CN103649112B - 改造层粘连蛋白及其利用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供改造层粘连蛋白、在该改造层粘连蛋白存在下培养细胞的培养方法、在该改造层粘连蛋白存在下建立iPS细胞的方法以及包被有该改造层粘连蛋白的培养基质，该改造层粘连蛋白的特征在于，在层粘连蛋白或形成了异三聚体的层粘连蛋白片段的α链的N末端、α链的C末端、β链的N末端以及γ链的N末端的至少1处结合有细胞增殖控制分子。通过使用本发明的改造层粘连蛋白，在无异源成分环境下培养人干细胞，从而能够提供可应用于再生医疗的安全性高的人干细胞。
Description
技术领域
本发明涉及改造人层粘连蛋白及其利用，具体而言，涉及在层粘连蛋白或其片段上结合有细胞增殖控制分子的改造人层粘连蛋白、使用该改造人层粘连蛋白的细胞培养方法和iPS细胞的建立方法以及包被有该改造人层粘连蛋白的培养基质。
背景技术
干细胞特别是ES细胞、iPS细胞等多能干细胞在再生医疗中的应用正受到全世界的关注。但是，为了在保持多能性的状态下培养、维持干细胞，通常将细胞在与作为饲养细胞的用放射线、抗生素进行处理使细胞分裂停止的来源于小鼠胚胎的成纤维细胞（MEF）共存下进行培养。作为MEF，通常，经常使用STO细胞等，但在iPS细胞的诱导中，经常使用SNL细胞（McMahon,A.P.&Bradley,A.Cell62,1073-1085（1990））等。然而，在临床应用干细胞的阶段，这些饲养细胞的使用成为很大的制约。为了解决该问题，迄今为止正在尝试以各种细胞粘附分子作为干细胞的胞外基质来代替饲养细胞，其中，报道了从过量产生基底膜成分的小鼠EHS肿瘤中制备得到的粗提物（以商品名Matrigel（マトリゲル）进行市售）的多能性维持活性最高。但是，虽然已知Matrigel富含层粘连蛋白、IV型胶原蛋白等基底膜成分，但其组成并未被完全阐明，而且，由于其来源于小鼠，因此并不适合再生医疗中的人干细胞的培养。
为了将人干细胞应用于再生医疗，优选满足不使用饲养细胞的无饲养细胞条件以及从培养体系中排除异源成分的无异源成分（Xeno-Free）条件的培养环境。因此，作为来源于人的胞外基质，正尝试使用人玻连蛋白、人纤连蛋白，但它们与Matrigel相比，人干细胞的未分化维持效果、粘附效率差，在质量、材料来源的确保、安全性等方面存在问题。由此可见，现状是适于维持培养用于应用于再生医疗的人干细胞的胞外基质的开发没有进展，迫切要求开发使用化学组成均一的人源性胞外基质的新的人干细胞培养技术。
层粘连蛋白是基底膜的主要的细胞粘附分子，是由α链、β链以及γ链这3条亚基链构成的异三聚体，是分子量为80万Da的巨大糖蛋白。3条亚基链在C末端侧缔合而形成卷曲螺旋结构并通过二硫键形成稳定的异三聚体分子。本发明人报道了人层粘连蛋白（特别是由α3β3γ2构成的层粘连蛋白332以及由α5β1γ1构成的层粘连蛋白511）的重组蛋白对于维持人ES细胞的多能性有效（参照非专利文献1）。然而，在人干细胞的表面还发现了层粘连蛋白受体以外的粘附受体（位于细胞表面且介导细胞向胞外基质的粘附的膜结合分子），单独依靠层粘连蛋白分子不能有效利用这些粘附受体。因此，迫切期望开发具有更接近天然粘附活性且能够在无饲养细胞条件下培养人干细胞的新的来源于人的胞外基质。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Miyazaki T,Futaki S,Hasegawa K,Kawasaki M,Sanzen N,Hayashi M,Kawase E,Sekiguchi K,Nakatsuji N,Suemori H.Recombinant humanlaminin isoforms can support the undifferentiated growth of human embryonicstem cells.Biochem.Biophys.Res.Commun.375:27-35,2008.
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于，提供能够在无饲养细胞的培养环境中以保持多能性的状态维持培养干细胞的培养基质、使用该培养基质的细胞培养方法和iPS细胞建立方法以及包被有该胞外基质的培养基质。
用于解决问题的方法
本发明为了解决上述课题而包含下述发明。
［1］一种改造层粘连蛋白，其特征在于，在层粘连蛋白或形成了异三聚体的层粘连蛋白片段的α链的N末端、α链的C末端、β链的N末端以及γ链的N末端的至少1处结合有细胞增殖控制分子。
［2］根据上述［1］所述的改造层粘连蛋白，其中，细胞增殖控制分子是细胞粘附分子。
［3］根据上述［1］所述的改造层粘连蛋白，其中，细胞增殖控制分子是增殖因子结合分子。
［4］根据上述［1］～［3］中任一项所述的改造层粘连蛋白，其中，层粘连蛋白片段具有整合蛋白结合活性。
［5］根据上述［4］所述的改造层粘连蛋白，其中，层粘连蛋白片段是层粘连蛋白E8片段。
［6］根据上述［1］～［5］中任一项所述的改造层粘连蛋白，其中，层粘连蛋白由选自α1～α5的1种α链、选自β1～β3的1种β链、选自γ1～γ3的1种γ链构成。
［7］根据上述［6］所述的改造层粘连蛋白，其中，层粘连蛋白是层粘连蛋白α5β1γ1或层粘连蛋白α3β3γ2。
［8］根据上述［2］所述的改造层粘连蛋白，其中，细胞粘附分子是选自以下（a）～（e）中的至少1种以上，
（a）与整合蛋白结合的细胞粘附分子、
（b）与膜结合型蛋白聚糖结合的细胞粘附分子、
（c）与盘状结构域受体结合的细胞粘附分子、
（d）与肌营养不良蛋白聚糖结合的细胞粘附分子、
（e）与细胞表面的糖链结合的细胞粘附分子。
［9］根据上述［2］所述的改造层粘连蛋白，其中，细胞粘附分子是选自以下（a）～（k）的至少1种以上，
（a）纤连蛋白或其包含细胞粘附活性位点的片段、
（b）胶原蛋白或其包含细胞粘附活性位点的片段、
（c）玻连蛋白或其包含细胞粘附活性位点的片段、
（d）肾连蛋白或其包含细胞粘附活性位点的片段、
（e）骨桥蛋白或其包含细胞粘附活性位点的片段、
（f）MAEG或其包含细胞粘附活性位点的片段、
（g）肌腱蛋白或其包含细胞粘附活性位点的片段、
（h）SVEP1或其包含细胞粘附活性位点的片段、
（i）TGF-β1潜在相关肽（TGF-β1latency associated peptide）或其包含细胞粘附活性位点的片段、
（j）TGF-β3潜在相关肽或其包含细胞粘附活性位点的片段、
（k）层粘连蛋白α链的球形结构域4和/或球形结构域5。
［10］根据上述［3］所述的改造层粘连蛋白，其中，增殖因子结合分子是选自以下（a）～（f）的至少1种以上，
（a）基底膜蛋白聚糖或其包含增殖因子结合位点的片段、
（b）聚集蛋白或其包含增殖因子结合位点的片段、
（c）XVIII型胶原蛋白或其包含增殖因子结合位点的片段、
（d）多配体蛋白聚糖或其包含增殖因子结合位点的片段、
（e）磷脂酰肌醇蛋白聚糖或其包含增殖因子结合位点的片段、
（f）潜在TGF-β结合蛋白（latent TGF-βbinding protein）或其包含增殖因子结合位点的片段。
［11］根据上述［1］～［10］中任一项所述的改造层粘连蛋白，其中，改造层粘连蛋白来源于人。
［12］一种哺乳动物细胞的培养方法，其特征在于，在上述［1］～［11］中任一项所述的改造人层粘连蛋白的存在下进行培养。
［13］根据上述［12］所述的的培养方法，其中，哺乳动物细胞是ES细胞、iPS细胞或成体干细胞。
［14］根据上述［12］或［13］所述的的培养方法，其中，不使用饲养细胞。
［15］一种培养基质，其特征在于，包被有上述［1］～［11］中任一项所述的改造人层粘连蛋白。
［16］根据上述［15］所述的培养基质，其中，以0.03～25μg/cm2的浓度包被有改造人层粘连蛋白。
［17］一种iPS细胞的建立方法，其特征在于，包括：在上述［1］～［11］中任一项所述的改造层粘连蛋白的存在下使核重编程物质（核初期化物質）与体细胞接触的步骤。
［18］根据上述［17］所述的iPS细胞的建立方法，其中，所述核重编程物质包含选自由Oct家族、Sox家族、Klf家族、Lin家族和Glis家族以及编码它们的核酸组成的组中的1种以上的物质。
发明效果
根据本发明，能够提供作为可在无饲养细胞的培养环境中以保持多能性的状态维持培养干细胞的胞外基质的改造人层粘连蛋白、使用该改造人层粘连蛋白的细胞培养方法和iPS细胞建立方法以及包被有该改造人层粘连蛋白的培养基质。通过使用来源于人的改造人层粘连蛋白，以无异源成分的培养基建立iPS细胞、培养人干细胞，能够提供可应用于再生医疗的安全性高的人干细胞。
附图说明
图1是示出使人层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段与人层粘连蛋白α1链第4～5个球形结构域融合后得到的改造人层粘连蛋白（以下记作“Plus＃1层粘连蛋白E8”）以及使人层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段与人纤连蛋白的细胞粘附位点融合后得到的改造人层粘连蛋白（以下记作“Plus＃2层粘连蛋白E8”）的SDS-PAGE分析结果的图。
图2是示出对人iPS细胞对Plus＃1层粘连蛋白E8、Plus＃2层粘连蛋白E8或Matrigel的浓度依赖性粘附效率进行比较的结果的图。
图3是示出使用包被有Plus＃1层粘连蛋白E8、Plus＃2层粘连蛋白E8或Matrigel的培养基质对人iPS细胞进行1代或3代传代培养后的结果的图。
图4是示出确认Plus＃2层粘连蛋白E8对重组人α5β1整合蛋白或重组人α6β1整合蛋白的结合活性的结果的图。
图5是示出使用包被有Plus＃1层粘连蛋白E8、Plus＃2层粘连蛋白E8、全长层粘连蛋白511或Matrigel的培养基质对人ES细胞进行单个分散培养后的结果的图。
图6是示出使用包被有Plus＃1层粘连蛋白E8、Plus＃2层粘连蛋白E8、使人层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段与人基底膜蛋白聚糖的结构域I～III融合后得到的改造人层粘连蛋白（以下记作“Plus＃3层粘连蛋白E8”）或人层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段、或Matrigel的培养基质对人iPS细胞进行7天的培养后确认存活的结果的图。
图7是示出使用包被有Plus＃1层粘连蛋白E8或Plus＃2层粘连蛋白E8的培养基质对人iPS细胞进行10代传代培养后对未分化标记Oct3/4、SSEA-4以及TRA-1-60进行免疫染色的结果的图。
图8是示出使用包被有Plus＃1层粘连蛋白E8、Plus＃2层粘连蛋白E8、全长层粘连蛋白511或Matrigel的培养基质对人iPS细胞进行单个分散培养后的结果的图。
图9是示出对使用未包被皿、包被Plus＃1层粘连蛋白E8的皿以及包被Plus＃2粘连蛋白E8的皿从来源于成人皮肤的成纤维细胞建立人iPS细胞进行研究的结果的图。
图10是示出附加体（episomal）质粒载体的结构的图，（I）是pCEB-hSK-O，（II）是pCEB-hUL-G。
具体实施方式
〔改造人层粘连蛋白〕
本发明提供一种改造层粘连蛋白，其特征在于，在层粘连蛋白或形成了异三聚体的层粘连蛋白片段的α链的N末端、α链的C末端、β链的N末端以及γ链的N末端的至少1处结合有细胞增殖控制分子。
层粘连蛋白是由α链、β链以及γ链这3条亚基链构成的异三聚体分子。已知α链为α1～α5这5种，β链为β1～β3这3种，γ链为γ1～γ3这3种，并且它们的组合至少存在12种以上的异构体（参照表1）。构成本发明的改造层粘连蛋白的层粘连蛋白可以是任一种异构体。也就是说，构成本发明的改造层粘连蛋白的层粘连蛋白只要由选自α1～α5的1种α链、选自β1～β3中的1种β链、选自γ1～γ3中的1种γ链构成即可。具体而言，可以优选使用表1中记载的12种以及除此之外的全部异构体。优选的是层粘连蛋白α3β3γ2、层粘连蛋白α5β1γ1。
表1
层粘连蛋白的来源没有特别限定，可以使用来源于各种生物的层粘连蛋白。优选的是来源于哺乳动物的层粘连蛋白。作为哺乳动物，例如可以列举：人、小鼠、大鼠、牛、猪等，但不限于此。其中，特别优选使用来源于人的层粘连蛋白。在为了得到人的再生医疗的材料而培养人干细胞时，要求满足从培养体系中排除异源成分的无异源成分条件的培养环境，因此，优选使用来源于人的层粘连蛋白。
构成本发明的改造层粘连蛋白的层粘连蛋白可以为全长，也可以是其片段。也就是说，可以是由全长α链、全长β链以及全长γ链构成的全长层粘连蛋白，也可以是由α链、β链以及γ链的至少一个以上为比全长短的片段构成的层粘连蛋白片段。其中，层粘连蛋白片段需要形成异三聚体。另外，层粘连蛋白片段优选具有整合蛋白结合活性。层粘连蛋白片段形成异三聚体能够通过对层粘连蛋白片段进行SDS-PAGE来检测条带的数量等方法来进行确认（参照实施例1）。层粘连蛋白片段具有整合蛋白结合活性能够通过ELISA法等来进行确认（参照实施例4）。
构成本发明的改造层粘连蛋白的层粘连蛋白片段只要形成了由α链、β链以及γ链构成的异三聚体即可，分子量等没有特别限定。从整合蛋白结合活性的强度、作为重组蛋白的表达效率（与全长层粘连蛋白相比，能够以重组蛋白的形式高收率地进行制造）的观点考虑，优选层粘连蛋白的E8片段。层粘连蛋白的E8片段是将小鼠层粘连蛋白α1β1γ1（以下记作“小鼠层粘连蛋白111”）用弹性蛋白酶进行消化而得到的片段中作为具有强细胞粘附活性的片段而被鉴定的片段（Edgar D.,Timpl R.,Thoenen H.The heparin-binding domainof laminin is responsible for its effects on neurite outgrowth and neuronalsurvival.EMBO J.,3:1463-1468,1984.、Goodman SL.,Deutzmann R.,von der MarkK.Two distinct cell-binding domains in laminin can independently promotenonneuronal cell adhesion and spreading.J.Cell Biol.,105:589-598,1987.）。对于小鼠层粘连蛋白111以外的层粘连蛋白，推测在用弹性蛋白酶进行消化时也存在与小鼠层粘连蛋白111的E8片段相当的片段，但还没有对用弹性蛋白酶消化小鼠层粘连蛋白111以外的层粘连蛋白并对E8片段进行分离、鉴定的报道。因此，本发明中使用的层粘连蛋白E8并非必须是层粘连蛋白的弹性蛋白酶消化产物，只要是具有与小鼠层粘连蛋白111的E8同样的细胞粘附活性、具有同样的结构、具体相同程度的分子量的层粘连蛋白的片段即可。
层粘连蛋白可以是天然型，也可以是在维持其生物学活性的状态下1个或1个以上氨基酸残基被修饰的修饰型。层粘连蛋白的制造方法没有特别限定，例如可以列举：由层粘连蛋白高表达细胞进行纯化的方法、以重组蛋白的形式进行制造的方法等。层粘连蛋白片段的制造方法也没有特别限定，例如可以列举：用弹性蛋白酶等蛋白分解酶消化全长层粘连蛋白并分离、纯化目标片段的方法、以重组蛋白的形式进行制造的方法等。从制造量、质量的均一性、制造成本等观点考虑，层粘连蛋白以及层粘连蛋白片段两者都优选以重组蛋白的形式进行制造。
重组层粘连蛋白、重组层粘连蛋白片段能够通过适当使用公知的基因重组技术来制造。作为重组层粘连蛋白、重组层粘连蛋白片段的制造方法，例如可以通过如下方法进行制备：分别获取编码α链、β链以及γ链的各全长蛋白或部分蛋白的DNA，将其分别插入表达载体中，将得到的3种表达载体共同导入适当的宿主细胞使其表达，并利用公知的方法对形成三聚体的蛋白质进行纯化。作为重组层粘连蛋白（全长）的制造方法，例如可以列举Ido等人报道的方法（Hiroyuki Ido,Kenji Harada,Sugiko Futaki,Yoshitaka Hayashi,RyokoNishiuchi,Yuko Natsuka,Shaoliang Li,Yoshinao Wada,Ariana C.Combs,JamesM.Ervasti,and Kiyotoshi Sekiguchi,“Molecular dissection of the α-dystroglycan-and integrin-binding sites within the globular domain of humanlaminin-10”The Journal of Biological Chemistry,279,10946-10954,2004.）等，但不限于此。作为重组层粘连蛋白片段（人层粘连蛋白E8）的制造方法，可以列举Ido等人（Hiroyuki Ido,Aya Nakamura,Reiko Kobayashi,Shunsuke Ito,Shaoliang Li,SugikoFutaki,and Kiyotoshi Sekiguchi,“The requirement of the glutamic acid residueat the third position from the carboxyl termini of the lamininγchains inintegrin binding by laminins”The Journal of Biological Chemistry,282,11144-11154,2007.）的方法，但不限于此。
编码构成主要的哺乳类的层粘连蛋白的α链、β链、γ链的基因的碱基序列信息以及各链的氨基酸序列信息能够由公知的数据库（GenBank等）获得。表1中，针对包括人的主要哺乳类，示出了构成层粘连蛋白的各链的登录号。除此之外的各种哺乳动物的层粘连蛋白构成链的碱基序列信息以及氨基酸序列信息也同样能够由公知的数据库（GenBank等）获得。
表2
层粘连蛋白E8是从α链的C末端片段除去球形结构域4以及球形结构域5后的片段（以下记作“α链E8”）、β链的C末端片段（以下记作“β链E8”）以及γ链的C末端片段（以下记作“γ链E8”）形成三聚体后的片段，三聚体的分子量为约150～约170kDa。α链E8通常由约770个氨基酸构成，N末端侧的约230氨基酸与三聚体形成有关。β链E8通常由约220～约230个氨基酸构成。γ链E8通常由约240～约250个氨基酸构成。γ链E8的从C末端部起第3位的谷氨酸残基对层粘连蛋白E8的细胞粘附活性是必须的（Hiroyuki Ido,Aya Nakamura,ReikoKobayashi,Shunsuke Ito,Shaoliang Li,Sugiko Futaki,and Kiyotoshi Sekiguchi,“The requirement of the glutamic acid residue at the third position from thecarboxyl termini of the lamininγchains in integrin binding by laminins”TheJournal of Biological Chemistry,282,11144-11154,2007.）。
构成本发明的改造层粘连蛋白的细胞增殖控制分子是指细胞的培养以及扩增所必需的细胞外因子，具体而言，符合上述定义的是：（i）与细胞表面的受体结合并提供细胞的脚手架的胞外基质的细胞粘附分子、或者（ii）通过与增殖因子结合而与增殖因子的局部化控制、活性控制相关的分子（在本说明书中称为“增殖因子结合分子”）。作为增殖因子结合分子的结合对象的增殖因子，与生长因子同义，只要是促进细胞的增殖、生长、分化等的物质，则没有特别限定。例如可以列举：EGF（Epidermal growth factor）、bFGF（basicfibroblast growth factor）、TGF（Transforming growth factor）、IGF（Insulin-likegrowth factor）、PDGF（Platelet-derived growth factor）、VEGF（Vesicularendothelial growth factor）、HGF（Hepatocyte growth factor）、NGF（Nerve growthfactor）等。
构成本发明的改造层粘连蛋白的细胞粘附分子，可以是与细胞和胞外基质的粘附相关的分子、以及与细胞彼此之间的粘附相关的分子中的任意一种，不仅包括存在于细胞膜中的膜蛋白，还包括胞外基质，并没有特别限定。另外，构成本发明的改造层粘连蛋白的细胞粘附分子可以是细胞粘附分子的全长，也可以是细胞粘附分子的包含细胞粘附位点的片段。作为粘附分子，可以列举以下的（a）～（e），优选为从中选出的至少1种以上。
（a）与整合蛋白结合的细胞粘附分子
（b）与膜结合型蛋白聚糖结合的细胞粘附分子
（c）与盘状结构域受体结合的细胞粘附分子
（d）与肌营养不良蛋白聚糖结合的细胞粘附分子
（e）与细胞表面的糖链结合的细胞粘附分子
作为与整合蛋白结合的细胞粘附分子，例如可以列举：纤连蛋白、胶原蛋白、玻连蛋白、肾连蛋白、骨桥蛋白、MAEG、肌腱蛋白、SVEP1、TGF-β1潜在相关肽、TGF-β3潜在相关肽等。作为与膜结合型蛋白聚糖结合的细胞粘附分子，例如可以列举：纤连蛋白、玻连蛋白、肾连蛋白、层粘连蛋白等。作为与肌营养不良蛋白聚糖结合的细胞粘附分子，例如可以列举层粘连蛋白等。作为与细胞表面的糖链结合的细胞粘附分子，可以列举刀豆蛋白A（Concanavalin A）、双花扁豆凝集素（Dolichos biflorus agglutinin）、花生凝集素（Arachis hypogaea agglutinin）、蓖麻凝集素（Ricinus communis agglutinin）、麦胚凝集素（Wheat germ agglutinin）等。但不限于此。
作为适合构成本发明的改造层粘连蛋白的细胞粘附分子，例如可以列举：纤连蛋白、玻连蛋白、肾连蛋白、骨桥蛋白、MAEG、TGF-β1潜在相关肽、TGF-β3潜在相关肽、肌腱蛋白等在分子内含有Arg-Gly-Asp序列的蛋白质、I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、其他胶原蛋白分子、SVEP1、E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、P-钙粘蛋白等、钙粘蛋白家族的细胞间粘附分子。另外，作为细胞粘附分子的包含细胞粘附活性位点的片段，例如可以列举：人纤连蛋白的包含III型组件的第7～第10个的片段（Fusao Kimizuka,Yoichi Ohdate,Yasutoshi Kawase,Tomoko Shimojyo,Yuki Taguchi,Kimikazu Hashino,Shoichi Goto,Hidetaka Hashi,Ikunoshin Kato,Kiyotoshi Sekiguchi,and Koiti Titani,“Role of type IIIhomology repeats in cell adhesive function within the cell-binding domain offibronectin”The Journal of Biological Chemistry,266,3045-3051,1999.）、纤连蛋白的包含III型组件的第12～14个的片段（Ri-ichiroh Manabe,Naoko Oh-e,ToshinagaMaeda,Tomohiko Fukuda,and Kiyotoshi Sekiguchi,“Modulation of cell adhesiveactivity of fibronectin by the alternatively spliced EDA segment”The Journalof Cell Biology,139,295-307,1997.）、肾连蛋白的分子中央区的连接肽区域（YuyaSato,Toshihiko Uemura,Keisuke Morimitsu,Ryoko Sato-Nishiuchi,Ri-ichirohManabe,Junichi Takagi,Masashi Yamada,and Kiyotoshi Sekiguchi,“Molecular basisof the recognition of nephronectin by integrin alpha8beta1”The Journal ofBiological Chemistry,284,14524-14536,2009.）等。而且，人层粘连蛋白α链的球形结构域4和/或球形结构域5也适合用作构成本发明的改造人层粘连蛋白的细胞粘附分子。
细胞粘附分子的制造方法没有特别限定，例如可以列举：从表达目标细胞粘附分子的细胞进行纯化的方法、以重组蛋白的形式进行制造的方法等。重组蛋白可以适当使用公知的基因重组技术来制造。另外，分别编码人的纤连蛋白、玻连蛋白、肾连蛋白、骨桥蛋白、MAEG、TGF-β1、TGF-β3、肌腱蛋白、I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、SVEP1、E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、P-钙粘蛋白的基因的碱基序列信息以及氨基酸序列信息可以分别用记载于表3的登录号从公知的数据库（GenBank等）获取。来源于人以外的生物的细胞粘附分子的基因的碱基序列信息以及氨基酸序列信息也同样可以由公知的数据库（GenBank等）获取。作为一例，将与细胞表面的糖链结合的细胞粘附分子中来源于人以外的生物的外源凝集素的基因的碱基序列信息以及氨基酸序列信息分别示于表4。
表3
| 氨基酸序列 | 碱基序列 | |
| 人纤连蛋白 | NP_002017 | NM_002026 |
| 人玻连蛋白 | NP_000629 | NM_000638 |
| 人肾连蛋白 | NP_001171620 | NM_001184691 |
| 人骨桥蛋白 | NP_001035147 | NM_001040058 |
| 人MAEG | NP_001161362 | NM_001167890 |
| 人TGF-β1 | NP_000651 | NM_000660 |
| 人TGF-β3 | NP_003230 | NM_003239 |
| 人肌腱蛋白 | NP_002151 | NM_002160 |
| 人I型胶原蛋白α1链 | NP_000079 | NM_000088 |
| 人I型胶原蛋白α2链 | NP_000080 | NM_000089 |
| 人IV型胶原蛋白α1链 | NP_001836 | NM_001845 |
| 人IV型胶原蛋白α2链 | NP_001837 | NM_001846 |
| 人SVEP1 | NP_699197 | NM_153366 |
| 人E-钙粘蛋白 | NP_004351 | NM_004360 |
| 人N-钙粘蛋白 | NP_001783 | NM_001792 |
| 人P-钙粘蛋白 | NP_001784 | NM_001793 |
表4
| 氨基酸序列 | 碱基序列 | |
| 刀豆蛋白A | P02866 | X01632 |
| 双花扁豆凝集素 | P05045 | J02721 |
| 花生凝集素 | P02872 | S42352 |
| 蓖麻凝集素-1 | XP_002534649 | XM_002534603 |
| 麦胚凝集素 | P10968 | M25536 |
构成本发明的改造层粘连蛋白的增殖因子结合分子，只要是能够与参与培养细胞的增殖的增殖因子结合的分子，则没有特别限定。通过嵌合增殖因子结合分子，从而能够将增殖因子捕捉到基质面，使增殖因子更有效地(更生理性地)对细胞产生作用，刺激增殖。构成本发明的改造层粘连蛋白的增殖因子结合分子可以是增殖因子结合分子的全长，也可以是含有增殖因子结合位点的片段。作为增殖因子结合分子，例如可以列举硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。作为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，例如可以列举：基底膜蛋白聚糖、聚集蛋白、XVIII型胶原蛋白、多配体蛋白聚糖1～4、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1～6等。另外，作为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖以外的增殖因子结合分子，例如可以列举：潜在TGF-β结合蛋白1～4等。作为增殖因子结合分子的包含增殖因子结合位点的片段，例如可以列举：基底膜蛋白聚糖的结构域I～III（从N末端起第22位的缬氨酸至第1676位的脯氨酸的区域；氨基酸序列信息记载于表5）、聚集蛋白的包含第1至第8卵泡抑素（FS）结构域的区域（Uwe Winzen,Gregory J.Cole,andWilli Halfter,“Agrin is a chimeric proteoglycan with the attachment sites forheparan sulfate/chondroitin sulfate located in two multiple serine-glycineclusters”The Journal of Biological Chemistry,27j8,30106-30114,2008.）等。
增殖因子结合分子的制造方法没有特别限定，例如可以列举：由表达目标增殖因子结合分子的细胞进行纯化的方法、以重组蛋白的方式进行制造的方法等。重组蛋白能够通过适当使用公知的基因重组技术来制造。另外，分别编码人的基底膜蛋白聚糖、聚集蛋白、XVIII型胶原蛋白、多配体蛋白聚糖1～4、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1～6、潜在TGF-β结合蛋白1～4的基因的碱基序列信息以及氨基酸序列信息能够分别用记载于表5的登录号从公知的数据库（GenBank等）获取。
表5
| 氨基酸序列 | 碱基序列 | |
| 人基底膜蛋白聚糖 | NP_005520 | NM_005529 |
| 人凝集蛋白 | NP_940978 | NM_198576 |
| 人XVIII型胶原蛋白α1链 | NP_085059 | NM_030582 |
| 人多配体蛋白聚糖1 | NP_001006947 | NM_001006946 |
| 人多配体蛋白聚糖2 | NP_002989 | NM_002998 |
| 人多配体蛋白聚糖3 | NP_055469 | NM_014654 |
| 人多配体蛋白聚糖4 | NP_002990 | NM_002999 |
| 人磷脂酰肌醇蛋白聚糖1 | NP_002072 | NM_002081 |
| 人磷脂酰肌醇蛋白聚糖2 | NP_689955 | NM_152742 |
| 人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 | NP_001158089 | NM_001164617 |
| 人磷脂酰肌醇蛋白聚糖4 | NP_001439 | NM_001448 |
| 人磷脂酰肌醇蛋白聚糖5 | NP_004457 | NM_004466 |
| 人磷脂酰肌醇蛋白聚糖6 | NP_005699 | NM_005708 |
| 人潜在TGF-β结合蛋白1 | NP_996826 | NM_206943 |
| 人潜在TGF-β结合蛋白2 | NP_000419 | NM_000428 |
| 人潜在TGF-β结合蛋白3 | NP_001123616 | NM_001130144 |
| 人潜在TGF-β结合蛋白4 | NP_001036009 | NM_001042544 |
对于本发明的改造层粘连蛋白而言，只要是层粘连蛋白或形成了异三聚体的层粘连蛋白片段的α链的N末端、α链的C末端、β链的N末端以及γ链的N末端至少1处结合有上述细胞增殖控制分子(例如细胞粘附分子、增殖因子结合分子等)即可。因此，本发明的改造层粘连蛋白中，可以在2处结合有细胞增殖控制分子，可以在3处结合有细胞增殖控制分子，也可以在4处结合有细胞增殖控制分子。当细胞增殖控制分子在多处结合时，细胞增殖控制分子可以是1种，也可以是2种以上。细胞增殖控制分子只要在上述4处结合，则在哪处结合均可，但优选层在α链的C末端结合层粘连蛋白α链的球形结构域4和／或球形结构域5。
本发明的改造层粘连蛋白能够通过适当使用公知的基因重组技术以重组改造层粘连蛋白的形式进行制造。例如，在制备于人层粘连蛋白E8的α链的N末端结合有细胞增殖控制分子的改造层粘连蛋白时，连接编码人层粘连蛋白的α链E8的DNA和编码细胞增殖控制分子的DNA，并制备插入有编码在人层粘连蛋白E8的α链的N末端结合有细胞增殖控制分子的融合蛋白的融合基因的表达载体。通过将其与人层粘连蛋白的β链E8表达载体以及γ链E8表达载体这3种表达载体共同导入适当的宿主细胞，并使其表达，并用公知的方法对形成三聚体的蛋白质进行纯化，由此能够得到。其他处结合有细胞增殖控制分子的改造层粘连蛋白、多处结合有细胞增殖控制分子的改造层粘连蛋白也可以根据以上方法进行制造。另外，本发明的改造层粘连蛋白也可以在α链的N末端、α链的C末端、β链的N末端以及γ链的N末端在至少1处以化学方式结合有细胞增殖控制分子。
本发明的改造层粘连蛋白具有高细胞粘附活性和/或增殖刺激活性，能够作为高纯度且均一的蛋白质来提供，因此，作为培养细胞特别是培养干细胞的胞外基质是非常有用的。通过使本发明的改造层粘连蛋白为来源于人的改造层粘连蛋白，能够在无饲养细胞以及无异源成分的环境中培养人干细胞，能够提供可用于再生医疗的安全性高的人干细胞。
〔哺乳动物细胞的培养方法〕
本发明提供在上述本发明的改造层粘连蛋白的存在下培养哺乳动物细胞的培养方法。本发明的改造层粘连蛋白具有高细胞粘附活性和/或增殖刺激活性，因此，通过用作成为哺乳动物细胞的脚手架的胞外基质，能够以不使用饲养细胞的方式培养现有技术中使用饲养细胞培养的细胞。
本发明的培养方法可以适用于各种哺乳动物细胞的培养，但优选应用于干细胞的培养。干细胞是指具有自我复制能力和多能性的细胞，包含成体干细胞、多能干细胞等。作为成体干细胞，可以列举：神经干细胞、间充质干细胞、造血干细胞等。作为多能干细胞，可以列举：ES细胞（胚胎干细胞）、iPS细胞（诱导性多能干细胞）、mGS细胞（多能生殖干细胞）、ES细胞和体细胞的融合细胞等。更优选的是多能干细胞，进一步优选ES细胞、iPS细胞。哺乳动物没有特别限定，可以列举人、小鼠、大鼠、牛、猪等。其中，优选人。也就是说，本发明的培养方法优选用于人干细胞的培养。另外，在使用本发明的培养方法进行人干细胞的培养时，优选使用来源于人的改造层粘连蛋白。
在改造人层粘连蛋白存在下进行培养的方法可以是使用添加有本发明的改造层粘连蛋白的培养基培养细胞的方法，也可以是使用包被有本发明的改造层粘连蛋白的培养基质培养细胞的方法。在使用添加有改造层粘连蛋白的培养基时，可以预先在培养基中添加改造层粘连蛋白，也可以使用时在培养基中添加改造层粘连蛋白。添加的改造层粘连蛋白的量没有特别限制，优选相对于培养中使用的培养器皿的培养面积为约0.03～约25μg/cm2的浓度，更优选约0.06～约10μg/cm2，进一步优选约0.38～约3.8μg/cm2。
以下，作为本发明的培养方法的实施方式，针对在来源于人的改造层粘连蛋白存在下对人干细胞进行培养的情况下的培养方法进行说明，但本发明的培养方法不限于此，能够适当用于人以外的哺乳动物细胞的培养。
在使用本发明的培养方法对人干细胞进行培养时，所使用的培养基没有特别限定，但优选合成培养基，特别优选不包含来源于人以外的生物的成分（无异源成分）合成培养基。使用本发明的培养方法，在无饲养细胞且无异源成分的培养条件下培养人干细胞，由此能够提供可用于再生医疗的安全性高的人干细胞。合成培养基可以适当使用市售品。作为市售的合成培养基，可以列举：mTeSR1（商品名、STEMCELL TECHNOLOGIES）、TeSR2（商品名、STEMCELLTECHNOLOGIES）、StemPro hESC SFM（商品名、Invitrogen）、hESF-GRO（商品名、株式会社细胞科学研究所）等。其中，TeSR2是无异源成分的培养基。另外，也可以适当使用以下文献（i）～（v）中记载的培养基。
（i）Liu,Y.et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,346:131-139,2006.
（ii）Vallier,L.et al.,J.Cell Sci.118:4495-4509,2005.
（iii）Li,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,91:688-698,2005.
（iv）Yao,S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,103:6907-6912,2006.
（v）Lu,J.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,103:5688-5693,2006.
使用本发明的培养方法培养人iPS细胞时的一个实施方式如下所示。
（1）从与饲养细胞的共培养体系中回收人iPS细胞
使用以下的方法1或方法2的任一种方法从与饲养细胞的共培养体系中回收人iPS细胞。
方法1：
在与饲养细胞（例如MEF）共培养的人iPS细胞的培养皿（第3～5天）中添加0.25%胰蛋白酶/DMEM-F12（例如1ml/60mm皿），在37℃下恒温处理2～3分钟，用DMEM-F12洗涤培养皿以除去饲养细胞。加入培养液，使全部细胞物理剥离而得到的细胞悬液通过100μm的BDFalcon细胞过滤网（BD Falcon#352460），然后洗涤过滤网，从而仅对人iPS细胞的集落进行分离、回收。
方法2：
在与饲养细胞（例如MEF）共培养的人iPS细胞的培养皿（第3～5天）中添加细胞剥离液（例如，ES/iPS细胞用剥离液（リプロセルRCHETP002、1mg/ml分散酶/DMEM-F12、10mg/ml胶原酶IV/DMEM-F12等）（例如1ml/60mm皿），在37℃下恒温处理5分钟，剥离人iPS细胞和MEF。将细胞转移至15ml离心管中，加入约10ml培养液使细胞悬浮，然后将管静置5分钟而仅使集落沉降。除去上清，将同样的操作重复2次以上，从而仅使人iPS细胞的集落沉降，并将其回收。
（2）将人iPS细胞转移至包被有来源于人的改造层粘连蛋白的培养基质
将回收的人iPS细胞的集落分散为单个细胞。分散为单个细胞的方法没有特别限定，例如可以列举：进行胰蛋白酶処理的方法、通过使用P-1000ピペットマン等将培养液吹洗数次而将集落打散的方法等。分散为单个细胞后，悬浮于适当的培养液（例如TeSR2等）中，并接种至包被（例如1.0μg/cm2）有来源于人的改造层粘连蛋白的培养皿上。在适合于所使用的培养液的CO2浓度条件下进行培养，并每天更换培养液。
（3）传代培养
以扩增区域的不足或集落内死细胞的出现变得显著为大致标准而进行传代操作。本发明的培养方法中，可以通过与现有的方法同样地在使人iPS细胞维持适度大小的集落形态的状态下进行接种的方法来进行传代培养，也可以通过使人iPS细胞分散为单个细胞后进行接种的方法来进行传代培养。在此，分散为单个细胞的状态并不需要细胞悬液中的全部细胞均分散为单个细胞，下述状态也包括在分散为单个细胞的状态中：除了分散为单个细胞的细胞以外，细胞悬液中还包含约几个～约十几个粘附状态的细胞。
分散为单个细胞的情况下：
在培养有人iPS细胞的培养皿中添加TrypLE Select（商品名，Invitrogen#12563011）（例如1ml/100mm皿），在37℃下恒温处理5分钟。使用例如P-1000ピペットマン等将培养液吹洗数次，由此将人iPS细胞的集落打散，使其分散为单个细胞。加入培养液使细胞悬浮，并回收至离心管中。重复两次离心（1000×g、3分钟）和使用该培养液进行的洗涤操作，然后将细胞悬浮于新鲜的培养液中，并以例如约40000细胞/cm2的接种密度将分散为单个细胞的人iPS细胞接种到包被（例如1.0μg/cm2）有来源于人的改造层粘连蛋白的培养皿中。在适合于所使用的培养液的CO2浓度条件下进行培养，并每天更换培养液。
未分散为单个细胞的情况下：
在未将人iPS细胞分散为单个细胞的情况下，细胞的剥离时使用胶原酶IV、分散酶、Accutase等酶。在培养有人iPS细胞的本发明的培养基质中添加10mg/ml胶原酶/DMEM-F12、或2mg/ml分散酶/DMEM-F12、或Accutase（Millipore#SCR005）（例如1ml/60mm皿），在37℃下恒温处理5分钟。除去酶液后加入培养液，使用例如P-1000ピペットマン等将培养液吹洗数次，从而将人iPS细胞细微打散至维持约50个～约100个集落状的程度。将细胞悬液回收至离心管中，重复两次离心（200×g、3分钟）和使用该培养液进行的洗涤操作，然后将细胞悬浮于新鲜的培养液中，并将二分之一～四分之一的稀释量接种到包被（例如1.5μg/cm2）有来源于人的改造层粘连蛋白的培养皿中。培养在适合于所使用的培养液的CO2浓度条件下进行，并每天更换培养液。
〔iPS细胞的建立方法〕
本发明提供在上述本发明的改造层粘连蛋白存在下建立iPS细胞的方法。本发明的iPS细胞建立方法只要包括在上述本发明的改造层粘连蛋白的存在下使核重编程物质与体细胞接触的步骤即可。优选还包括在本发明的改造层粘连蛋白的存在下培养已与核重编程物质接触后的体细胞的步骤。
针对iPS细胞的建立方法，公知例如可以根据以下（vi）～（xiii）中记载的步骤建立。
（vi）Takahashi,K.and Yamanaka,S.,Cell,126:663-676（2006）
（vii）Okita,K.et al.,Nature,448:313-317（2007）
（viii）Wernig,M.et al.,Nature,448:318-324（2007）
（ix）Maherali,N.et al.,Cell Stem Cell,1:55-70（2007）
（x）Nakagawa,M.et al.,Nat.Biotethnol.,26:101-106（2008）
（xi）Takahashi,K.et al.,Cell,131:861-872（2007）
（xii）Yu,J.et al.,Science,318:1917-1920（2007）
（xiii）Maekawa,M.et al.,Nature,474:225-229（2011）
由此可见，通过向体细胞中导入特定因子，能够制造在人及小鼠中在分化多能性上不逊于ES细胞的iPS细胞。针对该特定因子，在本发明中定义为“核重编程物质”，并且只要是通过导入到体细胞中或者通过使其与iPS细胞的建立效率改善因子一起接触体细胞而能够从该体细胞诱导iPS细胞的物质（组），则可以由蛋白性因子或编码其的核酸（包括整合到载体中的形态）、或者低分子化合物等的任意物质构成。
在核重编程物质是蛋白性因子或编码其的核酸时，优选地示例出以下组合（以下，仅记载蛋白性因子的名称）。
（1）Oct3/4、Klf4、c-Myc
（2）Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2（其中，Sox2可以被Sox1、Sox3、Sox15、Sox17或Sox18置换。另外，Klf4可以被Klf1、Klf2或Klf5置换。而且，c-Myc可以被T85A（活性型突变体）、L-Myc置换。）
（3）Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Fbx15、Nanog,ERas、TcelI
（4）Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、SV40Large T antigen（以下，SV40LT）
（5）Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、HPV16E6
（6）Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、HPV16E7
（7）Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、HPV6E6、HPV16E7
（8）Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、Bmil
（以上，参照WO2007/069666（其中，在上述（2）的组合中，对于从Sox2向Sox18的置换、从Klf4向Klf1或Klf5的置换，参照Nature Biotechnology,26,101-106（2008））。对于“Oct3/4,Klf4,c-Myc,Sox2”的组合，参照Cell,126,663-676（2006）、Cell,131,861-872（2007）等。对于“Oct3/4,Klf4（或Klf5）,c-Myc,Sox2”的组合，也参照Nat.Cell Biol.,11,197-203（2009）。对于“Oct3/4,Klf4,c-Myc,Sox2,hTERT,SV40LT”的组合，也参照Nature,451,141-146（2008）。）
（9）Oct3/4、Klf4、Sox2（参照Nature Biotechnology,26,101-106（2008））
（10）Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28（参照Science,318,1917-1920（2007））
（11）Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28、hTERT、SV40LT（参照Stem Cells,26,1998-2005（2008））
（12）Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Nanog、Lin28（参照Cell Research（2008）600-603）
（13）Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、SV40LT（参照Stem Cells,26,1998-2005（2008））
（14）Oct3/4、Klf4（参照Nature454:646-650（2008）、Cell StemCell,2:525-528（2008）））
（15）Oct3/4、c-Myc（参照Nature454:646-650（2008））
（16）Oct3/4、Sox2（参照Nature,451,141-146（2008）、WO2008/118820）
（17）Oct3/4、Sox2、Nanog（参照WO2008/118820）
（18）Oct3/4、Sox2、Lin28（参照WO2008/118820）
（19）Oct3/4、Sox2、c-Myc、Esrrb（其中，Esrrb可以被Esrrg置换。参照Nat.CellBiol.,11,197-203（2009））
（20）Oct3/4、Sox2、Esrrb（参照Nat.Cell Biol.,11,197-203（2009））
（21）Oct3/4、Klf4、L-Myc（参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,107,14152-14157（2010））
（22）Oct3/4、Nanog
（23）Oct3/4（Cell136:411-419（2009）、Nature,08436,doi:10.1038publishedonline（2009）
（24）Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Nanog、Lin28、SV40LT（参照Science,324:797-801（2009））
（25）Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc、Glis1（参照Nature,474:225-229（2011）,WO2010/098419,WO2011/102531）
（26）Oct3/4、Klf4、Sox2、Glis1（参照Nature,474:225-229（2011）,WO2010/098419,WO2011/102531）
在上述（1）～（26）中，可以使用其他Oct家族成员例如Oct1A、Oct6等来代替Oct3/4。另外，可以使用其他的Sox家族成员例如Sox7等来代替Sox2（或Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18）。另外，可以使用其他Glis家族成员Glis2、Glis3等来代替Glis1。而且，在上述（1）～（26）中，在含有c-Myc或Lin28作为核重编程物质时，可以分别使用L-Myc或Lin28B来代替c-Myc或Lin28。
另外，虽然与上述（1）～（26）不符，但将这些中任意一个中的构成要素全部包含在内，且还含有任意其他物质的组合也能包含在本发明的“核重编程物质”的范畴中。另外，在作为核重编程的对象的体细胞以用于核重编程的充分的水平内源性表达上述（1）～（26）中任意一个的构成要素的一部分的条件下，除去该构成要素而仅含有剩下的构成要素的组合也包含在本发明的“核重编程物质”的范畴内。
在这些组合中，作为优选的核重编程物质的例子，可以列举：从Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin28以及Glis1中选择的至少1个，优选2个以上，更优选3个以上。
上述各蛋白性因子的小鼠以及人cDNA序列信息可以通过参照WO2007/069666中记载的NCBI accession numbers来获得（Nanog在该公报中以“ECAT4”的名称记载。另外，Lin28、Lin28B、Esrrb、Esrrg、L-Myc、Glis1的小鼠以及人cDNA序列信息分别可以参照表6中记载的NCBI accession numbers来获得。），本领域技术人员能够容易地分离这些cDNA。
表6
| 基因名 | 小鼠 | 人 |
| Lin28 | NM_145833 | NM_024674 |
| Lin28b | NM_001031772 | NM_001004317 |
| Esrrb | NM_011934 | NM_004452 |
| Esrrg | NM_011935 | NM_001438 |
| L-Myc | NM_008506 | NM_001033081 |
| Glis1 | NM_147221 | NM_147193 |
这些能够诱导iPS细胞的核重编程物质向体细胞的导入，在该物质为蛋白性因子的情况下，可以通过使用自身公知的向细胞导入蛋白质的方法来实施。作为这样的方法，例如可以列举：使用蛋白质导入试剂的方法、使用蛋白质导入结构域或细胞透过性肽融合蛋白的方法、显微注射法等。此外，也可以使用电穿孔法、半完整细胞法(Kano，F.eta1.Methods in Molecular Biology，Vol.322，357-365(2006))、基于Wr-t肽的导入法(Kondo，E.et a1.，Mol.Cancer Ther.3(12)，1623-1630(2004))等蛋白质导入法。如果注重iPS细胞的建立效率，则优选不是蛋白性因子自身而是以编码其的核酸的形态使用核重编程物质。该核酸可以是DNA，也可以是RNA，或者可以是DNA／RNA嵌合体。另外，该核酸可以使双链，也可以是单链。优选该核酸是双链DNA，特别优选是cDNA。核重编程物质的cDNA被插入到含有能在作为宿主的体细胞中发挥作用的启动子的适当的表达载体中。作为表达载体，例如可以使用：逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、仙台病毒等病毒载体、动物细胞表达质粒(例如pA-11、pxT1、pRc／CMV、pRc／RSV、pcDNAI／Neo)等。使用的载体的种类可以根据得到的iPS细胞的用途而适当选择。例如可以使用腺病毒载体、质粒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体等。作为核重编程物质的核酸(重编程基因)可以分别整合到各表达载体上，也可以在1个表达载体上整合到2种以上优选2～3种基因。在使用基因导入效率高的逆转录病毒、慢病毒载体时，优选前者，在使用质粒、腺病毒、附加体载体等时，优选后者。而且，可以并用整合了2种以上基因的表达载体和仅整合了1基因的表达载体。
〔干细胞的快速扩增方法〕
本发明提供干细胞的快速扩增方法。本发明的快速扩增方法，只要是包括：使干细胞分散为单个细胞的步骤，和在上述本发明的改造层粘连蛋白的存在下对分散为单个细胞的干细胞进行培养的步骤；并且以约2×104细胞/cm2～约20×104细胞/cm2的密度对分散为单个细胞的干细胞进行接种的方法即可。接种密度更优选约3×104细胞/cm2～约10×104细胞/cm2，进一步优选约4×104细胞/cm2～约5×104细胞/cm2。现有的培养体系中，以上述细胞密度接种分散成单个的干细胞时粘附效率非常低，而通过本发明的快速扩增方法，能够得到显著高的粘附效率，并且在之后旺盛地增殖，因此，与现有的方法相比，能够以非常快的速度使干细胞增殖。
在使干细胞分散为单个细胞的步骤中，与上述的“分散为单个细胞的情况下”同样，通过使用例如胰蛋白酶处理、P-1000ピペットマン等对培养液进行数次吹洗而将从培养皿中剥离、回收的干细胞的集落分散为单个细胞。接着，使用公知的细胞计数方法对细胞数进行计数，并适当地调节细胞悬液的细胞浓度以达到上述接种密度。关于培养方法，可以按照上述本发明的培养方法中的记载来进行。
本发明的干细胞的快速扩增方法优选应用于ES细胞、iPS细胞等多能干细胞，更优选应用于ES细胞。另外，优选应用于人多能干细胞，更优选应用于人ES细胞。在将本发明的干细胞的快速扩增方法应用于人干细胞时，优选使用来源于人的改造层粘连蛋白。
〔来源于干细胞的单个细胞的克隆分离方法〕
本发明提供来源于干细胞的单个细胞的克隆分离方法。本发明的来源于单个细胞的克隆分离方法只要包括：使干细胞分散为单个细胞的步骤，和在上述本发明的改造层粘连蛋白的存在下对分散为单个细胞的干细胞进行培养的步骤；并且形成来源于单个细胞的集落的方法即可。通过本发明的来源于单个细胞的克隆分离方法，能够进行在现有的培养体系中难以进行的来源于单个细胞的干细胞克隆的形成和分离，并且能够容易地获取均一的干细胞。
形成来源于单个细胞的集落并分离来源于单个细胞的克隆的方法，没有特别限定。可以适当地使用例如公知的有限稀释法等。根据所使用的方法来选择适当的细胞密度以及所使用的本发明的培养基质，对分散为单个细胞的干细胞进行接种，并进行培养即可。关于培养方法，可以按照上述本发明的培养方法中的记载来进行。
本发明的来源于干细胞的单个细胞的克隆分离方法优选应用于ES细胞、iPS细胞等多能干细胞，更优选应用于ES细胞。另外，优选应用于人多能干细胞，更优选应用于人ES细胞。当将本发明的来源于干细胞的单个细胞的克隆分离方法应用于人干细胞时，优选使用来源于人的改造层粘连蛋白。
〔干细胞的单个细胞培养方法〕
本发明提供干细胞的单个细胞培养方法。本发明的单个细胞培养方法，只要是包括：使干细胞分散为单个细胞的步骤，和在上述本发明的改造层粘连蛋白的存在下对分散为单个细胞的干细胞进行培养的步骤；并且在不使细胞增殖的情况下以单个细胞的状态进行维持的方法即可。对于形成了集落的干细胞而言，有时集落周缘部与集落内部的细胞的状态不同，通过本发明的单个细胞培养方法，细胞不形成集落，因此能够得到状态均一的干细胞，能够期待分化诱导效率的提高。
作为在不使细胞增殖的情况下以单个细胞的状态进行维持的方法，优选：根据所使用的培养基质选择适当的细胞密度来对分散为单个细胞的干细胞进行接种，并在细胞增殖前将细胞用于其他用途。另外，例如，可以通过使用不含增殖因子的培养液或增殖因子量减少的培养液来延长能够以单个细胞的状态进行维持的时间。
本发明的干细胞的单个细胞培养方法优选应用于ES细胞、iPS细胞等多能干细胞，更优选应用于ES细胞。另外，优选应用于人多能干细胞，更优选应用于人ES细胞。在将本发明的干细胞的单个细胞培养方法应用于人干细胞时，优选使用来源于人的改造层粘连蛋白。
〔培养基质〕
本发明提供包被有上述本发明的改造层粘连蛋白的培养基质。使用本发明的培养基质进行培养的细胞没有特别限制，只要是可培养的哺乳动物细胞，无论怎样的细胞都可以使用本发明的培养基质进行培养。优选的是干细胞。干细胞中包含成体干细胞、多能干细胞等。作为成体干细胞，可以列举神经干细胞、间充质干细胞、造血干细胞等。作为多能干细胞，可以列举：ES细胞（胚胎干细胞）、iPS细胞（诱导性多能干细胞）、mGS细胞（多能生殖干细胞）、ES细胞和体细胞的融合细胞等。更优选的是多能干细胞，进一步优选的是ES细胞、iPS细胞。作为哺乳动物，可以列举：人、小鼠、大鼠、牛、猪等。其中，优选人。本发明的培养基质在以不使用饲养细胞方式培养现有技术的使用饲养细胞来培养的细胞时非常有用。
制造本发明的培养基质的方法没有特别限制，只要是能够在公知的培养器皿中包被本发明的改造层粘连蛋白的方法，则任何方法均可。例如，在适当的溶剂例如PBS、生理盐水、三羟甲基氨基甲烷或4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸中以中性pH的生理盐水稀释，将该溶液添加到适当的培养器皿中，在约4℃～约37℃下静置约1～12小时，由此能够将改造层粘连蛋白包被到培养器皿表面来制造本发明的培养基质。作为培养器皿，只要能够用于哺乳动物细胞的培养，则没有特别限定，例如可以列举：玻璃制或塑料制的培养皿、烧瓶、微孔板、培养玻片、微载体、聚偏氟乙烯膜等聚合物膜等。
改造层粘连蛋白的包被浓度没有特别限定，但优选约0.03～约25μg/cm2，更优选约0.06～约10μg/cm2，进一步优选约0.38～约3.8μg/cm2。本发明的培养基质使用了改造层粘连蛋白，因此与以往使用的包被Matrigel的情况相比，能够以低的包被浓度使多个人干细胞粘附、增殖。
本发明的培养基质可以包被有一种改造层粘连蛋白，也可以包被有多种不同的改造层粘连蛋白。另外，也可以包被有改造层粘连蛋白以外的成分。例如可以列举：血清成分、细胞外基质分子、生长因子、分化诱导因子、形态发生因子（成形素）等。另外，也可以包被合成高分子凝胶（合成聚合物）等非生物成分。
本发明的培养基质优选包被有来源于人的改造层粘连蛋白。如果是包被有来源于人的改造层粘连蛋白的培养基质，则上述改造层粘连蛋白以外的成分优选是来源于人的成分。在不使用通常用在人干细胞的培养中的饲养细胞的培养环境（无饲养细胞）下，包被有来源于人的改造层粘连蛋白的本发明的培养基质能够在保持多能性的状态下维持并培养人干细胞。通常，为了维持克隆增殖和未分化性，人干细胞的培养使用在通过X射线照射或丝裂霉素C处理而使增殖停止的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等饲养细胞上对干细胞进行共培养的培养体系，而不使用这种饲养细胞的培养体系则为无饲养细胞培养体系。另外，如果使用排除了异种来源成分的培养基，则能够在完全不含异种来源成分的培养条件（无异源成分，Xeno-free）下培养人干细胞，从而能够提供对人表达免疫原性的可能性非常低、安全性高的人多能干细胞。作为无异源成分的培养基，例如可以列举：TeSR2（商品名、STEMCELLTECHNOLOGIES）等。
实施例
以下，根据实施例，对本发明进行详细说明，但本发明不限于此。
〔实施例1：改造人层粘连蛋白的制备〕
（1）Plus＃1层粘连蛋白E8用表达载体的制备
Plus＃1层粘连蛋白E8（使重组人层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段和人层粘连蛋白α1链的第4-5球形结构域融合后得到的改造人层粘连蛋白），通过制备重组人层粘连蛋白511E8（以下记为“rhLM511E8”）之后，在人层粘连蛋白α5链的E8的C末端部附加人层粘连蛋白α1链的第4-5球形结构域（以下记为“人层粘连蛋白α1链LG45”）来制备。
（1-1）人层粘连蛋白α5链、β1链、γ1链的各E8片段表达载体的制备
rhLM511E8根据Ido等人（Hiroyuki Ido,Aya Nakamura,Reiko Kobayashi,Shunsuke Ito,Shaoliang Li,Sugiko Futaki,and Kiyotoshi Sekiguchi,“Therequirement of the glutamic acid residue at the third position from thecarboxyl termini of the lamininγchains in integrin binding by laminins”,TheJournal of Biological Chemistry,282,11144-11154,2007）记载的方法如下制备。
首先，以克隆用质粒pBluescript KS（＋）（Stratagene）为模板，使用以下三种引物组进行PCR，分别制备在质粒的多克隆位点内的EcoRV的5’侧插入有编码6×His标签（HHHHHH）的DNA序列、编码HA（血凝素）标签（YPYDVPDYA）的DNA序列、或编码FLAG标签（DYKDDDDK）的DNA的三种pBluescript KS（+）。
（i）用于引入6×His标签的引物
5’-ATGATGATGAAGCTTATCGATACCGT-3’（正向、序列号1）
5’-CATCATCATGATATCGAATTCCTGCA-3’（反向、序列号2）
（ii）用于引入HA标签的引物
5’-ATCATATGGATAAAGCTTATCGATACCGT-3’（正向、序列号3）
5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’（反向、序列号4）
（iii）用于引入FLAG标签的引物
5’-ATCCTTGTAATCAAGCTTATCGATACCGT-3’（正向、序列号5）
5’-GATGATGATAAGGATATCGAATTCCT-3’（反向、序列号6）
然后，以含有α5链、β1链、γ1链的全长碱基序列的质粒（HiroyukiIdo,KenjiHarada,Sugiko Futaki,Yoshitaka Hayashi,Ryoko Nishiuchi,Yuko Natsuka,ShaoliangLi,Yoshinao Wada,Ariana C.Comb,James M.Ervasti,and Kiyotoshi Sekiguchi,“Molecular Dissection of theα-Dystroglycan-and Integrin-binding Sites withinthe Globular Domain ofHuman Laminin-10”,The Journal of Biological Chemistry,279,10946-10954,2004）为模板，使用以下引物进行PCR，对各链的相当于α5（Ala2534-Ala3327）、β1（Leu1561-Leu1786）、γ1（Asn1362-Pro1609）的区域进行扩增。
（iv）用于扩增α5链E8片段的引物
5’-GCTGCCGAGGATGCTGCTGGCCAGG-3’（正向、序列号7）
5’-CTAGGCAG GATGCCGGGCGGGCTGA-3’（反向、序列号8）
（v）用于扩增β1链E8片段的引物
5’-CTTCAGCATAGTGCTGCTGACATTG-3’（正向、序列号9）
5’-TTACAAGCATGTGCTATACACAGCAAC-3’（反向、序列号10）
（vi）用于扩增γ1链E8片段的引物
5’-AATGACATTCTCAACAACCTGAAAG-3’（正向、序列号11）
5’-CTAGGGCTTTTCAATGGACGGGGTG-3’（反向、序列号12）
将扩增出的DNA片段插入到附加有标签序列的pBluescript KS（+）的多克隆位点的EcoRV位点，然后用限制性内切酶EcoRI和HindIII将包含5’侧的编码标签的序列在内的扩增后的DNA切出，并将其插入到哺乳细胞用表达载体pSecTag2B（Invitrogen、内源性具有编码小鼠Ig-κ链V-J2-C信号肽的DNA序列。）的相应位点，从而分别制备人α5链E8片段（N末端侧包含6×His标签）、人β1链E8片段（N末端侧包含HA标签）、人γ1链E8片段（N末端侧包含FLAG标签）的表达载体。
（1-2）人层粘连蛋白α1链LG45融合人层粘连蛋白α5链E8片段表达载体的制备
为了获得从5’侧开始依次编码小鼠Ig-κ链V-J2-C信号肽-6×His标签-人层粘连蛋白α5链E8-人层粘连蛋白α1链LG45的DNA片段，分别获取编码人层粘连蛋白α5链E8的DNA片段和编码人层粘连蛋白α1链LG45的DNA片段，并通过延伸PCR将这2种DNA片段连接、扩增。用限制性内切酶AscI对扩增产物进行消化，并插入到人层粘连蛋白α5链E8表达载体的AscI-PmeI位点，以制备人层粘连蛋白α1链LG45融合人层粘连蛋白α5链E8片段表达载体。
首先，以人层粘连蛋白α5链E8片段表达载体为模板，使用以下的引物进行PCR，对α5链E8片段的3’侧754碱基对进行扩增。另外，在序列号14的引物的5’侧附加在延伸PCR中使用的序列。
（vii）用于扩增人层粘连蛋白α5链部分片段的引物
5’-CAATGATCTGGAGCTGGCCGACGCCTACTACCTG-3’（正向、序列号13）
5’-CTCTGCATCAGGCCCCAGGCCCGGGGTC-3’（反向、序列号14）
然后，以含有人层粘连蛋白α1链的全长碱基序列的质粒（Hiroyuki Ido,KenjiHarada,Yoshiko Yagi,and Kiyotoshi Sekiguchi,“Probing the integrin-bindingsite within the globular domain of laminin-511with the function-blockingmonoclonal antibody4C7.”,Matrix Biology,25（2）,112-117,2006）为模板，使用以下的引物进行PCR，对与人层粘连蛋白α1链LG45位点（Asp2684-Ser3075）相当的区域进行扩增。另外，在序列号15的引物的5’侧附加在延伸PCR中使用的序列。
（viii）用于扩增人层粘连蛋白α1链LG45位点的引物
5’-CCTGGGGCCTGATGCAGAGGACAGCAA-3’（正向、序列号15）
5’-AAACTCAGGACTCGGTCCCAGGACAGGAATGAAGG-3’（反向、序列号16）
将得到的2种DNA片段用以下的引物进行延伸PCR，以使其连接、扩增，得到编码人层粘连蛋白α5链E8的C末端部和人层粘连蛋白α1链LG45位点的DNA片段。用限制性内切酶AscI对扩增后的DNA进行消化，并插入到人层粘连蛋白α5链E8表达载体的AscI-PmeI位点，以制备人层粘连蛋白α1链LG45融合人层粘连蛋白α5链E8片段表达载体。
（ix）用于扩增人层粘连蛋白α5链E8的C末端部和人层粘连蛋白α1链LG45位点的引物
5’-CAATGATCTGGAGCTGGCCGACGCCTACTACCTG-3’（正向、序列号13）
5’-AAACTCAGGACTCGGTCCCAGGACAGGAATGAAGG-3’（反向、序列号16）
（2）Plus＃2层粘连蛋白E8用表达载体的制备
Plus＃2层粘连蛋白E8（使rhLM511E8和人纤连蛋白III型组件的第7～10个融合后得到的改造人层粘连蛋白），是通过在制备rhLM511E8后在人层粘连蛋白γ1链的E8的N末端部附加人纤连蛋白的细胞粘附位点（人纤连蛋白III型组件的第7～10个、以下记作“FNIII7～10”）来制备。
（2-1）人层粘连蛋白α5链、β1链、γ1链的各E8片段表达载体的制备
用与上述（1-1）同样的方法分别制备人层粘连蛋白α5链E8片段（在N末端侧含有6×His标签）、β1链E8片段（在N末端侧含有HA标签）、γ1链E8片段（在N末端侧含有FLAG标签）的表达载体。
（2-2）FNIII7～10融合人层粘连蛋白γ1E8片段表达载体的制备
为了获取从5’侧依次编码小鼠Ig-κ链V-J2-C信号肽-FLAG标签-FNIII7～10-γ1链E8的DNA片段，分别获取编码小鼠Ig-κ链V-J2-C信号肽-FLAG标签的DNA片段、编码FNIII7～10的DNA片段以及编码γ1链E8片段的DNA片段，并通过延伸PCR对这3种DNA片段进行连接、扩增。用限制性内切酶NheI和NotI对扩增产物进行消化，并插入到哺乳细胞用表达载体pSecTag2B（Invitrogen、内源性具有编码小鼠Ig-κ链V-J2-C信号肽的基因序列。）的相应位点，以制备FNIII7-10融合人层粘连蛋白γ1E8片段表达载体的表达载体。
首先，以人层粘连蛋白γ1链E8片段表达载体作为模板，使用以下的引物进行PCR，分别对与小鼠Ig-κ链V-J2-C信号肽-FLAG标签以及γ1链E8片段相当的区域进行扩增。另外，在序列号18和19的引物的5’侧附加在延伸PCR中使用的序列。
（x）用于扩增信号肽序列-FLAG标签序列的引物
5’-GAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTA-3’（正向、序列号17）
5’-TGGTGGAGACAATGGATCCTTATCATCATCATCC-3’（反向、序列号18）
（xi）用于扩增γ1链E8片段序列的引物
5’-TAATTACCGAACAGATAATGACATTCTCAACAACC-3’（正向、序列号19）
5’-GAAAGGACAGTGGGAGTGGCACC-3’（反向、序列号20）
然后，以人纤连蛋白表达载体（Hiroki Akamatsu,Keiko Ichihara-Tanaka,Keiichi Ozono,Wataru Kamiike,Hikaru Matsuda,and Kiyotoshi Sekiguchi,“Suppression of Transformed Phenotypes of Human Fibrosarcoma Cells byOverexpression of Recombinant Fibronectin”,Cancer Research,56,4541-4546,1996）作为模板，使用以下的引物进行PCR，对与FNIII7～10相当的区域（Pro1173-Arg1539）进行扩增。另外，在序列号21和22的引物的5’侧附加在延伸PCR中使用的序列。
（xii）用于扩增FNIII7～10序列的引物
5’-GATGATGATAAGGATCCATTGTCTCCACCAACAA-3’（正向、序列号21）
5’-ATGTCATTATCTGTTCGGTAATTAATGGAAATTGG-3’（反向、序列号22）
使用以下的引物进行延伸PCR，使得到的3种DNA片段连接、扩增，得到编码小鼠Ig-κ链V-J2-C信号肽-FLAG标签-FNIII7～10-γ1链E8的DNA片段。用限制性内切酶NheI和NotI对扩增出的DNA进行消化，插入到哺乳细胞用表达载体pSecTag2B（Invitrogen）的相应位点，制备FNIII7～10融合人层粘连蛋白γ1E8片段的表达载体。
（xiii）用于扩增FNIII7～10融合人层粘连蛋白γ1E8片段的引物
5’-GAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTA-3’（正向、序列号17）
5’-GAAAGGACAGTGGGAGTGGCACC-3’（反向、序列号20）
（3）Plus＃1层粘连蛋白E8以及Plus＃2层粘连蛋白E8的表达以及纯化
Plus＃1层粘连蛋白E8和Plus＃2层粘连蛋白E8的表达通过将制备的各链的表达载体导入FreeStyle293-F细胞（商品名、Invitrogen、以下记作“293-F细胞”）来进行。也就是说，如果是Plus＃1层粘连蛋白E8，则将人层粘连蛋白α1链LG45融合人层粘连蛋白α5链E8片段表达载体、人β1链E8片段表达载体以及人γ1链E8片段表达载体导入293-F细胞，如果是Plus＃2层粘连蛋白E8，则将人α5链E8片段表达载体、人β1链E8片段表达载体以及FNIII7～10融合人层粘连蛋白γ1E8片段表达载体导入293-F细胞。使用转染试剂293fectin（商品名、Invitrogen）以及Opti-MEM（商品名、Invitrogen），将各链的表达载体各150μg同时对300ml的293-F细胞（1.0×106个/ml）进行转染，并进行72小时培养后，回收培养液。以1000×g对培养液进行10分钟离心，再以15000×g对其上清进行30分钟离心，除去细胞和不溶物。在培养上清中添加10ml的Ni-NTA琼脂糖（QIAGEN），孵育一夜，吸附目标蛋白。回收Ni-NTA琼脂糖，并用TBS（-）（不含Ca、Mg的Tris缓冲生理盐水）以及10mM咪唑/TBS（-）进行洗涤，然后用200mM咪唑/TBS（-）进行洗脱。通过A280的吸光度确认洗脱组分中的蛋白质的量，向洗脱出目标蛋白的组分中添加3ml的ANTI-FLAGM2affinity Gel（SIGMA），在4℃下旋转一夜。将凝胶转移至Poly-Prep柱（Bio-Rad、#731-1550B04），在用TBS（-）洗涤后，用含有100μg/mlFLAG peptide（Sigma、#F3290）的TBS（-）进行洗脱。通过银染来确认洗脱组分，将洗脱出的组分合并，对PBS（-）（磷酸缓冲生理盐水）进行透析。将透析后的纯化物通过0.22μm的disc syringe filter（Millipore、＃SLGV033RS）来进行灭菌，并保存在-80℃下。
（4）Plus＃1层粘连蛋白E8以及Plus＃2层粘连蛋白E8的SDS-PAGE分析
利用SDS-PAGE法将纯化后的Plus＃1层粘连蛋白E8和Plus＃2层粘连蛋白E8的电泳图与rhLM511E8进行比较。向具有5％～20％的浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶（ATTO、#2331830）的各1个孔中分别添加1.5μg的rhLM511E8、1.9μg的Plus＃1层粘连蛋白E8、1.9μg的Plus＃2层粘连蛋白E8，并以20mA进行75分钟电泳。电泳是根据Laemmli法使用由25mMTris、192mM甘氨酸、0.1％十二烷基硫酸钠组成的缓冲液在还原条件下进行。蛋白质的染色使用Quick-CBB（WAKO、#299-50101）。
（5）结果
将结果示于图1。对于Plus＃1层粘连蛋白E8，观察到3条带（从高分子侧开始为α5E8＋α1LG45、γ1E8、β1E8）。α5E8＋α1LG45的条带位置与α5E8相比移向高分子侧。该结果表明，在α5E8上附加有α1LG45。对于Plus＃2层粘连蛋白E8，观察到3条带（从高分子侧起是α5E8、γ1E8＋FNIII7～10、β1E8）。γ1E8＋FNIII7～10的带位置与γ1E8相比移向高分子侧。该结果表明，在γ1E8上附加有FNIII7～10。从以上结果可以确认得到了设计的Plus＃1层粘连蛋白E8以及Plus＃2层粘连蛋白E8。
〔实施例2：人iPS细胞对各种胞外基质的浓度依赖性粘附效率的比较〕
（1）人iPS细胞
人iPS细胞使用由独立行政法人医药基盘研究所生物资源库购入的细胞株（克隆名：tic（JCRB1331））。tic细胞根据独立行政法人医药基盘研究所生物资源库推荐的方法，在与小鼠饲养细胞的共培养下进行维持。向共培养皿中添加1U/ml分散酶/DMEM-F12，并用刮刀刮下并收集tic细胞的集落。使包含该tic细胞集落和小鼠饲养细胞的溶液通过100μm的BD Falcon细胞过滤网，并对过滤网进行洗涤，分离tic细胞集落。用作为无异源成分培养基的TeSR2（商品名、STEMCELLTECHNOLOGIES）回收残留的集落，用P-1000ピペットマン将其微细打散后，重悬于TeSR2中，并接种到包被有Matrigel的培养器皿中。在37℃、5％CO2的条件下每天进行培养液更换，进行扩增培养至4-5天为止。这样扩增培养后的细胞被供于实验。
（2）胞外基质
作为胞外基质，使用Plus＃1层粘连蛋白E8、Plus＃2层粘连蛋白E8以及BDMatrigel人ES细胞用（商品名、BD Bioscience#354277、以下记作“Matrigel”）。用磷酸缓冲生理盐水（Invitrogen、#10010-023）稀释Plus＃1层粘连蛋白E8溶液、Plus＃2层粘连蛋白E8溶液、Matrigel溶液后，添加到BD FALCON MICROTEST96孔板（商品名、BDBiosciences、#353072）中，在4℃下静置一夜，以进行包被。需要说明的是，以使Matrigel溶液为0.1～30μg/cm2、使Plus＃1层粘连蛋白E8溶液以及Plus＃2层粘连蛋白E8溶液为0.0038～3.8μg/cm2的范围的方式向板中进行添加。
（3）粘附细胞的测定
从使用TeSR2培养的人iPS细胞（tic）中除去培养基后，加入含有4.8mM EDTA的磷酸缓冲生理盐水，在37℃下进行3分钟恒温处理。然后，加入TrypLE Select（商品名、Invitrogen、#12563-011），在37℃下进行3分钟恒温处理，使细胞分散成单个细胞。对细胞进行计数后，以2.7×104个细胞/孔（8.2×104个细胞/cm2）的密度将细胞接种到板上。在细胞接种起6小时后，除去上清，用DMEM-F12对孔洗涤一次，加入含有10％中性福尔马林的磷酸缓冲生理盐水，对细胞进行10分钟的固定。细胞的染色中使用Diff-Quik（注册商标、sysmex株式会社、#16920）。风干后，加入1％SDS，将细胞裂解，使用多功能酶标仪测定波长595nm下的吸光度。
（4）结果
将结果示于图2。即使低浓度（0.13μg/cm2）地包被Plus＃1层粘连蛋白E8和Plus＃2层粘连蛋白E8，也显示出显著高的粘附细胞数。另一方面，以10μg/cm2包被通用的Matrigel，粘附细胞数达到最大值。但是，该最大值低于Plus＃1层粘连蛋白E8以及Plus＃2层粘连蛋白E8的最大值。由该结果可知，Plus＃1层粘连蛋白E8以及Plus＃2层粘连蛋白E8以Matrigel的约1/80的蛋白量显示出比Matrigel高的人iPS细胞的细胞粘附活性。此外，可以认为Plus＃1层粘连蛋白E8和Plus＃2层粘连蛋白E8的最适包被浓度为约0.13～3.8μg/cm2。
〔实施例3：包被有各种胞外基质的培养器皿中人iPS细胞的传代培养（I）〕
（1）人iPS细胞
人iPS细胞使用32R1（Masato Nakagawa,Nanako Takizawa,Megumi Narita,Tomoko Ichisaka,Shinya Yamanaka,“Promotion of direct reprogramming bytransformation-deficient Myc.”,Proceedings of the National Academy ofSciences,107（32）,14152-14157,2010）。32R1细胞在MSTO小鼠饲养细胞上维持（KazutoshiTakahashi,Koji Tanabe,Mari Ohnuki,Megumi Narita,Tomoko Ichisaka,KiichiroTomoda,Shinya Yamanaka,“Induction of pluripotent stem cells from adult humanfibroblasts by defined factors.”,Cell,131（5）,861-872,2007）。
（2）胞外基质
作为胞外基质，使用Plus＃1层粘连蛋白E8、Plus＃2层粘连蛋白E8以及Matrigel。在用磷酸缓冲生理盐水稀释Plus＃1层粘连蛋白E8溶液和Plus＃2层粘连蛋白E8溶液后，以0.5μg/cm2的浓度添加到6孔板中，在4℃下静置一夜或在37℃下静置1小时，以进行包被。在用DMEM/F12稀释Matrigel溶液后，以35μg/cm2的浓度添加到6孔板中，在室温下静置1小时，以进行包被。
（3）细胞的传代以及观察
用磷酸缓冲生理盐水洗涤在饲养细胞上培养的32R1细胞，加入细胞剥离剂（CTK溶液），在37℃下处理约2分钟，除去饲养细胞。然后，用细胞刮刀回收32R1细胞，并将32R1细胞接种到包被有胞外基质的孔中。每24小时更换培养基。在第5天观察细胞的状态，并拍摄照片（第1代（1st Passage））。在第7天及第14天对细胞进行传代，在第21天观察细胞的状态，并拍摄照片（第3代（3rd Passage））。
（4）结果
将人iPS细胞（32R1细胞）的观察结果示于图3。上部的第1代是表示在包被有各种胞外基质的培养器皿中开始培养后第5天的细胞状态的照片，中部以及下部的第3代是表示2次传代后（在包被有各种胞外基质的培养器皿中开始培养后第21天）的细胞状态的照片。对于第1代（第5天），在Matrigel包被层上几乎不残留细胞，与此相对，在Plus＃1层粘连蛋白E8包被层上以及在Plus＃2层粘连蛋白E8包被层上，人iPS细胞存活。对于第3代（第21天），能够观察到人iPS细胞的集落，表明能够在Plus＃1层粘连蛋白E8包被层上以及Plus＃2层粘连蛋白E8包被层上持续培养人iPS细胞。如果比较Plus＃1层粘连蛋白E8和Plus＃2层粘连蛋白E8，能够确认与Plus＃1层粘连蛋白E8包被层相比，Plus＃2层粘连蛋白E8包被层上细胞数更多。
〔实施例4：Plus＃2层粘连蛋白E8对重组人α5β1整合蛋白或α6β1整合蛋白的结合活性〕
（1）实验方法
测定Plus＃2层粘连蛋白E8、rhLM511E8或纤连蛋白和重组人α5β1整合蛋白或α6β1整合蛋白的结合活性。纤连蛋白使用根据Sekiguchi等人的方法（Kiyotoshi Sekiguchiand Sen-itiroh Hakomori,“Domain structure of human plasmafibronectin.Differences and similarities between human and hamsterfibronectins.”,The Journal of Biological Chemistry,258,3967-3973,1983）使用明胶固定亲和柱而纯化得到的物质。重组人α5β1整合蛋白通过使用Takagi等人制备的表达载体来制备（Junichi Takagi,Harold P.Erickson,and Timothy A.Springer,“C-terminalopening mimics'inside-out'activation of integrin alpha5beta1.”,Naturestructural&molecular biology,8（5）,412-416,2001）。该重组人α5β1整合蛋白由α5亚基和β1亚基的细胞外结构域构成。另外，为了使两亚基二聚体化，在α5的C末端部附加有主要由酸性氨基酸残基和疏水性氨基酸残基构成的序列，另外在β1的C末端部附加有主要由碱基性氨基酸残基和疏水性氨基酸残基构成的序列。而且，在α5的C末端部附加有FLAG标签，在β1的C末端部附加有6×His标签。重组人整合蛋白α6β1根据Ido等人的方法（HiroyukiIdo,Kenji Harada,Yoshiko Yagi,Kiyotoshi Sekiguchi,“Probing the integrin-binding site within the globular domain of laminin-511with the function-blocking monoclonal antibody4C7.”,Matrix Biology,25（2）,112-117,2006）来制备。分子结构与上述重组人α5β1整合蛋白相同。
用磷酸缓冲生理盐水（Invitrogen、#10010-023）稀释Plus＃2层粘连蛋白E8溶液、rhLM511E8溶液、纤连蛋白溶液后，添加到BDFALCON MICROTEST96孔板（商品名、BDBiosciences、#353072）中，在4℃下静置一夜，以进行包被。另外，考虑摩尔量，以0.4μg/cm2的浓度包被Plus＃2层粘连蛋白E8溶液，以0.32μg/cm2的浓度包被rhLM511E8溶液，以0.59μg/cm2的浓度包被纤连蛋白溶液。
用含有1％（重量/体积）的牛血清白蛋白和0.02％（体积/体积）的Tween-20的Tris缓冲生理盐水对孔进行封闭后，使10nM的重组人α5β1整合蛋白或α6β1整合蛋白在1mM的Mn2 ＋存在下、在室温下反应3小时。用含有1mM的Mn2＋和0.1％（重量/体积）的牛血清白蛋白和0.02％（体积/体积）的Tween-20的Tris缓冲生理盐水（以下，记作“1mMMn2＋/0.1％BSA/TBS-T0.02”）对孔洗涤3次后，使识别重组整合蛋白的二聚体位点的生物素化兔多克隆抗体在1mM的Mn2＋存在下、在室温下反应3小时。用1mM Mn2＋/0.1％BSA/TBS-T0.02对孔洗涤3次后，使经HRP标记后的链霉亲和素在1mM的Mn2＋存在下、在室温下反应15分钟。用1mM Mn2＋/0.1％BSA/TBS-T0.02对孔洗涤3次后，加入邻苯二胺/H2O2溶液，进行显色反应。使用2.5M H2SO4来停止反应。在显色强度的定量中，使用多功能酶标仪，测定波长490nm的吸光度。
（2）结果
将结果示于图4。Plus＃2层粘连蛋白E8示出与人纤连蛋白相同程度的对重组人α5β1整合蛋白的结合活性。另外，rhLM511E8未显示出对重组人α5β1整合蛋白的结合活性。另一方面，Plus＃2层粘连蛋白E8示出与rhLM511E8同等的对重组人α6β1整合蛋白的结合活性。另外，人纤连蛋白未显示出对人α6β1整合蛋白的结合活性。根据以上结果表明，Plus＃2层粘连蛋白E8是具有对α5β1整合蛋白和α6β1整合蛋白的结合活性的重组蛋白。
〔实施例5：在包被有各种胞外基质培养器皿中人ES细胞的单个分散培养〕
（1）人ES细胞
人ES细胞使用由National Stem Cell Bank购入的H9株。饲养细胞使用通过丝裂霉素C处理而停止细胞分裂的SNL细胞（McMahon,A.P.&Bradley,A.Cell62,1073-1085（1990）），进行H9细胞向饲养细胞上的重新播种。培养基使用灵长类ES细胞培养用培养基（ReproCELL），进行共培养。
（2）胞外基质
作为胞外基质，全长层粘连蛋白511根据Ido等人（Hiroyuki Ido,Kenji Harada,Sugiko Futaki,Yoshitaka Hayashi,Ry oko Nishiuchi,Yuko Natsuka,Shaoliang Li,Yoshinao Wada,Ariana C.Combs,James M.Ervasti,and Kiyotoshi Sekiguchi,“Molecular dissection of the α-dystroglycan-and integrin-binding sites withinthe globular domain of human laminin-10”Jhe Journal of Biological Chemistry,279,10946-10954,2004.）记载的方法进行制备。
（3）人ES细胞的培养
H9细胞通过以下方法从与SNL饲养细胞的共培养体系回收。
（3-1）培养基的准备
在必要量的维持培养培养基（mTeSR1（StemCell Technologies公司）和NutriStem（cosmobio公司）的1：1混合溶液）中加入1/1000量的10mM Y-27632。
（3-2）板的包被
向6孔板加入1.5ml/well的PBS（-）、4.8μg/well的Plus＃1层粘连蛋白E8（包被量：0.5μg/cm2），使其在37℃、CO25％的培养箱中反应60分钟后，加入1ml/well维持培养培养基，在使培养基融合后，除去上清。同样地，准备包被有Plus＃2层粘连蛋白E8的微孔板。与全长层粘连蛋白511同样地进行包被（包被量：2.0μg/cm2）。在各包被板中加入1.5ml/well维持培养培养基（添加有Y-27632），并在培养箱中保管。另外，对于Matrigel溶液，在上述条件下以成为0.1～30μg/cm2的范围的方式添加到板中。
（3-3）饲养细胞的除去
除去培养基，用4ml PBS洗涤一次，然后，完全吸除PBS，加入0.5ml的CTK液，在37℃下进行孵育。大部分饲养细胞被剥落后，抽吸CTK液，用4ml的PBS洗涤1次，然后，以600μl/well逐个加入X0.5TrypLE Select（由Invitrogen公司购入），使其在37℃、CO25％的培养箱中反应1分钟、进而3分钟。然后，从培养箱中取出，用显微镜观察细胞的形态，确认细胞间粘附被破坏、细胞成为圆形的形态。除去之前加入的X0.5TrypLE Select，并在以3ml/well加入维持培养用培养基后，用细胞刮刀剥落细胞。
（3-4）细胞的培养
除去饲养细胞，将分散成单个的13000个H9细胞接种到上述预先制备的包被板（6-孔板），用37℃、CO25％的培养箱进行单个分散培养。次日，更换成维持培养用培养基。培养基更换每隔一天进行，并从开始培养后6、7日左右起，开始每天进行。
（4）结果
用包被有各种胞外基质的培养器皿进行H9细胞的单个分散培养，在进行了7天培养后，对增殖后的细胞集落进行碱性磷酸酶（ALP）染色，将其结果示于图5。图5中，左上起未包被（图中、None）、Matrigel包被（图中、Matrigel）、全长层粘连蛋白511包被（图中、LN511FL）、从左下起Plus＃1层粘连蛋白E8包被（图中、LN511E8plus＃1）、Plus＃2层粘连蛋白E8包被（图中、LN511E8plus＃2）。通过碱性磷酸酶染色，观察到在下部的Plus＃1层粘连蛋白E8包被以及Plus＃2层粘连蛋白E8包被的培养器皿中H9细胞增殖良好。另一方面，在上部未包被以及Matrigel包被的培养器皿中，几乎观察不到H9细胞。由以上结果可知，如果使用包被Plus＃1层粘连蛋白E8或Plus＃2层粘连蛋白E8的培养基质，则能够容易地提供基于单个分散的人ES细胞的培养方法。
〔实施例6：包被有各种胞外基质的培养器皿中人iPS细胞的传代培养（II）〕
（1）人iPS细胞
人iPS细胞使用对来源于成人皮肤的成纤维细胞（aHDF-Slc7al）利用逆转录病毒导入Oct3/4、KLF4、SOX2以及L-MYC这4个基因而建立的32R1细胞（Masato Nakagawa,NanakoTakizawa,Megumi Narita,Tomoko Ichisaka,Shinya Yamanaka,“Promotion of directreprogramming by transformation-deficient Myc.”,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,107（32）,14152-14157,2010）。
（2）胞外基质
使用Plus＃1层粘连蛋白E8、Plus＃2层粘连蛋白E8、Plus＃3层粘连蛋白E8（使rhLM511E8和人基底膜蛋白聚糖的结构域I～III融合后而得到的改造层粘连蛋白）、rhLM511E8以及Matrigel。Plus＃3层粘连蛋白E8是通过在制备rhLM511E8后向人层粘连蛋白β1链的E8的N末端部附加人基底膜蛋白聚糖的结构域I～III（以下，记作“Pln-D1/2/3”）如下地制备。
（2-1）人层粘连蛋白α5链、β1链、γ1链的各E8片段表达载体的制备
用于上述（1-1）同样的方法分别制备人层粘连蛋白α5链E8片段（在N末端侧含有6×His标签）、β1链E8片段（在N末端侧含有HA标签）、γ1链E8片段（在末端侧含有FLAG标签）的表达载体。
（2-2）Pln-D1/2/3融合人层粘连蛋白β1链E8片段表达载体的制备
为了获得从5’侧起依次编码小鼠Ig-κ链V-J2-C信号肽-Pln-D1/2/3-HA标签-β1链E8的DNA片段，获取编码Pln-D1/2/3的DNA片段并用限制性内切酶HindIII进行消化。将消化产物插入到人层粘连蛋白β1链E8片段表达载体的相应位点，制备Pln-D1/2/3融合人层粘连蛋白β1链E8片段表达载体。
首先，以人基底膜蛋白聚糖表达载体（Shaoliang Li,Chisei Shimono,NaokoNorioka,Itsuko Nakano,Tetsuo Okubo,Yoshiko Yagi,Maria Hayashi,Yuya Sato,Hitomi Fujisaki,Shunji Hattori,Nobuo Sugiura,Koji Kimata and KiyotoshiSekiguchi,“Activin A Binds to Perlecan through Its Pro-region That HasHeparin/Heparan Sulfate Binding Activity”,Journal of Biological Chemistry,285（47）,36645-36655,2010）为模板，使用以下的引物进行PCR，对与Pln-D1/2/3相当的区域（Gly25-Glu1680）进行扩增。另外，在引物的5’侧附加有限制性内切酶HindIII识别序列。将得到的DNA片段用限制性内切酶HindIII进行消化，并插入到人层粘连蛋白β1链E8片段表达载体的相应位点，制备Pln-D1/2/3融合人层粘连蛋白β1链E8片段表达载体。
（xiv）用于扩增Pln-D1/2/3序列的引物
5’-ACGAAGCTTGGGCTGAGGGCATACGATGGC-3’（正向、序列号23）
5’-ATAAAGCTTCTCGACCACCAGTGGGGCTTGG-3’（反向、序列号24）
（2-3）Plus＃3层粘连蛋白E8的表达以及纯化
用与实施例1的（3）相同的方法进行Plus＃3层粘连蛋白E8的表达及纯化。也就是说，除将人α5链E8片段表达载体、Pln-D1/2/3融合人层粘连蛋白β1链E8片段表达载体以及人γ1链E8片段表达载体导入到293-F细胞以外，与实施例1的（3）同样地进行。
（3）人iPS细胞的培养
根据以下方法，从与SNL饲养细胞的共培养体系中收取32R1细胞。
（3-1）培养基的准备
向必要量的维持培养培养基（mTeSR1（StemCell Technologies公司）和NutriStem（cosmobio公司）的1：1混合溶液）中加入1/1000量的10mM Y-27632。
（3-2）板的包被
向6孔板加入1.5ml/well的PBS（-），4.8μg/well的Plus＃1层粘连蛋白E8（包被量：0.5μg/cm2），使其在37℃、CO25％的培养箱中反应60分钟后，加入1ml/well的维持培养培养基，在使培养基融合后，除去上清。同样地，准备包被了Plus＃2以及＃3层粘连蛋白E8的微孔板（包被量均为0.5μg/cm2）。在各包被板中加入1.5ml/well维持培养培养基（加入有Y-27632），并在培养箱中保管。另外，对于Matrigel溶液，在上述条件下以成为0.1～30μg/cm2的范围的方式添加到板中。
（3-3）饲养细胞的除去
除去培养基，用4ml PBS洗涤一次，然后，完全吸除PBS，加入0.5ml的CTK液，在37℃下进行孵育。大部分饲养细胞被剥落后，抽吸CTK液，用4ml的PBS洗涤1次，然后，以600μl/well逐个加入X0.5TrypLE Select（由Invitrogen公司购入），使其融合，在37℃、CO25％的培养箱中使其反应1分钟、进而3分钟。然后，从培养箱取出，用显微镜观察细胞的形态，确认细胞间粘附被破坏、细胞成为圆形的形态。除去之前加入的X0.5TrypLE Select，并在以3ml/well加入维持培养用培养基后，用细胞刮刀剥落细胞。
（3-4）细胞的培养
除去饲养细胞，将分散成单个的13000个32R1细胞接种到上述预先制备的包被板（6-孔板），在37℃、CO25％的培养箱中进行单个分散培养。次日，更换成维持培养用培养基。培养基更换每隔1天进行，并在培养开始后，从6、7日开始每天进行。细胞的传代每7～9天进行。对培养开始第7天的传代前的细胞的状态拍摄照片（物镜4倍）。其后进行10代传代培养后，对Oct3/4、SSEA-4以及TRA-1-60进行免疫染色，对相位差图像以及荧光图像拍摄照片（各物镜10倍）。
（4）结果
将开始培养第7天的传代前的人iPS细胞的状态示于图6。图6中，从左上起Matrigel包被（图中、Matrigel（包被量：30μg/cm2））、rhLM511E8包被（图中、E8）、Plus＃1层粘连蛋白E8包被（图中、E8plus＃1）、从左下起Plus＃2层粘连蛋白E8包被（图中、E8plus＃2）、Plus＃3层粘连蛋白E8包被（图中、E8plus＃3）。确认了32R1细胞在包被有各种胞外基质的培养器皿中的存活。
将使用包被有Plus＃1层粘连蛋白E8或Plus＃2层粘连蛋白E8的培养器皿进行了10代传代培养后的人iPS细胞的免疫染色的结果示于图7。图7中，上两行是使用包被有Plus＃1层粘连蛋白E8（图中、LN511E8plus＃1）的培养器皿的结果，下两行是使用包被有Plus＃2层粘连蛋白E8（图中、LN511E8plus＃2）的培养器皿的结果。各自上部为相位差图像（PH），下部为免疫荧光图像（FL）。从图7可知，作为未分化的ES细胞以及iPS细胞的标记的Oct3/4、SSEA-4、TRA-1-60全部是阳性，因此，如果使用包被有Plus＃1层粘连蛋白E8或Plus＃2层粘连蛋白E8的培养基质，则即使在进行10代传代培养后，也维持未分化状态。
〔实施例7：包被有各种胞外基质的培养器皿中人iPS细胞的单个分散培养〕
（1）人iPS细胞
与实施例3、6同样使用32R1细胞。
（2）胞外基质
与实施例5同样使用Plus＃1层粘连蛋白E8、Plus＃2层粘连蛋白E8、全长层粘连蛋白511以及Matrigel。
（3）人iPS细胞的培养
与实施例3同样地进行板的包被。与实施例6同样地除去饲养细胞，并将分散成单个的13000个32R1细胞接种到预先制备的包被板（6-孔板），在37℃、CO25％的培养箱中进行单个分散培养。次日，更换成维持培养用培养基。培养基更换每隔一天进行，从开始培养后6、7日左右起，每天进行。
（4）结果
用包被有各种胞外基质的培养器皿进行32R1细胞的单个分散培养，在进行7天培养后，将对增殖后的细胞集落进行碱性磷酸酶（ALP）染色后的结果示于图8。图8中，从左上起未包被（图中、None）、Matrigel包被（图中、Matrigel）、全长层粘连蛋白511包被（图中、LN511FL）、从左下起Plus＃1层粘连蛋白E8包被（图中、LN511E8plus＃1）、Plus＃2层粘连蛋白E8包被（图中、LN511E8plus＃2）。通过碱性磷酸酶染色，观察到在下部的Plus＃1层粘连蛋白E8包被以及Plus＃2层粘连蛋白E8包被的培养器皿中32R1细胞增殖良好。另一方面，在上部未包被以及Matrigel包被的培养器皿中，几乎观察不到32R1细胞。由以上结果示出，如果使用包被有Plus＃1层粘连蛋白E8或Plus＃2层粘连蛋白E8的培养基质，则能够容易地提供基于单个分散的人iPS细胞的培养方法。
〔实施例8：人iPS细胞的建立〕
（1）实验方法
不是像上述实施例6以及7那样使用预先建立的人iPS细胞株，而是使用包被有Plus＃1层粘连蛋白E8或Plus＃2层粘连蛋白E8的培养器皿，尝试建立人iPS细胞。包被浓度为0.5μg/cm2。具体而言，在包被有Plus＃1层粘连蛋白E8或Plus＃2层粘连蛋白E8的皿上，根据美国临时申请61/521153中记载的方法，使用附加体质粒载体pCEB-hSK-O以及pCEB-hUL-G，将重编程基因导入到来源于成人皮肤的成纤维细胞（HDF1388细胞），用维持培养培养基（mTeSR1（StemCell Technologies公司）和NutriStem（cosmobio公司）的1：1混合溶液）进行培养。在导入重编程基因后第30天，计数人iPS细胞的集落数。
pCEB-hSK-O附加体质粒是具有在各自的CAG启动子的控制下分别配置有夹着2A序列连接了人SOX2以及人KLF4的各翻译区域的构建体和人OCT3/4的翻译区域的表达盒的质粒（参照图10（I））。pCEB-hUL-G附加体质粒是具有在各自的CAG启动子的控制下配置有夹着2A序列连接了人L-MYC以及人LIN28的各翻译区域的构建体和人GLIS1的翻译区域的表达盒的质粒（参照图10（II））。
这些附加体质粒使用Okita et al.,“A more efficient method to generateintegration-free human iPS cells”,Nature Methods,8（5）,409（2011）以及国际公布WO2011/016588中记载的质粒等来制备。
（2）结果
将3个独立的实验（Exp.1、2以及3）中在未包被皿、Plus＃1层粘连蛋白E8包被皿以及Plus＃2层粘连蛋白E8包被皿条件下的人iPS细胞集落数（建立数）示于图9。在任意实验中，左表示未包被皿、中央表示Plus＃1层粘连蛋白E8包被皿、右表示Plus＃2层粘连蛋白E8包被皿。由图9可知，除了Exp.2的Plus＃1层粘连蛋白E8包被皿，Plus＃1层粘连蛋白E8包被皿或Plus＃2层粘连蛋白E8包被皿中人iPS细胞集落数（建立数）都比未包被皿增加。由该结果可见，包被有Plus＃1层粘连蛋白E8或Plus＃2层粘连蛋白E8的培养基质在建立iPS细胞中非常有用。
需要说明的是，本发明并不限定于上述的各实施方式及实施例，在权利要求所示的范围内可以进行各种变更，将不同的实施方式中分别公开的技术手段进行适当组合而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。另外，本说明书中记载的学术文献及专利文献的全部内容以参考的方式援引到本说明书中。
Claims (10)
1.一种改造层粘连蛋白，其特征在于，在层粘连蛋白E8片段的α链的N末端、α链的C末端、β链的N末端以及γ链的N末端的至少1处融合有增殖因子结合分子，其中，层粘连蛋白E8片段是层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段或层粘连蛋白α3β3γ2的E8片段，增殖因子结合分子是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。
2.根据权利要求1所述的改造层粘连蛋白，其中，增殖因子结合分子是选自以下(a)～(e)的至少1种以上，
(a)基底膜蛋白聚糖或其包含增殖因子结合位点的片段、
(b)聚集蛋白或其包含增殖因子结合位点的片段、
(c)XVIII型胶原蛋白或其包含增殖因子结合位点的片段、
(d)多配体蛋白聚糖或其包含增殖因子结合位点的片段、
(e)磷脂酰肌醇蛋白聚糖或其包含增殖因子结合位点的片段。
3.根据权利要求1或2所述的改造层粘连蛋白，其中，改造层粘连蛋白来源于人。
4.一种哺乳动物细胞的培养方法，其特征在于，在权利要求1～3中任一项所述的改造层粘连蛋白的存在下进行培养。
5.根据权利要求4所述的培养方法，其中，哺乳动物细胞是ES细胞、iPS细胞或成体干细胞。
6.根据权利要求4或5所述的培养方法，其中，不使用饲养细胞。
7.一种培养基质，其特征在于，包被有权利要求1～3中任一项所述的改造层粘连蛋白。
8.根据权利要求7所述的培养基质，其中，以0.03～25μg/cm2的浓度包被有改造层粘连蛋白。
9.一种iPS细胞的建立方法，其特征在于，包括：在权利要求1～3中任一项所述的改造层粘连蛋白的存在下使核重编程物质与体细胞接触的步骤。
10.根据权利要求9所述的iPS细胞的建立方法，其中，所述核重编程物质包含选自由Oct家族、Sox家族、Klf家族、Lin家族和Glis家族以及编码它们的核酸组成的组中的1种以上的物质。
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