KR100375673B1

KR100375673B1 - 피타제 생산 효모 균주를 함유하는 사료용 조성물

Info

Publication number: KR100375673B1
Application number: KR10-2000-0004429A
Authority: KR
Inventors: 이현정; 이상철; 김진욱; 신기준; 최윤재; 강승하; 복진덕
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2000-01-29
Filing date: 2000-01-29
Publication date: 2003-03-15
Also published as: KR20010076962A

Abstract

본 발명은 그람양성 세균인엔테로박터(Enterobactor) sp. 4로부터 유래한 피타제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 pGAP-phyA 및 이 백터를피치아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115 효모 균주에 도입하여 형질전환시킨 형질전환체피치아 파스토리스pGAP-phyA를 함유하는 사료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 형질전환체피치아 파스토리스pGAP-phyA는 사료첨가제로 사용할 시 사료에 연속적으로 피타제를 발현 분비하고, 또 동물의 위장을 통과한 이후 장내에서 연속적으로 피타제를 분비할 수 있으므로, 생균의 사료첨가제로 유용하다.

Description

피타제 생산 효모 균주를 함유하는 사료용 조성물 {Composition for feeding containing yeast funguses producing phytase}

본 발명은 피타제 생산 효모 균주를 함유하는 사료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 효모 균주에엔테로박터sp. 4로부터 유래된 피타제를 분비할 수 있는 새로운 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터를 피치아 파스토리스 효모균주에 도입해 형질전환시킨 형질전환체 또는 그 배양액을 함유하는 사료용 조성물에 관한 것이다.

최근 가축의 분뇨 및 축산폐수로 인한 환경 및 수질 오염의 문제가 심각하게 대두되고 있고, 그 규제 또한 강화되고 있기 때문에, 이를 줄이기 위한 연구가 많이 행해지고 있으며, 특히, 가축이 사료내 영양소를 최대한 이용할 수 있는 저공해성 사료를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

저공해성 사료를 개발하기 위해서 가장 관심이 집중되고 있는 것은 사료내 인과 질소의 함량이다. 특히 인은 핵산, 조효소, 인 단백질과 인지질들의 생합성을 형성하는데 있어 동물에게 없어서는 안되는 영양소이지만, 식물성 사료내에 존재하는 인은 단지 총합량의 20~30%만이 이용되고 나머지는 모두 배설되어 환경오염의 주원인이 되고 있다(Neison 등, J. Nutr. 101: 1289~1293(1971), Nasi 등, J. Agr. Sci. Filand. 62: 435~442.(1990)). 즉, 식물체내에 존재하는 인의 대부분은 피틴산(phytic acid)과 결합된 유기태(有機態)인의 형태로 존재하는데, 가축들, 특히 단위가축이나 물고기들은 이러한 유기태 인을 분해시킬 수 있는 피타제를 분비할 수 없기 때문에 유기태 인을 거의 대부분 그대로 배설하게 되고, 따라서 이렇게 배설된 유기태 인은 환경오염원으로 작용하여 토양과 수질을 오염시킨다. 또한, 유기태 인은 다른 영양소 및 칼슘, 마그네슘, 철 등의 필수 광물질과 결합하기 때문에, 항영양인자로서도 작용한다.

따라서, 종래 잠재적 오염원이며, 항영양인자로 작용하는 유기태 인을 가축이 이용할 수 있는 무기태 인의 형태로 전변시키는 효소인 피타제(myo-inositol haxaphosphate phosphohydrolase)를 사료내에 첨가하여 사료의 효율성을 높이는 한편 유기태 인으로 인한 환경오염을 예방 및 해결하고자 하였다.

한편, 이를 위해 본 출원인은 피타제를 보다 효과적으로 대량 생산할 수 있는 방법을 연구하게 되었고, 그 결과엔테로박터sp. 4로부터 피타제를 코딩하는 유전자 단편을 분리하고, 이를 함유하는 재조합 벡터를 제작한 후, 이 벡터를 세균으로부터 유래된 외래성 유전자를 포함하는 세균용 벡터의 숙주로 통상 사용되는 대장균 및 세균에 도입하여 형질전환체를 얻고, 이 형질전환체를 대량으로 배양한 배양액으로부터 피타제를 분리 및 회수하는 방법에 대하여 특허를 획득한 바 있다(대한민국 등록특허 142209호(1998. 03. 27)).

그러나, 이 방법은 배양액으로부터 피타제를 분리 및 정제하여야 하므로, 생산효율적인 면에서 번거롭고, 비용 또한 많이 드는 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 배양액으로부터 피타제를 분리 및 정제할 필요없이 생균 상태로 사료에 첨가할 수 있는 방법에 대하여 광범위하게 연구하게 되었고, 그 결과, 그람양성 세균인엔테로박터sp. 4 유래의 피타제를 코딩하는 유전자를 비병원성이며 무해한 미생물이어서 식품 및 의약품 생산에 안정성이 입증되었고, 최근 외래 단백질의 대량 발현을 위한 숙주로써 많이 사용되고 있으며, 가축의 장내에 서식할 수 있는피치아 파스토리스(Pichia pastoris)효모 균주에서 발현시킬 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

도 1은 엔테로박터 에스피. 4 유래의 피타제 유전자의 PCR 증폭을 실시한 후, 전기영동한 사진이다.

도 2는 본 발명에 따른 재조합 벡터 pGAP-phyA의 상세 모식도이다.

도 3은 본 발명에 따른 형질전환체피치아 파스토리스(Pichia pastoris)pGAP-phyA(KFCC-11123)에서 피타제가 발현됨을 보여주는 사진이다.

따라서, 본 발명의 목적은 가축분뇨로 인한 환경오염을 방지하고, 사료의 효율을 높이기 위해 사료에 첨가되는 피타제를 생균형태로 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 그람양성 세균인엔테로박터sp. 4 유래의 피타제를 코딩하는 유전자 단편을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 적용은 하기 발명의 상세한 설명란에 의해 당업자에게 명백하게 드러날 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 가축분뇨에 의한 수질 오염의 방지 및 사료의 효율성 증대를 위해 사료 첨가제로 사용되는 피타제를 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조하는데 있어서, 형질전환된 균주의 대량배양에 의해 생산된 피타제를 분리, 정제한 후, 이를 사료에 첨가하는 것이 아니라, 피타제를 생산하는 형질전환체 자체를 사료에 첨가할 수 있도록, 즉, 생균 형태의 사료 첨가제를 제조하기 위해, 그람양성 세균인엔테로박터sp. 4 유래의 피타제를 코딩하는 유전자 단편을 효모 균주인피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에 도입하여 형질전환시킴을 특징으로 한다. 즉, 유전자 재조합 기술에 있어서, 숙주세포는 외래 유전자의 기원에 따라 정해지므로, 세균으로부터 유래된 외래성 유전자를 포함하는 세균용 벡터의 숙주로는 통상 대장균 및 세균이 사용되지만, 본 발명에서는 그람양성 세균인엔테로박터sp. 4 유래의 피타제를 코딩하는 유전자 단편을피치아 파스토리스효모 균주에 도입하여 형질전환시킴을 특징으로 한다.

효모의 균체는 고등동물의 우수한 영양원이 될 뿐만 아니라 중요한 생화학적물질의 보고이고, 또한 효모의 대사에 의한 각종 유용물질의 생산이 가능하여 그 유용성이 증가되고 있는 실정으로, 사료 첨가제로서도 널리 사용되어져 오고 있으며, 가축의 장내에서도 서식할 수 있다.

더구나, 효모 중 메틸성(methylotropic) 효모인피치아 파스토리스는 메탄올에 의해 발현이 정교하게 잘 조절되며, 높은 발현율을 가지는 프로모터인 AOX1 프로모터를 사용할 수 있다는 장점(AOX1 프로모터의 제어하에 비메탄올(non-methanolic) 탄소원에서 외래 유전자가 발현정지(expression off) 상태로 유지되다가 메탄올 첨가에 의하여 발현이 시작됨)과 고농도의 세포배양을 할 수 있다는 장점이 있어 최근 종양 회저 인자(Tumor necrosis factor), 파상풍 독소 단편 C(Tetanus toxin fragment C), 인간 혈청 알부민(Human serum albumin) 등의 외래 단백질 대량 발현을 위한 숙주로써 많은 연구가 되고 있다.

따라서, 본 발명에서도 피타제를 생균의 사료첨가제로 제공하기 위해 숙주세포로서피치아 파스토리스효모 균주를 사용한다.

한편, 종래피치아 파스토리스효모 균주를 형질전환시키기 위하여 사용된 발현벡터의 프로모터는 유도성 프로모터인 AOX1 프로모터이지만, 갈락토스나 메탄올 등은 사료나 동물체내에서 만나기 어려운 유도인자이기 때문에, 생균으로 사용할 경우 동물체내에서 발현이 안되는 문제점이 있으므로, 본 발명에서는 발현벡터의 프로모터로서 연속적으로 발현되는(constitutive) 프로모터인 GAP(glyceraldehyde 3-phosphatate dehydrogenase) 프로모터를 사용하고,피치아 파스토리스효모 균주에서 배지속으로 분비를 유도하기 위하여 MF-α(matingfactor α) 분비인자(signal peptide)와 분비인자를 제거한엔테로박터sp. 4의 피타제 유전자 단편을 적합하게 연결시킴으로서 발현시 세포밖으로 분비되도록 한다.

본 발명에 따라 제공된 형질전환체는 사료내에 피타제를 연속적으로 분비할 수 있고, 또한, 동물의 위장을 통과한 후 소장, 대장에서 살아남는 형질전환체에 의해 장내에서도 피타제를 연속적으로 분비할 수 있으므로, 생균제로 사용할 수 있다.

이하 본 발명을 각종 실시예에 의해 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예에만 국한되는 것은 아니다.

[실시예 1]엔테로박터sp. 4 유래의 피타제의 염색체 DNA 분리

토양으로부터 분리한 미생물인엔테로박터sp. 4로 부터 염색체 DNA를 추출하기 위해 5㎖의 MSA 브로쓰에 접종하여 37℃ 진탕 배양기에서 배양하여 계대배양액으로 이용하였다. 계대배양액을 1ℓ의 MSA에 재차 접종한 후, 37℃에서 36시간 정도 배양하였다. 이들 균체를 원심분리(4℃, 5,500rpm, 10min)하여 수집한 후, 300㎖ 염수-EDTA용액(0.15M NaCl, 0.1M EDTA, pH 8.0)에 2회 세척하고, 40㎖의 염수-Tris용액 (0.1M NaCl, 10mM NaCl, O.1M Tris-HCl, pH 9.0)에 용해하였다. 그 다음, 리소자임을 1.8㎎/㎖의 농도로 첨가하여 37℃에서 10분 동안 온화하게 흔들었다.

12㎖의 Tris-SDS 용액(5%(w/v) SDS, 0.14M NaCl, 1mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 7.5)을 한 방울씩 천천히 첨가한 후, 60℃에서 20분동안 온화하게 흔들었다. 프로테이나제 K를 1㎎/㎖의 농도로 첨가한 후, 3℃에서 3시간 동안 정치시키고, 페놀 추출과 에탄올 침전에 의하여 염색체 DNA를 침전시킨 후 유리막대로 DNA를 건져서 70%(v/v) 에탄올 용액에 세척한 다음 30㎖의 SSC 용액(0.1M NaCl, 0.015M Na3 시트레이트)에 용해시켰다. DNA가 용해된 SSC 용액에 30㎕ RNAase 용액(50 ㎎/㎖)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하여서 RAN을 제거한 후 다시 페놀 추출과 에탄올 침전을 시켰다. 유리막대로 침전된 DNA를 건져서 70%(v/v) 에탄올 용액에 세척하여 3㎖ TE 완충용액(10 mM Tris-HCl, pH 8.0), 1mM EDTA)에 용해시킨 후, 0.1배 TE 완충용액을 넣고 투석을 시켜서 순수한 염색체 DNA를 얻었다.

[실시예 2]엔테로박터sp. 4 유래의 피타제를 코딩하는 유전자의 클로닝 및 염기서열 분석

피타제 유전자의 시그널 염기서열(signal sequence)에 해당하는 20개의 아미노산을 제외한 유전자를 클로닝하기 위하여 EcoR Ⅰ사이트(GAATTC)를 갖는 프라이머 EPC2 5'-ACC ACGGAA TTCGAA TTA TTT ACC GTT CCA GC-3'와 프라이머 EPN2 5'-ACC ACG AAT TCC AGA CCG CGC AAC AGC AAC-3' (30mer)를 합성한 후, 폴리머라제 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)법으로 증폭하였다. PCR 조건은 94℃에서 3분간 디내츄레이션(denaturation)시킨 다음 30사이클(cycle)의 PCR 증폭을 실시하였다. 디내츄레이션(Denaturation)은 95℃에서 30초간, 어닐링(annealing)은 58℃에서 30초, 신장(extension)은 72℃에서 100초간 그리고 마지막 사이클(cycle)에서 마지막 신장(last extension)은 72℃에서 5분간 실시하였다. PCR을 통해 증폭된 DNA는 아가로스 겔 전기영동을 통하여 확인하였다(도 1). 염기서열 및 아미노산 서열은 automatic sequencer(Perkin elmer)방법으로 분석하였고, 그 결과는 서열 번호 1에 나타내었다.

[실시예 3] 피타제를 코딩하는 유전자 발현벡터의 제작

실시예 2에서 증폭된 피타제를 코딩하는 유전자 단편을 pGAPzαA 플라스미드(invitrogen 사)의 EcoRⅠ위치에 결찰(ligation)시켜 발현벡터 'pGAP-phyA'를 작성하였다. 이 발현벡터 pGAP-phyA의 구체적인 모식도는 도 2에 나타내었다.

[실시예 4]피치아 파스토리스효모 균주에서의 형질전환

숙주세포로 히스티딘 탈수소효소(histidinol dehydrogenase) 활성이 결여된 영양소 균주인피치아 파스토리스GS115(invitrogen 사) 균주를 사용하여, 발현벡터 pGAP-phyA를 도입한 형질전환체를 얻었다.

즉, 우선 10㎍이상의 발현벡터 DNA를 얻기위하여 E. coli Top 10 F'(invitrogen 사)에 형질전환을 실시하였다. 형질전환 방법은 electroporation 방법으로 Gene Pulser Apparatus (Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 실행하였다. 정제한 발현벡터 pGAP-phyA DNA를 100㎕의 컴페턴트 세포(competent cell)와 섞은 후, 0.2cm 일렉트로포레이션 큐벳(electroporation cuvette)에 넣고, 400Ω, 25㎌, 6.25KV/cm로 형질전환시켰다. 형질전환 후, E. coli Top 10 F'를 저염 LB 배지(10g 트립톤, 5g NaCl, 5g 효모추출물 per liter)를 10N의 NaOH을 이용하여 pH 7.5로 조정하고, 항생제 제오신을 ㎖당 25㎍의 양으로 첨가한 한천 플레이트에서 배양하였다. 여기에서 자란 균주를 다시 배양하여 효모에 형질전환시킬 10㎍의 발현벡터 pGAP-phyA DNA를 추출하고, 이것을피치아 파스토리스GS115에 형질전환을실시하였다. 먼저, 발현벡터 pGAP-phyA DNA는 AvrI 제한 효소로 온침(digestion)시켜 선형 DNA로 만들어준 후 실행하였고, 숙주세포인피치아 파스토리스GS115는 YPD 배지 50㎖에 접종하여 30℃에서 하룻밤 동안 배양한 다음, 2ℓ 플라스크내 500㎖의 YPD 배지에 0.1∼0.5㎖의 배양균(culture)을 접종하여 OD600이 1.3∼1.5가 될 때까지 배양하였다. 그리고, 4℃에서 1,500×g로 5분간 원심분리한 후 500㎖의 냉각 멸균 증류수로 현탁 후 동일한 조건으로 원심분리하고 다시 250㎖의 냉각 멸균 증류수로 같은 과정을 반복하였다. 그리고 20㎖, 1㎖의 1M 솔비톨(sorbitol)을 이용하여 동일한 과정을 반복하여 최종 부피가 1.5㎖이 되는 컴페턴트 세포를 만들었다. 이 컴페턴트 세포(competent cell) 80㎕과 선형(linearized) DNA 10㎍을 섞어 0.2cm 일렉트로포레이션 큐벳에 넣고 얼음에서 5분간 배양한 후 1500volt, 200Ω에서 일렉트로포레이션하여 형질전환시켰다. 그리고 즉시 1㎖의 1M 솔비톨(sorbitol)을 붓고 멸균된 마이크로원심분리 튜브(microcentrifuge tube)에 옮긴 후 MD 플레이트에 깔고(spreading) 30℃에서 콜로니(colony)가 형성될 때까지 배양하였다.

[실시예 5] 형질전환체의 선별

상기 실시예 4에서 형성한 콜로니가 목적하는 형질전환체인지 여부를 확인하기 위하여 1단계의 선별과정을 거쳤다. 즉, 발현벡터 pGAP-phyA내에 포함되어 있는 제오신 내성 유전자(Zeocin resistant gene)가 배지내에 존재하는 제오신에 대해 저항성을 갖는 다는 것을 이용하여 하기와 같은 방법으로 항생제 내성 유전자가 도입된 형질전환체(multiple inserts transformant)를 스크리닝(screening)하였다. 즉, 피타제 스크리닝 용액(PSS; α-naphtyl phosphate 0.1%(W/V), Fast Garnet GBCsalts 0.2%(W/V), 0.6M acetate buffer(pH5.5))은 클로니가 형성된 플레이트에 부어서 갈색으로 변하는 균체를 선발하였다(도 3).

이 형질전환 균체를피치아 파스토리스pGAP-phyA로 명명하고, 2000년 1월 21일자로 한국종균협회 부설 한국 미생물보존센터(KFCC)에 기탁하였고, 수탁번호 KFCC-11123을 부여받았다.

[실시예 6]피치아 파스토리스pGAP-phyA(KFCC-11123)로부터 피타제의 발현 여부 조사

Hartingsveldt W. V., et al (1987)의 방법을 응용하여 형질전환체로부터 발현되는 피타제의 양을 분석하였다. 즉, 피타제 배양 시료를 0.25M Na·acetate(pH 5.5)와 1mM Na·phytate(Sigma)가 함유된 시약에 넣어 1㎖가 되게 하고, 각각 30℃, 40℃, 50℃, 70℃에서 30분간 반응시킨 후, 1㎖의 10% 트리클로로아세트산을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 그런 다음, 발색제로 100㎖에 3.2㎖의 H₂SO₄, 1g의 (NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O 및 7.32g의 FeSO₄·7H₂O가 첨가된 용액 2㎖을 첨가하여 분광광도계로 750nm에서 측정하였다. 그 결과, 피타제가 25.8U/L가 발현됨을 확인하였다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 형질전환체피치아 파스토리스pGAP-phyA(KFCC-11123)는 사료에 첨가되어 피타제를 사료에 연속적으로 분비할 수 있으며, 동물에 섭취된 후 장내에서도 피타제를 연속적으로 분비할 수 있으므로, 그 자체를 사료 첨가제로 사용할 수 있는 생균제로서 유용하다.

Claims

삭제
삭제
서열번호 1의 염기서열을 갖는엔테로박터sp. 4(Enterobactersp. 4) 유래의 피타제 코딩 유전자 단편을 함유하는 재조합 벡터 pGAP-phyA를피치아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115 효모 균주에 도입하여 형질전환시킨피치아 파스토리스pGAP-phyA (KFCC-11123)를 함유하는 것을 특징으로 하는 사료용 조성물.