KR20020090546A

KR20020090546A - 유산균 염색체 ｄｎａ로의 삽입을 위한 삽입 벡터

Info

Publication number: KR20020090546A
Application number: KR1020010029431A
Authority: KR
Inventors: 장수진; 정대균; 김해영; 이형주; 지근억; 김정환; 장해춘; 이종훈
Original assignee: 주식회사 알엔에이
Priority date: 2001-05-28
Filing date: 2001-05-28
Publication date: 2002-12-05
Also published as: WO2002097098A1

Abstract

본 발명은 유산균용 삽입 벡터에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유산균 염색체 DNA에 삽입되어 안정적으로 복제될 수 있는 유산균용 삽입 벡터 pJC2; 유산균에서 인간 유래 페리틴 유전자를 안정적으로 발현시킬 수 있는 삽입 벡터 pJC7F; 상기 pJC2 및 pJC7F로 형질전환된 유산균 형질전환체에 관한 것이다. 본 발명의 pJC2 및 pJC7F는 식품등급으로 사용될 수 있으며, 이를 이용하여 형질전환시킨 유산균 형질전환체로부터 철분제제로 사용될 수 있는 페리틴 단백질을 안정하게 발현시킬 수 있다.

Description

유산균 염색체 ＤＮＡ로의 삽입을 위한 삽입 벡터{Integration vector for insertion into chromosomal DNA of lactic acid bacteria}

본 발명은 유산균 염색체 DNA로의 삽입을 위한 삽입 벡터에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 특정 선별 유전자를 포함하고 있어 유산균의 염색체 DNA 내로의 삽입 여부를 용이하게 스크리닝할 수 있고, 유산균 염색체 DNA에 삽입되어 유용한 목적단백질을 대량으로 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 유산균주 내에서 안정적으로 복제될 수 있는 삽입 벡터에 관한 것이다.

유산균(lactic acid bacteria)은 탄수화물을 혐기적으로 이용하여 젖산을 생산하는 미생물로 자연계에 널리 분포하는 미생물이다. 유산균은 중성 및 알칼리성에서 잘 생육하는 부패성 미생물의 생육을 억제하기 때문에 동서양을 막론하고 식품의 중요한 보존 수단으로 응용되어 왔으며, 특히, 우유, 유제품, 육제품, 침채류 및 각종 젓갈류의 가공에 이용되어 왔다. 유산균은 젖산 및 초산과 같은 유기산을 생산하여 장내 대부분의 미생물을 살균(bacteriocide)하기 때문에, 식품의 pH를 감소시키면서 보존성을 증진시키는 작용을 한다.

최근에, 유산균은 식품산업 분야에서 많은 주목을 받고 있으며, 이러한 유산균은 위장을 건강하게 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있을 뿐만 아니라, 유산균을 섭취함으로써 건강을 증진시킬 수 있다는 것이 보고되어 있다(Matsuzakiet al.,Int. J. Food.Microbiol., 41:133-140; Bengmart,Gut, 42:2-7; Gilliard,FEMS Microbiol.Rev., 87:175-188; Perdigonet al.,J. Diary. Sci., 70:919-926; Tejada-Simonet al.,J. Food. Prot., 62:1435-1444).

최근 유산균의 장내균총의 안정화, 유해 세균 정착의 예방, 장질환 등의 치료 등의 효과가 입증됨에 따라, 사람의 건강을 증진시키기 위하여 식품과 식품 첨가물의 건강 기능성 소재로 유산균의 사용이 세계적인 주목을 받고 있으며, 이를 이용한 상품화도 진행되고 있다. 특히, 엘리 메치니코프(Elie Metchnikoff)의 발효유의 건강 증진에 대한 과학적인 연구 이래로, 유산균의 항암 작용, 콜레스테롤 조절 작용, 면역 조절 작용, 국소 및 전신 면역기능의 항진 등에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 또한, 신생아나 면역기능이 저하된 소아의 면역기능을 증진시키기 위하여, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophillus) 및 락토바실러스 비피덤(Lactobacillus bifidum) 등을 식품 첨가제로 이용하고 있다.

최근에는 생명공학기법을 이용하여 새로운 기능을 가진 유산균을 개발하려는 연구가 전세계적으로 활발하게 진행되고 있다. 유산균은 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 안정성과 함께 단백질을 세포밖으로 분비하는 분비 기작을 가지고 있으며, 바실러스균과는 달리 세포 밖으로 분비되는 단백질 가수분해 효소들의 역가가 낮기 때문에 외래 단백질을 생산하는데 유리하다. 따라서, 유산균을 이용하여 효소, 항균제, 백신 등을 장내의 상피세포로 전달하고자 하는 연구가 심도있게 진행되고 있으며, 향후 이와 같이 개발될 유산균의 경제적, 사회적, 의학적 가치 등은 매우 클 것으로 예상되고 있다.

따라서, 유산균의 산업적 응용 가치를 높이기 위해서는 유전공학기법을 이용한 균주 개량이 효과적이며, 전세계적으로 유산균에서 외래 단백질을 대량으로 발현시키기 위하여 유산균에서 복제 수가 많은 플라스미드(high-copy number plasmid), 강한 컨스티튜티브 프로모터(constitutive promoter) 및 조절되는 프로모터(regulated promoter) 등이 연구되고 있다(Jos M.B.M. Van Der Vossem, Daniel Van Der Lelie, and Gerard Venema appl. environ. microbiol. 53:2452-2457).

그러나, 이와 같이 산업적으로 중요한 유산균을 유전공학기법으로 개량하였을 때, 개량된 벡터가 안정하게 그 형질을 유지하면서 형질전환된 유산균주 내에서 유지되는가가 중요한 문제점으로 부각된다.

유전공학기법을 이용한 유산균주 개량이나 개량된 유산균주를 이용한 신제품 개발에는 식품산업에 이용되는 균주 개량의 필수적 요소인 '안전성'을 바탕으로 유산균주의 염색체 DNA에 삽입될 수 있는 식품용 클로닝 벡터 개발이 요구된다.

상기 식품용 클로닝 벡터 개발의 일환으로 비복제 플라스미드(nonreplicative plasmid)가 개발되었으나, 형질전환 효율이 매우 낮은 단점이 있다(Walker, D. C and T.R. Klaenhammer,J. Bacteriol., 176:5330-5340, 1994; Emmanuelle M.et al.,J. Bacteriol., 178:931-935, 1995).

현재, 세계적으로 선두 그룹에 있는 미국, 유럽 등의 유산균 연구진의 연구방향도 유산균을 이용한 벡신(vaccine) 개발, 여러 호르몬제의 장내 운반체 등에 관한 연구와 아울러, 이를 위한 유산균용 삽입 벡터 개발에 맞추어져 있으나, 아직 시작 단계에 있다.

또한, 유산균 형질전환체를 선별하는데 있어서, 대부분의 유산균은 β-갈락토시다제(β-galactosidase)를 분비하고, 항생제 저항성 유전자를 선별유전자로 사용할 경우 많은 경우에 있어서 복귀변이주(revertant)를 형성하기 때문에, X-gal 및 항생제를 포함하는 배지상에서 형질전환체만을 선별하기가 어려운 단점이 있었다. 따라서, 형질전환체를 보다 용이하게 선별하기 위한 방법을 찾기 위한 노력이 계속되어 왔다.

한편, 페리틴(ferritin) 단백질은 철 저장 단백질로서 철 이온이 중심에 존재하는 구형 단백질이며, 간, 비장, 골수에 많이 존재하고 있다. 페리틴은 세포에서 철을 저장체 형태로 결합시키기 때문에, 철의 독성으로부터 세포들을 보호하고 산소와의 반응을 저해함으로써, 세포 단백질 및 지질을 보호하는 역할을 수행하는 중요한 단백질로 보고되어 있다. 이러한 중요한 작용을 하는 철분의 결핍은 인간에게 많은 문제점을 야기시키며, 특히, 유아, 임산부, 청소년 및 아동 등에서 결핍 증세가 흔히 나타나고 있다. 따라서, 철분 결핍에 대한 치료 및 예방을 위하여, 음식물에 포함된 철분을 섭취하는 것으로는 부족하기 때문에, 매일 10 - 50 ㎎ 철분이 포함된, 생체내 이용률이 높은 철분제제가 필요하다.

현재 국내에서 시판되고 있는 철분제제는 국내 모 제약회사에서 빈혈 치료제로 철분제제가 아닌 말이나 소의 비장에서 추출한 페리틴 추출액을 수입하여 치료제로 사용하고 있다. 그러나, 이렇게 동물에서 추출한 페리틴 성분은 사람의 유전자와는 다른 아미노산으로 구성되어 있으므로, 실제로 사람에게 투여되어 체내에 흡수되었을 때, 그 기능과 작용에 대한 효율성은 의문시되고 있다.

국내 철분제제의 시장성은 1,999년을 기준으로 연간 약 700억원대이고, 세계 시장규모는 조혈제의 경우 연간 26억 달러에 이르고 있다. 한편, 국내 철분제제는 약 92%가 부적합 판정을 받았으며, 식품첨가제 및 의약품의 철분제제를 전량 수입에 의존하고 있는 실정이다. 또한, 광우병 파동으로 인하여 가축으로부터 추출한 철 단백질의 철분제제가 소비자들에게 매우 큰 불신을 주고 있기 때문에, 새로운 철분제제가 개발되어 대체되었을 경우 국내 철분제제의 시장에 대한 파급 효과는 매우 클 것으로 기대되며, 따라서 대체 철 단백질의 개발이 시급히 요구되고 있는 상황이다.

국내외적으로 철분제제의 연구 및 개발 상황은 조혈촉진 호르몬인 에리트로포이에틴(erythropoetin)을 포유동물의 세포에 형질전환시킴으로써, 에리트로포이에틴의 상업화를 시도하고 있다. 그러나, 에리트로포이에틴의 경우 기능성 단백질과는 달리 단순한 호르몬이며 고가이기 때문에, 적용 범위 및 수요 전망이 매우 적다. 따라서, 철분제제로 페리틴을 사용하게 되면, 가격이 저렴할 뿐만 아니라 약효가 우수한 장점이 있기 때문에 페리틴을 유산균에서 발현시키는 생산 시스템의 개발이 요구되고 있다.

본 발명자들은 형질전환된 유산균 내에서 안정되게 그 형질을 유지하고, 목적단백질을 암호화하는 목적유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있으며, 식품 등급으로 사용될 수 있는 삽입 벡터, 구체적으로 인간 유래 페리틴 유전자를 안정되게 발현시킬 수 있는 삽입 벡터를 개발하였고, 이를 이용하여 유산균을 형질전환시키고, 상기 삽입 벡터가 형질전환체의 염색체 DNA에 삽입되어 목적단백질이 안정되게 발현되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 특정 선별 유전자를 포함하고 있어 유산균의 염색체 DNA로의 삽입 여부를 용이하게 스크리닝할 수 있고, 유산균 염색체 DNA에 삽입되어 유용한 목적단백질을 대량으로 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 유산균주 내에서 안정적으로 복제될 수 있는 삽입 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 삽입 벡터로 형질전환된 유산균 형질전환체를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균용 삽입 벡터 pJC2의 제조 과정을 나타낸 것이다.

도 2는 유산균용 삽입 벡터 pJC2의 개열지도를 나타낸 것이다.

도 3은 유산균용 삽입 벡터 pJC2로 형질전환시킨 형질전환체가 cellomix^TM플레이트 상에서 셀룰라제 할로(halo)를 형성하는 것을 나타낸 것이다.

도 4는 유산균용 삽입 벡터 pJC2로 형질전환시킨 형질전환체에서celA유전자를 PCR로 증폭한 결과를 나타낸 것이다.

레인 1 : λ/HindIII 마커

레인 2 : 형질전환시키지 않은 유산균의 염색체 DNA를 주형으로 사용한 PCR 결과

레인 3 : 형질전환된 유산균에서 pJC2가 삽입된 염색체 DNA를 주형으로 사용한 PCR 결과

레인 4 : 양성 대조군으로 플라스미드 pJC2를 주형으로 사용한 PCR 결과

도 5는 삽입 벡터 pJC2로 형질전환시킨 형질전환체의 염색체 DNA 및celA 유전자를 프로브로 사용하여 수행한 서던 블럿의 결과를 나타낸 것이다.

레인 1 : 양성 대조군으로EcoRI으로 절단된 pJC2의 서던 블럿

레인 2 :KpnI으로 절단된 락토바실러스 가세리 염색체 DNA의 서던 블럿

레인 3 :EcoRI으로 절단된 락토바실러스 가세리 염색체 DNA의 서던 블럿

레인 4 :KpnI으로 절단된 락토바실러스 존소니 염색체 DNA의 서던 블럿

레인 5 :EcoRI으로 절단된 락토바실러스 존소니 염색체 DNA의 서던 블럿

레인 6 : 음성 대조군으로 락토바실러스 가세리 염색체 DNA의 서던 블럿

레인 7 : 양성 대조군으로EcoRI으로 절단된 pJC2의 서던 블럿

레인 8 :KpnI으로 절단된 락토바실러스 불가리커스 염색체 DNA의 서던 블럿

레인 9 :EcoRI으로 절단된 락토바실러스 불가리커스 염색체 DNA의 서던 블럿

도 6은 삽입 벡터 pJC2에 프로모터 및 페리틴 유전자를 삽입하여 제조한 삽입 벡터 pJC7F의 개열지도를 나타낸 것이다.

도 7은 유산균용 삽입 벡터 pJC7F로 형질전환된 형질전환체의 염색체 DNA를 주형으로 하여 cp25 프로모터 및 페리틴 유전자를 PCR로 증폭한 결과를 나타낸 것이다.

레인 1 : 음성 대조군으로 형질전환시키지 않은 유산균의 염색체 DNA를 주형으로 사용한 PCR 결과

레인 2 및 3 : pJC7F가 삽입된 락토바실러스 불가리커스 형질전환체의 염색체 DNA를 주형으로 사용한 PCR 결과

레인 4 : λ/HindIII 마커

레인 5 : 양성 대조군으로 pJC7F를 사용한 PCR 결과

도 8은 상기 형질전환체에서 발현된 페리틴 단백질을 His·Tag 컬럼을 이용하여 부분 정제한 결과를 나타낸 것이다.

레인 1 : MBI 단백질 마커(MBI protein marker)

레인 2 내지 레인 7 : His·Tag 컬럼에 의해 정제된 철단백질의 분획

레인 8 : 철단백질을 발현하는 균주의 세포추출액

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 그람 음성균의 복제 원점, 제1 선별유전자인 항생제 저항성 유전자, 유산균 염색체 DNA로의 삽입 여부를 확인하기 위한 제2 선별유전자celA,상기celA의 프로모터 및 삽입 서열(IS:insertion sequence)을 포함하는 유산균용 삽입 벡터(integration vector)를 제공한다.

또한, 본 발명은 그람 음성균의 복제 원점, 제1 선별유전자인 항생제 저항성 유전자, 유산균 염색체 DNA로의 삽입 여부를 확인하기 위한 제2 선별유전자celA,상기celA의 프로모터, 삽입 서열, 목적단백질을 암호화하는 목적유전자 및 상기 목적유전자의 프로모터를 포함하는 유산균용 삽입 벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 삽입 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 그람 음성균의 복제 원점, 제1 선별유전자인 항생제 저항성 유전자, 유산균 염색체 DNA로의 삽입 여부를 확인하기 위한 제2 선별유전자celA,상기celA의 프로모터 및 삽입 서열(IS:insertion sequence)을 포함하는 유산균용 삽입 벡터(integration vector)를 제공한다.

본 발명에 따른 삽입 벡터는 그람 양성균의 복제 원점이 아닌 그람 음성균의 복제 원점을 사용함으로써, 그람 양성균인 유산균 내에서 벡터의 복제 원점만으로는 벡터가 안정되게 유지되지 못하게 함으로써, 벡터내 삽입 서열에 의해 형질전환체인 그람 양성균인 유산균의 염색체 DNA로 벡터가 삽입되도록 유도하였다.

본 발명에 따른 유산균용 삽입 벡터의celA의 프로모터는 유산균용 프로모터이면 특별한 제한없이 사용될 수 있으나, 나이신 A(nicin A) 유전자의 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다.

제1 선별유전자인 항생제 저항성 유전자로는 통상 사용되는 공지의 모든 항생제가 사용될 수 있으며, 구체적으로, 에리트로마이신 또는 클로람페니콜이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 에리트로마이신이 바람직하다.

본 발명에 따른 삽입 벡터에 삽입된 제2 선별유전자로는celA유전자가 사용되는데 그 특징이 있다. 대부분의 유산균은 β-갈락토시다아제(β-galactosidase)를 분비하고, 항생제 저항성 유전자를 선별유전자로 사용할 경우 많은 경우에 있어서 복귀변이주(revertant)를 형성하기 때문에, X-gal 및 항생제를 포함하는 배지상에서 형질전환체만을 선별하기가 어렵다. 따라서, 형질전환체의 선별을 정확하고 용이하게 하기위하여, 제2 선별유전자를 삽입하여 삽입 벡터를 제조하게 되었다.

본 발명에 따른 삽입 벡터에 삽입된 삽입 서열로는 공지의 삽입 서열이 모두 사용될 수 있고, 구체적으로, IS1223, IS481, IS100 및 IS903이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 IS1223이 바람직하다. IS1223은 락토바실러스 존소니(Lactobacillus jonsonii)의 삽입 서열로 랜덤 삽입(random integration) 및 멀티 카피 삽입을 매개하는 것으로 보고되어 있다(Walker, D. C. and T. R. Klaenhammer,J. Bacteriol., 176:5330-5340, 1994).

구체적으로, 본 발명은 또한 그람 음성균의 복제 원점, 나이신 A 유전자의프로모터, 클로스트리디움 써모셀럼 유래의celA유전자 및 IS1223을 포함하는 유산균용 삽입 벡터 pJC2를 제공한다.

상기 pJC2를 제조하기 위하여, 먼저, 에리트로마이신 저항성 유전자(erythromycin resistant gene, Em^r), IS1223 및 그람 음성균의 복제 기원을 포함하는 pTRK327에 pLB1로부터lacZ유전자 및nisA프로모터를 분리하여 상기 pTRK327에 삽입함으로써 pJC1을 제조하였고, 여기에 T 벡터(promega)에celA 유전자를 넣어 제조된 벡터 pTvec/celA로부터celA유전자를 분리하여 삽입함으로써 pJC2-1을 제조하였다. 상기 pJC2-1로부터 클로람페니콜 저항성 유전자를 제거하여 pJC2-2를 제조하였고, 많은 제한효소 부위를 제거하여 pJC2를 제조하였다.

또한, 본 발명은 목적단백질을 암호화하는 목적유전자 및 상기 목적유전자의 프로모터를 더 포함하는 유산균용 삽입 벡터를 제공한다.

본 발명에 따른 삽입 벡터에 삽입될 수 있는 목적유전자로는 항 고혈압 단백질 발현 유전자 또는 백신으로 사용되는 펩타이드 발현 유전자 등 인체에 유용한 단백질을 발현할 수 있는 유전자가 삽입될 수 있으나, 보다 바람직하게는 페리틴 유전자가 바람직하다.

본 발명에 따른 삽입 벡터에 삽입될 수 있는 프로모터로는 서열번호 3으로 표시되는 cp25 프로모터, P21, P23, 및 P59가 바람직하며, 보다 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 cp25 프로모터가 바람직하다.

본 발명에 따른 삽입 벡터는 또한 상기 프로모터 및 목적단백질을 암호화하는 유전자 사이에 His·Tag 서열을 암호화하는 유전자가 삽입된 유산균용 삽입 벡터를 제공한다.

본 발명에 따른 삽입 벡터에 특정 염기서열을 삽입함으로써, 발현된 목적유전자를 정제하기 용이하게 제조할 수 있다. 삽입 벡터에 삽입될 수 있는 특정 염기서열로는 His·Tag 서열, CBD 서열 및 S·Tag 서열이 바람직하며, 보다 바람직하게는 His·Tag 서열이 바람직하다.

본 발명에서 상기 삽입 벡터로 형질전환된 형질전환체의 선별은 에리트로마이신 및 셀룰라제 기질을 포함하는 한천 플레이트를 사용하였으며, 셀룰라제 기질로는 셀룰로즈가 바람직하고, 본 발명에서는 시판되고 있는 cellomix^TM한천플레이트를 사용하였다.

본 발명에 따른 삽입 벡터를 이용하여 대장균 및 유산균을 형질전환시키는 방법으로는 전기천공법 또는 칼슘클로라이드 방법이 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 전기천공법이 바람직하다.

상기 삽입 벡터를 이용하여 형질전환시킬 수 있는 유산균으로는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 불가리커스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 루터리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus cassei) 또는 락토바실러스 아밀로보러스 (Lactobacillus amylovorus)가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 존소니, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 불가리커스 및 락토바실러스 플란타룸이 바람직하다.

상기 형질전환체에서 본 발명의 삽입 벡터가 염색체 DNA에 삽입되었는지 여부 확인은 벡터에 삽입된celA유전자를 PCR로 증폭하여 1.4 kb의 DNA 밴드를 확인함으로써 가능하다. 또한, 상기에서 증폭된celA유전자를 프로브로 사용하여 형질전환체 염색체 DNA로 서던 블럿을 수행할 수 있다. 이와 같은 방법으로 본 발명의 실시예에서 사용한 락토바실러스 존소니, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 불가리커스 및 락토바실러스 플란타룸 모두 pJC2가 염색체 DNA에 삽입된 것을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

<실시예 1> 유산균용 삽입 벡터 pJC2의 제조

도 1에 본 발명의 삽입 벡터 pJC2를 제조하는 과정이 개략적으로 도시되어 있다. 에리트로마이신 저항성 유전자(erythromycin resistant gene, em^r), 테트라싸이클린 저항성 유전자(tetracyclin resistant gene, tet^r), 클로람페니콜 저항성 유전자(chloramphenicol resistant gene, cm^r), IS1223 및 그람 음성균의 복제 기원을 포함하는 벡터 pTRK327(North Carolina State University)을 제조하였다. 상기 IS1223은 락토바실러스 존소니 NCK88로부터 분리하여 삽입하였다.

벡터 pLB1(Seoul University)으로부터lacZ유전자 및nisA프로모터를 포함하는 3.3 kbBamHI-BglII 단편을 분리하여 상기 pTRK327에 삽입함으로써 재조합 벡터 pJC1을 제조하였다. 상기lacZ유전자 및nisA프로모터는 락토코커스 락티스로부터 분리되었다. 재조합 벡터 pJC1을 이용하여 대장균 XL1-Blue(NEB) 및 유산균인 락토바실러스 가세리 ATCC33323을 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균 및 락토바실러스 가세리는 X-gal(5-bromo-4-indole-3-β-glucopyranosiase) 플레이트 상에서 파란색 콜로니를 나타내었다.

벡터 pTvec/celA로부터 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum) 유래의 1.4 kbApaI-SalI 단편의celA유전자를 분리하여 상기 재조합 벡터 pJC1에 삽입함으로써, 제2 선별유전자celA를 포함하는 9.6 kb의 재조합 벡터 pJC2-1을 제조하였다. 제한효소PvuII 및AvaI을 이용하여 상기 재조합 벡터 pJC2-1으로부터 cm^r을 제거하여 7.8kb의 재조합 벡터 pJC2-2를 제조하였다. 제한효소NcoI을 사용하여 재조합 벡터 pJC2-2로부터 많은 제한효소 부위를 제거한 후, 블런트 라이게이션 효소(Takara Shuzo Co., Ltd)를 사용하여 연결시켰다.

그 결과, 그람 음성균의 복제 기원((-) origin),nisA프로모터,celA유전자, 에리트로마이신 저항성 유전자 및 IS1223을 포함하는 7.6kb의 유산균용 삽입 벡터 pJC2를 제조하였고, 그 개열지도를 도 2에 나타내었다.

<실시예 2> 삽입 벡터 pJC2를 이용한 형질전환 및 형질전환체의 선별

상기 실시예 1에서 제조한 삽입 벡터 pJC2를 사용하여 락토바실러스 가세리 ATCC33323 및 대장균 XL1-Blue(NEB)를 전기천공법(electroporation)으로 형질전환시켰다. 전기천공법에 사용될 컴피턴트 유산균의 제조는 Holo and Nes 방법(Holo.H., and I.F.Nes Appl. Environ. Microbiol. 56:1890-1896)을 변형하여 제조하였다. 유산균 균주를 5 ㎖ MRS 액체 배지에 접종하여 밤샘 배양한 후, 0.2% 글라이신(glycine) 및 0.5 M 수크로스(sucrose)가 포함된 100 ㎖ MRS 배지(Difco)에서 600 nm에서의 흡광도가 0.5 내지 0.7에 도달할 때까지 서브컬쳐(subculture)하였다. 배양된 세포를 4℃, 6,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 회수하고, 회수된 균체를 다시 20 ㎖의 차가운 증류수로 현탁한 후, 다시 상기와 같이 원심분리하였다. 이와 같이 회수된 균체를 다시 한 번 상기와 같이 증류수로 현탁하고 원심분리하였다. 회수된 균체를 78 mM 수크로스 및 0.29 mM MgCl₂로 구성된, 차가운 1 X SMEB 완충용액으로 현탁한 후, 4℃, 6,000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 1 볼륨(volume)의 SMEB 완충용액으로 현탁하여 -70℃에 보관하였다가 형질전환에 사용하였다. 컴피턴트 대장균의 제조는 공지의 방법(dower, W.J., J. F. Miller, and C.W.Ragsdale. Nucleic Acids Res. 16:6127-6145)에 따라제조하였다.

상기와 같이 제조된 컴피턴트 세포를 이용하여 하기와 같은 방법으로 전기천공법을 수행하였다. 40 ㎕ 컴피턴트(competent) 대장균과 100 내지 200 ng의 플라스미드 DNA를 0.2 cm 큐벳(Bio-Rad)에 혼합한 후, Gene pulser unit(Bio-Rad)을 사용하여 2.5 kv, 25 ㎌로 전기적 충격을 가하였다. 상기와 같은 방법으로 형질전환된 형질전환체를 이스트 익스트랙트 0.5%, 트립톤 2%, 염화나트륨 0.05%, 염화칼륨 250mM, 염화마그네슘 2M과 글루코스 1M로 구성된 SOC 배지를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.

대장균의 배양은 LB(Difco) 액체 배지를 사용하였으며, cellomix^TM및 200 ㎍/㎖ 에리트로마이신, 10 ㎍/㎖ 클로람페니콜 및 100 ㎍/㎖ 암피실린이 포함된 한천 플레이트(한천 농도 1.5%)를 사용하여 37℃에서 형질전환체를 선별하였다. 컴피턴트 유산균의 형질전환은 상기 대장균의 형질전환과 동일한 방법으로 실시하였다.

락토바실러스 가세리의 배양은 MRS 액체 배지(Difco)를 사용하였으며, cellomix^TM(RNA Inc., Seoul, Korea) 및 5 ㎍/㎖ 에리트로마이신, 1 ng/㎖의 나이신(nicin) 항생제가 포함된 MRS 한천 플레이트(한천 농도 1.5%)를 사용하여 37℃에서 형질전환체를 선별하였다.

락토바실러스 가세리를 숙주 세포로 사용한 경우, 에리트로마이신에 저항성이 있으면서 셀룰라제를 분비하는 총 10개의 콜로니가 분리되었다. 셀룰라제를 분비하는 형질전환체의 선별은 콩고 레드(congo red)용액으로 30분간 염색한 후,celA할로(halo)가 나타날때까지 1M NaCl로 세척하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

<실시예 3> 삽입 벡터 pJC2의 유산균 염색체 DNA로의 삽입 확인

<3-1>celA유전자의 PCR

형질전환된 락토바실러스 가세리의 염색체 DNA에 삽입 벡터 pJC2가 삽입(integration)되었는지를 확인하기 위하여, 형질전환된 락토바실러스 가세리의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다.

락토바실러스 가세리의 염색체 DNA는 공지의 방법(O'sullivan, D.J. and T.R.Klaenhammer,Applied. Environ. Microbiol., 59:2730-2733, 1993)을 변형하여 분리하였다. MRS 액체 배지(Difco)에 배양된 유산균 1.5 ㎖을 4℃, 14,000 rpm으로 1분 동안 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA(pH 8.0)로 구성된 200 ㎕의 TE 완충용액으로 현탁하였다. 여기에 60 ㎕의 라이소자임(lysozyme)을 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시킴으로써, 세포벽을 제거하였다. 상기 반응액에 10% SDS 및 프로티네이즈 K(proteinase K, 20 ㎎/㎖)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 페놀처리로 단백질을 제거하고, 0.6배의 이소아밀알코올을 첨가하여 -20℃에서 반응시켜 원심분리기로 DNA를 침전시킴으로써 염색체 DNA를 분리하였다.

상기와 같은 방법으로 분리된 삽입 벡터 pJC2로 형질전환된 락토바실러스 가세리의 염색체 DNA를 주형으로하고, 서열번호 1 및 2로 표시되는celA-F 및celA-R 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 56℃, 2시간 30분, 35사이클과 같은 조건으로 수행하였다. 형질전환시키지 않은 삽입 벡터 pJC2를 주형으로 하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 수행하여 양성 대조군으로 사용하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 레인 3에서 삽입 벡터 pJC2로 형질전환된 락토바실러스 가세리에서 1.4 kbcelA유전자가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

<3-2>celA유전자 프로브를 이용한 서던 블럿

형질전환된 락토바실러스 가세리의 염색체 DNA에 삽입 벡터 pJC2가 삽입되었는지를 확인하기 위하여, 형질전환된 락토바실러스 가세리의 염색체 DNA 및 형질전환되지 않은 락토바실러스 가세리의 염색체 DNA를 음성 대조군으로 서던 블럿(Southern blot)을 수행하였다. 상기 실시예 2-2-1과 동일한 방법으로 염색체 DNA를 분리하고, 분리된 염색체 DNA를 제한 효소ScaI,EcoRI 및KpnI으로 절단하여, 0.8% 아가로스 겔에 전기영동하여 절단된 단편을 분리하였다. 전기영동된 아가로스 겔로부터 절단된 DNA를 니트로셀룰로스막에 이동시켰다. ECL 다이렉트 핵산 라벨링 및 디텍션 시스템(ECL system, Amersham Life Science)을 사용하여, 실시예 3-1에서 얻은 1.4 kbcelAPCR 산물을 라벨링한 후, 상기 DNA가 이동된 니트로셀룰로스막을 공지의 방법에 따라 혼성화(hybridization)함으로써 서던 블럿을 수행하였다. 또한, 음성대조군으로 형질전환시키지 않은 유산균 균주의 염색체 DNA 및 플라스미드 삽입 벡터 pJC2 자체를 상기와 동일한 방법으로 서던 블럿을 수행하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 레인 2 및 3에서 락토바실러스 가세리의 염색체 DNA에 삽입 벡터 pJC2가 삽입된 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 페리틴 유전자를 포함하는 유산균용 삽입 벡터 pJC7F의 제조

상기 실시예 1에서 제조된 삽입 벡터 pJC2에 서열번호 3으로 표시되는 합성 프로모터 cp25와 550bp의 인간 헤비 체인 페리틴 유전자를 삽입하고, 이 사이에 His·Tag 유전자를 삽입하여 유산균용 삽입 벡터 pJC7F를 제조하였다. 상기 pJC7F의 개열지도를 도 6에 나타냈다.

상기 유산균용 삽입 벡터 pJC7F를 2001년 5월 14일자로 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM 10267로 기탁하였다.

<실시예 5> 삽입 벡터 pJC7F를 이용한 형질전환 및 형질전환체의 선별

실시예 2와 동일한 방법에 따라 상기 실시예 4에서 제조한 삽입 벡터 pJC7F로 락토바실러스 가세리 ATCC33323을 형질전환시킨 후, 형질전환된 락토바실러스 가세리를 선별하였다.

<실시예 6> 페리틴 유전자의 삽입 여부 확인, 발현된 페리틴 단백질의 확인 및 정제

<6-1> 페리틴 유전자의 삽입 여부 확인

형질전환된 락토바실러스 가세리의 염색체 DNA에 삽입 벡터 pJC7F가 삽입되었는지 여부를 확인하기 위하여, 실시예 3-1 및 3-2와 동일한 방법으로 PCR 및 서던 블럿을 실시하였다. 또한, PCR에 사용한 프라이머는celA유전자에 대한 프라이머 이외에, 프로모터 cp25 및 페리틴 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 4로 표시되는 프라이머를 사용하였고, 이 때의 PCR 조건은 58℃, 2시간, 35사이클로 실시하였다.

PCR 결과를 도 7에 나타냈으며, 형질전환된 락토바실러스 가세리의 염색체 DNA를 주형으로 PCR을 수행한 레인 2 및 3에서 900 bp의 DNA 밴드를 확인할 수 있었으며, 삽입 벡터 pJC7F를 주형으로 하여 PCR을 수행한 결과인 cp25 및 페리틴 유전자를 포함하는 900 bp의 DNA 밴드와 일치하는 것을 확인할 수 있었다.

<6-2> 발현된 페리틴 단백질의 확인 및 정제

삽입 벡터 pJC7F로 형질전환된 락토바실러스 가세리에서 페리틴 단백질이 발현되었는지 확인하기 위하여, 형질전환된 락토바실러스 가세리를 5 ㎍/㎖ 에리트로마이신을 포함하는 100 ㎖ MRS 액체 배지(Difco)에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 6,000 rpm으로 5 내지 7분간 원심분리하여 회수하고, His·Tag 결합 완충용액으로 현탁하였다. 세포 현탁액을 엠플리파이(amplify)를 20%로 조정하여 초당 1회씩 3분 동안 세포를 초고속 파쇄기(Sonics & materials inc.)로 파쇄하였다. 세포 파쇄액을 6,000 rpm으로 5 내지 7분간 원심분리하였다. 상층액을 His·Bind Kit(Novagen) 및 His·Tag 컬럼(column, Novagen)을 사용하여 페리틴 단백질을 정제하였다.

정제된 페리틴 단백질로 12% 세퍼레이팅 겔(separating gel) 및 5% 스택킹 겔(stacking gel)을 이용하여 공지의 방법에 따라 SDS-PAGE를 수행하였다. 이와 같은 방법으로 형질전환된 락토바실러스 가세리에서 페리틴 단백질이 발현된 것을 확인할 수 있었고, 정제된 단백질의 분자량은 23 kDa으로 나타났다. 도 8에 락토바실러스 가세리의 SDS-PAGE 수행 결과를 나타냈다. 레인 8의 세포 추출액과 비교할 때, His·Tag 컬럼을 거친 레인 2 내지 레인 7의 컬럼 용출액은 페리틴 단백질이 부분적으로 정제된 것을 알 수 있다. His·Tag 컬럼에 전체 단백질 14.4 ㎍/㎖을 로딩(loading)했을 때, 페리틴 단백질을 0.6 ㎍/㎖ 얻을 수 있었으며, 이는 전체 단백질의 4.1%에 해당하는 양으로 나타났다.

<실시예 7> 락토바실러스 존소니

락토바실러스 가세리 ATCC33323 대신 락토바실러스 존소니 NCK88을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 2 내지 6과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 도 5에celA유전자를 프로브로 사용하여 형질전환된 락토바실러스 존소니의 염색체 DNA를 서던 블럿한 결과를 나타내었다. 그 결과, 레인 4 및 5에서 상기 락토바실러스 존소니의 염색체 DNA에 삽입 벡터 pJC2가 삽입된 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 8> 락토바실러스 불가리커스

락토바실러스 가세리 ATCC33323 대신 락토바실러스 불가리커스을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 2 내지 6과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 도 5에celA유전자를 프로브로 사용하여 형질전환된 락토바실러스 불가리커스의 염색체 DNA를 서던 블럿한 결과를 나타내었다. 그 결과, 레인 8 및 9에서 상기 락토바실러스 존소니의 염색체 DNA에 삽입 벡터 pJC2가 삽입된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7에 삽입 벡터 pJC7F로 형질전환된 락토바실러스 불가리커스의 염색체 DNA를 주형으로 하여 cp25 프로모터 및 페리틴 유전자를 PCR로 증폭한 결과를 나타내었다. 그 결과, 레인 2 및 3에서 cp25 프로모터 및 페리틴 유전자를 포함하는 900 bp의 DNA 밴드를 확인할 수 있었다.

또한, 하기 표 1에 본 발명에 따른 삽입 벡터 pJC2로 형질전환시킨 유산균 균주의 형질전환 효율을 나타냈다.

숙주 세포	형질전환 효율(콜로니 수/㎍ DNA)
락토바실러스 가세리락토바실러스 존소니락토바실러스 불가리커스	1010-1530-40

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 형질전환 효율은 락토바실러스 가세리가 10 콜로니/㎍ DNA, 락토바실러스 존소니가 10 내지 15 콜로니/㎍ DNA, 락토바실러스 불가리커스가 30 내지 40 콜로니/㎍ DNA 이었으며, 본 발명의 삽입 벡터 pJC2를 이용한 형질전환체의 효율은 락토바실러스 불가리커스가 가장 높게 나타났다.

상기에서 살펴본 바와 같이. 유산균용 삽입 벡터 pJC2는 유산균 염색체 DNA에 안정적으로 삽입되었고, 이에 페리틴 유전자를 삽입시킨 pJC7F로 형질전환시킨 유산균 형질전환체에서 페리틴 단백질이 안정적으로 발현되었다. 대부분의 유산균은 β-갈락토시다아제(β-galactosidase)를 분비하고, 항생제 저항성 유전자를 선별유전자로 사용할 경우 많은 경우에 있어서 복귀변이주(revertant)를 형성하기 때문에, X-gal 및 항생제를 포함하는 배지상에서 형질전환체만을 선별하기가 어려운 단점이 있었다. 상기 단점을 해결하기 위하여, 본 발명의 삽입 벡터는 제2 선별유전자로celA유전자가 삽입되었으며, 이러한 삽입 벡터로 형질전환된 형질전환체의 셀룰라제 활성을 검출하는 방법에 의해 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다. 또한, 본 발명의 삽입 벡터는 식품등급으로 사용될 수 있는 유산균의 염색체 DNA에 삽입되어 안정적으로 복제되고, 목적유전자를 유산균 내에서 안정적으로 발현시킬 수 있다. 아울러, 유산균 내에서 발현된 목적 단백질은 독성제거 과정없이 식품첨가물 또는 약학제제로 이용될 수 있다.

Claims

그람 음성균의 복제 원점, 제1 선별유전자인 항생제 저항성 유전자, 유산균염색체 DNA로의 삽입 여부를 확인하기 위한 제2 선별유전자celA,상기celA의 프로모터 및 삽입 서열(IS: insertion sequence)을 포함하는 유산균용 삽입 벡터(integration vector).
그람 음성균의 복제 원점, 제1 선별유전자인 항생제 저항성 유전자, 유산균 염색체 DNA로의 삽입 여부를 확인하기 위한 제2 선별유전자celA,상기celA의 프로모터, 삽입 서열, 목적단백질을 암호화하는 목적유전자 및 상기 목적유전자의 프로모터를 포함하는 유산균용 삽입 벡터.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기celA의 프로모터는 나이신 A(nicin A) 유전자의 프로모터인 것을 특징으로 하는 유산균용 삽입 벡터.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 제1 선별유전자인 항생제 저항성 유전자는 에리트로마이신 저항성 유전자 또는 클로람페니콜 저항성 유전자인 것을 특징으로 하는 유산균용 삽입 벡터.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 삽입 서열은 IS1223, IS481, IS100 및 IS903으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유산균용 삽입 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 삽입 벡터는 그람 음성균의 복제 원점, 에리트로마이신 저항성 유전자, 나이신 A 유전자의 프로모터, 클로스트리디움 써모셀럼 유래의celA유전자 및 IS1223을 포함하는 유산균용 삽입 벡터 pJC2.
제 6항의 삽입 벡터 pJC2로 형질전환된 형질전환체.
제 2항에 있어서, 상기 목적단백질을 암호화하는 목적유전자가 페리틴 유전자인 것을 특징으로 하는 유산균용 삽입 벡터.
제 2항에 있어서, 상기 목적유전자의 프로모터는 서열번호 3으로 표시되는cp25 프로모터, P21, P23 및 P59로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유산균용 삽입 벡터.
제 2항에 있어서, 상기 삽입 벡터의 프로모터 및 목적단백질을 암호화하는 목적유전자 사이에 His·Tag 서열을 암호화하는 유전자가 삽입된 것을 특징으로 하는 유산균용 삽입 벡터.
제 2항에 있어서, 상기 삽입 벡터는 그람 음성균의 복제 원점, 에리트로마이신 저항성 유전자, 나이신 A 유전자의 프로모터, 클로스트리디움 써모셀럼 유래의celA유전자, IS1223, 페리틴 유전자, His·Tag 서열을 암호화하는 유전자 및 서열번호 3으로 표시되는 cp25 프로모터를 포함하는 유산균용 삽입 벡터 pJC7F(기탁번호 : KCCM 10267).
제 11항에 따른 삽입 벡터 pJC7F로 형질전환된 형질전환체.