DE60320362T2

DE60320362T2 - Verfahren zur Herstellung von Dipeptiden

Info

Publication number: DE60320362T2
Application number: DE60320362T
Authority: DE
Inventors: Shin-Ichi Hashimoto; Kazuhiko Tabata; Aya Kubota; Hajime Ikeda
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 2002-12-26
Filing date: 2003-12-29
Publication date: 2009-07-23
Anticipated expiration: 2023-12-30
Also published as: CN1720325A; CA2511553C; HK1086296A1; JP4447467B2; EP1433791B1; WO2004058960A1; ATE392430T1; US20040171106A1; EP1433791A2; EP1983059A2; EP1908773B1; JPWO2004058960A1; CA2511553A1; EP1908773A3; US8039236B2; EP1983059A3; ES2306835T3; KR20050084466A; CN100400660C; EP1908773A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung eines anderen Dipeptids als L-Ala-L-Ala, wobei ein Protein verwendet wird, das eine Dipeptid-synthetisierende Aktivität besitzt, und ein Verfahren für die Herstellung eines anderen Dipeptids als L-Ala-L-Ala, wobei ein Mikroorganismus oder eine Transformante verwendet wird, der/die ein Protein herstellt, das eine Dipeptid-synthetisierende Aktivität besitzt.
Die Verfahren der chemischen Synthese (Flüssigphasenverfahren und Festphasenverfahren), die Verfahren der enzymatischen Synthese und die Verfahren der biologischen Synthese, die rekombinante DNA-Techniken verwenden, stehen für eine Peptidsynthese in einem großen Umfang zur Verfügung. Zur Zeit werden die Verfahren der enzymatischen Synthese und die Verfahren der biologischen Synthese für die Synthese von langkettigen Peptiden mit mehr als 50 Resten verwendet und die Verfahren der chemischen Synthese und die Verfahren der enzymatischen Synthese werden hauptsächlich für die Synthese von Dipeptiden verwendet.
Bei der Synthese von Dipeptiden durch die Verfahren der chemischen Synthese sind jedoch Arbeitsvorgänge wie das Einführen und das Entfernen von Schutzgruppen für die funktionalen Gruppen notwendig und es werden außerdem Racemate gebildet. Die Verfahren der chemischen Synthese werden daher mit Bezug auf die Kosten und die Effizienz als unvorteilhaft eingeschätzt. Sie sind ebenfalls vom Standpunkt der Umwelthygiene wegen der Verwendung von großen Mengen organischer Lösungsmittel und dergleichen ungünstig.
Für die Synthese von Dipeptiden durch die enzymatischen Verfahren sind die nachfolgenden Verfahren bekannt: ein Verfahren, das die reverse Reaktion der Protease verwendet (J Biol Chem 119, 707-720 (1937)); Verfahren, welche die wärmebeständige Aminoacyl-t-RNA-Synthetase verwenden ( Japanische veröffentlichte, nicht geprüfte Patentanmeldung Nr.: 146539/83 ; Japanische veröffentlichte, nicht geprüfte Patentanmeldung Nr.: 209991/83 ; Japanische veröffentlichte, nicht geprüfte Patentanmeldung Nr.: 209992/83 ; und Japanische veröffentlichte, nicht geprüfte Patentanmeldung Nr.: 106298/84 ); und Verfahren, welche die Nicht-Ribosomen-Peptid-Synthetase verwenden (hierin nachfolgend als NRPS bezeichnet) (Chem Biol 7, 373-384 (2000); FEBS Lett 498, 42-45 (2001); US-Patent Nr.: 5,795,738 und US-Patent Nr.: 5,652,116 ).
Das Verfahren, das die reverse Reaktion der Protease verwendet, benötigt jedoch die Einführung und das Entfernen von Schutzgruppen für die funktionalen Gruppen von Aminosäuren, die als Substrate verwendet werden, was Schwierigkeiten bei der Erhöhung der Effizienz der peptidherstellenden Reaktion und bei der Verhinderung der peptiddegradierenden Reaktion hervorruft. Die Verfahren, welche die wärmestabile Aminoacyl-t-RNA-Synthetase verwenden, besitzen die Mängel, dass die Expression des Enzyms und die Verhinderung von Nebenreaktionen, die andere Nebenprodukte als die gewünschten Produkte herstellen, schwierig sind. Die Verfahren, die NRPS verwenden, sind nicht effizient, weil die Expression des Enzyms durch die rekombinanten DNA-Techniken aufgrund der Größe seines großen Enzymmoleküls und dadurch, dass die Bereitstellung des Coenzyms 4'-Phosphopantethein notwendig ist, schwierig ist.
Andererseits besteht eine Gruppe von Peptidsynthetasen, die ein Molekulargewicht des Enzyms besitzen, das niedriger als das der NRPS ist, und die das Coenzym 4'-Phosphopantethein nicht benötigen; zum Beispiel γ-Glutamylcysteinsynthetase, Glutathionsynthetase, D-Alanin-D-Alanin(D-Ala-D-Ala)-Ligase und Poly-γ-Glutamatsynthetase. Die meisten dieser Enzyme verwenden D-Aminosäuren als Substrate oder katalysieren die Bildung von Peptidbindungen an der γ-Carboxylgruppe. Wegen solcher Eigenschaften können sie nicht für die Synthese von Dipeptiden durch die Bildung der Peptidbindungen an der α-Carboxylgruppe der L-Aminosäure verwendet werden.
Das einzige bekannte Beispiel eines Enzyms, das zur Synthese eines Dipeptids durch die Aktivität, eine Peptidbindung an der α-Carboxylgruppe der L-Aminosäure zu bilden, fähig ist, ist die Bacilysin(ein Dipeptid-Antibiotikum, das von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zu Gattung Bacillus gehört)-Synthetase. Von der Bacilysin-Synthetase ist bekannt, dass sie die Aktivität besitzt, Bacilysin [L-Alanin-L-Anticapsin (L-Ala-L-Anticapsin)] und L-Alanin-L-Alanin (L-Ala-L-Ala) zu synthetisieren, aber es bestehen keine Informationen über ihre Aktivität, andere Peptide zu synthetisieren (J Ind Microbiol 2, 201-208 (1987) und Enzyme Microbial Technol 29, 400-406 (2001)).
Von den Bacilysin-Biosynthetase-Genen in Bacillus subtilis 168, dessen gesamte Genominformationen aufgeklärt wurden (Nature 390, 249-256 (1997), ist bekannt, dass die Produktivität von Bacilysin durch die Amplifikation der Bacilysin-Operone, welche die ORFs ywfA-F ( WO 00/03009 Broschüre) enthalten, erhöht wird. Es ist jedoch nicht bekannt, ob ein ORF, das ein Protein codiert, das eine Aktivität besitzt, zwei oder mehrere Aminosäuren durch eine Peptidbindung zu ligieren, in diesen ORFs enthalten ist, und falls es enthalten ist, welches ORF das Protein codiert. Die Einträge P39461 und Q8KWT3 der UNIPROT-Datenbank beschreiben ebenfalls nicht spezifizierte Proteine von Bacillus subtilis, deren Funktion nicht beschrieben wird. Inoaka et al., J Biol Chem 278, 2169-2176 (2003) beschreiben des weiteren das polycistronische Operon ywf BCDEFG und ein monocistronisches Gen (ywf H) von Bacillus subtilis und berichten, dass die Herstellung von Bacilysin durch ein zweifaches Regulationssystem kontrolliert wird, das aus ppGpp und GTP zusammengesetzt ist.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren für die Herstellung eines anderen Dipeptids als L-Ala-L-Ala zur Verfügung zu stellen, wobei als eine Enzymquelle eine Kultur eines Mikroorganismus verwendet wird, der die Fähigkeit besitzt, ein Protein, das die Dipeptid-synthetisierende Aktivität besitzt, oder ein Protein für die Synthese eines Dipeptids herzustellen, wie hierin beschrieben wird. Es wird ebenfalls hierin beschrieben ein Protein, das die Aktivität besitzt, ein Dipeptid zu synthetisieren, das unterschiedlich zu L-Ala-L-Ala ist und für das bis jetzt noch kein Verfahren der enzymatischen Synthese vorgeschlagen wurde, das eine Peptidsynthetase oder dergleichen verwendet, und ein Protein für die Synthese des Dipeptids; eine DNA, die das Protein codiert, das eine Dipeptid-synthetisierende Aktivität besitzt; eine rekombinante DNA, welche die DNA umfasst; eine Transformante, welche die rekombinante DNA trägt; ein Verfahren für die Herstellung des Proteins, das die Dipeptid-synthetisierende Aktivität besitzt; und ein enzymatisches Verfahren für die Synthese des Dipeptids, welches das Protein, das die Dipeptid-synthetisierende Aktivität besitzt, oder das Protein für die Synthese des Dipeptids verwendet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die nachfolgenden Punkte (1) bis (9).

(1) Ein Verfahren für die Herstellung eines anderen Dipeptids als L-Ala-L-Ala, umfassend: (a) Halten eines Proteins, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) einem Protein, das die in einer der SEQ ID NOs.: 2 bis 8 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst; (ii) einem Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die 85% oder mehr Ähnlichkeit zu der in einer der SEQ ID NOs.: 1 bis 8 gezeigten Aminosäuresequenz zeigt, und eine Dipeptid-synthetisierende Aktivität hat, (iii) einem Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die 80% oder mehr Ähnlichkeit zu der in SEQ ID NO.: 17 gezeigten L-Aminosäuresequenz hat und eine Dipeptid-synthetisierende Aktivität hat, von mindestens zwei L-Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, und von ATP in einem wässrigen Medium; (b) Zulassen, dass sich das Dipeptid bildet und im Medium anreichert; und (c) Gewinnen des Dipeptids aus dem Medium.
(2) Verfahren für die Herstellung eines anderen Dipeptids als L-Ala-L-Ala, umfassend: (a) Halten einer Enzymquelle und von mindestens zwei L-Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, in einem wässrigen Medium, wobei die Enzymquelle eine Kultur oder behandeltes Material der Kultur ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) einer Kultur einer Transformante, die eine DNA trägt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (1) einer DNA, die das wie in Anspruch 1 definierte Protein codiert; (2) einer DNA, welche die in einer der SEQ ID NOs: 10 bis 16 und 36 gezeigten Nucleotidsequenz umfasst; (3) einer DNA, die unter stringenten Bedingungen mit einer DNA hybridisiert, welche die in einer der SEQ ID NOs.: 9 bis 16 und 36 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst und die ein Protein mit einer Dipeptid-synthetisierenden Aktivität codiert; oder behandeltes Material der Kultur ist; und (ii) einer Kultur eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit, das wie in Anspruch 1 definierte Protein herzustellen, oder behandeltem Material der Kultur; (b) Zulassen, dass sich das Dipeptid bildet und im Medium anreichert; und (c) Gewinnen des Dipeptids aus dem Medium.
(3) Verfahren nach [2], wobei der Mikroorganismus ein Mikroorganismus ist, der zu der Gattung Bacillus gehört.
(4) Verfahren nach [3], wobei der Mikroorganismus, der zu der Gattung Bacillus gehört, ein Mikroorganismus der Gattung Bacillus ist, mit der Fähigkeit Bacilysin herzustellen.
(5) Verfahren nach [4], wobei der Mikroorganismus der Gattung Bacillus mit der Fähigkeit Bacilysin herzustellen, ein Mikroorganismus ist, der zu der Art gehört, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium und Bacillus pumilus.
(6) Verfahren nach [2], wobei der Mikroorganismus ein Mikroorganismus ist, der mit einer rekombinanten DNA transformiert ist, die eine DNA umfasst, welche die in SEQ ID NO.: 9 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst, oder ein Mikroorganismus ist, der zu Bacillus subtilis gehört.
(7) Verfahren nach [6], wobei der Mikroorganismus, der eine rekombinante DNA trägt, die eine DNA umfasst, welche die in SEQ ID NO.: 9 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst, ein Mikroorganismus ist, der zu der Gattung Escherichia gehört.
(8) Verfahren nach einem von [2] bis [7], wobei das behandelte Material der Kultur eine konzentrierte Kultur, eine getrocknete Kultur, Zellen, die durch Zentrifugation der Kultur erhalten wurden, oder ein Produkt ist, das erhalten wird, indem die Zellen einer Trocknung, Gefriertrocknung, Behandlung mit einem Tensid bzw. grenzflächenaktiven Mittel, Ultraschall, mechanischer Reibung, Behandlung mit einem Lösungsmittel, enzymatischer Behandlung, Proteinfraktionierung oder -immobilisierung unterzogen werden, oder ein Enzympräparat ist, das durch Extrahieren der Zellen erhalten wird.
(9) Verwendung eines wie in [1] definierten Proteins, einer wie in [2] definierten DNA oder einer Transformante, welche die DNA trägt oder die Fähigkeit hat, das Protein herzustellen, zur Herstellung eines anderen Dipeptids als L-Ala-L-Ala.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Protein, das die Aktivität besitzt, ein Dipeptid zu synthetisieren, das von L-Ala-L-Ala unterschiedlich ist, und für das bisher kein Verfahren der enzymatischen Synthese vorgeschlagen wurde, hergestellt werden. Andere Dipeptide als L-Ala-L-Ala können durch die Verwendung des Proteins oder einer Transformante oder eines Mikroorganismus hergestellt werden, das/die/der die Fähigkeit besitzt, das Protein herzustellen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Aminosäuresequenz des Eintrags Q8KWT3 der UNIPROT-Datenbank.
2 zeigt die Nucleotidsequenz, auf die in dem Eintrag Q8KWT3 der UNIPROT-Datenbank verwiesen wird.
Erklärung der Symbole:

ywfE:

das Gen ywfE, das von Bacillus subtilis 168 abgeleitet ist.

Ptrp:

Tryptophan-Promotor-Gen

PT5:

T5-Promotor-Gen

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Proteine, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, schließen ein:
ein Protein, das die Aminosäuresequenz umfasst, die in einer der SEQ ID NOs.: 2 bis 8 gezeigt werden;
ein Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die 85% oder mehr Ähnlichkeit zu der Aminosäuresequenz zeigt, die in einer der SEQ ID NOs.: 1 bis 8 gezeigt werden und die eine Dipeptid-synthetisierende Aktivität besitzt; und
ein Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die 80% oder mehr Ähnlichkeit zu der Aminosäuresequenz zeigt, die in der SEQ ID NOs.: 17 gezeigt wird und die eine Dipeptid-synthetisierende Aktivität besitzt.
Ein Beispiel des Proteins, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung für die Synthese eines anderen Dipeptids als L-Ala-L-Ala verwendet wird, ist ein Protein, das aus der Aminosäuresequenz besteht, die in der SEQ ID No.: 1 gezeigt wird.
Nachfolgend können hierin die vorstehenden Proteine, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung für die Synthese eines Dipeptids verwendet werden, das durch die Formel (I) dargestellt wird, d. h. R¹-R² (wobei R¹ und R², die gleich oder unterschiedlich sein können, jeweils einen Aminosäurerest darstellen), gemeinschaftlich als die Proteine bezeichnet werden, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Das Protein kann ebenfalls aus einer Aminosäuresequenz bestehen, in der ein oder mehrere Aminosäurereste deletiert, substituiert oder hinzugefügt sind und die eine Aktivität besitzen, eine Dipeptid zu synthetisieren, und kann zum Beispiel durch das Einführen einer ortsgerichteten Mutation in eine DNA erhalten werden, die ein Protein codiert, das aus der Aminosäuresequenz besteht, die in einer der SEQ ID NOs.: 1 bis 8 gezeigt wird, wobei ortsgerichtete Mutagenese in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (nachfolgend hierin als Molecular Cloning, zweite Auflage bezeichnet); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (nachfolgend hierin als Current Protocols in Molecular Biology bezeichnet); Nucleic Acids Research 10, 6487 (1982); Proc Natl Acad Sci USA 79, 6409 (1982); Gene 34, 315 (1985); Nucleic Acids Research 13, 4431 (1985); Proc Natl Acad Sci USA 82, 488 (1985); etc. beschrieben ist.
Die Anzahl der Aminosäurereste, die deletiert, substituiert oder hinzugefügt werden, ist nicht ausdrücklich begrenzt, aber sie liegt in dem Bereich, in dem eine Deletion, Substitution oder ein Zufügen durch bekannte Verfahren wie z. B. die vorstehende ortsgerichtete Mutagenese möglich ist. Die geeignete Anzahl beträgt vorzugsweise 1 bis 20, stärker bevorzugt 1 bis 10, noch stärker bevorzugt 1 bis 5.
Der Ausdruck "ein oder mehrere Aminosäurereste werden in der Aminosäuresequenz, die in einer der SEQ ID NOs.: 1 bis 8 gezeigt werden, deletiert, substituiert oder hinzugefügt" bedeutet, dass die Aminosäuresequenz eine Deletion, Substitution oder eine Hinzufügung eines einzelnen Aminosäurerests oder von mehreren Aminosäureresten an einer beliebigen Position der Aminosäuresequenz haben kann, die in einer der SEQ ID NOs.: 1 bis 8 gezeigt wird.
Aminosäurereste, die substituiert werden können, sind zum Beispiel solche, die in jeder der Aminosäuresequenzen, die in den SEQ ID NOs.: 1 bis 8 gezeigt werden, nicht konserviert sind, wenn die Sequenzen unter Verwendung einer bekannten Alignment-Software verglichen werden. Ein Beispiel einer bekannten Alignment-Software ist die Alignment-Software, die in der Genanalyse-Software Genetyx (Software Development Co., Ltd.) enthalten ist. Als Analyseparameter für die Analyse-Software können Standardwerte verwendet werden.
Eine Deletion oder eine Hinzufügung von Aminosäureresten kann zum Beispiel in der N-terminalen Region oder der C-terminalen Region der Aminosäuresequenz enthalten sein, die in einer der SEQ ID NOs.: 1 bis 8 gezeigt wird.
Eine Deletion, Substitution oder eine Hinzufügung können gleichzeitig in einer Sequenz enthalten sein und die Aminosäuren, die substituiert oder hinzugefügt werden sollen, können entweder natürlich sein oder nicht. Beispiele der natürlichen Aminosäuren sind L-Alanin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Glutamin, L-Glutaminsäure, Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Lysin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin, L-Valin und L-Cystein.
Das Nachfolgende sind Beispiele von Aminosäuren, die zu einer gegenseitigen Substitution fähig sind. Die Aminosäuren in der gleichen Gruppe können gegenseitig substituiert werden.

Gruppe A: Leucin, Isoleucin, Norleucin, Valin, Norvalin, Alanin, 2-Aminobuttersäure, Methionin, O-Methylserin, t-Butylglycin, t-Butylalanin, Cyclohexylalanin
Gruppe B: Asparaginsäure, Glutaminsäure, Isoasparaginsäure, Isoglutaminsäure, 2-Aminoadipinsäure, 2-Aminokorksäure
Gruppe C: Asparagin, Glutamin
Gruppe D: Lysin, Arginin, Ornithin, 2,4-Diaminobuttersäure, 2,3-Diaminopropionsääure
Gruppe E: Prolin, 3-Hydroxyprolin, 4-Hydroxyprolin
Gruppe F: Serin, Threonin, Homoserin
Gruppe G: Phenylalanin, Tyrosin

Damit das Protein, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, die Aktivität besitzen kann, ein anderes Dipeptid als L-Ala-L-Ala zu synthetisieren, ist es wünschenswert, dass die Ähnlichkeit seiner Aminosäuresequenz zu der Aminosäuresequenz, die in einer der SEQ ID NOs.: 1 bis 8 gezeigt wird, vorzugsweise SEQ ID Nr.: 1, 85% oder mehr beträgt, stärker bevorzugt 90% oder mehr beträgt, besonders bevorzugt 95% oder mehr beträgt oder am stärksten bevorzugt 98% oder mehr beträgt.
Die Ähnlichkeit unter den Aminosäuresequenzen und den Nucleotidsequenzen kann durch die Verwendung des Algorithmus BLAST durch Karlin und Altschul [Proc Natl Acad Sci USA 90, 5873 (1993)] und FASTA [Methods Enzymol 183, 63 (1990)] bestimmt werden. Auf der Grundlage des Algorithmus BLAST wurden Programme wie z. B. BLASTN und BLASTX entwickelt [J Mol Biol 215, 403 (1990)]. Wenn eine Nucleotidsequenz mittels BLASTN auf der Grundlage von BLAST analysiert wird, sind die Parameter zum Beispiel wie nachfolgend: Punktzahl = 100, Wortlänge = 12. Wenn eine Aminosäuresequenz mittels BLASTX auf der Grundlage von BLAST analysiert wird, sind die Parameter zum Beispiel wie nachfolgend: Punktzahl = 50, Wortlänge = 3. Wenn BLAST- und Gapped-BLAST-Programme verwendet werden, werden die Standardparameter von jedem Programm verwendet. Die spezifischen Techniken für diese Analysen sind bekannt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).
Ein Protein, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die eine 85% oder höhere, stärker bevorzugt eine 90% oder höhere, besonders bevorzugt eine 95% oder höhere, am stärksten bevorzugt eine 98% oder höhere Ähnlichkeit zu der Aminosäuresequenz besitzt, die in einer der SEQ ID NOs.: 1 bis 8 gezeigt wird, vorzugsweise SEQ ID NO.: 1, und welche die Aktivität besitzt, ein Dipeptid zu synthetisieren, ist ebenfalls in den Proteinen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Die Ähnlichkeit unter den Aminosäuresequenzen kann durch die Verwendung von BLAST oder FASTA bestimmt werden, wie vorstehend beschrieben wurde.
Die Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID NO.: 17 gezeigt wird, ist eine Region, die unter den Proteinen konserviert ist, welche die Aminosäuresequenzen besitzen, die in den SEQ ID NOs.: 1 bis 7 gezeigt werden, und sie ist ebenfalls eine Region, die der Konsensussequenz der Proteine entspricht, die eine Ala-Ala-Ligase-Aktivität besitzen und von verschiedenen Mikroorganismen abgeleitet sind.
Ein Protein, das die Aminosäuresequenz besitzt, die eine 80% oder höhere, vorzugsweise eine 90% oder höhere, weiter bevorzugt eine 95% oder höhere Ähnlichkeit zu der Aminosäuresequenz besitzt, die in der SEQ ID NO.: 17 gezeigt wird, und welche die Aktivität besitzt, ein Dipeptid zu synthetisieren, ist ebenfalls in den Proteinen eingeschlossen, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Damit das Protein, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die eine 80% oder höhere, vorzugsweise eine 90% oder höhere, weiter bevorzugt eine 95% oder höhere Ähnlichkeit zu der Aminosäuresequenz besitzt, die in der SEQ ID NO.: 17 gezeigt wird, die Aktivität haben kann, ein Dipeptid zu synthetisieren, ist es wünschenswert, dass die Ähnlichkeit seiner Aminosäuresequenz zu der Aminosäuresequenz, die in einer der SEQ ID NOs.: 1 bis 8 gezeigt wird, mindestens 80% oder mehr, im Allgemeinen 90% oder mehr und insbesondere 95% oder mehr beträgt.
Die Ähnlichkeit unter den Aminosäuresequenzen kann durch die Verwendung von BLAST oder FASTA bestimmt werden, wie vorstehend beschrieben wurde.
Es ist möglich, zu bestimmen, dass das Protein, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ein Protein ist, dass die Aktivität besitzt, ein Dipeptid zu synthetisieren, zum Beispiel in der nachfolgenden Weise. Das heißt, eine Transformante, die das Protein exprimiert, das hierin im Zusammenhang mit den Verfahren der vorliegenden Verfahren beschrieben wird, wird durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt, das Protein wird durch die Verwendung der Transformante hergestellt und man hält das Protein, mindestens zwei L-Aminosäuren, die gleich oder unterschiedlich sein können (vorrausgesetzt, dass L-Alanin in Kombination mit einer anderen L-Aminosäure verwendet wird) und ATP anschließend in einem wässrigen Medium, gefolgt von einer HPLC-Analyse oder dergleichen, um zu bestimmen, ob ein anderes Dipeptid als L-Ala-L-Ala gebildet wurde und im wässrigen Medium angereichert wurde.
Die DNAs der Proteine, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, schließen ein:
eine DNA, die das Protein codiert, wie gemäß des vorstehenden [1] definiert wurde;
eine DNA, welche die Nucleotidsequenz umfasst, die in einer der SEQ ID NOs.: 10 bis 16 und 36 gezeigt wird;
eine DNA, die mit der DNA unter stringenten Bedingungen hybridisiert, welche das Komplement einer Nucleotidsequenz umfasst, die in einer der SEQ ID NOs.: 9 bis 16 und 36 gezeigt wird, und die ein Protein codiert, das die Aktivität besitzt, ein Dipeptid zu synthetisieren; und
eine DNA, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die eine 80% oder höhere Ähnlichkeit zu der Nucleotidsequenz zeigt, die in der SEQ ID NO.: 18 gezeigt wird, und die ein Protein codiert, das die Aktivität besitzt, ein Dipeptid zu synthetisieren.
Die DNAs, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines anderen Dipeptids als L-Ala-L-Ala verwendet werden können, schließen die vorstehend beschriebenen DNAs und die DNA ein, die aus der Nucleotidsequenz besteht, die in der SEQ ID NO.: 9 gezeigt wird.
Die vorstehende DNA, die unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann, verweist zum Beispiel auf DNAs, die durch Kolonie-Hybridisierung, Plaque-Hybridisierung, Southern-Blot-Hybridisierung oder dergleichen erhalten werden, wobei ein Teil oder die gesamte DNA als eine Sonde verwendet wird, welche die Nucleotidsequenz besitzt, die in einer der SEQ ID NOs.: 9 bis 16 und 36 gezeigt wird. Ein spezifisches Beispiel einer solchen DNA ist eine DNA, die durch die Durchführung einer Hybridisierung bei 65°C in der Gegenwart von 0,7 bis 1,0 Mol/l Natriumchlorid identifiziert werden kann, wobei ein Filter mit Kolonie- oder Plaque-abgeleiteter DNA verwendet wird, die darauf immobilisiert wurde, und der Filter anschließend bei 65°C mit einer 0,1 bis 2fach konzentrierten SSC-Lösung gewaschen wird (1fach konzentrierte SSC-Lösung: 150 mMol/l Natriumchlorid und 15 mMol/l Natriumcitrat). Die Hybridisierung kann gemäß den Verfahren durchgeführt werden, die in Molecular Cloning, zweite Auflage; Current Protocols in Molecular Biology; DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, zweite Auflage, Oxford University (1995), etc. beschrieben werden. Genau gesagt schließt die hybridisierbare DNA eine DNA ein, die mindestens eine 75% oder höhere Ähnlichkeit, vorzugsweise eine 85% oder höhere Ähnlichkeit, stärker bevorzugt eine 90% oder höhere Ähnlichkeit, besonders bevorzugt eine 95% oder höhere Ähnlichkeit zu der Nucleotidsequenz zeigt, die in einer der SEQ ID NOs.: 9 bis 16 und 36 gezeigt wird, wie durch die Verwendung von BLAST oder FASTA, vorstehend beschrieben, auf der Grundlage der vorstehenden Parameter berechnet werden kann.
Es ist möglich zu bestätigen, dass die DNA, die mit der DNA unter stringenten Bedingungen hybridisiert, welche die Nucleotidsequenz besitzt, die in einer der SEQ ID NOs.: 9 bis 16 und 36 gezeigt wird, eine DNA ist, die ein Protein codiert, das die Aktivität besitzt, ein Dipeptid zu synthetisieren, das durch die Formel (I) dargestellt wird, zum Beispiel durch die Herstellung eines Proteins, das durch die DNA durch rekombinante DNA-Techniken codiert wird, und durch das Messen der Aktivität des Proteins, wie vorstehend beschrieben wird.
(i) Herstellung einer DNA, die in einem Verfahren für die Herstellung des Proteins, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, oder eines anderen Dipeptids als L-Ala-L-Ala verwendet wird.
Eine DNA, die in dem Verfahren für die Herstellung des Proteins, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, oder eines anderen Dipeptids als L-Ala-L-Ala verwendet wird (nachfolgend hierin ebenfalls als das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung bezeichnet), kann zum Beispiel durch eine Southern-Hybridisierung einer chromosomalen DNA-Bibliothek von einem Mikroorganismus erhalten werden, der zu der Gattung Bacillus gehört, wobei eine Sonde verwendet wird, die auf der Grundlage der Nucleotidsequenz entwickelt wird, die in einer der SEQ ID NOs.: 9 bis 16 gezeigt wird, oder durch PCR erhalten werden [PCR Protocols, Academic Press (1990)], wobei Primer-DNAs, die auf der Grundlage der Nucleotidsequenz entwickelt wurden, die in einer der SEQ ID NOs.: 9 bis 16 gezeigt werden, und als eine Matrize die chromosomale DNA eines Mikroorganismus, der zur Gattung Bacillus gehört, verwendet werden.
Eine DNA, die in dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann ebenfalls durch die Durchführung einer Suche durch verschiedene Gensequenz-Datenbanken nach einer Sequenz, die eine 75% oder höhere Ähnlichkeit, vorzugsweise eine 85% oder höhere Ähnlichkeit, stärker bevorzugt eine 90% oder höhere Ähnlichkeit, weiter bevorzugt ein 95% oder höhere Ähnlichkeit, besonders bevorzugt eine 98% oder höhere Ähnlichkeit zu der Nucleotidsequenz der DNA besitzt, welche die Aminosäuresequenz codiert, die in einer der SEQ ID NOs.: 1 bis 8 und 17 gezeigt wird, und durch Erhalten der gewünschten DNA auf der Grundlage der durch die Suche erhaltenen Nucleotidsequenz von einer chromosomalen DNA- oder einer cDNA-Bibliothek von einem Organismus erhalten werden, welche die Nucleotidsequenz gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren besitzt.
Die erhaltene DNA als solche oder nach der Spaltung mit geeigneten Restriktionsenzymen wird in einem Vektor durch ein herkömmliches Verfahren eingeführt und die so erhaltene rekombinante DNA wird in eine Wirtszelle eingeführt. Anschließend kann die Nucleotidsequenz der DNA durch ein herkömmliches Sequenzierungsverfahren wie z. B. das Didesoxy-Verfahren [Proc Natl Acad Sci USA 74, 5463 (1977)] oder durch die Verwendung eines Nucleotidsequenziergeräts wie z. B. des 373A DNA Sequencer (Perkin-Elmer Corp.) bestimmt werden.
In den Fällen, in denen durch die Analyse der Nucleotidsequenz bestimmt wird, dass die erhaltene DNA eine unvollständige DNA ist, kann die DNA mit vollständiger Länge durch eine Southern-Hybridisierung einer chromosomalen DNA-Bibliothek erhalten werden, wobei die unvollständige DNA als eine Sonde verwendet wird.
Es ist ebenfalls möglich, die gewünschte DNA auf der Grundlage der bestimmten Nucleotidsequenz der DNA durch eine chemische Synthese herzustellen, wobei ein DNA-Synthesegerät (z. B. das Modell 8905, PerSeptive Biosystems) verwendet wird.
Beispiele der DNAs, die durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhalten werden können, sind DNAs, welche die Nucleotidsequenzen besitzen, die in den SEQ ID NOs.: 9 bis 16 gezeigt werden.
Beispiele der Vektoren für das Einführen der DNA, die in dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, schließen pBluescript II KS (+) (Stratagene), pDIRECT [Nucleic Acids Res 18, 6069 (1990)], pCR-Script Amp SK (+) (Stratagene), pT7 Blue (Novagen, Inc), pCR II (Invitrogen Corp) und pCR-TRAP (Genhunter Corp) ein.
Als die Wirtszelle können Mikroorganismen verwendet werden, die zu der Gattung Escherichia etc. gehören. Beispiele der Mikroorganismen, die zu der Gattung Escherichia gehören, schließen Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli ATCC 12435, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli Nr. 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, Escherichia coli NM522 und Escherichia coli ME8415 ein.
Die Einführung der rekombinanten DNA kann durch jedes der Verfahren für die Einführung von DNA in die vorstehenden Wirtszellen durchgeführt werden, zum Beispiel durch das Verfahren, das Calcium-Ionen verwendet [Proc Natl Acad Sci USA 69, 2110 (1972)], das Protoplasten-Verfahren ( Japanisches veröffentlichte nicht geprüfte Patentanmeldung Nr.: 248394/88 ) und Elektroporation [Nucleic Acids Res 16, 6127 (1988)].
Ein Beispiel des Mikroorganismus, der die DNA trägt, die in dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird und die durch das vorstehende Verfahren erhalten wird, ist Escherichia coli NM522/pPE43, der ein Mikroorganismus ist, der mit einer rekombinanten DNA transformiert wurde, welche die DNA umfasst, welche die Sequenz besitzt, die in der SEQ ID Nr.: 1 gezeigt wird.
(ii) Verfahren für die Herstellung eines Proteins, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird
Ein Protein, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann durch das Exprimieren der DNA, die hierin beschrieben wird, oder einer DNA, die in dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, hergestellt werden, wobei sie durch die Verfahren, die vorstehend in (i) beschrieben werden, in Wirtszellen unter Verwendung der Verfahren, die in Molecular Cloning, zweite Auflage, Current Protocols in Molecular Biology etc. beschrieben werden, zum Beispiel auf die nachfolgenden Weise erhalten wird.
Auf der Grundlage einer DNA, die hierin beschrieben wird, oder einer DNA, die in dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird ein DNA-Fragment in einer geeigneten Länge, das eine Region umfasst, die ein Protein codiert, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, gemäß dem Bedarf hergestellt. Die Produktivität des Proteins kann durch den Austausch eines Nucleotids in der Nucleotidsequenz der Region erhöht werden, die das Protein codiert, um ein Codon herzustellen, das für die Expression in einer Wirtszelle am geeignetesten ist. Eine DNA, die eine Nucleinsäuresequenz mit optimierten Codons umfasst, wird als Teil der vorliegend offenbarten Erfindung erkannt werden. Das DNA-Fragment kann stromabwärts eines Promotors in einem geeigneten Expressionsvektor eingeführt werden, um eine rekombinante DNA herzustellen.
Eine Transformante, die ein Protein herstellt, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann durch die Einführung der rekombinanten DNA in eine Wirtszelle erhalten werden, die für die Expression des Vektors geeignet ist.
Als eine Wirtszelle können alle Bakterienzellen, Hefezellen, Tierzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen etc. verwendet werden, die das gewünschte Gen exprimieren können.
Die Expressionsvektoren, die verwendet werden können, sind solche, die fähig zur autonomen Replikation oder zur Integration in das Chromosom der vorstehenden Wirtszellen sind, und die einen Promotor an einer Position umfassen, der für die Transkription einer DNA, die hierin beschrieben wird, oder einer DNA, die in dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, geeignet ist.
Wenn eine prokaryontische Zelle wie z. B. ein Bakterium als eine Wirtszelle verwendet wird, wird bevorzugt, dass eine rekombinante DNA, die eine DNA umfasst, die hierin beschrieben wird, oder eine DNA, die in dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, eine rekombinante DNA ist, die zur autonomen Replikation in einer prokaryontischen Zelle fähig ist und die zum Beispiel einen Promotor, eine Ribosomen-Bindungssequenz, eine DNA, die hierin beschrieben wird, oder eine DNA, die in dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, und eine Transkriptions-Terminierungssequenz besitzt. Die rekombinante DNA kann des weiteren ein Gen umfassen, das den Promotor reguliert.
Beispiele für geeignete Expressionsvektoren sind pBTrp2, pBTac1 und pBTac2 (Produkte von Boehringer Mannheim GmbH), pHelix1 (Roche Diagnostics Corp), pKK233-2 (Amersham Pharmacia Biotech), pSE280 (Invitrogen Corp), pGEMEX-1 (Promega Corp), pQE-8 (Qiagen, Inc), pET-3 (Novagen, Inc), pKYP10 ( japanische veröffentlichte nicht geprüfte Patentanmeldung Nr.: 110600/83 ), pKYP200 [Agric Biol Chem 48, 669 (1984)], PLSA1 Agric Biol Chem 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc Natl Acad Sci USA 82, 4306 (1985)], pBluescript II SK (+), pBluescript II KS (–) (Stratagene), pTrs30 [hergestellt von Escherichia coli JM109/pTrs30 (FERM BP-5407)], pTrs32 [hergestellt von Escherichia coli JM109/pTrs32 (FERM BP-5408)], pPAC31 ( WO 98/12343 ), pUC19 [Gene 33, 103 (1985)], pSTV28 (Takara Shuzo Co, Ltd), pUC118 (Takara Shuzo Co, Ltd) und pPA1 ( japanische veröffentliche nicht geprüfte Patentanmeldung Nr.: 233798/88 ).
Als Promotor kann jeder Promotor verwendet werden, der in Wirtszellen wie z. B. Escherichia coli arbeitet. Zum Beispiel können Promotoren verwendet werden, die von Escherichia coli oder einem Phagen abgeleitet sind, wie z. B. der trp-Promotor (P_trp), der lac-Promotor (P_lac), der P_L-Promotor, der P_R-Promotor und der P_SE-Promotor, der SPO1-Promotor, SPO2-Promotor und der penP-Promotor. Künstlich entwickelte und modifizierte Promotoren wie z. B. ein Promotor, in dem zwei P_trp als Tandem kombiniert sind, der tac-Promotor, der lacT7-Promotor und der letl-Promotor etc. können ebenfalls verwendet werden.
Ebenfalls nützlich sind der xylA-Promotor für die Expression in Mikroorganismen, die der Gattung Bacillus angehören [Appl Microbiol Biotechnol 35, 594-599 (1991)] und der P54-6-Promotor für die Expression in Mikroorganismen, die zu der Gattung Corynebacterium gehören [Appl Microbiol Biotechnol 53, 674-679 (2000)].
Es wird bevorzugt, dass ein Plasmid verwendet wird, in dem der Abstand zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz (Ribosomen bindende Sequenz) und dem Initiations-Codon in einer geeigneten Länge (z. B. 6 bis 18 Nucleotiden) eingestellt ist.
In der rekombinanten DNA, in der die DNA, die hierin beschrieben wird, oder die DNA, die in dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, in einen Expressionsvektor ligiert wird, ist die Terminierungssequenz der Transkription nicht essentiell, aber es wird bevorzugt, dass die Terminierungssequenz der Transkription direkt stromabwärts des Strukturgens platziert wird.
Ein Beispiel einer solchen DNA ist pPE43 (vergl. Beispiel 2).
Beispiele von geeigneten prokaryontischen Zellen schließen Mikroorganismen ein, die zu der Gattung Escherichia,
Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azotobacter, Chromatium, Erwinia, Methylobacterium, Phormidium, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Scenedesmus, Streptomyces, Synechoccus und Zymomonas gehören. Spezifische Beispiele sind Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli DH5α, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No. 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, Escherichia coli NM522, Bacillus subtilis ATCC 33712, Bacillus megaterium, Bacillus sp. FERM BP-6030, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum ATCC 14068, Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 14297, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Pseudomonas sp. D-0110, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi, Anabaena cylindrica, Anabaena doliolum, Anabaena flos-aquae, Arthrobacter aurescens, Arthrobacter citreus, Arthrobacter globformis, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter mysorens, Arthrobacter nicotianae, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter protophormiae, Arthrobacter roseoparaffinus, Arthrobacter sulfureus, Arthrobacter ureafaciens, Chromatium buderi, Chromatium tepidum, Chromatium vinosum, Chromatium warmingii, Chromatium fluviatile, Erwinia uredovora, Erwinia carotovora, Erwinia ananas, Erwinia herbicola, Erwinia punctata, Erwinia terreus, Methylobacterium rhodesianum, Methylobacterium extorquens, Phormidium sp. ATCC 29409, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodopseudomonas blastica, Rhodopseudomonas marina, Rhodopseudomonas palustris, Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum salexigens, Rhodospirillum salinarum, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces aureus, Streptomyces fungicidicus, Streptomyces griseochromogenes, Streptomyces griseus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivogriseus, Streptomyces rameus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces vinaceus und Zymomonas mobilis.
Die Einführung der rekombinanten DNA kann durch jedes Verfahren für die Einführung von DNA in die vorstehenden Wirtszellen durchgeführt werden, zum Beispiel durch das Verfahren, das Calcium-Ionen verwendet [Proc Natl Acad Sci USA 69, 2110 (1972)], das Protoplasten-Verfahren ( japanische veröffentlichte nicht geprüfte Patentanmeldung Nr.: 248394/88 ) und durch die Elektroporation [Nucleic Acids Res 16, 6127 (1988)].
Wenn ein Hefestamm als die Wirtszelle verwendet wird, können YEp13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419), pHS19, pHS15 etc. als Expressionsvektor verwendet werden.
Als der Promotor kann jeder Promotor verwendet werden, der in Hefestämmen arbeitet. Geeignete Promotoren schließen den PHO5-Promotor, den PGK-Promotor, den GAP-Promotor, den ADH-Promotor, den gal 1-Promotor, den gal 10-Promotor, den Hitzeschock-Polypeptid-Promotor, den MFα1-Promotor und den CUP1-Promotor ein.
Beispiele von geeigneten Wirtszellen sind Hefestämme, die zu der Gattung
Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Pichia und Candida, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius, Pichia pastoris und Candida utilis gehören.
Die Einführung der rekombinanten DNA kann durch jedes Verfahren für die Einführung von DNA in Hefe durchgeführt werden, zum Beispiel durch die Elektroporation [Methods Enzymol 194, 182 (1990)], das Sphäroplasten-Verfahren [Proc Natl Acad Sci USA 81, 4889 (1984)] und das Lithium-Acetat-Verfahren [J Bacteriol 153, 163 (1983)].
Wenn eine Tierzelle als die Wirtszelle verwendet wird, können pcDNAl, pcDM8 (im Handel erhältlich von Funakoshi Co, Ltd), pAGE107 ( japanische veröffentlichte nicht geprüfte Patentanmeldung Nr.: 22979/91 ), pAS3-3 ( Japanische veröffentlichte nicht geprüfte Patentanmeldung Nr.: 227075/90 ), pCDM8 [Nature 329, 840 (1987)], pcDNAl/Amp (Invitrogen Corp), pREP4 (Invitrogen Corp), pAGE 103 [J Biochem 101, 1307 (1987)], pAGE210, pAMo, pAMoA etc. als Expressionsvektor verwendet werden.
Als der Promotor kann jeder Promotor verwendet werden, der in Tierzellen arbeiten kann. Geeignete Promotoren schließen den Promotor des IE (sehr frühen) Gens des Cytomegalievirus (CMV), den frühen SV40-Promotor, den Metallothionein-Promotor, den Promotor eines Retrovirus, den Hitzeschock-Promotor, den SRα-Promotor etc. ein. Der Enhancer des IE-Gens des menschlichen CMV kann in Kombination mit dem Promotor verwendet werden.
Beispiele von geeigneten Wirtszellen sind Myelomzellen der Maus, Myelomzellen der Ratte, Hybridome der Maus, vom Menschen abgeleitete Namalwa-Zellen und Namalwa KJM-1-Zellen, menschliche embryonale Nierenzellen, menschliche Leukämiezellen, Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze, vom chinesischen Hamster abgeleitete CHO-Zellen und HBT5637 ( japanische veröffentlichte nicht geprüfte Patentanmeldung Nr.: 299/88 ).
Die Myelomzellen der Maus schließen SP2/0 und NSO ein, die Myelomzellen der Ratte schließen YB2/0 ein, die menschlichen embryonalen Nierenzellen schließen HEK293 (ATCC CRL-1573) ein; die menschlichen Leukämiezellen schließen BALL-1 ein, die Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze schließen COS-1 und COS-7 ein.
Die Einführung der rekombinanten DNA kann durch jedes Verfahren für die Einführung von DNA in Tierzellen durchgeführt werden, zum Beispiel durch die Elektroporation [Cytotechnology 3, 133 (1990)], das Calcium-Phosphat-Verfahren ( japanische veröffentlichte nicht geprüfte Patentanmeldung Nr.: 227075/90 ), die Lipofektion [Proc Natl Acad Sci USA 84, 7413 (1987)] und durch das Verfahren, das in Virology 52, 456 (1973) beschrieben wird.
Wenn eine Insektenzelle als die Wirtszelle verwendet wird, kann das Protein durch die Verfahren hergestellt werden, die in Baculovirus Expression Vectors, A Laborstory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992); Current Protocols in Molecular Biology; Molecular Biology, A Laboratory Manual; Bio/Technology 6, 47 (1988) etc. beschrieben werden.
Das heißt, der Transfervektor für das rekombinante und ein Baculovirus werden zusammen in Insektenzellen transfiziert, um ein rekombinantes Virus im Kulturüberstand der Insektenzellen zu erhalten, und anschließend werden die Insektenzellen mit dem rekombinanten Virus infiziert, wodurch das Protein hergestellt werden kann.
Die Gentransfer-Vektoren, die in diesen Verfahren nützlich sind, schließen pVL1392, pVL1393 und pBlueBacIII (Produkte der Invitrogen Corp.) ein.
Ein Beispiel des Baculovirus ist das Autographa californica-kernpolyeder-Virus, das ein Virus ist, das Insekten infiziert, die zu der Familie Barathra gehören.
Beispiele von Insektenzellen sind Eierstockzellen von Spodoptera frugiperda, Eierstockzellen von Trichoplusia ni und kultivierte Zellen, die von dem Eierstock der Seidenraupe abgeleitet sind.
Die Eierstockzellen von Spodoptera frugiperda schließen Sf9 und Sf21 (Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual) ein; die Eierstockzellen von Trichoplusia ni schließen High 5 und BTI-TN-5B1-4 (Invitrogen Corp) ein; und die kultivierten Zellen, die von dem Eierstock der Seidenraupe abgeleitet sind, schließen Bombyx mori N4 ein.
Die Cotransfektion des rekombinanten Gentransfer-Vektors und des vorstehenden Baculovirus in die Insektenzellen für die Herstellung des rekombinanten Virus kann durch das Calcium-Phosphat-Verfahren ( japanische veröffentlichte nicht geprüfte Patentanmeldung Nr.: 227075/90 ), durch Lipofektion [Proc Natl Acad Sci USA 84, 7413 (1987)] etc. durchgeführt werden.
Wenn eine Pflanzenzelle als die Wirtszelle verwendet wird, können das Ti-Plasmid, der Tabak-Mosaikvirus-Vektor etc. als Expressionsvektor verwendet werden.
Als der Promotor kann jeder Promotor verwendet werden, der in Pflanzenzellen arbeiten kann. Geeignete Promotoren schließen den 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV), den Reis-Actin 1-Promotor etc. ein.
Beispiele von geeigneten Wirtszellen sind Zellen von Pflanzen wie z. B. Tabak, Kartoffel, Tomate, Karotte, Sojabohne, Raps, Luzerne, Reis, Weizen und Gerste.
Die Einführung eines rekombinanten Vektors kann durch jedes Verfahren für die Einführung von DNA in Pflanzenzellen durchgeführt werden, zum Beispiel durch das Verfahren unter Verwendung des Agrobacteriums ( japanische veröffentlichte nicht geprüfte Patentanmeldungen Nr.: 140885/84 und 70080/85 und WO 94/00977 ), durch die Elektroporation ( japanische veröffentlichte nicht geprüfte Patentanmeldung Nr.: 251887/85 ) und durch das Verfahren unter Verwendung einer Partikelkanone (Genkanone) ( japanische Patente Nr.: 2606856 und 2517813 ).
Wenn die DNA in Hefe, einer Tierzelle, einer Insektenzelle oder einer Pflanzenzelle exprimiert wird, kann ein glycosyliertes Protein erhalten werden.
Das Protein, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann durch die Kultivierung der Transformante, die wie vorstehend erhalten wird in einem Medium, das es ermöglicht, dass sich ein Protein, das hierin beschrieben wird, bildet und in der Kultur anreichert, und durch Gewinnung des Proteins aus der Kultur hergestellt werden.
Der Wirt der vorstehenden Transformante für die Herstellung des Proteins, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann jede bakterielle Zelle, Hefezelle, Tierzelle, Insektenzelle, Pflanzenzelle oder dergleichen sein, aber ist vorzugsweise ein Bakterium, stärker bevorzugt ein Mikroorganismus, der zu der Gattung Escherichia gehört, und weiter bevorzugt ein Mikroorganismus, der zu Escherichia coli gehört.
Das Züchten der vorstehenden Transformante in einem Medium kann durch herkömmliche Verfahren für die Kultivierung des Wirts durchgeführt werden.
Für die Züchtung der Transformante, die durch die Verwendung einer prokaryontischen Zelle wie z. B. Escherichia coli oder einer eukaryontischen Zelle wie z. B. Hefe als Wirt erhalten wird, können jedes natürliche Medium und jedes synthetische Medium verwendet werden, wenn es ein Medium ist, das für das effiziente Züchten der Transformante geeignet ist und das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze etc. enthält, die von dem verwendeten Wirt assimiliert werden können.
Als Kohlenstoffquelle kann jede Kohlenstoffquelle verwendet werden, die von dem Wirt assimiliert werden kann. Beispiele von geeigneten Kohlenstoffquellen schließen Kohlenhydrate wie z. B. Glucose, Fructose, Saccharose, Melasse, welche diese enthält, Stärke und Stärke-Hydrolysate; organische Säuren wie z. B. Essigsäure und Propionsäure; und Alkohole wie z. B. Ethanol und Propanol ein.
Als Stickstoffquellen können Ammoniak, Ammoniumsalze von organischen oder anorganischen Säuren wie z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat und Ammoniumphospat und andere stickstoffhaltige Verbindungen ebenso wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Casein-Hydrolysat, Sojabohnenkuchen, Sojabohnenkuchen-Hydrolysat und verschiedene fermentierte mikrobielle Zellen und gespaltene Produkte davon verwendet werden.
Beispiele von anorganischen Salzen schließen Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat und Calciumcarbonat ein.
Das Züchten wird im Allgemeinen unter aeroben Bedingungen zum Beispiel durch eine Schüttelkultur oder eine Submersspinnerkultur unter Belüftung durchgeführt. Die Temperatur der Kultur beträgt vorzugsweise 15 bis 40°C und der Kulturzeitraum beträgt im Allgemeinen 5 Stunden bis 7 Tage. Der pH-Wert wird bei 3,0 bis 9,0 während der Kultivierung gehalten. Das Einstellen des pH-Wertes wird durch die Verwendung einer organischen oder anorganischen Säure, einer alkalischen Lösung, von Harnstoff, Calciumcarbonat, Ammoniak etc. durchgeführt.
Falls es notwendig ist, können Antibiotika wie z. B. Ampicillin und Tetracyclin zu dem Medium während der Kultivierung zugegeben werden.
Wenn ein Mikroorganismus, der mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der einen induzierbaren Promotor umfasst, gezüchtet wird, kann ein Induktor dem Medium zugegeben werden, falls dies notwendig ist. In dem Fall eines Mikroorganismus, der mit einem Expressionsvektor transformiert wurde, der den lac-Promotor umfasst, kann zum Beispiel Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid oder dergleichen zu dem Medium zugegeben werden; und in dem Fall eines Mikroorganismus, der mit einem Expressionsvektor transformiert wurde, der den trp-Promotor umfasst, kann Indolacrylsäure oder dergleichen zugegeben werden.
Für das Züchten der Transformante, die durch die Verwendung einer Tierzelle als die Wirtszelle erhalten wurde, können allgemein verwendete Medien wie z. B. das RPM11640-Medium [J Am Med Assoc 199, 519 (1967); das Eagle-MEM [Science 122, 501 (1952)], das DMEM [Virology 8, 396 (1959)] und das 199-Medium [Proc Soc Biol Med 73, 1 (1950)], Medien, die durch die Zugabe von fötalem Kälberserum oder dergleichen zu diesen Medien hergestellt werden, etc. als das Medium verwendet werden.
Das Züchten wird im Allgemeinen bei einem pH-Wert von 6 bis 8 bei 25°C bis 40°C für 1 bis 7 Tage in der Anwesenheit von 5% CO₂ durchgeführt.
Falls es notwendig ist, können Antibiotika wie z. B. Kanamycin, Penicillin und Streptomycin zu dem Medium während des Züchtens zugegeben werden.
Für das Züchten der Transformante, die durch das Verwenden einer Insektenzelle als die Wirtszelle erhalten wird, können allgemein verwendete Medien wie z. B. das TNM-FH-Medium (PharMingen, inc), das Sf-900 II SFM-Medium (Life Technologies, Inc), das ExCell 400 und das ExCell 405 (JRH Biosciences, Inc) und das Grace's Insect Medium [Nature 195, 788 (1962)] als das Medium verwendet werden.
Das Züchten wird im Allgemeinen bei einem pH-Wert von 6 bis 7 bei 25°C bis 30°C für 1 bis 5 Tage durchgeführt.
Falls es notwendig ist, können Antibiotika wie z. B. Gentamicin zu dem Medium während des Züchtens zugegeben werden.
Die Transformante, die durch die Verwendung einer Pflanzenzelle als die Wirtszelle erhalten wird, kann in der Form von Zellen als solche oder nach der Differenzierung in Pflanzenzellen oder in Pflanzenorganen gezüchtet werden. Für die Züchtung von solchen Transformanten können allgemein verwendete Medien wie z. B. das Murashige-Skoog(MS)-Medium und das White-Medium, Medien, die durch die Zugabe von Phytohormonen wie z. B. Auxin und Cytokinin zu diesen Medien hergestellt werden, etc. als das Medium verwendet werden.
Das Züchten wird im Allgemeinen bei einem pH-Wert von 5 bis 9 bei 20 bis 40°C für 3 bis 60 Tage durchgeführt.
Falls es notwendig ist, können Antibiotika wie z. B. Kanamycin und Hygromycin zu dem Medium während des Züchtens zugegeben werden.
Wie vorstehend beschrieben wird, kann ein Protein, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, durch Züchten, der Transformante, die von einem Mikroorganismus, einer Insektenzelle, einer Tierzelle oder einer Pflanzenzelle abgeleitet ist und eine rekombinante DNA trägt, die durch die Ligierung einer DNA, die hierin beschrieben wird, oder einer DNA, die in dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, in einen Expressionsvektor hergestellt wird, gemäß einem herkömmlichen Kulturverfahren, durch Zulassen, dass sich das Protein bildet und anreichert, und durch Gewinnung des Proteins aus der Kultur hergestellt werden.
Ein Protein, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann durch die intrazelluläre Herstellung durch die Wirtszellen, durch eine extrazelluläre Absonderung durch die Wirtszellen oder durch die Herstellung von äußeren Membranen durch die Wirtszellen hergestellt werden und in Abhängigkeit des ausgewählten Verfahrens wird die Struktur des hergestellten Proteins angemessen modifiziert.
Wenn ein Protein, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, in Wirtszellen oder auf den äußeren Membranen der Wirtszellen hergestellt wird, ist es möglich, durch die Anwendung des Verfahrens von Paulson et al. [J Bio Chem 264, 17619 (1989)], des Verfahrens von Lowe et al. [Proc Natl Acad Sci USA 86, 8227 (1989); Genes Develop 4, 1288 (1990)] oder der Verfahren, die in den japanischen veröffentlichten nicht geprüften Patentanmeldungen Nr.: 336963/93 , WO 94/23021 etc. das Protein zu einer Absonderung aus der Wirtszelle zu zwingen.
Das heißt, eine extrazelluläre Absonderung eines Proteins, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, durch die Wirtszellen kann durch das Herstellen des Proteins in der Form eines Proteins hervorgerufen werden, in dem ein Signalpeptid stromaufwärts eines Proteins, das die aktive Stelle eines Proteins der vorliegenden Erfindung enthält, durch die Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken hinzugefügt wird.
Es ist ebenfalls möglich, die Herstellung des Proteins durch die Verwendung eines Gen-Amplifikationssystems zu erhöhen, das ein Dihydrofolatreductase-Gen oder dergleichen gemäß dem Verfahren verwendet, das in der japanischen veröffentlichten nicht geprüften Patentanmeldung Nr.: 227075/90 beschrieben wird.
Des weiteren kann ein Protein, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, unter Verwendung eines Tiers, das ein eingeführtes Gen besitzt (ein nichtmenschliches transgenes Tier), oder einer Pflanze, die ein eingeführtes Gen besitzt (transgene Pflanze), hergestellt werden, die durch die Redifferenzierung der Tier- oder Pflanzenzellen, die das eingeführte Gen tragen, aufgebaut werden.
Wenn eine Transformante, die ein Protein herstellt, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ein Tier oder eine Pflanze ist, kann das Protein durch das Aufziehen und das Kultivieren des Tiers oder der Pflanze in einer üblichen Weise, Zulassen, dass sich das Protein bildet und darin zu akkumuliert, und durch das Gewinnen des Proteins aus dem Tier oder der Pflanze hergestellt werden.
Die Herstellung eines Proteins, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wobei ein Tier verwendet wird, kann zum Beispiel durch die Herstellung des Proteins in einem Tier, das durch die Einführung des Gens gemäß bekannter Verfahren [Am J Clin Nutr 63, 639S (1996); Am J Clin Nutr 63, 627S (1996); Bio/Technology 9, 830 (1991)] aufgebaut wird, durchgeführt werden.
In dem Fall eines Tiers kann ein Protein, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, zum Beispiel durch das Aufziehen eines nichtmenschlichen transgenen Tiers, das eine eingeführte DNA, die hierin beschrieben wird, oder eine DNA trägt, die in dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, durch Zulassen, dass sich das Protein bildet und in dem Tier anreichert, und durch die Gewinnung des Proteins aus dem Tier hergestellt werden. Die Orte, an denen das Protein gebildet wird und sich anreichert, schließen die Milch [ japanische veröffentlichte nicht geprüfte Patentanmeldung Nr.: 309192/88 ), das Ei etc. des Tiers ein. Als Promotor in diesem Verfahren kann jeder Promotor verwendet werden, der in einem Tier arbeitet kann. Bevorzugte Promotoren schließen spezifische Promotoren für Brustdrüsenzellen wie z. B. α-Casein-Promotor, β-Casein-Promotor, β-Lactoglobulin-Promotor und saures Molkenprotein-Promotor ein.
Die Herstellung des Proteins, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung einer Pflanze verwendet wird, kann zum Beispiel durch das Züchten einer transgenen Pflanze, welche die eingeführte DNA trägt, die das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, gemäß bekannter Verfahren [Soshiki Baiyo (Tissue Culture) 20, (1994); Soshiki Baiyo 21 (1995); Trends Biotechnol 15, 45 (1997), durch Zulassen, dass sich das Protein bildet und in der Pflanze anreichert, und durch die Gewinnung des Proteins aus der Pflanze durchgeführt werden. Gewebespezifische Promotoren können ebenfalls bei der Pflanzenherstellung durch Mittel, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet werden.
Die Isolation und Reinigung eines Proteins, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird und das unter Verwendung der Transformante, die ein Protein herstellt, wie es hierin beschrieben wird, hergestellt wird, können durch herkömmliche Verfahren für die Isolation und Reinigung von Enzymen durchgeführt werden.
Wenn ein Protein, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, zum Beispiel in einer löslichen Form in den Zellen hergestellt wird, können die Zellen durch das Zentrifugieren nach dem Abschluss der Kultivierung gewonnen und in einem wässrigen Puffer suspendiert werden, gefolgt von einer Aufspaltung unter Verwendung eines Ultraschallgeräts, einer French Press, eines Manton Gaulin-Homogenisators, einer Dynomill oder dergleichen gewonnen werden, um einen zellfreien Extrakt zu erhalten.
Eine gereinigte Proteinherstellung kann durch das Zentrifugieren des zellfreien Extrakts, um den Überstand zu erhalten, und die anschließende Verwendung des Überstands für gewöhnliche Verfahren für die Isolation und Reinigung von Enzymen, z. B. die Extraktion mit einem Lösungsmittel, das Aussalzen mit Ammoniumsulfat etc., das Entsalzen, die Präzipitation mit einem organischen Lösungsmittel, eine Anionen-Austauschchromatographie unter Verwendung von Harzen wie z. B. Diethylaminoethyl(DEAE)-Sepharose und DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical Corporation), die Kationenaustausch-Chromatographie unter Verwendung von Harzen wie z. B. S-Sepharose FF (Pharmacia), die hydrophobe Chromatographie unter Verwendung von Harzen wie z. B. Butyl-Sepharose und Phenyl-Sepharose, die Gelfiltration unter Verwendung eines molekularen Siebs, die Affinitätschromatographie, die Chromatofokussierung und die Elektrophorese wie z. B. die isoelektrische Fokussierung, einzeln oder in Kombination, erhalten werden.
Wenn ein Protein als ein Einschlusskörper in Zellen hergestellt wird, werden die Zellen auf eine ähnliche Weise gewonnen und aufgebrochen, gefolgt von einer Zentrifugation, um eine Fraktion des Präzipitats zu erhalten. Nachdem das Protein aus der Fraktion des Präzipitats durch ein herkömmliches Verfahren gewonnen wurde, wird der Einschlusskörper des Proteins mit einem Denaturierungsmittel für Proteine löslich gemacht.
Die löslich gemachte Proteinlösung wird mit einer Lösung, die kein Denaturierungsmittel für Proteine enthält, oder mit einer Lösung, die das Denaturierungsmittel für Proteine in einer so niedrigen Konzentration enthält, dass keine Denaturierung des Proteins hervorgerufen wird, verdünnt oder dagegen dialysiert, wodurch das Protein zu einer normalen Struktur höherer Ordnung renaturiert wird. Anschließend kann eine gereinigte Proteinherstellung durch die gleichen Schritte der Isolation und der Reinigung erhalten werden, wie vorstehend beschrieben wird.
Wenn das Protein, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, oder sein Derivat wie z. B. eine glycosylierte Form, extrazellulär abgesondert wird, kann das Protein oder sein Derivat wie z. B. eine glycosylierte Form im Kulturüberstand gewonnen werden.
Das heißt, die Kultur wird mit den gleichen Mitteln wie vorstehend, wie z. B. Zentrifugation, behandelt, um eine lösliche Fraktion zu erhalten. Eine gereinigte Proteinherstellung kann aus der löslichen Fraktion durch die Verwendung der gleichen Verfahren für die Isolation und Reinigung erhalten werden, wie vorstehend beschrieben wird.
Beispiele der Proteine, die auf die vorstehend beschriebenen Weise erhalten werden, sind Proteine, die jeweils aus den Aminosäuresequenzen bestehen, die in den SEQ ID NOs.: 1 bis 8 gezeigt werden.
Es ist ebenfalls möglich, ein Protein, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, als ein Fusionsprotein mit einem anderen Protein herzustellen und es durch eine Affinitätschromatographie zu reinigen, wobei eine Substanz verwendet wird, die eine Affinität für das fusionierte Protein besitzt. Gemäß dem Verfahren von Lowe et al. [Proc Natl Acad Sci USA 86, 8227 (1989)]; Genes Develop 4, 1288 (1990)] und den Verfahren, die in den japanischen veröffentlichten nicht geprüften Patentanmeldungen Nr.: 336963/93 und WO 94/23021 beschrieben werden, kann ein Protein der vorliegenden Erfindung zum Beispiel als ein Fusionsprotein mit Protein A hergestellt werden und es kann durch eine Affinitätschromatographie unter Verwendung von Immunglobulin G gereinigt werden.
Des weiteren ist es möglich, ein Protein, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, als ein Fusionsprotein mit einem Flag-Peptid herzustellen und es durch eine Affinitätschromatographie unter Verwendung des anti-Flag-Antikörpers [Proc Natl Acad Sci USA 86, 8227 (1989); Genes Develop 4, 1288 (1990)] zu reinigen. Das Protein kann ebenfalls durch eine Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Protein gereinigt werden.
Ein Protein, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann ebenfalls durch Verfahren der chemische Synthese wie z. B. das Fmoc-Verfahren (das Fluorenylmethyloxycarbonyl-Verfahren) und das tBoc-Verfahren (das t-Butyloxycarbonyl-Verfahren) auf der Grundlage der Sequenzinformation der Aminosäure des Proteins, das vorstehend erhalten wurde, hergestellt werden. Des weiteren kann ein Protein der vorliegenden Erfindung durch die Verwendung eines Peptid-Synthesegeräts von Advanced ChemTech, Perkin-Elmer, Pharmacia, Protein Technology instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimadzu Corporation, etc. chemisch synthetisiert werden.
(iii) Verfahren für die Herstellung eines Dipeptids der vorliegenden Erfindung
(i) Enzymatisches Verfahren
Ein Beispiel des enzymatischen Verfahrens für die Herstellung eines anderen Dipeptids als L-Ala-L-Ala ist ein Verfahren, umfassend: das Halten eines Proteins, das hierin beschrieben wird, von mindestens zwei L-Aminosäuren, die gleich oder unterschiedlich sein können, und von ATP in einem wässrigen Medium; das Zulassen, dass sich das Dipeptid bildet und im Medium anreichert; und das Gewinnen des Dipeptids aus dem Medium.
Mindestens zwei Aminosäuren, vorzugsweise eine oder zwei Arten von Aminosäuren, die als Substrate in dem vorstehenden Verfahren verwendet werden, werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus L-Aminosäuren, Glycin (Gly) und β-Alanin (β-Ala) besteht, und können in jeder Kombination, außer für die Verwendung von L-Alanin als eine Art von Aminosäure verwendet werden. Beispiele von L-Aminosäuren sind L-Alanin (L-Ala), L-Glutamin (L-Gln), L-Glutaminsäure (L-Glu), L-Valin (L-Val), L-Leucin (L-Leu), L-Isoleucin (L-Ile), L-Prolin (L-Pro), L-Phenylalanin (L-Phe), L-Tryptophan (L-Trp), L-Methionin (L-Met), L-Serin (L-Ser), L-Threonin (L-Thr), L-Cystein (L-Cys), L-Asparagin (L-Asn), L-Tyrosin (L-Tyr); L-Lysin (L-Lys), L-Arginin (L-Arg), L-Histidin (L-His), L-Asparaginsäure (L-Asp), L-α-Aminobuttersäure (L-α-AB), L-Azaserin, L-Theanin, L-4-Hydroxyprolin (L-4-HYP), L-3-Hydroxyprolin (L-3-Hyp), L-Ornithin (L-Orn), L-Citrullin (L-Cit) und L-6-Diazo-5-oxo-norleucin.
Die Aminosäuren, die in dem vorstehenden Verfahren stärker bevorzugt werden, schließen die Nachfolgenden ein: eine Kombination von einer Art der Aminosäure, die von der Gruppe ausgewählt wird, die aus L-Ala, Gly, L-Met, L-Ser, L-Thr und β-Ala besteht, und einer Art von Aminosäure, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus L-Ala, L-Gln, L-Glu, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser; L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, L-α-AB, β-Ala, L-Azaserin, L- Theanin, L-4-Hyp, L-3-Hyp, L-Orn, L-Cit und L-6-Diazo-5-oxo-norleucin besteht (mit Ausnahme der Kombination von L-Ala und L-Ala); eine Kombination von L-Gln und L-Phe; und eine Kombination von L-α-AB und L-Gln, L-Arg oder L-α-AB. Weitere bevorzugte Aminosäuren sind: eine Kombination von L-Ala und einer Art von Aminosäure, die von der Gruppe ausgewählt wird, die aus L-Gln, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-α-AB, L-Azaserin, L-Cit und L-Theanin besteht; eine Kombination von Gly und einer Art von Aminosäure, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus L-Gln, Gly, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-α-AB und L-Cit besteht; eine Kombination von L-Met und einer Art von Aminosäure, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus L-Phe, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Tyr, L-Lys und L-His besteht; eine Kombination von L-Ser und einer Art von Aminosäure, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus L-Gln, L-Phe, L-Ser, L-Thr, L-Tyr, L-His und L-α-AB besteht; eine Kombination von L-Thr und einer Art von Aminosäure, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus L-Gln, L-Phe, L-Leu, L-Thr und L-α-AB besteht; eine Kombination von L-Gln und L-Phe; eine Kombination von β-Ala und einer Art von Aminosäure, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus L-Phe, L-Met, L-His und L-Cit besteht, und eine Kombination von L-α-AB und L-Gln, L-Arg oder L-α-AB.
In dem vorstehenden Verfahren wird ein Protein der vorliegenden Erfindung in einer Menge von 0,01 bis 100 mg, vorzugsweise 0,1 bis 10 mg pro mg der als ein Substrat verwendeten Aminosäure zugegeben.
In dem vorstehenden Verfahren wird die Aminosäure, die als ein Substrat verwendet wird, zu dem wässrigen Medium am Anfang oder im Verlauf der Reaktion zugegeben, um eine Konzentration von 0,1 bis 500 g/l, vorzugsweise 0,2 bis 200 g/l zu erhalten.
In dem vorstehenden Verfahren wird ATP, das als eine Energiequelle verwendet wird, mit einer Endkonzentration von 0,5 mMol bis 10 Mol/l verwendet.
Das wässrige Medium, das in dem vorstehenden Verfahren verwendet wird, kann jede Komponente umfassen und kann jede Zusammensetzung besitzen, solange die Dipeptid-bildende Reaktion nicht gehemmt wird. Geeignete wässrige Medien schließen Wasser und Puffer wie z. B. Phosphatpuffer, Carbonatpuffer, Acetatpuffer, Boratpuffer, Citratpuffer und Trispuffer ein. Das wässrige Medium kann Alkohole wie z. B. Methanol und Ethanol, Ester wie z. B. Ethylacetat, Ketone wie z. B. Aceton und Amide wie z. B. Acetamid umfassen.
Die Dipeptid-bildende Reaktion wird im wässrigen Medium bei einem pH-Wert von 5 bis 11, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6 bis 10, bei 20 bis 50°C, vorzugsweise bei 25 bis 45°C, für 2 bis 150 Stunden, vorzugsweise für 6 bis 120 Stunden durchgeführt.
Die Dipeptide, die in dem vorstehenden Verfahren hergestellt werden, schließen die Dipeptide ein, die durch die Formel (I) dargestellt werden, d. h. R¹-R². Bevorzugte Dipeptide sind solche, die durch die Formel (I) dargestellt werden, wobei R¹ und R², die gleich oder verschieden sein können, jeweils eine Aminosäure darstellen, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus L-Ala, L-Gln, L-Glu, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr; L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, L-α-AB, β-Ala, L-Azaserin, L-Theanin, L-4-HYP, L-3-HYP, L-Orn, L-Cit und L-6-Diazo-5-oxo-norleucin (mit der Ausnahme, dass sowohl R¹ als auch R² zur gleichen Zeit L-Ala sind) besteht. Stärker bevorzugt werden Dipeptide, bei denen R¹ L-Ala, Gly, L-Met, L-Ser, L-Thr oder β-Ala ist und R² L-Gln, L-Glu, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser; L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, L-α-AB, β-Ala, L-Azaserin, L-Theanin, L-4-HYP, L-3-HYP, L-Orn, L-Cit oder L-6-Diazo-5-oxo-norleucin ist. Weitere bevorzugte Dipeptide sind: Dipeptide, bei denen R¹ L-Ala ist und R² L-Gln, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-α-AB, L-Azaserin und L-Theanin oder L-Cit ist; Dipeptide bei denen R¹ Gly ist und R² L-Gln, Gly, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-α-AB oder L-Cit ist; Dipeptide, bei denen R¹ L-Met ist und R² L-Phe, L-Met, L-Cys, L-Tyr, L-Lys oder L-His ist; Dipeptide, bei denen R¹ L-Ser ist und R² L-Gln, Gly, L-Phe, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Tyr, L-His und L-α-AB ist; Dipeptide, bei denen R¹ L-Thr ist und R² L-Gln, L-Leu, L-Phe, L-Met, L-Ser, L-Thr oder L-α-AB ist; Dipeptide, bei denen R¹ L-Gln ist und R² L-Phe oder L-α-AB ist; ein Dipeptid, bei dem R¹ L-Phe ist und R² L-Gln ist, ein Dipeptid, bei dem R¹ L-Trp ist und R² Gly ist; Dipeptide, bei denen R¹ L-Cys ist und R² L-Ala, L-Gln, Gly oder L-Met ist; Dipeptide, bei denen R¹ L-Lys ist und R² L-Ala, Gly oder L-Met ist; Dipeptide, bei denen R¹ β-Ala ist und R² L-Phe, L-Met oder L-His ist; ein Dipeptid, bei dem R¹ L-Arg ist und R² L-α-AB ist, ein Dipeptid, bei dem R¹ L-His ist und R² L-Met ist; und Dipeptide, bei denen R¹ L-α-AB ist und R² L-Ala, L-Gln, Gly, L-Ser, L-Thr, L-Arg oder L-α-AB ist.
(2) Verfahren, das eine Kultur einer Transformante oder eines Mikroorganismus oder ein behandeltes Material der Kultur als eine Enzymquelle verwendet
Ein Beispiel des Verfahrens für die Herstellung eines anderen Dipeptids als L-Ala-L-Ala, das eine Kultur einer Transformante oder eines Mikroorganismus oder ein behandeltes Material der Kultur als eine Enzymquelle verwendet, ist ein Verfahren, das umfasst: das Halten einer Enzymquelle und von mindestens zwei L-Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, in einem wässrigen Medium, wobei die Enzymquelle eine Kultur einer Transformante, welche die Fähigkeit besitzt, ein Protein der vorliegenden Erfindung herzustellen, oder eines Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, ein Protein, das hierin beschrieben wird, herzustellen, oder behandeltes Material der Kultur ist; das Zulassen, dass sich ein anderes Dipeptid als L-Ala-L-Ala, das durch die Formel (I) dargestellt wird, bildet und im Medium anreichert; und das Gewinnen des Dipeptids aus dem Medium.
Die Transformanten, die in dem vorstehenden Verfahren nützlich sind, schließen die Transformanten ein, die ein Protein herstellen, das hierin beschrieben wird und das durch das vorstehende Verfahren (ii) hergestellt werden kann. Als die Wirte der Transformanten können Bakterien, Hefe, Tierzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen etc. verwendet werden. Bevorzugte Wirte sind Bakterien, unter denen Mikroorganismen stärker bevorzugt werden, die zu den Gattungen Escherichia, Bacillus und Corynebacterium gehören.
Bevorzugte Mikroorganismen, die zu der Gattung Escherichia gehören, schließen solche ein, die zu Escherichia coli gehören; bevorzugte Mikroorganismen, die zu der Gattung Bacillus gehören, schließen solche ein, die zu Bacillus subtilis und Bacillus megaterium gehören; und bevorzugte Mikroorganismen, die zu der Gattung Corynebacterium gehören, schließen solche ein, die zu Corynebacterium glutamicum und Corynebacterium ammoniagenes gehören.
Die Mikroorganismen, die in dem vorstehenden Verfahren verwendet werden, können jeder Mikroorganismus sein, der die Fähigkeit besitzt, ein Protein herzustellen, das hierin beschrieben wird, aber es ist vorzugsweise ein Mikroorganismus, der zu der Gattung Bacillus gehört, stärker bevorzugt ein Mikroorganismus, der zu der Gattung Bacillus gehört und die Bacilysin synthetisierende Aktivität besitzt, weiter bevorzugt ein Mikroorganismus, der zu einer Art gehört, die von der Gruppe ausgewählt wird, die aus Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium und Bacillus pumilus besteht, und am stärksten bevorzugt ein Stamm, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Bacillus subtilis ATCC 15245, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus subtilis IAM 1213, Bacillus subtilis IAM 1107, Bacillus subtilis IAM 1214, Bacillus subtilis ATCC 9466, Bacillus subtilis IAM 1033, Bacillus subtilis ATCC 21555, Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 und Bacillus pumilus NRRL B-12025 besteht.
Die behandelten Materialien der Kultur schließen eine konzentrierte Kultur, eine getrocknete Kultur, Zellen, die durch Zentrifugation der Kultur erhalten werden, oder Produkte, die erhalten werden, indem die Zellen durch verschiedene Mittel wie z. B. Trocknung, Gefriertrocknung, Behandlung mit einem Tensid, Ultraschall, mechanische Reibung, Behandlung mit einem Lösungsmittel, enzymatische Behandlung, Proteinfraktionierung und -immobilisierung behandelt werden, oder ein Enzympräparat, das durch Extrahieren der Zellen erhalten wird, etc., ein.
In dem vorstehenden Verfahren sind die Arten der Aminosäuren, die als Substrate verwendet werden, ihre Konzentrationen, der Zeitpunkt ihrer Zugabe und die hergestellten Dipeptide ähnlich zu solchen, die in dem enzymatischen Verfahren hergestellt werden, das vorstehend unter (iii) (1) beschrieben wird.
In dem Verfahren, das eine Kultur eines Mikroorganismus oder ein behandeltes Material der Kultur als eine Enzymquelle verwendet, kann die Kultur der Transformante oder des Mikroorganismus, die als Enzymquelle verwendet wird, ebenfalls als das wässrige Medium zusätzlich zu den wässrigen Medien verwendet werden, die in dem enzymatischen Verfahren verwendet werden, das vorstehend unter (iii) (1) beschrieben wird.
In dem vorstehenden Verfahren können ATP oder Verbindungen, die durch die Transformante oder durch den Mikroorganismus metabolisiert werden können, um ATP herzustellen, zum Beispiel Zucker wie z. B. Glucose, Alkohole wie z. B. Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure als ATP-Quelle zu dem wässrigen Medium gemäß dem Bedarf zugegeben werden.
Falls es notwendig ist, kann des weiteren ein Tensid oder ein organisches Lösungsmittel zu dem wässrigen Medium zugegeben werden. Jedes grenzflächenaktivierende Mittel, das die Bildung eines Dipeptids fördert, kann verwendet werden. Geeignete Tenside schließen nichtionische Tenside wie z. B. Polyoxyethylenoctadecylamin (z. B. Nymeen S-215, NOF Corporation), kationische Tenside wie z. B. Cetyltrimethylammoniumbromid und Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid (z. B. Cation F2-40E, NOF Corporation), anionische Tenside wie z. B. Lauroylsarcosinat und tertiäre Amine wie z. B. Alkyldimethylamin (z. B. Tertiary Amine FB, NOF Corporation) ein, die einzeln oder in Kombination verwendet werden können. Das Tensid wird im Allgemeinen bei einer Konzentration von 0,1 bis 50 g/l verwendet. Als das organische Lösungsmittel können Xylol, Toluol, aliphatische Alkohole, Aceton, Ethylacetat etc. im Allgemeinen bei einer Konzentration von 0,1 bis 50 ml/l verwendet werden.
Wenn die Kultur oder das behandelte Material der Kultur als die Enzymquelle verwendet wird, variiert die Menge der Enzymquelle, die zugegeben werden soll, gemäß ihrer spezifischen Aktivität etc., aber sie beträgt zum Beispiel 5 bis 1000 mg (Gewicht der feuchten Zellen), vorzugsweise 10 bis 400 mg pro mg der Aminosäure, die als ein Substrat verwendet wird.
Die Dipeptid-bildende Reaktion wird in dem wässrigen Medium bei einem pH-Wert von 5 bis 11, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6 bis 10, bei 20 bis 65°C, vorzugsweise bei 25 bis 55°C, stärker bevorzugt bei 30 bis 45°C, für 1 Minute bis 150 Stunden, vorzugsweise 3 Minuten bis 120 Stunden, stärker bevorzugt für 30 Minuten bis 100 Stunden durchgeführt.
In den Verfahren, die vorstehend unter (iii) (1) und (2) beschrieben werden, kann die Gewinnung des gebildeten und in dem wässrigen Medium angereicherten Dipeptids durch herkömmliche Verfahren unter Verwendung von aktivem Kohlenstoff, Ionen-Austausch-Harzen etc. oder durch Mittel wie z. B. die Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, die Kristallisation, die Dünnschichtchromatographie und die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie durchgeführt werden.
Bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in den nachfolgenden Beispielen dargestellt. Diese Beispiel dürfen nicht als eine Begrenzung des Umfangs der Erfindung ausgelegt werden.
BEISPIEL 1
Suche nach einem Protein, das die Dipeptid-synthetisierende Aktivität besitzt, unter Verwendung einer Datenbank.
Durch die Verwendung der Aminosäuresequenz des D-Ala-D-Ala-Ligase-Gens, das von Bacillus subtilis 168 abgeleitet ist [Nature 390, 249-256 (1997)], als eine Suchanfrage wurde eine Suche nach einem Gen durchgeführt, das ein Protein mit einer Ähnlichkeit codiert und das in den Sequenzen der genomischen DNA von Bacillus subtilis 168 vorhanden ist, wobei die Suchfunktion nach Ähnlichkeit von Subtilist (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/) verwendet wurde, welches eine Datenbank der genomischen DNA von Bacillus subtilis 168 ist.
Von den Sequenzen, die als ein Ergebnis der Suche erhalten wurden, wurden Gene ausgeschlossen, welche die Aminosäuresequenzen codieren, die in den SEQ ID NOs.: 33, 34 und 35 gezeigt werden, die Motive für die D-Ala-D-Ala-Ligase [Biochemistry 30, 1673 (1991)] sind und Proteine codieren, deren Funktion schon aufgeklärt wurden. Von den restlichen Sequenzen wurde die Sequenz, welche die höchste Ähnlichkeit (29,1%) mit dem Motiv der D-Ala-D-Ala-Ligase zeigte, als ein Gen ywfE mit einer unbekannten Funktion ausgewählt.
Die Nucleotidsequenz von ywfE wird in der SEQ ID NO.: 9 gezeigt und die Aminosäuresequenz des Proteins, das durch die Nucleotidsequenz codiert wird, wird in der SEQ ID NO.: 1 gezeigt.
BEISPIEL 2
Aufbau eines Stamms, der das Gen ywfE exprimiert
Auf der Grundlage der Information der Nucleotidsequenz, die in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde ein ywfE-Genfragment von Bacillus subtilis in der nachfolgenden Weise erhalten.
Das heißt, LB-Medium [10 g/l Bacto-tryptone (Difco), 5 g/l Hefeextrakt (Difco) und 5 g/l Natriumchlorid] wurden mit Bacillus subtilis 168 beimpft und für eine statische Kultur über Nacht bei 30°C verwendet. Nach der Kultur wurde die chromosomale DNA des Mikroorganismus gemäß dem Verfahren, das in Current Protocols in Molecular Biology beschrieben wird und gesättigtes Phenol verwendet, isoliert und gereinigt.
Durch die Verwendung eines DNA-Synthesegeräts (Modell 8905, PerSeptive Biosystems, Inc) wurden DNAs, welche die Nucleotidsequenzen besitzen, die in den SEQ ID NOs.: 19 bis 22 gezeigt werden (nachfolgend hierin als Primer A, Primer B, Primer C bzw. Primer D bezeichnet) synthetisiert. Primer A besitzt eine Sequenz, in der eine Nucleotidsequenz, welche die Erkennungsstelle für XhoI enthält, an das 5'-Ende einer Region der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis hinzugefügt ist, die das Initiationscodon von ywfE enthält. Primer B besitzt eine Sequenz, in der eine Nucleotidsequenz, die eine Erkennungsstelle für BamHI enthält, an das 5'-Ende einer Nucleotidsequenz hinzugefügt ist, die komplementär zu einer Sequenz ist, die das Terminierungscodon von ywfE enthält. Primer C besitzt eine Sequenz, in der eine Nucleotidsequenz, welche die Erkennungsstelle für EcoRI enthält, an das 5'-Ende der Nucleotidsequenz der Region des trp-Promotors des Expressionsvektors pTTS30 hinzugefügt ist, der den trp-Promotor enthält [hergestellt von Escherichia coli JM 109/pTrS30 (FERM BP-5407)]. Primer D besitzt eine Sequenz, in der eine Nucleotidsequenz, welche die Erkennungsstelle für XhoI enthält, an das 5'-Ende einer Sequenz hinzugefügt ist, die komplementär zu der Sequenz der Region des trp-Promotors des Expressionsvektors pTrS30 ist, der den trp-Promotor enthält.
Ein Genfragment von ywfE wurde durch PCR amplifiziert, wobei der vorstehende Primer A und der Primer B und als eine Matrize die chromosomale DNA von Bacillus subtilis verwendet wurde. Ein Fragment der Region des trp-Promotors wurde durch PCR amplifiziert, wobei der Primer C und der Primer D und als eine Matrize pTrS30 verwendet wurden. Die PCR wurde mit 30 Zyklen, wobei ein Zyklus aus der Reaktion bei 94°C für eine Minute, der Reaktion bei 55°C für 2 Minuten und der Reaktion bei 72°C für 3 Minuten bestand, unter Verwendung von 40 μl eines Reaktionsgemisches durchgeführt, das 0,1 μg der chromosomalen DNA oder 10 ng von pTrS30 als eine Matrize, 0,5 μMol/l von jedem der Primer, 2,5 Einheiten der DNA-Polymerase Pfu (Stratagene), 4 μl des Puffers für die DNA-Polymerase Pfu (10 x) (Stratagene) und 200 μMol/l von jedem der dNTPs (dATP, dGTP, dCTP und dTTP) umfasste.
Ein Zehntel von jedem der so erhaltenen Reaktionsgemische wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, um zu bestätigen, dass ein ca. 1,4 kb großes DNA-Fragment, das dem Fragment des ywfE-Gens entspricht, und ein ca. 0,3 kb großes DNA-Fragment, das dem Fragment der Region des trp-Promotors entspricht, bei der PCR amplifiziert wurden, wobei der Primer A und der Primer B verwendet wurden beziehungsweise der Primer C und der Primer D verwendet wurden. Anschließend wurde das übrig gebliebene Reaktionsgemisch mit einer gleichen Menge von Phenol/Chloroform (1 Vol./1 Vol.), gesättigt mit TE [10 mMol/l Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 1 mMol/l EDTA] gemischt. Die so erhaltene Lösung wurde zentrifugiert und die so erhaltene obere Schicht wurde mit einem zweifachen Volumen kaltem Ethanol gemischt und man ließ das Gemisch bei –80°C für 30 Minuten ruhen. Die so erhaltene Lösung wurde zentrifugiert, um die DNA zu präzipitieren, und die so erhaltene DNA wurde in 20 μl TE gelöst.
Die so erhaltenen Lösungen (jeweils 5 μl) wurden jeweils einer Reaktion unterworfen, um die DNA, die unter Verwendung des Primers A und des Primers B amplifiziert worden war, mit den Restriktionsenzymen XhoI und BamHI zu spalten, und sie wurden einer Reaktion unterworfen, um die DNA, die unter Verwendung des Primers C und des Primers D amplifiziert worden war, mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XhoI zu spalten. Die DNA-Fragmente wurden durch eine Agarosegelelektrophorese getrennt und ein 1,4 kb großes Fragment, das ywfE enthielt, bzw. ein 0,3 kb großes Fragment, das die Region des trp-Promotors enthielt, wurden gewonnen, wobei der GENECLEAN II Kit (BIO 101) verwendet wurde.
Der pTrs30 [ein trp-Promotor enthaltener Expressionsvektor, der von Escherichia coli JM109/pTrs30 [FERM BP-5407), 0,2 μg] hergestellt wurde, wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI gespalten. Die DNA-Fragmente wurden durch eine Agarosegelelektrophorese getrennt und ein 4,5 kb großes DNA-Fragment wurde in der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben wurde, gewonnen.
Das 1,4 kb große Fragment, das ywfE enthielt, das 0,3 kb große Fragment, das die Region des trp-Promotors enthielt, und das 4,5 kb große DNA-Fragment, das vorstehend erhalten wurde, wurde einer Reaktion zur Ligierung bei 16°C für 16 Stunden unterzogen, wobei ein Kit für die Ligierung (Takara Shuzo Co, Ltd) verwendet wurde.
Escherichia coli NM522 (Stratagene) wurde transformiert, wobei das Reaktionsgemisch gemäß dem Verfahren, das Calciumionen verwendet [Proc Natl Acad Sci USA 69, 2110 (1972)] verwendet wurde, auf LB-Agar-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, ausgebreitet und über Nacht bei 30°C kultiviert.
Ein Plasmid wurde aus einer Kolonie der Transformante, die auf dem Medium gewachsen war, gemäß einem bekannten Verfahren extrahiert und die Struktur des Plasmids wurde unter Verwendung von Restriktionsenzymen analysiert, wodurch bestätigt wurde, dass der Expressionsvektor pPE43, der ywfE enthielt, das stromabwärts des trp-Promotors ligiert war, erhalten wurde.
BEISPIEL 3
Herstellung eines Dipeptids
8 ml eines LB-Mediums, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, wurden in einem großen Probenröhrchen mit Escherichia coli NM522, der pPE43 enthielt (Escherichia coli NM522/pPE43) und in Beispiel 2 erhalten wurde, beimpft und bei 28°C für 17 Stunden kultiviert. Die so erhaltene Kultur wurde zentrifugiert, um feuchte Zellen zu erhalten
Ein Reaktionsgemisch (0,1 ml), das 60 mg/ml (Endkonzentration) feuchter Zellen, 120 mMol/l Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7,4), 60 mMol/l Magnesiumchlorid, 60 mMol/l ATP, 30 mMol/l L-Ala, 30 mMol/l L-Gln und 0,4% Nymeen S-215 umfasste, wurde hergestellt und die Reaktion wurde bei 37°C für 3 Minuten durchgeführt.
Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsprodukt durch das Dinitrophenol-Verfahren derivatisiert und anschließend durch HPLC analysiert. Die HPLC-Analyse wurde durchgeführt, wobei als eine Trennsäule die Lichrosorb-RP-18-Säule (Kanto Kagaku) und als ein Eluent 1% (Vol./Vol.) Phosphorsäure und 25% (Vol./Vol.) Acetonitril mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,7 ml/min verwendet wurde. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass 120 mg/l L-Alanyl-L-Glutamin (L-Ala-LGln) gebildet und in dem Reaktionsgemisch angereichert wurden.
Die Bildung von L-Ala-LGln wurde nicht beobachtet, wenn die Reaktion durchgeführt wurde, wobei Zellen von Escherichia coli NM522/pTrS31 verwendet wurden, der ein Kontrollstamm ist, der nur einen Vektor trägt.
BEISPIEL 4
Reinigung der am C-Ende mit einer His-Markierung versehenen rekombinanten Dipeptid-Synthetase
Durch die Verwendung des vorstehenden DNA-Synthesegeräts wurden DNAs, welche die Nucleotidsequenz besitzen, die in den SEQ ID NOs: 23 und 24 gezeigt werden (nachfolgend hierin als Primer E beziehungsweise Primer F bezeichnet), synthetisiert. Der Primer E besitzt eine Nucleotidsequenz, die eine Region enthält, in der das Initiationscodon von ywfE (atg) durch die Erkennungssequenz von NcoI (ccatgg) ersetzt ist. Der Primer F besitzt eine Nucleotidsequenz, die eine Region enthält, in der das Terminierungscodon von ywfE durch die Erkennungssequenz von BamHI (ggatcc) ersetzt ist.
Die PCR wurde durchgeführt, wobei die chromosomale DNA von Bacillus subtilis 168 (ATCC 23857) als eine Matrize und der vorstehende Primer E und Primer F als eine Gruppe von Primern verwendet wurden. Das heißt, die PCR wurde mit 30 Zyklen, wobei ein Zyklus aus der Reaktion bei 94°C für eine Minute, der Reaktion bei 55°C für 2 Minuten und der Reaktion bei 72°C für 3 Minuten bestand, unter Verwendung von 40 μl eines Reaktionsgemisches durchgeführt, das 0,1 μg der chromosomalen DNA, 0,5 μMol/l von jedem der Primer, 2,5 Einheiten der DNA-Polymerase Pfu, 4 μl des Puffers für die DNA-Polymerase Pfu (10 x) und 200 μMol/l von jedem der dNTPs umfasste.
Ein Zehntel des so erhaltenen Reaktionsgemisches wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, um zu bestätigen, dass ein ca. 1,4 kb großes Fragment, das dem ywfE-Fragment entsprach, amplifiziert wurde. Anschließend wurde das übrig gebliebene Reaktionsgemisch mit einer gleichen Menge von Phenol/Chloroform, gesättigt mit TE, gemischt. Die so erhaltene Lösung wurde zentrifugiert und die so erhaltene obere Schicht wurde mit einem zweifachen Volumen kaltem Ethanol gemischt und man ließ das Gemisch bei –80°C für 30 Minuten ruhen. Die so erhaltene Lösung wurde zentrifugiert und das so erhaltene DNA-Präzipitat wurde in 20 μl TE gelöst.
Die so erhaltene Lösung (5 μl) wurde einer Reaktion unterworfen, um die amplifizierte DNA mit den Restriktionsenzymen NcoI und BamHI zu spalten. Die DNA-Fragmente wurden durch eine Agarosegelelektrophorese getrennt und ein 1,4 kb großes DNA-Fragment, das ywfE enthielt, wurde gewonnen, wobei der GENECLEAN II Kit verwendet wurde.
Der am C-Ende mit einer His-Markierung versehene rekombinante Expressionsvektor pQE60 (Qiagen, Inc) (0,2 μg) wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und BamHI gespalten. Die DNA-Fragmente wurden durch eine Agarosegelelektrophorese getrennt und ein 3,4 kb großes DNA-Fragment wurde auf die gleiche Weise wie vorstehend gewonnen.
Das 1,4 kb große DNA-Fragment, das ywfE enthielt, und das 3,4 kb große DNA-Fragment, das vorstehend erhalten wurde, wurden einer Reaktion zur Ligierung bei 16°C für 16 Stunden unterworfen, wobei ein Kit für die Ligierung verwendet wurde.
Escherichia coli NM522 wurde transformiert, wobei das Reaktionsgemisch für die Ligierung gemäß dem Verfahren verwendet wurde, das Calciumionen verwendet, auf LB-Agar-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, ausgebreitet und über Nacht bei 30°C kultiviert.
Ein Plasmid wurde aus einer Kolonie der Transformante, die auf dem Medium gewachsen war, gemäß einem bekannten Verfahren extrahiert und die Struktur des Plasmids wurde unter Verwendung von Restriktionsenzymen analysiert, wodurch bestätigt wurde, dass der pQE60ywfE, der ein am C-Ende mit einer His-Markierung versehener ywfE-Expressionsvektor ist, erhalten wurde.
8 ml eines LB-Mediums, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, wurden in einem großen Probenröhrchen mit Escherichia coli NM522, der pQE60ywfE enthielt (Escherichia coli NM522/pQE60ywfE), beimpft und bei 28°C für 17 Stunden kultiviert. 50 ml eines LB-Mediums, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, wurden mit der so erhaltenen Kultur in einem 250 ml großen Erlenmeyer-Kolben beimpft und bei 30°C für 3 Stunden kultiviert. Anschließend wurde Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mMol/l zu erhalten, gefolgt von einer weiteren Kultivierung bei 30°C für 4 Stunden. Die so erhaltene Kultur wurde zentrifugiert, um feuchte Zellen zu erhalten, und ein mit einer His-Markierung versehenes rekombinantes Enzym wurde aus den feuchten Zellen gereinigt, wobei der HisTrap (His-tagged Protein Purifikation Kit, Amersham Pharmacia Biotech) gemäß den Anweisungen verwendet wurde, die darin beigefügt waren.
BEISPIEL 5
Herstellung eines Dipeptids unter Verwendung eines mit einer His-Markierung versehenen rekombinanten Enzyms (1)

(i) Ein Reaktionsgemisch (0,1 ml), das 0,04 mg des gereinigten mit einer His-Markierung versehenem Enzyms, das in Beispiel 4 erhalten wurde, 100 mMol/l Tris/HCl (pH-Wert 8,0), 60 mMol/l Magnesiumchlorid, 60 mMol/l ATP, 30 mMol/l L- Ala und 30 mMol/l L-Gln umfasste, wurde hergestellt und die Reaktion wurde bei 37°C für 16 Stunden durchgeführt. Nach der Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsprodukt in der gleichen Weise wie vorstehend in Beispiel 3 analysiert, wodurch bestätigt wurde, dass 3,7 g/l L-Ala-L-Gln und 0,3 g/l L-Alanyl-L-Alanin (L-Ala-L-Ala) gebildet und in dem Reaktionsgemisch angereichert wurden.
(ii) Die Reaktionen wurden unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend unter (i) durchgeführt, wobei Reaktionsgemische verwendet wurden, welche die gleiche Zusammensetzung wie die des Reaktionsgemisches hatten, wie vorstehend unter (i) beschrieben wurde, mit der Ausnahme, dass 0,01 mg des Enzyms verwendet wurden und dass L-Phe, L-Met, L-Leu beziehungsweise L-Val anstelle von L-Gln verwendet wurden. Nach der Beendigung der Reaktionen wurden die Reaktionsprodukte in der gleichen Weise wie vorstehend in Beispiel 3 analysiert, wodurch bestätigt wurde, dass die nachfolgenden Dipeptide gebildet und in den jeweiligen Reaktionsgemischen angereichert wurden: ausschließlich 7,0 g/l L-Alanyl-L-Phenylalanin (L-Ala-L-Phe); 7,0 g/l L-Alanyl-L-Methionin (L-Ala-L-Met) und 0,03 g/l L-Ala-L-Ala; 5,0 g/l L-Alanyl-L-Leucin (L-Ala-L-Leu) und 0,2 g/l L-Ala-L-Ala; und 1,6 g/l L-Alanyl-L-Valin (L-Ala-L-Val) und 0,3 g/l L-Ala-L-Ala.
(iii) Die Reaktionen wurden unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend unter (i) durchgeführt, wobei Reaktionsgemische verwendet wurden, welche die gleiche Zusammensetzung wie die des Reaktionsgemisches hatten, wie vorstehend unter (i) beschrieben wurde, mit der Ausnahme, dass 0,01 mg des Enzyms verwendet wurden und dass Gly anstelle von L-Ala verwendet wurde und L-Phe beziehungsweise L-Met anstelle von L-Gln verwendet wurden.

Nach der Beendigung der Reaktionen wurden die Reaktionsprodukte in der gleichen Weise wie vorstehend in Beispiel 3 analysiert, wodurch bestätigt wurde, dass 5,2 g/l Glycyl-L-Phenylalanin (Gly-L-Phe) und 1,1 g/l Glycyl-L-Methionin (Gly-L-Met) gebildet und in den jeweiligen Reaktionsgemischen angereichert wurden.
Wenn ATP von den Zusammensetzungen der vorstehenden Reaktionsgemische ausgeschlossen wurde, wurde kein Dipeptid gebildet.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigten, dass das Genprodukt ywfE die Aktivität besitzt, in Anwesenheit von ATP die nachfolgenden Dipeptide herzustellen: L-Ala-L-Gln plus L-Ala-L-Ala, L-Ala-L-Phe, L-Ala-L-Met plus L-Ala-L-Ala, L-Ala-L-Leu plus L-Ala-L-Ala oder L-Ala-L-Val plus L-Ala-L-Ala von L-Ala plus L-Gln, L-Phe, L-Met, L-Leu oder L-Val; und Gly-L-Phe oder Gly-L-Met von Gly plus L-Phe oder L-Met.
BEISPIEL 6
Herstellung eines Dipeptids unter Verwendung eines mit einer His-Markierung versehenen rekombinanten Enzyms (2)
Ein Reaktionsgemisch (0,1 ml), das 0,04 mg des gereinigten, mit einer His-Markierung versehenen rekombinanten Enzyms, das in Beispiel 4 erhalten wurde, 100 mMol/l Tris/HCl (pH-Wert 8,0), 60 mMol/l Magnesiumchlorid und 60 mMol/l ATP unfasste, wurde hergestellt. Zu diesem Gemisch wurden entsprechend Kombinationen von L-Aminosäuren, Gly oder β-Ala, die in der ersten Zeile von Tabelle 1 gezeigt werden, und von L-Aminosäuren, Gly oder β-Ala, die in der äußersten linken Spalte von Tabelle 1 gezeigt werden, zugegeben, um eine Konzentration von jeweils 30 mMol/l zu ergeben, und die so erhaltenen Gemische wurden einer Reaktion bei 37°C für 16 Stunden unterzogen. Nach der Beendigung der Reaktionen wurden die Reaktionsprodukte durch HPLC analysiert, wodurch bestätigt wurde, dass die Dipeptide, die in Tabelle 1 gezeigt werden, gebildet wurden. Tabelle 1-1
Tabelle 1-2
Tabelle 1-3
Die Dipeptide, die durch die Reaktion gebildet wurden, welche als Substrate zwei Arten (oder eine Art) von L-Aminosäuren, Gly oder β-Ala verwendeten, die in der ersten Reihe und in der äußersten linken Spalte von Tabelle 1 gezeigt werden, werden in der jeweiligen Zelle der Tabelle gezeigt. In der Tabelle bedeutet O, dass ein Dipeptid gebildet wurde, obwohl seine Sequenz nicht identifiziert wurde; X bedeutet, dass die Bildung eines Dipeptids nicht bestätigt wurde; und ein Leerzeichen bedeutet, dass die Reaktion nicht durchgeführt wurde.
BEISPIEL 7
Herstellung eines Dipeptids unter Verwendung des Stamms, der das mit einer His-Markierung versehene rekombinante Enzym exprimiert
8 ml eines LB-Mediums, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, wurden in einem großen Probenröhrchen mit Escherichia coli NM522/pQE60ywfE, das in Beispiel 4 erhalten wurde, beimpft und bei 28°C für 17 Stunden kultiviert. 50 ml eines LB-Mediums, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, wurden mit der so erhaltenen Kultur in einem 250 ml großen Erlenmeyer-Kolben beimpft und bei 30°C für 3 Stunden kultiviert. Anschließend wurde Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mMol/l zu erhalten, gefolgt von einer weiteren Kultivierung bei 30°C für 4 Stunden. Die so erhaltene Kultur wurde zentrifugiert, um feuchte Zellen zu erhalten
Ein Reaktionsgemisch (20 ml, pH-Wert 7,2), das 200 g/l feuchte Zellen, 50 g/l Glucose, 5 g/l Phytinsäure (mit 33% konz. Natriumhydroxid-Lösung bis zur Neutralität verdünnt), 15 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 5 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat, 4 g/l Nymeen S-215, 10 ml/l Xylol, 200 mMol/l L-Ala und 200 mMol/l L-Gln umfasste, wurde in ein 50 ml großes Becherglas gegeben und die Reaktion wurde bei 32°C bei 900 UpM für 2 Stunden durchgeführt. Während der Reaktion wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches bei 7,2 durch die Verwendung von 2 Mol/l Kaliumhydroxid erhalten.
Das Reaktionsprodukt wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 3 analysiert, wodurch bestätigt wurde, dass sich 25 mg/l L-Ala-L-Gln anreicherten.
BEISPIEL 8
Clonierung von Genen, die dem ywfE-Gen von verschiedenen Mikroorganismen der Gattung Bacillus entsprechen, und die Analyse davon
Auf der Grundlage der Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID No.: 9 gezeigt wird, wurden Gene, die dem ywfE-Gen entsprachen, das in Bacillus subtilis ATCC 15245, ATCC 6633, IAM 1213, IAM 1107, IAM 1214, ATCC 9466, IAM 1033 und ATCC 21555, Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 und Bacillus pumilus NRRL B-12025 vorkommt, in der nachfolgenden Weise erhalten.
Das heißt, LB-Medium wurde mit Bacillus subtilis ATCC 15245, ATCC 6633, IAM 1213, IAM 1107, IAM 1214, ATCC 9466, IAM 1033 und ATCC 21555, Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 bzw. Bacillus pumilus NRRL B-12025 beimpft und einer statischen Kultur über Nacht bei 30°C unterzogen. Nach der Kultur wurden die chromosomalen DNAs der jeweiligen Mikroorganismen unter Verwendung von gesättigtem Phenol gemäß dem Verfahren, das in Current Protocols in Molecular Biology beschrieben wurde, isoliert und gereinigt.
Durch die Verwendung eines DNA-Synthesegeräts (Modell 8905, PerSeptive Biosystems, Inc) wurden DNAs, welche die Nucleotidsequenzen besitzen, die in den SEQ ID NOs.: 25 und 26 beschrieben werden (nachfolgend hierin als Primer G bzw. Primer H bezeichnet) synthetisiert. Primer G besitzt eine Sequenz, die eine Region stromaufwärts des Initiationscodons von ywfE der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis enthält, und Primer H besitzt eine Sequenz, die komplementär zu einer Sequenz ist, die eine Region stromabwärts des Terminationscodons von ywfE enthält.
Die PCR wurde durchgeführt, wobei jede der chromosomalen DNAs von Bacillus subtilis ATCC 15245, ATCC 6633, IAM 1213, IAM 1107, IAM 1214, ATCC 9466, IAM 1033 und ATCC 21555 und Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 als eine Matrize und der vorstehende Primer G und der Primer H als eine Gruppe von Primern verwendet wurde. Das heißt, die PCR wurde mit 30 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus aus der Reaktion bei 94°C für eine Minute, der Reaktion bei 55°C für 2 Minuten und der Reaktion bei 72°C für 3 Minuten unter Verwendung von 40 μl eines Reaktionsgemisches, das 0,1 μg der chromosomalen DNA, 0,5 μMol/l von jedem der Primer, 2,5 Einheiten der DNA-Polymerase Pfu, 4 μl des Puffers für die DNA- Polymerase Pfu (10 x) und 200 μMol/l von jedem der dNTPs umfasste, aufgebaut war.
Ein Zehntel von jedem der so erhaltenen Reaktionsgemische wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, um zu bestätigen, dass ein ca. 1,4 kb großes Fragment, das dem ywfE-Fragment entsprach, amplifiziert wurde. Anschließend wurde das übrig gebliebene Reaktionsgemisch mit einer gleichen Menge von Phenol/Chloroform, das mit TE gesättigt war, gemischt. Die so erhaltene Lösung wurde zentrifugiert und die so erhaltene obere Schicht wurde mit einem zweifachen Volumen kaltem Ethanol gemischt und man ließ das Gemisch bei –80°C für 30 Minuten ruhen. Die so erhaltene Lösung wurde zentrifugiert und das so erhaltene DNA-Präzipitat wurde in 20 μl TE gelöst.
Jedes der so erhaltenen 1,4 kb großen DNA-Fragmente, die von den chromosomalen DNAs der jeweiligen Stämme abgeleitet war, und pCR-blunt (Invitrogen Corp) wurden einer Ligierungs-Reaktion unterworfen, wobei ein Kit für die Ligierung bei 16°C für 16 Stunden verwendet wurde.
Escherichia coli NM522 wurde unter Verwendung von jedem Ligierungs-Reaktionsgemisch gemäß dem Verfahren, das Calciumionen verwendet, transformiert, auf LB-Agar-Medium ausgebreitet, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, und über Nacht bei 30°C kultiviert.
Ein Plasmid wurde aus einer Kolonie von jeder Transformante, die auf dem Medium gewachsen war, gemäß einem bekannten Verfahren extrahiert und die Struktur jedes Plasmids wurde unter Verwendung von Restriktionsenzymen analysiert. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass die nachfolgenden Plasmide erhalten wurden, die ein Gen enthielten, das dem ywfE-Gen entsprach: pYWFE1 (abgeleitet von ATCC 15245 (SEQ ID NO.: 36)), pYWFE2 (abgeleitet von ATCC 6633 (SEQ ID NO.: 10)), pYWFE3 (abgeleitet von IAM 1213 (SEQ ID NO.: 11)), pYWFE4 (abgeleitet von IAM 1107 (SEQ ID NO.: 12)), pYWFE5 (abgeleitet von IAM 1214 (SEQ ID NO.: 13)), pYWFE6 (abgeleitet von ATCC 9466), pYWFE7 (abgeleitet von IAM 1033 (SEQ ID NO.: 36)), pYWFE8 (abgeleitet von ATCC 21555 (SEQ ID NO.: 14)) und pYWFE9 (abgeleitet von IFO 3022 (SEQ ID NO.: 15)).
Andererseits wurde ein Gen, das dem ywfE-Gen entsprach, das von Bacillus pumilus NRRL B-12025 (SEQ ID NO.: 16) abgeleitet war, in der nachfolgenden Weise erhalten.
Die PCR wurde durchgeführt, wobei die chromosomale DNA des Stamms NRRL B-12025, die vorstehend hergestellt wurde, als eine Matrize und die DNAs, die aus den Nucleotidsequenzen bestanden, die in SEQ ID NOs: 27 beziehungsweise 28 gezeigt werden, als eine Gruppe von Primern verwendet wurden. Das heißt, die PCR wurde mit 30 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus aus der Reaktion bei 98°C für 5 Sekunden, der Reaktion bei 55°C für 30 Sekunden und der Reaktion bei 72°C für 1 Minute aufgebaut war, wobei 50 μl eines Reaktionsgemisches verwendet wurden, das 0,1 μg der chromosomalen DNA, 0,5 μMol/l von jedem der Primer, 2,5 Einheiten der Polymerase Z-taq (Takara Shuzo Co, Ltd), 5 μl des Puffers für die Polymerase Z-taq (10 x) (Takara Shuzo Co, Ltd) und 200 μMol/l von jedem der dNTPs umfasste.
Ein Zehntel des so erhaltenen Reaktionsgemisches wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, um zu bestätigen, dass ein ca. 0,8 kb großes Fragment amplifiziert wurde. Anschließend wurde das übrig gebliebene Reaktionsgemisch mit einer gleichen Menge von Phenol/Chloroform, das mit TE gesättigt war, gemischt. Das so erhaltene Gemisch wurde zentrifugiert und die so erhaltene obere Schicht wurde mit einem zweifachen Volumen kaltem Ethanol gemischt und man ließ das Gemisch bei –80°C für 30 Minuten ruhen. Die so erhaltene Lösung wurde zentrifugiert und das so erhaltene DNA-Präzipitat wurde in 20 μl TE gelöst.
Das so erhaltene 0,8 kb große Fragment, das von der chromosomalen DNA abgeleitet war, und der pGEM T-easy (Promega Corp) wurden einer Ligierungs-Reaktion unterworfen, wobei ein Kit für die Ligierung bei 16°C für 16 Stunden verwendet wurde.
Escherichia coli DH5α wurde unter Verwendung des Reaktionsgemisches gemäß dem Verfahren, das Calciumionen verwendet, transformiert, auf LB-Agar-Medium ausgebreitet, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, und über Nacht bei 30°C kultiviert.
Ein Plasmid wurde von der Transformante, die vorstehend erhalten wurde, extrahiert und die Nucleotidsequenz der ca. 0,8 kb großen DNA-Insertion wurde bestimmt, wobei eine Sequenz der Nucleotide 358 bis 1160 in der Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NO.: 16 gezeigt wird, bestätigt wurde.
Das vorstehende Plasmid wurde mit EcoRI gespalten und anschließend einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment abzutrennen. Das DNA-Fragment wurde unter Verwendung des GENECLEAN II-Kits gereinigt und etwa 0,5 μg des gereinigten DNA-Fragments wurde mit einer DIG-Markierung versehen, wobei der DIG-HIGH Prime DNA Labeling & Detection Starter Kit I (Roche Diagnostics Corp) gemäß den Anleitungen, die darin beigefügt waren, verwendet wurde.
Eine Southern-Blot-Analyse der chromosomalen DNA des NRRL B-12025-Stamms wurde durchgeführt, wobei die mit DIG markierte DNA, die vorstehend erhalten wurde, verwendet wurde.
Die chromosomale DNA des Stamms NRRL B-12025 wurde vollständig mit BamHI, EcoRI, HindIII, KpnI, PstI, SacI, SalI oder beziehungsweise SphI gespalten und einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, um die DNA-Fragmente zu trennen, gefolgt von einem Transfer auf eine Nylonmembran plus Ladung (Roche Diagnostics Corp) gemäß einem herkömmlichen Verfahren.
Nachdem die DNA-Fragmente auf der Nylonmembran durch UV-Bestrahlung fixiert worden waren, wurde eine Southern-Blot-Hybridisierung durchgeführt, wobei die vorstehende DNA-Sonde und die Nylonmembran verwendet wurden. Die Hybridisierung wurde durchgeführt, indem die Nylonmembran mit der DNA-Sonde bei 65°C für 16 Stunden in Kontakt gebracht wurde, die Nylonmembran zweimal mit einer Lösung, die aus 0,1% SDS und 2 × SSC bestand, bei Raumtemperatur für 5 Minuten gewaschen wurde und die Membran des weiteren zweimal mit einer Lösung, die aus 0,1% SDS und 0,5 × SSC bestand, bei 65°C für 15 Minuten gewaschen wurde. Die anderen Durchführungen und Bedingungen und der Nachweis der hybridisierten DNA wurden gemäß den Anleitungen durchgeführt, die dem vorstehend erwähnten DIG-High Prime DNA Labeling & Detection Starter Kit I beigefügt waren.
Als ein Ergebnis wurde eine Farbentwicklung bei etwa 3,5 kbp der Fragmente, die vollständig mit HindIII und PstI gespalten wurden, beobachtet.
Anschließend wurde die chromosomale DNA des Stamms NRRL B-12025 vollständig mit HindIII beziehungsweise mit PstI gespalten und einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, um die DNA-Fragmente zu trennen. Von den jeweiligen DNAs, die mit dem Restriktionsenzym gespalten wurden, wurden 3–4 kbp große Fragmente unter Verwendung des GENECLEAN II-Kits gereinigt, gefolgt von einer Autozyklisierung unter Verwendung eines Kits für die Ligierung.
Auf der Grundlage der Nucleotidsequenz des 0,8 kb großen DNA-Fragments, das vorstehend bestimmt wurde, wurden die Nucleotidsequenzen entwickelt und synthetisiert, die in den SEQ ID NOs.: 29 und 30 gezeigt werden, und sie wurden in einer PCR als Primer verwendet, wobei die zyklisierte DNA, die vorstehend erhalten wurde, als eine Matrize erhalten wurde. Die PCR wurde mit 30 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus aus der Reaktion bei 98°C für 5 Sekunden, der Reaktion bei 55°C für 30 Sekunden und der Reaktion bei 72°C für 3 Minuten und 30 Sekunden aufgebaut war, wobei 50 μl eines Reaktionsgemisches verwendet wurden, das 10 ng der zyklisierten DNA, 0,5 μMol/l von jedem der Primer, 2,5 Einheiten der Polymerase Pyrobest (Takara Shuzo Co, Ltd), 5 μl des Puffers für die Polymerase Pyrobest (10 x) (Takara Shuzo Co, Ltd) und 200 μMol/l von jedem der dNTPs umfasste.
Ein Zehntel des so erhaltenen Reaktionsgemisches wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, um zu bestätigen, dass ein ca. 3,0 kb großes Fragment amplifiziert wurde. Anschließend wurde das übrig gebliebene Reaktionsgemisch mit einer gleichen Menge von Phenol/Chloroform, das mit TE gesättigt war, gemischt. Das so erhaltene Gemisch wurde zentrifugiert und die so erhaltene obere Schicht wurde mit einem zweifachen Volumen kaltem Ethanol gemischt und man ließ das Gemisch bei –80°C für 30 Minuten ruhen. Die so erhaltene Lösung wurde zentrifugiert und das so erhaltene DNA-Präzipitat wurde in 20 μl TE gelöst.
Das so erhaltene DNA-Fragment und der Zero Blunt PCR Cloning Kit (Invitrogen Corp) wurden einer Ligierungs-Reaktion unterworfen, wobei ein Kit für die Ligierung verwendet wurde.
Escherichia coli NM522 wurde unter Verwendung des Reaktionsgemisches gemäß dem Verfahren, das Calciumionen verwendet, transformiert, auf LB-Agar-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, ausgebreitet und über Nacht bei 30°C kultiviert.
Ein Plasmid wurde aus einer Kolonie der Transformante, die auf dem Medium gewachsen war, gemäß einem bekannten Verfahren extrahiert und die Struktur des Plasmids wurde unter Verwendung von Restriktionsenzymen analysiert. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass das Plasmid pYWFE10 (abgeleitet von NRRL B-12025), das ein Gen enthielt, das dem ywfE-Gen entsprach, erhalten wurde.
Die Nucleotidsequenzen des Gens, das dem ywfE-Gen entsprach, die jeweils in den Plasmiden pYEFE1 bis pYWFE10 enthalten waren, die vorstehend erhalten wurden, wurden bestimmt, wobei ein 373A-DNA-Sequenziergerät verwendet wurde.
Die Aminosäuresequenzen der Proteine, die durch die Gene codiert wurden, die in pYWFE1, pYWFE6 beziehungsweise pYWFE7 enthalten waren, waren identisch zu der Aminosäuresequenz des Proteins, das durch das ywfE-Gen codiert wurde, wohingegen solche der Proteine, die durch die Gene codiert wurden, die in pYWFE2, pYWFE3, pYWFE4, pYWFE5, pYWFE8, pYWFE9 beziehungsweise pYWFE10 enthalten waren, unterschiedlich zu der Aminosäuresequenz des Proteins waren, das durch das ywfE-Gen codiert wurde.
Die Aminosäuresequenzen der Proteine, die durch die Gene codiert wurden, die dem ywfE entsprachen, die in pYWFE2, pYWFE3, pYWFE4, pYWFE5, pYWFE8, pYWFE9, pYWFE10 und pYWFE1 und pYEFW7 enthalten waren, werden in den SEQ ID NOs.: 2 bis 8 beziehungsweise 1 gezeigt und die Nucleotidsequenzen dieser Gene werden in den SEQ ID NOs.: 10 bis 16 beziehungsweise 36 gezeigt.
BEISPIEL 9
Reinigung der am C-Ende mit einer His-Markierung versehenden rekombinanten Dipeptid-Synthetase
Eine PCR wurde durchgeführt, wobei jede der chromosomalen DNAs von Bacillus subtilis ATCC 15245, ATCC 6633, IAM 1213, IAM 1107, IAM 1214, ATCC 9466, IAM 1033 und ATCC 21555 und Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 als eine Matrize und der Primer A und der Primer B, die in dem Beispiel 2 beschrieben wurden, als eine Gruppe von Primern verwendet wurden. Das heißt, die PCR wurde mit 30 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus aus der Reaktion bei 94°C für eine Minute, der Reaktion bei 55°C für 2 Minuten und der Reaktion bei 72°C für 3 Minuten aufgebaut war, wobei 40 μl eines Reaktionsgemisches verwendet wurden, das 0,1 μg der chromosomalen DNA, 0,5 μMol/l von jedem der Primer, 2,5 Einheiten der DNA-Polymerase Pfu, 4 μl des Puffers für die DNA-Polymerase Pfu (10 x) und 200 μMol/l von jedem der dNTPs umfasste.
Wenn die chromosomale DNA von Bacillus pumilus NRRL B-12025 als eine Matrize verwendet wurde, wurde die PCR durchgeführt, wobei die DNAs, welche die Nucleotidsequenzen besitzen, die in den SEQ ID NOs.: 31 beziehungsweise 32 gezeigt werden, als eine Gruppe von Primern unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend verwendet wurden.
Ein Zehntel der so erhaltenen Reaktionsgemische wurden einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, um zu bestätigen, dass ein ca. 1,4 kb großes DNA-Fragment, das dem ywfE-Fragment entsprach, amplifiziert wurde. Anschließend wurde das übrig gebliebene Reaktionsgemisch mit einer gleichen Menge von Phenol/Chloroform, das mit TE gesättigt war, gemischt. Das so erhaltene Gemisch wurde zentrifugiert und die so erhaltene obere Schicht wurde mit einem zweifachen Volumen kaltem Ethanol gemischt und man ließ das Gemisch bei –80°C für 30 Minuten ruhen. Die so erhaltene Lösung wurde zentrifugiert und das so erhaltene DNA-Präzipitat wurde in 20 μl TE gelöst.
Jede der so erhaltenen Lösungen (5 μl) wurde einer Reaktion unterworfen, um die amplifizierte DNA mit den Restriktionsenzymen NcoI und BamHI zu spalten. Die DNA-Fragmente wurden durch eine Agarosegelelektrophorese getrennt und ein 1,4 kb großes DNA-Fragment, das ein Gen enthielt, das dem ywfE entsprach, wurde gewonnen, wobei der GENECLEAN II-Kit verwendet wurde.
Anschließend wurden 0,2 μg des am C-Ende mit einer His-Markierung versehenen rekombinanten Expressionsvektors pQE60 mit den Restriktionsenzymen NcoI und BamHI gespalten. Die DNA-Fragmente wurde durch eine Agarosegelelektrophorese getrennt und ein 3,4 kb großes DNA-Fragment wurde auf die gleiche Weise, wie vorstehend beschrieben wurde, gewonnen.
Jedes der 1,4 kb großen DNA-Fragmente, die ein Gen enthielten, das dem ywfE von Bacillus subtilis 168 entsprach, und das 3,4 kb große DNA-Fragment, das vorstehend erhalten wurde, wurden einer Ligierungs-Reaktion unterworfen, wobei ein Kit für die Ligierung bei 16°C für 16 Stunden verwendet wurde.
Escherichia coli NM522 wurde unter Verwendung der Ligierungs-Reaktionsgemische gemäß dem Verfahren transformiert, das Calciumionen verwendet, auf LB-Agar-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, ausgebreitet und über Nacht bei 30°C kultiviert.
Ein Plasmid wurde aus einer Kolonie von jeder Transformante, die auf dem Medium gewachsen war, gemäß einem bekannten Verfahren extrahiert und die Struktur von jedem Plasmid wurde unter Verwendung von Restriktionsenzymen analysiert. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass die nachfolgenden am C-Ende mit einer His-Markierung versehenen Gen-Expressionsvektoren, erhalten wurden: pQE60ywfE1 (ein Vektor, der das Gen enthält, das von ATCC 15245 abgeleitet wurde), pQE60ywfE2 (ein Vektor, der das Gen enthält, das von ATCC 6633 abgeleitet wurde), pQE60ywfE3 (ein Vektor, der das Gen enthält, das von IAM 1213 abgeleitet wurde), pQE60ywfE4 (ein Vektor, der das Gen enthält, das von IAM 1107 abgeleitet wurde), pQE60ywfE5 (ein Vektor, der das Gen enthält, das von IAM 1214 abgeleitet wurde), pQE60ywfE6 (ein Vektor, der das Gen enthält, das von ATCC 9466 abgeleitet wurde), pQE60ywfE7 (ein Vektor, der das Gen enthält, das von IAM 1033 abgeleitet wurde), pQE60ywfE8 (ein Vektor, der das Gen enthält, das von ATCC 21555 abgeleitet wurde), pQE60ywfE9 (ein Vektor, der das Gen enthält, das von IFO 3022 abgeleitet wurde) und pQE60ywfE10 (ein Vektor, der das Gen enthält, das von NRRL B-12025 abgeleitet wurde).
8 ml eines LB-Mediums, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, wurden in einem großen Probenröhrchen mit Escherichia coli NM522/pQE60ywfE1 bis NM522/pQE60ywfE10 beimpft und bei 28°C für 17 Stunden kultiviert. 50 ml eines LB-Mediums, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, wurden mit jeder der so erhaltenen Kulturen in einem 250 ml großen Erlenmeyer-Kolben beimpft und bei 30°C für 3 Stunden kultiviert. Anschließend wurde Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mMol/l zu erhalten, gefolgt von einer weiteren Kultivierung bei 30°C für 4 Stunden. Die so erhaltene Kultur wurde zentrifugiert, um feuchte Zellen zu erhalten, und mit einer His-Markierung versehene rekombinante Enzyme wurde aus den jeweiligen feuchten Zellen gereinigt, wobei HisTrap gemäß den Anweisungen, die beigefügt waren, verwendet wurde.
BEISPIEL 10
Herstellung von Dipeptiden unter Verwendung gereinigter Enzyme
Die Reaktionsgemische (jeweils 0,1 ml), die 0,04 mg der jeweiligen rekombinanten Enzyme, die in dem Beispiel 9 erhalten wurden, 100 mMol/l Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 60 mMol/l Magnesiumchlorid, 60 mMol/l ATP, 30 mMol/l L-Ala und 30 mMol/l L-Gln umfassten, wurden hergestellt und die Reaktionen wurden bei 37°C für 16 Stunden durchgeführt.
Nach der Beendigung der Reaktionen wurden die Reaktionsgemische durch das Verfahren analysiert, das in Beispiel 3 beschrieben wurde, wodurch bestätigt wurde, dass 3,0 bis 3,5 g/l L-Ala-L-Gln und 0,25 bis 0,3 g/l L-Ala-L-Ala gebildet und angereichert wurden.
Wenn das ATP von den Zusammensetzungen der vorstehenden Reaktionen ausgeschlossen wurde, wurde kein L-Ala-L-Gln oder L-Ala-L-Ala gebildet.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigten, dass jedes der Produkte der Gene, die in dem Beispiel 8 erhalten wurden, die Aktivität besitzen, L-Ala-L-Gln und L-Ala-L-Ala von L-Ala und L-Gln in der Gegenwart von ATP herzustellen.
SEQUENZPROTOKOLL, FREIER TEXT

SEQ ID NO.: 19 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Primer
SEQ ID NO.: 20 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Primer
SEQ ID NO.: 21 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Primer
SEQ ID NO.: 22 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Primer
SEQ ID NO.: 23 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Primer
SEQ ID NO.: 24 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Primer
SEQ ID NO.: 25 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Primer
SEQ ID NO.: 26 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Primer
SEQ ID NO.: 27 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Primer
SEQ ID NO.: 28 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Primer
SEQ ID NO.: 29 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Primer
SEQ ID NO.: 30 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Primer
SEQ ID NO.: 31 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Primer
SEQ ID NO.: 32 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Primer
SEQ ID NO.: 33 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Aminosäuresequenz, die in der Datenbanksuche verwendet wurde
SEQ ID NO.: 34 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Aminosäuresequenz, die in der Datenbanksuche verwendet wurde
SEQ ID NO.: 35 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Aminosäuresequenz, die in der Datenbanksuche verwendet wurde

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung eines anderen Dipeptids als L-Ala-L-Ala, umfassend: (a) Halten eines Proteins, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) einem Protein, das die in einer der SEQ ID NOs.: 2 bis 8 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, (ii) einem Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die 85% oder mehr Ähnlichkeit zu der in einer der SEQ ID NOs.: 1 bis 8 gezeigten Aminosäuresequenz zeigt, und Dipeptid-synthetisierende Aktivität hat, (iii) einem Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die 80% oder mehr Ähnlichkeit zu der in SEQ ID NO.: 17 gezeigten Aminosäuresequenz hat und Dipeptid-synthetisierende Aktivität hat von mindestens zwei L-Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, und von ATP in einem wässrigen Medium; (b) Zulassen, dass sich das Dipeptid bildet und im Medium anreichert; und (c) Gewinnen des Dipeptids aus dem Medium.
Verfahren zur Herstellung eines anderen Dipeptids als L-Ala-L-Ala, umfassend: (a) Halten einer Enzymquelle und von mindestens zwei L-Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, in einem wässrigen Medium, wobei die Enzymquelle eine Kultur oder behandeltes Material der Kultur ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) einer Kultur einer Transformante, die eine DNA trägt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (1) einer DNA, die das wie in Anspruch 1 definierte Protein codiert; (2) einer DNA, die die in einer der SEQ ID NOs.: 10 bis 16 und 36 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst; (3) einer DNA, die unter stringenten Bedingungen mit einer DNA hybridisiert, die die in einer der SEQ ID NOs.: 9 bis 16 und 36 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst und die ein Protein mit Dipeptid-synthetisierender Aktivität codiert; oder behandeltes Material der Kultur ist; und (ii) einer Kultur eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit, das wie in Anspruch 1 definierte Protein herzustellen oder behandeltes Material der Kultur; (b) Zulassen, dass sich das Dipeptid bildet und im Medium anreichert; und (c) Gewinnen des Dipeptids aus dem Medium.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Mikroorganismus ein Mikroorganismus ist, der zu der Gattung Bacillus gehört.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Mikroorganismus, der zu der Gattung Bacillus gehört, ein Mikroorganismus der Gattung Bacillus ist, mit der Fähigkeit Bacilysin herzustellen.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Mikroorganismus der Gattung Bacillus mit der Fähigkeit Bacilysin herzustellen, ein Mikroorganismus ist, der zu einer Art gehört, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium und Bacillus pumilus.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Mikroorganismus ein Mikroorganismus ist, der mit einer rekombinanten DNA transformiert ist, die eine DNA umfasst, die die in SEQ ID NO.: 9 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst, oder ein Mikroorganismus ist, der zu Bacillus subtilis gehört.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Mikroorganismus, der eine rekombinante DNA trägt, die eine DNA umfasst, die die in SEQ ID NO.: 9 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst, ein Mikroorganismus ist, der zu der Gattung Escherichia gehört.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei das behandelte Material der Kultur eine konzentrierte Kultur, eine getrocknete Kultur, Zellen, die durch Zentrifugieren der Kultur erhalten wurden, oder ein Produkt ist, das erhalten wird, indem die Zellen einer Trocknung, Gefriertrocknung, Behandlung mit einem Tensid, Ultraschall, mechanischer Reibung, Behandlung mit einem Lösungsmittel, enzymatischer Behandlung, Proteinfraktionierung oder -immobilisierung unterzogen werden, oder ein Enzympräparat ist, das durch Extrahieren der Zellen erhalten wird.
Verwendung eines wie in Anspruch 1 definierten Proteins, einer wie in Anspruch 2 definierten DNA oder einer Transformante, die die DNA trägt oder die Fähigkeit hat, das Protein herzustellen, zur Herstellung eines anderen Dipeptids als L-Ala-L-Ala.