JP6840951B2 - 培養用生成物、培養容器、及び培養容器の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は細胞培養に係り、特に接着細胞などを簡単に培養する技術に関する。
細胞を生体外で培養する際には、その細胞種特異的な機能や活性の維持に適した培養環境が重要であり、その環境因子として、培養器材、器材表面のコート剤、培地、液性因子などがある。生体内において細胞が分化・増殖する場合には、細胞外マトリックスが足場として機能して組織の構築が行われるため、足場材となる培養用器材や、器材表面の細胞外マトリックス由来基質などを含むコート剤は、生体外での細胞培養において重要な役割を果たす。
人工多能性幹細胞（以下、iPS細胞）は様々な細胞に分化できる多能性と無限に増殖できる自己複製能を有する細胞（非特許文献１）であるため、再生医療や創薬の分野においてiPS細胞の利用が期待されている。このiPS細胞を未分化能を維持したまま増殖させるためには、培養器材表面のコート剤や培地の組み合わせにより、適切な培養環境を維持することが特に重要となる（非特許文献２）。培養環境が適切でない場合には、iPS細胞の未分化の状態を維持できなかったり、細胞が死滅してしまったりすることがある。
未分化状態を維持する培養方法には、支持細胞であるフィーダ細胞と共培養するオンフィーダ培養法と、フィーダ細胞に替わる添加剤のみで未分化状態を維持するフィーダフリー培養法があり、支持細胞や細胞外マトリックス由来基質が必要である。更に、再生医療にiPS細胞を用いる際には、支持細胞由来の汚染や支持細胞自体の混入を防ぐ必要があるため、細胞外マトリックス由来基質の利用が不可欠である。このような技術に関連する特許文献としては、特許文献１がある。
Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., and Yamanaka, S., Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors., Cell, 131, 5, 861 - 72, (2007)
Higuchi, A., Ling, Q., Ko, Y., Chang, Y., and Umezawa, A., Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells., Chem.Rev., 111, 3021 - 3035, (2011)
上述した細胞外マトリックス由来基質であるラミニンは、iPS細胞を未分化な状態で安定的に増殖培養するための基質として広く利用されているが、コート時に表面で安定化させるために時間を要する。また表面が乾燥するとその培養機能が低下する。また、コートした表面の乾燥保存が難しいため、使用直前のコーティングが必要であるという課題がある。
本発明の目的は、上記の課題を解決し、作業工程を簡略化し、作業に費やす時間を低減することが可能な培養用生成物、及び培養容器を提供することにある。
本発明においては、上記の課題を解決するため、細胞の培養用表面を有する培養用生成物であって、培養用表面は、細胞外マトリックス由来基質と、マルトース或いはラクトースの少なくとも1つ含む糖類を含む安定化剤とを有する培養用生成物を提供する。
また、本発明においては、上記の課題を解決するため、培養容器であって、容器本体と、容器本体の表面に塗られた、細胞の培養用生成物とを備え、培養用生成物は、細胞外マトリックス由来基質と、マルトース或いはラクトースの少なくとも1つ含む糖類を含む安定化剤とを有する培養容器を提供する。
本発明により、細胞外マトリックス由来基質保持表面の乾燥保存が可能であり、培養使用直前の細胞外マトリックス由来基質のコーティング作業を省略可能であり、細胞培養開始時の時間と作業工程を短縮可能となる。
以下、本発明の培養生成物、及び培養容器の実施形態について詳述する。本発明者が検討を重ねた結果、細胞外マトリックス由来基質を乾燥状態で保存した表面でも細胞培養が可能であり、簡便に使用できることを見出し、本発明の培養生成物を完成させるに至った。本発明は、iPS細胞で代表される接着細胞の機能を維持したまま培養できる表面を提供するものであり、細胞外マトリックス由来基質と安定化剤を表面に有する培養用生成物、及び培養容器を構成する。すなわち、細胞の培養用表面を有する培養用生成物であって、培養用表面は、細胞外マトリックス由来基質と、マルトース或いはラクトースの少なくとも1つ含む糖類を含む安定化剤を有する培養用生成物、及びそれを利用した培養容器を構成する。
本発明は主として接着細胞を対象とし、接着細胞にはiPS細胞・ES細胞を含む幹細胞や体性幹細胞、各種初代培養細胞、株化細胞が含まれるが、この限りではない。また本発明は、細胞外マトリックス由来基質と安定化剤を含む培養用生成物であれば良く、細胞外マトリックス由来基質としては、ラミニン、コラーゲン、プロテオグリカン、エンタクチン/ニドゲン、フィブロネクチンなどの糖タンパク質や成長因子またはいずれかの混合物が挙げられるがこれに限定されない。細胞外マトリックス由来基質がラミニンの場合、ラミニンの全長を有しているもの、更には一部機能部位の断片などが含まれる。また本発明では特に、糖類を安定化剤として使用する。安定化剤として用いる糖類は、単糖、二糖、多糖類を、単独でも混合されて使用しても良く、特にマルトース、ラクトースを少なくとも1つ含むことが望ましい。
本発明によって提供される培養用生成物が使用される培養容器の容器本体は、培養皿、マルチウェルプレート、培養フラスコ、および同様の培養用の容器が全て含まれる。この培養容器の容器本体は、培養用生成物に含まれる細胞外マトリックス由来基質の吸着や結合を可能にできる物質でできたものであり、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、セルロース、フィブロインなど高分子材料が含まれ、これらの組み合わせを含むことが出来る。
本発明により提供される培養用生成物は、細胞外マトリックス由来基質をコーティング後に安定化剤を塗布する場合や、細胞外マトリックス由来基質と安定化剤を同時に塗布することによって作製される生成物を含む。
また、本発明の培養用生成物を生成するため、細胞外マトリックス由来基質や安定化剤を調製する溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）やトリス緩衝生理食塩水など細胞培養に使用する緩衝液であれば、特にその種類は問わない。この安定化剤を含む溶液は器材表面にコーティング前に、好適には0.22μｍのフィルターでろ過滅菌を行う。
本発明は、安定化剤いずれかを0.008〜0.3 mg / cm2有する生成物であり、より好ましくは0.01〜0.2 mg / cm2有する生成物であり、さらに好ましくは0.03〜0.1 mg / cm2有する生成物である。これら0.03 mg、0.1 mg、0.2 mg / cm2は本発明によって提供される培養用生成物の安定化剤保持量の計測値であり、0.03 mg / cm2を示す生成物の安定化剤濃度は解析に用いた装置の定量限界である。ここで言う安定化剤保持量とは安定化剤を培養表面に添加し、一定時間静置後、上清を除去後に培養表面に残っている安定化剤の量を所定の方法で計測した量である。ここで言う所定の方法とは作製した培養用生成物上に超純水を添加し、24時間静置することで安定化剤を抽出し、その安定化剤抽出溶液を回収し、HPLC溶離液で希釈し、0.45μｍメンブレンフィルターでろ過し、測定試料として用いて測定する方法である。表面保持量はそれぞれの安定化剤を用いて作成した検量線によって導かれ、各表面から抽出された糖量を生成物の表面積単位で示した。0.01 mg、0.008 mgは検量線を用いて本発明作製時の安定化剤の濃度から概算される値である。
＜細胞外マトリックス由来基質保持量の算出方法＞
安定化剤と同様に細胞外マトリックス由来基質の保持量は次のように測定した。作製した培養用生成物上に超純水を添加し、２４時間静置することで細胞外マトリックス由来基質を抽出した。細胞外マトリックス由来基質抽出溶液を回収し、HPLC溶離液で希釈し、0.45μｍメンブレンフィルターでろ過し、測定試料とした。
安定化剤と同様に細胞外マトリックス由来基質の保持量は次のように測定した。作製した培養用生成物上に超純水を添加し、２４時間静置することで細胞外マトリックス由来基質を抽出した。細胞外マトリックス由来基質抽出溶液を回収し、HPLC溶離液で希釈し、0.45μｍメンブレンフィルターでろ過し、測定試料とした。
本発明によって提供される培養用生成物は、37℃以下で保存可能であり、より好ましくは25℃以下で保存可能であり、さらに好ましくは4℃以下で保存可能である。特に単糖の一種であるマンノースを安定化剤として用いた本発明によって提供される生成物は、4℃で3カ月間保存後もラミニンの機能を維持しており、使用直前にラミニンコーティングした表面と同等の培養が可能であった。また、ラクトースを安定化剤として用いた本発明によって提供される生成物は、4℃で1カ月間保存後もラミニンの機能を維持しており、さらには37℃で高湿度環境下で1カ月間保存後もラミニンの機能を維持しており、使用直前にラミニンコーティングした表面と同等の培養が可能であった。
なお、本発明において培養に使用する培養液は、使用する細胞について良好な成育が得られる一般的な細胞培養液であれば、特にその種類を問わない。
以下、実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１の培養用生成物の生成について順次説明する。安定化剤溶液は各種糖を15 mM〜300 mMの濃度になるようにPBS溶液で溶解した。完全に糖が溶けたことを確認後、0.22 μmのフィルターに通しろ過滅菌を行った。
細胞外マトリックス由来基質としてiMatrix-511（カタログ番号892011；ニッピ）を使用し、PBSを400 μL添加した培養器材表面（24 well plate）にiMatrix-511を2 μL添加し、4℃で終夜コーティングした。iMatrix-511のコーティング液を除去し、調製した安定化剤を含むPBS溶液を400 μL添加し、コーティングした後、除去し乾燥保存した器材を本実施例によって提供される生成物とした。また、調整した安定化剤を含むPBS溶液を400 μL培養器材表面に添加し、iMatrix-511を2 μL添加し4℃で終夜コーティングした。その安定化剤とiMatrix-511の混合液を除去し乾燥保存した器材を本実施例によって提供される生成物とした。比較例１として、PBSを400 μL添加した培養器材表面にiMatrix-511を2 μL添加し、4℃で終夜コーティングし、コーティング液を除去し乾燥保存した器材を作製した。比較例２として、PBSを400 μL添加した培養器材表面にiMatrix-511を2 μL添加し、4℃で終夜コーティングし、コーティング液を除去した器材を作製した。
作製した器材上に超純水を添加し、２４時間静置することで安定化剤を抽出した。安定化剤抽出溶液を回収し、HPLC溶離液（アセトニトリル：超純水＝70：30 v/v）で希釈し測定試料とし、安定化剤の保持量を測定した。安定化剤の各濃度に応じた糖の保持量が検出された。これらの結果である器材表面の糖保持量を以下の表１に示す。
続いて、作製した培養用生成物上に超純水を添加し、２４時間静置することで表面吸着iMatrix-511を抽出した。iMatrix-511抽出溶液を回収し、HPLC溶離液（アセトニトリル：超純水＝70：30 v/v）で希釈し測定試料とし、iMatrix-511の保持量を測定した。安定化剤の有無や濃度はiMatrix-511の保持量に影響を与えないことが示された。これらの結果である器材表面のiMatrix-511の保持量を以下の表２に示す。
以上順次説明した実施例１で作製した培養用生成物である器材と、比較例１、２で作製した器材それぞれを用いてiPS細胞を培養した。iPS細胞の培養では細胞を1,400細胞/ cm2播種後、毎日培地交換を行った。1週間培養後の生細胞数を比較した。
その結果のグラフを図１に示す。図１は、培養使用直前にラミニンをコートした乾燥無表表面と、本実施例の細胞培養用生成物の表面とで、iPS細胞を培養後の細胞数比率データの比較を示すグラフである。同図で明らかなように、安定化剤無のラミニンのみをコーティングし乾燥させた器材（上述の比較例１に対応）よりも、本実施例の生成物の方が、生細胞数は多いことがわかった。また、使用直前にラミニンをコーティングした乾燥無の器材（上述の比較例２に対応）と同等の生細胞数が培養可能であった。
以上説明したように、本実施例の培養用生成物により、細胞外マトリックス由来基質保持表面の乾燥保存が可能であり、培養使用直前の細胞外マトリックス由来基質のコーティング作業を省略可能であり、細胞培養開始時の時間と作業工程を短縮可能となる。
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることが可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
本発明により、簡便に利用できる接着細胞培養表面が提供でき、iPS細胞などの接着細胞を簡単に培養することができるので、再生医療や創薬の分野で極めて有用である。
Claims (7)
- 細胞の培養用表面を有する培養用生成物であって、
前記培養用表面は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、セルロース、フィブロイン、又はこれらの組み合わせから構成される物質の表面であり、細胞外マトリックス由来基質であるラミニンと、0.01〜0.3 mg / cm 2 の安定化剤保持量でマルトース及びラクトースの少なくとも1つである安定化剤とを、含む乾燥用培養表面である、
ことを特徴とする培養用生成物。 - 請求項１に記載の培養用生成物であって、
前記安定化剤保持量が0.01〜0.2 mg / cm2 である、
ことを特徴とする培養用生成物。 - 請求項１乃至請求項２のいずれか１項に記載の培養用生成物であって、
前記細胞は接着細胞である、
ことを特徴とする培養用生成物。 - 請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の培養用生成物であって、
前記細胞は人工多能性幹細胞（iPS細胞）を含む、
ことを特徴とする培養用生成物。 - ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、セルロース、フィブロイン、又はこれらの組み合わせである容器本体と、
前記容器本体の表面に配置された請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の培養用生成物と、を有する、
ことを特徴とする培養容器。 - 細胞外マトリックス由来基質が付与された培養用表面を有し、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、セルロース、フィブロイン、又はこれらの組み合わせである容器本体を用意すること、
マルトース及びラクトースの少なくとも1つを含むコーティング液を前記培養用表面に付与すること、次いで、
前記コーティング液が付与された培養用表面を乾燥して、0.01〜0.3 mg / cm 2 の保持量でマルトース及びラクトースの少なくとも１つを有する培養用表面を得ること、
を含む、請求項５に記載の培養容器の製造方法。 - ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、セルロース、フィブロイン、又はこれらの組み合わせである培養用表面を有する容器本体を用意すること、
細胞外マトリックス由来基質と、マルトース及びラクトースの少なくとも1つとを含むコーティング液を前記培養用表面に付与すること、次いで、
前記コーティング液が付与された培養用表面を乾燥して、0.01〜0.3 mg / cm 2 の保持量でマルトース及びラクトースの少なくとも１つを有する培養用表面を得ること、
を含む、請求項５に記載の培養容器の製造方法。
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