ES2315039B1 - Construccion genica que codifica para el citocromo c y procedimiento de obtencion. - Google Patents
Construccion genica que codifica para el citocromo c y procedimiento de obtencion. Download PDFInfo
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Abstract
Construcción génica que codifica para el
citocromo c y procedimiento de obtención.
Se describe una construcción génica que
comprende (i) una primera secuencia de ácido nucleico que comprende
una secuencia de nucleótidos que codifica para un citocromo
c, y (ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido
señal; en donde el extremo 5' de dicha primera secuencia de ácido
nucleico está unido al extremo 3' de dicha segunda secuencia de
ácido nucleico. Dicha construcción génica puede ser utilizada para
construir vectores útiles para transformar, junto con un vector que
comprende los genes necesarios para la maduración del citocromo
c, una célula hospedadora y producir
citocromo c.
citocromo c.
Description
Construcción génica que codifica para el
citocromo c y procedimiento de obtención.
La invención se relaciona, en general, con un
procedimiento para la producción de citocromo c a partir de
genes sintéticos clonados en un sistema apropiado. La invención
también se refiere a construcciones génicas que comprenden la
secuencia codificante del citocromo c unida a una secuencia
que codifica un péptido señal, vectores y células hospedadoras
apropiadas para la puesta en práctica de dicho procedimiento.
El citocromo c es una proteína soluble
mitocondrial que participa en la cadena respiratoria de animales y
plantas y en la apoptosis. La proteína se sintetiza en forma de
apoproteína de unos 12 kDa, que es transportada a través de la
membrana externa de la mitocondria y pasa a localizarse en el
espacio intermembrana, donde la enzima citocromo c hemo
liasa cataliza la unión covalente de una molécula de hemo al extremo
amino terminal, quedando constituida la proteína funcional, con una
estructura globular y un peso de 12,5 kDa aproximadamente.
En el espacio intermembrana de la mitocondria,
el citocromo c realiza el transporte de electrones desde el
complejo citocromo c reductasa a la citocromo c
oxidasa en la cadena de transporte de electrones respiratoria, lo
que proporciona energía en forma de ATP para los procesos celulares
dependientes de energía.
Aparte de la función mencionada, el citocromo
c es uno de los componentes claves en la respuesta celular a
daños graves e infecciones, conocida como apoptosis o muerte
celular programada. Mediante la apoptosis, los organismos
pluricelulares controlan su salud eliminando células que han sido
dañadas de modo irreversible por causas diversas y limitan la
extensión de las infecciones mediante el suicidio celular.
El citocromo c sale de la mitocondria al
citosol en respuesta a una serie de estímulos que indican que la
célula está estresada. Dichos estímulos causan la apertura de unos
poros transitorios en la membrana mitocondrial, que permiten la
salida del citocromo c al citosol donde se une a otras
moléculas (Apaf-1, procaspasa-9 y
dATP), para formar el llamado apoptosoma. Dicho apoptosoma activa la
caspasa-9, que activa las
caspasas-3, 6 y 7 que son enzimas efectoras de la
apoptosis.
Actualmente se relaciona la disfunción en la
apoptosis (por exceso o por defecto) con enfermedades
degenerativas, coronarias y con cáncer, por lo que la producción
del citocromo c humano tiene indudable interés para el
desarrollo de métodos diagnósticos (por ejemplo mediante el diseño
de anticuerpos) o cualquier otra aplicación terapéutica. En cuanto
a las plantas, la apoptosis es la respuesta a distintos tipos de
estrés e infecciones, por lo que las aplicaciones de métodos
diagnósticos basados en niveles de citocromo c tiene interés
en la optimización de cultivos. Por tales motivos, seria
conveniente disponer de un sistema que permitiera producir citocromo
c, de cualquier especie, de forma sencilla y económica, en
las cantidades deseadas.
Tanaka et al. (J. Biochem., 1988, 103,
954-961) describen la producción de citocromo
c humano en pequeñas cantidades (sólo realizan estudios
analíticos) a partir de ADN complementario (ADNc) clonado en un
plásmido y expresado en Saccharomyces cerevisiae.
Tal como se ha mencionado previamente, seria
conveniente disponer de un sistema útil para producir, en las
cantidades deseadas, citocromo c, de cualquier especie, de
forma sencilla y económica. Los inventores han observado que es
posible cumplir dicho objetivo mediante el desarrollo de una
construcción génica que comprende una secuencia de nucleótidos que
codifica para un citocromo c fusionada por su extremo 5' al
extremo 3' de una secuencia de nucleótidos que codifica para un
péptido señal.
Por tanto, en un aspecto, la invención se
relaciona con dicha construcción génica que comprende: (i) una
primera secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica para un citocromo c, y (ii) una
segunda secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica para un péptido señal, en donde el extremo
5' de dicha primera secuencia de ácido nucleico está unido al
extremo 3' de dicha segunda secuencia de ácido nucleico. Dicha
construcción génica puede contener, además, secuencias de ácido
nucleico adicionales que incluyan un sitio de unión al ribosoma y
una región terminadora de la traducción.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un vector que comprende dicha construcción génica. Dicho vector
puede ser utilizado para transformar una célula hospedadora
apropiada capaz de expresar la construcción génica de la
invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona, por
tanto, con una célula hospedadora que comprende dicha construcción
o dicho vector.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un procedimiento para la producción de citocromo c que
comprende cultivar una célula hospedadora
co-transformada con (i) un vector que comprende
dicha a construcción génica y con (ii) un vector que comprende los
genes necesarios para la maduración del citocromo c, y, si se
desea, aislar y purificar el citocromo c producido.
Un procedimiento como el proporcionado por esta
invención permite obtener citocromo c de forma sencilla,
económica y reproducible, en las cantidades deseadas.
La Figura 1 ilustra la secuencia de nucleótidos
del gen sintético que codifica para el citocromo c de
Arabidopsis sp. Los extremos cohesivos BamHI y
EcoRI se incorporan a los extremos 5' y 3' respectivamente
de la construcción para facilitar la inserción en el vector de
expresión pBluescript II (SK+) (PBS).
La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótido
del gen sintético que codifica para el citocromo c humano.
Los extremos cohesivos BamHI y EcoRI se incorporaron a
los extremos 5' y 3' respectivamente de la construcción para
facilitar la inserción en el vector de expresión pBS.
La Figura 3 ilustra los vectores pCitH y pCitA
que se construyeron insertando el gen sintético en el sitio de
clonación del plásmido pBS. El gen se encuentra bajo el control del
promotor lac. Delante del gen se traduce primero un fragmento
truncado del gen lacZ, cuya señal de fin de la traducción
(en negrita) se solapa con el inicio de la traducción del gen. En
los recuadros punteados se muestran las secuencias de unión a
ribosomas. Tras el inicio de la traducción del
gen aparece la secuencia AAA (en un recuadro) la cual se corresponde con un potenciador del inicio de la traducción.
gen aparece la secuencia AAA (en un recuadro) la cual se corresponde con un potenciador del inicio de la traducción.
En un aspecto, la invención se relaciona con una
construcción génica, en adelante construcción génica de la
invención, que comprende:
- a)
- una primera secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un citocromo c, y
- b)
- una segunda secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido señal;
en donde el extremo 5' de dicha
primera secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 3' de
dicha segunda secuencia de ácido
nucleico.
La primera secuencia de ácido nucleico contiene
la secuencia de nucleótidos que codifica para el citocromo c
respiratorio de cualquier especie. No obstante, en una realización
particular, dicha primera secuencia de ácido nucleico se selecciona
entre la secuencia de nucleótidos que codifica para el citocromo
c de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 1) y la
secuencia de nucleótidos que codifica para el citocromo c de
Homo sapiens (SEQ ID NO: 12).
La segunda secuencia de ácido nucleico contiene
la secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido señal. Tal
como se utiliza en esta descripción, "péptido señal" se
refiere a una secuencia de aminoácidos presente en el extremo amino
terminal de formas precursoras (pre-proteínas) de
proteínas de membrana o de proteínas que se exportan o secretan al
exterior celular (es decir, proteínas que sufren una translocación
desde su sitio de síntesis hasta la membrana citoplasmática o a
través de la misma) que es esencial para iniciar dicha
translocación aunque resulta escindido durante la misma. En
general, un péptido señal comprende una secuencia de
15-30 restos de aminoácidos de los cuales, en el
extremo amino terminal suele haber uno o más aminoácidos básicos,
en la parte central suele haber unos 6 ó 7 aminoácidos hidrófobos, y
el extremo carboxilo terminal es hidrófilo y contiene la zona
reconocida y cortada por la peptidasa del líder. El aparato para la
exportación de la proteína consta de una serie de proteínas,
denominadas "proteínas Sec" (sistema secretor normal). Las
principales proteínas Sec parece que forman un complejo en la
membrana citoplasmática. Durante su tránsito a través del sistema
Sec, una proteasa especial, denominada endopeptidasa del líder o
peptidasa Led rompe el final de la secuencia señal de la
pre-proteína y la proteína madura pasa al otro lado
de la membrana citoplasmática o queda en dicha membrana. Por tanto,
dicho péptido señal, codificado por la segunda secuencia de ácido
nucleico de la construcción génica de la invención, interviene en
el transporte a través de la membrana de la proteína codificada por
dicha primera secuencia de ácido nucleico, así como en su
maduración. De forma más concreta, en la presente invención, el
péptido señal constituye una señal celular para que la proteína a
la que está unida (citocromo c) sea transportada a través de
la membrana citoplasmática y, a la vez, el sistema de maduración
separe a la proteína de dicho péptido señal mediante el
reconocimiento de una secuencia de corte para rendir la proteína
madura (citocromo c). Prácticamente cualquier péptido señal
susceptible de ser reconocido por un sistema de expresión
apropiado, tal como un sistema de expresión procariota o eucariota,
podría ser utilizado en la presente invención. No obstante, en una
realización particular, dicho sistema de expresión es un sistema de
expresión procariota y dicho péptido señal puede ser un péptido
señal perteneciente al sistema Sec (reconocido y madurado
correctamente por sistemas procariotas) o péptidos señal de otros
sistemas de transporte, tales como los de las hidrogenasas. A modo
ilustrativo, dicho péptido señal podría ser, por ejemplo, el
péptido señal de la lipoproteína de Serratia marcesens, el de
la proteína de unión a maltosa MalE, el de la
\beta-lactamasa de Staphylococcus aureus,
el de la proteína transportadora PhoE (OmpE) de Escherichia
coli, el de la fosfatasa alcalina PhoA, etc. No obstante, en
una realización particular, dicha segunda secuencia de ácido
nucleico de la construcción génica de la invención comprende la
secuencia de nucleótidos que codifica para el péptido señal del
citocromo c_{6} de Anabaena sp. (SEQ ID NO: 2).
La construcción génica de la invención puede
contener, ventajosamente, secuencias de ácido nucleico adicionales
útiles para aumentar la producción y/o para facilitar la
purificación del citocromo c codificado por dicha primera
secuencia de ácido nucleico presente en la construcción génica de
la invención.
Por tanto, en una realización particular, la
construcción génica de la invención comprende, además de dichas
primera y segunda secuencias de ácido nucleico, una tercera
secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que define un sitio de unión al ribosoma, en donde el
extremo 3' de dicha tercera secuencia de ácido nucleico está unido
al extremo 5' de dicha segunda secuencia de ácido nucleico. El
sitio de unión al ribosoma, que precede a la región codificante en
el ARN mensajero (ARNm), comprende la región a la que se une el
ribosoma para comenzar la traducción. Adicionalmente, si se desea,
dicha tercera secuencia de ácido nucleico puede incluir una región
potenciadora del inicio de la traducción.
En otra realización particular, la construcción
génica de la invención comprende, además de dichas primera y
segunda secuencias de ácido nucleico, una cuarta secuencia de ácido
nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que define una
región terminadora de la traducción, en donde el extremo 5' de
dicha cuarta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 3'
de dicha primera secuencia de ácido nucleico.
En otra realización particular, la construcción
génica de la invención comprende, además de dichas primera y
segunda secuencias de ácido nucleico, dichas tercera y cuarta
secuencias de ácido nucleico previamente definidas. En este caso,
dichas tercera y cuarta secuencias de ácido nucleico están
separadas entre sí por dichas primera y segunda secuencias de ácido
nucleico. A modo ilustrativo, el extremo 3' de dicha tercera
secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha
segunda secuencia de ácido nucleico y, a su vez, dicha segunda
secuencia de ácido nucleico está unida por su extremo 3' al extremo
5' de dicha primera secuencia de ácido nucleico, la cuál se
encuentra, a su vez, unida por su extremo 3' al extremo 5' de dicha
cuarta secuencia de ácido nucleico.
Para facilitar el clonaje de la construcción
génica de la invención en un vector, dicha construcción génica de
la invención puede contener, ventajosamente, una secuencia de ácido
nucleico que define una secuencia de reconocimiento de una primera
enzima de restricción en el extremo 5' de la construcción génica de
la invención, y otra secuencia de ácido nucleico que define una
secuencia de reconocimiento de una segunda enzima de restricción en
el extremo 3' de dicha construcción, en donde dichas primera y
segunda enzimas de restricción pueden reconocer dianas de
restricción iguales o diferentes. En una realización particular de
la invención, la construcción génica de la invención comprende, en
su extremo 5', una secuencia de nucleótidos que define una diana de
restricción para la enzima EcoRI y, en su extremo 3', una
secuencia de nucleótidos que define una diana de restricción para
la enzima BamHI.
La construcción génica de la invención puede
obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en
el estado de la técnica por los expertos en la materia (Sambrook
et al. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. 2ª ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory,
NY.).
La construcción génica de la invención puede ser
insertada en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la
invención se relaciona con un vector que comprende dicha
construcción génica de la invención. La elección del vector
dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir
posteriormente. A modo ilustrativo, el vector donde se introduce la
construcción génica proporcionada por la invención puede ser un
plásmido o un vector que, cuando se introduce en la célula
hospedadora, se integra o no en el genoma de dicha célula. La
obtención de dicho vector puede realizarse por métodos
convencionales conocidos por los técnicos en la materia (Sambrook
et al. (1989) citado supra).
El vector de la invención puede ser utilizado
para transformar células susceptibles de ser transformadas por
dicho vector. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona
con una célula hospedadora que comprende la construcción génica de
la invención o un vector proporcionado por esta invención, que ha
sido transformada con dicho vector proporcionado por esta
invención. En general, dicha célula hospedadora proporcionada por
esta invención es capaz de expresar la secuencia de ácido nucleico
codificante del citocromo c y del péptido señal presentes en
la construcción génica de la invención.
Aunque dicha célula hospedadora puede ser una
célula eucariota, en una realización preferida de esta invención,
la célula a transformar es una célula procariota, tal como una
bacteria, que puede ser Gram positiva o Gram negativa, tal como
Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Salmonella
tiphymurium, etc. En una realización particular, la bacteria
transformada es Escherichia coli.
Cuando la célula a transformar con el vector
proporcionado por esta invención es una célula eucariota, por
ejemplo, una levadura, habría que utilizar plásmidos, codones,
secuencias de unión al ribosoma y señales de transporte y maduración
propias de dichas células eucariotas.
La construcción génica de la invención puede ser
utilizada para producir una proteína eucariota (citocromo c)
en una célula hospedora. Dicha célula hospedadora puede ser una
célula eucariota o, ventajosamente, una célula procariota.
El citocromo c lleva como grupo
prostético un grupo hemo que la célula hospedadora ha de producir e
incorporar a la apoproteína para obtener la proteína madura. Por
tanto, para producir citocromo c es necesario que la célula
hospedadora exprese la maquinaria celular requerida para el
transporte y la unión del grupo hemo a la proteína y para el
correcto plegamiento y maduración de ésta, lo que puede conseguirse
co-transformado la célula hospedadora que comprende
la construcción génica de la invención o el vector proporcionado
por la invención con un segundo vector que comprende los genes
necesarios para la maduración del citocromo c. En una
realización particular, dicho segundo vector que incluye los genes
necesarios para llevar a cabo la maduración del citocromo c
comprende los genes ccm de E. coli que, como es
conocido, son necesarios para la maduración de citocromo c
en el periplasma de E. coli.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con una célula hospedadora que comprende la construcción
génica de la invención o un vector proporcionado por la invención y
un segundo vector que comprende los genes necesarios para la
maduración del citocromo c, tal como los genes ccm.
Dicha célula hospedadora puede obtenerse mediante
co-transformación con un vector proporcionado por la
invención y con un segundo vector que comprende los genes
necesarios para la maduración del citocromo c. En una
realización particular, dicha célula hospedadora
co-transformada con dichos vectores es una célula
procariota, tal como una bacteria, por ejemplo, E. coli.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un procedimiento para producir citocromo c, en forma de
proteína madura, que comprende cultivar una célula hospedadora
proporcionada por esta invención bajo condiciones que permiten la
producción de dicho citocromo c. Las condiciones para llevar
a cabo y optimizar el cultivo de la célula hospedadora de la
invención, dependerán de la célula hospedadora utilizada, y son
conocidas por los expertos en la materia.
De forma más concreta, la invención proporciona
un procedimiento para producir citocromo c que
comprende:
- a)
- co-transformar una célula hospedadora con (i) un vector proporcionado por esta invención que comprende la construcción génica de la invención y con (ii) un vector que comprende los genes necesarios para la maduración del citocromo c, tal como los genes ccm;
- b)
- cultivar una célula hospedadora co-transformada según la etapa a), bajo condiciones que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica para el citocromo c fusionado al péptido señal, y
- c)
- si se desea, aislar y purificar el citocromo c.
La co-transformación de dicha
célula hospedadora con dichos vectores puede realizarse por métodos
convencionales conocidos por los técnicos en la materia (Sambrook
et al. (1989) citado supra). Las condiciones para
llevar a cabo y optimizar el cultivo de la célula hospedadora
dependen de la célula hospedadora utilizada y son conocidas por los
expertos en la materia. Asimismo, el citocromo c producido
puede ser, si se desea, aislado y purificado mediante
procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la
materia. En el Ejemplo 1.4 se describe un procedimiento para aislar
y purificar citocromo c de A. thaliana y citocromo
c humano.
Prácticamente cualquier citocromo c, de
cualquier especie, tanto animal (incluida el hombre) como vegetal,
puede ser obtenido mediante el procedimiento proporcionado por esta
invención. Para ello, basta con insertar la secuencia de ácido
nucleico que codifica para el citocromo c deseado. Dicha
secuencia es conocida o puede ser obtenida en las bases de datos o
bien puede ser obtenida en base a la información de secuencias
ortólogas en otras especies cuyas secuencias codificantes del
citocromo c, o la secuencia de aminoácidos del citocromo
c, sean conocidas.
En una realización particular, el citocromo
c producido mediante el procedimiento proporcionado por esta
invención es citocromo c humano (H. sapiens) o
citocromo c de A. thaliana.
El citocromo c producido según el
procedimiento de esta invención puede ser utilizado en cualquiera
de sus aplicaciones habituales. A modo ilustrativo, el citocromo c
humano puede ser utilizado, por ejemplo, en el desarrollo de métodos
diagnósticos contra enfermedades degenerativas y coronarias;
asimismo, el citocromo c de A. thaliana puede ser
utilizado en la optimización de cultivos en el caso de
vegetales.
El siguiente ejemplo sirve para ilustrar la
invención y no debe ser considerado con fines limitativos de la
misma.
Para el diseño de este gen artificial se partió
de la secuencia de aminoácidos del citocromo c de A.
thaliana que se encuentra recogida en la base de datos NCBI con
el número de acceso NP_192742. A partir de la secuencia
aminoacídica de dicha proteína se diseñó el gen sintético por
traducción reversa mediante el empleo de la aplicación informática
Backtranslation tool v 2.0, a la que se accede desde la página web
de Entelechon, seleccionándose los codones más frecuentes de E.
coli. La secuencia del gen sintético codificante del citocromo
c de A. thaliana obtenida por traducción reversa
tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1.
A dicho gen sintético se le realizaron las
siguientes modificaciones:
- al extremo 5' se le añadieron las siguientes
secuencias:
- \bullet
- una secuencia que comprende la secuencia codificante del péptido de tránsito del citocromo c_{6} de Anabaena [SEQ ID NO: 2];
- \bullet
- una secuencia que comprende un sitio de unión al ribosoma (aggagg); y
- \bullet
- una secuencia que comprende un sitio de corte de la enzima de restricción BamHI (ggatcc); y
- al extremo 3' se le añadieron las siguientes
secuencias:
- \bullet
- una secuencia que comprende un terminador doble de la traducción (tgatga); y
- \bullet
- una secuencia que comprende un sitio de corte de la enzima de restricción EcoRI (gaattc).
La presencia de dichos sitios de corte de las
enzimas de restricción BamHI en el extremo 5' y EcoRI
en el 3' es necesaria para unir toda la construcción con el plásmido
pBS (Stratagene).
El gen artificial resultante, que comprende la
secuencia codificante del citocromo c de A. thaliana,
tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 3.
La obtención de dicho gen sintético se realizó
mediante la reacción en cadena de la polimerasa de ADN (PCR),
usando dos oligonucleótidos convencionales [SEQ ID NO: 4 y SEQ ID
NO: 5] y seis oligonucleótidos [SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID
NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11]. Cinco de dichos
oligonucleótidos [SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID
NO: 9 y SEQ ID NO: 10] son largos (de entre 68 y 107 bases) y
solapan por sus extremos en unas 20 bases. Los oligonucleótidos
fueron generados mediante síntesis química por la empresa
Sigma-Genosys.
Brevemente, la mezcla de PCR contenía: 2,2 mM de
cada deoxinucleótidotrifosfato (dNTP), 1 \muM de cada
oligonucleótido (CR1, CR2, A1, A2, A3, A4, A5 y A6) [SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:
9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11], 1 U de la polimerasa Expand High
Fidelity (Roche) y su correspondiente tampón estándar, con
MgCl_{2}, en un volumen final de reacción de 50 \muL, más 50
\muL de aceite mineral. El programa de la PCR fue: 1 min a 95ºC,
1 min a 46ºC, 2 min a 72ºC, más 30 ciclos de 1 min a 95ºC, 1 min a
55ºC, 2 min a 72ºC y un paso final de 10 min a 72ºC en una máquina
Mastercycler 53330 (Eppendorf). De esta primera PCR se obtuvo el ADN
molde que se usó en una segunda PCR para amplificar el gen. El ADN
que iba a usarse como molde se purificó por medio de un sistema
comercial (GFX PCR ADN y Gel Band Purification Kit, de Amersham
Biosciences) siguiendo las instrucciones del fabricante y se
cuantificó en un gel de agarosa (tal como se explica más adelante).
En la segunda PCR se usaron las mismas condiciones que en la
primera y la mezcla de reacción fue la siguiente: 1 nM de ADN
molde, 2,2 mM de cada dNTP, 1 \muM de los oligonucleótidos CR1 y
A6 [SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 11], 1U de la polimerasa Expand High
Fidelity (Roche) y su correspondiente tampón estándar, con
MgCl_{2}, en un volumen final de reacción de 50 \muL, más 50
\muL de aceite mineral.
El resultado de la PCR se visualizó y cuantificó
por electroforesis en un gel de agarosa al 1% (p/v) en tampón TBE
(Tris-borato 90 mM, EDTA 2 mM, pH 8) diluido al 50%
(v/v) y con bromuro de etidio a una concentración de 5 \mug/mL.
Este proceso se realizó según un protocolo estándar (Sambrook et
al. (1989) citado supra). Del gel de agarosa se
extrajeron las bandas correspondientes al tamaño de ADN esperado
[437 pares de bases (pb)]. Las electroforesis se llevaron a cabo en
aparatos ADN Sub Cell (Bio-Rad). A cada muestra se
añadió 1/10 del volumen de tampón de carga, que es una mezcla de
azul de bromofenol 0,25% (p/v), xileno-cianol 0,25%
(ply) y glicerol 30% (v/v) en agua.
Para determinar el tamaño y la cantidad de ADN
de los fragmentos sometidos a electroforesis se compararon con
marcadores comerciales (DNA molecular Weight Marker VII, X y XIII
de Roche Applied Science).
Tras la electroforesis se visualizó el ADN
iluminando con luz UV de 302 nm, utilizándose para ello un
transiluminador LKB modelo Macro Vue. Los geles se fotografiaron
con un equipo UVP Imagestore GDS-5000. Los
fragmentos fueron purificados mediante el sistema comercial GFX PCR
ADN y Gel Band Purification Kit de Amersham Biosciences según las
instrucciones del fabricante, resultando el ADN puro para las
siguientes manipulaciones. Las secuencias amplificadas fueron
clonadas en el vector pGEM-T (del
pGEM-T cloning kit II de Promega) que es un plásmido
linearizado en EcoRV y que lleva una timidina terminal
añadida a cada extremo 3'. Esta característica mejora su ligación
con fragmentos de ADN procedentes de PCR, ya que muchas polimerasas
de ADN añaden una adenina al extremo 3' de las cadenas de ADN que
sintetizan. Éste es el caso de una parte de las moléculas de ADN que
sintetiza la polimerasa de ADN Expand High Fidelity. Para la
clonación en pGEM-T se realizó una ligación, en la
cual se mezclaron en un vial cantidades de plásmido y de ADN
amplificado en proporción 1:3, junto con 3 U de ADN ligasa T4 y su
tampón, en un volumen final de 10 \muL, se incubó la reacción
durante 16 horas a 16ºC y posteriormente se utilizó el ADN
resultante en una transformación de E. coli. Para esta parte
del trabajo se utilizó la estirpe DH5\alpha. Para realizar una
transformación es necesario preparar previamente las células de
forma que puedan adquirir el ADN, denominándose entonces células
competentes.
Para el diseño de este gen artificial se siguió
sustancialmente el mismo protocolo que el descrito previamente en
relación con la construcción del gen artificial que comprende la
secuencia codificante de citocromo c de A. thaliana
(apartado 1.1). En este caso, se partió de la secuencia de
aminoácidos del citocromo c de H. sapiens que se
encuentra recogida en la base de datos NCBI con el número de acceso
AAH05299 y, a partir de dicha secuencia de aminoácidos se diseñó el
gen sintético por traducción reversa mediante el empleo de la
aplicación informática Backtranslation tool v 2.0, seleccionándose
el empleo de codones de E. coli. La secuencia del gen
sintético codificante del citocromo c de H. sapiens
obtenida por traducción reversa tiene la secuencia mostrada en la
SEQ ID NO: 12.
A dicho gen sintético se le realizaron las
mismas modificaciones que al gen sintético codificante del
citocromo c de A. thaliana obtenida por traducción
reversa (apartado 1.1). El gen artificial resultante, que comprende
la secuencia codificante del citocromo c de H.
sapiens, tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 13.
La obtención de dicho gen sintético se realizó
mediante PCR, usando dos oligonucleótidos convencionales [SEQ ID
NO: 4 y SEQ ID NO: 5] y ocho oligonucleótidos [SEQ ID NO: 14, SEQ
ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:
19, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21]. Algunos de dichos
oligonucleótidos [SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ
ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20] son largos (de entre 61 y
101 bases) y solapan por sus extremos en unas 20 bases. Los
oligonucleótidos fueron generados mediante síntesis química por la
empresa Sigma-Genosys.
Brevemente, la mezcla de PCR contenía: 2,2 mM de
cada dNTP, 1 \muM de cada oligonucleótido (CR1,CR2, H1, H2, H3,
H4, H5, H6, H7 y H8) [SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 14,
SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID
NO: 19, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO. 21], 1 U de la polimerasa Expand
High Fidelity (Roche) y su correspondiente tampón estándar, con
MgCl_{2}, en un volumen final de reacción de 50 \muL, más 50
\muL de aceite mineral. El programa de la PCR fue el mismo que el
utilizado en el apartado 1.1. De la primera PCR se obtuvo el ADN
molde que se usó en una segunda PCR para amplificar el gen. El ADN
que iba a usarse como molde se purificó tal como se ha indicado
previamente y se cuantificó en un gel de agarosa (apartado 1.1). En
la segunda PCR se usaron las mismas condiciones que en la primera y
la mezcla de reacción fue la siguiente: 1 nM de ADN molde, 2,2 mM
de cada dNTP, 1\muM de los oligonucleótidos CR1 y H8 [SEQ ID NO: 4
y SEQ ID NO: 21], 1U de la polimerasa Expand High Fidelity (Roche)
y su correspondiente tampón estándar, con MgCl_{2}, en un volumen
final de reacción de 50 \muL, más 50 \muL de aceite.
El resultado de la PCR se visualizó y cuantificó
por electroforesis en un gel de agarosa al 1% (p/v) en tampón TBE
diluido al 50% (v/v) y con bromuro de etidio a una concentración de
5 \mug/mL, tal como se ha indicado previamente (apartado 1.1). Del
gel de agarosa se extrajeron las bandas correspondientes al tamaño
de ADN esperado [416 pb]. Las electroforesis se llevaron a cabo de
la forma indicada en el apartado 1.1.
El tamaño y la cantidad de ADN de los fragmentos
sometidos a electroforesis fueron determinados comparando con
marcadores comerciales (DNA molecular Weight Marker VII, X y XIII
de Roche Applied Science) tal como se indica en el apartado 1.1.
Tras la electroforesis el ADN se visualizó con
luz UV de 302 nm y los geles se fotografiaron (apartado 1.1). Los
fragmentos fueron purificados según lo indicado en el apartado 1.1,
resultando el ADN puro para las siguientes manipulaciones. Las
secuencias amplificadas fueron clonadas en el vector
pGEM-T (Promega) según el protocolo mencionado en
el apartado 1.1 y el ADN resultante se utilizó posteriormente para
transformar células competentes de E. coli DH5\alpha según
el protocolo que se describe a continuación.
Para la preparación de células competentes de
E. coli se cultivaron en 100 mL de medio líquido SOB
(Triptona 20 g/L, extracto de levadura 5 g/L, NaCl 0,5 g/L, KCl 2,5
mM y MgCl_{2} 10 mM) con agitación vigorosa hasta alcanzar una
absorbancia de 0,45-0,65 a 580 nm. Tras mantener el
cultivo en hielo durante 10 min, las células se recogieron por
centrifugación (5 min a 750 x g, 4ºC) y se resuspendieron en 30 mL
de solución RF1 (tampón acetato potásico 30 mM, pH 5,8, RbCl_{2}
100 mM, MnCl_{2} 50 mM, CaCl_{2} 10 mM y glicerol al 15% (p/v))
fría esterilizada por filtración. Tras mantener la solución en
hielo durante 5 min, se repitió el proceso de centrifugación
anterior y se resuspendieron las células en 4 mL de solución RF2
fría (tampón MOPS-NaOH 10 mM, pH 7,0, RbCl_{2} 10
mM, CaCl_{2} 75 mM y glicerol al 15%(p/v)). Las células así
preparadas se congelaron en nitrógeno líquido y se conservaron a
-80ºC en alícuotas de 200 L. La competencia de las células se
comprobó transformándolas con cantidades conocidas de ADN
plasmídico, obteniéndose en torno a 10^{7} transformantes/\mug
de ADN.
Para transformar las células competentes, el ADN
transformante se mezcló con una alícuota de células competentes
descongelada en hielo. Tras incubar 30 minutos en hielo, se
sometieron a choque térmico de 100 s a 42ºC y se volvieron a incubar
en hielo durante 2 min. La suspensión se suplementó posteriormente
con 0,8 mL de medio LB (NaCl 10 g/L, Triptona 10g/L, Extracto de
levadura 5 g/L, pH 7) y se incubó durante 1 hora a 37ºC en
agitación. A continuación, las células se sembraron en medio LB
sólido (LB más agar a 15 g/L) con ampicilina 100 \mug/mL y se
recogieron las placas a las 12 horas.
Dado que el plásmido pGEM-T
permite identificar clones portadores de moléculas recombinantes
gracias a la inactivación por inserción del gen lacZ, el
medio se suplementó con X-Gal (0,2 \muM) e IPTG
(16 \muM) para seleccionar en medio sólido colonias que llevasen
algún inserto que inactivase el gen lacZ. Las colonias con
plásmidos recombinantes mostraron color blanco, frente al color azul
de las que llevaban el plásmido sin inserto. Tras incubar 12 h a
37ºC se seleccionaron varios clones de color blanco para analizar
su ADN plasmídico, para lo cual se cultivaron en medio LB líquido
durante 12h a 37ºC y se realizó una minipreparación de ADN de los
cultivos mediante el sistema High Pure Plasmid Isolation Kit de
Roche. Una pequeña parte del ADN se sometió a análisis de
restricción, cortando los plásmidos con BamHI y EcoRI
(de Roche) y visualizándolos por electroforesis en gel de agarosa.
Se seleccionaron los clones que portaban los genes sintéticos.
Se procedió entonces a la clonación direccional
en el plásmido que se iba a usar como vector de expresión de las
proteínas (pBS) Para ello, se purificaron, tal como se ha explicado
con anterioridad, las bandas de ADN correspondientes a los genes
cortados en sus extremos con BamHI y EcoRI y el
plásmido pBS cortado con BamHI y EcoRI.
Posteriormente se realizó una ligación dirigida de estos fragmentos
con el plásmido de modo similar a lo explicado anteriormente,
obteniéndose los plásmidos recombinantes pCitA (con el gen
sintético que codifica el citocromo c de A. thaliana)
y pCitH (con el gen sintético que codifica el citocromo c de
H. sapiens) [Figura 1]. Una vez construidos los plásmidos
por ligación se realizó una transformación de E. coli
DH5\alpha con cada uno de los plásmidos recombinantes, se
cultivaron en las placas de LB como se ha explicado anteriormente,
se seleccionaron los clones de color blanco, se cultivaron los
clones en LB líquido, se extrajo el ADN plasmídico de los clones y
se analizó mediante restricción con BamHI y EcoRI y
electroforesis en gel de agarosa, de modo que se seleccionaron
tanto los clones de E. coli DH5\alpha que contenían el
plásmido pCitA como aquellos que contenían pCitH. Por último, se
enviaron los plásmidos purificados a un servicio de secuenciación
de ADN (Sistemas Genómicos) para comprobar que la PCR no había
introducido modificaciones en las secuencias y se guardaron los
clones positivos.
El citocromo c lleva como grupo
prostético un grupo hemo que la bacteria ha de producir e
incorporar a la apoproteína para obtener la proteína madura. Para
superproducir el citocromo c es necesario, pues, que E.
coli sobreexprese toda la maquinaria celular requerida para el
transporte y la unión del grupo hemo a la proteína, y para el
correcto plegamiento y maduración de ésta, y eso se consigue
co-transformando las células con pCitA o bien pCitH
junto con el plásmido pEC86 (Arslan et al., 1998, Biochem.
Biophys. Res. Commun. 251, 744-747) que sobreexpresa
los genes ccm (Th6ny-Meyer et al.,
1995, J. Bacteriol. 177, 4321-4326) necesarios para
la maduración de citocromos de tipo c en el periplasma de
E. coli. pEC86 se selecciona con una resistencia a
cloranfenicol, y los plásmidos derivados de pBS se seleccionan con
una resistencia a ampicilina, así que para producir los citocromos
c se transformó la estirpe de E. coli BL21 con ambos
plásmidos y se cultivó con los dos antibióticos. La estirpe y las
condiciones óptimas para la producción de las proteínas se
seleccionaron mediante una serie de pruebas de expresión, en las
que se varia la estirpe de E. coli, el tiempo, temperatura y
condiciones de oxigenación de los cultivos y se valora la
producción de citocromo c en las diferentes condiciones. La
estimación de la producción de citocromo c se realiza
comparando el espectro de absorción de la solución resultante de la
extracción del periplasma de las bacterias, ya que los citocromos
c en estado reducido tienen un espectro de absorción
característico con un máximo a 550 nm.
Para obtener cantidades reproducibles de
proteína en las sucesivas rondas de producción, se estableció una
fuente común de inóculos bacterianos transformados y congelados. La
estirpe seleccionada de E. coli fue BL21, y se explica a
continuación el protocolo de preparación de dichas células.
Brevemente, las células se cultivaron a partir de una colonia en un
frasco de LB líquido con 25 mL durante una noche; de ahí se tomó 1
mL y se cultivó de nuevo en un frasco con 25 mL de LB hasta alcanzar
la fase de crecimiento exponencial (4-5 h), momento
en el que se recogieron la células por centrifugación. A partir de
aquí se realizó todo el resto del proceso a 4ºC. Se lavaron las
células con una solución estéril de glicerol al 10% (p/v) y por
último se resuspendieron las células en 2 mL de la misma solución,
se congelaron en nitrógeno líquido y se conservaron a -80ºC en
alícuotas de 50 \muL.
La transformación se realizó por
electroporación, tomándose para ello una cubeta de electroporación
estéril a la que se añadieron 50 \muL de células electroporables
más 1 pL de ADN de pEC86 y 1 \muL de pCitA o pCitH
(aproximadamente 40 ng de cada plásmido); la mezcla se incubó en
hielo durante 1 minuto y se dio un pulso de corriente en el
electroporador Easyject optima de Equibio a 2.500 V. Inmediatamente
se añadió 1 mL de LB, después se incubó en agitación a 37ºC durante
1 h y se inoculó con ello un matraz de 50 mL de LB selectivo (con
los dos antibióticos). Se mantuvo en agitación a 37ºC durante una
noche y después se recogieron 30 mL del cultivo por centrifugación,
se resuspendieron en 7 mL de una solución de glicerol estéril al 80%
y se guardaron las células en alícuotas de 1 mL congeladas en
nitrógeno líquido y conservadas a -80ºC.
Para producir las proteínas se utilizó una de
las alícuotas anteriores para inocular un precultivo de 50 mL, que
se dejó crecer hasta alcanzar la fase exponencial, y del cual se
tomaron 10 mL para inocular matraces de 5 L conteniendo 3 L de medio
LB más hierro para hacer el grupo hemo, en forma de citrato
férrico-amónico (6 mg/L) más los dos antibióticos
(ampicilina a 100 mg/L y cloranfenicol a 20 mg/L) y se cultivaron
las bacterias a 37ºC con una agitación de 200 rpm durante 20 h. Las
células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en 50
mL de una solución de agua con pequeñas cantidades de benzamidina,
fluoruro de fenilmetilsulfonilo, ácido aminocaproico y DNAsa I. El
periplasma se les extrajo con un choque térmico (congelación en
nitrógeno líquido seguida de descongelación a 37ºC). Después del
choque térmico se centrifugó a 25000 g durante 5 min para separar
el extracto de periplasma de los restos celulares y se recogió el
sobrenadante. Después de una dilución de 2 volúmenes en tampón
borato 1,5 mM, pH 8,5 se realizó una cromatografia en una columna
de carboxi-metil celulosa equilibrada en el mismo
tampón. El citocromo c salió de la columna a 0,25 M de NaCl,
y después de concentrarlo y cambiarlo de tampón a Tricina 20 mM pH
7,5, NaCl 150 mM se realizó una filtración en gel por cromatografia
líquida de rápida resolución (FPLC). Al final de todo este proceso
se obtuvo un rendimiento de proteína pura de 1 mg/L para el
citocromo c de A. thaliana y de 0,7 mg/L para el
citocromo c humano.
En la Tabla 1 se recogen algunos parámetros
físico-químicos (peso molecular, punto isoeléctrico
y potencial red-ox a pH 7,5) de los citocromos
c de H. sapiens y de A. thaliana producidos y
purificados a partir de E. coli. Los espectros de absorción
(datos no mostrados) y el potencial redox ponen de manifiesto que
los productos obtenidos corresponden a citocromos c con sus
grupos hemo bien ensamblados y funcionales; asimismo, el punto
isoeléctrico y el análisis por MALDI-TOF (Matrix
assisted laser desorption/ionization-time of
flight) del peso molecular y de la digestión triptica de ambas
proteínas, confirman los datos ya que se han producido los
resultados esperados en base a la secuencia de la proteína. La
secuencia del extremo amino terminal de las dos proteínas demuestra
una correcta maduración de las mismas.
<110> UNIVERSIDAD DE SEVILLA
\vskip0.400000\baselineskip
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la obtención de
citocromo c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN complementario
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> citocromo c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 75
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Anabaena sp
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<223> secuencia que codifica para el
péptido de tránsito del citocromo c_{6}
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 437
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia que comprende la secuencia
codificante del citocromo c de A. thaliana
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido CR1 diseñado para
amplificar ADN complementario de citocromo c de A.
thaliana y Homo sapiens
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<400> 4
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\hskip1cm
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<210> 5
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<211> 80
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220> ADN sintético
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<223> oligonucleótido CR2 diseñado para
amplificar ADN complementario de citocromo c de A.
thaliana y H. sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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<210> 6
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<211> 100
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220> ADN sintético
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<223> oligonucleótido A1 diseñado para
amplificar ADN complementario de citocromo c de A.
thaliana
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 100
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido A2 diseñado para
amplificar ADN complementario de citocromo c de A.
thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 101
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido A3 diseñado para
amplificar ADN complementario de citocromo c de A.
thaliana
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 80
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
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<223> Oligonucleótido A4 diseñado para
amplificar ADN complementario de citocromo c de A.
thaliana
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 68
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
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<223> Oligonucle6tido A5 diseñado para
amplificar ADN complementario de citocromo c de A.
thaliana
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
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<223> Oligonucleótido A6 diseñado para
amplificar ADN complementario de citocromo c de A.
thaliana
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\newpage
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<210> 12
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<211> 312
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<212> ADN complementario
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<213> Homo sapiens
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<223> citocromo c
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 416
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia que comprende la secuencia
codificante del citocromo c de H. sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 14
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<211> 100
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido H1 diseñado para
amplificar ADN complementario de citocromo c de H.
sapiens
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 100
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido H2 diseñado para
amplificar ADN complementario de citocromo c de H.
sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 16
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<211> 101
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220> ADN sintético
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<223> Oligonucleótido H3 diseñado para
amplificar ADN complementario de citocromo c de H.
sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
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<212> ADN
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<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido H4 diseñado para
amplificar ADN complementario de citocromo c de H.
sapiens
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<400> 17
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<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 67
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<212> ADN
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<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido H5 diseñado para
amplificar ADN complementario de citocromo c de H.
sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
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<211> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido H6 diseñado para
amplificar ADN complementario de citocromo c de H.
sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido H7 diseñado para
amplificar ADN complementario de citocromo c de H.
sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido H8 diseñado para
amplificar ADN complementario de citocromo c de H.
sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (20)
1. Una construcción génica que codifica para el
citocromo c que comprende:
- a)
- una primera secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un citocromo c, y
- b)
- una segunda secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido señal;
en donde el extremo 5' de dicha
primera secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 3' de
dicha segunda secuencia de ácido
nucleico.
2. Construcción génica que codifica para el
citocromo c según la reivindicación 1, en la que dicha
primera secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica para el citocromo c de
Arabidopsis thaliana.
3. Construcción génica que codifica para el
citocromo c según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha
primera secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia de
nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 1.
4. Construcción génica que codifica para el
citocromo c según la reivindicación 1, en la que dicha
primera secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica para el citocromo c de Homo
sapiens.
5. Construcción génica que codifica para el
citocromo c según la reivindicación 1 ó 4, en la que dicha
primera secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia de
nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 12.
6. Construcción génica que codifica para el
citocromo c según la reivindicación 1, en la que dicha
segunda secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica para el péptido señal del citocromo
c_{6} de Anabaena sp.
7. Construcción génica que codifica para el
citocromo c según la reivindicación 1 ó 6, en la que dicha
segunda secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia de
nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 2.
8. Construcción génica que codifica para el
citocromo c según la reivindicación 1, que comprende,
además, una tercera secuencia de ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que define un sitio de unión al ribosoma,
en donde el extremo 3' de dicha tercera secuencia de ácido nucleico
está unido al extremo 5' de dicha segunda secuencia de ácido
nucleico.
9. Construcción génica que codifica para el
citocromo c según la reivindicación 8, en la que dicha
tercera secuencia de ácido nucleico comprende, además, una región
potenciadora del inicio de la traducción.
10. Construcción génica que codifica para el
citocromo c según la reivindicación 1, que comprende,
además, una cuarta secuencia de ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que define una región terminadora de la
traducción, en donde el extremo 5' de dicha cuarta secuencia de
ácido nucleico está unido al extremo 3' de dicha primera secuencia
de ácido nucleico.
11. Construcción génica que codifica para el
citocromo c según la reivindicación 1, 8, 9 ó 10, que
comprende, además, una secuencia de ácido nucleico que define una
secuencia de reconocimiento de una primera enzima de restricción en
el extremo 5' de dicha construcción y otra secuencia de ácido
nucleico que define una secuencia de reconocimiento de una segunda
enzima de restricción en el extremo 3' de dicha construcción, en
donde dichas primera y segunda enzimas de restricción reconocen
dianas de restricción iguales o diferentes.
12. Construcción génica que codifica para el
citocromo c según la reivindicación 1, que comprende la
secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 3 o la
secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 13.
13. Un vector que comprende una construcción
génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Una célula hospedadora que comprende una
construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12
o un vector según la reivindicación 13.
15. Célula según la reivindicación 14, que
comprende, además, un vector que comprende los genes necesarios
para la maduración del citocromo c.
16. Célula según la reivindicación 15, en la que
dicho vector que comprende los genes necesarios para la maduración
del citocromo c es un vector que comprende los genes
ccm.
17. Célula según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16, en la que dicha célula hospedadora es una
bacteria.
18. Célula según la reivindicación 17, en la que
dicha bacteria es Escherichia coli.
19. Un procedimiento para la producción de
citocromo c que comprende:
- a)
- co-transformar una célula hospedadora con (i) un vector según la reivindicación 13 y con (ii) un vector que comprende los genes necesarios para la maduración del citocromo c;
- b)
- cultivar una célula hospedadora co-transformada según la etapa a), bajo condiciones que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica para el citocromo c fusionado al péptido señal, y, si se desea,
- c)
- aislar y purificar el citocromo c.
20. Un procedimiento para la producción de
citocromo c que comprende cultivar una célula hospedadora
transformada según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 bajo
condiciones que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos
que codifica para el citocromo c fusionado al péptido señal,
y, si se desea, aislar y purificar el citocromo c.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200402723A ES2315039B1 (es) | 2004-11-05 | 2004-11-05 | Construccion genica que codifica para el citocromo c y procedimiento de obtencion. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200402723A ES2315039B1 (es) | 2004-11-05 | 2004-11-05 | Construccion genica que codifica para el citocromo c y procedimiento de obtencion. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2315039A1 ES2315039A1 (es) | 2009-03-16 |
| ES2315039B1 true ES2315039B1 (es) | 2009-12-30 |
Family
ID=40416919
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200402723A Active ES2315039B1 (es) | 2004-11-05 | 2004-11-05 | Construccion genica que codifica para el citocromo c y procedimiento de obtencion. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2315039B1 (es) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002218979A (ja) * | 2001-01-23 | 2002-08-06 | Univ Nihon | シトクロムｃの生産方法 |
-
2004
- 2004-11-05 ES ES200402723A patent/ES2315039B1/es active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GUPTA, R. et al. "{}Functional relationship of cytochrome c6 and plastocyanin in Arabidopsis"{}. NATURE. 30.05.2002. Vol. 417, páginas 567-571, todo el documento. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2315039A1 (es) | 2009-03-16 |
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