DE60013299T2

DE60013299T2 - Phagenresistente mikroorganismen und genetische determinanten für phagenresistenz

Info

Publication number: DE60013299T2
Application number: DE60013299T
Authority: DE
Inventors: Giovanni Mogna; Paolo Strozzi; Simona Di Lorenzo; Vittorio Bottazzi; Maria L. Callegari; Lorenzo Morelli
Original assignee: Anidral SRL
Current assignee: Anidral SRL
Priority date: 1999-07-27
Filing date: 2000-06-15
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2020-06-16
Also published as: ITMI991654A1; EP1196593B1; ATE274583T1; DE60013299D1; AU6427900A; AR029751A1; IT1313568B1; ITMI991654A0; WO2001007566A3; US20060019370A1; EP1196593A2; WO2001007566A2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Bakterienstämme, die daraus stammenden Plasmide, eine Gensequenz, die in den Plasmiden enthalten ist und für ein Protein des Phagenresistenz-Systems codiert, und auf ein Verfahren, um Mikroorganismuskulturen Resistenz zu verleihen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Milchsäurebakterien spielen im Verfahren zur Herstellung von Milchderivaten, insbesondere von fermentierten Milchprodukten und Käsen eine fundamentale Rolle.
Ihre Wirkung üben Sie in den ersten Phasen der Käseumwandlung aus, induzieren einige Modifikationen in der Milch und/oder im Käsebruch, die von der Herstellungsgeschwindigkeit und der Menge an Milchsäure, die aus der Laktosefermentation erhalten wird, abhängen.
Das Acidifizierungsvermögen und die Gesamtenzymaktivität der Milchsäurebakterien-Starterkultur, die in spezifischen Molkereiherstellungsschritten verwendet wird, sind fundamentale technologische Parameter, die die organoleptischen und strukturellen Charakteristika des Endproduktes bestimmen.
Diese metabolischen Eigenschaften sind für die verschiedenen Spezies der Milchsäurebakterien typisch und hängen quantitativ auf verschiedene Weise von der Anzahl und dem Grad der Lebensfähigkeit der Milchsäurebakterien in der Kultur und von ihrer Vermehrungsrate in Milch und anschließend im Käsebruch ab.
Eine Verzögerung oder noch schlimmer, eine Blockierung des Wachstums der Starterkultur kann ernste Herstellungsprobleme verursachen, die das industrielle Verfahren als Ganzes beeinträchtigen.
Eine häufigere Ursache für eine verlangsamte oder vollständig blockierte Bakterienreplikation liegt im Vorliegen von Bakterien, Viren, die fähig sind, sich im Inneren einer Bakterienzelle zu vermehren. Bakteriophagen oder Phagen sind fähig, die Wirtszelle zu erkennen und spezifisch anzugreifen und sie im lytischen Zyklus vollständig zu zerstören, wodurch Dutzende oder Hunderte andere virulente Phagen freigesetzt werden, die fähig sind, andere empfindliche Bakterienzellen anzugreifen.
Dieser Vorgang, der erstmals 1935 beschrieben wurde, stellt bis heute eines der äußerst ernsten Probleme dar, die die Käseindustrie beeinträchtigt, da, wenn die Phageninfektion beginnt, die Möglichkeit besteht, dass die Produktion nicht zu Ende geführt werden kann, was einen riesigen wirtschaftlichen Verlust bedeutet.
Äußerst viel versprechende Resultate zur Überwindung dieses Problems wurden unter Verwendung von Bakterienkulturen erzielt, welche aus:

a) Stämmen mit unterschiedlichem Lysotyp (Phagenempfindlichkeit), die rotierend eingesetzt werden;
b) phagenresistenten Stämmen bestehen.

Die erste Lösung, die derzeit von den Starter produzierenden Firmen am besten entwickelt ist, beinhaltet beachtliche Organisationsanstrengungen von den Kulturlieferanten und -anwendern und erlaubt in keinem Fall eine vollständige Standardisierung des Endproduktes. Der Grund dafür ist, dass es fasst unmöglich ist, Bakterienstämme mit identischen technologischen Charakteristika, aber mit unterschiedlichem Lysotyp, zu erhalten, zu isolieren und zu produzieren.
Die zweite Lösung kann durch verschiedene Mechanismen erreicht werden.
Die phagenresistenten Stämme bilden sich spontan in empfindlichen Populationen nach einem Phagenangriff.
Die bei diesen Stämmen gezeigten Phagenresistenzmechanismen können in drei Kategorien gruppiert werden:

1. Blockierung der Adsorption an der Bakterienwand und anschließende Blockierung des Phagen-DNR-Eintritts in das Cytoplasma;
2. Phagen-DNA-Restriktion (Enzymspaltung) bei Eintritt ins Innere der Bakterienzelle;
3. Interferenz mit den Phagen-DNA-Duplizierungsmechanismen bei ihrem Eintritt in die Bakterienzelle (abortive Infektion).

Spontane phagenresistente Mutanten werden allerdings im Allgemeinen durch geringe technologische Eignung gekennzeichnet, was sie für die industrielle Verwendung ungeeignet macht (King W.R. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1983, 45, 1481-1485; Steenson L.R. et al., Dairy Sci., 1986, 69, 2227–2236).
Es wurden neuere Erfindungen beschrieben, die sich mit dem Problem des Erhalts phagenresistenter Stämme mit hohen technologischen Eigenschaften mittels Gentechnologie befassen, wobei diese auf die Einführung von Genen, die für einen oder mehrere der oben aufgelisteten Mechanismen in Starterstämmen codieren, gerichtet sind (US-Patent 5,824,523 und US-Patent 5,538,864).
Dieser Ansatz weist unter industriellen Gesichtspunkten einige Nachteile auf, da diese Mikroorganismen und die daraus erhaltenen Lebensmittel zumindest in der europäischen Gemein schaft in der „Novel Foods"-Kategorie enthalten sind, die durch die EC-Regulierung Nr. 258/97 vom 27. Januar 1997 geregelt wird.
Die Möglichkeit, phagenresistente Kulturstämme unter Verwendung natürlicher Gentransfertechniken zu erhalten, ist von besonderem Interesse.
Zu diesem Zweck ist es notwendig, genetische Elemente auszuwählen, die fähig sind, in vivo zu rekombinieren und zu mobilisieren und zeitweise einen erhöhten Phagenresistenzlevel zu verleihen.
O'Sullivan et al. (Microbiology, Band 145, Nr. 1, 1999, S. 127–134) beschreiben die Sequenzierung und Charakterisierung des kryptischen Plasmids pCI65st mit 6,5 kb aus Streptococcus Thermophilus NDI-6, ein Stamm, der aus indischem fermentierten Milch-Dahl isoliert wurde. Diese Plasmid verleiht Hitzeschockresistenz wie auch Bakteriophagen-Lyse-Resistenz.
Die codierten Proteine sind HsdS oder Spezifitätsproteinen aus den Restriktionsmodifikationssystemen, Typ I, ähnlich.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Autoren der vorliegenden Anmeldung isolierten neue Streptococcus-thermophilus-Stämme, die Phagenresistenz zeigen. Diese Stämme wurden taxonomisch, technologisch und genetisch charakterisiert. Darüber hinaus wurden Genelemente, die für die Phagenresistenz verantwortlich sind, isoliert und charakterisiert.
Der Elternstamm, TO03 genannt, wurde bei der BCCM^TM/lmg Bacteria Collection (Gent-Belgien) als Nr. P-18384 hinterlegt, während die entsprechende phagenresistente Mutante, B39 ge nannt, bei der selben Sammlung als Nr. P-18383 hinterlegt wurde. Beide Stämme repräsentieren den ersten Aspekt der Erfindung. Diese Stämme enthalten die Geninformation, die Phagenresistenz verleiht, aber nur im Stamm B39, in dem die zwei Plasmide – ansonsten als zwei getrennte Moleküle im Wildtyp enthalten – genetisch rekombiniert sind, wird Phagenresistenz beobachtet. Der Phagen-resistente Phänotyp B39 hat für die Verwendung auf dem Gebiet der Molkereimilch dieselben Eigenschaften wie der Elternstamm; insbesondere die Acidifizierungsrate in Milch ist dieselbe wie die des TO03-Stamms, was die Verwendung des B39-Stamms als Starterkultur in denselben Molkereiprozessen, in denen der Elternstamm verwendet wird, zulässt.
Der TO03-Stamm hat zwei Plasmide, die pCRB33 und pCRB63 genannt werden, in denen ORFs (Open Reading Frames = offene Leseraster) gefunden werden, die eine hohe Homologie mit den „s"-Untereinheiten zeigen, von denen bekannt ist, dass sie in Typ-I-Restriktions- und Modifizierungsmechanismen involviert sind. In den TO03-Stämmen sind diese zwei ORF unvollständig und somit inaktiv. Die obigen Plasmide können rekombinieren, wobei sie das pCRB96-Plasmid bilden, in dem die unvollständigen und inaktiven ORFs nach Rekombination eine vollständige und aktive „s"-Untereinheit ergeben.
Die Plasmide pCRB33, pCRB63 und pCRB96 sind weitere Ausführungsformen der Erfindung.
Solche Plasmide werden im folgenden Beispiel 1 beschrieben. Für jedes Plasmid wird insbesondere die vollständige Restriktionskarte bereitgestellt.
Nach einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf die Gendeterminante, die für die Verleihung von Phagenresistenz verantwortlich ist. Diese Determinante entspricht dem ORF des Plasmids pCRB96, das für die oben genannte „s"-Untereinheit codiert, deren Sequenz in SEQ ID. NO: 1 angegeben ist. Ein solches Protein verleiht in Typ-I-Restriktions- und Modifizierungssystemen Spezifität für das Restriktionsenzym und Methylase. Die Untereinheit allein ist nicht fähig, Phagenresistenz zu verleihen; ein Transferieren der Untereinheit in einen heterologen Wirt bestimmt nicht automatisch eine Phänotypänderung, dazu ist das Vorliegen des Gens erforderlich, das für die zwei involvierten Enzyme, die notwendig sind, codiert. Die Einführung in einen Wirt, der ein vollständiges Typ-I-R/M einer heterologen s-Untereinheit enthält, kann zu einer erhöhten Phagenresistenz führen, die mit der eines vollständigen R/M-System vergleichbar ist. Tatsächlich kann die s-Untereinheit allein die Systemspezifität verändern, ohne dass eine vorher existierende inhibiert wird. Eine Resistenz resultiert aus der Summe der Effekte der zwei Untereinheiten.
Die Gendeterminante kann unter Verwendung herkömmlicher Techniken (wie zum Beispiel in Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, beschrieben) insertiert werden.
Ein Plasmid, das die Gendeterminante für Phagenresistenz, die hierin beschrieben wird, enthält, ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung.
Die nicht-konjugativen Plasmide, zum Beispiel pCRB96, können in Verbindung mit anderen Plasmiden, die fähig sind, ihren Transfer zu vermitteln, verwendet werden. Daher bezieht sich die Erfindung in einem anderen Aspekt auf die Verwendung von Plasmiden, die die Gendeterminante der Phagenresistenz, die hierin beschrieben wurde, allein oder in Kombination mit einem konjugativen Plasmid enthalten, um Bakterien Phagenresistenz zu verleihen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Wirtsorganismus, in dem das Plasmid, das die Phagenresistenz-Gendeterminante gemäß der Erfindung enthält, replizieren kann. Das Plasmid kann durch herkömmliche Techniken, zum Beispiel konjungativen Transfer und Transformation, eingeführt werden.
Außer Streptococcus thermophilus kann der Wirt Bacillus subtilis oder Escherichia coli oder vorzugsweise Lactococcus lactis sein. Die Einführung durch Transformation der s-Untereinheit in einen heterologen Wirt einer anderen Gattung und Spezies als Streptococcus thermophilus, aber von gleichem industriellen Interesse, kann durch Vektoren, die für den Wirt selbst geeignet sind, erreicht werden. Die Mikroorganismen, die das erfindungsgemäße Plasmid enthalten, sind bei der Herstellung von Milchderivaten wie fermentierten Milchprodukten und Käsen besonders nützlich. Sie werden als Starterkulturen eingesetzt, die aus einem einzelnen Stamm oder mehreren Stämmen bestehen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Streptococcus-thermophilus-Stamm TO03, der als Starterkultur bei Frischkäse und Pasta-Filata-Käse verwendet wird, erwies sich gegenüber dem lytischen Bakteriophagen SST3-Angriff empfindlich.
Der Stamm TO03 bzw. der TO03-Stamm wird charakterisiert durch:

– eine Taxonomie, die durch Hybridisierung mit einer 23 SrRNA-spezifischen Sonde nach Ehrmann et al., 1992 erhalten wird (1);
– ein Zuckerfermentationsprofil, das durch API-Tunnel erhalten wird, das für Glucose, Fructose, Lactose und Saccharose positiv war;
– Acidifizierungskapazität in steriler Magermilch bei 37°C, wie sie durch kontinuierliche pH-Detektion bestimmt wird (2);
– zwei extrachromosomale DNA oder Plasmide mit einer Größe von 3,3 und 6,3 kb, als pCRB33 bzw. pCRB63 bezeichnet ( 3).

Der Stamm TO03 wurde durch den lytischen Phagen SST3 bei einem Phage/Bakterienzellen-Verhältnis von 1:10 (m.o.i. 0,1) attackiert. Die überlebenden Zellen wurden auf M17-Agarmedium plattiert. Die Platten wurden dann unter Anaerobiose bei 42°C über Nacht inkubiert. Dieses Verfahren erlaubte die Identifizierung von 40 Kolonien der ursprünglichen Bakterienpopulation, die aus 10⁹ kbE/ml bestand. Die isolierten Kolonien außerdem weiter auf Resistenz analysiert.
Die erhaltenen phagenresistenten Isolate wurden auch durch ihr Zuckerfermentationsprofil, ihr Acidifizierungsvermögen in Milch und den Gehalt an extrachromosomalen DNA charakterisiert.
So konnten die resistenten Phagenisolate in zwei Gruppen eingeteilt werden:

– Gruppe R1, umfassend Isolate, die die zwei Plasmide pCRB33, pCRB63 und das zusätzliche Plasmid pCRB96 enthalten.
– Gruppe R2, umfassend Isolate, die das pCRB33 und das zusätzliche Plasmid pCRB96 enthalten.

Alle Isolate waren taxonomisch mit dem Elternstamm identisch, zeigten dasselbe Zuckerfermentationsprofil, wuchsen aber in Milch langsamer, was sie technologisch weniger nützlich macht.
Ein Isolat der Gruppe R2 wurde erfolgreich in flüssigem M17 bei 30°C, einer Temperatur unter dem Temperaturoptimum, wachsen gelassen. Die unter diesen Bedingungen erhaltene Bakterienpopulation wurde auf Agarmedium plattiert und außerdem einem Phagenangriff ausgesetzt.
Die kbE, die sich als phagenresistent erwiesen, etwa 50% der Isolate, wurden dann erneut getestet, um ihre Acidifizierungsrate in Milch zu beurteilen. Überraschenderweise wurde bei einer dieser Kolonien, die als B39 bezeichnet wurde, eine Acidifizierungsrate beobachtet, die ähnlich der des Elternstamms war (2).
Die Plasmidprofilanalyse dieses Stamms bewies das alleinige Vorliegen des 9,6 kb-Plasmids, pCRB96 genannt.
Um die Involvierung des Plasmids pCRB96 bei der Phagenresistenz zu untersuchen, fuhren wir fort, das Plasmid selbst zu entfernen. Der erhaltene Klon, C48 genannt, war frei von Plasmiden und für den Phagen SST3 empfindlich. Um eine weitere Bestätigung für die Rolle dieses Plasmids zu erhalten, führten wir es durch Konjugation wieder in den Klon C48 ein. Allerdings hatte der Klon C48 dieselben phänotypischen Merkmale wie der Stamm B39, was eine Unterscheidung zwischen Donoren und Empfängern nach der Konjugation unmöglich macht. Um diesen Nachteil zu überwinden selektierten wir ausgehend von C48 einen fusidinsäureresistenten Klon.
Der Stamm C48 wurde mit UV bestrahlt und die überlebenden Zellen wurden in M17-Agarmedium, das Fusidinsäure enthielt, ausgesät. Das Ziel war es, eine Mutante für diesen Antibiotikumtyp zu selektieren, um sie als Empfängerselektor nach Konjugation zu verwenden.
Der erhaltene Klon wurde TO60 genannt.
Die UV-Strahlen veränderten die Empfindlichkeit des Klons gegenüber SST3-Phagen nicht. Da das Plasmid pCRB96 konjugativ ist, war es notwendig, einen Co-Transfer des Plasmids selbst durchzuführen, der durch pAMβ₁ vermittelt wird. Dies ist ein konjugatives Plasmid und codiert für Erythromycinresistenz. Die nachfolgenden Schritte, die auf eine Erreichung des Plasmidtransfers gerichtet waren, sind in 4 erläutert und können wie folgt zusammengefasst werden:

– das Plasmid pAMβ₁ wurde aus dem Donorstamm Lactobacillus lactis subsp. lactis SH4174 durch eine erste Konjugation zu dem Klon B39 transferiert. Die Kolonien dieses Donorstamms wurden in M17-Platten, die Glucose und Erythromycin enthielten, gezählt und unter anaeroben Bedingungen bei 30°C inkubiert. Die transkonjugierenden Kolonien wurden auf M17-Platten, die Lactose und Erythromycin enthielten, selektiert und unter anaeroben Bedingungen bei 42°C inkubiert;
– in einem zweiten Konjugationsereignis verwendeten wir den Klon B39 (enthielt pAMβ₁) als Donorstamm und den Klon TO60 als Empfängerstamm. In diesem Fall waren die erwarteten Transkonjugantien gegenüber Erythromycin und auch gegenüber Fusidinsäure resistent. Alle Kolonien mit diesen Charakteristika wurden auf Phagenresistenz analysiert.

Einige von diesen (11 von insgesamt 350 analysierten Kolonien) erwiesen sich als phagenresistent. Der Plasmidgehalt dieser Klone bewies das zeitweilige Vorliegen der Plasmide pAMβ₁ und pCRB96.
Die Entfernungsexperimente (curing experiments) und der pCRB96-Plasmidtransfer haben somit bewiesen, dass die Phagenresistenz der Klone, die ausgehend vom Stamm TO03 isoliert worden waren, an das vorliegen eines solchen Plasmids gebunden war.
Die phagenresistenten Klone zeigten keine vollständige Resistenz gegen den Phagen SST3, allerdings war die Anzahl der Phagen-Plaques, die auf der Platte erhalten wurden, im Vergleich zu der kbE-Zahl, die mit dem Stamm TO03 erhalten wurde, um mindestens 2 log reduziert. Um den involvierten Phagenresistenztyp zu identifizieren, führten wir Kreuzhybridisierungen zwischen dem SST3-Phagen, der im Stamm TO03 vermehrt worden war, und demselben Phagen, der im Stamm B39 vermehrt worden war, durch.
Aus Gründen der Zweckdienlichkeit wurde der letztgenannte Phage als SST39 bezeichnet.
Wie in Tabelle 1 gezeigt wurde, zeigte der Phage, der an den empfindlichen Stamm titriert worden war, einen höheren Titer als der, der erhalten wurde, wenn der Wirtsstamm B39 war. Andererseits produzierte der Phage, der mit dem Stamm B39 vermehrt worden war, denselben Wert für kbE/ml, wenn er an den beiden Stämmen titriert wurde.
Tabelle 2 zeigt die Resultate der Titrationen, die an den empfindlichen Stämmen und an dem Stamm, der gegenüber SST39, vermehrt in TO03 bzw. B39, resistent war, erhalten wurden. Es kann beobachtet werden, dass der Phage SST39 seine Fähigkeit, den phagenresistenten Stamm anzugreifen, nach Vermehrung im Stamm TO03 verliert. Dieses Verhalten ist für Restriktions- und Modifikationssysteme typisch. Wir messen demnach dem Plasmid pCRB96 eine Rolle in einem R/M-System bei.
Plasmid-DNA-Analyse
Die Restriktionskartenanalyse der Plasmide pCRB33, pCRB63 und pCRB96 legt nahe, dass der letztgenannte das Resultat der Integration der zwei Plasmide sein könnte, welche ursprünglich in dem gegenüber dem Phagen TO03 resistenten Stamm lokalisiert waren. Die ersten Bestätigungen wurden in DNA/DNA-Hybridisierungsexperimenten erhalten. Mit dem letztgenannten Verfahren wurden in der Tat Signale erhalten, wenn das pCRB96-Plasmid an Sonden hybridisiert wurde, die pCRB33- und pCRB63-Fragmente umfassen.
Um einen weiteren Beweis für das Integrationsereignis zu erhalten, führten wir eine Klonierung und Sequenzierung des Plasmids pCRB33 durch. Eine graphische Darstellung des Plasmids ist in 5 gezeigt. Aus der Sequenzanalyse konnten wir zwei vollständige ORFs lokalisieren, die in 5 als ORF1 bzw. ORF2 angegeben sind.
Das ORF2 zeigte eine hohe Homologie (87%) bezüglich der Sequenz des RepA-Proteins, das am Plasmid pST1 des Stamms Streptococcus thermophilus ST (Hinterlegungsnummer GENEBANK X65856) lokalisiert ist. Stromabwärts von der codierenden Re gion wurde eine Terminationsregion gefunden, die aus repetiven Sequenzen mit 96%iger Homologie zu denen des oben erwähnten RepA besteht. Das ORF1 zeigt in einigen Teilen Homologie zu vielen s-Untereinheiten des Typ-I-Restriktions- und Modifikationssystems.
Die höheren Homologien wurden in einer 133 bp-Region gefunden, deren Sequenz eines der zwei konservierten Motive aus den s-Untereinheiten enthält. Dieselbe Homologie zu den s-Untereinheiten wurde auch in einer Region 153 by außerhalb des ORF1 und 473 by vom Ende der ersten Region entfernt gefunden. Diese zwei Regionen können als zwei repetitive direkte Sequenzen angesehen werden. Wir nannten die erste 133 pb-Sequenz DR1 und die zweite 153 bp-Sequenz DR2.
Unter Verwendung eines Primersets, das an der Sequenz der zwei DR, die in pCRB33 gefunden wurden, entwickelt worden war, wurde das Plasmid pCRB96 durch PCR amplifiziert. Das Amplifikationsprodukt wurde aus zwei Fragmenten mit 3,3 bzw. 6,3 kb aufgebaut. Diese Resultate veranlassten uns die Hypothese aufzustellen, dass die zwei DR in der Integrationsregion lokalisiert sind.
Zusammenfassend ausgedrückt, pCRB33 enthält ein Gen, das für ein Protein codiert, welches für die Replikation verantwortlich ist, und wahrscheinlich zwei DR, die beim Integrationsereignis involviert sind.
Wir klonierten und bestimmten die Nukleotidsequenz des Plasmids pCRB63. Die Sequenzanalyse zeigte keine Homologie zu den bekannten Genen, die für Phagenresistenz codieren, ausgenommen ORF1, dessen Sequenz eine Region zeigte, die eine hohe Homologie bezüglich der unterschiedlichen s-Untereinheit der Typ-I-Restriktions- und Modifikationssysteme besaß, genau wie es vorher für das pCRB33-Plasmid-ORF1 bewiesen worden war.
Die gezeigte Homologie betraf auch in diesem Fall die konservierten Motive der s-Untereinheiten. Auch im Plasmid pCRB63 liegen die zwei DR vor, genau wie bei pCRB33.
Das Plasmid pCRB96 war somit vollständig sequenziert und das Resultat war, dass es ein Co-Integrationsprodukt der Plasmide pCRB33 und pCRB63 ist.
Die zwei Regionen, in denen die Integration stattfindet, sind die, die durch die zwei DRs begrenzt sind, während die Region zwischen diesen die Stelle ist, an der die zwei Plasmide geschnitten und aneinander gefügt sind. In pCRB96 gibt es in der Tat zwei Regionen, in denen DR1 und DR2 vorkommen. Die pCRB33-DR1 ist in diesem Fall mit der pCRB63-DR2 assoziiert, während die kleinere Plasmid-DR2 mit der pCRB63-DR1 assoziiert ist.
Das ORF1 (2) mit hoher Homologie zu den s-Untereinheiten der Typ-I-R/M-Systeme, insbesondere zu der s-Untereinheit, die aus Lactobacillus lactis IL1403 isoliert wurde, und zu der s-Untereinheit L/dl von Lactococcus lactis subsp. cremoris (Hinterlegungsnummer GENEBANK AF 034786 und U90222), die zu 55% homolog sind, wurde in einer der Integrationsregionen lokalisiert. Im Fall von pCRB96 beweisen die Sequenz, die Homologie und der Phänotyp, dass das für die s-Untereinheit codierende Gen vollständig und funktionell ist.
Dagegen enthalten pCRB33 und pCRB63 ORFs mit Homologie zu Genen, die für die s-Untereinheit der Typ-I-R/M-Systeme codieren, die aber unvollständig und somit nicht funktionell sind. Lediglich pCRB96 hat durch Integration das funktionelle Gen, dessen Sequenz die Summe der pCRB33-ORF1- und pCRB63-ORF1-Teile ist. Die Sequenz der gesamten pCRB96-s-Untereinheit ist in SEQ ID NO: 1 angegeben.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: Taxonomische Identifizierung der Stämme TO03 und B39 Verwendete Sonde: CATGCCTTCGCTTACGCT
Sonde und Hybridisierungsprotokoll nach Ehrmann et al. (1992) „Species-specific oligonucleotide probe for the identification of Streptococcus thermophilus", Systematic and Applied Microbiology, 15, 453–455.
Hybridisierungsresultate:
A1: Modellstamm der Spezies Streptococcus thermophilus DSM 20617 (positive Kontrolle);
A2: DNA, extrahiert aus Lactobacillus helveticus ATCC 15009 (negative Kontrolle);
B1: DNA, extrahiert aus Streptococcus thermophilus B39;
B2: DNA, extrahiert aus Streptococcus thermophilus TO03.
Positive Signale wurden vom Referenzstamm DSM 20617 und den in der Untersuchung befindlichen Stämme TO03 und B39 erhalten, wodurch bestätigt wurde, dass es sich um die Streptococcus-thermophilus-Spezies handelt.
2: Acidifizierungskurve: 1% Inoculum, sterile Magermilch, 37°C.
3: Plasmidprofil für die Stämme TO03 (Vertiefung 2) und B39 (Vertiefung 4).
4: Schema der Konjugationen, die durchgeführt wurden, um die Plasmide pAMß1 und pCRB96 einer Co-Transfektion zu unterziehen.
5: Schematische Darstellung von pCRB33.
ORF1: ORF lokalisiert von nt 411 bis nt 1308, was 299 Aminosäuren entspricht, in der angehängten pCRB33-Nukleotidsequenz. Dieses ORF zeigt Homologie zu verschiedenen Untereinheiten der Typ-I-Restriktionssysteme.
ORF2: ORF, lokalisiert von nt 2070 bis nt 2960. Dieses ORF zeigt 87%ige Homologie zu pST1-RepA (Zugangsnummer X65856).
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung detaillierter.
BEISPIEL 1
Charakterisierung der Plasmide pCRB33, pCRB63 und pCRB96
Die folgenden Tabellen geben die Restriktionsprofile der Plasmide pCRB333, pCRB63 und pCRB96 an. Tabelle 3: Plasmid pCRB33, 3375 Basenpaare
Tabelle 3 (Fortsetzung)
r = a oder g; k = g oder t; h = a oder c oder t; d = a oder g oder t; y = c oder t; s = c oder g; b = c oder g oder t; n = a oder c oder g oder t; m = a oder c; w = a oder t; v = a oder c oder g.
Die folgenden Endonukleasen spalteten die pCRB33-Sequenz nicht:
Apal, Ava I, BamHI, BcII, BgII, CfoI, ClaI, HaeII, HincII, HindII, HpaI, NcoI, PvuI, SacI, SacII, SaII, SmaI, SohI, XhoI, XmaI. Tabelle 4: Plasmid pCRB63, 6148 Basenpaare
Tabelle 4 (Fortsetzung)
Tabelle 4 (Fortsetzung)
r = a oder g; k = g oder t; h = a oder c oder t; d = a oder g oder t; y = c oder t; s = c oder g; b = c oder g oder t; n = a oder c oder g oder t; m = a oder c; w = a oder t; v = a oder c oder g.
Die folgenden Endonukleasen spalteten die pCRB33-Sequenz nicht:
ApaI, BamHI, BcII, BgII, HpaI, NcoI, PstI, PvuII, SmaI, XhoI, XmaI. Tabelle 5: Plasmid pCRB96, 9515 Basenpaare
Tabelle 5 (Fortsetzung)
Tabelle 5 (Fortsetzung)
Tabelle 5 (Fortsetzung)
r = a oder g; k = g oder t; h = a oder c oder t; d = a oder g oder t; y = c oder t; s = c oder g; b = c oder g oder t; n = a oder c oder g oder t; m = a oder c; w = a oder t; v = a oder c oder g.
Die folgenden Endonukleasen spalteten die pCRB96-Sequenz nicht.
ApaI, BamHI, BcII, BgII, HpaI, NcoI, SmaI, XhoI, XmaI.
BEISPIEL 2
Konjugativer Transfer bzw. konjugative Übertragung

1. Im ersten Konjugationszyklus werden die Kulturen des Donorstamms Lactobacillus lactis SH4174, der das Plasmid pAMß1 enthält, welches für Erythromycinresistenz codiert, und Kulturen der Empfängerstämme Streptococcus thermophilus B39, die das Plasmid pCRB96 enthalten, wachsen gelassen.
2. Im zweiten Konjugationszyklus werden die Donor- und Empfängerstammkulturen von Streptococcus thermophilus B39 (pAMß1), enthaltend das Plasmid pAMß1 und das Plasmid pCRB96, und Streptococcus thermophilus TO60, plasmidfrei bzw. gegen Fusidinsäure resistent, wachsen gelassen.

Verfahren
Von beiden Kulturen werden gleiche Volumina entnommen und gemischt.
Aus dieser Mischung werden 0,2 ml entnommen, in eine Petrischale gegeben, die M17-Medium ohne Selektionsagens enthält, gleichmäßig plattiert und 6 bis 30 Stunden inkubiert.
Die auf diesem Medium gewachsenen Bakterienzellen werden mit 1 ml Salzlösung geerntet und dann werden geeignete Verdünnungen in Kulturmedium (siehe Tabelle), die zum Selektieren von Donor- und Empfängerstämmen und möglichen Transkonjuganzien, die im Konjugationsgemisch vorliegen, geeignet sind, auf einer Platte ausgesät.
Tabelle 6: Erster Konjugationszyklus
Tabelle 7: Zweiter Konjugationszyklus
Aus dem zweiten Konjugationszyklus werden zwei Transkonjugans-Typen erwartet:
ein Typ, der nur das konjugative pAMβ1-Plasmid enthält, und
ein Typ, der die beiden Plasmide pCRB96 und pAMβ1 enthält. Resultate
Tabelle 8: Erster Konjugationszyklus
Tabelle 9: Zweiter Konjugationszyklus
Im zweiten Konjugationszyklus wurden nur 50 kolonienbildende Einheiten einer Co-Mobilisierung des Plasmids pCRB96 durch das Plasmid pAMβ1 unterworfen.
Die Phagenresistenzlevel der TO60-Transkonjuganzien (pCRB96-pAMβ1) waren mit denen von B39 identisch.
Die Phagensensitivitätlevel von TO60 und TO60 (pAMβ1) waren mit denen von TO03 identisch.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Streptococcus thermophilus-Stämme P-18383 und P-18384, hinterlegt bei BCCM/LMG (Cent/Belgien).
Nukleinsäuremolekül mit der Sequenz SEQ ID No. 1.
Plasmid, das das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2 enthält.
Plasmid, erhältlich aus einer Kultur vom Streptococcus thermophilus-Stamm N. P-18384 nach Anspruch 1 mit 3375 Basenpaaren und je einer einzelnen Restriktionsschnittstelle für AccI-, AseI-, AsnI-, EcoRV-, FokI-, NotI-, PstI-, PvuII-, XbaI-Nuklease.
Plasmid, erhältlich aus einer Kultur vom Streptococcus thermophilus-Stamm N. P-18384 nach Anspruch 1 mit 6184 Basenpaaren und je einer einzelnen Restriktionsschnittstelle für AvaI-, HindIII-, KpnI-, PvuI-, SacI-, SacII-, SalI-, SpeI-, SphI-Nuklease.
Plasmid, erhältlich aus einer Kultur vom Streptococcus thermophilus-Stamm N. P-18383 nach Anspruch 1 mit 9515 Basenpaaren und je einer einzelnen Restriktionsschnittstelle für AvaI-, NotI-, PstI-, PvuI-, PvuII-, SacI-, SacII-, SalI-, SphI-Nuklease.
Mikroorganismus, der das Plasmid nach den Ansprüchen 3–6 enthält.
Mikroorganismus nach Anspruch 7, ausgewählt aus Streptococcus thermophilus, Lactobacillus lactis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. diacetylactis, Lc. Cremoris, Lb. delbruckeii subsp. Lactis, Lb. delbruckeii subsp. bulgaricus, Lb. delbruckeii subsp. delbruckeii, Lb. Helveticus, Lb. casei.
Starterkultur zur Milchfermentation, umfassend einen Mikroorganismus nach Anspruch 1, 7 oder 8.
Verwendung eines Plasmids nach Anspruch 3 und 6, alleine oder in Kombination mit einem Konjugationsplasmid, zum Übertragen von Phagenresistenz auf ein Bakterium.