CN115976031B

CN115976031B - 一种重组纤连蛋白及其应用

Info

Publication number: CN115976031B
Application number: CN202210844025.4A
Authority: CN
Inventors: 侯建; 陈东; 李林秀; 乔美玲; 刘婕
Original assignee: Yantai Huaxin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Yantai Huaxin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-07-18
Filing date: 2022-07-18
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-07-18
Also published as: CN115976031A

Abstract

本发明公开了一种重组纤连蛋白突变体及其应用，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过对重组纤连蛋白突变体的核苷酸序列进行优化，通过部分片段的重复，可以更有效地促进细胞增殖活性及粘附活性。

Description

一种重组纤连蛋白及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组纤连蛋白及其应用。

背景技术

纤连蛋白(Fibronectin，FN)是一种细胞外基质中的大分子糖蛋白，它广泛存在于血浆、多种细胞表面及细胞基质中，是细胞外基质中重要的粘附分子之一，纤连蛋白与细胞膜上的整合素受体结合，在细胞与细胞之间、细胞与基质之间的相互作用中发挥极其重要的功能，在调节细胞粘附、迁移、增殖等过程中发挥重要作用。

纤连蛋白是创面修复中一种关键的蛋白质。经研究发现，创伤修复由参与修复的细胞和细胞外基质相互作用共同完成。纤连蛋白是细胞外基质的重要成份，可通过介导分子间或细胞间粘附来参与修复，它有助于固定细胞分化和指导细胞运动；对创伤修复过程均有重要的调节作用。因此，临床上纤连蛋白主要应用于创伤修复、烧烫伤、角膜修复、牙周修复等方面。

纤连蛋白是一种多功能、高活性、纯天然的生物蛋白。纤连蛋白具有两个相似的亚基，每个亚基都具有六个功能区和一个RGD序列。每个功能区都可以通过与细胞表面的受体结合，从而发挥相应的生物学功能。例如FN可通过与细胞表面α4β7受体结合，促进成纤维细胞的分化。

重组纤连蛋白片段由于具有多种生物学功能，是目前纤连蛋白研究的热点之一，另外，由于重组纤连蛋白片段稳定性好，易于制备，能够更好的推广应用。纤连蛋白在伤口愈合中起着至关重要的作用，纤连蛋白在损伤部位沉积，形成血凝块，止血并保护皮下组织。纤连蛋白形成细胞运动及定位的基质，介导成纤维细胞、巨噬细胞参与损伤修复。纤连蛋白对创面愈合有深远影响，包括在肉芽组织的发育和组织过程中，细胞的迁移和生长，以及结缔组织基质的重塑和再合成。纤连蛋白促进成纤维细胞粘附血浆纤维蛋白，以及促进胶原蛋白在伤口处沉积等。

纤连蛋白在医学、美容、化妆品领域有广泛的应用前景，但是从人体或者动物血液、组织中提取的天然纤连蛋白产量极为有限，成本高，此外产品纯度较低。DNA重组技术能够解决纤连蛋白制备的难题，但是由于纤连蛋白单体分子量较大，利用DNA重组技术表达全长的纤连蛋白的会存在一定困难，蛋白往往稳定性差，活性低。如何利用重组DNA技术表达纤连蛋白的功能结构域，得到稳定性高、活性好的纤连蛋白是解决纤连蛋白应用瓶颈的重要途径。

现有技术公开的重组纤连蛋白突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示，其对应的氨基酸顺序如SEQ ID NO .3所示。

针对现有技术普遍存在的缺点，本发明提供了一种重组纤连蛋白及其应用。本发明提供的重组纤连蛋白突变体可以更有效促进细胞增殖活性及粘附活性。

发明内容

在实际应用中，多采用纤连蛋白作为细胞增殖活性和细胞粘附的促进剂，为了满足实际需要，需要对纤连蛋白的核苷酸序列进行优化。为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种重组纤连蛋白突变体，其核苷酸序列为SEQ ID NO .2。

优选地，所述的重组纤连蛋白突变体以可溶性的形式表达。

优选地，所述的重组纤连蛋白突变体，是将纤连蛋白进行翻译优化和部分核苷酸序列进行重复获得的。

优选地，所述纤连蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO .4。

本发明还提供了上述重组纤连蛋白在促进细胞增殖活性和/或细胞粘附活性中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的重组纤连蛋白突变体具有如下优势：

(1) 本发明提供的重组纤连蛋白，可以更有效地促进细胞增殖活性，提高细胞粘附活性；

(2) 本发明提供的重组纤连蛋白突变体，制备过程简单，纯化方便。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

本发明实施例涉及的主要材料如下：宿主菌大肠杆菌、质粒pET-28a(Merck)、预染蛋白Marker；Ni SepharoseTM6Fast Flow购自GE公司；其它试剂均为分析纯试剂。

通过生物大分子模拟选择了纤连蛋白促细胞增殖及粘附的功能结构域，设计了新的纤连蛋白。根据大肠杆菌密码子偏好性，对纤连蛋白突变体的核苷酸序列进行优化,并且对核苷酸序列进行了重新设计，具体而言，在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中，ggcgaagaagataccgccgaa的序列重复了一次，由此形成SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，由此使得纤连蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例1 重组纤连蛋白突变体的表达和纯化

1. 纤连蛋白表达菌株的制备

所述纤连蛋白表达菌株的制备过程为：

② 大肠杆菌感受态细胞的制备：制备过程详见《分子克隆实验指南》第三版；

②将表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞：转化过程详见《分子克隆实验指南》第三版；

将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的纤连蛋白核苷酸序列的表达菌分别按 1:1000 接种至 20 mL 卡那霉素抗性的 LB 培养基中 37℃、200 rpm 过夜培养。按照终 OD为 0.04 转接至 1000 mL 培养基中，37℃ 、200 rpm 培养至 OD600 达到 0.6~0 .8。加入终浓度0.5 mmol/L 的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导发酵，IPTG 为诱导剂，20℃、200 rpm 诱导 16h，4℃ 、大于等于 3000×g、40 min 离心收集菌体（离心至菌全部沉淀），得到菌体沉淀。

2. 纯化表达

具体操作过程如下：

使用 AKTA 纯化仪，连接 Ni-NTA 柱，采用分步洗脱的方法进行纯化。

（1）用纯化缓冲液 A（20mM Tris，50mM NaCl，pH 8.0）对菌体沉淀进行重悬，重悬后使用超声破碎仪或高压均质仪破碎菌悬液。

（2）破碎后的悬液加入到离心管中，平衡重量后，4℃ 、大于等于25000×g、 30min，离心收集上清。

（3）离心后的菌液上清使用抽滤装置进行过滤，经过 0.22μm 滤膜过滤后作为蛋白原液进行后续试验。

（4）连接好 AKTA 和 Ni-NTA 柱，使用 5-10 倍柱体积的超纯水冲洗柱子。流速为柱料能承受最大流速的 50%-80%。

（5）待流穿液电导值接近 0 且紫外吸收值无明显变化后，使用5-8倍柱体积的 A液平衡柱子，直至流穿液电导值和紫外吸收值均达到稳定不变为止。流速为柱料能承受的最大流速的 30%-50%。

（6）平衡好柱子后开始上样，流速为柱料能承受的最大流速的10%-30%。若蛋白原液体积较小而浓度较高，应适当减少流速或增加重复上样次数。当流穿液的紫外吸收值开始变化时，收集上样流穿液并取样进行 SDS-PAGE 电泳。

（7）上样完毕后，继续使用 A 液进行平衡，直至流穿液电导值和紫外吸收值接近上样前数值且稳定后，停止平衡。平衡流速为柱料能承受最大流速的30%～50%。

（8）柱子达到平衡后，采用分步洗脱的方式进行洗脱。第一步使用4%B和 96%A行洗脱，目的是洗脱杂蛋白。在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行 SDS-PAGE电泳。

（9）第二步使用 70%B和 30%A进行洗脱，目的是洗脱目的蛋白。洗脱时的流速为柱料能承受最大流速的 30%-50%。在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行SDS-PAGE 电泳。

（10）当洗脱时的紫外吸收值不再变化时，使用 100%B 进行柱冲洗，洗去仍未洗下的蛋白。洗脱时的流速为柱料能承受最大流速的 30%-50%。在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行 SDS-PAGE 电泳。

实施例2 重组纤连蛋白促细胞增殖活性测定

依据纤连蛋白对小鼠胚胎成纤维细胞(BALB/c 3T3 细胞)的生长具有刺激作用，BALB/c 3T3 细胞的生长状况因纤连蛋白生物学活性的不同而不同，以此检测纤连蛋白的生物学活性。具体测定过程为：

（1）BALB/c 3T3细胞接种于96孔细胞培养板中（5000个细胞/孔），37℃，5% CO₂细胞培养箱培养24 h；

（2）换用DMEM无血清培养基继续培养12 h；

（3）分别加入低浓度（1μg/ml）和高浓度（10μg/ml）实验组重组纤连蛋白突变体（SEQ ID NO.4）和阳性对照组重组纤连蛋白突变体（SEQ ID NO.3）的可溶性表达纯化组分以及PBS（阴性对照组），继续培养48～72h；

（4）每孔加入10 µL CCK-8试剂，37℃，5% CO2细胞培养箱孵育2 h后取出；

（5）用酶标仪读取96孔板在450 nm和630 nm的吸光值，以630 nm为参比波长，在450 nm处测定吸光度，记录测定结果。

相对促细胞增殖率=（实验组450 nm吸光值-阴性对照组450 nm吸光值）/阴性对照组450 nm吸光值×100%。结果如表1所示。

表1：相对促细胞增值率

组别	孔数	增值率（%）
			低浓度实验组	6	19.2±1.7
高浓度实验组	6	25.6±1.5
			低浓度阳性对照组	6	15.3±1.8
高浓度阳性对照组	6	19.6±1.5

实验结果表明，本发明的重组纤连蛋白突变体可以更有效的促进细胞增殖。

实施例3 重组纤连蛋白突变体促细胞粘附活性测定

所述细胞粘附活性测定的具体过程为：

（1）实验组和阳性对照组重组纤连蛋白突变体蛋白溶液浓度为1μg/ml（低浓度）和10 µg/ml（高浓度），96孔细胞培养板每孔加入50µL样品溶液，37℃放置2 h，对照孔加50 µLPBS。

（2）BALB/c 3T3细胞用胰酶消化，计数，每孔加入5×10⁴个细胞。37℃ CO₂培养箱培养2 h；

（3）PBS洗3遍，洗去未粘附的细胞，再加入200 µLDMEM培养基；

（4）每孔加入10 µL CCK-8试剂，37℃，5% CO₂细胞培养箱孵育2 h后取出。

（6）促细胞粘附率=（实验组450 nm吸光值-阴性对照组450 nm吸光值）/阴性对照组450 nm吸光值×100%。结果如表2所示。

表2：促细胞粘附率

组别	孔数	促细胞粘附率（%）
			低浓度实验组	6	18.6±1.8
高浓度实验组	6	35.9±2.7
			低浓度阳性对照组	6	11.6±1.7
高浓度阳性对照组	6	22.9±1.9

实验结果表明，本发明的重组纤连蛋白突变体可以更有效的促进细胞粘附。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种重组纤连蛋白突变体，其特征在于，所述纤连蛋白突变体的氨基酸序列如SEQID NO .4所示。

2.权利要求1所述的重组纤连蛋白突变体在制备促进细胞增殖活性的试剂中的应用。

3.权利要求1所述的重组纤连蛋白突变体在制备促进细胞粘附活性的试剂中的应用。