KR101043562B1 - 디펩티드의 제조법 - Google Patents

디펩티드의 제조법 Download PDF

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교와 핫꼬 바이오 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명에 의하면, L-Ala-L-Ala 이외의 디펩티드 합성 활성을 갖는 단백질 및 상기 디펩티드 합성용 단백질, 상기 디펩티드 합성 활성을 갖는 단백질의 제조법, 상기 디펩티드 합성 활성을 갖는 단백질 또는 상기 디펩티드 합성용 단백질을 사용한 상기 디펩티드의 제조법 및 상기 디펩티드 합성 활성을 갖는 단백질 또는 상기 디펩티드 합성용 단백질을 생산하는 미생물의 배양물 등을 산소원으로 사용한 상기 디펩티드의 제조법이 제공된다.

Description

디펩티드의 제조법{PROCESS FOR PRODUCING DIPEPTIDE}
본 발명은 디펩티드 합성 활성을 갖는 단백질 및 디펩티드 합성용 단백질, 디펩티드 합성 활성을 갖는 단백질의 제조법, 디펩티드 합성 활성을 갖는 단백질 또는 디펩티드 합성용 단백질을 사용한 디펩티드의 제조법, 디펩티드 합성 활성을 갖는 단백질 또는 디펩티드 합성용 단백질을 생산하는 미생물 또는 형질 전환체, 및 그 미생물 또는 형질 전환체를 사용한 디펩티드의 제조법에 관한 것이다.
펩티드의 대량합성법에 대해서는, 화학 합성법 (액상법, 고상법), 효소적 합성법 및 DNA 재조합법을 사용한 생물학적 합성법이 알려져 있다. 현재 50잔기 이상의 장쇄 펩티드에 대해서는 효소적 합성법 또는 생물학적 합성법이 사용되고, 디펩티드에 대해서는 화학 합성법과 효소적 합성법이 주로 사용되고 있다.
화학 합성법에 의한 디펩티드의 합성에서는, 관능기의 보호·탈보호 등의 조작이 필요하고, 또한 라세미체도 합성되는 점에서, 화학 합성법은 경제적, 효율적인 방법이라고는 할 수 없다. 또한 화학 합성법은 대량의 유기용매 등을 사용하기 때문에 환경 위생면에서도 바람직한 방법은 아니다.
효소법에 의한 디펩티드의 합성에 대해서는, 단백질 분해효소 (프로테아제) 의 역반응을 이용한 방법 [J. Biol. Chem., 119, 707-720(1937) 참조], 내열성 아 미노아실 t-RNA 합성효소를 이용하는 방법 [일본 공개특허공보 소58-146539호, 일본 공개특허공보 소58-209991호, 일본 공개특허공보 소58-209992호 및 일본 공개특허공보 소59-106298호 참조], 비(非)리보좀펩티드합성효소 (이하 NRPS 라 함) 를 이용하는 방법 [Chem. Biol., 7, 373-384(2000), FEBS Lett., 498, 42-45(2001), 미국특허 제5795738호 및 미국특허 제5652116호 참조] 이 알려져 있다.
그러나, 단백질 분해효소의 역반응을 이용한 방법에서는, 기질이 되는 아미노산의 관능기의 보호·탈보호가 필요하고, 펩티드형성 반응의 효율화 및 펩티드분해 반응의 저지가 곤란하다는 문제점이 있다. 내열성 아미노아실 t-RNA 합성효소를 이용하는 방법에는, 효소의 발현, 목적산물 이외의 부생반응의 저지가 곤란하다는 문제점이 있다. NRPS 를 이용하는 방법에 대해서는, 효소분자가 거대하기 때문에 DNA 재조합법을 사용하여 그 효소를 발현하는 것이 곤란한 점과 보효소인 4'-포스포판테테인 (4'-phosphopantetheine) 의 공급이 필요하다는 점에서, 효율적인 제조법이라고는 할 수 없다. 한편, 효소분자량이 NRPS 보다 작고 보효소인 4'-phosphopantetheine 을 필요로 하지 않는 γ-글루타밀시스테인합성효소 (γ-glutamylcysteine synthetase), 글루타티온 합성효소 (glutathione synthetase), D-알라닐-D-알라닌 (D-Ala-D-Ala) 리가아제 (D-Ala-D-Ala ligase), 폴리-γ-글루탐산 합성효소 (poly-γ-glutamate synthetase) 등의 1군의 펩티드 합성효소도 알려져 있다. 이들 효소의 대부분은 D-아미노산을 기질에 사용하거나 또는 γ위치의 카르복실기에서의 펩티드 결합의 형성을 촉매하는 등의 특징을 갖기 때문에, L-아미노산의 α위치 카르복실기로 펩티드 결합하는 디펩티드의 합성에 사용할 수는 없다.
L-아미노산의 α위치 카르복실기에서의 펩티드 결합 형성 활성에 의한 디펩티드 생성이 알려져 있는 것은 바실러스속에 속하는 미생물 유래의 디펩티드 항생물질인 바실리신 합성 효소뿐이다. 바실리신 합성 효소는 바실리신 (L-알라닐-L-안티캅신, L-Ala-L-anticapsin) 및 L-알라닐-L-알라닌 (L-Ala-L-Ala) 을 합성하는 활성을 갖는 것은 알려져 있지만, 그 밖의 디펩티드의 합성 활성에 대해서는 알려져 있지 않다 [J. Ind. Microbiol., 2, 201-208(1987) 및 Enzyme. Microbial. Technol., 29, 400-406(2001) 참조].
한편, 전체 게놈 정보가 해명된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 168주 [Nature, 390, 249-256(1997)] 에서의 바실리신 생합성 효소 유전자군에 대해서는 ywfA∼F 의 ORF 를 포함하는 바실리신 오페론을 증폭하면 바실리신의 생산성이 증가하는 것이 알려져 있다 [국제공개특허 제00-03009호 팜플렛 참조]. 그러나 이들 0RF 중에 2종 이상의 아미노산을 펩티드 결합으로 연결하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 ORF 가 포함되어 있는지, 포함되어 있다면 어떤 ORF 가 그 단백질을 암호화하는지에 대해서는 알려져 있지 않다.
(발명의 개시)
본 발명의 목적은, 펩티드 합성효소 등에 의한 효소적 합성법이 알려져 있지 않은 L-알라닐-L-알라닌 (L-Ala-L-Ala) 이외의 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질 및 그 디펩티드 합성용 단백질, 그 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA, 그 DNA 를 함유하는 재조합 DNA, 그 재조합 DNA 를 보유하는 형질 전환체, 그 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질의 제조법, 그 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질 또는 그 디펩티드 합성용 단백질을 사용한 그 디펩티드의 효소적 합성법, 그 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질 또는 그 디펩티드 합성용 단백질을 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양물 등을 효소원에 사용한 디펩티드의 제조법을 제공하는 것에 있다.
본 발명은 이하의 (1)∼(21) 에 관한 것이다.
(1) 이하의 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 단백질 (단, 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 제외함).
[1] 서열번호 2∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질
[2] 서열번호 1∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 식 (Ⅰ)
R1-R2 (Ⅰ)
(식 중, R1 및 R2 는 동일하거나 상이하고, 각각 아미노산을 나타내지만, 동시에 L-알라닌을 나타내지는 않는다) 로 표시되는 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질
[3] 서열번호 1∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 65% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질
[4] 서열번호 17 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 또한 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질.
(2) 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 식 (Ⅰ)
R1-R2 (Ⅰ)
(식 중 R1 및 R2 는 동일하거나 상이하고, 각각 아미노산을 나타내지만, 동시에 L-알라닌을 나타내지는 않는다) 로 표시되는 디펩티드의 합성용 단백질.
(3) 이하의 [1]∼[4] 중 어느 한 항에 기재된 DNA (단, 서열번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 제외함)
[1] 상기 (1) 의 단백질을 암호화하는 DNA
[2] 서열번호 10∼16 및 36 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA
[3] 서열번호 9∼16 및 36 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 갖는 DNA 와 엄격한(stringent) 조건 하에서 하이브리드화하고, 또 식 (Ⅰ)
R1-R2 (Ⅰ)
(식 중 R1 및 R2 는 동일하거나 상이하고, 각각 아미노산을 나타내지만, 동시에 L-알라닌을 나타내지는 않는다) 로 표시되는 디펩티드 합성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA
[4] 서열번호 18 로 표시되는 염기 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 갖는 DNA 이고, 또한 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드 합성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA
(4) 상기 (3) 의 DNA 를 함유하는 재조합 DNA.
(5) 상기 (4) 의 재조합 DNA 를 갖는 형질 전환체.
(6) 형질 전환체가 미생물을 숙주로 하여 얻어지는 형질 전환체인 상기 (5) 의 형질 전환체.
(7) 미생물이 이셰리키아(Escherichia)속에 속하는 미생물인 상기 (6) 의 형질 전환체.
(8) 상기 (5)∼(7) 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 상기 (1) 의 단백질을 생성, 축적시켜, 그 배양물에서 그 단백질을 채취하는 상기 (1) 의 단백질의 제조법.
(9) 상기 (1) 의 단백질을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배지에 배양하고, 배양물 중에 그 단백질을 생성, 축적시켜, 그 배양물에서 그 단백질을 채취하는 상기 (1) 의 단백질의 제조법.
(10) 미생물이 바실러스(Bacillus)속에 속하는 미생물인 상기 (9) 의 제조법.
(11) 바실러스속에 속하는 미생물이, 바실리신을 생산하는 능력을 갖는 바실러스속에 속하는 미생물인 상기 (10) 의 제조법.
(12) 바실리신을 생산하는 능력을 갖는 바실러스속에 속하는 미생물이, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀롤리케파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 및 바실러스 푸밀루스(Bacillus pumilus) 로 이루어지는 군에서 선택되는 종에 속하는 미생물인 상기 (11) 의 제조법.
(13) 상기 (1) 의 단백질 또는 상기 (2) 의 디펩티드의 합성용 단백질, 1종 이상의 아미노산 및 ATP 를 수성 매질 중에 존재시키고, 그 매질 중에 식 (Ⅰ)
R1-R2 (Ⅰ)
(식 중 R1 및 R2 는 동일하거나 상이하고, 각각 아미노산을 나타내지만, 동시에 L-알라닌을 나타내지는 않는다) 로 표시되는 디펩티드를 생성, 축적시켜, 그 매질에서 그 디펩티드를 채취하는 그 디펩티드의 제조법.
(14) 이하의 [1]∼[3] 에서 선택되는 배양물 또는 그 배양물의 처리물을 효소원에 사용하고, 그 효소원, 1종 이상의 아미노산을 수성 매질 중에 존재시키고, 그 매질 중에 식 (Ⅰ)
R1-R2 (Ⅰ)
(식 중 R1 및 R2 는 동일하거나 상이하고, 각각 아미노산을 나타내지만, 동시에 L-알라닌을 나타내지는 않는다) 로 표시되는 디펩티드를 생성, 축적시켜, 그 매질에서 그 디펩티드를 채취하는 그 디펩티드의 제조법.
[1] 상기 (5)∼(7) 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환체의 배양물 또는 그 배양물의 처리물, [2] 상기 (1) 의 단백질을 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양물 또는 그 배양물의 처리물, [3] 상기 (2) 의 디펩티드의 합성용 단백질을 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양물 또는 그 배양물의 처리물
(15) 상기 (1) 의 단백질을 생산하는 능력을 갖는 미생물이 바실러스속에 속하는 미생물인 상기 (14) 의 제조법.
(16) 바실러스속에 속하는 미생물이, 바실리신을 생산하는 능력을 갖는 바실러스속에 속하는 미생물인 상기 (15) 의 제조법.
(17) 바실리신을 생산하는 능력을 갖는 바실러스속에 속하는 미생물이, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀롤리케파시엔스, 바실러스 코아귤란스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 메가테리움 및 바실러스 푸밀루스로 이루어지는 군에서 선택되는 종에 속하는 미생물인 상기 (16) 의 제조법.
(18) 상기 (2) 의 디펩티드의 합성용 단백질을 생산하는 능력을 갖는 미생물이, 서열번호 9 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 를 포함하는 재조합 DNA 를 함유하는 미생물, 또는 바실러스 서브틸리스에 속하는 미생물인 상기 (14) 의 제조법.
(19) 서열번호 9 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 를 포함하는 재조합 DNA 를 함유하는 미생물이, 이셰리키아속에 속하는 미생물인 상기 (18) 의 제조법.
(20) 배양물의 처리물이, 배양물의 농축물, 배양물의 건조물, 배양물을 원심 분리하여 얻어지는 균체, 그 균체의 건조물, 그 균체의 동결 건조물, 그 균체의 계면활성제 처리물, 그 균체의 초음파 처리물, 그 균체의 기계적 마쇄 처리물, 그 균체의 용매 처리물, 그 균체의 효소 처리물, 그 균체의 단백질 분획물, 그 균체의 고정화물 또는 그 균체에서 추출하여 얻어지는 효소표본인 것을 특징으로 하는 상기 (14)∼(19) 의 제조법.
(21) 디펩티드가 식 (Ⅱ)
R3-R4 (Ⅱ)
(식 중 R3 및 R4 는 동일하거나 상이하고, 각각 L-알라닌, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-발린, L-류신, L-이소류신, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-메티오닌, L-세린, L-트레오닌, L-시스테인, L-아스파라긴, L-티로신, L-리신, L-알기닌, L-히스티딘, L-아스파르트산, L-α-아미노부티르산, β-알라닌, L-아자세린, L-테아닌, L-4-히드록시프롤린, L-3-히드록시프롤린, L-오르니틴, L-시트룰린 및 L-6-디아조-5-옥소노르류신에서 선택되는 아미노산을 나타내지만, 동시에 L-알라닌을 나타내지는 않는다) 로 표시되는 디펩티드인 상기 (13)∼(20) 의 제조법.
본 발명의 단백질로는,
[1] 서열번호 2∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질,
[2] 서열번호 1∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 식 (Ⅰ)
R1-R2 (Ⅰ)
(식 중 R1 및 R2 는 동일하거나 상이하고, 각각 아미노산을 나타내지만, 동시에 L-알라닌을 나타내지는 않는다) 로 표시되는 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질,
[3] 서열번호 1∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 65% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질,
[4] 서열번호 17 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질,
을 들 수 있다 (단, 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 제외함).
또 본 발명의 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드의 합성용 단백질로는, 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 들 수 있다.
이하, 상기 본 발명의 단백질 및 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드의 합성용 단백질을 합쳐 본 발명의 단백질이라 부르기도 한다.
상기에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질은, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) (이하, Molecular Cloning 제2판이라 약칭함), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997) (이하, Current Protocols in Molecular Biology라 약칭함), Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982), Gene, 34, 315(1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985) 등에 기재된 위치 특이적 돌연변이 유발법(site-directed mutagenesis)을 사용하고, 예를 들어 서열번호 1∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 DNA 에 위치 특이적 돌연변이를 유발함으로써 취득할 수 있다.
결실, 치환 또는 부가되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않지만, 상기 위치 특이적 돌연변이 유발법 등의 주지된 방법에 의해 결실, 치환 또는 부가할 수 있는 정도의 수이고, 1개 내지 수십 개, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개이다.
서열번호 1∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되었다는 것은, 동일서열 중 임의의 위치에서 1 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가될 수 있음을 의미한다.
아미노산의 치환이 가능한 아미노산으로는, 예를 들어 서열번호 1∼8 로 표시되는 아미노산 서열을 공지된 얼라인먼트 소프트웨어를 사용하여 비교하였을 때 모든 아미노산 서열에서 보존되지 않은 아미노산을 들 수 있다. 공지된 얼라인먼트 소프트웨어로는, 예를 들어 유전자 해석 소프트웨어 Genetyx (소프트웨어개발 주식회사) 에 포함되는 얼라인먼트 해석 소프트를 들 수 있다. 그 해석 소프트의 해석 파라미터로는 디폴트값을 사용할 수 있다.
또, 아미노산의 결실 또는 부가가 가능한 아미노산의 위치로는, 예를 들어 서열번호 1∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단 측 및 C 말단 측을 들 수 있다.
결실, 치환 또는 부가는 동시에 발생해도 되며, 치환 또는 부가되는 아미노산은 천연이든 아니든 상관없다. 천연 아미노산으로는, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, L-시스테인 등을 들 수 있다.
이하에 서로 치환 가능한 아미노산의 예를 나타낸다. 동일군에 포함되는 아미노산은 서로 치환 가능하다.
A 군: 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌
B 군: 아스파르트산, 글루탐산, 이소아스파르트산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산
C 군: 아스파라긴, 글루타민
D 군: 리신, 알기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산
E 군: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린
F 군: 세린, 트레오닌, 호모세린
G 군: 페닐알라닌, 티로신
또 본 발명의 단백질이 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드 합성 활성을 갖기 위해서는, 서열번호 1∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열, 바람직하게는 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열과의 상동성이 65% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖고 있는 것이 바람직하다.
아미노산 서열이나 염기 서열의 상동성은, Karlin and Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST [Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)] 나 FASTA [Methods Enzymol., 183, 63(1990)] 를 사용하여 결정할 수 있다. 이 알고리즘 BLAST 에 기초하여 BLASTN 나 BLASTX 라 불리는 프로그램이 개발되고 있다 [J. Mol. Biol., 215, 403(1990)]. BLAST 에 기초하여 BLASTN 에 의해 염기 서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들어 score=100, wordlength=12 로 한다. 또한 BLAST 에 기초하여 BLASTX 에 의해 아미노산 서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들어 score=50, wordlength=3 으로 한다. BLAST 와 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다. 이들 해석방법의 구체적인 수법은 공지이다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).
또 서열번호 1∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열, 바람직하게는 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열과 65% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질도 역시 본 발명의 단백질이다 (단, 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 제외함). 아미노산 서열의 상동성은 상기한 바와 같이 BLAST 나 FASTA 를 사용하여 결정할 수 있다.
서열번호 17 로 표시되는 아미노산 서열은, 서열번호 1∼7 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 사이에서 보존되고 있는 영역이고, 또한 각종 미생물의 Ala-Ala 리가아제 활성을 갖는 단백질의 콘센서스(consensus) 서열에 대응하는 영역이다.
서열번호 17 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질이고, 또한 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질도 역시 본 발명의 단백질이다 (단, 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 제외함).
서열번호 17 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질이고, 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질이기 위해서는, 그 단백질의 아미노산 서열과 서열번호 1∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과의 상동성이 적어도 80% 이상, 통상은 90% 이상, 특히 95% 이상의 상동성을 갖고 있는 것이 바람직하다.
아미노산 서열의 상동성은 상기한 바와 같이 BLAST 나 FASTA 를 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명의 단백질이 상기 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드 합성 활성을 갖는 단백질인 것을 확인하는 수단으로는, 예를 들어 DNA 재조합법을 사용하여 본 발명의 단백질을 발현하는 형질 전환체를 제작하고, 그 형질 전환체를 사용하여 본 발명의 단백질을 제조한 후, 본 발명의 단백질, 1종 이상의 L-아미노산 (단, L-알라닌은 다른 L-아미노산과 함께 사용함) 및 ATP 를 수성 매질 중에 존재시켜 그 수성 매질 중에 상기 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드가 생성, 축적되는지 아닌지를 HPLC 등에 의해 분석하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 DNA 로는,
[5] 상기 [1]∼[4] 에 기재된 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA,
[6] 서열번호 10∼16 및 36 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA,
[7] 서열번호 9∼16 및 36 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 갖는 DNA 와 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하고, 또 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드 합성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA (단, 서열번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 제외하며, 바람직하게는 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 DNA 를 제외함),
[8] 서열번호 18 로 표시되는 염기 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 갖는 DNA 이며, 또한 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드 합성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA (단, 서열번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 제외하며, 바람직하게는 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 DNA 를 제외함),
를 들 수 있다.
또한 본 발명의 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드의 제조법에 사용할 수 있는 DNA 로는, 상기 [5]∼[8] 에 기재된 DNA 및 서열번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 들 수 있다.
상기 엄격한 조건 하에서 하이브리드화 가능한 DNA 란, 서열번호 9∼16 및 36 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 갖는 DNA 의 일부 또는 전부를 프로브로 하여 콜로니 하이브리드화법, 플라크 하이브리드화법 또는 서던 블롯 하이브리드화법 등을 사용함으로써 얻어지는 DNA 를 의미하고, 구체적으로는 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA 를 고정화한 필터를 사용하여 0.7∼1.0mol/ℓ의 염화나트륨 존재 하, 65℃ 에서 하이브리드화한 후, 0.1∼2배 농도의 SSC 용액 (1배 농도의 SSC 용액의 조성은 150mmol/ℓ 염화나트륨, 15mmol/ℓ 시트르산나트륨으로 이루어짐) 을 사용하여 65℃ 조건 하에서 필터를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA 를 들 수 있다. 하이브리드화는 [Molecular Cloning 제2판, Current Protocols in Molecular Biology, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)] 등에 기재되어 있는 방법에 준하여 실시할 수 있다. 하이브리드화 가능한 DNA 로서 구체적으로는, 상기한 BLAST 및 FASTA 등을 사용하여 상기 파라미터에 기초하여 계산하였을 때, 서열번호 9∼16 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열과 적어도 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA 를 들 수 있다.
서열번호 9∼16 및 36 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 와 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 DNA 가 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA 인 것은, 예를 들어 상기한 바와 같이 재조합 DNA 법을 사용하여 그 DNA 에 코드되는 단백질을 제조하여 그 단백질의 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다.
(ⅰ) 본 발명의 DNA 및 본 발명의 단백질 또는 디펩티드의 제조법에 사용되는 DNA 의 제조
본 발명의 DNA 및 본 발명의 단백질 또는 디펩티드의 제조법 (이하, 간단히 본 발명의 제조법이라고도 함) 에 사용되는 DNA 는, 예를 들어 서열번호 9∼16 및 36 으로 표시되는 염기 서열에 기초하여 설계할 수 있는 프로브를 사용한, 바실러스속에 속하는 미생물의 염색체 DNA 라이브러리에 대한 서던 하이브리드화, 또는 서열번호 9∼16 및 36 으로 표시되는 염기 서열에 기초하여 설계할 수 있는 프라이머 DNA 를 사용한, 바실러스속에 속하는 미생물의 염색체 DNA 를 주형으로 한 PCR [PCR Protocols, Academic Press(1990)] 에 의해 취득할 수 있다.
또한 각종 유전자 서열 데이터 베이스에 대하여 서열번호 1∼8 및 17 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 의 염기 서열과 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 서열을 검색하고, 그 검색에 의해 얻어진 염기 서열에 기초하여 그 염기 서열을 갖는 생물의 염색체 DNA, cDNA 라이브러리 등으로부터 상기한 방법에 의해 본 발명의 DNA 또는 본 발명의 제조법에 사용되는 DNA 를 취득할 수도 있다.
취득한 DNA 를 그대로 또는 적당한 제한효소 등으로 절단하여 통상적인 방법에 의해 벡터에 도입하고, 얻어진 재조합 DNA 를 숙주세포에 도입한 후, 통상 사용되는 염기 서열 해석방법, 예를 들어 디데옥시법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463(1977)] 또는 373A·DNA 시퀀서 (파킨 엘머사 제조) 등의 염기 서열 분석장치를 사용해 분석함으로써 그 DNA 의 염기 서열을 결정할 수 있다.
염기 서열을 결정한 결과, 취득된 DNA 가 부분 길이인 경우에는 그 부분 길이 DNA 를 프로브에 사용한, 염색체 DNA 라이브러리에 대한 서던 하이브리드화법 등에 의해 전체 길이 DNA 를 취득할 수 있다.
또 결정된 DNA 의 염기 서열에 기초하여 퍼셉티브 바이오시스템즈사 제조 8905형 DNA 합성장치 등을 사용하여 화학 합성함으로써 목적으로 하는 DNA 를 제조할 수도 있다.
상기한 바와 같이 하여 취득되는 DNA 로서, 예를 들어 서열번호 9∼16 및 36 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 를 들 수 있다.
본 발명의 DNA 및 본 발명의 제조법에 사용되는 DNA 를 삽입하는 벡터로는, pBluescriptⅡ KS(+) (스트라타진사 제조), pDIRECT [Nucleic Acids Res., 18, 6069(1990)], pCR-Script Amp SK(+) (스트라타진사 제조), pT7Blue (노바젠사 제조), pCRⅡ (인비트로젠사 제조) 및 pCR-TRAP (진헌터사 제조) 등을 들 수 있다.
숙주세포로는, 이셰리키아속에 속하는 미생물 등을 들 수 있다. 이셰리키아속에 속하는 미생물로는, 예를 들어 이셰리키아 콜라이 (Escherichia coli) XL1-Blue, 이셰리키아 콜라이 XL2-Blue, 이셰리키아 콜라이 DH1, 이셰리키아 콜라이 MC1000, 이셰리키아 콜라이 ATCC12435, 이셰리키아 콜라이 W1485, 이셰리키아 콜라이 JM109, 이셰리키아 콜라이 HB101, 이셰리키아 콜라이 No.49, 이셰리키아 콜라이 W3110, 이셰리키아 콜라이 NY49, 이셰리키아 콜라이 MP347, 이셰리키아 콜라이 NM522, 이셰리키아 콜라이 ME8415 등을 들 수 있다.
재조합 DNA 의 도입방법으로는, 상기 숙주세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어 칼슘 이온을 사용하는 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110(1972)], 프로토플라스트법 (일본 공개특허공보 소63-248394호), 전기천공(electroporation)법 [Nucleic Acids Res., 16, 6127(1988)] 등을 들 수 있다.
상기 방법에 의해 얻어지는 본 발명의 제조법에 사용되는 DNA 를 보유하는 미생물로는, 예를 들어 서열번호 1 로 표시되는 서열을 갖는 DNA 를 함유하는 재조합 DNA 를 보유하는 미생물인 이셰리키아 콜라이 NM522/pPE43 를 들 수 있다.
(ⅱ) 본 발명의 단백질의 제조법
본 발명의 단백질은 Molecular Cloning 제2판, Current Protocols in Molecular Biology 등에 기재된 방법 등을 사용하여, 예를 들어 이하의 방법에 의해 상기 (Ⅰ) 의 방법에 의해 취득한 본 발명의 DNA 및 본 발명의 제조법에 사용되는 DNA 를 숙주세포 속에서 발현시켜 제조할 수 있다.
본 발명의 DNA 또는 본 발명의 제조법에 사용되는 DNA 를 기초로 하여, 필요에 따라 본 발명의 단백질을 암호화하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 제조한다. 또 그 단백질을 암호화하는 부분의 염기 서열을, 숙주의 발현에 가장 알맞는 코돈이 되도록 염기를 치환함으로써, 그 단백질의 생산율을 향상시킬 수 있다.
그 DNA 단편을 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써 재조합 DNA 를 제작한다.
그 재조합 DNA 를 그 발현 벡터에 적합한 숙주세포에 도입함으로써, 본 발명의 단백질을 생산하는 형질 전환체를 얻을 수 있다.
숙주세포로는, 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포 등, 식물세포 등, 목적으로 하는 유전자를 발현시킬 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있다.
발현 벡터로는, 상기 숙주세포에서 자립복제 가능 내지는 염색체 중으로 삽입이 가능하고, 본 발명의 DNA 또는 본 발명의 제조법에 사용되는 DNA 를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다.
세균 등의 원핵생물을 숙주세포로서 사용하는 경우에는, 본 발명의 DNA 또는 본 발명의 제조법에 사용되는 DNA 를 갖는 재조합 DNA 는 원핵생물 속에서 자립복제 가능함과 동시에 프로모터, 리보솜 결합 서열, 본 발명의 DNA 또는 본 발명의 제조법에 사용되는 DNA, 전사 종결 서열로 구성된 재조합 DNA 인 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 포함되어 있어도 된다.
발현 벡터로는, pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (모두 베링거만하임사 제조), pHelix1 (로슈 다이아그노스틱스사 제조), pKK233-2 (아마샴 파마시아 바이오테크사 제조), pSE280 (인비트로젠사 제조), pGEMEX-1 (프로메가사 제조), pQE-8 (키아겐사 제조), pET-3 (노바젠사 제조), pKYP10 (일본 공개특허공보 소58-110600호), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277(1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306(1985)], pBluescriptⅡ SK(+), pBluescriptII KS(-) (스트라타진사 제조), pTrS30 [이셰리키아 콜라이 JM109/pTrS30 (FERM BP-5407) 로 제조], pTrS32 [이셰리키아 콜라이 JM109/pTrS32 (FERM BP-5408) 로 제조], pPAC31 (WO98/12343), pUC19 [Gene, 33, 103(1985)], pSTV28 (다카라슈조사 제조), pUC118 (다카라슈조사 제조), pPA1 (일본 공개특허공보 소63-233798호) 등을 예시할 수 있다.
프로모터로는, 이셰리키아 콜라이 등의 숙주세포 속에서 기능하는 것이라면 어떠한 것이든 된다. 예를 들어 trp 프로모터 (P trp ), lac 프로모터 (P lac ), PL 프로모터, PR 프로모터, PSE 프로모터 등의 대장균이나 파지 등에서 유래되는 프로모터, SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등을 들 수 있다. 또한 Ptrp 를 2개 직렬시킨 프로모터, tac 프로모터, 1acT7 프로모터, let I 프로모터와 같이 인위적으로 설계 및 개질된 프로모터 등도 사용할 수 있다.
그리고 바실러스속에 속하는 미생물 속에서 발현시키기 위한 xylA 프로모터 [Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599(1991)] 나 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속에 속하는 미생물 속에서 발현시키기 위한 P54-6 프로모터 [Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679(2000)] 등도 사용할 수 있다.
리보솜 결합 서열인 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 서열과 개시 코돈 사이를 적당한 거리 (예를 들어 6∼18 염기) 로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 DNA 또는 본 발명의 제조법에 사용되는 DNA 를 발현 벡터에 결합시킨 재조합 DNA 에서는 전사 종결 서열은 반드시 필요하지 않지만, 구조 유전자의 바로 아래에 전사 종결 서열을 배치하는 것이 바람직하다.
이러한 재조합 DNA 로는, 예를 들어 pPE43 을 들 수 있다.
원핵생물로는, 이셰리키아속, 세라티아(Serratia)속, 바실러스속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 미크로박테리움(Microbacterium)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 알리시클로바실러스(Alycyclobacillus)속, 아나베나(Anabena)속, 아나시스티스(Anacystis)속, 아트로박터(Arthrobacter)속, 아조토박터(Azotobacter)속, 크로마티움(Chromatium)속, 에르비니아(Erwinia)속, 메틸로박테리움(Methylobacterium)속, 포르미디움(Phormidium)속, 로도박터(Rhodobacter)속, 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas)속, 로도스피릴룸(Rhodospirillum)속, 세네데스무스(Scenedesmus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 시네코커스(Synechoccus)속, 자이모모나스(Zymomonas)속 등에 속하는 미생물, 예를 들어 이셰리키아 콜라이 XL1-Blue, 이셰리키아 콜라이 XL2-Blue, 이셰리키아 콜라이 DH1, 이셰리키아 콜라이 DH5α, 이셰리키아 콜라이 MC1000, 이셰리키아 콜라이 KY3276, 이셰리키아 콜라이 W1485, 이셰리키아 콜라이 JM109, 이셰리키아 콜라이 HB101, 이셰리키아 콜라이 No.49, 이셰리키아 콜라이 W3110, 이셰리키아 콜라이 NY49, 이셰리키아 콜라이 MP347, 이셰리키아 콜라이 NM522, 바실러스 서브틸리스 ATCC33712, 바실러스 메가테리움, 바실러스 SP(Bacillus sp.) FERMBP-6030, 바실러스 아밀롤리케파시엔스, 바실러스 코아귤란스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 푸밀루스, 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 이마리오필룸(Brevibacterium immariophilum) ATCC14068, 브레비박테리움 사카롤리티컴(Brevibacterium saccharolyticum) ATCC14066, 브레비박테리움 플라범(Brevibacterium flavum) ATCC14067, 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869, 코리네박테리움 글루타미컴(Corymebacterium glutamicum) ATCC13032, 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC14297, 코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corymebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 미크로박테리움 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum) ATCC15354, 세라티아 피카리아(Serratia ficaria), 세라티아 폰티콜라(Serratia fonticola), 세라티아 리케파시엔스(Serratia Liquefaciens), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 슈도모나스 SP(Pseudomonas sp.) D-0110, 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter), 아그로박테리움 리조진즈(Agrobacterium rhizogenes), 아그로박테리움 루비(Agrobacterium rubi), 아나베나 실린드리카(Anabaena cylindrica), 아나베나 돌리올룸(Anabaena doliolum), 아나베나 플로스아쿠아(Anabaena flos-aquae), 아트로박터 오레센스(Arthrobacter aurescens), 아트로박터 시트레우스(Arthrobacter citreus), 아트로박터 글로브포르미스(Arthrobacter globformis), 아트로박터 히드로카보글루타미커스(Arthrobacter hydrocarboglutamicus), 아트로박터 미소렌스(Arthrobacter mysorens), 아트로박터 니코티아나(Arthrobacter nicotianae), 아트로박터 파라피네우스(Arthrobacter paraffineus), 아트로박터 프로토포르미에(Arthrobacter protophormiae), 아트로박터 로세오파라피너스(Arthrobacter roseoparaffinus), 아트로박터 술푸레우스(Arthrobacter sulfureus), 아트로박터 우레아파시엔스(Arthrobacter ureafaciens), 크로마티움 부데리(Chromatium buderi), 크로마티움 테피덤(Chromatium tepidum), 크로마티움 비노섬(Chromatium vinosum), 크로마티움 워밍기(Chromatium warmingii), 크로마티움 플루비아틸레(Chromatium fluviatile), 에르비니아 우레도바라(Erwinia uredovora), 에르비니아 카로토바라(Erwinia carotovora), 에르비니아 아나스(Erwinia ananas), 에르비니아 헤리콜라(Erwinia herbicola), 에르비니아 펑크타타(Erwinia punctata), 에르비니아 테레우스(Erwinia terreus), 메틸로박테리움 로데시아넘(Methylobacterium rhodesianum), 메틸로박테리움 엑소토르켄스(Methylobacterium extorquens), 포르미디움 SP(Phormidium sp.) ATCC29409, 로도박터 캡술라터스 (Rhodobacter capsulatus) 로도박터 스페로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 로도슈도모나스 블라스티카(Rhodopseudomonas blastica), 로도슈도모나스 마리나(Rhodopseudomonas marina), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 로도스피릴룸 러브럼(Rhodospirillum rubrum), 로도스피릴룸 살렉시겐스(Rhodospirillum salexigens), 로도스피릴룸 살리나럼(Rhodospirillum salinarum), 스트렙토마이세스 암보파시엔스(Streptomyces ambofaciens), 스트렙토마이세스 오레오파시엔스(Streptomyces aureofaciens), 스트렙토마이세스 아우레우스(Streptomyces aureus), 스트렙토마이세스 푼지시디커스(Streptomyces fungicidicus), 스트렙토마이세스 그리세오크로모게네스(Streptomyces griseochromogenes), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 올리보그리세우스(Streptomyces olivogriseus), 스트렙토마이세스 라메우스(Streptomyces rameus), 스트렙토마이세스 타나시엔시스(Streptomyces tanashiensis), 스트렙토마이세스 비나세우스(Streptomyces vinaceus), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 등을 들 수 있다.
재조합 DNA 의 도입방법으로는, 상기 숙주세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어 칼슘 이온을 사용하는 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110(1972)], 프로토플라스트법 (일본 공개특허공보 소63-248394호), 전기천공법 [Nucleic Acids Res., 16, 6127(1988)] 등을 들 수 있다.
효모균주를 숙주세포로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서 예를 들어 YEp13(ATCC37115), YEp24(ATCC37051), YCp50(ATCC37419), pHS19, pHS15 등을 사용할 수 있다.
프로모터로는, 효모균주 속에서 기능하는 것이면 어떠한 것을 사용해도 되며, 예를 들어 PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 히트쇼크 폴리펩티드 프로모터, MFα1 프로모터, CUP 1 프로모터 등의 프로모터를 들 수 있다.
숙주세포로는, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)속, 트리코스포론(Trichosporon)속, 시와니오마이세스(Schwanniomyces)속, 피치아(Pichia)속 또는 칸디다(Candida)속 등에 속하는 효모균주를 들 수 있고, 구체적으로는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베이마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 시와니오마이세스 알루비우스(Schwanniomyces alluvius), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 칸디다 우틸리스(Candida utilis) 등을 들 수 있다.
재조합 DNA 의 도입방법으로는, 효모에 DNA 를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어 전기천공법 [Methods Enzymol., 194, 182(1990)], 스페로플라스트(spheroplast)법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889(1984)], 아세트산리튬법 [J. Bacteriol., 153, 163(1983)] 등을 들 수 있다.
동물세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서 예를 들어 pcDNAI, pcDM8 (후나코시사에서 시판), pAGE107 (일본 공개특허공보 평3-22979호), pAS3-3 (일본 공개특허공보 평2-227075호), pCDM8 [Nature, 329, 840(1987)], pcDNAI/Amp (인비트로젠사 제조), pREP4 (인비트로젠사 제조), pAGE103 [J. Biochem, 101, 1307(1987)], pAGE210, pAMo, pAMoA 등을 사용할 수 있다.
프로모터로는, 동물세포 속에서 기능하는 것이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어 사이토메갈로바이러스 (CMV) 의 IE (immediate early) 유전자의 프로모터, SV40 의 초기 프로모터 또는 메탈로티오네인의 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 히트쇼크 프로모터, SRα 프로모터 등을 들 수 있다. 또 인간 CMV 의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용해도 된다.
숙주세포로는, 마우스 골수종 세포, 래트 골수종 세포, 마우스 하이브리도마 세포, 인간의 세포인 나말바(Namalwa) 세포 또는 나말바 KJM-1 세포, 인간태아 신장 세포, 인간 백혈병 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포, 차이니즈 햄스터의 세포인 CHO 세포, HBT5637 (일본 공개특허공보 소63-299호) 등을 들 수 있다.
마우스 골수종 세포로는 SP2/0, NSO 등, 래트 골수종 세포로는 YB2/0 등, 인간태아 신장 세포로는 HEK293 (ATCC CRL-1573), 인간 백혈병 세포로는 BALL-1 등, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포로는 COS-1, COS-7 등을 들 수 있다.
재조합 DNA 의 도입방법으로는, 동물세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어 전기천공법 [Cytotechnology, 3, 133(1990)], 인산칼슘법 (일본 공개특허공보 평2-227075호), 리포펙션(lipofection)법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413(1987)], [Virology, 52, 456(1973)]에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
곤충세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 예를 들어 [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York(1992), Current Protocols in Molecular Biology, Molecular Biology, A Laboratory Manual, Bio/Technology, 6, 47(1988)] 등에 기재된 방법에 의해 단백질을 생산할 수 있다.
즉, 재조합 유전자 도입 벡터 및 바큘로바이러스를 곤충세포에 공도입하여 곤충세포 배양 상청 중에 재조합 바이러스를 얻은 후, 다시 재조합 바이러스를 곤충세포에 감염시켜 단백질을 생산시킬 수 있다.
그 방법에서 사용되는 유전자 도입 벡터로는, 예를 들어 pVL1392, pVL1393, pBlueBacⅢ (모두 인비트로젠사 제조) 등을 들 수 있다.
바큘로바이러스로는, 예를 들어 밤나방과 곤충에 감염되는 바이러스인 오토그래파 캘리포니카 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등을 사용할 수 있다.
곤충세포로는, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)의 난소세포, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 의 난소세포, 누에 난소 유래의 배양세포 등을 사용할 수 있다.
스포돕테라 프루기페르다의 난소세포로는 Sf9, Sf21 (바큘로바이러스 익스프레션 벡터즈 어 래버러토리 매뉴얼) 등, 트리코플루시아 니의 난소세포로는 High 5, BTI-TN-5B1-4 (인비트로젠사 제조) 등, 누에 난소 유래의 배양세포로는 봄비크스 모리(Bombyx mori) N4 등을 들 수 있다.
재조합 바이러스를 제조하기 위한, 곤충세포에 대한 상기 재조합 유전자 도입 벡터와 상기 바큘로바이러스의 코트랜스펙션(cotransfection) 방법으로는, 예를 들어 인산칼슘법 (일본 공개특허공보 평2-227075호), 리포펙션법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413(1987)] 등을 들 수 있다.
식물세포를 숙주세포로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서 예를 들어 Ti 플라스미드, 담배 모자이크 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.
프로모터로는, 식물세포 속에서 기능하는 것이면 어떤 것을 사용해도 되며, 예를 들어 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 의 35S 프로모터, 벼 액틴 1 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주세포로는, 담배, 감자, 토마토, 당근, 콩, 유채, 알팔파, 벼, 밀, 보리 등의 식물세포 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입방법으로는, 식물세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어 아그로박테리움(Agrobacterium) 을 사용하는 방법 (일본 공개특허공보 소59-140885호, 일본 공개특허공보 소60-70080호, WO94/00977), 전기천공법 (일본 공개특허공보 소60-251887호), 파티클 건 (유전자총) 을 사용하는 방법 (일본 특허 제2606856호, 일본 특허 제 2517813호) 등을 들 수 있다.
효모, 동물세포, 곤충세포 또는 식물세포에 의해 발현시킨 경우에는, 당 또는 당쇄가 부가된 단백질을 얻을 수 있다.
이상과 같이 하여 얻어지는 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 본 발명의 단백질을 생성 축적시켜 그 배양물로부터 채취함으로써, 그 단백질을 제조할 수 있다.
본 발명의 단백질을 제조하기 위한 상기 형질 전환체의 숙주로는, 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포 등, 식물세포 등 어떤 것이나 상관없으며, 바람직하게는 세균, 보다 바람직하게는 이셰리키아속에 속하는 미생물, 더욱 바람직하게는 이셰리키아 콜라이에 속하는 미생물을 들 수 있다.
상기 형질 전환체를 배지에 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다.
이셰리키아 콜라이 등의 원핵생물 또는 효모 등의 진핵생물을 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 그 생물이 자화될 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 형질전환체의 배양을 효율적으로 실시할 수 있는 배지라면 천연배지, 합성배지 어느 것이나 사용할 수 있다.
탄소원으로는, 그 생물이 자화될 수 있는 것이면 되고, 글루코오스, 프룩토스, 수크로스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류 등을 사용할 수 있다.
질소원으로는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 그 밖의 질소함유 화합물 그리고 펩톤, 고기 추출물, 효모 추출물, 콘 스팁 리커, 카세인 가수분해물, 콩깻묵 및 콩깻묵 가수분해물, 각종 발효균체 및 그 소화물 등을 사용할 수 있다.
무기염으로는, 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상 진탕배양 또는 심부 통기 교반배양 등의 호기적 조건하에서 실시한다. 배양온도는 15∼40℃ 가 좋고, 배양시간은 통상 5시간∼7일간이다. 배양중 pH 는 3.0∼9.0 으로 유지한다. pH 의 조정은 무기 또는 유기의 산, 알칼리 용액, 우레아, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 실시한다.
또, 배양중 필요에 따라 앰피실린이나 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
프로모터로서 유도성 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라 유도인자를 배지에 첨가해도 된다. 예를 들어, lac 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가해도 된다.
동물세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지 [J. Am. Med. Assoc., 199, 519(1967)], 이글 (Eagle) 의 MEM 배지 [Science, 122, 501(1952)], DMEM 배지 [Virology, 8, 396(1959)], 199 배지 [Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1(1950)] 또는 이들 배지에 소태아혈청 등을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상 pH 6∼8, 25∼40℃, 5% CO2 존재 하 등의 조건 하에서 1∼7일간 실시한다.
또 배양중 필요에 따라 카나마이신, 페니실린, 스트렙토마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
곤충세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지 (파민젠사 제조), Sf-900 Ⅱ SFM 배지 (라이프 테크놀로지사 제조), ExCell400, ExCell405 [모두 JRH 바이오사이언시즈사 제조], Grace's Insect Medium [Nature, 195, 788(1962)] 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상 pH 6∼7, 25∼30℃ 등의 조건 하에서 1∼5일간 실시한다.
또한 배양중 필요에 따라 겐타마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
식물세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체는, 세포로서 또는 식물의 세포나 기관으로 분화시켜 배양할 수 있다. 그 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용되고 있는 Murashige-Skoog(MS) 배지, 화이트 (White) 배지, 또는 이들 배지에 옥신, 사이토카이닌 등 식물호르몬을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상 pH 5∼9, 20∼40℃ 의 조건 하에서 3∼60일간 실시한다.
또 배양중 필요에 따라 카나마이신, 하이글로마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
상기한 바와 같이 본 발명의 DNA 또는 본 발명의 제조법에 사용되는 DNA 를 발현 벡터에 연결한 재조합 DNA 를 보유하는 미생물, 곤충세포, 동물세포 또는 식물세포 유래의 형질 전환체를 통상의 배양방법에 따라 배양하고, 본 발명의 단백질을 생성 축적시켜 그 배양물에서 그 단백질을 채취함으로써, 그 단백질을 제조할 수 있다.
본 발명의 단백질의 생산방법으로는, 숙주세포 내에 생산시키는 방법, 숙주세포 외로 분비시키는 방법 또는 숙주세포 외막 상에 생산시키는 방법이 있고, 선택한 방법에 따라 생산시키는 단백질의 구조를 바꿀 수 있다.
본 발명의 단백질이 숙주세포 내 또는 숙주세포 외막 상에 생산되는 경우, Paulson 등의 방법 [J. Biol. Chem., 264, 17619(1989)], Lowe 등의 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227(1989), Genes Develop., 4, 1288(1990)] 또는 일본 공개특허공보 평05-336963호, WO94/23021 등에 기재된 방법을 준용함으로써 그 단백질을 숙주세포 외로 적극적으로 분비시킬 수 있다.
즉, 유전자 재조합의 수법을 사용하여 본 발명 단백질의 활성부위를 포함하는 단백질 앞에 시그널펩티드를 부가한 형태로 생산시킴으로써, 그 단백질을 숙주세포 외로 적극적으로 분비시킬 수 있다.
또한 일본 공개특허공보 평2-227075호에 기재되어 있는 방법에 준하여, 디히드로엽산 환원 효소 유전자 등을 사용한 유전자 증폭계를 이용하여 생산량을 상승시킬 수도 있다.
그리고, 유전자 도입한 동물 또는 식물의 세포를 재분화시킴으로써 유전자가 도입된 동물개체 (트랜스제닉 비인간동물) 또는 식물개체 (트랜스제닉 식물) 를 조성하고, 이들 개체를 사용하여 본 발명의 단백질을 제조할 수도 있다.
본 발명의 단백질을 생산하는 형질 전환체가 동물개체 또는 식물개체인 경우에는, 통상의 방법에 따라 사육 또는 재배하고, 그 단백질을 생성 축적시켜 그 동물개체 또는 식물개체에서 그 단백질을 채취함으로써, 그 단백질을 제조할 수 있다.
동물개체를 사용하여 본 발명의 단백질을 제조하는 방법으로는, 예를 들어 공지된 방법 [Am. J. Clin. Nutr., 63, 639S(1996), Am. J. Clin. Nutr., 63, 627S(1996), Bio/Technology, 9, 830(1991)] 에 준하여 유전자를 도입하여 조성한 동물 중에 본 발명의 단백질을 생산하는 방법을 들 수 있다.
동물개체의 경우에는, 예를 들어 본 발명의 DNA 또는 본 발명의 제조법에 사용되는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 비인간동물을 사육하고, 본 발명의 단백질을 그 동물 중에 생성, 축적시켜 그 동물 중에서 그 단백질을 채취함으로써 그 단백질을 제조할 수 있다. 그 동물 중의 그 단백질을 생성, 축적시키는 장소로는, 예를 들어 그 동물의 젖 (일본 공개특허공보 소63-309192호), 알 등을 들 수 있다. 이 때 사용되는 프로모터로는, 동물에서 기능하는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있지만, 예를 들어 유선 세포 특이적인 프로모터인 α 카세인 프로모터, β 카세인 프로모터, β 락토글로불린 프로모터, 유청 산성 단백질 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
식물개체를 사용하여 본 발명의 단백질을 제조하는 방법으로는, 예를 들어 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 식물을 공지된 방법 [조직배양, 20(1994), 조직배양, 21(1995), Trends Biotechnol., 15, 45(1997)] 에 준하여 재배하고, 그 단백질을 그 식물 중에 생성, 축적시켜 그 식물 중에서 그 단백질을 채취함으로써 그 단백질을 생산하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 단백질을 생산하는 형질 전환체를 사용하여 제조된 본 발명의 단백질을 단리·정제하는 방법으로는, 통상의 효소의 단리, 정제법을 사용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 단백질이 세포 내에 용해상태로 생산된 경우에는, 배양 종료 후 세포를 원심 분리에 의해 회수하여 수성 완충액에 현탁한 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, Manton Gaulin 균질화기, Dynomill 등에 의해 세포를 파쇄하여 무세포 추출액을 얻는다.
그 무세포 추출액을 원심 분리함으로써 얻어지는 상청으로부터 통상의 효소의 단리정제법, 즉 용매추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로스, DIAION HPA-75 (미츠비시화성사 제조) 등의 수지를 사용한 음이온교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF (파마시아사 제조) 등의 수지를 사용한 양이온교환 크로마토그래피법, 부틸세파로스, 페닐세파로스 등의 수지를 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자 체를 사용한 겔 여과법, 어피니티(affinity)-크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점 포커싱 등의 전기영동법 등의 수법을 단독 또는 조합해 사용하여 정제표본을 얻을 수 있다.
또 그 단백질이 세포 내에 불용체를 형성하여 생산된 경우에는, 마찬가지로 세포를 회수한 후 파쇄하여 원심 분리함으로써 얻어진 침전 획분에서 통상의 방법에 의해 그 단백질을 회수한 후, 그 단백질의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다.
그 가용화액을, 단백질 변성제를 포함하지 않거나 또는 단백질 변성제의 농도가 단백질이 변성되지 않을 정도로 희박한 용액에 희석 또는 투석하여 그 단백질을 정상적인 입체 구조에 구성시킨 후, 상기와 같은 단리정제법에 의해 정제표본을 얻을 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 그 당 수식체 등의 유도체가 세포 외로 분비된 경우에는, 배양 상청에 그 단백질 또는 그 당 부가체 등의 유도체를 회수할 수 있다.
즉, 그 배양물을 상기와 같은 원심 분리 등의 수법에 의해 처리함으로써 가용성 획분을 취득하고, 그 가용성 획분으로부터 상기와 같은 단리정제법을 사용함으로써 정제표본을 얻을 수 있다.
이렇게 하여 취득되는 단백질로서, 예를 들어 서열번호 1∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 들 수 있다.
또 본 발명의 단백질을 다른 단백질과의 융합 단백질로서 생산하고, 융합한 단백질에 친화성을 갖는 물질을 사용한 어피니티-크로마토그래피를 이용하여 정제할 수도 있다. 예를 들어, Lowe 등의 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227(1989), Genes Develop., 4, 1288(1990)], 일본 공개특허공보 평5-336963호, WO94/23021 에 기재된 방법에 준하여, 본 발명의 단백질을 단백질 A 와의 융합 단백질로서 생산하고, 이뮤노글로불린 G 를 사용하는 어피니티-크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
또한 본 발명의 단백질을 Flag 펩티드와의 융합 단백질로서 생산하고, 항 Flag 항체를 사용하는 어피니티-크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227(1989), Genes Develop., 4, 1288(1990)]. 또한 그 단백질 자체에 대한 항체를 사용한 어피니티-크로마토그래피로 정제할 수도 있다.
상기에서 취득된 단백질의 아미노산 서열정보를 기초로 Fmoc 법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc 법 (t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해 본 발명의 단백질을 제조할 수 있다. 또한 Advanced ChemTech사, 파킨 엘머사, Pharmacia사, Protein Technology Instrument사, Synthecell-Vega사, PerSeptive사, 시마즈제작소 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.
(ⅲ) 본 발명의 디펩티드의 제조법
(1) 효소적 제조법
디펩티드의 효소적 제조법으로는, 본 발명의 단백질, 1종 이상의 아미노산 및 ATP 을 수성 매질 중에 존재시키고, 그 매질 중에 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드를 생성, 축적시켜 그 매질로부터 그 디펩티드를 채취하는 방법을 들 수 있다.
상기 제조법에 있어서, 기질에 사용되는 1종 이상의 아미노산, 바람직하게는 1 또는 2종의 아미노산으로는, 1종의 아미노산으로서 L-알라닌을 사용하는 경우를 제외하고, 아미노산, 바람직하게는 L-아미노산, 글리신 (Gly) 및 β-알라닌 (βAla) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산이면 어느 아미노산을 어떤 조합으로도 사용해도 된다. L -아미노산으로는, 예를 들어 L-알라닌 (L-Ala), L-글루타민 (L-Gln), L-글루탐산 (L-Glu), L-발린 (L-Val), L-류신 (L-Leu), L-이소류신 (L-Ile), L-프롤린 (L-Pro), L-페닐알라닌 (L-Phe), L-트립토판 (L-Trp), L-메티오닌 (L-Met), L-세린 (L-Ser), L-트레오닌 (L-Thr), L-시스테인 (L-Cys), L-아스파라긴 (L-Asn), L-티로신 (L-Tyr), L-리신 (L-Lys), L-알기닌 (L-Arg), L-히스티딘 (L-His), L-아스파르트산 (L-Asp), L-α-아미노부티르산 (L-α-AB), L-아자세린 (L-Azaserine), L-테아닌 (L-theanine), L-4-히드록시프롤린 (L-4-HYP), L-3-히드록시프롤린 (L-3-HYP), L-오르니틴 (L-Orn), L-시트룰린 (L-Cit) 및 L-6-디아조-5-옥소노르류신 (L-6-diazo-5-oxo-norleucine) 등을 들 수 있다.
상기 제조법에 사용되는 보다 바람직한 아미노산으로는, L-Ala, Gly, L-Met, L-Ser, L-Thr 및 β-Ala 에서 선택되는 1종의 아미노산과 L-Ala, L-Gln, L-Glu, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, L-α-AB, β-Ala, L-Azaserine, L-theanine, L-4-HYP, L-3-HYP, L-Orn, L-Cit 및 L-6-diazo-5-oxo-norleucine 에서 선택되는 1종의 아미노산의 조합 (단, L-Ala 끼리의 조합을 제외함), L-Gln 과 L-Phe 의 조합 및 L-α-AB 와 L-Gln, L-Arg 또는 L-α-AB 의 조합, 더욱 바람직하게는 L-Ala 와 L-Gln, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-α-AB, L-Azaserine, L-Cit 및 L-theanine 에서 선택되는 1종의 아미노산의 조합, Gly 와 L-Gln, Gly, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-α-AB 및 L-Cit 에서 선택되는 1종의 아미노산의 조합, L-Met 와 L-Phe, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Tyr, L-Lys 및 L-His 에서 선택되는 1종의 아미노산의 조합, L-Ser 와 L-Gln, L-Phe, L-Ser, L-Thr, L-Tyr, L-His 및 L-α-AB 에서 선택되는 1종의 아미노산의 조합, L-Thr 와 L-Gln, L-Phe, L-Leu, L-Thr 및 L-α-AB 에서 선택되는 1종의 아미노산의 조합, L-Gln 과 L-Phe 의 조합, β-Ala 와 L-Phe, L-Met, L-His 및 L-Cit 에서 선택되는 1종의 아미노산의 조합, 및 L-α-AB 와 L-Gln, L-Arg 또는 L-α-AB 의 조합을 들 수 있다.
상기 제조법에 있어서, 본 발명의 단백질은 기질로서 사용하는 아미노산 1㎎ 당 0.01∼100㎎, 바람직하게는 0.1㎎∼10㎎ 첨가한다.
상기 제조법에 있어서, 기질로서 사용하는 아미노산은 0.1∼500g/ℓ, 바람직하게는 0.2∼200g/ℓ의 농도가 되도록 수성 매질 중에 처음 또는 반응 도중에 첨가한다.
상기 제조법에 있어서, 에너지원으로서 사용하는 ATP 는 0.5mmol∼10mol/ℓ의 농도로 사용한다.
상기 제조법에서 사용되는 수성 매질로는, 디펩티드의 생성반응을 저해하지 않는 한 어떠한 성분, 조성의 수성 매질이든 되고, 예를 들어 물, 인산염, 탄산염, 아세트산염, 붕산염, 시트르산염, 트리스 등의 완충액 등을 들 수 있다. 또한 메탄올, 에탄올 등의 알코올류, 아세트산에틸 등의 에스테르류, 아세톤 등의 케톤류, 아세트아미드 등의 아미드류를 함유하고 있어도 된다.
디펩티드의 생성반응은 수성 매질 중 pH 5∼11, 바람직하게는 pH 6∼10, 20∼50℃, 바람직하게는 25∼45℃ 의 조건으로 2∼150시간, 바람직하게는 6∼120시간 실시한다.
상기 방법으로 제조되는 디펩티드로는 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드를 들 수 있고, 바람직하게는 식 (Ⅰ) 에서 R1 및 R2 가 동시에 또는 다르고, L-Ala, L-Gln, L-Glu, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, L-α-AB, β-Ala, L-Azaserine, L-theanine, L-4-HYP, L-3-HYP, L-Orn, L-Cit 및 L-6-diazo-5-oxo-norleucine 에서 선택되는 아미노산인 디펩티드 (단, R1 및 R2 는 동시에 L-Ala 인 경우를 제외함) 를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 R1 이 L-Ala, Gly, L-Met, L-Ser, L-Thr 또는 β-Ala 인 경우에는 R2 가 L-Gln, L-Glu, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, L-α-AB, β-Ala, L-Azaserine, L-theanine, L-4-HYP, L-3-HYP, L-Orn, L-Cit 또는 L-6-diazo-5-oxo-norleucine 인 디펩티드를 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 R1 이 L-Ala 인 경우에는 R2 는 L-Gln, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-α-AB, L-Azaserine, L-theanine 또는 L-Cit 인 디펩티드, R1 이 Gly 인 경우에는 R2 는 L-Gln, Gly, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-α-AB 또는 L-Cit 인 디펩티드, R1 이 L-Met 인 경우에는 R2 는 L-Phe, L-Met, L-Cys, L-Tyr, L-Lys 또는 L-His 인 디펩티드, R1 이 L-Ser 인 경우에는 R2 는 L-Gln, Gly, L-Phe, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Tyr, L-His 또는 L-α-AB 인 디펩티드, R1 이 L-Thr 인 경우에는 R2 는 L-Gln, L-Leu, L-Phe, L-Met, L-Ser, L-Thr 또는 L-α-AB 인 디펩티드, R1 이 L-Gln 인 경우에는 R2 는 L-Phe 또는 L-α-AB 인 디펩티드, R1 이 L-Phe 인 경우에는 R2 는 L-Gln 인 디펩티드, R1 이 L-Trp 인 경우에는 R2 는 Gly 인 디펩티드, R1 이 L-Cys 인 경우에는 R2 는 L-Ala, L-Gln, Gly 또는 L-Met 인 디펩티드, R1 이 L-Lys 인 경우에는 R2 는 L-Ala, Gly 또는 L-Met 인 디펩티드, R1 이 β-Ala 인 경우에는 R2 는 L-Phe, L-Met 또는 L-His 인 디펩티드, R1 이 L-Arg 인 경우에는 R2 는 L-α-AB 인 디펩티드, R1 이 L-His 인 경우에는 R2 는 L-Met 인 디펩티드, 및 R1 이 L-α-AB 인 경우에는 R2 는 L-Ala, L-Gln, Gly, L-Ser, L-Thr, L-Arg 또는 L-α-AB 인 디펩티드를 들 수 있다.
(2) 형질 전환체 또는 미생물의 배양물 또는 배양물의 처리물을 효소원으로서 사용하는 제조법
형질 전환체 또는 미생물의 배양물 또는 배양물의 처리물을 효소원으로서 사용하는 디펩티드의 제조법으로는, 본 발명의 단백질을 생산하는 능력을 갖는 형질 전환체 또는 본 발명의 단백질을 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양물 또는 배양물의 처리물을 효소원으로 사용하여 그 효소원 및 1종 이상의 아미노산을 수성 매질 중에 존재시키고, 그 매질 중에 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드를 생성, 축적시켜 그 매질로부터 그 디펩티드를 채취하는 그 디펩티드의 제조법을 들 수 있다.
상기 제조법에 사용되는 형질 전환체로는, 상기 (ⅱ) 의 방법에 의해 제조할 수 있는, 본 발명의 단백질을 생산하는 형질 전환체를 들 수 있다. 그 형질 전환체의 숙주로는, 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포 등, 식물세포 등을 들 수 있고, 바람직하게 세균, 보다 바람직하게는 이셰리키아속, 바실러스속 또는 코리네박테리움속에 속하는 미생물을 들 수 있다.
이셰리키아속에 속하는 미생물로는, 바람직하게는 이셰리키아 콜라이에 속하는 미생물 등을 들 수 있고, 바실러스속에 속하는 미생물로는 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 메가테리움 등에 속하는 미생물을 들 수 있고, 코리네박테리움속에 속하는 미생물로는 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미컴 또는 코리네박테리움 암모니아게네스 등에 속하는 미생물을 들 수 있다.
상기 제조법에 사용되는 미생물은, 본 발명의 단백질을 생산하는 능력을 갖는 미생물이라면 어떤 미생물이든 되고, 바람직하게는 바실러스속에 속하는 미생물, 보다 바람직하게는 바실리신 합성 활성을 갖는 바실러스속에 속하는 미생물, 더욱 바람직하게는 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀롤리케파시엔스, 바실러스 코아귤런스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 메가테리움 및 바실러스 푸밀루스로 이루어지는 군에서 선택되는 종에 속하는 미생물, 가장 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 ATCC15245, 바실러스 서브틸리스 ATCC6633, 바실러스 서브틸리스 IAM1213, 바실러스 서브틸리스 IAM1107, 바실러스 서브틸리스 IAM1214, 바실러스 서브틸리스 ATCC9466, 바실러스 서브틸리스 IAM1033, 바실러스 서브틸리스 ATCC21555, 바실러스 아밀롤리케파시엔스 IFO3022 및 바실러스 푸밀루스 NRRL B-12025 로 이루어지는 군에서 선택되는 주인 미생물을 들 수 있다.
배양물의 처리물로는, 배양물의 농축물, 배양물의 건조물, 배양물을 원심 분리하여 얻어지는 균체, 그 균체의 건조물, 그 균체의 동결 건조물, 그 균체의 계면활성제 처리물, 그 균체의 초음파 처리물, 그 균체의 기계적 마쇄 처리물, 그 균체의 용매 처리물, 그 균체의 효소 처리물, 그 균체의 단백질 분획물, 그 균체의 고정화물 또는 그 균체에서 추출하여 얻어지는 효소표본 등을 들 수 있다.
상기 제조법에 있어서, 기질로서 사용하는 아미노산의 종류, 사용농도 및 첨가시기, 그리고 생산되는 디펩티드는 상기 (ⅲ) 의 (1) 의 효소적 제조법과 동일하다.
또 미생물의 배양물 또는 그 배양물의 처리물을 효소원으로 한 제조법에 있어서 사용되는 수성 매체로는, 상기 (ⅲ) 의 (1) 의 효소적 제조법에 사용되는 수성 매체에 더하여 효소원으로서 사용한 형질 전환체 또는 미생물의 배양액도 수성 매체로서 사용할 수 있다.
또한 상기 제조법에서는, 필요에 따라 ATP 의 공급원으로서 ATP 또는 형질 전환체 또는 미생물이 대사하여 ATP 를 생산할 수 있는 화합물, 예를 들어 글루코오스와 같은 당류, 에탄올과 같은 알코올류, 아세트산과 같은 유기산류 등을 수성 매질 중에 첨가할 수 있다.
또한 필요에 따라, 수성 매질 중에 계면활성제 또는 유기용매를 첨가해도 된다. 계면활성제로는, 폴리옥시에틸렌·옥타데실아민 (예를 들어 나이민(Nymeen) S-215, 니혼유시사 제조) 등의 비이온 계면활성제, 세틸트리메틸암모늄·브로마이드나 알킬디메틸·벤질암모늄클로라이드 (예를 들어 양이온 F2-40E, 니혼유시사 제조) 등의 양이온계 계면활성제, 라우로일·잘코시네이트 등의 음이온계 계면활성제, 알킬디메틸아민 (예를 들어 3급 아민 FB, 니혼유시사 제조) 등의 3급 아민류 등, 디펩티드의 생성을 촉진하는 것이면 어떤 것이든 되고, 1종 또는 수종을 혼합하여 사용할 수도 있다. 계면활성제는 통상 0.1∼50g/ℓ의 농도로 사용된다. 유기용제로는 자일렌, 톨루엔, 지방족 알코올, 아세톤, 아세트산에틸 등을 들 수 있고, 통상 0.1∼50㎖/ℓ의 농도로 사용된다.
배양물 또는 그 배양물의 처리물을 효소원으로서 사용하는 경우, 그 효소원의 양은 당해 효소원의 비활성 등에 따라 다르지만, 예를 들어 기질로서 사용하는 아미노산 1㎎ 당 습윤세포 중량으로서 5∼1000㎎, 바람직하게는 10∼400㎎ 첨가한다.
디펩티드의 생성반응은 수성 매질 중 pH 5∼11, 바람직하게는 pH 6∼10, 20∼65℃, 바람직하게는 25∼55℃, 보다 바람직하게는 30∼45℃ 의 조건에서 통상 1분간∼150시간, 바람직하게는 3분간∼120시간, 보다 바람직하게는 30분간∼100시간 실시한다.
상기 (ⅲ) 의 (1) 또는 (2) 의 제조법에 있어서, 수성 매질 중에 생성, 축적한 디펩티드의 채취는 활성탄이나 이온교환 수지 등을 사용하는 통상의 방법 또는 유기용매에 의한 추출, 결정화, 박층 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피 등에 의해 실시할 수 있다.
도 1 은 플라스미드 pPE43 의 구축과정을 나타내는 도면이다.
도 2 는 플라스미드 pQE60ywfE 의 구축과정을 나타내는 도면이다.
또 도면 중 ywfE 는 바실러스 서브틸리스 168주 유래의 ywfE 유전자, Ptrp 는 트립토판 프로모터 유전자, PT5 는 T5 프로모터 유전자를 나타낸다.
(발명을 실시하기 위한 최선의 형태)
이하에 실시예를 나타내는데, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
데이터 베이스를 이용한 디펩티드 합성 활성을 갖는 단백질의 검색
바실러스 서브틸리스 168주 유래의 D-Ala-D-Ala 리가아제 유전자의 아미노산 서열 [Nature, 390, 249-256(1997)]을 문의사항(query)로 하고, 바실러스 서브틸리스 168주의 게놈 DNA 의 데이터 베이스인 Subtilist (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/) 의 호몰로지 검색기능을 사용하여, 바실러스 서브틸리스 168주의 게놈 DNA 서열 중에 존재하는 상동성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 검색하였다.
그 결과 추출된 서열 중 D-Ala-D-Ala 리가아제 모티브 [Biochemistry, 30, 1673(1991)] 인 서열번호 33, 34 또는 35 로 표시되는 아미노산 서열을 코드하고, 또 이미 그 기능이 동정되어 있는 단백질을 암호화하는 유전자를 배제한 것 중 D-Ala-D-Ala 리가아제 모티브와 가장 높은 상동성 (29.1%) 을 나타내는 것으로서 기능 미지 유전자 ywfE 를 선택하였다.
ywfE 의 염기 서열을 서열번호 9, 그 염기 서열에 코드되는 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 1 로 나타내었다.
실시예 2
ywfE 유전자 발현주의 조성
실시예 1 에서 얻어진 염기 서열 정보에 따라, 바실러스 서브틸리스의 ywfE 유전자 단편을 이하와 같이 하여 취득하였다.
먼저, 바실러스 서브틸리스 168주 (ATCC 23857) 를 LB 배지 [10g/ℓ 박토트립톤 (디프코사 제조), 5g/ℓ 이스트 추출물 (디프코사 제조), 5g/ℓ 염화나트륨] 에 접종하여 30℃ 에서 하룻밤 정치 배양하였다. 배양 후 Current Protocols in Molecular Biology에 기재된 포화페놀을 사용하는 방법에 의해 그 미생물의 염색체 DNA 를 단리정제하였다.
퍼셉티브 바이오 시스템즈 (Perseptive Biosystems) 사 제조 8905형 DNA 합성기를 사용하여, 서열번호 19∼22 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA (이하, 각각 프라이머 A, 프라이머 B, 프라이머 C 및 프라이머 D 라 함) 를 합성하였다. 프라이머 A 는 바실러스 서브틸리스의 염색체 DNA 의 ywfE 개시 코돈을 포함하는 영역의 5'말단에 XhoI 인식 서열을 포함하는 염기 서열을 부가한 것이다. 프라이머 B 는 ywfE 의 종결 코돈을 포함하는 서열과 상보적인 염기 서열의 5'말단에 BamHI 인식 서열을 포함하는 염기 서열을 부가한 것이다. 또한 프라이머 C 는 trp 프로모터를 포함하는 발현 벡터 pTrS30 [이셰리키아 콜라이 JM109/pTrS30 (FERM BP-5407) 로 제조] 의 trp 프로모터 영역의 염기 서열의 5'말단에 EcoRI 인 식 서열을 포함하는 염기 서열을 부가한 것이다. 프라이머 D 는 trp 프로모터를 포함하는 발현 벡터 pTrS30 의 trp 프로모터 영역의 서열과 상보적인 서열의 5'말단에 XhoI 인식 서열을 포함하는 염기 서열을 부가한 것이다.
ywfE 유전자 단편의 증폭에는 상기 프라이머 A 및 프라이머 B, 주형으로서 바실러스 서브틸리스의 염색체 DNA 를 사용하고, trp 프로모터 영역의 단편의 증폭에는 프라이머 C 및 프라이머 D, 주형으로서 pTrS30 을 사용하여 PCR 을 하였다. PCR 은 주형으로서 0.1㎍ 의 염색체 DNA 또는 10ng 의 pTrS30, 0.5μmol/ℓ의 각 프라이머, 2.5units 의 Pfu DNA 중합효소 (스트라타진사 제조), 4㎕ 의 Pfu DNA 중합효소용×10 완충액 (스트라타진사 제조), 각 200μmol/ℓ의 dNTP (dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP) 을 함유하는 반응액 40㎕ 를 제조하여 94℃ 에서 1분간, 55℃ 에서 2분간, 72℃ 에서 3분간의 공정을 30회 반복함으로써 실시하였다.
그 반응액의 1/10 을 아가로스겔 전기 영동하고, 프라이머 A 및 프라이머 B 를 사용한 PCR 에서는 ywfE 유전자 단편에 상당하는 약 1.4kb, 프라이머 C 및 프라이머 D 를 사용한 반응에서는 trp 프로모터 영역의 DNA 단편에 상당하는 약 0.3kb 의 DNA 단편이 각각 증폭하고 있는 것을 확인한 후, 나머지 반응액과 등량의 TE [10mmol/ℓ Tris-HCl (pH 8.0), 1mmol/ℓ EDTA] 포화페놀/클로로포름 (1vol/1vol) 용액을 첨가하여 혼합하였다. 그 용액을 원심 분리하여 얻어진 상층에 2배 용량의 냉에탄올을 첨가하고 혼합하여 -80℃ 에 30분간 방치하였다. 그 용액을 원심 분리하여 DNA 를 침전시킨 후, 그 DNA 를 20㎕ 의 TE 에 용해시켰다.
그 용해액 각각 5㎕ 를 사용하여 프라이머 A 및 프라이머 B 로 증폭한 DNA 를 제한효소 XhoI 및 BamHI 로, 또 프라이머 C 및 프라이머 D 로 증폭한 DNA 를 제한효소 EcoRI 및 XhoI 로 절단하여 아가로스겔 전기 영동에 의해 DNA 단편을 분리한 후, 진클린 Ⅱ 키트 (GENECLEAN Ⅱ kit, BIO 101사 제조) 를 사용해 ywfE 를 포함하는 1.4kb 및 trp 프로모터 영역을 포함하는 0.3kb 의 DNA 단편을 각각 회수하였다.
trp 프로모터를 포함하는 발현 벡터 pTrS30 [이셰리키아 콜라이 JM109/pTrS30 (FERM BP-5407) 에서 제조] 0.2㎍ 를 제한효소 EcoRI 및 BamHI 로 절단한 후, 아가로스겔 전기 영동에 의해 DNA 단편을 분리하여 상기와 동일한 방법에 의해 4.5kb 의 DNA 단편을 회수하였다.
상기에서 얻어진 ywfE 를 포함하는 1.4kb 단편, trp 프로모터 영역을 포함하는 0.3kb 단편 및 4.5kb 의 단편을 라이게이션 키트 (다카라슈조사 제조) 를 사용하여 16℃ 에서 16시간 반응시켜 연결하였다.
그 반응액을 사용하여 이셰리키아 콜라이 NM522주 (스트라타진사 제조) 를 칼슘 이온을 사용하는 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110(1972)] 에 의해 형질 전환하고, 그 형질 전환체를 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 포함하는 LB 한천 배지에 도포한 후 30℃ 에서 하룻밤 배양하였다.
생육시킨 형질 전환체의 콜로니로부터 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, 제한효소를 사용하여 그 구조를 해석함으로써, trp 프로모터 하류에 ywfE 가 연결된 발현 벡터인 pPE43 가 취득된 것을 확인하였다 (도 1).
실시예 3
디펩티드의 생산
실시예 2 에서 얻어진 pPE43 을 보유하는 이셰리키아 콜라이 NM522 (이셰리키아 콜라이 NM522/pPE43주) 를 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 포함하는 8㎖ 의 LB 배지가 들어있는 굵은 시험관에 접종하여 28℃ 에서 17시간 배양하였다. 그 배양액을 원심 분리하여 습윤세포를 취득하였다.
최종 농도 60㎎/㎖ 의 그 습윤세포, 120mmol/ℓ의 인산칼륨 버퍼 (pH 7.4), 60mmol/ℓ의 염화마그네슘, 60mmol/ℓ의 ATP, 30mmol/ℓ의 L-Ala, 30mmol/ℓ의 L-Gln, 0.4% 의 나이민 S-215 로 이루어지는 0.1㎖ 의 반응액을 제조하여 37℃ 에서 3분간 반응시켰다.
반응 종료 후, 반응 생성물을 디니트로페놀화법으로 유도체화한 후에 HPLC 법에 의해 분석하였다. HPLC 법에 의한 분석은, 분리칼럼에 간토화학사 제조의 Lichrosorb-RP-18 칼럼을 사용하고, 용리액으로서 1%(v/v) 인산, 25%(v/v) 아세토니트릴을 사용하여, 0.7㎖/분의 유동속도로 실시하였다. 그 결과 반응액 중에 120㎎/ℓ의 L-알라닐-L-글루타민 (L-Ala-L-Gln) 이 생성 축적되어 있는 것을 확인하였다.
대조 균주인 벡터만을 포함하는 이셰리키아 콜라이 NM522/pTrS31주의 균체에서는 L-Ala-L-Gln 의 생성은 관찰되지 않았다.
실시예 4
C 말단 His 태그 부가 재조합 디펩티드 합성 효소의 정제
상기 DNA 합성기를 사용하여 서열번호 23 및 24 로 표시되는 염기 서열을 갖 는 DNA (이하, 각각 프라이머 E, 프라이머 F 라 함) 를 합성하였다. 프라이머 E 는 ywfE 의 개시 코돈 (atg) 을 NcoI 인식 서열 (ccatgg) 로 치환한 영역을 포함하는 염기 서열이다. 프라이머 F 는 ywfE 의 종결 코돈을 BamHI 인식서열 (ggatcc) 로 치환한 영역을 포함하는 염기 서열이다.
바실러스 서브틸리스 168주 (ATCC23857) 의 염색체 DNA 를 주형으로 하고, 상기 프라이머 E 및 프라이머 F 를 프라이머 세트로 사용하여 PCR 을 하였다. PCR 은 0.1㎍ 의 염색체 DNA, 0.5μmol/ℓ의 각 프라이머, 2.5units 의 Pfu DNA 중합효소, 4㎕ 의 Pfu DNA 중합효소용(×10) 완충액, 200μmol/ℓ의 각 dNTP 를 포함하는 반응액 40㎕ 을 제조하여 94℃ 에서 1분간, 55℃ 에서 2분간, 72℃ 에서 3분간의 공정을 30회 반복하여 실시하였다.
그 반응액의 1/10 을 아가로스겔 전기 영동하여 ywfE 단편에 상당하는 약 1.4kb 의 단편이 증폭되고 있는 것을 확인한 후, 나머지 반응액과 등량의 TE 포화페놀/클로로포름 용액을 첨가하여 혼합하였다. 그 용액을 원심 분리하여 얻은 상층에 2배 용량의 냉에탄올을 첨가하고 혼합하여 -80℃ 에 30분간 방치하였다. 그 용액을 원심 분리하여 얻어진 DNA 의 침전을 20㎕ 의 TE 에 용해하였다.
그 용해액 5㎕ 을 사용하여, 증폭한 DNA 를 제한효소 NcoI 및 BamHI 로 절단하여 아가로스겔 전기 영동에 의해 DNA 단편을 분리한 후, 진클린 Ⅱ 키트를 사용하여 ywfE 를 포함하는 1.4kb 의 DNA 단편을 회수하였다.
C 말단 His 태그 부가 재조합 발현 벡터 pQE60 (키아겐사 제조) 0.2g 을 제한효소 NcoI 및 BamHI 로 절단한 후, 아가로스겔 전기 영동에 의해 DNA 단편을 분 리하여, 상기와 동일한 방법에 의해 3.4kb 의 DNA 단편을 회수하였다.
상기에서 얻어진 ywfE 를 포함하는 1.4kb 의 DNA 단편과 3.4kb 의 DNA 단편을 라이게이션 키트를 사용하여 16℃ 에서 16시간 반응시켜 연결하였다.
그 연결 반응액을 사용하여 이셰리키아 콜라이 NM522주를 칼슘 이온을 사용하는 방법에 의해 형질 전환하고, 그 형질 전환체를 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 포함하는 LB 한천 배지에 도포한 후 30℃ 에서 하룻밤 배양하였다.
생육시킨 형질 전환체의 콜로니로부터 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, 제한효소를 사용하여 그 구조를 해석함으로써, C 말단 His 태그 부가형 ywfE 발현 벡터인 pQE60ywfE 가 취득된 것을 확인하였다 (도 2).
pQE60ywfE 를 보유하는 이셰리키아 콜라이 NM522 (이셰리키아 콜라이 NM522/pQE60ywfE 주) 를 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 포함하는 8㎖ 의 LB 배지가 들어 간 굵은 시험관에 접종하여 28℃ 에서 17시간 배양하였다. 그 배양액을 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 포함하는 50㎖ 의 LB 배지가 들어 있는 250㎖ 들이 삼각 플라스크에 접종하여 30℃ 에서 3시간 배양한 후, 최종 농도가 1mmol/ℓ가 되도록 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 를 첨가하고, 다시 30℃ 에서 4시간 배양하였다. 그 배양액을 원심 분리하여 습윤세포를 취득하고, 그 습윤세포로부터 HisTrap (His 태그 부가 단백질 정제 키트, Amersham Pharmasia Biotech 사 제조) 를 사용해 설명서에 따라서 His 태그 부가 재조합 효소를 정제하였다.
실시예 5
His 태그 부가 재조합 효소를 사용한 디펩티드의 생산 (1)
(ⅰ) 실시예 4 에서 취득한 정제한 His 태그 부가 재조합 효소 0.04㎎, 100mmol/ℓ의 Tris-HCl (pH 8.0), 60mmol/ℓ의 염화마그네슘, 60mmol/ℓ의 ATP, 30mmol/ℓ의 L-Ala, 30mmol/ℓ의 L-Gln 로 이루어지는 1㎖ 의 반응액을 제조하여 37℃ 에서 16시간 반응시켰다.
반응 종료 후, 상기 실시예 3 과 동일한 방법에 의해 반응 생성물을 분석하고, 반응액 중에 3.7g/ℓ의 L-Ala-L-Gln 과 0.3g/ℓ의 L-알라닐-L-알라닌 (L-Ala-L-Ala) 이 생성 축적되어 있는 것을 확인하였다.
(ⅱ) 효소를 0.01㎎, L-Gln 대신에 L-Phe, L-Met, L-Leu 또는 L-Val 을 함유하는 것 이외에는 상기 (ⅰ) 의 반응액의 조성과 동일한 반응액을 제조하여 상기 (ⅰ) 의 반응조건으로 반응시켰다.
반응 종료 후, 상기 실시예 3 과 동일한 방법에 의해 반응 생성물을 분석하고, 반응액 중에 각각 7.0g/ℓ의 L-알라닐-L-페닐알라닌 (L-Ala-L-Phe) 만, 7.0g/ℓ의 L-알라닐-L-메티오닌 (L-Ala-L-Met) 및 0.03g/ℓ의 L-Ala-L-Ala, 5.0g/ℓ의 L-알라닐-L-류신 (L-Ala-L-Leu) 및 0.2g/ℓ의 L-Ala-L-Ala, 또는 1.6g/ℓ의 L-알라닐-L-발린 (L-Ala-L-Val) 및 0.3g/ℓ의 L-Ala-L-Ala 이 생성 축적되어 있는 것을 확인하였다.
(ⅲ) 효소를 0.01㎎, L-Ala 대신에 Gly, L-Gln 대신에 L-Phe 또는 L-Met 를 함유하는 것 이외에는 상기 (1) 의 반응액의 조성과 동일한 반응액을 제조하여 상기 (1) 의 반응조건으로 반응시켰다.
반응 종료 후, 상기 실시예 3 과 동일한 방법에 의해 반응 생성물을 분석하 고, 반응액 중에 각각 5.2g/ℓ의 글리실-L-페닐알라닌 (Gly-L-Phe) 또는 1.1g/ℓ의 글리실-L-메티오닌 (Gly-L-Met) 이 생성 축적되어 있는 것을 확인하였다.
상기 반응액 조성으로부터 ATP 를 제거하면 디펩티드는 전혀 생성되지 않았다.
이상의 결과로부터, ywfE 유전자 산물은 ATP 존재 하에서 L-Ala 와 L-Gln, L-Phe, L-Met, L-Leu 또는 L-Val 로부터, L-Ala-L-Gln 및 L-Ala-L-Ala, L-Ala-L-Phe, L-Ala-L-Met 및 L-Ala-L-Ala, L-A1a-L-Leu 및 L-Ala-L-Ala 또는 L-Ala-L-Val 및 L-Ala-L-Ala 를 생성하는 활성, Gly 와 L-Phe 또는 L-Met 로부터 Gly-L-Phe 또는 Gly-L-Met 를 생성하는 활성을 갖는 것이 분명해졌다.
실시예 6
His 태그 부가 재조합 효소를 사용한 디펩티드의 생산 (2)
실시예 4 에서 얻어진 정제한 His 태그 부가 재조합 효소 0.04㎎, 100mmol/ℓ의 Tris-HCl (pH 8.0), 60mmol/ℓ의 염화마그네슘, 60mmol/ℓ의 ATP 로 이루어지는 0.1㎖ 의 반응액을 제조하여, 표 1 의 제 1 행째와 가장 왼쪽 열 아미노산의 조합으로 이루어지는 각종 L-아미노산, Gly 또는 β-Ala 를 각각 30mmol/ℓ 씩이 되도록 반응액에 첨가하여 37℃ 에서 16시간 반응시켰다. 반응 종료 후 반응 생성물을 HPLC 분석하였더니, 표 1 에 나타내는 디펩티드가 생성되어 있는 것이 확인되었다.
Figure 112005033146219-pct00001
Figure 112005033146219-pct00002
Figure 112005033146219-pct00003
표 1 의 제 1 행째와 가장 왼쪽 열에 기재된 2 종류 (또는 1 종류) 의 L-아미노산, Gly 또는 β-Ala 를 기질로 하여 반응시킨 경우에 생성된 디펩티드를 범위 내에 기재하였다. ○ 는 서열은 미확정이지만 디펩티드가 생성된 것, × 는 디펩티드의 생성이 확인되지 않은 것, 그리고 빈칸은 미실시를 나타낸다.
실시예 7
His 태그 부가 재조합 효소 발현주를 사용한 디펩티드의 생산
실시예 4 에서 얻어진 이셰리키아 콜라이 NM522/pQE60ywfE 주를 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 포함하는 8㎖ 의 LB 배지가 들어 있는 굵은 시험관에 접종하여 28℃ 에서 17시간 배양하였다. 그 배양액을 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 포함하는 50㎖ 의 LB 배지가 들어 있는 250㎖ 들이 삼각 플라스크에 접종하여 30℃ 에서 3시간 배양한 후, 최종 농도가 1mmol/ℓ가 되도록 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 를 첨가하고, 다시 30℃ 에서 4시간 배양하였다. 그 배양액을 원심 분리하여 습윤세포를 취득하였다.
200g/ℓ의 습윤세포, 50g/ℓ의 글루코오스, 5g/ℓ의 피틴산(phytic acid) (33% 의 진한 수산화나트륨 용액을 사용하여 중성이 되도록 희석), 15g/ℓ의 인산이수소칼륨, 5g/ℓ의 황산마그네슘·7수화물, 4g/ℓ의 나이민 S-215, 10㎖/ℓ의 자일렌, 200mmol/ℓ의 L-Ala, 200mmol/ℓ의 L-Gln 으로 이루어지는 20㎖ 의 반응액 (pH 7.2) 을 50㎖ 용량의 비커에 넣고 32℃, 900rpm 의 조건 하에서 2시간 반응시켰다. 반응 중에는 2mol/ℓ의 수산화칼륨을 사용하여 반응액의 pH 를 7.2 로 유지하였다.
반응 생성물을 실시예 3 에 기재된 방법과 동일한 방법으로 분석하였더니, 25㎎/ℓ의 L-Ala-L-Gln 의 축적이 확인되었다.
실시예 8
바실러스속에 속하는 각종 미생물로부터의 ywfE 유전자에 상당하는 유전자의 클로닝과 그 해석
서열번호 9 로 표시되는 염기 서열에 기초하여, 바실러스 서브틸리스 ATCC15245, ATCC6633, IAM1213, IAM1107, IAM1214, ATCC9466, IAM1033, ATCC21555, 바실러스 아밀롤리케파시엔스 IF03022 및 바실러스 푸밀루스 NRRL B-12025 에 존재하는 ywfE 유전자에 상당하는 유전자를 아래와 같이 하여 취득하였다.
먼저, 바실러스 서브틸리스 ATCC15245, ATCC6633, IAM1213, IAM1107, IAM1214, ATCC9466, IAM1033, ATCC21555, 바실러스 아밀롤리케파시엔스 IFO3022 및 바실러스 푸밀루스 NRRL B-12025 를 각각 LB 배지에 접종하고 30℃ 에서 하룻밤 정치 배양하였다. 배양 후 Current Protocols in Molecular Biology에 기재된 포화페놀을 사용하는 방법에 의해 그 미생물의 염색체 DNA 를 각각 단리정제하였다.
퍼셉티브 바이오 시스템사 제조 8905형 DNA 합성기를 사용하여 서열번호 25 및 26 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA (이하, 각각 프라이머 G, 프라이머 H 라 함) 를 합성하였다. 프라이머 G 는 바실러스 서브틸리스 168주의 염색체 DNA 의 ywfE 의 개시 코돈보다 상류를 포함하는 영역의 서열이다. 프라이머 H 는 ywfE 의 종결 코돈보다 하류를 포함하는 서열과 상보적인 서열이다.
바실러스 서브틸리스 ATCC15245, ATCC6633, IAM1213, IAM1107, IAM1214, ATCC9466, IAM1033, ATCC21555 또는 바실러스 아밀롤리케파시엔스 IFO3022 의 염색체 DNA 를 주형으로 하여 상기 프라이머 G 및 프라이머 H 를 프라이머 세트로 사용하여 PCR 을 하였다. PCR 은 0.1㎍ 의 염색체 DNA, 0.5μmol/ℓ의 각 프라이머, 2.5units 의 Pfu DNA 중합효소, 4㎕ 의 Pfu DNA 중합효소용×10 완충액, 200μmol/ℓ의 각 dNTP 을 포함하는 반응액 40㎕ 을 제조하고, 94℃ 에서 1분간, 55℃ 에서 2분간, 72℃ 에서 3분간의 공정을 30회 반복하여 실시하였다.
그 반응액의 1/10 을 아가로스겔 전기 영동하여 ywfE 단편에 상당하는 약 1.6kb 의 단편이 증폭되고 있는 것을 확인한 후, 나머지 반응액과 등량의 TE 포화페놀/클로로포름 용액을 첨가하여 혼합하였다. 그 용액을 원심 분리하여 얻어진 상층에 2배 용량의 냉에탄올을 첨가하고 혼합하여 -80℃ 에 30분간 방치하였다. 그 용액을 원심 분리하여 얻어진 DNA 의 침전을 20㎕ 의 TE 에 용해하였다.
상기에서 얻어진 각 균주 염색체 DNA 유래의 1.4kb 단편과 pCR-blunt (인비트로젠사 제조) 를 라이게이션 키트를 사용하여 16℃ 에서 16시간 반응시켜 연결하였다.
그 반응액을 사용하여 이셰리키아 콜라이 NM522주를 칼슘 이온을 사용하는 방법에 의해 형질 전환하고, 그 형질 전환체를 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 포함하는 LB 한천 배지에 도포한 후 30℃ 에서 하룻밤 배양하였다.
생육시킨 형질 전환체의 콜로니로부터 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, 제한효소를 사용하여 각각의 구조를 해석함으로써, ywfE 유전자에 상당하는 유전자를 포함하는 플라스미드인 pYWFE1 (ATCC15245주 유래, 서열번호 36 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA), pYWFE2 (ATCC6633주 유래, 서열번호 10 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA), pYWFE3 (IAM1213주 유래, 서열번호 11 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA), pYWFE4 (IAM1107주 유래, 서열번호 12 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA), pYWFE5 (IAM1214주 유래, 서열번호 13 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA), pYWFE6 (ATCC9466주 유래, 서열번호 9 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA), pYWFE7 (IAM1033주 유래, 서열번호 36 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA), pYWFE8 (ATCC21555주 유래, 서열번호 14 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA), pYWFE9 (IF03022주 유래, 서열번호 15 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA) 가 취득되고 있는 것을 확인하였다.
한편, 바실러스 푸밀루스 NRRL B-12025 유래의 ywfE 에 상당하는 유전자 (서열번호 16 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA) 는 아래와 같이 취득하였다.
상기에서 제조한 NRRL B-12025주의 염색체 DNA 를 주형으로 하고 서열번호 27 및 28 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 프라이머 세트로 사용하여 PCR 을 하였다. PCR 은 0.1㎍ 의 염색체 DNA, 0.5μmol/ℓ의 각 프라이머, 2.5units 의 Z-taq 중합효소 (다카라슈조사 제조), 5㎕ 의 Z-taq 중합효소용×10 완충액 (다카라슈조사 제조), 200μmol/ℓ의 각 dNTP 을 포함하는 반응액 50㎕ 를 제조하여 98℃ 에서 5초간, 55℃ 에서 30초간, 72℃ 에서 1분간의 공정을 30회 반복함으로써 실시하였다.
그 반응액의 1/10 을 아가로스겔 전기 영동하여 약 0.8kb 의 단편이 증폭되어 있는 것을 확인한 후, 나머지 반응액과 등량의 TE 포화페놀/클로로포름 용액을 첨가하여 혼합하였다. 그 혼합액을 원심 분리하여 얻어진 상층에 2배 용량의 냉에탄올을 첨가하고 혼합하여 -80℃ 에 30분간 방치하였다. 그 용액을 원심 분리하여 얻어진 DNA 의 침전을 20㎕ 의 TE 에 용해하였다.
상기에서 얻어진 각 균주염색체 DNA 유래의 0.8kb 단편과 pGEM T-easy (프로메가사 제조) 를 라이게이션 키트를 사용하여 16℃ 에서 16시간 반응시켜 연결하였다.
그 반응액을 사용하여 이셰리키아 콜라이 DH5α주를 칼슘 이온을 사용하는 방법에 의해 형질 전환하고, 그 형질 전환체를 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 포함하는 LB 한천 배지에 도포한 후 30℃ 에서 하룻밤 배양하였다.
상기에서 얻어진 형질 전환체로부터 플라스미드를 추출하여 약 0.8kb 의 삽입 DNA 단편의 염기 서열을 결정하였더니, 서열번호 16 으로 표시되는 염기 서열 중 염기번호 358∼1160 번으로 이루어지는 염기 서열이 확인되었다.
다음으로 그 플라스미드를 EcoRI 로 절단한 후, 아가로스겔 전기 영동에 의해 DNA 단편을 분리하였다. 그 DNA 단편을 진클린 Ⅱ 키트를 사용하여 정제하였다. 약 0.5㎍ 의 그 정제 DNA 단편을 DIG-하이프라임 DNA 라벨링 & 디텍션 스타터 키트 Ⅰ (로슈 다이아그노스틱스사 제조) 을 사용하여 DIG 라벨화하였다. DIG 라벨화는 그 키트에 첨부된 설명서에 따라서 실시하였다.
상기에서 얻어진 DIG 라벨화 DNA 를 사용하여 NRRL B-12025주의 염색체 DNA 를 서던 분석하였다.
NRRL B-12025주의 염색체 DNA 를 BamHI, EcoRI, HindⅢ, KpnI, PstI, SacI, SalI 및 SphI 를 사용하여 각각 완전 소화하여 아가로스 전기 영동에 의해 DNA 단편을 분리한 후, 통상적인 방법에 따라 나일론 막 양전하 (로슈 다이아그노스틱스사 제조) 로 전이시켰다.
UV 를 조사함으로써 그 나일론막에 DNA 단편을 고정한 후, 상기 프로브 DNA 및 그 나일론막을 사용하여 서던 하이브리드화하였다. 하이브리드화는, 그 프로브 DNA 와 그 나일론막을 65℃ 에서 16시간 접촉시키고, 그 후 그 나일론막을 0.1% SDS 및 2×SSC 로 이루어지는 용액을 사용하여 실온에서 5분간 2회 세정하고, 다시 0.1% SDS 및 0.5×SSC 로 이루어지는 용액을 사용하여 65℃ 에서 15분간 2회 세정함으로써 실시하고, 그 밖의 조작, 조건 및 하이브리드화한 DNA 의 검출은, 상기한 DIG-하이프라임 DNA 라벨링 & 디텍션 스타터 키트 Ⅰ 에 첨부된 설명서에 준하여 실시하였다.
그 결과, HindⅢ 및 PstI 의 완전 소화 단편의 3.5kbp 부근에 발색이 보였다.
다음으로, NRRL B-12025주의 염색체 DNA 를 HindⅢ 및 PstI 를 사용하여 각각 완전 소화하여 아가로스겔 전기 영동에 의해 DNA 단편을 분리하였다. 각각의 제한 효소 소화 DNA 에서 3-4kbp 의 단편을 진클린 Ⅱ 키트를 사용해 정제하고, 라이게이션 키트를 사용하여 자기 환화(autocyclization)하였다.
상기에서 결정한 0.8kb 의 DNA 단편의 염기 서열에 기초하여 서열번호 29 및 30 으로 표시되는 염기 서열을 설계, 합성하여, 상기에서 취득한 환화 DNA 를 주형으로 하여 PCR 을 하였다. PCR 은 10ng 의 환화 DNA, 0.5μmol/ℓ의 각 프라이머, 2.5units 의 pyrobest 중합효소 (다카라슈조사 제조), 5㎕ 의 pyrobest 중합효소용×10 완충액 (다카라슈조사 제조), 200μmol/ℓ의 각 dNTP 를 포함하는 반응액 50㎕ 를 제조하고, 98℃ 에서 5초간, 55℃ 에서 30초간, 72℃ 에서 3분 30초간의 공정을 30회 반복함으로써 실시하였다.
그 반응액의 1/10 을 아가로스겔 전기 영동하여 약 3.0kb 의 단편이 증폭되고 있는 것을 확인한 후, 나머지 반응액과 등량의 TE 포화페놀/클로로포름 용액을 첨가하여 혼합하였다. 그 혼합액을 원심 분리하여 얻어진 상층에 2배 용량의 냉에탄올을 첨가하고 혼합하여 -80℃ 에 30분간 방치하였다. 그 용액을 원심 분리하여 얻어진 DNA 의 침전을 20㎕ 의 TE 에 용해하였다.
상기에서 얻어진 DNA 단편과 Zero Blunt PCR Cloning Kit (인비트로젠사 제조) 를 라이게이션 키트를 사용하여 연결하였다.
그 반응액을 사용하여 이셰리키아 콜라이 NM522주를 칼슘 이온을 사용하는 방법에 의해 형질 전환하고, 그 형질 전환체를 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 포함하는 LB 한천 배지에 도포한 후 30℃ 에서 하룻밤 배양하였다.
생육시킨 형질 전환체의 콜로니로부터 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, 제한효소를 사용하여 그 구조를 해석함으로써, ywfE 유전자에 상당하는 유전자를 포함하는 플라스미드인 pYWFE10 (NRRL B-12025주 유래, 서열번호 16 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA) 가 얻어지고 있는 것을 확인하였다.
상기에서 얻어진 pYWFE1∼pYWFE10 에 포함되는 ywfE 에 상당하는 각 유전자의 염기 서열을 염기 서열 분석장치 373A·DNA 시퀀서를 사용하여 결정하였다.
pYWFE1, pYWFE6 및 pYWFE7 에 포함되는 유전자에 코드되는 단백질의 아미노산 서열은 ywfE 유전자에 코드되는 단백질의 아미노산 서열과 동일하지만, pYWFE2, pYWFE3, pYWFE4, pYWFE5, pYWFE8, pYWFE9 및 pYWFE10 에 포함되는 유전자에 의해 코드되는 단백질의 아미노산 서열은 ywfE 유전자에 코드되는 단백질의 아미노산 서열과 달랐다.
pYWFE2, pYWFE3, pYWFE4, pYWFE5, pYWFE8, pYWFE9, pYWFE10 및 pYWFE1 과, pYWFE7 에 포함되는 ywfE 에 상당하는 유전자에 의해 코드되는 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 2∼8 및 1 에, 그 유전자의 염기 서열을 서열번호 10∼16 및 36 에 각각 나타내었다.
실시예 9
C 말단 His 태그 부가 재조합 디펩티드 합성효소의 정제
바실러스 서브틸리스 ATCC15245, ATCC6633, IAM1213, IAM1107, IAM1214, ATCC9466, IAM1033, ATCC21555 또는 바실러스 아밀롤리케파시엔스 IFO3022 의 염색체 DNA 를 주형으로 하고, 실시예 2 에 기재된 프라이머 A 및 프라이머 B 를 프라이머 세트로 사용하여 PCR 을 하였다. PCR 은 0.1㎍ 의 염색체 DNA, 0.5μmol/ℓ의 각 프라이머, 2.5units 의 Pfu DNA 중합효소, 4㎕의 Pfu DNA 중합효소용×10 완충액, 200μmol/ℓ의 각 dNTP 를 포함하는 반응액 40㎕ 를 제조하여 94℃ 에서 1분간, 55℃ 에서 2분간, 72℃ 에서 3분간의 공정을 30회 반복함으로써 실시하였다.
바실러스 푸밀루스 NRRL B-12025 의 염색체 DNA 를 주형으로 한 경우에는, 서열번호 31 및 32 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 를 프라이머 세트로 사용하여 상기와 동일한 조건으로 PCR 을 하였다.
그 반응액의 1/10 을 아가로스겔 전기 영동하여 ywfE 단편에 상당하는 약 1.4kb 의 DNA 단편이 증폭되고 있는 것을 확인한 후, 나머지 반응액과 등량의 TE 포화페놀/클로로포름 용액을 첨가하여 혼합하였다. 그 혼합액을 원심 분리하여 얻어진 상층에 2배 용량의 냉에탄올을 첨가하고 혼합하여 -80℃ 에 30분간 방치하였다. 그 용액을 원심 분리하여 얻어진 DNA 의 침전을 20㎕ 의 TE 에 용해하였다.
그 용해액의 각각 5㎕ 을 사용하여, 증폭한 DNA 를 제한효소 NcoI 및 BamHI 로 절단하여 아가로스겔 전기 영동에 의해 DNA 단편을 분리한 후, 진클린 Ⅱ 키트를 사용하여 ywfE 에 상당하는 유전자를 포함하는 1.4kb 의 DNA 단편을 회수하였다.
다음으로 C 말단 His 태그 부가형 재조합 발현 벡터 pQE60 0.2㎍ 을 제한효소 NcoI 및 BamHI 로 절단한 후 아가로스겔 전기 영동에 의해 DNA 단편을 분리하고, 상기와 동일한 방법에 의해 3.4kb 의 DNA 단편을 회수하였다.
상기에서 얻어진 바실러스 서브틸리스 168주의 ywfE 에 상당하는 유전자를 포함하는 1.4kb 의 DNA 단편 및 3.4kb 의 DNA 단편을 라이게이션 키트를 사용하여 16℃ 에서 16시간 반응시켜 각각 연결하였다.
그 반응액을 사용하여 대장균 NM522주를 칼슘 이온을 사용하는 방법에 의해 형질 전환하고, 그 형질 전환체를 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 포함하는 LB 한천 배지에 도포한 후 30℃ 에서 하룻밤 배양하였다.
생육시킨 형질 전환체의 콜로니로부터 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, 제한효소를 사용하여 그들의 구조를 해석함으로써, C 말단 His 태그 부가형 유전자 발현 벡터인 pQE60ywfE1 (ATCC15245 유래의 유전자를 함유하는 벡터), pQE60ywfE2 (ATCC6633 유래의 유전자를 함유하는 벡터), pQE60ywfE3 (IAM1213 유래의 유전자를 함유하는 벡터), pQE60ywfE4 (IAM1107 유래의 유전자를 함유하는 벡터), pQE60ywfE5 (IAM1214 유래의 유전자를 함유하는 벡터), pQE60ywfE6 (ATCC9466 유래의 유전자를 함유하는 벡터), pQE60ywfE7 (IAM1033 유래의 유전자를 함유하는 벡터), pQE60ywfE8 (ATCC21555 유래의 유전자를 함유하는 벡터), pQE60ywfE9 (IFO3022 유래의 유전자를 함유하는 벡터) 및 pQE60ywfE10 (NRRL B-12025 유래의 유전자를 함유하는 벡터) 가 취득되어 있는 것을 확인하였다.
상기에서 얻어진 이셰리키아 콜라이 NM522/pQE60ywfE1∼NM522/pQE60ywfE10주를, 각각 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 포함하는 8㎖ 의 LB 배지가 들어 있는 굵은 시험관에 접종하여 28℃ 에서 17시간 배양하였다. 그 배양액을 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 포함하는 50㎖ 의 LB 배지가 들어 있는 250㎖ 들이 삼각 플라스크에 접종하여 30℃ 에서 3시간 배양한 후, 최종 농도가 1mmol/ℓ가 되도록 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드를 첨가하고, 다시 30℃ 에서 4시간 배양하였다. 그 배양액을 원심 분리하여 얻어진 습윤세포로부터, HisTrap 를 그 사용 설명서에 따라 사용하여 His 태그 부가 재조합 효소를 정제하였다.
실시예 10
정제효소를 사용한 디펩티드의 생산
실시예 9 에서 얻어진 재조합 효소 0.04㎎, 100mmol/ℓ의 Tris-HCl (pH 8.0), 60mmol/ℓ의 염화마그네슘, 60mmol/ℓ의 ATP, 30mmol/ℓ의 L-Ala 및 30mmol/ℓ의 L-Gln 으로 이루어지는 0.1㎖ 의 반응액을 제조하여 37℃ 에서 16시간반응시켰다.
반응 종료 후, 실시예 3 에 기재된 방법에 의해 반응액을 분석한 결과, 각각 3.0∼3.5g/ℓ의 L-Ala-L-Gln 및 0.25∼0.3g/ℓ의 L-Ala-L-Ala 가 생성 축적되어 있는 것이 확인되었다.
또한 상기 반응액 조성으로부터 ATP 를 제거하면 L-Ala-L-Gln 및 L-Ala-L-Ala 는 전혀 생성되지 않았다.
이상의 결과로부터, 실시예 8 에서 얻어진 유전자의 산물은 모두 ATP 존재 하에서 L-Ala 와 L-Gln 로부터 L-Ala-L-Gln 및 L-Ala-L-Ala 를 생성하는 활성을 갖는 것이 분명해졌다.
본 발명에 의해, 효소적 합성법이 알려져 있지 않았던 L-Ala-L-Ala 이외의 디펩티드를 합성하는 활성을 갖는 단백질을 제조할 수 있어, 그 단백질 또는 그 단백질을 생산하는 능력을 갖는 형질 전환체 또는 미생물을 사용하여 L-Ala-L-Ala 이외의 디펩티드를 제조할 수 있다.
「서열표 프리텍스트」
서열번호 19-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 20-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 21-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 22-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 23-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 24-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 25-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 26-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 27-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 28-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 29-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 30-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 31-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 32-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 33-인공서열의 설명: 데이터 베이스 서치에 사용한 아미노산 서열
서열번호 34-인공서열의 설명: 데이터 베이스 서치에 사용한 아미노산 서열
서열번호 35-인공서열의 설명: 데이터 베이스 서치에 사용한 아미노산 서열
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. <120> Process for producing dipeptides <130> 11524WO1 <150> JP 2002-376054 <151> 2002-12-26 <150> JP 2003-420887 <151> 2003-12-18 <160> 36 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 472 <212> PRT <213> Bacillus subtilis 168 <400> 1 Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro 1 5 10 15 Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser 20 25 30 Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile 35 40 45 Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser 50 55 60 Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp 65 70 75 80 His Asn Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala 85 90 95 Glu Met Phe Gly Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile 100 105 110 Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly 115 120 125 Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala 130 135 140 Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr 145 150 155 160 Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile 165 170 175 Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr 180 185 190 Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu 195 200 205 Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile 210 215 220 Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu 225 230 235 240 Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu 245 250 255 Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr 260 265 270 Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys 275 280 285 Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln 290 295 300 Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro 305 310 315 320 Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro 325 330 335 Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp 340 345 350 Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp 355 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cggtcataaa agataaagac 180 tattttaaga gtttagctga ttttgaacac cctgattcca tttattgggc gcatgaagat 240 cataacaagc ctgaggaaga ggtcgtcgag caaatcgtca aggttgccga aatgtttggg 300 gcggatgcca tcacaacaaa caatgaatta ttcattgctc cgatggcgaa agcctgtgaa 360 cgtctgggct tgagaggtgc cggcgtgcag gcagccgaaa atgccagaga taaaaataaa 420 atgagggacg cttttaataa ggccggagtc aaatcgatca aaaacaaacg agtcacaact 480 cttgaagatt tccgtgctgc tcttgaagag atcggcacac ctcttatctt aaagcctaca 540 tacttagcga gttctatcgg tgtaacgctg attacggaca ctgagacggc agaagatgaa 600 tttaacagag tcaatgacta tctgaaatca attaacgtgc caaaggcggt tacgtttgaa 660 gcgccgttta tcgctgaaga atttttacag ggtgagtacg gagactggta tcaaacagaa 720 gggtactccg actatatcag tatagaaggc atcatggctg acggtgagta tttcccgatc 780 gccattcatg ataaaacgcc gcaaatcggg tttacagaga catcccacat tacgccgtcc 840 attctggatg aagaggcaaa aaagaaaatt gtcgaagctg ccaaaaaggc aaatgaaggg 900 cttggactgc aaaattgcgc aacacataca gagatcaagc taatgaaaaa cagagaaccg 960 ggtttaatag agtcggcagc cagatttgcc ggctggaata tgatccccaa 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Bacillus subtilis IAM1107 <400> 12 atggagagaa aaacagtatt ggtcatcgct gatcttggag gctgcccgcc gcacatgttt 60 tataaaagcg ctgctgaaaa atataacctg gtcagcttta ttccaagacc ttttgcaatt 120 acagcctccc atgcagcatt gattgaaaaa tactcggtcg cggtcgtaaa agataaagac 180 tattttaaga gtttagctga ttttgagcat cctgactcca tttattgggc gcatgaggat 240 cataacaagc ctgaggaaga ggtcgtcgag caaatcgtca aggttgccga aatgttcggg 300 gcggatgcca tcacaacaaa caatgaatta ttcattgctc cgatggcgaa agcctgtgaa 360 cgtctgggct tgagaggtgc cggcgtgcag gcagccgaaa atgccagaga taaaaataaa 420 atgagggacg cttttaataa ggccggagtc aaatcgatca aaaacaaacg agtcacaact 480 cttgaagatt tccgtgctgc tcttgaagag atcggcacac ctcttatctt aaagcctaca 540 tacttagcga gttctatcgg tgtaacgctg attacggaca ctgagacggc agaagatgaa 600 tttaacagag tcaatgacta tctgaaatca attaacgtgc caaaggcggt tacgtttgaa 660 gcgccgttta tcgctgaaga atttttacag ggtgagtacg gagactggta tcaaacagaa 720 gggtactccg actatatcag tatagaaggc atcatggctg acggtgagta tttcccgatc 780 gccattcatg ataaaacgcc gcaaatcggg tttacagaga catcccacat tacgccgtcc 840 attctggatg aagaggcaaa aaagaaaatt gtcgaagctg ccaaaaaggc aaatgaaggg 900 cttggcctgc aaaattgcgc aacacataca gaggtcaagc taatgaaaaa cagagaaccg 960 ggtttaattg aatcggcagc cagatttgcc ggctggaata tgatccctaa cattaaaaag 1020 gttttcggcc ttgatatggc gcaattatta ttagatgtcc tctgtttcgg aaaagatgcc 1080 gatctgccgg acggattatt ggatcaagag ccttactatg tcgccgactg ccatttgtac 1140 ccgcagcatt tcaaacaaaa tggccagatt ccagaaaccg ctgaggattt ggtcattgaa 1200 gcgatcgata ttccggacgg gcttttaaaa ggggatactg aaatcttttc tttttcggcc 1260 gcagcaccag gcacttcagt tgatttgaca ttgtttgaag ctttcaattc cattgctgca 1320 tttgaactga aaggcagtaa ttcacaggat gtggctgaat caatcagaca aattcagcag 1380 catgcgaagc tgacggcaaa gtatgtgctg ccagta 1416 <210> 13 <211> 1416 <212> DNA <213> Bacillus subtilis IAM1214 <400> 13 atggagagaa aaacagtatt ggtcatcgct gatcttggag gctgcccgcc gcacatgttt 60 tataaaagcg ctgctgaaaa atataacctg gttagcttta ttccgagacc ttttgcaata 120 acagcctccc atgcagcact gattgaaaaa tactcggtcg cggtcataaa agataaagac 180 tattttcaga gcttagctga 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ttagatgttc tctgtttcgg aaaagatgct 1080 gatctgccgg acgggttatt ggatcaagag ccttactatg ttgctgactg ccatctgtac 1140 cctcagcatt tcaaacaaaa tggccagatc cctgaaactg ccgaggattt ggtaatcgaa 1200 gcgatcgata ttccggatgg gcttttgaag ggtgatacag aaatcgttac tttttcggct 1260 gcggcaccag gaacatcagt tgatttgaca ctgtttgaag ccttcaactc cattgctgca 1320 tttgaactga aaggcagcaa ttcacaggat gtggctgaat caatcagaca aattcagcag 1380 catgcgaagc tgacggcaaa gtatgtgctg ccagta 1416 <210> 14 <211> 1416 <212> DNA <213> Bacillus subtilis ATCC21555 <400> 14 atggagagaa aaacagtatt ggttatcgct gatcttgggg gctgcccgcc gcatatgttt 60 tacaaaagcg cagccgaaaa atacaacctc gtcagcttta ttccgagacc ctttgcaatt 120 acagcctctc atgcggcctt aattgaaaaa tactcgattg cggtcattaa agataaagac 180 tattttaaga gtctggctga ttttgaacat cccgattcga tttattgggc tcatgaagat 240 catgacaaac ctgaggaaga agtcgtcgaa gaaatcgtga aagtggccga catgtttggg 300 gttgacgcca ttacgaccaa caatgaactg tttatcgctc cgatggcaaa agcgtgtaaa 360 cgtctcggcc tgcggggagc gggcgtacag gccgctgaaa acgccagaga taaaaataaa 420 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 28 cggcagatcr gcdtcttttc c 21 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 29 gctaggtctt gaacattgtg caaccc 26 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 30 ggtgttccga tagactcaat ggc 23 <210> 31 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 31 catgccatgg agaaaaaaac tgtacttgtc attgctgact tagg 44 <210> 32 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 32 cgcggatccc ttcactaatt catccattaa ctgaatcg 38 <210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence used for data base search <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (9) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (10) <223> Xaa represents any amino acid selected from Leu, Ile, Val, Met and Ala <220> <221> UNSURE <222> (11) <223> Xaa represents Glu, Ser or Ala <220> <221> UNSURE <222> (12) <223> Xaa represents Gly, Ser or Ala <400> 33 His Gly Xaa Xaa Gly Gln Asp Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 34 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence used for data base search <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> Xaa represents Leu Ile or Val <220> <221> UNSURE <222> (2) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (5) <223> Xaa represents Gly or Ala <220> <221> UNSURE <222> (6) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> Xaa represents any amino acid selected from Gly, Ser, Ala, Ile and Val <220> <221> UNSURE <222> (9) <223> Xaa represents any amino acid selected from Leu, Ile, Val, Met, Cys and Ala <220> <221> UNSURE <222> (11) <223> Xaa represents any amino acid selected from Leu, Ile, Val, Met, Phe and Ala <220> <221> UNSURE <222> (12) <223> Xaa represents any amino acid selected from Leu, Ile, Val, Met, Phe and Ala <220> <221> UNSURE <222> (13) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (14) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (15) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (16) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (17) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (18) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (19) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (20) <223> Xaa represents Leu, Ile or Val <220> <221> UNSURE <222> (21) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (23) <223> Xaa represents any amino acid selected from Leu, Ile, Val, Ala and Pro <220> <221> UNSURE <222> (25) <223> Xaa represents Ser, Thr or Pro <220> <221> UNSURE <222> (26) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (28) <223> Xaa represents Gly or Ala <400> 34 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Asn Xaa Xaa Pro Xaa 20 25 <210> 35 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence used for data base search <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> Xaa represents Leu Ile or Val <220> <221> UNSURE <222> (2) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (5) <223> Xaa represents Gly or Ala <220> <221> UNSURE <222> (6) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> Xaa represents any amino acid selected from Gly, Ser, Ala, Ile and Val <220> <221> UNSURE <222> (9) <223> Xaa represents any amino acid selected from Leu, Ile, Val, Met, Cys and Ala <220> <221> UNSURE <222> (11) <223> Xaa represents any amino acid selected from Leu, Ile, Val, Met, Phe and Ala <220> <221> UNSURE <222> (12) <223> Xaa represents any amino acid selected from Leu, Ile, Val, Met, Phe and Ala <220> <221> UNSURE <222> (13) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (14) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (15) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (16) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (17) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (18) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (19) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (20) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (21) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (22) <223> Xaa represents Leu, Ile or Val <220> <221> UNSURE <222> (23) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (25) <223> Xaa represents any amino acid selected from Leu, Ile, Val, Ala and Pro <220> <221> UNSURE <222> (27) <223> Xaa represents Ser, Thr or Pro <220> <221> UNSURE <222> (28) <223> Xaa represents any amino acid selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val <220> <221> UNSURE <222> (30) <223> Xaa represents Gly or Ala <400> 35 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Asn Xaa Xaa Pro Xaa 20 25 30 <210> 36 <211> 1416 <212> DNA <213> Bacillus subtilis ATCC 15245 and Bacillus subtilis IAM 1033 <400> 36 atggagagaa aaacagtatt ggtcatcgct gatcttggag gctgcccgcc gcacatgttt 60 tataaaagcg ctgctgaaaa atataacctg gtcagcttta ttccaagacc ttttgcaatt 120 acagcctccc atgcagcatt gattgaaaaa tactcggtcg cggtcataaa agataaagac 180 tattttaaga gtttagctga ttttgagcat cctgattcca tttattgggc gcatgaggat 240 cataacaagc ctgaggaaga ggtcgtcgag caaatcgtca aggttgccga aatgtttggg 300 gcggatgcca tcacaacaaa caatgaatta ttcattgctc cgatggcgaa agcctgtgaa 360 cgtctgggcc tgagaggtgc cggcgtgcag gcagccgaaa atgccagaga taaaaataaa 420 atgagggacg cttttaataa ggccggagtc aaatcgatca aaaacaaacg agtcacaact 480 cttgaagatt tccgtgctgc tcttgaagag atcggcacac ctcttatctt aaagcctaca 540 tacttagcga gttcaatcgg tgtaacgctg attacggaca ctgagacggc agaagatgaa 600 tttaacagag tcaatgacta tctgaaatca attaacgtgc caaaggcggt tacgtttgaa 660 gcgccgttta tcgctgaaga atttttacag ggtgagtacg gagactggta tcaaacagaa 720 gggtactccg actatatcag tatagaaggc atcatggctg acggtgagta tttcccgatc 780 gccattcatg ataaaacgcc gcaaatcggg tttacagaga catcccacat tacgccgtcc 840 attctggatg aagaggcaaa aaagaaaatt gtcgaagctg ccaaaaaggc aaatgaaggg 900 cttggcctgc aaaattgcgc aacacataca gagatcaagc taatgaaaaa cagagaaccg 960 ggtttaatag agtcggcagc cagattcgca ggctggaata tgattcctaa tattaaaaag 1020 gtctttggcc ttgatatggc gcaattatta ttagatgtcc tctgtttcgg aaaagacgcc 1080 gatctgccgg acggattatt ggatcaagag ccttattatg ttgccgactg ccatttgtac 1140 ccgcagcatt tcaaacaaaa tggccagatt ccagaaaccg ctgaggattt ggtcattgaa 1200 gcgatcgata ttccggacgg gcttttaaaa ggggatactg aaatcgtttc attttcagcc 1260 gcagcaccag gcacttcagt tgatttgaca ttgtttgaag ctttcaattc cattgctgca 1320 tttgaactga aaggcagtaa ttcacaggat gtggctgaat caatcagaca aattcagcag 1380 catgcaaagc tgacggcaaa gtatgtgctg ccagta 1416

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  13. 이하의 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 단백질, 1종 이상의 아미노산 및 ATP 를 수성 매질 중에 존재시키고, 상기 매질 중에 식 (Ⅰ)
    R1-R2 (Ⅰ)
    (식 중, R1 및 R2 는 동일하거나 상이하고, 각각 아미노산을 나타내지만, 동시에 L-알라닌을 나타내지는 않는다) 로 표시되는 디펩티드를 생성 및 축적시켜, 상기 매질에서 상기 디펩티드를 채취하는 디펩티드의 제조법:
    [1] 서열번호 1∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    [2] 서열번호 1∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질;
    [3] 서열번호 1∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질; 및
    [4] 서열번호 17 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질.
  14. 이하의 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 배양물 또는 상기 배양물의 처리물을 효소원으로 사용하고, 상기 효소원, 1종 이상의 아미노산을 수성 매질 중에 존재시키고, 상기 매질 중에서, 식 (Ⅰ)
    R1-R2 (Ⅰ)
    (식 중, R1 및 R2 는 동일하거나 상이하고, 각각 아미노산을 나타내지만, 동시에 L-알라닌을 나타내지는 않는다) 로 표시되는 디펩티드를 생성 및 축적시켜, 상기 매질에서 상기 디펩티드를 채취하는 디펩티드의 제조법:
    [1] 서열번호 1∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양물 또는 상기 배양물의 처리물;
    [2] 서열번호 1∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질을 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양물 또는 상기 배양물의 처리물;
    [3] 서열번호 1∼8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질을 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양물 또는 상기 배양물의 처리물; 및
    [4] 서열번호 17 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드의 합성 활성을 갖는 단백질을 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양물 또는 상기 배양물의 처리물.
  15. 제 14 항에 있어서, 미생물이, 바실러스속에 속하는 미생물인 제조법.
  16. 제 15 항에 있어서, 바실러스속에 속하는 미생물이, 바실리신을 생산하는 능력을 갖는 바실러스속에 속하는 미생물인 제조법.
  17. 제 16 항에 있어서, 바실리신을 생산하는 능력을 갖는 바실러스속에 속하는 미생물이, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀롤리케파시엔스, 바실러스 코아귤란스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 메가테리움 및 바실러스 푸밀루스로 이루어지는 군에서 선택되는 종에 속하는 미생물인 제조법.
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  23. 이하의 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 DNA 를 함유하는 재조합 DNA 를 갖는 형질 전환체의 배양물 또는 상기 배양물의 처리물을 효소원으로 사용하고, 상기 효소원, 1종 이상의 아미노산을 수성 매질 중에 존재시키고, 상기 매질 중에서, 식 (Ⅰ)
    R1-R2 (Ⅰ)
    (식 중, R1 및 R2 는 동일하거나 상이하고, 각각 아미노산을 나타내지만, 동시에 L-알라닌을 나타내지는 않는다) 로 표시되는 디펩티드를 생성 및 축적시켜, 상기 매질에서 상기 디펩티드를 채취하는 디펩티드의 제조법:
    [1] 제 13 항에 기재된 단백질을 암호화하는 DNA;
    [2] 서열번호 9∼16 및 36 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA;
    [3] 서열번호 9∼16 및 36 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 갖는 DNA 와 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하고, 상기 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드 합성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA; 및
    [4] 서열번호 18 로 표시되는 염기 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하고, 식 (Ⅰ) 로 표시되는 디펩티드 합성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  24. 제 23 항에 있어서, 형질 전환체가 미생물을 숙주로 하여 얻어지는 형질 전환체인 제조법.
  25. 제 24 항에 있어서, 미생물이 이셰리키아(Escherichia)속에 속하는 미생물인 제조법.
  26. 제 14 항 내지 제 17 항 및 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물의 처리물이, 배양물의 농축물, 배양물의 건조물, 배양물을 원심 분리하여 얻어지는 균체, 상기 균체의 건조물, 동결 건조물, 계면활성제 처리물, 초음파 처리물, 기계적 마찰 처리물, 용매 처리물, 효소 처리물, 단백질 분획물, 고정화물 또는 그 균체에서 추출하여 얻어지는 효소표본인 것을 특징으로 하는 제조법.
  27. 제 13 항 내지 제 17 항 및 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 디펩티드가 식 (Ⅱ)
    R3-R4 (Ⅱ)
    (식 중, R3 및 R4 는 동일하거나 상이하고, 각각 L-알라닌, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-발린, L-류신, L-이소류신, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-메티오닌, L-세린, L-트레오닌, L-시스테인, L-아스파라긴, L-티로신, L-리신, L-알기닌, L-히스티딘, L-아스파르트산, L-α-아미노부티르산, β-알라닌, L-아자세린, L-테아닌, L-4-히드록시프롤린, L-3-히드록시프롤린, L-오르니틴, L-시트룰린 및 L-6-디아조-5-옥소노르류신에서 선택되는 아미노산을 나타내지만, R3 및 R4 는 동시에 L-알라닌을 나타내지는 않는다) 로 표시되는 디펩티드인 제조법.
  28. 제 26 항에 있어서, 디펩티드가 식 (Ⅱ)
    R3-R4 (Ⅱ)
    (식 중, R3 및 R4 는 동일하거나 상이하고, 각각 L-알라닌, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-발린, L-류신, L-이소류신, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-메티오닌, L-세린, L-트레오닌, L-시스테인, L-아스파라긴, L-티로신, L-리신, L-알기닌, L-히스티딘, L-아스파르트산, L-α-아미노부티르산, β-알라닌, L-아자세린, L-테아닌, L-4-히드록시프롤린, L-3-히드록시프롤린, L-오르니틴, L-시트룰린 및 L-6-디아조-5-옥소노르류신에서 선택되는 아미노산을 나타내지만, R3 및 R4 는 동시에 L-알라닌을 나타내지는 않는다) 로 표시되는 디펩티드인 제조법.
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