ Ｐ−５６１６およびＡＴＣＣ２１８３１など、Ｌ−オルニチン生産株としてＡＴＣＣ１３２３２など、Ｌ−ヒスチジン生産株としてＦＥＲＭ ＢＰ−６６７４およびＡＴＣＣ２１６０７など、Ｌ−トリプトファン生産株としてＤＳＭ１０１１８、ＤＳＭ１０１２１、ＤＳＭ１０１２３およびＦＥＲＭ ＢＰ−１７７７など、Ｌ−フェニルアラニン生産株としてＡＴＣＣ１３２８１およびＡＴＣＣ２１６６９など、Ｌ−チロシン生産株としてＡＴＣＣ２１６５２など、Ｌ−システイン生産株としてＷ３１１０／ｐＨＣ３４（特表２００３−５１１０８６記載）など、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン生産株としてＷＯ９６／２７６６９記載のエシェリヒア・コリＳＯＬＲ／ｐＲＨ７１など、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン生産株としてＦＥＲＭ ＢＰ−５０２６およびＦＥＲＭ ＢＰ−５４０９など、Ｌ−シトルリン生産株としてＦＥＲＭ Ｐ−５６４３およびＦＥＲＭ Ｐ−１６４５などをあげることができる。
なお、上記のＦＥＲＭ番号で表される菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ（日本）、ＡＴＣＣ番号で表される菌株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国）、ＶＫＰＭ番号で表される菌株は、Ｒｕｓｓｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ロシア）、ＤＳＭ番号で表される菌株はＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ドイツ）からそれぞれ入手することができる。
（ｉｉｉ）１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有し、かつ該１種以上のアミノ酸のうちの少なくとも１種のアミノ酸を生産する能力を有する微生物の調製
１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有し、かつ該１種以上のアミノ酸のうちの少なくとも１種のアミノ酸を生産する能力を有する微生物は、
（ａ）上記（ｉｉ）の方法で調製することができる１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物に、上記（ｉ）の方法で調製することができる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを導入する方法、
（ｂ）上記（ｉ）の方法で調製することができる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを導入した微生物に、上記（ｉｉ）の方法により１種以上のアミノ酸を生産する能力を付与する方法、
（ｃ）元来１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物に、上記（ｉ）の方法により１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを導入する方法、または
（ｄ）元来１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物に、上記（ｉｉ）の方法により１種以上のアミノ酸を生産する能力を付与する方法、
などにより調製することができる。
上記（ｉ）の方法で調製することができる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを微生物に導入することにより、該微生物に１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を付与することができる。微生物に１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を付与する方法としては、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記（ｉ）の方法で調製したＤＮＡを宿主細胞中で発現させる方法をあげることができる。
上記（ｉ）の方法で調製したＤＮＡをもとにして、必要に応じて、蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることができる。
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、該蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できる微生物であればいずれも用いることができ、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌をあげることができる。好ましい原核生物としては上記（ｉｉ）の原核生物をあげることができる。
該微生物は、１種以上のアミノ酸を生産する能力を有していてもよいし、該能力を有していなくてもよい。該能力を有していない微生物を宿主細胞として用いた場合は、上記方法で得られる組換え体ＤＮＡを下記の方法により該微生物に導入して形質転換体を調製した後、上記（ｉｉ）の方法により該形質転換体に１以上のアミノ酸を生産する能力を付与することにより、本発明の製造法で用いられる微生物を取得することができる。
発現ベクターとしては、微生物の細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明の製造法に用いられるＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の製造法に用いられるＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明の製造法に用いられるＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、ｐＷＨ１５２０（ＭｏＢｉＴｅｃ社製）、ｐＣＳ２９９Ｐ（ＷＯ ００／６３３８８）、ｐＶＬＴ３１［Ｇｅｎｅ，１２３，１７（１９９３）］およびｐＩＪ７０２（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）等を例示することができる。
エシェリヒア属に属する微生物を宿主細胞として用いる場合、プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ内で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐ ｔｒｐ ）、ｌａｃプロモーター（Ｐ ｌａｃ ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるためのｘｙｌＡプロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３５，５９４−５９９（１９９１）］、コリネバクテリウム属に属する微生物中で発現させるためのＰ５４−６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，６７４−６７９（２０００）］、シュードモナス属に属する微生物中で発現させるためのｔａｃプロモーター［Ｇｅｎｅ，１２１，１７−２４（１９９３）］、ストレプトマイセス属に属する微生物中で発現させるためのｘｙｌＡプロモーター（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の製造法に用いられるＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えばｐＰＥ４３をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの微生物細胞への導入方法としては、該細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
また、上記（ｃ）の方法で用いられる、元来１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物としては、上記（ｉｉ）のアミノ酸を生産する能力を有する公知の菌株などをあげることができる。
また、上記（ｄ）の方法で用いられる、元来１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、（Ａ）バチルス属に属する微生物、より好ましくはバシリシン合成活性を有するバチルス属に属する微生物、さらに好ましくはバチルス・サチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウムおよびバチルス・プミルスからなる群より選ばれる種に属する微生物、最も好ましくは、バチルス・サチリスＡＴＣＣ１５２４５、バチルス・サチリスＡＴＣＣ６６３３、バチルス・サチリスＩＡＭ１２１３、バチルス・サチリスＩＡＭ１１０７、バチルス・サチリスＩＡＭ１２１４、バチルス・サチリスＡＴＣＣ９４６６、バチルス・サチリスＩＡＭ１０３３、バチルス・サチリスＡＴＣＣ２１５５５、バチルス・アミロリケファシエンス ＩＦＯ３０２２およびバチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５からなる群より選ばれる株である微生物、および（Ｂ）ストレプトマイセス属に属する微生物、好ましくはアルボノルシンを生産する能力を有するストレプトマイセス属に属する微生物、より好ましくはストレプトマイセス・アルボラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ）またはストレプトマイセス・ノウルセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｏｕｒｓｅｉ）に属する微生物をあげることができる。
（ｉｖ）ペプチダーゼおよびペプチド取り込み活性を有する蛋白質の活性が低下または喪失した微生物
本発明の製造法に用いられる微生物としては、上記（ｉｉｉ）の方法により調製される微生物において、１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み蛋白質の活性が低下または喪失した微生物、または３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失した微生物をあげることができる。
該微生物は、例えば（ａ）１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み蛋白質の機能が低下または喪失した微生物、または３種以上のペプチダーゼの機能が低下または喪失した微生物に、上記（ｉｉｉ）の方法により１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力、および該１種以上のアミノ酸のうちの少なくとも１種のアミノ酸を生産する能力を付与する方法、（ｂ）上記（ｉｉｉ）の方法により調製することができる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力、および該１種以上のアミノ酸のうちの少なくとも１種のアミノ酸を生産する能力を有する微生物の、ａ）１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み蛋白質、またはｂ）３種以上のペプチダーゼ、の機能を低下または喪失させる方法等により取得することができる。
１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み蛋白質の活性が低下または喪失した微生物としては、該微生物が正常に生育できる限りにおいて、任意の１種以上のペプチダーゼおよび任意の１種以上のペプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物をあげることができ、好ましくは１種以上９種以下、より好ましくは１種以上７種以下、さらに好ましくは１種以上４種以下のペプチダーゼの活性が低下または喪失しており、かつ好ましくは１種以上５種以下、より好ましくは１種以上３種以下、さらに好ましくは１種以上２種以下、特に好ましくは１種のペプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。
該微生物としては、より具体的には、該微生物のゲノムＤＮＡ上に存在するペプチダーゼをコードする遺伝子（以下、ペプチダーゼ遺伝子と略す）およびペプチド取り込み蛋白質をコードする遺伝子（以下、ペプチド取り込み蛋白質遺伝子）のうち、１種以上のペプチダーゼ遺伝子の塩基配列および１種以上のペプチド取り込み蛋白質遺伝子の塩基配列において、該塩基配列の全部または一部が欠失しているため、または該塩基配列中に塩基の置換または付加があるために該ペプチダーゼおよび該ペプチド取り込み蛋白質の活性が低下または喪失した微生物をあげることができる。
ペプチダーゼの活性が低下しているとは、上記した塩基の欠失、置換または付加がない遺伝子がコードするペプチダーゼに比べ、ペプチド分解活性が低くなっていることいい、通常は８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは５％以下に低下していることをいう。
微生物のペプチド分解活性は、基質となるペプチドと微生物菌体とを水性媒体中に共存せしめ、ペプチド分解反応を行った後、残存しているペプチド量を公知の方法、例えばＨＰＬＣなどを用いた分析法によって定量することにより測定することができる。
上記ペプチダーゼとしては、ペプチド分解活性を有する蛋白質であればいずれでもよく、好ましくはジペプチド分解活性が高い蛋白質、より好ましくはジペプチダーゼをあげることができる。
より具体的なペプチダーゼとしては、例えばエシェリヒア・コリに存在する、配列番号４５で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＡ、配列番号４６で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＢ、配列番号４７で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＤ、配列番号４８で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＮ、ＰｅｐＰ［ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．（以下、ＧｅｎＢａｎｋと略す）ＡＡＣ７５９４６］、ＰｅｐＱ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６８５０）、ＰｅｐＥ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６９９１）、ＰｅｐＴ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４２１１）、Ｄｃｐ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４６１１）およびＩａｄＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７７２８４）など、バチルス・サチリスに存在するＡｍｐＳ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０１２２８５）、ＰｅｐＴ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ９９３３９）、ＹｂａＣ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ９９１０４）、ＹｃｄＤ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ９９１０５）、ＹｊｂＧ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ９９１１０）、ＹｋｖＹ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ９９１１１）、ＹｑｊＥ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ９９１１６）、ＹｗａＤ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ９９１２３）など、コリネバクテリウム・グルタミカムに存在するＢＡＢ９７７３２、ＢＡＢ９７８５８、ＢＡＢ９８０８０、ＢＡＢ９８８８０、ＢＡＢ９８８９２、ＢＡＢ９９０１３、ＢＡＢ９９５９８およびＢＡＢ９９８１９（いずれも日本ＤＮＡデータバンクの登録番号）で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質などをあげることができ、ジペプチダーゼとしては、配列番号４５〜４８で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＡ、ＰｅｐＢ、ＰｅｐＤおよびＰｅｐＮ、並びにＰｅｐＱ、ＰｅｐＥ、ＩａｄＡをあげることができる。また、配列番号４５〜４８のいずれかのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質もジペプチド分解活性が高い蛋白質としてあげることができる。アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等を用いて決定することができる。
また、ペプチド取り込み蛋白質の活性が低下しているとは、上記した塩基の欠失、置換または付加がない遺伝子がコードするペプチド取り込み蛋白質に比べ、ペプチド取り込み活性が低くなっていることいい、通常は８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは５％以下に低下していることをいう。
微生物のペプチド取り込み活性は、基質となるペプチドと微生物菌体とを水性媒体中に共存せしめ、ペプチド取り込み反応を行った後、水性媒体中に残存しているペプチド量を公知の方法、例えばＨＰＬＣなどを用いた分析法によって定量することにより測定することができる。
上記ペプチド取り込み蛋白質としては、染色体ＤＮＡ上でオペロンを形成する遺伝子にコードされている蛋白質であり、細胞膜上で複合体を形成してペプチド取り込み活性を発現する蛋白質、および単独の蛋白質としてペプチド取り込み活性を有する蛋白質など、微生物のペプチド取り込みに関与している蛋白質であればいずれでもよく、好ましくはジペプチド取り込み活性が高い蛋白質をあげることができる。
より具体的なペプチド取り込み蛋白質としては、例えばエシェリヒア・コリに存在する配列番号４９で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＡ、配列番号５０で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＢ、配列番号５１で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＣ、配列番号５２で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＤ、配列番号５３で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＦ、ＯｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６５６９）、ＯｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６５６８）、ＯｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６５６７）、ＯｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６５６６）、ＯｐｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６５６５）、ＹｄｄＯ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４５５６）、ＹｄｄＰ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４５５７）、ＹｄｄＱ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４５５８）、ＹｄｄＲ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４５５９）、ＹｄｄＳ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４５６０）、ＹｂｉＫ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７３９１５）、ＭｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４４１１）、ＳａｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４３７６）、ＳａｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４３７５）、ＳａｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４３７４）、ＳａｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４３７３）、およびＳａｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４３７２）など、バチルス・サチリスに存在するＤｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ４０００２）、ＤｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ４０００３）、ＤｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ４０００４）、ＤｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ４０００５）、ＤｐｐＥ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ４０００６）、ＯｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ３９７８７）、ＯｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ３９７８８）、ＯｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ３９７８９）、ＯｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ３９７９０）、ＯｐｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ３９７９１）、ＡｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ６２３５８）、ＡｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ６２３５９）、ＡｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ６２３６０）、ＡｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ６２３５６）、ＡｐｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ６２３５７）、ＹｃｌＦ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＢ１２１７５）およびＹｋｆＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＢ１３１５７）など、コリネバクテリウム・グルタミカムに存在するＢＡＢ９９０４８、ＢＡＢ９９３８３、ＢＡＢ９９３８４、ＢＡＢ９９３８５、ＢＡＢ９９７１３、ＢＡＢ９９７１４、ＢＡＢ９９７１５、ＢＡＢ９９８３０、ＢＡＢ９９８３１、ＢＡＢ９９８３２（いずれも日本ＤＮＡデータバンクの登録番号）で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質などをあげることができ、また、ジペプチド取り込み活性が高い蛋白質としては、配列番号４９〜５３で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＡ、ＤｐｐＢ、ＤｐｐＣ、ＤｐｐＤ、ＤｐｐＦおよびそれらいずれかのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する蛋白質もペプチド取り込み活性が高いペプチド取り込み蛋白質としてあげることができる。
上記アミノ酸配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物としては、該微生物が正常に生育できる限りにおいて、任意の３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物をあげることができ、好ましくは３種以上９種以下、より好ましくは３種以上６種以下、さらに好ましくは３種または４種のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。
具体的なペプチダーゼとしては、上記したエシェリヒア・コリ、バチルス・サチリスおよびコリネバクテリウム・グルタミカムに存在するペプチダーゼおよびジペプチダーゼをあげることができる。また、配列番号４５〜４８のいずれかのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質もジペプチド分解活性が高い蛋白質としてあげることができる。
上記アミノ酸配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
（ｖ）ペプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質の活性が低下または喪失した微生物の調製
ペプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質の活性が低下または喪失した微生物は、該微生物を取得できる方法であれば、その取得方法に制限はないが、例えば以下に示す微生物の染色体ＤＮＡのペプチダーゼ遺伝子やペプチド取り込み蛋白質遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法により取得することができる。
微生物の染色体ＤＮＡの遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を、塩基の欠失等を導入したい宿主細胞内では自立複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができる。
該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、薬剤耐性を指標にして相同組換えによって染色体ＤＮＡ上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株を選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜１日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体ＤＮＡ上において２回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。染色体ＤＮＡ上の欠失等を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことを確認することができる。
上記方法により、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入することができる微生物としては、例えばエシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができる。
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換または付加を導入する相同組換えを利用した方法としては、直鎖ＤＮＡを用いた方法をあげることができる。
具体的には、塩基の欠失、置換または付加を導入したい遺伝子を含有する直鎖ＤＮＡを細胞内に取り込ませ、染色体ＤＮＡと導入した直鎖ＤＮＡとの間で相同組換えが起こさせる方法である。本方法は、直鎖ＤＮＡを効率よく取り込む微生物であれば、いずれの微生物にも適用でき、好ましい微生物としてはエシェリヒア属またはバチルス属に属する微生物、より好ましくはエシェリヒア・コリ、さらに好ましくはλファージ由来の組換えタンパク質群（Ｒｅｄ組換え系）を発現しているシェリヒア・コリをあげることができる。
λＲｅｄ組換え系を発現しているエシェリヒア・コリとしては、λＲｅｄ組換え系遺伝子を有するプラスミドＤＮＡであるｐＫＤ４６［エシェリヒア・コリ ジェネティック ストックセンター（米国エール大学）より入手可能］を保有するエシェリヒア・コリＪＭ１０１株等をあげることができる。
相同組換えに用いられるＤＮＡとしては、
（ａ）塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡに位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、薬剤耐性遺伝子の両端に有する直鎖ＤＮＡ、
（ｂ）塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを直接連結した直鎖ＤＮＡ、
（ｃ）薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を有するＤＮＡの両端に、塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを有する直鎖ＤＮＡ、
（ｄ）上記（ａ）の直鎖ＤＮＡにおいて、薬剤耐性遺伝子と染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡの間に、さらに酵母由来のＦｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２，５８７５（１９８５）〕が認識する塩基配列を有するＤＮＡ、
をあげることができる。
薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付与する薬剤耐性遺伝子であれば、いずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる。宿主微生物にエシェリヒア・コリを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子等をあげることができる。
ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のことをいい、該遺伝子としては例えば、バチルス属に属する微生物由来のｓａｃＢ遺伝子〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９，１３６１−１３６６（１９９３）〕、およびエシェリヒア属に属する微生物由来のｒｐｓＬ遺伝子〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，７２，９９−１０４（２００１）〕等をあげることができる。
上記の直鎖ＤＮＡの両末端に存在する、染色体ＤＮＡ上の置換または欠失の導入対象となる領域の両端の外側に存在するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡは、直鎖ＤＮＡにおいて、染色体ＤＮＡ上の方向と同じ方向に配置され、その長さは１０ｂｐ〜１００ｂｐ程度が好ましく、２０ｂｐ〜５０ｂｐ程度がより好ましく、３０〜４０ｂｐ程度がさらに好ましい。
酵母由来のＦｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号５４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および該ＤＮＡにおいて１個〜数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来のＦｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識し、相同組換えを触媒する塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
相同性を有するとは、上記直鎖ＤＮＡが、染色体ＤＮＡ上の目的とする領域において、相同組換えが起こる程度の相同性を有することであり、具体的な相同性としては、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは１００％の相同性をあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
上記直鎖ＤＮＡは、ＰＣＲにより作製することができる。また上記直鎖ＤＮＡを含むＤＮＡをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖ＤＮＡを得ることもできる。
微生物の染色体ＤＮＡに塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、以下の方法１〜４があげられる。
方法１：上記（ａ）または（ｄ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。
方法２：上記方法１により取得された形質転換株に、上記（ｂ）の直鎖ＤＮＡを導入し、該方法により染色体ＤＮＡ上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体ＤＮＡ上の領域を置換または欠失させる方法。
方法３：
［１］上記（ｃ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］染色体ＤＮＡ上の置換または欠失の対象領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、染色体ＤＮＡ上における方向と同一の方向で連結したＤＮＡを合成し、上記［１］で得られた形質転換株に導入する、
［３］ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記［２］の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体ＤＮＡ上から削除された株として選択する方法。
方法４：
［１］上記（ｄ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］上記［１］で得られた形質転換株にＦｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子発現プラスミドを導入し、該遺伝子を発現させた後、上記［１］で用いた薬剤に感受性である株を取得する方法。
上記方法で用いられる、直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入する方法としては、該微生物へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕等をあげることができる。
方法２または方法３［２］で用いられる直鎖ＤＮＡにおいて、該ＤＮＡの中央部付近に、染色体ＤＮＡ上に挿入したい任意の遺伝子を組み込こんだ直鎖ＤＮＡを用いることにより、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体ＤＮＡ上に挿入することができる。
上記方法２〜４では、最終的に得られる形質転換株の染色体ＤＮＡ上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法であるため、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、該方法の操作を繰り返すことにより、容易に染色体ＤＮＡ上の位置の異なる２以上の領域に塩基の欠失、置換または付加を有する微生物を製造することができる。
（ｖｉ）本発明のジペプチドの製造法
上記（ｉｉｉ）および（ｖ）の方法により得られる微生物を培地に培養し、培養物中にジペプチドを生成、蓄積させ、該培養物からジペプチドを採取することにより、ジペプチドを製造することができる。
該微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
すなわち、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。
該培地には、目的とするジペプチドを構成するアミノ酸が含まれる必要はないが、天然培地、またはアミノ酸要求性株を培養するための培地には該アミノ酸が含まれている場合もある。本発明の製造法に用いられる培地には、本発明で用いられる微生物が、その成育に必要とする量のアミノ酸が含まれていてもよい。すなわち、通常の培地に含まれるアミノ酸の量は、本発明の製造法で用いられる微生物によって生産される該アミノ酸の量に比べ非常に少ないので、通常の培地に含まれる該アミノ酸の量は、該アミノ酸の有無により、本願発明により製造されるジペプチドの生産量が変わるほどの量ではなく、よって本発明の製造法に用いられる培地にはその程度の該アミノ酸が含まれていてもよい。
本発明に用いられる培地に含まれるアミノ酸量としては、例えば天然培地あれば通常は２．５ｇ／Ｌ未満、好ましくは０．５ｇ／Ｌ以下、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは２０ｍｇ／Ｌ以下の該アミノ酸、合成培地であれば通常は１ｇ／Ｌ以下、好ましくは５０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以下の該アミノ酸は含まれていてもよい。ただし、本願発明の製造法により、２種の異なるアミノ酸からなるジペプチドを製造する場合であって、用いられる微生物が該ジペプチドを構成するアミノ酸うちの１種のアミノ酸を生産する能力しか有していない場合、本発明で用いられる培地に、該微生物が生産することができない残りの１種のアミノ酸を添加してもよい。このとき添加するアミノ酸の量は、通常０．５ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは２ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌである。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
上記方法で製造されるジペプチドとしては、１種または２種のアミノ酸がα結合したジペプチドをあげることができ、好ましくは該アミノ酸がＬ−アミノ酸またはグリシンであるジペプチド、より好ましくは、式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
で表されるジペプチドにおいてＲ１およびＲ２が同一または異なって、Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ）、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、Ｌ−バリン（Ｌ−Ｖａｌ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ｌｅｕ）、Ｌ−イソロイシン（Ｌ−Ｉｌｅ）、Ｌ−プロリン（Ｌ−Ｐｒｏ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）、Ｌ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｐ）、Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ｍｅｔ）、Ｌ−セリン（Ｌ−Ｓｅｒ）、Ｌ−スレオニン（Ｌ−Ｔｈｒ）、Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）、Ｌ−アスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）、Ｌ−チロシン（Ｌ−Ｔｙｒ）、Ｌ−リジン（Ｌ−Ｌｙｓ）、Ｌ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−Ａｓｐ）、Ｌ−α−アミノ酪酸（Ｌ−α−ＡＢ）、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン（Ｌ−４−ＨＹＰ）、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン（Ｌ−３−ＨＹＰ）、Ｌ−オルニチン（Ｌ−Ｏｒｎ）およびＬ−シトルリン（Ｌ−Ｃｉｔ）から選ばれるアミノ酸であるジペプチド、さらに好ましくはＲ１がＬ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＳｅｒまたはＬ−Ｔｈｒの場合は、Ｒ２がＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、Ｌ−４−ＨＹＰ、Ｌ−３−ＨＹＰ、Ｌ−ＯｒｎまたはＬ−Ｃｉｔであるジペプチド、特に好ましくは、Ｒ１がＬ−Ａｌａの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−α−ＡＢまたはＬ−Ｃｉｔであるジペプチド、Ｒ１がＧｌｙの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−α−ＡＢまたはＬ−Ｃｉｔであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｍｅｔの場合は、Ｒ２はＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＬｙｓまたはＬ−Ｈｉｓであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｓｅｒの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＨｉｓまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｔｈｒの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＴｈｒまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｇｌｎの場合は、Ｒ２はＬ−ＰｈｅまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｐｈｅの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｔｒｐの場合は、Ｒ２はＧｌｙであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｃｙｓの場合は、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、またはＬ−Ｍｅｔであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｌｙｓの場合は、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬ−Ｍｅｔであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ａｒｇの場合は、Ｒ２はＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｈｉｓである場合は、Ｒ２はＬ−Ｍｅｔであるジペプチド、およびＲ１がＬ−α−ＡＢの場合は、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−ＡｒｇまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチドをあげることができ、最も好ましくはＬ−アラニル−Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅ）、Ｌ−スレオニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ｐｈｅ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｔｙｒ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｍｅｔ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−バリン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｖａｌ）、Ｌ−アラニル−イソロイシン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｉｌｅ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ）およびＬ−セリニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｐｈｅ）をあげることができる。
培養物中に生成、蓄積したジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
以下に、１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ取得法等の実験例を示すが、該ＤＮＡの取得法等は該実験例に限定されるものではない。
実験例１ データベースを利用したジペプチド合成活性を有する蛋白質の検索
バチルス・サチリス１６８株由来のＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼ遺伝子のアミノ酸配列［Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６（１９９７）］をクエリーとして、バチルス・サチリス１６８株のゲノムＤＮＡのデータベースであるＳｕｂｔｉｌｉｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ／）のホモロジー検索機能を用いて、バチルス・サチリス１６８株のゲノムＤＮＡ配列中に存在する相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子を検索した。
その結果抽出された配列のうち、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼモチーフ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１６７３（１９９１）］である配列番号３３、３４または３５で表されるアミノ酸配列をコードし、かつ既にその機能が同定されている蛋白質をコードする遺伝子を排除したもののうち、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼモチーフと最も高い相同性（２９．１％）を示すものとして機能未知遺伝子ｙｗｆＥを選択した。
ｙｗｆＥの塩基配列を配列番号９、該塩基配列にコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１に示した。
実験例２ ｙｗｆＥ遺伝子発現株の造成
実験例１で得られた塩基配列情報に従い、バチルス・サチリスのｙｗｆＥ遺伝子断片を以下のようにして取得した。
まず、バチルス・サチリス１６８株（ＡＴＣＣ ２３８５７）をＬＢ培地［１０ｇ／ｌバクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇ／ｌイーストエキス（ディフコ社製）、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム］に植菌し３０℃で一晩静置培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の飽和フェノールを用いる方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
パーセプティブ・バイオシステムズ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号１９〜２２で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＡ、プライマーＢ、プライマーＣおよびプライマーＤと呼ぶ）を合成した。プライマーＡは、バチルス・サチリスの染色体ＤＮＡのｙｗｆＥの開始コドンを含む領域の５’末端にＸｈｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＢは、ｙｗｆＥの終止コドンを含む配列と相補的な塩基配列の５’末端にＢａｍＨＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。またプライマーＣは、ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製］のｔｒｐプロモーター領域の塩基配列の５’末端にＥｃｏＲＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＤは、ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０のｔｒｐプロモーター領域の配列と相補的な配列の５’末端にＸｈｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
ｙｗｆＥ遺伝子断片の増幅には上記のプライマーＡおよびプライマーＢ、鋳型としてバチルス・サチリスの染色体ＤＮＡを用い、ｔｒｐプロモーター領域の断片の増幅にはプライマーＣおよびプライマーＤ、鋳型としてｐＴｒＳ３０を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、鋳型として０．１μｇの染色体ＤＮＡまたは１０ｎｇのｐＴｒＳ３０、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製）、各２００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）を含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、プライマーＡおよびプライマーＢを用いたＰＣＲではｙｗｆＥ遺伝子断片に相当する約１．４ｋｂ、プライマーＣおよびプライマーＤを用いた反応ではｔｒｐプロモーター領域のＤＮＡ断片に相当する約０．３ｋｂのＤＮＡ断片がそれぞれ増幅していることを確認した後、残りの反応液と等量のＴＥ［１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ］飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離してＤＮＡを沈殿させた後、該ＤＮＡを２０μＬのＴＥに溶解した
該溶解液それぞれ５μＬを用い、プライマーＡおよびプライマーＢで増幅したＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで、またプライマーＣおよびプライマーＤで増幅したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ ｋｉｔ、ＢＩＯ １０１社製）を用いて、ｙｗｆＥを含む１．４ｋｂおよびｔｒｐプロモーター領域を含む０．３ｋｂのＤＮＡ断片をそれぞれ回収した。
ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製］０．２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により４．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｙｗｆＥを含む１．４ｋｂ断片、ｔｒｐプロモーター領域を含む０．３ｋｂ断片および４．５ｋｂの断片をライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株（ストラタジーン社製）を、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］によって形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ｔｒｐプロモーター下流にｙｗｆＥが連結された発現ベクターであるｐＰＥ４３が取得されていることを確認した（図１）。
実験例３ ジペプチドの生産
実験例２で得られたｐＰＥ４３を保有するエシェリヒア・コリＮＭ５２２（エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＰＥ４３株）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地が入った太型試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。
終濃度６０ｍｇ／ｍｌの該湿菌体、１２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎ、０．４％のナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で３分間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をジニトロフェノール化法で誘導体化した後にＨＰＬＣ法により分析した。ＨＰＬＣ法による分析は、分離カラムに関東化学社製のＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂ−ＲＰ−１８カラムを用い、溶離液として１％（ｖ／ｖ）リン酸、２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを用い、０．７ｍｌ／分の流動速度で行った。その結果反応液中に１２０ｍｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ）が生成蓄積していることを確認した。
対照菌株であるベクターのみを含むエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＴｒＳ３０株の菌体ではＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎの生成は認められなかった。
実験例４ Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え型ジペプチド合成酵素の精製
上記ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号２３および２４で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＥ、プライマーＦと呼ぶ）を合成した。プライマーＥは、ｙｗｆＥの開始コドン（ａｔｇ）をＮｃｏＩ認識配列（ｃｃａｔｇｇ）に置換した領域を含む塩基配列である。プライマーＦは、ｙｗｆＥの終止コドンをＢａｍＨＩ認識配列（ｇｇａｔｃｃ）に置換した領域を含む塩基配列である。
バチルス・サチリス１６８株（ＡＴＣＣ ２３８５７）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーＥおよびプライマーＦをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ｙｗｆＥ断片に相当する約１．４ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットを用いて、ｙｗｆＥを含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え体発現ベクターｐＱＥ６０（キアゲン社製）０．２ｇを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｙｗｆＥを含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片と３．４ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、Ｃ末Ｈｉｓタグ付加型ｙｗｆＥ発現ベクターであるｐＱＥ６０ｙｗｆＥが取得されていることを確認した（図２）。
ｐＱＥ６０ｙｗｆＥを保有するエシェリヒア・コリＮＭ５２２（エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ株）を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地の入った２５０ｍｌ容三角フラスコに接種し３０℃で３時間培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３０℃で４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得し、該湿菌体から、Ｈｉｓ Ｔｒａｐ（Ｈｉｓタグ付加タンパク精製キット、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｓｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、説明書に従いＨｉｓタグ付加組換え型酵素を精製した。
実験例５ Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産（１）
（ｉ）実験例４で取得した精製したＨｉｓタグ付加組換え型酵素０．０４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎからなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で１６時間反応を行った。
反応終了後、上記実験例３と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中に３．７ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎと０．３ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ）が生成蓄積していることを確認した。
（ｉｉ）酵素を０．０１ｍｇ、Ｌ−Ｇｌｎの代わりにＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＬｅｕまたはＬ−Ｖａｌを含有する以外は、上記（ｉ）の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記（ｉ）の反応条件で反応させた。
反応終了後、上記実験例３と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中にそれぞれ、７．０ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅ）のみ、７．０ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｍｅｔ）および０．０３ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、５．０ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ）および０．２ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、または１．６ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−バリン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｖａｌ）および０．３ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａが生成蓄積していることを確認した。
（ｉｉｉ）酵素を０．０１ｍｇ、Ｌ−Ａｌａの代わりにＧｌｙ、Ｌ−Ｇｌｎの代わりにＬ−ＰｈｅまたはＬ−Ｍｅｔを含有する以外は、上記（ｉ）の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記（ｉ）の反応条件で反応させた。
反応終了後、上記実験例３と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中にそれぞれ５．２ｇ／Ｌのグリシル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ）または１．１ｇ／Ｌのグリシル−Ｌ−メチオニン（Ｇｌｙ−Ｌ−Ｍｅｔ）が生成蓄積していることを確認した。
上記反応液組成からＡＴＰを除くとジペプチドは全く生成されなかった。
以上の結果から、ｙｗｆＥ遺伝子産物は、ＡＴＰ存在下において、Ｌ−ＡｌａとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−ＰｈｅＬ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＬｅｕまたはＬ−Ｖａｌとから、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＭｅｔおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＬｅｕおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、またはＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＶａｌおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａを生成する活性、ＧｌｙとＬ−ＰｈｅまたはＬ−ＭｅｔとからＧｌｙ−Ｌ−ＰｈｅまたはＧｌｙ−Ｌ−Ｍｅｔを生成する活性を有することが明らかになった。
実験例６ Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産（２）
実験例４で得られた精製したＨｉｓタグ付加組換え型酵素０．０４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰからなる０．１ｍｌの反応液を調製し、表１の第１行目と最左列のアミノ酸の組み合わせからなる各種Ｌ−アミノ酸、Ｇｌｙまたはβ−Ａｌａをそれぞれ３０ｍｍｏｌ／Ｌずつになるように反応液に添加し、３７℃で１６時間反応を行った。反応終了後、反応生成物をＨＰＬＣ分析したところ、表１に示すジペプチドが生成していることが確認された。
Figure 0004796495
Figure 0004796495
Figure 0004796495
表１の第１行目と最左列に記載の２種類（もしくは１種類）のＬ−アミノ酸、Ｇｌｙまたはβ−Ａｌａを基質として反応した場合に生成したジペプチドを枠内に記載した。○は配列は未確定だがジペプチドが生成したこと、×はジペプチドの生成が確認されなかったこと、および空欄は未実施を示す。
実験例７ Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素発現株を用いたジペプチドの生産
実験例４で得られたエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った太型試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地の入った２５０ｍｌ容三角フラスコに接種し３０℃で３時間培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／ＬになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で４時間培養した。該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。
２００ｇ／Ｌの湿菌体、５０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌのフィチン酸（３３％の濃水酸化ナトリウム溶液を用いて中性になるよう希釈）、１５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム・７水和物、４ｇ／ＬのナイミーンＳ−２１５、１０ｍｌ／Ｌのキシレン、２００ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａ、２００ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎからなる２０ｍｌの反応液（ｐＨ７．２）を５０ｍｌ容量のビーカーに入れ、３２℃、９００ｒｐｍの条件下で２時間反応を行った。反応中は２ｍｏｌ／Ｌの水酸化カリウムを用いて反応液のｐＨを７．２に保った。
反応生成物を実験例３記載の方法と同様の方法で分析したところ、２５ｍｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎの蓄積が確認された。
実験例８ バチルス属に属する各種微生物からのｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子のクローニングとその解析
配列番号９で表される塩基配列に基づき、バチルス・サチリスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、バチルス・アミロリケファシエンスＩＦＯ３０２２、およびバチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５に存在するｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を以下のようにして取得した。
まず、バチルス・サチルスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、バチルス・アミロリケファシエンスＩＦＯ３０２２、およびバチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５をそれぞれＬＢ培地に植菌し３０℃で一晩静置培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の飽和フェノールを用いる方法により、該微生物の染色体ＤＮＡをそれぞれ単離精製した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号２５および２６で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＧ、プライマーＨと呼ぶ）を合成した。プライマーＧは、バチルス・サチリス１６８株の染色体ＤＮＡのｙｗｆＥの開始コドンより上流を含む領域の配列である。プライマーＨは、ｙｗｆＥの終止コドンより下流を含む配列と相補的な配列である。
バチルス・サチルスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、またはバチルス・アミロリケファシエンスＩＦＯ３０２２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーＧおよびプライマーＨをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ｙｗｆＥ断片に相当する約１．４ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
上記で得られた各菌株染色体ＤＮＡ由来の１．４ｋｂ断片とｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（インビトロジェン社製）を、ライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応を行い連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてそれぞれの構造を解析することにより、ｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含むプラスミドであるｐＹＷＦＥ１（ＡＴＣＣ１５２４５株由来、配列番号３６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ２（ＡＴＣＣ６６３３株由来、配列番号１０で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ３（ＩＡＭ１２１３株由来、配列番号１１で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ４（ＩＡＭ１１０７株由来、配列番号１２で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ５（ＩＡＭ１２１４株由来、配列番号１３で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ６（ＡＴＣＣ９４６６株由来、配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ７（ＩＡＭ１０３３株由来、配列番号３６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ８（ＡＴＣＣ２１５５５株由来、配列番号１４で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ９（ＩＦＯ３０２２株由来、配列番号１５で表される塩基配列を有するＤＮＡ）が取得されていることを確認した。
一方、バチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５由来のｙｗｆＥに相当する遺伝子（配列番号１６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）は以下のように取得した。
上記で調製したＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡを鋳型にし、配列番号２７および２８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＺ−ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、５μＬのＺ−ｔａｑポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ社製）、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液５０μＬを調製し、９８℃で５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、約０．８ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
上記で得られた０．８ｋｂ断片とｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙ（プロメガ社製）を、ライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応を行い連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＤＨ５α株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
上記で得られた形質転換体からプラスミドを抽出して、約０．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、配列番号１６で表される塩基配列中の塩基番号３５８〜１１６０番からなる塩基配列が確認された。
次に該プラスミドをＥｃｏＲＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した。該ＤＮＡ断片をジーンクリーンＩＩキットを用いて精製した。約０．５μｇの該精製ＤＮＡ断片を、ＤＩＧ−ハイプライムＤＮＡラベリング＆デテクション スターターキットＩ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて、ＤＩＧラベル化した。ＤＩＧラベル化は、該キット添付の説明書に従って行った。
上記で得られたＤＩＧラベル化ＤＮＡを用いて、ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡのサザン解析を行った。
ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩおよびＳｐｈＩを用いてそれぞれ完全消化し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、常法に従いナイロンメンブレンプラスチャージ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）に転移させた。
ＵＶを照射することにより、該ナイロン膜にＤＮＡ断片を固定した後、上記プローブＤＮＡおよび該ナイロン膜を用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーションは、該プローブＤＮＡと該ナイロン膜を６５℃で１６時間接触させ、その後該ナイロン膜を、０．１％ＳＤＳおよび２×ＳＳＣからなる溶液を用い、室温で５分間、２回洗浄し、さらに０．１％ＳＤＳおよび０．５×ＳＳＣからなる溶液を用い、６５℃で１５分間、２回洗浄することで行い、その他の操作、条件およびハイブリダイズしたＤＮＡの検出は、上記したＤＩＧ−ハイプライムＤＮＡラベリング＆デテクション スターターキットＩに添付されている説明書に準じて行った。
その結果、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩの完全消化断片の３．５ｋｂｐ付近に発色が見られた。
次に、ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩを用いてそれぞれ完全消化し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した。それぞれの制限酵素消化ＤＮＡから３−４ｋｂｐの断片をジーンクリーンＩＩキットを用いて精製し、ライゲーションキットを用いて自己環化させた。
上記で決定した０．８ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列に基づき、配列番号２９および３０で表される塩基配列を設計、合成し、上記で取得した環化ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、１０ｎｇの環化ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、５μＬのｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ社製）、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液５０μＬを調製し、９８℃で５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分３０秒間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、約３．０ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
上記で得られたＤＮＡ断片とＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）とをライゲーションキットを用いて連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含むプラスミドであるｐＹＷＦＥ１０（ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株由来、配列番号１６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）が得られていることを確認した。
上記で得られたｐＹＷＦＥ１〜ｐＹＷＦＥ１０に含まれるｙｗｆＥ遺伝子に相当する各遺伝子の塩基配列を塩基配列分析装置３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサーを用いて決定した。
ｐＹＷＦＥ１、ｐＹＷＦＥ６およびｐＹＷＦＥ７に含まれる遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、ｙｗｆＥ遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列と同一であったが、ｐＹＷＦＥ２、ｐＹＷＦＥ３、ｐＹＷＦＥ４、ｐＹＷＦＥ５、ｐＹＷＦＥ８、ｐＹＷＦＥ９およびｐＹＷＦＥ１０に含まれる遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、ｙｗｆＥ遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列と異なっていた。
ｐＹＷＦＥ２、ｐＹＷＦＥ３、ｐＹＷＦＥ４、ｐＹＷＦＥ５、ｐＹＷＦＥ８、ｐＹＷＦＥ９、ｐＹＷＦＥ１０およびｐＹＷＦＥ１とｐＹＷＦＥ７に含まれるｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２〜８および１に、該遺伝子の塩基配列を配列番号１０〜１６および３６にそれぞれ示した。
実験例９ Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え型ジペプチド合成酵素の精製
バチルス・サチルスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、またはバチルス・アミロリケファシエンスＩＦＯ３０２２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、実験例２記載のプライマーＡおよびプライマーＢをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
バチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５の染色体ＤＮＡを鋳型とした場合は、配列番号３１および３２で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、上記と同様の条件でＰＣＲを行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ｙｗｆＥ断片に相当する約１．４ｋｂのＤＮＡ断片がそれぞれ増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液のそれぞれ５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットを用いて、ｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
次にＣ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え体発現ベクターｐＱＥ６０ ０．２μｇを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたバチルス・サチルス１６８株のｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片、および３．４ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応を行いそれぞれ連結した。
該反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法により形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてそれらの構造を解析することにより、Ｃ末Ｈｉｓタグ付加型遺伝子発現ベクターであるｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１（ＡＴＣＣ１５２４５由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ２（ＡＴＣＣ６６３３由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ３（ＩＡＭ１２１３由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ４（ＩＡＭ１１０７由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ５（ＩＡＭ１２１４由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ６（ＡＴＣＣ９４６６由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ７（ＩＡＭ１０３３由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ８（ＡＴＣＣ２１５５５由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ９（ＩＦＯ３０２２由来の遺伝子を含有するベクター）、およびｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１０（ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５由来の遺伝子を含有するベクター）が取得されていることを確認した。
上記で得られたエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１〜ＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１０株を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った太型試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地の入った２５０ｍｌ容の三角フラスコに接種し３０℃で３時間培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／ＬになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で４時間培養した。該培養液を遠心分離して得られた湿菌体から、ＨｉｓＴｒａｐをその使用説明書に従って用いて、Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素を精製した。
実験例１０ 精製酵素を用いたジペプチドの生産
実験例９で得られた組換え型酵素０．０４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａおよび３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎからなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で１６時間反応を行った。
反応終了後、実験例３記載の方法により反応液を分析した結果、それぞれ、３．０〜３．５ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎおよび０．２５〜０．３ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａが生成蓄積していることが確認された。
また、上記反応液組成からＡＴＰを除くとＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａは全く生成されなかった。
以上の結果から、実験例８で得られた遺伝子の産物は、いずれもＡＴＰ存在下でＬ−ＡｌａとＬ−ＧｌｎとからＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａを生成する活性を有することが明らかになった。
実験例１１ ａｌｂＣ遺伝子およびその類縁遺伝子の取得
ストレプトマイセス・ノウルセイのａｌｂＣ遺伝子の塩基配列［Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌ．，９，１３５５（２００２）］に基づき、ストレプトマイセス・ノウルセイおよびストレプトマイセス・アルボラスよりａｌｂＣ遺伝子およびその類縁遺伝子を、以下の方法で取得した。
まず、ストレプトマイセス・ノウルセイＩＦＯ１５４５２株とストレプトマイセス・アルボラスＩＦＯ１４１４７株を、それぞれ、１％グリシン添加したＫＭ７３培地［２ｇ／ｌイーストエキス（ディフコ社製）、１０ｇ／ｌ可溶性デンプン（和光純薬工業社製）］、ＫＰ培地［１５ｇ／ｌグルコース、１０ｇ／ｌグリセロール、１０ｇ／ｌポリペプトン（日本製薬株式会社製）、１０ｇ／ｌ肉エキス（極東製薬工業株式会社製）、４ｇ／ｌ炭酸カルシウム］に植菌し２８℃で一晩振とう培養した。なお、ストレプトマイセス・ノウルセイＩＦＯ１５４５２株およびストレプトマイセス・アルボラスＩＦＯ１４１４７株は、独立行攻法人 製品評価技術基盤機構 生物資源部門［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＮＩＴＥ）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＲＣ）］（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）より分譲を受けた。
培養後、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎに記載の方法に従って該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
ａｌｂＣ遺伝子の塩基配列に基づき、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号４１および４２で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＪ、プライマーＫと呼ぶ）を合成した。プライマーＪは、ストレプトマイセス・ノウルセイの染色体ＤＮＡのａｌｂＣ遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端にＮｃｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＫは、ａｌｂＣ遺伝子の終止コドンを含む配列と相補的な塩基配列の５’末端にＢｇｌＩＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
上記のプライマーＪおよびプライマーＫをプライマーセットに、鋳型としてストトレプトマイセス・ノウルセイまたはストレプトマイセス・アルボラスの染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、鋳型として０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、５μＬのＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ社製）、各２００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ、５μＬのジメチルスルホキシドを含む反応液５０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、約０．７ｋｂのＤＮＡ断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離してＤＮＡを沈殿させた後、該ＤＮＡをそれぞれ２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液それぞれ５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットを用いて、７００ｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ回収した。
ファージＴ５プロモーターを含む発現ベクターｐＱＥ６０ ０．２μｇを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られた各放線菌由来の０．７ｋｂ断片およびｐＱＥ６０由来の３．４ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ファージＴ５プロモーター下流にストレプトマイセス・ノウルセイ由来のＤＮＡが連結された発現ベクターであるｐＡＬ−ｎｏｕ、およびストレプトマイセス・アルブラス由来のＤＮＡが連結された発現ベクターであるｐＡＬ−ａｌｂが取得されていることを確認した（図３）。
それぞれのプラスミドに挿入された放線菌由来のＤＮＡ部分の塩基配列を塩基配列決定装置３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサーを使って決定したところ、ｐＡＬ−ａｌｂには配列番号３７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、すなわち配列番号３９で表される塩基配列を有するＤＮＡが含有され、ｐＡＬ−ｎｏｕには配列番号３８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、すなわち配列番号４０で表される塩基配列を有するＤＮＡが含有されていることを確認した。
実験例１２ 菌体を酵素源に用いたジペプチドの製造
実験例１１で得られたｐＡＬ−ｎｏｕまたはｐＡＬ−ａｌｂを保有するエシェリヒア・コリＮＭ５２２（エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＡＬ−ｎｏｕ株またはＮＭ５２２／ｐＡＬ−ａｌｂ株）およびプラスミドを保有しないＮＭ５２２株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＬＢ培地が入った試験管（プラスミドを持たない株の場合にはアンピシリンは無添加、以下同様）に接種し、３０℃で１７時間培養した。この培養液０．５ｍｌを５０ｍｌのＬＢ培地が入った２５０ｍｌ容の三角フラスコにそれぞれ植菌し、３０℃で１時間振とう培養した後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、さらに４時間培養を継続した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。
終濃度１００ｍｇ／ｍｌの該湿菌体、６０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．２）、１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、１ｇ／ＬのＬ−Ｌｅｕ、１ｇ／ＬのＬ−Ｐｈｅからなる３．０ｍｌの反応液を調製し、３０℃で反応を行った。反応１時間後にサンプリングし、アセトニトリルを２０％（ｖ／ｖ）になるように加えた後、反応生成物をＨＰＬＣを用いて分析した。ＨＰＬＣによる分析は、分離カラムにＯＤＳ−ＨＡカラム（ＹＭＣ社製）、溶離液として３０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを用い、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎ、２１５ｎｍの紫外吸収を測定する条件で行った。
その結果、エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＡＬ−ｎｏｕ株の反応液中には３６．７ｍｇ／ｌのシクロ（Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニン）［ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｈｅ）］の蓄積が確認されたが、エシェリヒア・コリＮＭ５２２株の反応液中にはｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｈｅ）はまったく検出されなかった。同じ反応液を以下の条件でＨＰＬＣによって分析し、直鎖ジペプチド（以下、「直鎖ジペプチド」は単に「ジペプチド」と称す）であるＬ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｈｅ）およびＬ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｌｅｕ）を測定した。
両ジペプチドはＦ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後にＨＰＬＣを用いて分析した。ＨＰＬＣによる分析は、分離カラムにＯＤＳ−ＨＧ５（野村化学社製）、溶離液としてＡ液（酢酸６ｍｌ／ｌ、２０％（ｖ／ｖ）アセト二トリル、トリエチルアミンにてｐＨ４．８に調整）およびＢ液（酢酸 ６ｍｌ／ｌ、７０％（ｖ／ｖ）アセト二トリル、トリエチルアミンにてｐＨ４．８調整）を用い、分析開始後５分まではＡ液：Ｂ液＝８：２、５分〜２０分までは、２０分経過したときにＡ液：Ｂ液＝１：１になるようにリニアーグラジエントをかけ、流動速度０．６ｍｌ／分、励起波長２５４ｎｍ、蛍光波長６３０ｎｍでジペプチドを検出する条件で行った。
その結果、エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＡＬ−ｎｏｕ株の反応液中には２１．９ｍｇ／ＬのＬ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｈｅと１２．０ｍｇ／ＬのＬ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｌｅｕが蓄積していることが確認された。また対照株として用いたエシェリヒア・コリＮＭ５２２株の反応液中にはいずれのジペプチドも検出されなかった。
このことから、実験例１１で取得されたシクロジペプチド合成酵素はジペプチドを合成する能力をもつことが明らかになった。
実験例１３ 精製酵素を用いたジペプチドの製造（１）
実験例１２と同様にエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＡＬ−ｎｏｕ株を培養した。培養終了後、遠心分離によって湿菌体を取得し、６０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．２）で洗浄後、１０ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾール含有２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウムバッファーに懸濁した。この懸濁を４℃で超音波処理して菌体破砕液を取得した。この菌体破砕液（１０ｍｌ、蛋白質０．８６３ｍｇを含む）をアマシャム社製Ｈｉｓタグ精製カラムに通塔し、１０ｍｍｏｌ／Ｌのイミダゾールを含有する２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムバッファー１５ｍｌを通塔することによる洗浄を行い、ＨｉｓタグつきａｌｂＣ蛋白質をカラム内にて精製した。次にこのＨｉｓタグ付きのａｌｂＣ蛋白質を保持するカラムに、実験例１２と同組成の反応液（反応液組成：６０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．２）、１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、１ｇ／ＬのＬ−Ｌｅｕ、１ｇ／ＬのＬ−Ｐｈｅからなる反応液）２ｍｌを通塔し、カラム内に基質を保持した状態で、３０℃にて、インキュベートした。２４時間後、同組成の反応液３ｍｌでカラム内の反応液を溶出し、実験例１２と同様の方法により反応液中のシクロジペプチドおよびジペプチドを定量した。
その結果、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｈｅ）６．８ｍｇ／Ｌ、Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｈｅ ２８．７ｍｇ／ＬおよびＬ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｌｅｕ １８．５ｍｇ／Ｌが生成していることが分かった。ＡＴＰを含まない反応液で同様にインキュベートした場合は、シクロジペプチド、ジペプチドともに検出されなかった。
実験例１４ 精製酵素を用いたジペプチドの製造（２）
基質のアミノ酸を他のアミノ酸に換える以外は実験例１３と同様の方法で酵素反応を行い、生成物を分析した。反応液は、基質のアミノ酸を、１ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ、Ｌ−ＬｅｕまたはＬ−Ｐｈｅに置き換えた以外は実験例１３と同じ組成の溶液を用いた。
その結果、反応開始後２４時間で、それぞれ９．４１ｍｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、７．８５ｍｇ／ＬのＬ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｌｅｕ、または５．２０ｍｇ／ＬのＬ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｈｅが生成していることが分かった。
実験例１５ ｙｗｆＥ遺伝子の発現を強化した大腸菌の造成
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号８４〜８７に記載の配列をそれぞれ有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＬ、プライマーＭ、プライマーＮ、プライマーＯ）を合成した。配列番号８４の配列は、プラスミドｐＱＥ６０ｙｗｆＥのｙｗｆＥ遺伝子のリボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ配列を含む領域について５’側にＸｈｏＩ認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号８５の配列は、ｙｗｆＥ遺伝子の終止コドンを含む配列と相補的な配列の５’側にＢａｍＨＩ認識配列を含む配列を付加したものである。また配列番号８６の配列は、ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０のｔｒｐプロモーター領域の配列について５’側にＥｃｏＲＩ認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号８７の配列は、ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０のｔｒｐプロモーター領域の配列と相補的な配列の５’側にＸｈｏＩ認識配列を含む配列を付加したものである。
プラスミドｐＱＥ６０ｙｗｆＥを鋳型とし、ｙｗｆＥ遺伝子断片の増幅には上記のプライマーＬおよびプライマーＭを、ｔｒｐプロモーター領域の断片の増幅にはプライマーＮおよびプライマーＯをそれぞれプライマーセットとして用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、１０ｎｇのｐＱＥ６０ｙｗｆＥ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む４０μＬの反応液を調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、プライマーＬおよびプライマーＭを用いたＰＣＲではｙｗｆＥ遺伝子断片に相当する約１．４ｋｂ、プライマーＮおよびプライマーＯを用いた反応ではｔｒｐプロモーター領域の断片に相当する約０．３ｋｂの断片がそれぞれ増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡを２０μｌのＴＥに溶解した。
上記で得られたそれぞれのＤＮＡ溶液５μｌを用い、プライマーＬおよびプライマーＭで増幅したＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで、またプライマーＮおよびプライマーＯで増幅したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより、それぞれｙｗｆＥ遺伝子を含む１．４ｋｂおよびｔｒｐプロモーター領域を含む０．３ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
０．２μｇのｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｙｗｆＥ遺伝子を含む１．４ｋｂ断片、ｔｒｐプロモーター領域を含む０．３ｋｂ断片および４．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｔｒｐプロモーター下流にｙｗｆＥ遺伝子を含む発現ベクターであるｐＰＥ５６を得た該ベクターの構造を制限酵素消化により確認した（図４）。
実験例１６ ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子およびｄｐｐオペロン欠損株の作製
エシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡ上の特定遺伝子が欠損した菌株は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１−６６４５（２０００）］に従って作製した。
以下に記載のプラスミドｐＫＤ４６、ｐＫＤ３およびｐＣＰ２０は、エシェリヒア・コリ ジェネティック ストック センター（米国エール大学）から該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ株を入手し、当該株から公知の方法により抽出して用いた。
（１）遺伝子欠損用ＤＮＡ断片のクローニング
エシェリヒア・コリＫ１２株の染色体ＤＮＡ上に存在する配列番号５５で表される塩基配列を有するｐｅｐＤ遺伝子、配列番号５６で表される塩基配列を有するｐｅｐＮ遺伝子、配列番号５７で表される塩基配列を有するｐｅｐＢ遺伝子、配列番号５８で表される塩基配列を有するｐｅｐＡ遺伝子および配列番号５９で表される塩基配列を有するｄｐｐＡ遺伝子、配列番号６０で表される塩基配列を有するｄｐｐＢ、配列番号６１で表される塩基配列を有するｄｐｐＣ遺伝子、配列番号６２で表される塩基配列を有するｄｐｐＤ遺伝子および配列番号６３で表される塩基配列を有するｄｐｐＦ遺伝子を欠損させることを目的に、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用い、エシェリヒア・コリＫ１２株の染色体ＤＮＡ上における各々の欠損標的遺伝子の上流および下流に位置する３６ｂｐからなる塩基配列と相同な塩基配列、および配列番号５４で表される酵母由来Ｆｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識する塩基配列を有するＤＮＡを合成した。ただし、ｄｐｐＡ遺伝子、ｄｐｐＢ遺伝子、ｄｐｐＣ遺伝子、ｄｐｐＤ遺伝子およびｄｐｐＦ遺伝子は、オペロンを形成しているので、該オペロンの上流および下流に位置する塩基配列と相同な塩基配列を有するＤＮＡを合成した。
すなわち、ｐｅｐＤ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号６４および６５、ｐｅｐＮ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号６６および６７、ｐｅｐＡ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号６８および６９、ｐｅｐＢ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号７０および７１、ｄｐｐオペロン欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号７２および７３で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれ合成した。
次に、上記合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、ｐＫＤ３ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは１０ｎｇのプラスミドＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄｅｏｘｙＮＴＰを含む４０μＬの反応液を用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
それぞれの反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃で３０分間放置した。該溶液を遠心分離し、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子およびｄｐｐオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を取得した。
（２）ｐｅｐＤ遺伝子欠損エシェリヒア・コリＪＭ１０１の作製
エシェリヒア・コリＪＭ１０１株をｐＫＤ４６で形質転換した後、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で培養することでｐＫＤ４６を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１株（以下、エシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＫＤ４６と称す）を選択した。
プラスミドｐＫＤ４６は、λＲｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子を有し、該遺伝子の発現はＬ−アラビノースにより誘導することができる。よって、Ｌ−アラビノース存在下で生育させたｐＫＤ４６を保有する大腸菌を、直鎖状ＤＮＡを用いて形質転換すると、高頻度で相同組換えが起こる。またｐＫＤ４６は温度感受性の複製起点を有するために、４２℃で生育させることにより、プラスミドを容易に脱落させることができる。
１０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−アラビノースと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンの存在下で培養して得られたエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＫＤ４６に、電気パルス法により上記で取得したｐｅｐＤ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を導入し、大腸菌ＪＭ１０１の染色体ＤＮＡ上にｐｅｐＤ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片が相同組換えにより組込まれた形質転換株を２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ）に塗布し、３０℃で培養することで選択した。
選択したクロラムフェニコール耐性株を、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に植菌し、４２℃で１４時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地、及び１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカし、３７℃で培養し、クロラムフェニコール耐性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択することにより、ｐＫＤ４６脱落株を取得した。
次に上記で得られたｐＫＤ４６脱落株をｐＣＰ２０を用いて形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で選択することにより、ｐＣＰ２０を保持するｐＫＤ４６脱落株を取得した。
プラスミドｐＣＰ２０は、酵母由来Ｆｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子を有し、該遺伝子の発現は４２℃で誘導することができる。
また、上記で作製したｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子及びｄ ｐｐオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片の、クロラムフェニコール耐性遺伝子の両端にはＦｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識する塩基配列が存在するため、Ｆｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが触媒する相同組換えにより容易に該耐性遺伝子を脱落させることができる。
さらに、ｐＣＰ２０は温度感受性の複製起点を有しているため、ｐＣＰ２０保持株を４２℃で生育させることにより、Ｆｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅの発現とｐＣＰ２０の脱落を同時に誘導することができる。
上記で取得したｐＣＰ２０保有ｐＫＤ４６脱落株を薬剤無添加のＬＢ寒天培地に植菌し、４２℃で１４時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを薬剤無添加ＬＢ寒天培地、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカして、３０℃で培養し、クロラムフェニコール感受性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。
上記で選択した各株からそれぞれ染色体ＤＮＡを常法（生物工学実験書、日本生物工学会編９７〜９８ページ、培風館、１９９２年）に従って調製した。欠損の標的遺伝子であるｐｅｐＤ遺伝子の内部塩基配列に基づいて設計した配列番号７４および７５で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１ｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄｅｏｘｙＮＴＰを含む４０μＬの反応液を用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
上記ＰＣＲにおいて、増幅ＤＮＡ断片が検出されなかった株をｐｅｐＤ遺伝子欠損株とし、エシェリヒア・コリＪＰＤ１株と命名した。
（３）エシェリヒア・コリＪＭ１０１の染色体ＤＮＡ上のｐｅｐＤ遺伝子およびｐｅｐＮ遺伝子が欠損した株の作製
上記（２）で得られたエシェリヒア・コリＪＰＤ１株をｐＫＤ４６で形質転換した後、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で培養することによりｐＫＤ４６を保持するエシェリヒア・コリＪＰＤ１（以下、エシェリヒア・コリＪＰＤ１／ｐＫＤ４６と称す）を選択した。エシェリヒア・コリＪＰＤ１／ｐＫＤ４６に、電気パルス法によりｐｅｐＮ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を導入し、エシェリヒア・コリＪＰＤ１／ｐＫＤ４６の染色体ＤＮＡ上にｐｅｐＮ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片が相同組換え
により組込まれた形質転換株を取得した。
次に、上記（２）と同様の操作を行うことにより、染色体ＤＮＡ上からクロラムフェニコール耐性遺伝子が欠落した株を取得し、該株をエシェリヒア・コリＪＰＤＮ２と命名した。
（４）エシェリヒア・コリＪＭ１０１の染色体ＤＮＡ上のｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子またはｄｐｐオペロンが欠損した株、および多重遺伝子欠損株の作製
ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子またはｄｐｐオペロンの欠損株は、上記（１）で作製した各遺伝子またはオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を用い、上記（２）と同様の方法により作製した。
上記方法により各々の遺伝子欠損株が取得されたことは、各々の欠損遺伝子の内部塩基配列に基づき設計、合成した配列番号７６〜８３で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、上記（２）と同様のＰＣＲにより確認した。ここで、配列番号７６および７７で表される塩基配列からなるＤＮＡはｐｅｐＮ欠損確認用、配列番号７８および７９で表される塩基配列からなるＤＮＡはｐｅｐＡ欠損確認用、配列番号８０および８１で表される塩基配列からなるＤＮＡはｐｅｐＢ欠損確認用、配列番号８２および８３で表される塩基配列からなるＤＮＡはｄｐｐオペロン欠損確認用プライマーセットである。
上記方法で取得されたｄｐｐオペロン欠損株をエシェリヒア・コリＪＤＰＰ１株、ｐｅｐＮ遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮ１株、ｐｅｐＡ遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＡ１株、ｐｅｐＢ遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＢ７株と名付けた。
また、上記（３）の方法に準じて、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子およびｄｐｐオペロンからなる群より選ばれる２以上の遺伝子またはオペロンの多重欠損株を作製した。多重欠損株が取得できたことの確認は、上記（２）と同様のＰＣＲにより確認した。前記方法で取得されたｐｅｐＤ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した二重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＤＰ４９株、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＤ遺伝子およびｐｅｐＮ遺伝子が欠損した三重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＤＮＢ４３株、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子およびｄｐｐ
オペロンが欠損した三重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６株、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した四重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮＤＡＰ５株、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した四重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮＤＢＰ７株と名づけた。表２は、各遺伝子欠損株における欠損遺伝子名を示す。
Figure 0004796495
実験例１７ ペプチダーゼおよびジペプチド取り込み活性が喪失したエシェリヒア・コリを用いたＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａの生産性の評価
実験例１６で得られた各種ペプチダーゼおよびジペプチド取り込み蛋白質をコードする遺伝子の欠損株を、実験例１５で造成したプラスミドｐＰＥ５６を用いて形質転換し、アンピシリン耐性を示す形質転換株を取得した。
得られた形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよびアミノ酸を含む８ｍｌの水性媒体（リン酸水素二カリウム １６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム １４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム ５ｇ／Ｌ、クエン酸（無水） １ｇ／Ｌ、カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５ｇ／Ｌ、Ｌ−Ｐｒｏ １ｇ／Ｌ、Ｌ−Ａｌａ ２．５ｇ／Ｌ、Ｌ−Ｇｌｎ ２．５ｇ／Ｌ、グルコース １０ｇ／ｌ、ビタミンＢ１ １０ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物 ２５ｍｇ／ｌ、硫酸鉄７水和物 ５０ｍｇ／ｌ、１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７．２に調整。Ｌ−Ｇｌｎは１０倍濃縮液をフィルターろ過滅菌後、グルコース、ビタミンＢ１、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸鉄・７水和物は別個に蒸煮後添加）を試験管に１％添加し、３０℃で２４時間反応させた。該水性媒体を遠心分離し上清を取得した。
該上清中の生産物をＦ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後にＨＰＬＣ法により分析した。ＨＰＬＣ法による分析は、分離カラムにＯＤＳ−ＨＧ５（野村化学社製）を用い、溶離液としてＡ液（酢酸６ｍｌ／ｌ、２０％（ｖ／ｖ）アセト二トリル、トリエチルアミンにてｐＨ４．８に調整）およびＢ液（酢酸６ｍｌ／ｌ、７０％（ｖ／ｖ）アセト二トリル、トリエチルアミンにてｐＨ４．８調整）を用い、分析開始後５分まではＡ液：Ｂ液＝８：２、５分〜２０分までは、２０分に達したときにＡ液：Ｂ液＝１：１になるようにリニアーグラジエントをかける条件で分析を行った。分析結果を表３に示す。
Figure 0004796495
表３から、２種以下のペプチダーゼをコードする遺伝子が欠損した微生物、１種のペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンのみが欠損した微生物では、ジペプチドの生成、蓄積量は低いが、１種以上のペプチダーゼをコードする遺伝子および１種のペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンが欠損した微生物、または３種以上のペプチダーゼをコードする遺伝子の活性が喪失した微生物では、ジペプチドの生成、蓄積量が大幅に増加していることがわかった。
実験例１８ ペプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質の活性が喪失した大腸菌株を用いたＬ−アラニル−Ｌ−バリン（以下、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｖａｌと称す）の生産性の評価
実験例１７と同様に、各種ペプチダーゼをコードする遺伝子およびペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンの欠損大腸菌株を、ｐＰＥ５６を用いて形質転換した。得られた形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよびアミノ酸を含む８ｍｌの水性媒体（リン酸水素二カリウム １６ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム １４ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム ５ｇ／ｌ、クエン酸（無水）１ｇ／ｌ、カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５ｇ／ｌ、Ｌ−Ｐｒｏ １ｇ／ｌ、Ｌ−Ａｌａ ２．５ｇ／ｌ、Ｌ−Ｖａｌ ２．５ｇ／ｌ、グルコース １０ｇ／ｌ、ビタミンＢ１ １０ｍｇ／ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物 ２５ｍｇ／ｌ、硫酸鉄・７水和物 ５０ｍｇ／ｌ、１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．２に調整。グルコース、ビタミンＢ１、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸鉄・７水和物は別個に蒸煮後に添加）が入った試験管に１％添加し、３０℃で２４時間反応させた。該水性媒体を遠心分離し上清を取得した。
該上清中の生成物を、実験例１７記載の方法により分析した。結果を表４に示す。
Figure 0004796495
表４から、２種以下のペプチダーゼをコードする遺伝子が欠損した微生物、および１種のペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンのみが欠損した微生物はジペプチドを生産しないが、３種以上のペプチダーゼ遺伝子が欠損した微生物、または１種以上のペプチダーゼをコードする遺伝子および１種のペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンが欠損した微生物は、ジペプチドを生産することがわかった。
実験例１９ ペプチダーゼおよびジペプチド取り込み系蛋白質の活性が喪失した大腸菌株を用いたグリシル−Ｌ−グルタミン（以下、Ｇｌｙ−Ｌ−Ｇｌｎと称す）の生産性の評価
実験例１７と同様に各種ペプチダーゼをコードする遺伝子およびジペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンの欠損株を、ｐＰＥ５６を用いて形質転換した。得られた形質転換株を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。
該培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよびアミノ酸を含む８ｍｌの水性媒体（リン酸水素二カリウム １６ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム １４ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム ５ｇ／Ｌ、クエン酸（無水） １ｇ／Ｌ、カザミノ酸（ディフコ社製） ０．５ｇ／Ｌ、Ｌ−Ｐｒｏ １ｇ／Ｌ、Ｇｌｙ ２．５ｇ／Ｌ、Ｌ−Ｇｌｎ ２．５ｇ／Ｌ、グルコース １０ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ １０ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物 ２５ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物 ５０ｍｇ／Ｌ、１０ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７．２に調整。Ｌ−Ｇｌｎは１０倍濃縮液をフィルターろ過滅菌後、グルコース、ビタミンＢ１、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸鉄・７水和物は別個に蒸煮後添加）が入った試験管に１％添加し、３０℃で２４時間反応させた。該水性媒体を遠心分離し上清を取得した。
該上清中の生成物を、実験例１７記載の方法より分析した。結果を表５に示す。
Figure 0004796495
表５から、２種以下のペプチダーゼをコードする遺伝子が欠損した微生物、および１種のペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンのみが欠損した微生物はジペプチドを生産しなかったが、３種以上のペプチダーゼをコードする遺伝子が欠損した微生物、および２種以上のペプチダーゼをコードする遺伝子および１種のペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンが欠損した微生物は、ジペプチドを生産することがわかった。
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
Ｌ−グルタミンの生合成調節に関与するｇｌｎＥ遺伝子、ｇｌｎＢ遺伝子が欠損した微生物の作製
エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡ上の特定遺伝子の欠損は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９７，６６４１−６６４５（２０００）］に従って行った。
（１）遺伝子欠損用薬剤耐性遺伝子断片のクローニング
エシェリヒア・コリＫ１２株のｇｌｎＥ、ｇｌｎＢの各遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている［Ｓｃｉｅｎｃｅ，５３３１，１４５３−１４７４（１９９７）］。報告されている塩基配列に基づいてパーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、ｇｌｎＥ遺伝子欠損用のプライマーＤＮＡとして配列番号８８および８９で表される塩基配列からなるＤＮＡ、ｇｌｎＢ遺伝子欠損用のプライマーＤＮＡとして配列番号９０および９１で表される塩基配列からなるＤＮＡを合成した。合成したプライマーＤＮＡは、各々の欠損の標的遺伝子の上流と下流に位置する３６ｂｐからなる塩基配列に基づき設計した。
上記合成ＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、ｐＫＤ３ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲはプラスミドＤＮＡ １０ｎｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液４μＬ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／Ｌを含む反応液４０μＬを用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離してＤＮＡを沈殿させた後、該ＤＮＡを２０μＬのＴＥに溶解した。上記操作により、ｇｌｎＥ遺伝子、ｇｌｎＢ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を取得した。
（２）染色体ＤＮＡ上のｇｌｎＥ遺伝子が欠損したエシェリヒア・コリＪＭ１０１株の作製
エシェリヒア・コリＪＭ１０１株をｐＫＤ４６で形質転換した後、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上でｐＫＤ４６を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１株（以下、エシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＫＤ４６と称す）を選択した。１０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−アラビノースと５０μｇ／ｍｌのアンピシリン存在下で培養したエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＫＤ４６を、電気パルス法によりｇｌｎＥ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を用いて形質転換し、ＪＭ１０１株の染色体ＤＮＡ上のｇｌｎＥ遺伝子にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入され、ｇｌｎＥ構造遺伝子が欠損するように組換えられた株を２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上で選択した。
取得したクロラムフェニコール耐性株を、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地にレプリカし、４２℃で保温した状態で単コロニー分離を実施した。得られた各コロニーを２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカし、クロラムフェニコール耐性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。次にこのｐＫＤ４６脱落株をｐＣＰ２０で形質転換し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性株を薬剤無添加のＬＢ寒天培地にレプリカし、４２℃で保温した状態で単コロニー分離を実施した。得られた各コロニーを薬剤無添加、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地、および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にそれぞれレプリカし、クロラムフェニコール感受性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。ここで得られた各株からそれぞれ染色体ＤＮＡを常法（生物工学実験書、日本生物工学会編９７〜９８ページ、培風館、１９９２年）により調製した。欠損の標的となるｇｌｎＥ遺伝子の内部配列を元に設計した、配列番号９２および９３で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡを用いて、コロニーＰＣＲを行った。コロニーＰＣＲは、２００μｌのピペットチップをコロニーに触れさせることで取得した量の菌体、プライマー各０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液４μＬ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／Ｌを含む反応液４０μｌを用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。ＰＣＲに供した株のうちで遺伝子増幅の見られなかった株は、ｇｌｎＥ遺伝子欠損株であることを確認し、エシェリヒア・コリＪＧＬＥ１と名づけた。
（３）染色体ＤＮＡ上のｇｌｎＥ遺伝子およびｇｌｎＢ遺伝子が欠損したエシェリヒア・コリＪＭ１０１株の作製
上記（２）で得られたエシェリヒア・コリＪＧＬＥ１株をｐＫＤ４６で形質転換した後、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で一晩培養することによりｐＫＤ４６を保持するエシェリヒア・コリＪＧＬＥ１株（以下、エシェリヒア・コリＪＧＬＥ１／ｐＫＤ４６と称す）を取得した。エシェリヒア・コリＪＧＬＥ１／ｐＫＤ４６をｇｌｎＢ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を用いて電気パルス法により形質転換し、染色体ＤＮＡ上のｇｌｎＢ遺伝子にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されｇｌｎＢ構造遺伝子が欠損するように組換えられた株を取得した。ｇｌｎＢ遺伝子の内部配列を元に設計した、配列番号９４および９５で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡを用いて、上記（２）の条件下でコロニーＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより遺伝子増幅が見られなかった株は、ｇｌｎ Ｂ遺伝子欠損株であることを確認し、エシェリヒア・コリＪＧＬＢＥ１と命名した。
ｙｗｆＥ遺伝子およびバチルス・サチルス由来のアラニン脱水素酵素遺伝子（ａｌｄ遺伝子）発現プラスミドの構築
実験例１５で造成したｙｗｆＥ遺伝子発現プラスミドｐＰＥ５６を基に、バチルス・サチルス由来のアラニン脱水素酵素遺伝子（ａｌｄ遺伝子）を同時に構成的に発現する発現プラスミドを図５に示す方法により構築した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号９６および配列番号９７で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＰ、プライマーＱと称す）を合成した。配列番号９６で表される塩基配列は、ａｌｄ遺伝子のリボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ配列を含む領域の５’側にＢａｍＨＩ認識配列を含む塩基配列を付加した配列である。配列番号９７で表される塩基配列は、ａｌｄ遺伝子の終止コドンを含む配列と相補的な配列の５’側にＢａｍＨＩ認識配列を含む配列を付加した配列である。
実験例２で取得したバチルス・サチルスの染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーＰおよびプライマーＱをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ａｌｄ遺伝子断片に相当する約１．２ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離してＤＮＡの沈殿を取得し、２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより、ａｌｄ遺伝子を含む１．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ｐＰＥ５６ ０．２μｇを制限酵素ＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により６．３ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。該６．３ｋｂのＤＮＡ断片の末端脱リン酸化を、６０℃で３０分間、アルカリホスファターゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５、タカラバイオ社製）処理することにより行った。反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加、混合して遠心分離した後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
上記で得られたａｌｄ遺伝子を含む１．２ｋｂのＤＮＡ断片とアルカリホスファターゼ処理した６．３ｋｂのＤＮＡ断片とをライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ａｌｄ遺伝子がｙｗｆＥ遺伝子と順向きに挿入されたプラスミドが取得されていることを制限酵素消化により確認し、該プラスミドをｐＰＥ８６と命名した（図５）。
エシェリヒア・コリ由来の脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子および脱感作型ａｒｏＦ遺伝子発現プラスミドの構築
（１）脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子発現プラスミドの造成
フェニルアラニンアナログ耐性変異導入により得られたフェニルアラニンの脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子を発現するプラスミドｐＥ ｐｈｅＡ ２２（特開昭６１−２６０８９２）から脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子を、チロシン耐性変異導入により得られたチロシンの脱感作型ａｒｏＦ遺伝子を発現するプラスミドｐＥ ａｒｏＦ １８（特開昭６２−６５６９１）から脱感作型ａｒｏＦ遺伝子を取得し、以下の方法により発現プラスミドを構築した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号９８および配列番号９９で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＲ、プライマーＳと呼ぶ）を合成した。配列番号９８で表される塩基配列は、ｐｈｅＡ遺伝子のリボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ配列を含む領域の５’側にＣｌａＩ認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号９９で表される塩基配列は、ｐｈｅＡ遺伝子の終止コドンを含む配列と相補的な配列の５’側にＢａｍＨＩ認識配列を含む配列を付加したものである。プラスミドｐＥ ｐｈｅＡ ２２を鋳型とし、上記プライマーＲおよびプライマーＳをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、１０ｎｇのプラスミドＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ｐｈｅＡ遺伝子断片に相当する約１．１ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離し、得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより、ｐｈｅＡ遺伝子を含む１．１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０〔大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製可能〕０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により４．６ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐｈｅＡ遺伝子を含む１．１ｋｂのＤＮＡ断片と４．６ｋｂのＤＮＡ断片とをライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出して、脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子発現プラスミドが取得されていることを制限酵素消化により確認し、該プラスミドをｐＰＨＥＡ１と命名した。
上記で得られたｐＰＨＥＡ１ ０．２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより、ｔｒｐプロモーターと脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子を含む１．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
次にｐＡＣＹＣ１８４の複製起点をもちクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドベクターｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）０．２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｔｒｐプロモーターと脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子を含む１．５ｋｂのＤＮＡ断片と３．０ｋｂのＤＮＡ断片とをライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子発現ベクターが取得されていることを制限酵素消化により確認し、該プラスミドをｐＰＨＥＡ２と命名した（図６）。
（２）脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子および脱感作型ａｒｏＦ遺伝子発現プラスミドの構築
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号１００および配列番号１０１で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＴ、プライマーＵと呼ぶ）を合成した。配列番号１００で表される塩基配列は、ａｒｏＦ遺伝子のリボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ配列を含む領域の５’側にＢａｌＩＩ認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号１０１で表される塩基配列は、ａｒｏＦの終止コドンを含む配列と相補的な配列の５’側にＢａｍＨＩ認識配列を含む配列を付加したものである。プラスミドｐＥ ａｒｏＦ １８を鋳型とし、上記プライマーＴおよびプライマーＵをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、１０ｎｇのプラスミドｐＥ ａｒｏＦ １８、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ａｒｏＦ遺伝子断片に相当する約１．１ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより、脱感作型ａｒｏＦ遺伝子を含む１．１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
次に上記（１）で取得した脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子発現プラスミドｐＰＨＥＡ２ ０．２μｇを制限酵素ＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により４．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。該４．５ｋｂのＤＮＡ断片の末端脱リン酸化を、６０℃で３０分間、アルカリホスファターゼ処理することにより行った。反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加、混合して遠心分離した後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
上記で得られた脱感作型ａｒｏＦ遺伝子を含む１．１ｋｂのＤＮＡ断片とアルカリホスファターゼ処理した４．５ｋｂのＤＮＡ断片とをライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、脱感作型ａｒｏＦ遺伝子が脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子と順向きに挿入された脱感作型ａｒｏＦ遺伝子および脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子発現プラスミドが取得されていることを制限酵素消化により確認し、該プラスミドをｐＰＨＥＡＦ２と命名した（図６）。
エシェリヒア・コリ由来のチロシン耐性を示すａｒｏＦ−ｔｙｒＡオペロン発現プラスミドの構築
（１）チロシン耐性を示すａｒｏＦ−ｔｙｒＡオペロン発現プラスミドの造成
チロシン耐性変異導入により得られたａｒｏＦ−ｔｙｒＡオペロンを発現するプラスミドｐＫｍ１ａｒｏＦｍ−１８（特開昭６０−０３４１９７）からチロシン耐性を示すａｒｏＦ−ｔｙｒＡオペロンを取得し、以下の方法により発現プラスミドを造成した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号１０２および１０３で表される塩基配列からなるＤＮＡを合成した。配列番号１０２で表される塩基配列は、ａｒｏＦ遺伝子のリボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ配列を含む領域の５’側にＣｌａＩ認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号１０３で表される塩基配列は、ｔｙｒＡ遺伝子の終止コドンを含む配列と相補的な配列の５’側にＳｐｈＩ認識配列を含む配列を付加したものである。
プラスミドｐＫｍ１ａｒｏＦｍ−１８を鋳型とし、配列番号１０２および１０３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、１０ｎｇのプラスミドＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ａｒｏＦ−ｔｙｒＡ遺伝子断片に相当する約２．２ｋｂの断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離し、得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶液５μＬを用い、増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｈＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより、ａｒｏＦ−ｔｙｒＡオペロンを含む２．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製可能］０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｈＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により４．６ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたａｒｏＦ−ｔｙｒＡオペロンを含む２．２ｋｂのＤＮＡ断片と４．６ｋｂのＤＮＡ断片とをライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出して、チロシン耐性を示すａｒｏＦ−ｔｙｒＡオペロン発現プラスミドが取得されていることを制限酵素消化により確認し、該プラスミドをｐＴＹ１と命名した。
上記で得られたｐＴＹ１ ０．２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより、ｔｒｐプロモーターとチロシン耐性を示すａｒｏＦ−ｔｙｒＡオペロンを含む２．６ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
次にｐＡＣＹＣ１８４の複製起点をもちクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドベクターｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）０．２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｔｒｐプロモーターとチロシン耐性を示すａｒｏＦ−ｔｙｒＡオペロンを含む２．６ｋｂのＤＮＡ断片と３．０ｋｂのＤＮＡ断片とをライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、チロシン耐性を示すａｒｏＦ−ｔｙｒＡオペロン発現ベクターが取得されていることを制限酵素消化により確認し、該プラスミドをｐＴＹ２と命名した。
ｍｅｔＪ遺伝子欠損株の作製
（１）ｍｅｔＪ遺伝子欠損用薬剤耐性遺伝子断片のクローニング
エシェリヒア・コリＫ１２株のｍｅｔＪ遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている［Ｓｃｉｅｎｃｅ，５３３１，１４５３−１４７４（１９９７）］。
ｍｅｔＪ遺伝子は、エシェリヒア・コリのＬ−メチオニン生合成系のリプレッサーをコードしており、このリプレッサーが産生できなくなる変異を導入することでＬ−メチオニン生産能が向上することが知られている（特開２０００−１３９４７１）。
報告されている塩基配列に基づいてパーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、ｍｅｔＪ遺伝子欠損株作製用のプライマーセットとして、配列番号１０４および１０５で表される塩基配列からなるＤＮＡを合成した。
該ＤＮＡは、各々欠損の標的遺伝子の上流と下流に位置する３６ｂｐからなる塩基配列に基づき設計した。
該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、ｐＫＤ３ＤＮＡを鋳型にしてｍｅｔＪ遺伝子欠損株作製用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片をＰＣＲで増幅した。
ＰＣＲは、プラスミドＤＮＡ１０ｎｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／Ｌ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液４μＬ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／Ｌを含む反応液４０μＬを用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離し、得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
（２）染色体ＤＮＡ上のｍｅｔＪ遺伝子に薬剤耐性遺伝子が挿入されたエシェリヒア・コリＪＭ１０１株の作製
エシェリヒア・コリＪＭ１０１および上記（１）で得られたｍｅｔＪ遺伝子欠損株作製用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を用いて、実施例１（２）と同様の操作により、エシェリヒア・コリＪＭ１０１の染色体ＤＮＡ上のｍｅｔＪ遺伝子にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入された組換え体を作製した。
染色体上へのクロラムフェニコール耐性遺伝子の挿入の確認は、クロラムフェニコール耐性遺伝子挿入部位の上流および下流のおよそ４００ｂｐに位置する塩基配列を有する配列番号１０６および１０７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いたコロニーＰＣＲにより行った。コロニーＰＣＲは、実施例１（２）と同じ条件で行った。
コロニーＰＣＲに供した株のうちでクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むおよそ２ｋｂの大きさの増幅断片が得られた株は、ｍｅｔＪ遺伝子欠損株であることを確認した後、実施例７（３）と同様の操作によりＦｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを発現するｐＣＰ２０を用いて染色体ＤＮＡからクロラムフェニコール耐性遺伝子が脱落した株を作製し、エシェリヒア・コリＪＭＪ１と命名した。
ｙｗｆＥ遺伝子およびエシェリヒア・コリ由来阻害解除型３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｓｅｒＡ遺伝子）発現プラスミドの構築
エシェリヒア・コリ由来の３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｓｅｒＡ遺伝子）において、構造遺伝子の１０９６〜１０９８番目のコドンを終止コドン（ＴＡＡ）に置換する変異は、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼのＣ末端の４５アミノ酸残基が欠失した、セリンによる実質的な阻害が解除された変異型の３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（以下、阻害解除型ｓｅｒＡ遺伝子という）を与えることが知られている（特許第２５８４４０９号）。
阻害解除型ｓｅｒＡ遺伝子増幅用プライマーには配列番号１０８で表される塩基配列からなるＤＮＡ、およびコドン置換変異配列を含む配列番号１０９で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いた。
配列番号１０８で表される塩基配列は、ｓｅｒＡ遺伝子のリボソーム結合配列であるシャイン−ダルガルノ配列を含む領域の５’側にＣｌａＩ認識配列を含む配列を付加した配列であり、配列番号１０９で表される塩基配列は、ｓｅｒＡ遺伝子のＣ末端４５アミノ酸残基を欠失させるための終止コドンを含む配列と相補的な配列の５’側にＳｐｈＩ認識配列を含む配列を付加した配列である。
上記合成ＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、エシェリヒア・コリＷ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型に阻害解除型ｓｅｒＡ遺伝子を増幅するＰＣＲを行った。ＰＣＲは、染色体ＤＮＡ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／Ｌ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液４μＬ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／Ｌを含む反応液４０μＬを用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、阻害解除型ｓｅｒＡ遺伝子断片に相当する約１．１ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩとＳｐｈＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより、ｓｅｒＡを含む１．１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
次に、ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０〔大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製可能〕０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｈＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により４．３ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｓｅｒＡ遺伝子を含む１．１ｋｂのＤＮＡ断片と４．３ｋｂのＤＮＡ断片とをライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、プラスミドｐＳＥ１５と名付けた。該ベクターの構造を制限酵素消化により確認した。
上記で得られたエシェリヒア・コリ由来阻害解除型ｓｅｒＡ遺伝子発現プラスミドｐＳＥ１５を鋳型に、配列番号１１０および１０９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いて阻害解除型ｓｅｒＡ遺伝子断片の増幅を行った。
また実験例１５で造成したｙｗｆＥ遺伝子発現プラスミドｐＰＥ５６を鋳型に、配列番号１１１および１１２で表される塩基配列からなるＤＮＡプライマーセットを用いてｔｒｐプロモーターを含むｙｗｆＥ遺伝子断片の増幅を行った。ＰＣＲは、いずれもプラスミドＤＮＡ１０ｎｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／Ｌ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液４μＬ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／Ｌを含む反応液４０μＬを用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
各該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離してＤＮＡを沈殿させた後、２０μＬのＴＥに溶解した。
上記操作により、阻害解除型ｓｅｒＡ遺伝子断片およびｔｒｐプロモーターを含むｙｗｆＥ遺伝子断片を取得した。阻害解除型ｓｅｒＡ遺伝子断片は、制限酵素ＢｇｌＩＩとＳｐｈＩを用いて切断し、ｔｒｐプロモーターを含むｙｗｆＥ遺伝子断片は、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断し、それぞれアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより、ｓｅｒＡ遺伝子を含む１．１ｋｂおよびｔｒｐプロモーターとｙｗｆＥ遺伝子とを含む１．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０ ０．２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｓｅｒＡ遺伝子を含む１．１ｋｂのＤＮＡ断片とｔｒｐプロモーター、ｙｗｆＥ遺伝子を含む１．８ｋｂのＤＮＡ断片、および３．９ｋｂのＤＮＡ断片とをライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、阻害解除型ｓｅｒＡ遺伝子がｙｗｆＥ遺伝子と順向きに挿入されたプラスミドが取得されていることを制限酵素消化により確認し、該プラスミドをｐＰＥ２１２と命名した。
ｉｌｖＬ遺伝子欠損株、および復帰型ｉｌｖＧ遺伝子置換株の作製
（１）ｉｌｖＬ遺伝子欠損株作製用薬剤耐性遺伝子断片および復帰型ｉｌｖＧ遺伝子置換株作製用ＤＮＡ断片のクローニング
エシェリヒア・コリＫ１２株のｉｌｖＬ、ｉｌｖＧの各遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている［Ｓｃｉｅｎｃｅ，５３３１，１４５３−１４７４（１９９７）］。
エシェリヒア・コリＫ１２株のｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの発現を調節するアテニュエーター領域は該オペロンの５’側上流域に位置し、その塩基配列はＮｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５，２１３７（１９８７）に記載されている。またこのアテニュエーター領域を除去することにより、アテニュエーションが機能しなくなりｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが構成的に発現することが知られている（特開平８−４７３９７９）ことから、以下の方法により、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン構成発現型のエシェリヒア・コリＫ１２株を作製した。
また、エシェリヒア・コリＫ１２株の野生株は、ｉｌｖＧ遺伝子がフレームシフト変異を持っているために活性のあるアセトヒドロキシ酸シンターゼのアイソザイムＩＩ（ＡＨＡＳＩＩ）が発現していない［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，９２２，（１９８１）］。そこでＡＨＡＳＩＩが正常に機能しているエシェリヒア・コリＯ１５７：Ｈ７株の染色体ＤＮＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ／ｏ１５７．ｈｔｍ）上に存在するｉｌｖＧ遺伝子配列を参考に、エシェリヒア・コリＫ１２株のｉｌｖＧ遺伝子の９８１番目と９８２番目の間にＡＡという２塩基の挿入によりフレームが戻った変異を導入し、アセトヒドロキシ酸シンターゼの活性が回復したエシェリヒア・コリＫ１２株を以下の方法で作成した。
報告されている塩基配列に基づいてパーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、ｉｌｖＬ遺伝子欠損株作製用薬剤耐性遺伝子を増幅するためのプライマーセットとして、配列番号１１３および１１４で表される塩基配列からなるＤＮＡを合成した。
該ＤＮＡは各々欠損の標的遺伝子の上流と下流に位置する３６ｂｐの相同配列を有している。
また、復帰型ｉｌｖＧ遺伝子上流領域増幅用プライマーセットとして、配列番号１１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および二塩基挿入変異配列を含む配列番号１１６で表される塩基配列からなるＤＮＡ、復帰型ｉｌｖＧ遺伝子下流領域増幅用プライマーセットとして、二塩基変異配列を含む配列番号１１７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および配列番号１１８で表される塩基配列からなるＤＮＡを合成した。
上記ＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、ｐＫＤ３ＤＮＡを鋳型にｉｌｖＬ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を、エシェリヒア・コリＷ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型に、復帰型ｉｌｖＧ上流領域、および復帰型ｉｌｖＧ下流領域をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ０．１μｇ、またはプラスミドＤＮＡ１０ｎｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／Ｌ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液４μＬ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／Ｌを含む反応液４０μＬを用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
各該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離してＤＮＡを沈殿させた後、該ＤＮＡを２０μＬのＴＥに溶解した。上記操作により、ｉｌｖＬ遺伝子欠損株作製用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片、および復帰型ｉｌｖＧ遺伝子上流領域、復帰型ｉｌｖＧ遺伝子下流領域を取得した。
次に、復帰型ｉｌｖＧ遺伝子上流領域、および復帰型ｉｌｖＧ遺伝子下流領域を鋳型に、配列番号１１５および１１８で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用いてクロスオーバーＰＣＲ［Ａ．Ｊ．Ｌｉｎｋ，Ｄ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｍ．Ｃｈｕｒｃｈ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，６２２８−６２３７（１９９７）］を行った。ＰＣＲは、上記と同様の条件下で行った。
上記ＰＣＲにより、復帰型ｉｌｖＧ遺伝子上流領域と復帰型ｉｌｖＧ遺伝子下流領域が連結した復帰型ｉｌｖＧ置換株作製用ＤＮＡ断片を取得した。
（２）染色体ＤＮＡ上のｉｌｖＧ遺伝子が復帰型ｉｌｖＧ遺伝子に置換したエシェリヒア・コリＪＭ１０１株の作製
エシェリヒア・コリＪＭ１０１株を常法によりｐＫＤ４６で形質転換した後、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で一晩培養することによりｐＫＤ４６を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１株（以下、エシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＫＤ４６と称す）を選択した。
１０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−アラビノースと５０μｇ／ｍｌのアンピシリン存在下で培養したエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＫＤ４６を、上記（１）で取得した復帰型ｉｌｖＧ遺伝子置換株作製用ＤＮＡ断片を用いて電気パルス法により形質転換し、染色体ＤＮＡ上のｉｌｖＧ遺伝子が復帰型ｉｌｖＧに置換した株を、２００ｍｇ／ＬのＬ−バリンを含むＭ９培地にグルコースを添加した寒天培地上で選択した。
取得したＬ−バリン耐性株を、再度２００ｍｇ／ＬのＬ−バリンを含むＭ９培地にグルコースを添加した寒天培地にレプリカし、４２℃で保温した状態で単コロニー分離を実施した。得られた各コロニーを２００ｍｇ／ＬのＬ−バリンを含むＭ９培地にグルコースを添加した寒天培地および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカし、Ｌ−バリン耐性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択し、取得された復帰型ｉｌｖＧ遺伝子置換株を、エシェリヒア・コリＪＭ１０１Ｇ＋１と命名した。
（３）染色体ＤＮＡ上のｉｌｖＧ遺伝子が復帰型ｉｌｖＧ遺伝子に置換し、ｉｌｖＬ遺伝子が欠損したエシェリヒア・コリＪＭ１０１株の作製
上記（２）で得られたエシェリヒア・コリＪＭ１０１Ｇ＋１株をｐＫＤ４６で形質転換した後、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で一晩培養することによりｐＫＤ４６を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１Ｇ＋１株（以下、エシェリヒア・コリＪＭ１０１Ｇ＋１／ｐＫＤ４６と称す）を取得した。
次に、上記（１）で取得したｉｌｖＬ遺伝子欠損株作製用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０１Ｇ＋１／ｐＫＤ４６を、電気パルス法により形質転換し、ＪＭ１０１株の染色体ＤＮＡ上のｉｌｖＬ遺伝子にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入された組換え株を２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上で選択した。
取得したクロラムフェニコール耐性株を、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地にレプリカし、４２℃で保温した状態で単コロニー分離を実施した。得られた各コロニーを２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地、および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカし、クロラムフェニコール耐性かつアンピシリン感受性を示すｐＫＤ４６脱落株を選択した。
エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡ上において、クロラムフェニコール耐性遺伝子挿入部位の上流および下流のおよそ４００ｂｐに位置する塩基配列を有する配列番号１１９および１２０で表される塩基配列を合成し、該合成ＤＮＡをプライマーセットに用いたコロニーＰＣＲにより、上記で取得した形質転換株の染色体ＤＮＡの構造を確認した。コロニーＰＣＲは、２００μｌのピペットチップをコロニーに触れさせることで取得した量の菌体、プライマー各０．５μｍｏｌ／Ｌ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液４μＬ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／Ｌを含む反応液４０μｌを用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
コロニーＰＣＲに供した株のうちでクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むおよそ２ｋｂの大きさの増幅断片が得られた株は、ｉｌｖＬ遺伝子欠損株であることを確認し、エシェリヒア・コリＪＩＬＧ＋Ｃｍ１と命名した。
次に上記で得られたエシェリヒア・コリＪＩＬＧ＋Ｃｍ１をｐＣＰ２０を用いて形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で選択することにより、ｐＣＰ２０を保持するエシェリヒア・コリＪＩＬＧ＋Ｃｍ１を取得した。
プラスミドｐＣＰ２０は、酵母由来Ｆｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子を有し、該遺伝子の発現は４２℃で誘導することができる。
また、上記（１）で作製したｉｌｖＬ遺伝子欠損株作製用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片中のクロラムフェニコール耐性遺伝子の両端には、Ｆｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識する塩基配列が存在するため、Ｆｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが触媒する相同組換えにより容易に該耐性遺伝子を脱落させることができる。
さらに、ｐＣＰ２０は温度感受性の複製起点を有しているため、ｐＣＰ２０保持株を４２℃で生育させることにより、Ｆｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅの発現とｐＣＰ２０の脱落を同時に誘導することができる。
上記で取得したエシェリヒア・コリＪＩＬＧ＋Ｃｍ１を薬剤無添加のＬＢ寒天培地に植菌し、４２℃で１４時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを薬剤無添加ＬＢ寒天培地、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカして、３０℃で培養し、クロラムフェニコール感受性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。
上記で選択した各株について、配列番号１１９および１２０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いて、コロニーＰＣＲを行った。コロニーＰＣＲは、２００μｌのピペットチップをコロニーに触れさせることで取得した量の菌体、プライマー各０．５μｍｏｌ／Ｌ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液４μＬ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／Ｌを含む反応液４０μｌを用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
ＰＣＲに供した株のうちでクロラムフェニコール耐性遺伝子が脱落したおよそ０．７ｋｂの大きさの増幅断片が得られた株は、ｉｌｖＬ遺伝子欠損株であることを確認し、エシェリヒア・コリＪＩＬＧ＋１と命名した。
阻害解除型ｉｌｖＡ置換株の作製
（１）ｉｌｖＡ遺伝子欠損株作製用薬剤耐性遺伝子断片および阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子置換株作製用ＤＮＡ断片のクローニング
エシェリヒア・コリＫ１２株のｉｌｖＡ遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている［Ｓｃｉｅｎｃｅ，５３３１，１４５３−１４７４（１９９７）］。
Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除したスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ２１９遺伝子（以下、阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子と称す）は４４７番目のロイシンがフェニルアラニンへ置換した変異を有することが知られている。［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，９４０３（１９９５）］。
報告されている塩基配列に基づいてパーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、ｉｌｖＡ遺伝子欠損株作製用薬剤耐性遺伝子断片を増幅するためのプライマーＤＮＡとして配列番号１２１および１２２で表される塩基配列からなるＤＮＡを合成した。
該ＤＮＡは各々欠損の標的遺伝子の上流と下流に位置する３６ｂｐと同一の塩基配列を有している。
また、阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子上流領域増幅用のプライマーセットとして、配列番号１２３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、コドン置換変異配列を含む配列番号１２４で表される塩基配列を有するＤＮＡを、阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子下流領域増幅用プライマーセットとして、コドン置換変異配列を含む配列番号１２５で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１２６で表される塩基配列からなるＤＮＡを合成した。
上記ＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、ｐＫＤ３ＤＮＡを鋳型にｉｌｖＡ遺伝子欠損株作製用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を、エシェリヒア・コリＷ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型に阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子上流領域、および阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子下流領域を増幅するＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ０．１μｇ、またはプラスミドＤＮＡ１０ｎｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／Ｌ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液４μＬ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／Ｌを含む反応液４０μＬを用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
各該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離してＤＮＡを沈殿させた後、該ＤＮＡを２０μＬのＴＥに溶解した。上記操作により、ｉｌｖＡ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片、阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子上流領域、および阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子下流領域を取得した。
次に上記ＰＣＲ増幅断片のうち、阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子上流領域、および阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子下流領域を鋳型に、配列番号１２３および１２６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いて、クロスオーバーＰＣＲを行った。ＰＣＲは、上記と同様の条件下で行った。
上記ＰＣＲにより、阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子上流領域と阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子下流領域が連結した阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子置換株作製用ＤＮＡ断片を取得した。
（２）エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡ上のｉｌｖＡ遺伝子に薬剤耐性遺伝子が挿入されたエシェリヒア・コリＪＭ１０１株の作製
１０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−アラビノースと５０μｇ／ｍｌのアンピシリン存在下で培養したエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＫＤ４６を、上記（１）で取得したｉｌｖＡ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を用いて電気パルス法により形質転換し、ＪＭ１０１株の染色体ＤＮＡ上のｉｌｖＡ遺伝子にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入され、ｉｌｖＡ構造遺伝子が欠損した組換え株を２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上で選択した。
取得したクロラムフェニコール耐性株を、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地にレプリカし、３０℃で保温した状態で単コロニー分離を実施した。得られた各コロニーを２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールと１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカし、クロラムフェニコール耐性かつアンピシリン耐性性を示すコロニーを選択した。
得られた各株について、染色体ＤＮＡ上のクロラムフェニコール耐性遺伝子挿入部位の上流および下流のおよそ４００ｂｐに位置する塩基配列を有する配列番号１２３および１２６で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして、コロニーＰＣＲを行った。
コロニーＰＣＲは、２００μｌのピペットチップをコロニーに触れさせることで取得した量の菌体、プライマー各０．５μｍｏｌ／Ｌ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液４μＬ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／Ｌを含む反応液４０μｌを用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
ＰＣＲに供した株のうちでクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むおよそ２ｋｂの大きさの増幅断片が得られた株は、ｉｌｖＡ遺伝子欠損株であることを確認し、エシェリヒア・コリＪＩＡＣｍ１／ｐＫＤ４６と命名した。
（３）染色体ＤＮＡ上のｉｌｖＡ遺伝子が阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子に置換したエシェリヒア・コリＪＭ１０１株の作製
上記（２）で作製したエシェリヒア・コリＪＩＡＣｍ１／ｐＫＤ４６株を、１０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−アラビノースと５０μｇ／ｍｌのアンピシリン存在下で培養後、上記（１）で取得した阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子置換株作製用ＤＮＡ断片を用いて電気パルス法により形質転換し、ＪＩＡＣｍ１株の染色体ＤＮＡ上のｉｌｖＡ遺伝子が阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子に置換した株を、イソロイシン要求性の復帰指標にしてＭ９培地にグルコースを添加した寒天培地上で選択した。
生育してきたアンピシリン耐性株を薬剤無添加のＭ９培地にグルコースを添加した寒天培地にレプリカし、４２℃で保温した状態で単コロニー分離を実施した。得られた各コロニーを薬剤無添加、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地、および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にそれぞれレプリカし、クロラムフェニコール感受性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。得られた株が阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子置換株であることを確認し、エシェリヒア・コリＪＩＡ１と命名した。
（４）染色体ＤＮＡ上のｉｌｖＡ遺伝子が、阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子に置換したエシェリヒア・コリＪＩＬＧ＋１の作製
エシェリヒア・コリＪＭ１０１の代わりに親株として実施例７で作製したエシェリヒア・コリＪＩＬＧ＋１を用いて、上記（１）〜（３）の操作を行うことにより、ｉｌｖＬ遺伝子が欠損し、ｉｌｖＧ遺伝子が復帰型ｉｌｖＧ遺伝子に置換しており、かつｉｌｖＡ遺伝子が、阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子に置換した株を取得し、エシェリヒア・コリＪＩＬＧ＋ＩＡ１と命名した。
変異型ｌｅｕＡ遺伝子置換株の作製
（１）ｌｅｕＡ遺伝子欠損株作製用薬剤耐性遺伝子断片および変異型ｌｅｕＡ遺伝子置換株作製用ＤＮＡ断片のクローニング
エシェリヒア・コリＫ１２株のｌｅｕＡ遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている［Ｓｃｉｅｎｃｅ，５３３１，１４５３−１４７４（１９９７）］。
エシェリヒア・コリＦＥＲＭ ＢＰ−４７０４は、ロイシンアナログ（４−アザロイシン）耐性により選抜されてきたロイシン生産菌であり（特開平８−７０８７９）、Ｌ−ロイシンによる阻害が実質的に解除したイソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードする変異型ｌｅｕＡ遺伝子を有していると考えられる。
報告されている塩基配列に基づいてパーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、ｌｅｕＡ遺伝子欠損株作製用薬剤耐性遺伝子断片のを増幅するためのプライマーセットとして、配列番号１２７および１２８で表される塩基配列からなるＤＮＡを合成した。
該ＤＮＡは、各々欠損の標的遺伝子の上流と下流に位置する３６ｂｐと同一の塩基配列を有している。
また、変異型ｌｅｕＡ遺伝子置換株作製用ＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーセットとして、ｌｅｕＡ遺伝子の開始コドンから上流およそ２００ｂｐに位置する塩基配列を有する配列番号１２９で表されるＤＮＡ、および終止コドンから下流およそ２００ｂｐに位置する塩基配列と逆向きの配列を有する配列番号１３０で表されるＤＮＡを合成した。
上記のＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、ｐＫＤ３ＤＮＡを鋳型にしてｌｅｕＡ遺伝子欠損株作製用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を、また常法により調製したＦＥＲＭ ＢＰ−４７０４の染色体ＤＮＡを鋳型にして変異型ｌｅｕＡ遺伝子置換株作製用ＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。
ＰＣＲは、染色体ＤＮＡ０．１μｇ、またはプラスミドＤＮＡ１０ｎｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／Ｌ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液４μＬ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／Ｌを含む反応液４０μＬを用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
各該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離してＤＮＡを沈殿させた後、該ＤＮＡを２０μＬのＴＥに溶解した。上記操作により、ｌｅｕＡ遺伝子欠損株作製用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片、および変異型ｌｅｕＡ遺伝子置換株作製用ＤＮＡ断片を取得した。
（２）染色体ＤＮＡ上のｌｅｕＡ遺伝子に薬剤耐性遺伝子が挿入したエシェリヒア・コリＪＭ１０１株の作製
実施例８（２）と同様の操作により、エシェリヒア・コリＪＭ１０１株の染色体ＤＮＡ上のｌｅｕＡ遺伝子にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されたエシェリヒア・コリの変異株を作製した。
染色体ＤＮＡ上へのクロラムフェニコール耐性遺伝子の挿入の確認は、クロラムフェニコール耐性遺伝子挿入部位の上流および下流のおよそ２００ｂｐに位置する塩基配列を有する配列番号１３１および１３２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いた、コロニーＰＣＲにより行った。
ＰＣＲは、実施例８（２）と同様の条件で行った。コロニーＰＣＲに供した株のうちでクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むおよそ２ｋｂの大きさの増幅断片が得られた株は、クロラムフェニコール耐性遺伝子がｌｅｕＡ遺伝子中に挿入されたｌｅｕＡ遺伝子欠損株であることを確認し、ＪＬＡＣｍ１／ｐＫＤ４６と命名した。
（３）染色体ＤＮＡ上のｌｅｕＡ遺伝子がエシェリヒア・コリＨ−９０７０株由来の変異型遺伝子に置換したエシェリヒア・コリＪＭ１０１株の作製
上記（１）で作製した変異型ｌｅｕＡ遺伝子置換株作製用ＤＮＡ断片、および上記（２）で作製したエシェリヒア・コリＪＬＡＣｍ１／ｐＫＤ４６株を用いて、実施例８（３）と同様の操作により、エシェリヒア・コリＪＬＡＣｍ１／ｐＫＤ４６の染色体ＤＮＡ上のクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されたｌｅｕＡ遺伝子が、変異型ｌｅｕＡ遺伝子に置換した組換え株を作製し、エシェリヒア・コリＪＬＡ１と命名した。
（４）染色体ＤＮＡ上のｌｅｕＡ遺伝子が、変異型ｌｅｕＡ遺伝子に置換したエシェリヒア・コリＪＩＬＧ＋１の作製
エシェリヒア・コリＪＭ１０１の代わりに親株として実施例７で作製したエシェリヒア・コリＪＩＬＧ＋１を用いて、上記（１）〜（３）の操作を行うことにより、ｉｌｖＬ遺伝子が欠損し、ｉｌｖＧ遺伝子が復帰型ｉｌｖＧ遺伝子に置換しており、かつｌｅｕＡ遺伝子が、変異型ｌｅｕＡ遺伝子に置換した株を取得し、エシェリヒア・コリＪＩＬＧ＋ＬＡ１と命名した。
Ｌ−アラニンを生産する能力を有する微生物を用いたＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａの発酵生産
実施例２で得られたバチルス・サチルス由来のｙｗｆＥ遺伝子およびバチルス・サチルス由来のａｌｄ遺伝子発現プラスミドｐＰＥ８６を用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０１株を形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で一晩培養した。生育してきた株から公知の手法によりプラスミドを抽出して、該プラスミドを制限酵素処理し、プラスミドｐＰＥ８６を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１株（以下、エシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＰＥ８６と称す）が取得できたことを確認した。同様の方法で、プラスミドｐＴｒＳ３０を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１株（以下、エシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＴｒＳ３０と称す）、プラスミドｐＰＥ５６を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１株（以下、エシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＰＥ５６と称す）も取得した。
上記の形質転換株を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地が入った試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む生産培地［１６ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、１４ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、５ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、１ｇ／Ｌクエン酸（無水）、５ｇ／Ｌカザミノ酸（ディフコ社製）、１０ｇ／Ｌグルコース、１０ｍｇ／ＬビタミンＢ１、２５ｍｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、５０ｍｇ／Ｌ硫酸鉄・７水和物、ｐＨ７．２に１０ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムで調整、グルコース、ビタミンＢ１、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸鉄・７水和物は別個に蒸煮後添加した］が８ｍｌ入っている試験管に１％接種し、３０℃で２４時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
該培養上清中の培養生成物を、Ｆ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後、ＨＰＬＣを用いて該生成物を分析した。ＨＰＬＣ法による分析は、実験例１７と同様の方法で行った。結果を表６に示す。
Figure 0004796495
Ｌ−ＡｌａおよびＬ−Ｇｌｎを生産する能力を有する微生物を用いたＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎの発酵生産
実施例１で得られたｇｌｎＥ遺伝子およびｇｌｎＢ遺伝子の二重欠損株であるエシェリヒア・コリＪＧＬＢＥ１を、実施例２で得られたｐＰＥ８６で形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。生育してきたコロニーから公知の方法によってプラスミドを抽出し、ｐＰＥ８６を保持するエシェリヒア・コリＪＧＬＢＥ１株が取得できていることを制限酵素処理で確認し、該株をエシェリヒア・コリＪＧＬＢＥ１／ｐＰＥ８６と命名した。同様の方法で、ｐＴｒＳ３０を保持するエシェリヒア・コリＪＧＬＢＥ１株（以下、エシェリヒア・コリＪＧＬＢＥ１／ｐＴｒＳ３０と称す）、ｐＰＥ５６を保持するエシェリヒア・コリＪＧＬＢＥ１株（エシェリヒア・コリＪＧＬＢＥ１／ｐＰＥ５６と称す）も取得した。
上記の形質転換株を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地が入っている試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む実施例１０記載の生産培地が８ｍｌ入っている試験管に１％接種し、３０℃で２４時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
培養上清中の培養生成物をＦ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後、ＨＰＬＣを用いて該生成物を分析した。ＨＰＬＣ法による分析は、実験例１７と同様の方法で行った。結果を表７に示す。
Figure 0004796495
Ｌ−ＡｌａおよびＬ−Ｐｈｅを生産する能力を有する微生物を用いたＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅの発酵生産
実施例１０で取得したエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＰＥ８６を、実施例３で造成したエシェリヒア・コリ由来の脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子発現プラスミドであるｐＰＨＥＡ２、またはエシェリヒア・コリ由来の脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子と脱感作型ａｒｏＦ遺伝子発現プラスミドであるｐＰＨＥＡＦ２を用いて形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。生育してきたコロニーから公知の方法にてプラスミドを抽出し、ｐＰＨＥＡ２またはｐＰＨＥＡＦ２を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＰＥ８６（それぞれ、エシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＰＥ８６／ｐＰＨＥＡ２、エシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＰＥ８６／ｐＰＨＥＡＦ２と称す）が取得できていることを確認した。同様の方法で、実施例１０で取得したエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＴｒＳ３０およびエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＰＥ５６を、ｐＰＨＥＡ２またはｐＰＨＥＡＦ２で形質転換することにより、ｐＰＨＥＡ２を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＴｒＳ３０（以下、エシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＴｒＳ３０／ｐＰＨＥＡ２）、ｐＰＨＥＡＦ２を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＴｒＳ３０（以下、エシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＴｒＳ３０／ｐＰＨＥＡＦ２と称す）、ｐＰＨＥＡ２を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＰＥ５６（以下、エシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＰＥ５６／ｐＰＨＥＡ２と称す）、ｐＰＨＥＡＦ２を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＰＥ５６（以下、エシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＰＥ５６／ｐＰＨＥＡＦ２と称す）を取得した。
上記の形質転換株を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む８ｍｌのＬＢ培地が入っている試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む実施例１０記載の生産培地が８ｍｌ入っている試験管に１％接種し、３０℃で２４時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
培養上清中の培養生成物をＦ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後、ＨＰＬＣを用いて該生成物を分析した。ＨＰＬＣによる分析は、実験例１７と同様の方法で行った。結果を表８に示す。
Figure 0004796495
Ｌ−ＴｈｒおよびＬ−Ｐｈｅを生産する能力を有する微生物を用いたＬ−スレオニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ｐｈｅ）の発酵生産
プロリン、メチオニン、イソロイシンおよびチアミン要求性を示し、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性が付与されたＬ−Ｔｈｒを生産する能力を有するエシェリヒア・コリβＩＭ−４株（ＡＴＣＣ２１２７７）を、実験例１５で得られたバチルス・サチルス由来のｙｗｆＥ遺伝子の発現を強化したプラスミドであるｐＰＥ５６で形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。生育してきたコロニーから公知の方法によりプラスミドを抽出し、ｐＰＥ５６を保持するエシェリヒア・コリＡＴＣＣ２１２７７（以下、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ２１２７７／ｐＰＥ５６と称す）が取得されていることを制限酵素処理により確認した。
次にエシェリヒア・コリＡＴＣＣ２１２７７／ｐＰＥ５６を、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、実施例３で得られたｐＰＨＥＡ２またはｐＰＨＥＡＦ２を用いて形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。生育してきたコロニーから公知の方法によりプラスミドを抽出し、ｐＳＴＶ２８、ｐＰＨＥＡ２またはｐＰＨＥＡＦ２を保持するエシェリヒア・コリＡＴＣＣ２１２７７／ｐＰＥ５６（以下、それぞれエシェリヒア・コリＡＴＣＣ２１２７７／ｐＰＥ５６／ｐＳＴＶ２８、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ２１２７７／ｐＰＥ５６／ｐＰＨＥＡ２およびエシェリヒア・コリＡＴＣＣ２１２７７／ｐＰＥ５６／ｐＰＨＥＡＦ２と称す）が取得されていることを制限酵素処理により確認した。同様の方法により、ｐＴｒＳ３０およびｐＳＴＶ２８を保持するエシェリヒア・コリＡＴＣＣ２１２７７（以下、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ２１２７７／ｐＴｒＳ３０／ｐＳＴＶ２８と称す）、ｐＴｒＳ３０およびｐＰＨＥＡ２を保持するエシェリヒア・コリＡＴＣＣ２１２７７（以下、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ２１２７７／ｐＴｒＳ３０／ｐＰＨＥＡ２と称す）、ｐＴｒＳ３０およびｐＰＨＥＡＦ２を保持するエシェリヒア・コリＡＴＣＣ２１２７７（以下、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ２１２７７／ｐＴｒＳ３０／ｐＰＨＥＡＦ２と称す）を取得した。
上記の形質転換株を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む８ｍＬのＬＢ培地が入っている試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む上記実施例４記載の生産培地が８ｍｌ入っている試験管に１％接種し、３０℃で２４時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
培養上清中の培養生成物をＦ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後、ＨＰＬＣを用いて該生成物を分析した。ＨＰＬＣによる分析は、実験例１７と同様の方法で行った。結果を表９に示す。
Figure 0004796495
Ｌ−ＡｌａおよびＬ−Ｔｙｒを生産する能力を有する微生物を用いたＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｔｙｒの発酵生産
実施例１０で取得したエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＰＥ８６を、実施例４で造成したエシェリヒア・コリ由来のチロシン耐性変異型ａｒｏＦ−ｔｙｒＡオペロン発現プラスミドであるｐＴＹ２を用いて形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。生育してきたコロニーから公知の方法にてプラスミドを抽出し、ｐＴＹ２を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＰＥ８６（以下、エシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＰＥ８６／ｐＴＹ２と称す）が取得できていることを確認した。同様の方法で、実施例１０で取得したエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＴｒＳ３０およびエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＰＥ５６を、ｐＴＹ２で形質転換することにより、ｐＴＹ２を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＴｒＳ３０（以下、エシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＴｒＳ３０／ｐＴＹ２と称す）、ｐＴＹ２を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＰＥ５６（以下、エシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＰＥ５６／ｐＴＹ２と称す）を取得した。
上記の各形質転換株を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む８ｍｌのＬＢ培地が入っている試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む実施例１０記載の生産培地が８ｍｌ入っている試験管に１％接種し、３０℃で２４時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
培養上清中の培養生成物をＦ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後、ＨＰＬＣを用いて該生成物を分析した。ＨＰＬＣによる分析は、実験例１７と同様の方法で行った。結果を表１０に示す。
Figure 0004796495
Ｌ−ＡｌａおよびＬ−Ｍｅｔを生産する能力を有する微生物を用いたＬ−アラニル−Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｍｅｔ）の発酵生産
実施例５で取得したエシェリヒア・コリＪＭＪ１を、実施例２で取得したｐＰＥ８６で形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。生育してきたコロニーから公知の方法によってプラスミドを抽出し、ｐＰＥ８６を保持するエシェリヒア・コリＪＭＪ１株が取得できていることを制限酵素処理で確認し、該株をエシェリヒア・コリＪＭＪ１／ｐＰＥ８６と命名した。同様の方法で、ｐＴｒＳ３０を保持するエシェリヒア・コリＪＭＪ１株（以下、エシェリヒア・コリＪＭＪ１／ｐＴｒＳ３０と称す）、ｐＰＥ５６を保持するエシェリヒア・コリＪＭＪ１株（エシェリヒア・コリＪＭＪ１／ｐＰＥ５６と称す）も取得した。
上記の形質転換株を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地が入っている試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む実施例１０記載の生産培地が８ｍｌ入っている試験管に１％接種し、３０℃で２４時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
培養上清中の培養生成物をＦ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後、ＨＰＬＣを用いて該生成物を分析した。ＨＰＬＣ法による分析は、実験例１７と同様の方法で行った。結果を表１１に示す。
Figure 0004796495
実施例１０〜１５に示す結果から、１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有し、かつ該１種以上のアミノ酸のうちの少なくとも１種のアミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地に培養することにより、該培地中にジペプチドを生成、蓄積させることができること、および１種のアミノ酸を生産する能力を有する上記微生物に比べ、２種のアミノ酸を生産する能力を有する上記微生物の方が、ジペプチドの生産能力が高いことが明らかとなった。
Ｌ−Ａｌａを生産する能力を有し、かつペプチダーゼ遺伝子およびジペプチド取り込み蛋白質遺伝子が欠損している微生物を用いたＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａの発酵生産
実験例１６（４）で得られたｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子およびｄｐｐオペロン遺伝子が欠損しているエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６株を、ｐＴｒＳ３０、実施例２で得られたｐＰＥ５６またはｐＰＥ８６で形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。生育してきたコロニーから公知の方法によりプラスミドを抽出し、ｐＴｒＳ３０、ｐＰＥ５６またはｐＰＥ８６を保持するエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６株（以下、それぞれエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６／ｐＴｒＳ３０、エシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６／ｐＰＥ５６およびエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６／ｐＰＥ８６と称す）が取得できていることを、制限酵素処理により確認した。
上記の形質転換株を、それぞれ実施例１０と同様の方法で培養し、培養上清中の生成物を実験例１７と同様の方法により分析した結果を表１２に示す。
Figure 0004796495
Ｌ−ＡｌａおよびＬ−Ｇｌｎを生産する能力を有し、かつペプチダーゼ遺伝子およびジペプチド取り込み蛋白質遺伝子が欠損している微生物を用いたＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎの発酵生産
（１）Ｌ−ＡｌａおよびＬ−Ｇｌｎを生産する能力を有し、かつペプチダーゼ遺伝子およびジペプチド取り込み蛋白質遺伝子が欠損している微生物の造成
実験例１６（４）で得られたエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６株を用いて実施例１と同じ操作を行うことにより、エシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６株にｇｌｎＥ遺伝子欠損およびｇｌｎＢ遺伝子欠損を導入し、Ｌ−ＡｌａおよびＬ−Ｇｌｎを生産する能力を有し、かつペプチダーゼ遺伝子およびジペプチド取り込み蛋白質遺伝子が欠損している微生物であるエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＧＢＥ１株を取得した。
（２）Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎの発酵生産
上記（１）で得られたエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＧＢＥ１株を実施例１６と同様の方法によりｐＴｒＳ３０、ｐＰＥ５６またはｐＰＥ８６で形質転換して、該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＧＢＥ１株（以下、それぞれエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＧＢＥ１／ｐＴｒＳ３０、エシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＧＢＥ１／ｐＰＥ５６およびエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＧＢＥ１／ｐＰＥ８６と称す）を取得した。
エシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＧＢＥ１／ｐＴｒＳ３０、エシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＧＢＥ１／ｐＰＥ５６およびエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＧＢＥ１／ｐＰＥ８６を、実施例１０と同様の方法で培養し、培養上清中の生成物を実験例１７と同様の方法により分析した結果を表１３に示す。
Figure 0004796495
Ｌ−ＡｌａおよびＬ−Ｔｙｒを生産する能力を有し、かつペプチダーゼ遺伝子およびジペプチド取り込み蛋白質遺伝子が欠損している微生物を用いたＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｔｙｒの発酵生産
実験例１６で取得したＪＰＮＤＤＰ３６株を、実施例２で取得したｐＰＥ８６で形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。生育してきたコロニーから公知の方法によってプラスミドを抽出し、ｐＰＥ８６を保持するエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６株が取得できていることを制限酵素処理で確認し、該株をエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６／ｐＰＥ８６と命名した。同様の方法で、ｐＴｒＳ３０を保持するエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６株（以下、エシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６／ｐＴｒＳ３０と称す）、ｐＰＥ５６を保持するエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６株（エシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６／ｐＰＥ５６と称す）も取得した。
さらに、上記で得られた形質転換株を、それぞれ実施例４で取得したｐＴＹ２で形質転換することにより、ｐＴＹ２を保持する形質転換株であるエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６／ｐＴｒＳ３０／ｐＴＹ２、エシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６／ｐＰＥ５６／ｐＴＹ２、およびエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６／ｐＰＥ８６／ｐＴＹ２を取得した。
上記の形質転換株を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地が入っている試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む実施例１０記載の生産培地が８ｍｌ入っている試験管に１％接種し、３０℃で２４時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
培養上清中の培養生成物をＦ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後、ＨＰＬＣを用いて該生成物を分析した。ＨＰＬＣ法による分析は、実験例１７と同様の方法で行った。結果を表１４に示す。
Figure 0004796495
Ｌ−ＡｌａおよびＬ−Ｖａｌを生産する能力を有し、かつペプチダーゼ遺伝子およびジペプチド取り込み蛋白質遺伝子が欠損している微生物を用いたＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｖａｌの発酵生産
実験例１６で取得したペプチダーゼ遺伝子およびペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンの欠損変異株を親株に用いて、実施例７記載の方法に従い、ｉｌｖＬ遺伝子を欠損し、かつｉｌｖＧ遺伝子のフレームシフト変異が復帰したエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋１株を作製した。
実施例２で取得したｐＰＥ８６を用いて、エシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋１株を形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で一晩培養した。生育してきた株から公知の手法によりプラスミドを抽出して、該プラスミドを制限酵素処理し、プラスミドｐＰＥ８６を保持するエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋１株（以下、エシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋１／ｐＰＥ８６と称す）が取得できていることを確認した。同様にしてプラスミドｐＴｒＳ３０を保持するエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋１株（以下、エシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋１／ｐＴｒＳ３０と称す）、プラスミドｐＰＥ５６を保持するエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋１株（以下、エシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋１／ｐＰＥ５６と称す）を取得した。
上記の形質転換株を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地が入った試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む培地［１６ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、１４ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、５ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、１ｇ／Ｌクエン酸（無水）、５ｇ／Ｌカザミノ酸（ディフコ社製）、１０ｇ／Ｌグルコース、１０ｍｇ／ＬビタミンＢ１、２５ｍｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、５０ｍｇ／Ｌ硫酸鉄・７水和物、ｐＨ７．２に１０ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムで調整、グルコース、ビタミンＢ１、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸鉄・７水和物は別個に蒸煮後添加した］が８ｍｌ入っている試験管に１％接種し、３０℃で２４時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
該培養上清中の培養生成物を、Ｆ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後、ＨＰＬＣを用いて該生成物を分析した。ＨＰＬＣ法による分析は、実験例１７と同様の方法で行った。結果を表１５に示す。
Figure 0004796495
Ｌ−ＡｌａおよびＬ−Ｉｌｅを生産する能力を有し、かつペプチダーゼ遺伝子およびジペプチド取り込み蛋白質遺伝子が欠損している微生物を用いたＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｉｌｅの発酵生産
実験例１６で取得したペプチダーゼ遺伝子およびペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンの欠損変異株であるエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６株を親株として、ｉｌｖＬ遺伝子が欠損し、ｉｌｖＧ遺伝子のフレームシフト変異が復帰し、さらにｉｌｖＡ遺伝子が阻害解除型ｉｌｖＡ遺伝子に置換したエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋ＩＡ１株を実施例７および８記載の方法に準じて作製した。
エシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋ＩＡ１株を実施例２で取得したｐＰＥ８６で形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。生育してきたコロニーから公知の方法によってプラスミドを抽出し、ｐＰＥ８６を保持するエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋ＩＡ１株が取得できていることを制限酵素処理で確認し、該株をエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋ＩＡ１／ｐＰＥ８６と命名した。同様の方法で、ｐＴｒＳ３０を保持するエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋ＩＡ１株（以下、エシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋ＩＡ１／ｐＴｒＳ３０と称す）、ｐＰＥ５６を保持するエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋ＩＡ１株（エシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋ＩＡ１／ｐＰＥ５６と称す）を取得した。
上記で取得した形質転換株を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地が入っている試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む実施例１０記載の生産培地が８ｍｌ入っている試験管に１％接種し、３０℃で２４時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
培養上清中の培養生成物をＦ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後、ＨＰＬＣを用いて該生成物を分析した。ＨＰＬＣ法による分析は、実験例１７と同様の方法で行った。結果を表１６に示す。
Figure 0004796495
Ｌ−ＡｌａおよびＬ−Ｌｅｕを生産する能力を有し、かつペプチダーゼ遺伝子およびジペプチド取り込み蛋白質遺伝子が欠損している微生物を用いたＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕの発酵生産
実験例１６で取得したペプチダーゼ遺伝子およびペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンの欠損変異株であるエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６株を親株として、ｉｌｖＬ遺伝子が欠損し、ｉｌｖＧ遺伝子のフレームシフト変異が復帰し、さらにｌｅｕＡ遺伝子が変異型ｌｅｕＡ遺伝子に置換したエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋ＬＡ１を、実施例７および９記載の方法に準じて作製し、実施例２で取得したｐＰＥ８６で形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。生育してきたコロニーから公知の方法によってプラスミドを抽出し、ｐＰＥ８６を保持するエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋ＬＡ１株が取得できていることを制限酵素処理で確認し、該株をエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋ＬＡ１／ｐＰＥ８６と命名した。同様の方法で、ｐＴｒＳ３０を保持するエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋ＬＡ１株（以下、エシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋ＬＡ１／ｐＴｒＳ３０と称す）、ｐＰＥ５６を保持するエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋ＬＡ１株（エシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＩＬＧ＋ＬＡ１／ｐＰＥ５６と称す）も取得した。
上記で得られた形質転換株を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地が入っている試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む実施例１０記載の生産培地が８ｍｌ入っている試験管に１％接種し、３０℃で２４時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
培養上清中の培養生成物をＦ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後、ＨＰＬＣを用いて該生成物を分析した。ＨＰＬＣ法による分析は、実験例１７と同様の方法で行った。結果を表１７に示す。
Figure 0004796495
L‐SerおよびL‐Pheを生産する能力を有し、かつペプチダーゼ遺伝子およびジペプチド取り込み蛋白質遺伝子が欠損している微生物を用いたL‐Ser−L‐Pheの発酵生産
実験例１６で取得したペプチダーゼ遺伝子およびペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンの欠損変異株であるエシェリヒア・コリJPNDDP36株を、実施例６で取得したpSE15またはpPE212で形質転換した後、50μg/mlのアンピシリンを含有するLB寒天培地に塗布して、30℃で一晩培養した。生育してきたそれぞれのコロニーから公知の方法にてプラスミドを抽出し、pSE15を保持するエシェリヒア・コリ JPNDDP36株、およびpPE212を保持するエシェリヒア・コリ JPNDDP36株が取得できていることを制限酵素処理で確認し、それぞれエシェリヒア・コリ JPNDDP36/pSE15、およびエシェリヒア・コリ JPNDDP36/pPE212と命名した。
さらに、上記で得られた形質転換株を、それぞれ実施例３で取得したエシェリヒア・コリ由来の脱感作型pheA 遺伝子および脱感作型aroF遺伝子発現プラスミドであるpPHEAF2で形質転換することにより、pPHEAF2を保持するエシェリヒア・コリ JPNDDP36/pSE15、およびエシェリヒア・コリ JPNDDP36/ pPE212を取得し、それぞれエシェリヒア・コリJPNDDP36/pSE15/pPHEAF2、およびエシェリヒア・コリ JPNDDP36/pPE212/pPHEAF2と命名した。
エシェリヒア・コリ JPNDDP36/pSE15/pPHEAF2、およびエシェリヒア・コリJPNDDP36/pPE212/pPHEAF2を、それぞれ50μg/mlのアンピシリンおよび30μg/mlのクロラムフェニコールを含む8mlの LB培地が入っている試験管に接種し、28℃で17時間培養した。該培養液を100μg/mlのアンピシリンおよび50μg/mlのクロラムフェニコールを含む実施例４記載の生産培地が8ml入っている試験管に１％接種し、30℃で24 時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
培養上清中の培養生成物をＦ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後、ＨＰＬＣを用いて該生成物を分析した。ＨＰＬＣによる分析は、実験例１７と同様の方法で行った。結果を表１８に示す。
Figure 0004796495

実施例１６〜２２に示す結果から、１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力、該１種以上のアミノ酸のうちの少なくとも１種のアミノ酸を生産する能力を有し、かつ１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み蛋白質の活性を喪失するか、または３種以上のペプチダーゼ活性が喪失した微生物を培地に培養することにより、該培地中にジペプチドを生成、蓄積させることができること、並びに該微生物は、１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力、および該１種以上のアミノ酸のうちの少なくとも１種のアミノ酸を生産する能力を有しているが、ペプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質の活性を喪失していない微生物に比べ、ジペプチドの生産能力が高いことが明らかになった。
本発明により、効率よく各種ジペプチドを製造することができる。
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：データベースサーチに用いたアミノ酸配列
配列番号３４−人工配列の説明：データベースサーチに用いたアミノ酸配列
配列番号３５−人工配列の説明：データベースサーチに用いたアミノ酸配列
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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配列番号９０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１００−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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配列番号１０３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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配列番号１０６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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配列番号１１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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配列番号１１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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配列番号１２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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配列番号１２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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配列番号１２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ

Claims (19)

  1. 以下の［１］〜［６］から選ばれる、１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有し、かつ該１種以上のアミノ酸のうちの少なくとも１種のアミノ酸を生産する能力を有するバチルス属またはストレプトマイセス属に属する微生物を培地に培養し、該培地中にジペプチドを生成、蓄積させ、該培地からジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法。
    ［１］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
    ［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質
    ［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質
    ［４］配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
    ［５］配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質
    ［６］配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質
  2. １種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質が以下の［１］〜［４］から選ばれるＤＮＡにコードされる蛋白質である、請求項１記載の製造法。
    ［１］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
    ［２］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
    ［３］配列番号３９または４０で表される塩基配列を有するＤＮＡ
    ［４］配列番号３９または４０で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
  3. 以下の［１］〜［４］から選ばれる、１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有し、かつ該１種以上のアミノ酸のうちの少なくとも１種のアミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、該培地中にジペプチドを生成、蓄積させ、該培地からジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法。
    ［１］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
    ［２］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
    ［３］配列番号３９または４０で表される塩基配列を有するＤＮＡ
    ［４］配列番号３９または４０で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
  4. アミノ酸を生産する能力が以下の［１］〜［５］から選ばれる方法で得られる、請求項１または２記載の製造法。
    ［１］該アミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法
    ［２］該アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法
    ［３］該アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
    ［４］該アミノ酸の生合成経路から該アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法
    ［５］野生型株に比べ、該アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
  5. アミノ酸を生産する能力が以下の［１］〜［５］から選ばれる方法で得られる、請求項３記載の製造法。
    ［１］該アミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法
    ［２］該アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法
    ［３］該アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
    ［４］該アミノ酸の生合成経路から該アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法
    ［５］野生型株に比べ、該アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
  6. 微生物がエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、シュードモナス属またはストレプトマイセス属に属する微生物である、請求項３または５記載の製造法。
  7. エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、シュードモナス属またはストレプトマイセス属に属する微生物が、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテリウム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィシェンス、バチルス・サチルス、バチルス・メガテリウム、セラチア・マルセッセンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、ストレプトマイセス・セリカラーまたはストレプトミセス・リビダンスである、請求項６記載の製造法。
  8. 微生物が１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質（以下、ペプチド取込み蛋白質ともいう）の活性が低下または喪失した微生物である、請求項１、２または４のいずれか１項に記載の製造法。
  9. 微生物が１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質（以下、ペプチド取込み蛋白質ともいう）の活性が低下または喪失した微生物である、請求項３または５記載の製造法。
  10. 微生物が３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失した微生物である、請求項１、２または４のいずれか１項に記載の製造法。
  11. 微生物が３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失した微生物である、請求項３または５記載の製造法。
  12. ペプチダーゼが配列番号４５〜４８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号４５〜４８のいずれかで表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質である、請求項８または１０記載の製造法。
  13. ペプチダーゼが配列番号４５〜４８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号４５〜４８のいずれかで表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質である、請求項９または１１記載の製造法。
  14. ペプチド取込み蛋白質が配列番号４９〜５３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号４９〜５３のいずれかで表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつペプチド取り込み活性を有する蛋白質である、請求項８または１２記載の製造法。
  15. ペプチド取込み蛋白質が配列番号４９〜５３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号４９〜５３のいずれかで表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつペプチド取り込み活性を有する蛋白質である、請求項９または１３記載の製造法。
  16. 微生物がエシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物である、請求項９、１１、１３または１５のいずれか１項に記載の製造法。
  17. エシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物が、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテリウム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィシェンス、バチルス・サチルスまたはバチルス・メガテリウムである、請求項１６記載の製造法。
  18. アミノ酸がＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−オルニチンおよびＬ−シトルリンから選ばれるアミノ酸である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の製造法。
  19. ジペプチドが、式（Ｉ）
    Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
    （式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なって、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−オルニチンおよびＬ−シトルリンから選ばれるアミノ酸を表す）で表されるジペプチドである請求項１〜１８のいずれか１項に記載の製造法。
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