CN105294851A - 与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子及其编码基因、制备方法与应用 - Google Patents
与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子及其编码基因、制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子及其编码基因、制备方法与应用。本发明提供的与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子，包括SEQ？ID？NO:1所示的氨基酸序列和SEQ？ID？NO:2所示的氨基酸序列。其能够与几丁质特异性的结合，且结合能力远远高于bFGF，因而缓释效果也强于bFGF。且经体外实验证实，本发明提供的与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子与天然bFGF具有相似的促进细胞增殖的生物学活性。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子及其编码基因、制备方法与应用。
背景技术
碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor；bFGF)，由内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞分泌，是一个传递发育信号，能促进中胚层和神经外胚层细胞分裂的多肽。bFGF是体内组织损伤修复过程中重要的生长因子，它能够促进新血管的生成、促进成纤维细胞的增殖病修复损害的内皮细胞。在体外，bFGF能刺激细胞增殖、迁移，诱导纤溶酶原激活物及胶原酶活性，是与肝素有高亲和力的细胞促分裂原。
目前，常将bFGF与支架材料混合用于创面修复，其中，最常用的支架材料为几丁质。几丁质，又称壳多糖(chitin)，为N-乙酰葡糖胺通过β连接聚合而成的结构同多糖。几丁质，广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的甲壳和真菌的胞壁中，也存在于一些绿藻中；主要是用来作为支撑身体骨架，以及对身体起保护的作用。目前，几丁质已经广泛的应用于再生医学领域。它可以(1)促进凝血和伤口愈合；(2)作为药物的缓释基质；(3)用于组织工程修复。
当几丁质作为bFGF缓释基质时，bFGF只是混合到几丁质中，混合后，几丁质和bFGF通过电荷吸附的机制结合在一起，形成缓释效果。但是几丁质与bFGF的这种结合机制不是很稳定，且结合率很低，因此缓释效果也非常不明显。研究表明，以几丁质为支架材料，bFGF会在很短时间内完全释放出来，在原位形成高浓度的bFGF。而高浓度的bFGF并不利于血管形成和组织再生，而且还有致癌风险。
因此，进一步研究具有缓释作用的bFGF制剂十分必要。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子及其编码基因、制备方法与应用。本发明提供的与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子(简称CBD-bFGF)能够与几丁质特异性的结合，且结合能力远远高于bFGF，因而缓释效果也强于bFGF。且经体外实验证实，本发明提供的与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子与天然bFGF具有相似的促进细胞增殖的生物学活性。
本发明提供的与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子，包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列和SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
SEQIDNO:1所示的氨基酸序列为具有活性的bFGF的氨基酸序列，其中包括154个氨基酸，其序列具体为AAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS。
SEQIDNO:2所示的氨基酸序列为具有几丁质绑定能力的氨基酸序列(ChitinBindingDomain，CBD)，其中包括52个氨基酸，其序列具体为TTNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQ。该氨基酸序列来源于几丁质酶，几丁质酶以几丁质为底物，催化其水解生成N-乙酰葡糖胺。本发明选择的如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列能够与几丁质特异性的结合，但是它并不具有几丁质酶的酶活性。由于酶与底物的结合关系比电荷吸附高很多，因此在SEQIDNO:2的前导作用下，能够使SEQIDNO:1具有更强的与几丁质特异性结合的能力。因此，本发明提供的CBD-bFGF能够具有较长时间的缓释作用，避免了在短时间内引起细胞因子浓度升高，从而避免致癌的风险，且不影响bFGF对细胞增殖活性的促进作用，并且能够降低促进细胞增殖活性所需的浓度。
在本发明的实施例中，与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子，包括如SEQIDNO:3所示氨基酸序列或SEQIDNO:4所示氨基酸序列。
SEQIDNO:3所示氨基酸序列为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列连接在SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的氨基端。SEQIDNO:4所示氨基酸序列为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列连接在SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的羧基端。本发明将bFGF与几丁质酶的结构域相融合，所形成的融合蛋白能够特异性的与几丁质高效结合。而SEQIDNO:2与SEQIDNO:3的连接顺序并不会影响融合蛋白与几丁质结合的效果。
在本发明的实施例中，与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子，还包括亲和纯化标签。
在本发明的实施例中，亲和纯化标签为GST标签或His标签。
在重组蛋白的亲和纯化中，通常需要利用亲和纯化标签。实验表明、添加亲和纯化标签并不会影响CBD-bFGF与几丁质结合，也不影响CBD-bFGF对细胞活性的促进作用。
在一些实施例中，几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。
本发明还要求保护，编码与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子的DNA分子，其包括SEQIDNO:6所示的核苷酸序列和SEQIDNO:7所示的核苷酸序列。
SEQIDNO:6所示的核苷酸序列能够表达CBD，而SEQIDNO:7所示的核苷酸序列能够表达bFGF。
在本发明的实施例中，编码与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子的DNA分子，包括如SEQIDNO:8所示的核苷酸序列或SEQIDNO:9所示的核苷酸序列。
SEQIDNO:8所示的核苷酸序列为SEQIDNO:7所示的核苷酸序列与SEQIDNO:6所示的核苷酸序列3’端连接；SEQIDNO:9所示的核苷酸序列为SEQIDNO:7所示的核苷酸序列与SEQIDNO:6所示的核苷酸序列5’端连接。
本发明提供的编码CBD-bFGF的核苷酸序列能够有效表达CBD-bFGF。
与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子的制备方法为将SEQIDNO:6所示的核苷酸序列和SEQIDNO:7所示的核苷酸序列经宿主细胞表达，制得与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子。
在本发明的实施例中，与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子的制备方法具体为：将SEQIDNO:6所示的核苷酸序列和SEQIDNO:7所示的核苷酸序列构建入重组表达载体后转化入宿主细胞，经诱导表达，获得与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子。
在一些实施例中，重组表达载体为PET21b、PET15b、PET-28a、PET-28b、PET-28c或PET-21a-c。
在一个实施例中，重组表达载体为PET21b。
在一些实施例中，宿主细胞为E.coliBL21(DE3)或E.coliBL21(DE3)plys。
在一个实施例中，宿主细胞为E.coliBL21(DE3)。
在一些实施例中，诱导表达的诱导剂为IPTG。
在一些实施例中，诱导剂的浓度为0.2mmol/L～1.0mmol/L。
在一个实施例中，诱导剂的浓度为0.2mmol/L。
在一些实施例中，诱导表达的温度为25℃～37℃，时间为8h～12h。
在一个实施例中，诱导表达的温度为37℃，时间为12h。
本发明提供的方法能够高效的表达CBD-bFGF。CBD-bFGF的理论分子量为23619.82Da，经检测，电泳图中预期位置呈现条带，且条带颜色较深、宽度较大，证明本发明成功诱导表达了CBD-bFGF。
本发明提供的与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子在制备促进细胞增殖的制剂中的应用。
在本发明的实施例中，细胞为Balb/c3T3细胞。
在本发明的实施例中，与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子促进细胞增殖的浓度为11pmol/L～34pmol/L。
在一些实施例中，权利要求1所述的与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子促进细胞增殖的浓度为11pmol/L。
本发明经过实验证明，采用CBD-bFGF能够对Balb/c3T3细胞的增殖产生显著的促进作用，最适浓度为11pmol/L～34pmol/L，促进细胞增殖效果最佳的浓度为11pmol/L。与bFGF相比，CBD-bFGF对Balb/c3T3细胞增殖促进作用的最适浓度更低，说明本发明提供的CBD-bFGF比bFGF具有更强的促进细胞增殖的最用。
本发明还提供了一种促进细胞增殖的制剂，包括与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子和几丁质。
实验表明，CBD-bFGF绑定几丁质球的能力是bFGF5.33倍，因此，将bFGF与几丁质混合制成的制剂能够具有良好的缓释效果，避免bFGF释放过快。因此，本发明提供的知己能够在原位长时间稳定的维持bFGF的浓度，有效促进细胞的增殖，降低致癌风险。
本发明提供了与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子(CBD-bFGF)及其编码基因、制备方法与应用。本发明提供的与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子，包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列和SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。其能够与几丁质特异性的结合，且结合能力远远高于bFGF，因而缓释效果也强于bFGF。且经体外实验证实，本发明提供的与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子与天然bFGF具有相似的促进细胞增殖的生物学活性。
附图说明
图1示实施例1制备的CBD-bFGF的SDS-PAGE电泳检测图；
图2示CBD-bFGF,bFGF,Control与几丁质球结合能力检测；
图3示ChBD-bFGF和bFGF的缓释作用；其中，示CBD-bFGF的缓释作用；示bFGF的缓释作用；
图4示ChBD-bFGF和bFGF对Balb/c3T3细胞活性的促进作用；其中，示CBD-bFGF对Balb/c3T3细胞活性的促进作用；示bFGF对Balb/c3T3细胞活性的促进作用。
具体实施方式
本发明提供了与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子及其编码基因、制备方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1CBD-bFGF的制备
将含有CBD-bFGF基因克隆入PET21b表达载体中，酶切位点为：NDEI和XholI。
此载体转化入E.coliBL21(DE3)中,0.2mMIPTG在37℃下诱导12h表达CBD-bFGF蛋白。蛋白经过His-tag填料亲和层析获得了CBD-bFGF蛋白。如下图：电泳图可以看出我们纯化得到了CBD-bFGF蛋白，理论分子量为23619.82和电泳图中CBD-bFGF分子量基本一致，如图1所示。
实施例2CBD-bFGF和几丁质球结合能力检测
以CBD-bFGF、bFGF为检测对象，以PBS为control。方法为：
1)、将几丁质球分别加入到含有CBD-bFGF(1μg/mL),bFGF(1μg/mL)的溶液中，37℃抚育2小时；
2)、用PBS洗几丁质球三次,每次5分钟；
3)、将结合有CBD-bFGF,bFGF几丁质球分别加入到含有10％BSA的溶液中,进行封闭；
4)、将结合有CBD-bFGF,bFGF几丁质球分别加入到含有小鼠抗bFGF的抗体中,4℃抚育过夜；
5)、用PBS洗几丁质球三次,每次5分钟；
6)、将结合有CBD-bFGF,bFGF几丁质球分别加入到含有兔抗小鼠FITC标记的抗体中,37℃抚育2小时；
7)、用PBS洗几丁质球三次,每次5分钟；
8)、激光共聚焦显微镜观察结合有CBD-bFGF,bFGF几丁质球，结果如图2。如图所示，从荧光图片可以看出CBD-bFGF结合几丁质球的能力要远远大于bFGF和Control组。
荧光强度见表1：
表1CBD-bFGF,bFGF,Control与几丁质球结合能力对比
| 组别 | 相对荧光强度 | 结合能力对比(倍数) |
| CBD-bFGF | 148904.328 | 5.33 |
| bFGF | 27957.822 | 1 |
| Control | 31325.519 | 1.12 |
结果显示，CBD-bFGF绑定几丁质球的能力是bFGF5.33倍。
实施例3CBD-bFGF的缓释效果
检测CBD-bFGF的缓释效果，以bGFG为对照，方法如下：
几丁质膜制备成直径8mm的圆片；
bFGF，CBD-bFGF细胞因子用PBS配制成20ug/ml的溶液；
几丁质膜分别浸泡于bFGF，CBD-bFGF溶液中，4℃过夜；
将膜分别从于bFGF，CBD-bFGF溶液中取出，放置于PBS溶液中；
在1、3、5、8、11、14、17、20、24、48小时时间点取样；
根据bFGFElisa试剂盒说明书方法操作，检测不同时间点样品中bFGF的含量；
用Origin作图，如图3。
由图3可以看出，从0到48小时，带有几丁质结合结构域的细胞因子CBD-bFGF比天然的bFGF具有更好的缓慢释放能力。
实施例4CBD-bFGF的生物学活性
以CBD-bFGF、bFGF为检测对象，以不同浓度(0.33pmol/L、1pmol/L、11pmol/L、34pmol/L、111pmol/L、333pmol/L)CBD-bFGF和bFGF作用Balb/c3T3细胞后，检测细胞的增殖率，相对生物活性的计算方法为：Balb/c3T3以5×104/孔密度种在96孔板中，用完全培养基培养24小时，更换维持培养基继续培养24小时，加入不同浓度的检测对象继续培养64小时，加入MTT抚育5小时，去培养基后加入DMSO，570nm检测不同检测对象的光吸收值作图。
结果如(图4)。结果显示ChBD-bFGF和bFGF均对细胞增殖有显著促进作用。而CBD-bFGF对细胞增殖起促进作用的最适浓度要低于bFGF，说明CBD-bFGF能够对细胞的增殖起到更好的促进作用。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子，包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列和SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子，其特征在于，包括如SEQIDNO:3所示氨基酸序列或SEQIDNO:4所示氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。
4.编码与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子的DNA分子，其特征在于，包括SEQIDNO:6所示的核苷酸序列和SEQIDNO:7所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，包括如SEQIDNO:8所示的核苷酸序列或SEQIDNO:9所示的核苷酸序列。
6.权利要求1所述与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子的制备方法，其特征在于，将SEQIDNO:6所示的核苷酸序列和SEQIDNO:7所示的核苷酸序列经宿主细胞表达，制得与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子。
7.权利要求1所述的与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子在制备促进细胞增殖的制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，权利要求1所述的与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子促进细胞增殖的浓度为11pmol/L～34pmol/L。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述细胞为Balb/c3T3细胞。
10.一种促进细胞增殖的制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子和几丁质。
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