CN117143224B - 一种重组人纤连蛋白截短肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人纤连蛋白截短肽及其制备方法与应用，其氨基酸序列为来源于天然纤连蛋白片段FNIII10和FNIII12‑14的组合，FNIII10的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；FNIII12‑14的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明对融合蛋白进行大肠杆菌偏好密码子优化，其生物安全性强，表达量高，纯化工艺稳定，成本低廉，有利于实现重组人纤连蛋白截短肽的规模化、工业化生产，克服了由于天然FN分子量过大，空间结构复杂无法通过基因工程的方法获得的问题。本发明的重组人纤连蛋白截短肽能促进细胞粘附，保护干细胞，促进多种创面的愈合。可以作为组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种重组人纤连蛋白截短肽及其制备方法与应用。
背景技术
纤连蛋白（Fibronectin，FN）是一种高分子量的糖蛋白，大量存在于人体的细胞外基质和血浆中，在胚胎和再生或损伤组织的细胞外基质中尤其丰富。FN有助于中性粒细胞和巨噬细胞吞噬和清除外来病原体，并释放各种生长因子和细胞因子，与角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞结合，大量细胞迁移至创面表面以促进创面愈合。
FN每个单体由I型、II型和III型这三种类型的重复单元组成，其中包含12个I型重复、2个II型重复和 15-17个III型重复，它们加起来约占 FN 序列的90%。其中，最广为人知的便是位于 FNIII10中的RGD序列，该区段包含序列Arg-Gly-Asp，不仅可以调控细胞粘附，而且对细胞的生存、增殖和分化都有重要作用。除此之外，FNIII12-14含有肝素结合域II和高度混杂的生长因子结合域，已经被证明与血管内皮生长因子（VEGF）/血小板衍生生长因子（PDGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和转化生长因子-β（TGF-β）等表现出很强的亲和力，各种亚型和FN片段的组合已被证明比全长FN能更有效地选择性促进伤口愈合。
目前国内外对不同来源的纤连蛋白的片段和突变体进行了大量的相关制备以及复配工艺研究。其中中国专利CN116640204 A将纤连蛋白片段FNIII10和FNIII12-14进行突变，将突变后的片段组合，获得了耐热的纤连蛋白片段用于化妆品领域。但至今对纤连蛋白在保护及促进干细胞活性等方面研究还没有。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，截取天然人纤连蛋白的FNIII10和FNIII12-14进行组合，所得重组人纤连蛋白截短肽可以促进干细胞的迁移和粘附能力，而且功效均优于商品化的全长FN，并且在高糖环境（AGEs）下具有保护干细胞的作用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案实现：一种重组人纤连蛋白截短肽，其氨基酸序列为来源于天然纤连蛋白片段FNIII10和FNIII12-14的组合，所述FNIII10的氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示；
所述FNIII12-14的氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示。
作为优先的，在上述的重组人纤连蛋白截短肽中，其增加纯化标签，所述纯化标签为His-Tag、FLAG或GST。
作为优先的，在上述的重组人纤连蛋白截短肽中，所述纯化标签为His-Tag，其氨基酸序列如SEQ ID NO .3所示。
编码上述重组人纤连蛋白截短肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO .4所示。
含有上述重组人纤连蛋白截短肽的载体，为pET-20b或pET-3c，对FNIII10和FNIII12-14和表达载体进行酶切连接。
含有上述载体的菌株，所述菌株为大肠杆菌E. coliDH5α。
上述重组人纤连蛋白截短肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）将FNIII10和FNIII12-14片段基因片段和线性化载体pET20b或pET-3c的酶切产物进行连接；
（2）将上述的连接产物转化到E. coliDH5α中，通过筛选阳性克隆而获得重组质粒，在宿主细胞中表达所述的核苷酸序列；
（3）收集、纯化及鉴定所得到的重组人纤连蛋白截短肽。
上述重组人纤连蛋白截短肽在制备促进细胞粘附、保护干细胞或创面愈合药物中的应用。所述促进细胞粘附是指促进皮肤细胞和牙周膜干细胞的细胞粘附能力；所述保护干细胞是指在显著的高糖环境（AGEs）下保护人源牙周膜干细胞。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明通过大肠杆菌表达系统表达纤连蛋白功能片段，克服了由于天然FN分子量过大，空间结构复杂无法通过基因工程的方法获得的问题，以往研究只能从动物或者人的组织或者血浆中分离提取，成分昂贵，目前临床上还没有广泛使用的纤连蛋白产品。本发明通过基因工程融合蛋白技术截取天然人纤连蛋白的FNIII10和FNIII12-14片段，并对融合蛋白进行大肠杆菌偏好密码子优化。其生物安全性强，表达量高，纯化工艺稳定，成本低廉，有利于实现重组人纤连蛋白截短肽的规模化、工业化生产。
（2）本发明制备的重组人纤连蛋白截短肽具有较好的生物学活性，在细胞学层面可以明显促进牙周膜干细胞的细胞迁移和粘附能力和显著的高糖环境（AGEs）下保护人源牙周膜干细胞效果。本发明获得的重组人纤连蛋白截短肽能使促进细胞粘附，保护干细胞，复配以适当辅料后，可进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂，作为活性添加剂应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。该重组人纤连蛋白截短肽具有人源化，免疫原性低，不易发生过敏反应的突出优点。同时也可以作为组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂。
附图说明
图1为大肠杆菌重组表达质粒pET20b- FN1024的构建图谱；
图2为重组人纤连蛋白截短肽FN1024在E. coli BL21(DE3)和 pLysS中的诱导表达情况；
图3为重组人纤连蛋白截短肽FN1024镍柱纯化情况；
图4为MTT检测重组人纤连蛋白截短肽FN1024对牙周膜干细胞（hPDLSCs）细胞增殖的结果；
图5为重组人纤连蛋白截短肽FN1024对hPDLSCs的促粘附结晶紫染色实验结果；
图6为重组人纤连蛋白截短肽FN1024对hPDLSCs的促细胞迁移（细胞划痕）实验结果；
图7为重组人纤连蛋白截短肽FN1024在高糖环境下（AGEs）对hPDLSCs的保护实验结果。
具体实施方式
除非另外指明，下述实施例中所用的空质粒均为可商购获得的质粒。重组质粒采用常规分子克隆方法构建。
实施例1：重组人纤连蛋白截短肽在大肠杆菌中表达
将编码重组人纤连蛋白截短肽的DNA片段(SEQ ID NO .4)，分别转入BL21(DE3)和BL21 pLysS，将使用序列SEQ ID NO: 4的表达菌命名为BL21(DE3) /pET20b-FN1024和BL21pLysS /pET20b- FN1024。后面实验使用的序列(SEQ ID NO .4)，是通过PCR对FN10、FN12-14基因片段进行扩增，FNIII10和FNIII12-14片段扩增体系如表1和表2中所示。大肠杆菌重组表达质粒pET20b- FN1024的构建图谱如图1所示。
后续分别使用EcoR I和Xho I酶对FNIII10和FNIII12-14片段进行双酶切，用NdeI和Xho I酶对pET20b质粒进行双酶切，均在37℃条件下水浴反应1 h。酶切体系如表3中所示。
将FNIII10和FNIII12-14片段基因片段和线性化载体pET20b的酶切产物连接后，将上述的连接产物转化到E. coliDH5α中，通过筛选阳性克隆而获得重组质粒，转化的具体步骤如下：
（1）从-80℃冰箱中取出E. coliDH5α感受态细胞，于冰上放至完全融化；
（2）向感受态中加入所得到的连接产物9 µL，用移液枪轻轻吹打混匀后继续置于冰上冰浴30 min；
（3）冰浴后的混合物放入42℃水浴锅中热激1 min；
（4）将热激后的感受态细胞迅速放回冰上，进行5 min冰浴；
（5）向冰浴后的感受态细胞中加入700 μL LB液体培养基，置于37℃恒温摇床振荡培养复苏45~60 min；
（6）复苏后的菌液以12000 rpm离心1 min，留取100 μL上清液将沉淀吹打均匀，涂布于含有100 mg/L Amp+抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
实施例2：重组人纤连蛋白截短肽的筛选及表达：
（1）分别挑取3个含有重组质粒pET20b-FN1024的BL21（DE3）/ pLysS阳性单菌落，接种于含有1.0 mg/mL Amp+的5 mL LB液体培养基中，37℃ 200 rpm过夜培养；
（2）将过夜培养的种子液以体积比1：100，接种于新的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm恒温振荡培养至OD600 =0.6时，加入IPTG至终浓度为1.0 mM，诱导培养4 h；
（3）离心机预冷至4℃，将菌液以4500 rpm离心15 min收集菌体，通过SDS-PΑGE进行表达鉴定。
（4）SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况：将不同破菌样品分别取25 μL于1.5 mL离心管中，分别加入2×Loading Buffer，涡旋混匀后简易离心，沸水浴8 min。每孔上样10 μL，用考马斯亮蓝G-250进行染色，观察目的蛋白表达情况。
FN1024在BL21(DE3)和 pLysS中的诱导表达情况如图2所示。
SDS-PAGE实验结果表明，在E. coli BL21(DE3)和 pLysS中成功表达重组人纤连蛋白截短肽FN1024，目的条带位置与预期结果相符。
实施例3：重组人纤连蛋白截短肽的纯化与鉴定
（1）高压均质机4℃预冷后用300 mL平衡液A重悬30 g菌体，常压均匀一遍后，1000Pa压力破碎2~3次，至菌体重悬液外观澄清透明，收集到离心管中，4℃ 15000 rpm离心30min，得到上清样品；
（2）镍柱纯化过程为平衡液A，上样，平衡液A，平衡液B，洗杂液，洗脱液。溶液配置如表4所示，分别接收不同阶段溶液并通过SDS-PAGE电泳鉴定。FN1024镍柱纯化情况如图3所示。
SDS-PAGE结果表明，成功通过镍离子亲和层析获得纯度＞90%的重组蛋白FN1024。
实施例4：重组人纤连蛋白截短肽的生物学实验
（1）MTT检测FN1024对牙周膜干细胞（hPDLSCs）细胞增殖的影响：
取培养48~72 h生长状况良好的hPDLSCs细胞，加入1.5 mL含0.25% EDTA的胰酶消化5 min，终止消化后计数，稀释为4×104的细胞重悬液接种于96孔板中，每孔100 μL，培养板转移到含5%二氧化碳的37℃细胞培养箱中贴壁过夜。试验前用无血清的H-DMEM培养基饥饿4~6 h。实验组分别加入含62.5、125、250、500、1000 μM FN1024的0.4%胎牛血清的H-DMEM培养基，对照组为不含N1024的0.4%胎牛血清的H-DMEM培养基，每组5个复孔，给药后每24 h取出一块细胞培养板，5 mg/mL的MTT工作液按1：10的比例加入，培养箱37℃孵育4 h后弃去上清。每孔100 μL DMSO溶解蓝紫色结晶甲瓒，置于酶标仪检测OD490nm处吸光度值。根据：（实验组OD值-Control组OD值）/Control组OD值×100%计算相对增值率。
图4为MTT检测FN1024对牙周膜干细胞（hPDLSCs）细胞增殖的结果。
MTT实验结果表明，在62.5-1000 μM浓度梯度范围内，重组蛋白FN1024对牙周膜干细胞（hPDLSCs）无细胞毒性。
（2）结晶紫细胞粘附试验检测FN1024对hPDLSCs的促粘附作用：
试验前一天，用含125 μM FN1024的无血清H-DMEM培养基包被24孔板，同时设置含125 μM FN10/ FN12-14的无血清的H-DMEM培养基为对照组，Control组为无血清的H-DMEM培养基，以上每组各3个复孔，4℃过夜。实验前弃去上清，用无菌PBS清洗3次。将生长状况良好的hPDLSCs细胞用胰酶消化，用无血清的H-DMEM培养基重悬，稀释成1×104的细胞重悬液接种于24孔板中，每孔500 μL， 37℃孵育3 h。弃去培养上清，PBS清洗3次，4%多聚甲醛溶液固定30 min，PBS清洗3次，每孔加入500 μL 1%结晶紫染色30 min，用无菌PBS清洗3次。显微镜观察并拍照记录。每组随机选取5个视野，利用Image.J软件分析粘附细胞数量。FN1024对hPDLSCs的促粘附结晶紫染色实验结果如图5所示。
结晶紫粘附实验结果表明，与对照组和其结构组成FN10和FN1024相比，重组蛋白FN1024组细胞粘附数量最多，具有最佳的促细胞粘附效果。
（3）重组人纤连蛋白截短肽FN1024对hPDLSCs的促细胞迁移作用
取生长状况良好的hPDLSCs细胞，加入1.5 mL含0.25% EDTA的胰酶消化5 min，终止消化后计数，稀释成2×105的细胞重悬液接种于6孔板，每孔2 mL，培养板转移到含5%二氧化碳的37℃细胞培养箱中培养48 h使细胞长满。用200 μL枪头每孔划5条平行线，随后用无菌PBS清洗3次去除划下细胞，实验组加入含125 μM FN1024的无血清H-DMEM培养基，Control组为无血清的H-DMEM培养基，同时设置含125 μM FN10/FN12-14的无血清基础培养基作为对照。倒置显微镜观察并拍照记录0、24、48、72 h划痕愈合情况，对hPDLSCs的促细胞迁移实验结果如图6所示。
细胞划痕实验结果表明，与对照组和其结构组成FN10和FN1024相比，FN1024组具有最佳的促细胞迁移效果。
（4）扫描电子显微镜（SEM）观察在AGEs环境下FN1024对hPDLSCs细胞的保护作用：
收集对数生长期的P5代hPDLSCs细胞，加入1.5 mL含0.25% EDTA的胰酶消化90 s，按2×103/mL接种于48孔板细胞爬片内，待细胞贴壁后，如实验分组给药，实验分组如下：①对照（Control）组；② 25 μg/mL AGEs组；③AGEs&低剂量蛋白给药组（AGEs&L-FN1024），FN1024浓度为125 μM；④AGEs&高剂量蛋白给药组（AGEs&H-FN1024），FN1024浓度为250 μM。给药后8 d后，弃去培养上清，用PBS冲洗3次，并在2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中固定过夜，按25%、50%、75%、90%和100%的酒精梯度脱水。临界点干燥后，将样品于扫描电子显微镜下进行细胞学观察并拍照记录。FN1024在高糖环境下（AGEs）对hPDLSCs的保护实验结果如图7所示。
SEM实验结果如图7所示，在正常培养环境中，对照组hPDLSCs细胞生长状况良好，呈放射状贴壁生长，细胞呈典型的长梭形，细胞完整，胞浆丰满，边界清晰。模型组AGEs给药8d后细胞结构紊乱，边缘模糊，出现细胞空泡，失去正常细胞形态，边界模糊。在AGEs环境下给药125、250μM FN1024给药8d后，与模型组相比，hPDLSCs细胞边界清晰，细胞形态呈长梭型，基本与对照组一致，并且细胞形态出现成纤维细胞样。结果表明，AGEs培养环境会对牙周膜干细胞有较大的损伤，FN1024给药后可以改善AGEs导致的损伤。
Claims (7)
1.一种重组人纤连蛋白截短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO .3所示。
2.编码权利要求1所述重组人纤连蛋白截短肽的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO .4所示。
3.含有权利要求2所述核酸的载体，其特征在于所述载体为pET-20b或pET-3c。
4.含有权利要求3所述载体的菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌E. coli DH5α。
5.权利要求1所述重组人纤连蛋白截短肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将FNIII10和FNIII12-14片段基因片段和线性化载体pET-20b或pET-3c的酶切产物进行连接；
（2）将上述的连接产物转化到E. coli DH5α中，通过筛选阳性克隆而获得重组质粒，在宿主细胞中表达权利要求2所述的核酸；
（3）收集、纯化及鉴定所得到的重组人纤连蛋白截短肽。
6.权利要求1所述重组人纤连蛋白截短肽在制备促进细胞粘附、保护干细胞或创面愈合药物中的应用；所述保护干细胞是指在显著的高糖环境下保护人源牙周膜干细胞。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述促进细胞粘附是指促进皮肤细胞和牙周膜干细胞的细胞粘附能力。
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