ES2584053T3 - Métodos y composiciones para la unión de células y cultivo en sustratos planos - Google Patents

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Abstract

Un método para unir células madre pluripotentes a un sustrato plano que contiene hasta alrededor del 12% de N, de al menos alrededor del 12% de O a al menos alrededor del 55% de O, un ángulo de contacto de alrededor de 18 grados a alrededor de 32 grados, y que carece de una capa adsorbida y una capa de células de alimentación, que comprende los pasos de: a. usar una suspensión obtenida de células madre pluripotentes, y b. añadir la suspensión de células al sustrato plano y permitir que las células se unan.

Description

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célula coloca la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación. Un marcador específico del linaje se refiere a una característica asociada específicamente con el fenotipo de las células de un linaje de interés y puede usarse para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida con el linaje de interés.
"Superficie" como se usa en la presente se refiere a la capa más exterior de las moléculas de un recipiente
o matriz de sustrato sólido pretendida para el uso en el cultivo o análisis celular. La composición elemental, la rugosidad, y la humectabilidad de la superficie pueden analizarse por Espectroscopia de Fotoelectrones por Rayos X (XPS), Microscopía de Fuerza Atómica (AFM), y medición del ángulo de contacto, respectivamente.
Se usan varios términos para describir células en cultivo. "Mantenimiento" se refiere generalmente a células colocadas en un medio de crecimiento bajo condiciones que facilitan el crecimiento y/o división celular que puede o no puede resultar en una población de células mayor. "Pase" se refiere al proceso de retirar las células de un recipiente de cultivo y colocarlas en un segundo recipiente de cultivo bajo condiciones que facilitan el crecimiento y/o división celular.
Una población específica de células, o una línea celular, es referida algunas veces o caracterizada por el número de veces que ha sido pasada. Por ejemplo, una población celular cultivada que ha sido pasada diez veces puede ser referida como un cultivo P10. El cultivo primario, es decir el primer cultivo después del aislamiento de las células del tejido, se designa P0. Después del primer subcultivo, las células se describen como un cultivo secundario (P1 o pase 1). Después del segundo subcultivo, las células se vuelven un cultivo terciario (P2 o pase 2), y así. Se entenderá por los expertos en la técnica que puede haber muchas duplicaciones de la población durante el periodo de pase; por lo tanto el número de duplicaciones de población de un cultivo es mayor que el número de pases. La expansión de las células (es decir, el número de duplicaciones de población) durante el periodo entre el paso depende de muchos factores, incluyendo pero no limitado a, la densidad del sembrado, sustrato, medio, condiciones de crecimiento, y el tiempo entre el pase.
Sustratos planos de la Presente Invención
Los sustratos planos adecuados para el uso en la presente invención pueden estar compuestos de cualquier material que sea capaz de proporcionar un apoyo en el que se puedan unir células pluripotentes. Por ejemplo, el sustrato plano puede estar comprendido de policarbonato. Alternativamente, el sustrato plano puede estar comprendido de tereftalato de polietileno (PETE). Alternativamente, el sustrato plano puede estar comprendido de nylon. Alternativamente, el sustrato plano puede estar comprendido de acetato de celulosa. Alternativamente, el sustrato plano puede estar comprendido de un éster de celulosa mixto. Ejemplos de sustratos planos adecuados para el uso de la presente invención pueden encontrarse en la Tabla 1.
La presente invención se refiere a métodos para la unión, cultivo y diferenciación de células madre pluripotentes a un sustrato plano que contiene hasta alrededor del 12% de N, de al menos alrededor del 12% de O a al menos alrededor del 55% de O, un ángulo de contacto de alrededor de 18 grados a alrededor de 32 grados, y que carece de una capa adsorbida y una capa de células de alimentación. El sustrato plano que contiene de al menos alrededor del 8% de N a al menos alrededor del 12% de N, y de al menos alrededor del 12% de O a al menos alrededor de 55% de O puede ser una superficie fibrosa rugosa o, alternativamente, una superficie lisa.
En una realización, la presente invención proporciona un método para unir células madre pluripotentes a un sustrato plano que contiene hasta alrededor del 12% de N, de al menos alrededor del 12% de O a al menos alrededor del 55% de O, un ángulo de contacto de alrededor de 18 grados a alrededor de 32 grados, y que carece de una capa adsorbida y una capa de células de alimentación, que comprende los pasos de:
a. Obtener una suspensión de células madre pluripotentes, y
b). Añadir la suspensión celular al sustrato plano y permitir que se unan las células.
En una realización, las células madre pluripotentes se mantienen en el cultivo después de que las células se unan a la superficie. En una realización, las células madre pluripotentes se diferencian en el sustrato plano después de que las células se unan a la superficie.
En una realización, la unión de las células madre pluripotentes a un sustrato plano que contiene hasta alrededor del 12% de N, de al menos alrededor del 12% de O a al menos alrededor del 55% de O, un ángulo de contacto de alrededor de 18 grados a alrededor de 32 grados, y que carece de una capa adsorbida y una capa de células de alimentación se potencia tratando las células con un compuesto capaz de inhibir la actividad de la Rho quinasa. El compuesto capaz de inhibir la Rho quinasa puede eliminarse de las células después de que se hayan unido.
El compuesto capaz de inhibir la Rho quinasa se selecciona del grupo consistente de: Y-27632, Fasudil, H1152 e Hidroxifasudil.
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En una realización alternativa, las células madre pluripotentes se propagan en el cultivo y después se tratan de una manera que promueve su diferenciación en otro tipo de célula. El otro tipo de célula puede ser una célula que expresa marcadores característicos del linaje endodermo definitivo. Alternativamente, el tipo de célula puede ser una célula que expresa marcadores característicos del linaje endodermo pancreático. Alternativamente, el tipo de célula puede ser una célula que expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. Alternativamente, el tipo de célula puede ser una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células β.
Las células madre pluripotentes tratadas de acuerdo con los métodos de la presente invención pueden diferenciarse en una variedad de otros tipos de células por cualquier medio adecuado en la técnica.
Por ejemplo, las células madre pluripotentes tratadas de acuerdo con los métodos de la presente invención pueden diferenciarse en células neurales, células cardiacas, hepatocitos y similares.
Por ejemplo, las células madre pluripotentes tratadas de acuerdo con los métodos de la presente invención pueden diferenciarse en progenitores neurales y cardiomiocitos de acuerdo con los métodos descritos en la WO2007030870.
En otro ejemplo, las células madre pluripotentes tratadas de acuerdo con los métodos de la presente invención pueden diferenciarse en hepatocitos de acuerdo con los métodos descritos en la patente US 6.458.589.
Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en D’Amour et al., Nature Biotechnol. 23:1534-1541, 2005.
Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en Shinozaki et al., Development 131:1651-1662, 2004.
Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en McLean et al., Stem Cells 25:29-38, 2007.
Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en D’Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392-1401, 2006.
Los marcadores característicos del linaje endodermo definitivo se seleccionan del grupo consistente de SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, proteína homeobox tipo Mix, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 y OTX2. Para su uso en la presente invención es adecuada una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje endodermo definitivo. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endodermo definitivo es una célula precursora de línea primitiva. En un aspecto alternativo, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endodermo definitivo es una célula del mesendodermo. en un aspecto alternativo, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endodermo definitivo es una célula del endodermo definitivo.
Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje endodermo pancreático de acuerdo con los métodos descritos en D’Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392-1401, 2006.
Los marcadores característicos del linaje endodermo pancreático se selecciona del grupo consistente de PDX1, HNF1 beta, PTF1 alfa, HNF6, HB9 y PROX1. Para su uso en la presente invención es adecuada una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje endodermo pancreático. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endodermo pancreático es una célula del endodermo pancreático.
Las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático por cualquier método de la técnica.
Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje endodermo endocrino de acuerdo con los métodos descritos en D’Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392-1401, 2006.
Los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se seleccionan del grupo consistente de
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Ejemplo 12: Propiedades Físicas de los Sustratos Planos de la Presente Invención
Se determinó la química de superficie en los sustratos planos de la presente invención. Las Tablas 7-10 representan el análisis por Espectroscopia de Fotoelectrones de rayos X (XPS) y el ángulo de contacto. Para la XPS, se usó una profundidad de análisis de aproximadamente 50-100 Å. Típicamente, el 95% de la señal se origina desde dentro de esta profundidad.
Las membranas 1-3 contenían concentraciones similares de oxígeno, carbono (principalmente como C-O y C-(C,H), probablemente O-C-O), y nitrógeno (como NO3, NO2 y posiblemente C-N, y R4-N+). La membrana 3 también contenía concentraciones de traza de NA+ y SOX y una concentración más alta de C-(C,H). La membrana 4 contenía C-(C,H), C-(O,N), y (O,N)-C=O y posiblemente una traza de sodio. La membrana 5 contenía principalmente C-O y también C-(C,H) y O-C-O y/o O-C=O. También se detectaron concentraciones de traza de Na+ y SOx. Las membranas 6-11 contenían C-(C,H), C-O, O-C=O, C-N, CO3, p-p*, y concentraciones de traza de R4-N+, SOx, y o Na+ o Cr3+ . La superficie de la membrana 6 puede también contener una concentración de traza de cloro. Las concentraciones de traza de cromo se detectaron sólo en las membranas 10 y 11, mientras que el Na+ se detectó en las membranas 6-9. La superficie de la membrana 12 contenía C-(C,H), C-O, O-C=O, y pi-pi+ consistente con PET. También se detectaron concentraciones de traza de nitrógeno y sodio.
La Figura 11 muestra las micrografías electrónicas de barrido de los sustratos planos de la presente invención. Se observaron dos tipos de morfologías. Uno tipo estaba caracterizado por una red abierta de fibras. El segundo tipo estaba caracterizado por una lámina lisa con orificios circulares dispersados a través de la superficie.
La Tabla 10 muestra las mediciones del ángulo de contacto de las superficies de la presente invención. Las superficies 1 a 5 tenían mediciones del ángulo de contacto de alrededor de 18º a alrededor de 32º . Las células madre pluripotentes no requerían la presencia de un inhibidor de la actividad de la Rho quinasa para unirse a las superficies 1-5.
Las superficies 6 a 12 tenían mediciones del ángulo de contacto mayores de 32º. Las células madre pluripotentes requerían de la presencia de un inhibidor de la Rho quinasa para unirse a estas superficies.
Ejemplo 13: Unión de Células Madre Pluripotentes a un Sustrato Plano que consiste de una Poliamina.
El sustrato plano consistente de poliamina se fabricó de acuerdo con los métodos descritos en la US6743273 y Schindler M et al, Biomaterials 26(28): 5624-5631; 2005. El sustrato plano está disponible comercialmente, vendido bajo la marca ULTRAWEB™. las superficies sintéticas ULTRAWEB™ están compuestas de nanofibras de poliamida electrohiladas orientadas aleatoriamente con un diámetro de fibra medio de 280 nm. La distribución del tamaño de fibra está entre 200 y 400 nm. La primera ULTRAWEB™ probada tenía una superficie ligeramente hidrófila (catálogo #3870XX1) mientras que la segunda superficie, superficie (catálogo #3871XX!) era ligeramente hidrófila y estaba recubierta con un material de poliamina que proporcionaba las nanofibras con un grupo de amina libre para una carga positiva neta. Ambas superficies son altamente efectivas en la absorción de proteínas a través de interacciones hidrófobas. En la Figura 12 se muestran micrografías electrónicas de barrido de 5 micras de resolución y de ampliación 10.000X. Sin embargo, las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 fueron incapaces de unirse a cualquiera de las superficies ULTRAWEB™ probadas.
Ejemplo de Referencia 14: El Efecto del uso del Medio Definido en la Unión de Células Madre Pluripotentes con los Sustratos Planos de la Presente Invención.
Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 se sembraron en los siguientes sustratos planos: Membrana 1 (éster de celulosa mixta), Membrana 4 (nylon), Membrana 5 (acetato de celulosa) y nitrocelulosa. Las células se sembraron a una dilución 1:3 en el medio definido mTESR™ y se cultivaron durante 24 horas. Los cultivos paralelos en medio acondicionado con MEF se incluyeron como controles. El cultivo de las células en mTESR™ no afecto a la capacidad de las células de unirse con las superficies planas. Las células fueron capaces de unirse a las membranas 1, 4 y 5, y nitrocelulosa. La membrana que mostró el mayor enlace de células usando mTESR™ fue la membrana 4, seguida por la Membrana , que fue igual que la de nitrocelulosa, seguida por la Membrana 1.
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Tabla 2: Expresión de los marcadores de superficie celular asociados con la pluripotencia de la línea de células madre embrionarias humanas H1 después de propagarse en membranas de ésteres de celulosa mixta durante 3 pases, como se determina por citometría de flujo
Marcadores de Superficie
Pordentaje de células positivas
Tra1-60
98.4%
Tra1-81
98.8%
SSEA-3
97.5%
SSEA-4
98.1%
Tabla 3: Protocolo para tratar células madre embrionarias humanas para inducir la diferenciación en células productoras de insulina
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Tiempo
Tratamiento
2 días
Medio DMEM-F 12 2% Albúmina de Suero Bovino Libre de Ácidos Grasos (FAF-BSA) 100 nanogramos por mililitro ActivinA 20 nanogramos por mililitro Wnt3A
2 días
Medio DMEM-F 12 2% Albúmina de Suero Bovino Libre de Ácidos Grasos (FAF-BSA) 100 nanogramos por mililitro ActivinA
3 días
Medio DMEM-F 12 2% BSA 20 nanogramos por mililitro FGF7 250 nanomoles Cyclopamine-KAAD
4 días
Medio DMEM-F 12 1% de suplemento de B27 20 nanogramos por mililitro FGF7 250 nanomoles Cyclopamine-KAAD 2 micromoles Retinal Acid (RA) 100 nanogramos por mililitro Noggin
3 días
Medio DMEM-F 12 1% de suplemento de B27 1 micromoles ALK5 inhibitor 2 100 nanogramos por mililitro Noggin 100 nanogramos por mililitro Netrin-4 50 nanogramos por mililitro Exendin-4 1micromoles DAPT
7 días
Medio DMEM-F 12 1% de suplemento de B27 1 micromoles inhibidor 2 de ALK5
7 días
Medio DMEM-F 12 1% de suplemento de B27
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Tabla 8: Concentraciones (en %) de Grupos Funcionales de Carbono
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Tabla 9: Concentraciones (en %) de Grupos Funcionales de Nitrógeno
C-(C,H)
C-(O,N) O-C-O / O-C=O CO3 pi-pi*
Muestra
B.E. Átomos% B.E. Átomos% B.E. Átomos% B.E. Átomos% B.E. Átomos%
1
284.8 2.3 287.0 29.7 288.4 7.3 - - - -
2
284.8 1.7 287.1 30.0 288.5 6.5 - - - -
3
284.8 7.6 287.0 27.1 288.4 6.6 - - - -
4
284.8 51.8 285.9 12.9 287.7 11.2 - - - -
5
284.8 14.9 286.3 28.8 288.5 15.8 - - - -
6
284.8 55.5 286.1 18.2 287.6 2.8 290.9 4.2 292.4 1.3
7
284.8 56.5 286.4 13.6 288.3 1.4 290.4 2.8 291.3 4.7
8
284.8 55.8 286.1 17.4 287.5 2.8 290.8 4.1 292.1 2.1
9
284.8 54.1 286.4 13.0 288.5 2.1 290.4 3.1 291.2 4.9
10
284.8 52.5 286.3 13.6 288.6 3.4 290.6 4.2 291.9 2.6
11
284.8 60.8 286.4 11.7 288.6 0.2? 290.7 4.8 292.0 2.8
12
284.8 39.2 286.4 15.5 288.8 13.2 290.5 0.5? 291.6 1.9
35
45
55
C-N
R4-N+ NO2 NO3
Muestra
B.E. Átomos% B.E. Átomos% B.E. Átomos% B.E. Átomos%
1
400.0 0.1? 401.6 0.1? 404.5 0.5 407.5 8.1
2
- - - - 404.6 0.4 407.5 9.2
3
400.0 0.1? 401.7 0.1? 404.4 0.4 407.4 7.8
4
400.0 11.9 - - - - - -
5
- - - - - - - -
6
400.0 3.5 - - - - - -
7
400.0 0.4 401.7 0.3 406.1 0.1? - -
8
400.0 2.9 401.8 0.1? - - 408.3 0.1?
9
400.0 0.6 401.7 0.4 405.8 0.1? - -
10
400.0 2.1 401.5 0.8 - - - -
11
400.0 0.2? 401.8 0.4 - - - -
12
400.0 0.1? 401.7 0.1? - - - -
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Tabla 10: Mediciones del ángulo de contacto de las placas de la presente invención
Lectura del Angulo de Contacto Agua (°)
Lectura del Angulo de Contacto (°)
Número de muestra
1 2 3 Media 1 2 3 Media Comentarios
1
110.9 - - 110.9 18.32 - - 18.32
2
55.4 59.96 60.44 58.6 28.13 - - 28.13
3
25.54 19.79 - 22.67 29.76 25.53 - 27.65
4
29.36 31.24 32.89 31.16 31.09 25.88 - 28.49
5
- - - - - - - - No se puede medir
6
90.42 - - - 32.07 - - 32.07
7
63.59 - - - 49.49 - - 49.49
8 brillo
58.8 - - 58.8 41.29 - - 41.29 La muestra tenía apariencia brillante
8 mate
72.69 - - 72.69 43.3 - - 43.3 La muestra tenía apariencia mate
9
71.89 - - 71.89 33.82 - - 33.82
10
- - - - - - - - No se puede medir
11
- - - - - - - - No se puede medir
12
76.96 65.187 - 71.07 46.31 - - 46.31 -
Aunque se han ilustrado los varios aspectos de la invención anteriores en referencia a los ejemplos y realizaciones preferidas, se apreciará que el alcance de la invención se define no sólo por la descripción anterior si 35 no por las siguientes reivindicaciones interpretadas apropiadamente bajo los principios de la ley de patentes.
45
55

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  1. imagen1
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