JP5265204B2 - 成人膵臓由来間質細胞 - Google Patents
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Description
本発明は、β細胞系統に分化され得る成人膵臓由来細胞の増殖可能な集団に関する。本発明は、そのような成人膵臓細胞の単離および増殖のための方法と、このような細胞を糖尿病の治療に利用するための関連する方法および組成も提供する。
臓器機能の喪失は、先天性欠損症、損傷または疾患に起因する場合がある。臓器機能の喪失の原因となる疾患の例の一つは糖尿病(diabetes mellitusまたはdiabetes)である。糖尿病の大部分の症例は、若年発症糖尿病もしくはインスリン依存性糖尿病(IDDM)としても知られる1型と、成人発症型糖尿病としても知られる2型の二つの臨床型に該当する。それぞれの型は、異なる予後、治療および原因がある。双方の種類は、患者の血糖値の調節能の喪失を特徴とする。結果として、代謝要求に見合うようにグルコースが細胞内に入ることができないため、血糖値が上昇する。この適切な血糖代謝の不能は、例えば、高血糖、異常な空腹感、口渇、多尿症、糖尿(glycouria)に始まり、その後例えば、神経障害、大血管疾患(macro-vascular disease)、および微小血管疾患(micro-vascular disease)に発展する、複雑な一連の初期および後期の総合的症状を引き起こす。
本発明は、β細胞系統の特性を有する細胞への分化能を維持したままでの成人膵臓由来細胞集団の単離、および約20集団倍加までの細胞集団の増殖のための方法を目的とする。あるいは、β細胞系統の特性を有する細胞への分化能を維持したままでの、約50集団倍加まで、もしくは約70集団倍加まで細胞集団が増殖する場合もある。
限定の目的ではなく開示の明確化を目的として、発明の詳細な説明は、特定の特徴、実施形態もしくは本発明の応用を述べる、または示す以下の小区分に分割される。
「膵臓由来細胞」とは、腺房細胞、腺管細胞、膵島細胞タイプに加え、間質細胞、星細胞、ニューロン、血管細胞、幹細胞、および前駆細胞といった支持細胞を含む、ほ乳類種由来の腎臓初代細胞もしくはほ乳類の膵臓より単離された初代細胞を指す。
本発明の一態様において、膵臓由来間質細胞は図1に示された多段階の方法によって単離される。この方法は、基本的に以下の段階を含む。
- 酵素溶液による死体膵臓、生体ドナーもしくは自家膵臓の潅流。
- 潅流された膵臓の機械的分離。
- ポリスクロース、またはフィコールなどの密度勾配上への消化された組織の重層の後、3つの明瞭な界面を得るための遠心。
- 各界面の組織と細胞の除去。
- 5%未満の血清を含む栄養豊富な選択培地で標準的組織培養プレートでの組織と細胞の培養。
- 約2週間から約4週間まで培地交換無しでそのまま培養を放置。
培養中もしくは単離された細胞内でのタンパク質マーカーおよび核酸マーカー発現の評価方法は、技術的に標準的である。これらの方法は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法(RT-PCR)、ノーザンブロット、インサイチュー・ハイブリダイゼーション(例としてキュレント・プロトコル・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology) (アウスベルら編(Ausubel et al., eds.) 2001 サプルメント(supplement))を参照)、および例えば、切片化された材料の免疫組織化学解析、ウェスタンブロット、無傷の細胞に利用可能なマーカーのためのフローサイトメトリー解析(FACS)(例えば、ハーロウおよびレーン,抗体の使用,ラボラトリー・マニュアル,ニューヨーク,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1998)を参照)といったイムノアッセイを含む。
さらに別の態様では、本発明は本発明に従って得られた成人膵臓由来間質細胞増殖方法を提供する。前述のように、膵島、腺管断片、および外分泌組織の不均一な混合物を含む可能性がある膵臓の消化物は、目的の成人膵臓由来間質細胞を選択的に濃縮するために低血清の選択培地中で約2週間から約4週間、望ましくは培地の交換なしに培養される。その結果得られた成人膵臓由来間質細胞が濃縮された細胞集団は、次に細胞集団中の成人膵臓由来間質細胞を増殖させるための増殖培地に切り換えられる。
一態様において、本発明は、β細胞系統のマーカー特性を持つ細胞への、増殖した本発明の成人膵臓由来間質細胞の分化が可能な組成を提供する。
本発明の方法に従って単離され、増殖させられた成人膵臓由来間質細胞が膵臓β細胞系統の細胞への分化能を維持していることが認められた。本発明の細胞は、1型および2型糖尿病の治療に利用される可能性もある。
<ヒト成人膵臓由来間質細胞株の確立>
膵臓の調製−
臨床移植に適さないヒトの膵臓は、研究利用のための適切な承諾の後に、ザ・ナショナル・ディジーズ・リサーチ・インターチェンジ(The National Disease Research Interchange)(ペンシルバニア州フィラデルフィア(Philadelphia,PA))から入手された。膵臓は、臓器保存溶液で氷上のステンレス製の皿に移され、無関係な組織は全て切り取られた。膵管に18ゲージのカテーテルが挿入され、膵臓に、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に溶解した、LIBERASE HI(商標)酵素(Roche、0.5mg/mL)とDNaseI(0.2mg/mL)とを含む酵素溶液が注入された。
酵素が注入された膵臓は、組織プロセッサで3から5秒間/パルスのパルスを3から5回行ってホモジナイズされ、分離した組織は攪拌機のバーを入れた2つの500mLのトリプシン処理フラスコ(Bellco)に移された。次に、50mLから100mLの酵素溶液が各フラスコに添加された。フラスコは、37℃の水浴中の水中撹拌プレート上に置かれ、中程度の撹拌速度で10分間インキュベートさせた。撹拌を止め、細かく消化された組織がフラスコから取り除かれ、酵素過程を急冷するために4℃のDPBS、5%ウシ胎児血清(FBS)、および0.1mg/mL DNaseI(DPBS+)が入った250mLの試験管に移された。フラスコに50mLから100mLの酵素溶液が補充され、水浴中に戻され、更に10分間撹拌が再開された。再び、フラスコが取り除かれ、細かい消化物が回収され、氷上の250mL試験管に移された。この過程は、膵臓が完全に消化されるまで、さらに3〜5回繰り返された。
酵素が注入された膵臓は、糖尿病37(Diabetes 37):413-420 (1988)に述べられた様な方法に従って処理された。簡潔に述べると、膵臓は無関係な組織が取り除かれ、上述の酵素溶液を注入された。次に膵臓はビーズと共にリコルディ・チャンバー(Ricordi Chamber)中に置かれ、組織のより大きな塊を保つために、メッシュサイズ400から600μmのスクリーンで覆われた。チャンバーはふたをされ、酵素溶液はおよそ37℃でチャンバーを循環させられ、酵素が膵臓を消化する一方で膵臓組織をビーズでバラバラにするためチャンバーは振盪された。十分な分離と消化が得られたら、消化は停止され組織が回収された。
回収された組織は、4℃で150xgで5分間遠心された。上清が吸引され、DPBS+中で組織は更に2回洗浄された。最後の洗浄後、組織は精製のため非連続的密度勾配に供された。消化された組織は、密度1.108g/mLのポリスクロース(バージニア州のメディアテック(Mediatech,VA))に、10mLのポリスクロース溶液当たり1から2mLの組織ペレットの割合で懸濁された。組織懸濁液は丸底のポリカーボネート遠心管に移され、密度1.096と1.037のポリスクロース溶液は注意深く遠心管に注がれた。DMEMの最後の層で非連続精製密度勾配を完成させた。密度勾配の遠心管は4℃で、2000rpmで20分間、ブレーキをかけずに遠心された。遠心後、組織は各界面(3界面)から回収され、DPBS+で上述のように数回洗浄され、50mLの試験管に回収された。
任意で、上記のプロトコルを用いて得た大きな細胞塊を更に分離させて、より小さな塊もしくは単細胞の懸濁液にすることもできる。最後の洗浄の後、各画分からの組織は200U/mL DNaseIを含む10mL 1Xトリプシン/EDTA溶液に懸濁された。試験管は水浴中に置かれ、ほぼ単細胞の懸濁液が得られるまで10mLの血清用ピペットで5から6分、繰り返し吸引排出された。消化物は4℃のDPBS+の添加で急冷され、試験管は800rpmで5分間遠心された。細胞懸濁液はDPBS+で洗浄され、下記のように培養された。
最後の洗浄後、各界面からの細胞はDMEM、2%FBS、100U/μgペニシリン/ストレプトマイシン、ITS、2mM L-グルタミン、0.0165mM ZnSO4(Sigma)、0.38μM 2-メルカプトエタノール(Invitrogen、CA)(以後「選択培地」)に懸濁された。6mLの細胞懸濁液がT-25組織培養フラスコに播種され、12mLの細胞懸濁液がT-75フラスコに播種された。フラスコは5%CO2の37℃のインキュベーターに置かれた。2週間から約4週間の培養後、全面的な培地交換が行われ、接着細胞は、5%FBS(HyClone、UT)、1%P/S、0.0165mM ZnSO4を含むDMEM(2750mg/L D-グルコース、862mg/Lグルタミン)(Gibco、CA)(以後「増殖培地」)の培養に戻され、ほぼコンフルエンスに達するようにされ(この段階は「0代継代」または「P0」と称される)、この時点で継代された。その後の細胞培養は、増殖培地中で5000細胞/cm2だった。培養は、約70から90%の密集度で7日から10日ごとに継代された。図2は本発明の典型的な成人膵臓由来間質細胞を示す。
<集団倍加時間>
上記の実施例1に従って単離および増殖させられた10代および12代継代の成人膵臓由来間質細胞は、増殖培地において、10000細胞/ウェル(24ウェル組織培養プレート)(マサチューセッツ州のコーニング(Corning,MA))で播種された。細胞は様々なタイムポイントでTRYPLE(商標) Express(カリフォルニア州のインビトロゲン(Invitrogen,CA))を用いてプレートの3つのウェルから取り除かれ、Guava PCA-96細胞解析システムとVIACOUNT(登録商標)試薬(カリフォルニア州のグアバ(Guava,CA))とを用いて計数された。図3は、正常酸素圧条件下で培養された10代継代細胞の増殖曲線を示す。直線期の対数曲線が細胞の集団倍加時間の推定に用いられた。10代および12代継代細胞の集団倍加時間は、それぞれ36時間と38時間だった。
<成人膵臓由来間質細胞の増殖能>
実施例1に従って単離された成人膵臓由来間質細胞は、75cm2の組織培養用処理済みのフラスコ(Corning、MA)で選択培地で正常酸素圧条件下(5%CO2、20%O2、75%N2)で3週間培養された。培養はその後、増殖培地に切り換えられ、週に2回から3回新しい培地を与えた。細胞はほぼコンフルエンスに達するようにして、その時点で継代された。培養は、最初の9代継代は7〜14日毎におよそ70〜95%の密集度で継代され、その間の細胞集団倍加時間は、100時間より長かった。10回目の継代の後、細胞増殖速度は加速し、細胞は4から6日毎に継代され、集団倍加時間はおよそ40時間に減少した。細胞は、各継代の際にTRYPLE(商標) Express(Invitrogen,CA)を用いてフラスコから回収され、Guava PCA-96細胞解析システムとVIACOUNT(登録商標)試薬(Guava,CA)とを用いて計数された。細胞は増殖培地中で132日間増殖し続け、現在40集団倍加に達し、細胞数は1012倍の増加と推定された。(図6を参照)
<複数の成人膵臓由来間質細胞系統の増殖能>
実施例1に従って単離された成人膵臓由来間質細胞は、低酸素圧条件下(5%CO2、3%O2、92%N2)または正常酸素圧条件下(5%CO2、20%O2、75%N2)で選択培地で2から4週間培養された。培養はその後、増殖培地に切り換えられ、週に2回から3回新しい培地を与えた。最初の培養期間後、低酸素圧条件下と正常酸素圧条件下で培養されたプレート中で接着細胞が観察された。更に、最初の2から4週間の培養後、膵島様または腺管構造はプレート中にほとんど残っていなかった。
<CD105陽性細胞の選択>
実施例1に従って単離されたP0成人膵臓由来細胞は、約70%の密集度でTRYPLE(商標) Express(Invitrogen,CA)溶液を用いて遊離され、次に増殖培地(DMEM、5%FBS、0.0165mM ZnSO4、および1%P/S)で洗浄された。細胞懸濁液は1400RPMで5分間遠心され、上清は廃棄された。その結果得られた細胞ペレットは、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁され、0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)と2mM EDTAとが添加された。細胞は、製造業者の取扱説明書(カリフォルニア州のミルテニー・バイオテック(Miltenyi Biotech,CA))に従って、CD105陽性集団が選択された。CD105陽性画分の単離は、抗ヒトCD105PE-標識マウス抗体(カリフォルニア州のサンタ・クラッツ(Santa Cruz,CA))を用いたフローサイトメトリーで確認された。陽性画分は増殖培地で培養された。CD105陽性画分は、主に増殖中の成人膵臓由来間質細胞で構成されていた。
<蛍光活性化細胞選別(FACS)解析>
TRYPLE(商標) express溶液(カリフォルニア州のギブコ(Gibco,CA))で5分間のインキュベーションにより、接着した細胞が継代9〜12のプレートから取り除かれた。遊離された細胞は、10%FBSを添加したDMEM中に再懸濁され、遠心で回収され、次に細胞はPBS中に2%BSA、0.05%アジ化ナトリウム(Sigma、MO)を含む染色用緩衝液中で洗浄、再懸濁された。適切であれば、細胞は0.1%のγグロブリン(Sigma)溶液を15分間用いてFc受容体がブロックされた。小分注(約105細胞)は、表II-Aに示されたようにフィコエリトリン(PE)かアロフィコシアニン(APC)を結合したモノクローナル抗体(106細胞あたり、抗体5μL)のいずれか、もしくは結合されていない一次抗体でインキュベートされた。コントロールにはイソタイプに適合した抗体、非染色細胞、および結合された2次抗体のみで染色された細胞を含めた。全ての抗体インキュベーションは4℃で30分間行われ、細胞は次に染色緩衝液で洗浄された。結合されていない一次抗体で染色された試料は、PEまたはAPCで標識された結合された二次抗体で4℃で更に30分間インキュベートされた。使用された二次抗体の一覧表として、表II-Bを参照。洗浄された細胞はペレットにされ、染色緩衝液に再懸濁され、FACS Array(BDバイオサイエンス(BD Biosciences))を用いて、少なくとも10,000イベントを回収して細胞表面分子が同定された。
<成人膵臓由来間質細胞の免疫染色>
実施例1に従って培養された、10代継代の成人膵臓由来間質細胞10,000細胞/cm2は、35mmのマイクロウェルディッシュ(マサチューセッツ州のメイテック社(Matek Corp,MA))のガラス底の増殖培地に播種された。培養3日後、細胞は4%パラフォルムアルデヒドで10分間固定され、次にPBSで2回洗浄され、0.5%Triton-X(Sigma)を含む透過緩衝液中に室温(RT)で5分間の添加の後、更にPBSでの3回の洗浄が行われた。固定され、透過処理された細胞は、1%ウシ血清アルブミン(BSA)もしくは二次抗体が作成された種からの4%血清(ヤギ、ロバ、もしくはウサギ)のいずれかでブロッキングされた。使用された一次および二次抗体は、表V A-Bに記載されている。コントロール試料は、一次抗体が除外された反応、あるいは一次抗体が一次抗体と同じ濃度に相当する免疫グロブリンで置き換えられた反応が含まれた。染色された試料は、核の対比染色のための二塩酸ジアミジノ-2-フェニルインドール(diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)(DAPI)を含むPROLONG(登録商標)抗退色剤(Invitrogen,CA)で洗浄された。画像はNikon Confocal Eclipse C-1倒立顕微鏡(Nikon、Japan)と60xの対物レンズを用いて得られた。増殖期の間、大部分の細胞が平滑筋アクチン、ネスチン、ビメンチン、βIIIチューブリン、およびGATA4に対して陽性に染色され(図5)、少数の細胞(5%未満)がGFAPに対して陽性に染色され、CK7もしくはCK19に陽性に染色された細胞は無かった。
<成人膵臓由来間質細胞のPCR解析>
RNAは、増殖培地で培養された9代継代細胞から抽出された。膵臓の発達に関わる重要遺伝子の発現について、ヒトの膵臓から採取されたRNAがポジティブコントロールとして使用され、骨髄由来間葉系細胞(メリーランド州のキャンブレックス(Cambrex,MD))がネガティブコントロールとして用いられた。
RNA試料は、エタノールを含む高塩濃度緩衝液の存在下でのシリカゲル膜(Rneasy Mini Kit、カリフォルニア州のキアゲン(Qiagen,CA))への結合によって精製され、混入物は洗い流された。RNAはカラムに結合させると同時にDNase I(Qiagen,CA)で15分間の処理により更に精製された。高品質RNAは、水で溶出された。収量と純度は、分光光度計のA260とA280の読み取りにより評価された。cDNAコピーは、ABI(カリフォルニア州のABI(ABI, CA)) high Capacity cDNA archive Kitを用いて、精製されたRNAから作成された。
特に明記しない限り、全ての試薬はApplied Biosystemsから購入された。リアルタイムPCR反応は、ABI PRISM(登録商標) 7000 Sequence Detection Systemを用いて実施された。TAQMAN(登録商標) UNIVERSAL PCR MASTER MIX(登録商標)(ABI、CA)が総反応体積20μL中に20ngの逆転写されたRNAと共に用いられた。ピペット操作によるエラーを補正するため、各cDNA試料は二つ組で(試験が)実施された。プライマーとFAM標識されたTAQMAN(登録商標)プローブは200nMの濃度で用いられた。各標的遺伝子の発現レベルは、展開前のApplied Biosystemの18SリボゾームRNAもしくはヒトのグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素(GAPDH)内在性コントロールキットを用いて標準化された。プライマーとプローブは、いずれもABI PRISM PRIMER EXPRESS(商標)ソフトウェアを用いて設計されたか、または展開前のABI gene analysis Kitが用いられた。各遺伝子について、プライマーもしくはプローブのいずれか一つは、エクソンの境界に及ぶように設計された。これは、存在する任意のゲノムDNAへのプライマー/プローブの結合の可能性を排除した。プライマーとプローブのセットを以下に列挙する。Nkx2.2(Hs00159616)、Pdx-1(Hs00426216)、Nkx6.1(Hs00232355)、Ngn3(Hs00360700)、Pax4(Hs00173014)、Pax6(Hs00240871)、インスリン(Hs00355773)、Glu2(Hs00165775)、グルカゴン(Hs00174967)、Isl-1(Hs00158126)、ソマトスタチン(Hs00174949)、FoxA2(Hs00232764)、HlxB9(Hs00232128)、GATA-4(Hs00171403)、GFAP(Hs00157674)、MAP2(Hs00159041)、Olig2(Hs00377820)およびOct-4(CGACCATCTGCCGCTTTGAG(SEQ ID NO:1)とCCCCCTGTCCCCCA TTCCTA(SEQ ID NO:2))、Rex-1(CAGATCCTAAACAGCTCGCAGAAT(SEQ ID NO:3)ならびにGCGTACGCAAATTAAACTCCAGA(SEQ ID NO:4))。最初の50℃2分間、および95℃10分間の後、試料は95℃15秒の変性ステップ後、60℃1分間のアニーリング・伸長ステップの2ステップを40サイクル行った。データ解析はGENEAMP(登録商標)7000 Sequence Detection Systemソフトウェアを用いて行われた。各プライマー・プローブセットに対して、Ct値は蛍光強度が増幅の指数関数的部分の中央の特定の値に達した時点のサイクル数として決定された。相対的遺伝子発現レベルは、比較Ct法を用いて計算された。簡潔に述べると、各cDNA試料について、内在性コントロールCt値を目的の遺伝子のCtから差し引いて、デルタCt値(ΔCt)を求める。標準化された標的値は、100%の効率で増幅されたと仮定して、2-ΔCtとして計算された。最後に、データは較正試料に対して相対的に表現された。比較Ct法は、標的と内因的コントロールの増幅効率がおよそ等しい場合のみに有効である。従って、各プライマー・プローブセットについて連続希釈したcDNA試料によって予備的な検証実験を行い、ΔCt値が求められた。これらのΔCt値は、増幅効率が等しい場合には希釈範囲にわたって一定のままである。
<分化プロトコル>
1x104細胞/cm2の13代継代成人膵臓由来間質細胞は、24ウェルのプレート(カリフォルニア州のコーニング(Corning,CA))に播種され、5%CO2インキュベーター中、37℃の標準的条件下の増殖培地で100%コンフルエントまで培養された。その後、細胞は10μMのMG132(カリフォルニア州のEMD(EMD,CA))を含むDMEM(1000mg/L D-グルコース)中で24時間培養された。細胞はPBSで1回洗浄され、1xB27(カリフォルニア州のギブコ(Gibco,CA))および1xN2(Gibco,CA)を添加したDMEM(1000mg/L D-グルコース)中で培養され、更に5日間、シクロパミン(10μM; EMD,CA)、bFGF(20ng/mL;ミネソタ州のR&Dシステム(R&D Systems,MN))、アクチビンA(20nM; R&D Systems,MN)もしくはFGF5(20ng/mL; R&D Systems,MN)が添加された。RNAが細胞から採取され、実施例7に概略が説明された方法でPDX-1とインスリンの発現について解析された。これらの培養条件は、PDX-1の発現を誘導したが、インスリンは誘導しなかった。
<成人膵臓由来間質細胞の凍結保存>
実施例1で述べられた方法に従って単離された成人膵臓由来間質細胞は目的とする継代数で回収され、1から2mLの90%FBS(ユタ州のハイクローン(HyClone,UT))と10%DMSO(Sigma,MO)に1から5x106細胞/mLの濃度で再懸濁された。細胞懸濁液は低温用バイアル(ニューヨーク州のコーニング(Corning,NY))に小分注され、Nalgene Cryo 1℃ Freezing Containerに移され、最低4時間−80℃の冷凍庫に置かれた。バイアルは−80℃から取り出され、必要とされるまで液体窒素貯蔵タンクの気相に移された。細胞は液体窒素貯蔵タンクの気相から低温用バイアルを取り出して、直ちに37℃の水浴に移し、1、2分間または小さな氷の結晶が残るのみになるまで解凍された。細胞は培地で洗浄され、上述の実施例で述べられたように37℃の培養中に置かれた。細胞はその後必要に応じて継代された。図21に示されたデータは、凍結保存が増殖能(expansion porential)と増殖速度(growth rate)にほとんど影響しないことを示した。
<成人膵臓由来間質細胞の増殖に対する栄養枯渇の影響>
実施例1で述べられた方法に従って単離された成人膵臓由来間質細胞は様々な培養条件に供され、その後の細胞増殖動態に対するこれらの条件の影響が評価された。膵島が欠乏した腺房に富んだ画分から単離された細胞、H8F5は、DMEM、5.5mMグルコース(Invitrogen,CA)、10%FBS(HyClone,UT)、2mM Glutamax、25mM HEPES、および1xAB/AM(Invitrogen,CA)で培養された。ある培養では、細胞は、コンフルエンスに達した8日目まで、新鮮な培地を2から3日ごとに与えられた。細胞はその後、細胞が培養フラスコ内でコンフルエンスに達する、週に1度継代された。第二の培養では、細胞はより頻繁に再度培地が交換される場合と比較して、より程度が低い細胞の接着と増殖を引き起こした、培地交換前に7日間増殖させた。この培養は、細胞が継代されたフラスコへの播種後12日までコンフルエンスに達しなかった。従って、両方の細胞は2、3日毎に培地が交換され、コンフルエンスに達したら継代された。細胞は各継代時に計数され、推定細胞数が最初にフラスコに播種された細胞数と回収された細胞数とから計算された。
<本発明の成人膵臓由来間質細胞の典型的集団の細胞遺伝子型解析>
細胞遺伝子型解析を行った13代継代の成人膵臓由来間質細胞は、CFR Title 21、Part 58に説明された食品医薬品局安全性試験実施基準に従って実施された。細胞は単層でT-75組織培養フラスコ中で、DMEM、5.5mMグルコース(Invitrogen,CA)、10%FBS(HyClone,UT)、2mM Glutamax、25mM HEPESおよび1xAB/AM(Invitrogen,CA)で増殖させられた。培養物に適量の有糸分裂細胞があると判断されたら、染色体の収集が行われた。細胞はコルセミド(0.02から0.03μg/mL)で2から18時間、37℃で処理された。その後、細胞はトリプシン処理され、200xgで6から7分間遠心され、上清が除かれた。
解析された100の中期細胞で認められた染色体数の分配が表XIIに示されている。染色体数は、中期当たり最頻染色体数が46で、45から46染色体の範囲だった。解析された1000細胞あたり、6細胞の倍数性中期(0.6%)が認められた。
解析された100の中期細胞の染色体異常データは、表XIIIに要約されている。細胞遺伝子型データは、異常が解析された細胞総数、異常細胞の総数、および異常の総数を含んだ。解析された100細胞中、染色体異常は認められなかった。
五つの核型が準備された(ヒト核型#1から#5)。細胞遺伝子型解析は、細胞系統がヒト由来であることを示している(図23から27を参照)。XおよびY染色体がそうであったように、正常な常染色体は全ての核型に存在した。識別不能な全ての染色体と再編成は、識別不能染色体(UC)として分類された。解析された5つの核型中、2つが核型あたり一つのUCを含んでいた。
<ヒト膵臓の画分3、4、および5由来の成人膵臓由来間質細胞のマイクロアレイ解析>
ヒト膵臓H5系統は、実施例1に概略が説明された方法に従って処理された。膵島に富む画分(画分3)、腺管に富む画分(画分4)、外分泌腺に富む画分(画分5)から単離された6〜8代継代の細胞は遺伝子発現プロファイリングに用いられた。ヒトH5細胞系統(画分3、4、および5)、ならびにヒト膵臓RNA(アンビオン(Ambion))から、RNeasy mini kit(キアゲン(Qiagen))を用いて総RNAが単離された。試料調製、ハイブリダイゼーション、および画像解析は、CodeLink(商標) System(GEヘルスケア(GE Healthcare)、ニュージャージー州のアマシャム・バイオサイエンス(Amersham Biosciences,NJ))に従って実施された。Codelink(商標) Human Whole Genomeアレイが用いられた。標的遺伝子の転写産物にわたり保存されたエクソンに対して設計された、約55,000の30merのプローブから成っている。チップは〜45000の独立Unigene IDを含む。標準化と対数変換の後、OmniViz(登録商標)ソフトウェア(MA)とGENESIFTER(ワシントン州のビズ・エックス・ラボ(VizXLabs, WA))を用いてデータ解析が行われた。クロスサンプル標準化に伴う分散安定化変換が、対数変換されたアレイデータセットに適用された。ピアソンの相関係数を用いて、各細胞系統内と異なる細胞系統内の分散(variability)が比較された。各細胞系統について、三つの生物学的複製と、二つの技術的複製が用いられた。解析された全試料で、細胞系統内の相関係数は系統間の比較より高かった。異なる細胞系統間の遺伝子発現プロファイルの変動が図28に示されている。細胞の種類の間での遺伝子発現の有意差は、分散の解析と補正P値<0.05のF検定を用いて評価された。表XIV〜XVIは、様々な細胞系統の間で少なくとも5倍発現が異なる遺伝子を記載している。
<二つの典型的ドナー膵臓由来の成人膵臓由来間質細胞のマイクロアレイ解析。>
ヒトの二つのドナー膵臓が、実施例1に概略が説明された方法に従って処理された。膵島に富む画分(画分3)から単離された9〜11代継代の成人膵臓由来間質細胞が遺伝子発現プロファイリングに用いられた。RNeasy mini kit(キアゲン(Qiagen))を用いて総RNAが細胞から単離された。製造業者のプロトコル(カリフォルニア州のアフィメトリックス(Affymetrix,CA))に従って、RNAが精製され、cRNAが標識され、断片化された。標識されたcRNAは、Affymetrix GeneChip AnalyzerでスキャンされるU133 2.0 plus Affymetrixヒト遺伝子チップにハイブリダイズされた。各細胞系統について、三つの生物学的複製と、二つの技術的複製が用いられた。データはOmniViz(登録商標)ソフトウェア(MA)とGENESIFTER(VizXLabs, WA)を用いてデータ解析された。H8の複製間の平均相関係数は、0.893(0.892〜0.895、n=3)で、H9の複製間では0.906(0.903〜0.909、n=3)だった。H8F3細胞とH9F3細胞間の遺伝子発現プロファイルを比較する散布図が、図29に示されている。表XVIIおよびXVIIIは、Affymetrixソフトウェアで本細胞に割り当てられた遺伝子を記載している。
(1) 成人膵臓由来間質細胞において、
実質的に純粋な集団である、成人膵臓由来間質細胞。
(2) 実施態様1に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
前記細胞集団は、NCAM、ABCG2、サイトケラチン7、サイトケラチン8、サイトケラチン18、もしくはサイトケラチン19からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質マーカーの発現が実質的に陰性である、成人膵臓由来間質細胞の集団。
(3) 実施態様1に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
前記細胞集団は、CD44、CD73、CD90、もしくはCD105からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質マーカーの発現が実質的に陽性である、成人膵臓由来間質細胞の集団。
(4) 実施態様1に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
インビトロで増殖(propagate)可能な、成人膵臓由来間質細胞の集団。
(5) 実施態様4に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
低酸素条件で増殖可能な、成人膵臓由来間質細胞の集団。
β細胞系統の特徴を示す細胞へ分化可能な、成人膵臓由来間質細胞の集団。
(7) 実施態様1に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質を過剰発現するよう遺伝子操作された、成人膵臓由来間質細胞の集団。
(8) 実施態様1に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質発現が減少するよう遺伝子操作された、成人膵臓由来間質細胞の集団。
(9) 実施態様2に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質が過剰発現するよう遺伝子操作された、成人膵臓由来間質細胞の集団。
(10) 実施態様2に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質発現を減少するよう遺伝子操作された、成人膵臓由来間質細胞の集団。
タンパク質を過剰発現するよう遺伝子操作された、成人膵臓由来間質細胞の集団。
(12) 実施態様3に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質発現を減少するよう遺伝子操作された、成人膵臓由来間質細胞の集団。
(13) 実施態様1に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(14) 実施態様2に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(15) 実施態様3に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(17) 実施態様2に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(18) 実施態様3に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(19) 実施態様1に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(20) 実施態様2に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(22) 実施態様7に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(23) 実施態様8に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(24) 実施態様9に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(25) 実施態様10に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(27) 実施態様12に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(28) 実施態様7に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(29) 実施態様8に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(30) 実施態様9に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(32) 実施態様11に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(33) 実施態様12に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(34) 実施態様7に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(35) 実施態様8に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(37) 実施態様10に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(38) 実施態様11に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(39) 実施態様12に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
a.前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
c.前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
e.前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
(40) ほ乳類の膵臓由来の間質細胞中に濃縮された細胞集団取得の方法において、
a.前記ほ乳類膵臓から膵臓細胞を単離する段階と、
b.前記細胞を、血清および約30mM未満の濃度でグルコースを添加した基礎栄養培地中で培養する段階と、
c.前記細胞を、前記培地で少なくとも約2週間増殖(grow)させ、それによって間質細胞が濃縮された細胞集団を取得する段階と、
を含む、方法。
前記血清濃度は、ほぼ5%未満である、方法。
(42) 実施態様40に記載の方法において、
前記細胞集団は、NCAM、ABCG2、サイトケラチン7、サイトケラチン8、サイトケラチン18、もしくはサイトケラチン19からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質マーカーの発現が実質的に陰性である、方法。
(43) 実施態様40に記載の方法において、
前記細胞集団は、CD44、CD73、CD90、もしくはCD105からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質マーカーの発現が実質的に陽性である、方法。
(44) 実施態様40に記載の方法において、
前記細胞集団中の前記間質細胞は、インビトロで増殖可能である、方法。
(45) 実施態様40に記載の方法において、
前記細胞集団中の前記間質細胞は、β細胞系統の特徴を示す細胞へ分化可能である、方法。
a.前記間質細胞をCD44、CD73、CD90、もしくはCD105からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質マーカーに基づいて選択し、単離する段階、
を更に含む、方法。
(47) ほ乳類の膵臓由来の成人膵臓由来間質細胞の純粋集団取得の方法において、
a.前記ほ乳類膵臓から膵臓細胞を単離する段階と、
b.前記細胞を、血清および約30mM未満の濃度でグルコースを添加した基礎栄養培地中で培養する段階と、
c.成人膵臓由来間質細胞を濃縮させた細胞集団を得るために、前記細胞を、前記培地で少なくとも約2週間増殖させる段階と、
d.前記成人膵臓由来間質細胞で特異的に発現されるタンパク質マーカー特異的な薬剤に特異的に結合する細胞を単離し、その結果として成人膵臓由来間質細胞の純粋集団を取得する段階と、
を含む、方法。
(48) 実施態様47に記載の方法において、
前記血清濃度は、ほぼ5%未満である、方法。
(49) 実施態様47に記載の方法において、
前記タンパク質マーカーは、CD44、CD73、CD90、もしくはCD105からなる群から選択される、方法。
(50) 実施態様47に記載の方法において、
前記細胞集団は、NCAM、ABCG2、サイトケラチン7、サイトケラチン8、サイトケラチン18、もしくはサイトケラチン19からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質マーカーの発現が実質的に陰性である、方法
前記細胞集団は、インビトロで増殖可能である、方法。
(52) 実施態様47に記載の方法において、
前記細胞集団は、低酸素条件で増殖可能である、方法。
(53) 実施態様47に記載の方法において、
前記細胞集団は、β細胞系統の特徴を示す細胞へ分化可能である、方法。
(54) β細胞系統の特徴を示す細胞取得の方法において、
ほ乳類膵臓由来の成人膵臓由来間質細胞の実質的に純粋な集団を取得する段階と、
前記成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統の特徴を示す細胞への分化を誘導する有効量の薬剤で前記成人膵臓由来間質細胞を処理する段階と、
を含む、方法。
(55) 実施態様54に記載の方法において、
前記成人膵臓由来間質細胞の集団は、
a.前記ほ乳類膵臓から膵臓細胞を単離する段階、
b.前記細胞を、血清および約30mM未満の濃度でグルコースを添加した基礎栄養培地中で培養する段階、
c.成人膵臓由来間質細胞を濃縮させた細胞集団を得るために、前記細胞を、前記培地で少なくとも約2週間増殖させる段階、ならびに、
d.前記成人膵臓由来間質細胞で特異的に発現されるタンパク質マーカー特異的な薬剤に特異的に結合する細胞を単離し、その結果として成人膵臓由来間質細胞の純化された集団を取得する段階、
によって得られる、方法。
前記血清濃度は、ほぼ5%未満である、方法。
(57) 実施態様54に記載の方法において、
成人膵臓由来間質細胞の前記集団は、分化を誘導するための処理前に培養液中で増殖(expand)される、方法。
(58) 実施態様54に記載の方法において、
β細胞系統の特徴を示す細胞は、インスリン産生細胞である、方法。
(59) 糖尿病もしくは糖尿病発症の恐れがある患者の治療の方法において、
(a)ドナーの膵臓組織から成人膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
(b)前記成人膵臓由来間質細胞を前記患者に移植する段階と、
を含み、
前記成人膵臓由来間質細胞は、膵臓ホルモン産生細胞に分化する、方法。
(60) 実施態様59に記載の方法において、
前記患者は、膵臓組織のドナーである、方法。
前記膵臓ホルモン産生細胞は、インスリン産生細胞である、方法。
(62) 糖尿病もしくは糖尿病発症の恐れがある患者の治療の方法において、
(a)ドナーの膵臓組織から成人膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
(b)前駆細胞を作成するために前記間質細胞を生体外で増殖させる段階と、
(c)前記前駆細胞を前記患者に移植する段階と、
を含み、
前記前駆細胞は、膵臓ホルモン産生細胞に分化する、方法。
(63) 実施態様62に記載の方法において、
前記膵臓ホルモン産生細胞は、インスリン産生細胞である、方法。
(64) 実施態様62に記載の方法において、
前記患者は、前記膵臓組織のドナーである、方法。
(65) 糖尿病もしくは糖尿病発症の恐れがある患者の治療の方法において、
(a)ドナーの膵臓組織から成人膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
(b)成人膵臓由来間質細胞の前記集団をインビトロで増殖させる段階と、
(c)増殖させた前記成人膵臓由来間質細胞を前記患者に移植する段階と、
を含み、
前記間質細胞は、膵臓ホルモン産生細胞に分化する、方法。
前記膵臓ホルモン産生細胞は、インスリン産生細胞である、方法。
(67) 実施態様65に記載の方法において、
前記患者は、前記膵臓組織のドナーである、方法。
(68) 糖尿病もしくは糖尿病発症の恐れがある患者の治療の方法において、
(a)ドナーの膵臓組織から成人膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
(b)成人膵臓由来間質細胞の前記集団をインビトロで増殖させる段階と、
(c)増殖させた前記成人膵臓由来間質細胞を膵臓β細胞系統に分化させる段階と、
(d)分化した前記細胞を前記患者に移植する段階と、
を含む、方法。
(69) 実施態様68に記載の方法において、
前記膵臓β細胞系統細胞は、インスリン産生細胞である、方法。
(70) 実施態様68に記載の方法において、
前記患者は、前記膵臓組織のドナーである、方法。
(a)ドナーの膵臓組織から成人膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
(b)ドナーから成熟膵島を得る段階と、
(c)前記成人膵臓由来間質細胞、および前記膵島の両方を前記患者に移植する段階と、
を含み、
前記膵島は、前記患者における前記成人膵臓由来間質細胞の生存および機能を増進する、方法。
(72) 実施態様71に記載の方法において、
前記成熟膵島の前記ドナーは、前記患者に対して同種異系もしくは異種である、方法。
(73) 糖尿病もしくは糖尿病発症の恐れがある患者の治療の方法において、
(a)ドナーの膵臓組織から成人膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
(b)ドナーから成熟膵島を得る段階と、
(c)前記成人膵臓由来間質細胞、および前記膵島の両方を前記患者に移植する段階と、
を含み、
前記成人膵臓由来間質細胞は、前記患者における前記膵島の生存および機能を増進する、方法。
(74) 実施態様73に記載の方法において、
前記成熟膵島の前記ドナーは、前記患者に対して同種異系もしくは異種である、方法。
(75) 実施態様59、62、65、68、71もしくは73のいずれか一つに記載の方法において、
前記患者に移植された前記細胞の生存および機能を促進する医薬的担体もしくは生体活性剤を前記患者に投与する段階、
をさらに含み、
前記担体もしくは薬剤は、前記患者への前記細胞の前記移植の前、前記移植の後、もしくは前記移植と同時に、投与される、方法。
前記患者に移植される前記細胞は、ポリマー支持材に取り込まれている、方法。
(77) 実施態様76に従う前記方法において、
前記ポリマー支持材は、前記患者において前記細胞の生存および機能を促進する医薬的担体もしくは生体活性剤をも担持(load)している、方法。
Claims (25)
- 成体膵臓由来間質細胞の集団において、
前記細胞は、NCAM、ABCG2、サイトケラチン7、サイトケラチン8、サイトケラチン18、サイトケラチン19、CD117,CD133、CD45、CD49f、EpCAM、HGF、PECAM、サイトケラチン5,6,10,13,14,15,16、GFAP、MHCおよびペリフェリンの発現について陰性であり、かつ、アルカリホスファターゼ、CD105、CD44、CD73、CD90、CD95、CD151、α−平滑筋アクチン、βIIIチューブリン、ビメンチンおよびネスチンの発現について陽性である、
成体膵臓由来間質細胞の集団。 - 請求項1に記載の成体膵臓由来間質細胞の集団において、
インビトロで増殖可能な、成体膵臓由来間質細胞の集団。 - 請求項2に記載の成体膵臓由来間質細胞の集団において、
低酸素条件で増殖可能な、成体膵臓由来間質細胞の集団。 - 請求項1に記載の成体膵臓由来間質細胞の集団において、
β細胞系統の特徴を示す細胞へ分化可能な、成体膵臓由来間質細胞の集団。 - 請求項1または2に記載の成体膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質を過剰発現するよう遺伝子操作された、成体膵臓由来間質細胞の集団。 - 請求項1または2に記載の成体膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質発現が減少するよう遺伝子操作された、成体膵臓由来間質細胞の集団。 - 請求項1,5または6に記載の細胞を用いた、成体膵臓由来間質細胞のβ細胞系統の細胞への分化誘導が可能な薬剤のスクリーニング方法において、
a.前記成体膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成体膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
c.前記成体膵臓由来間質細胞を、細胞の前記β細胞系統の細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞を、前記薬剤を用いてインキュベーションする段階と、
e.前記成体膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
f.前記薬剤によるインキュベーションの前または後に、前記成体膵臓由来間質細胞中の前記膵臓マーカーの発現レベルを比較する段階と、
を含む、薬剤のスクリーニング方法。 - 請求項1,5または6に記載の成体膵臓由来間質細胞における遺伝子またはタンパク質の発現の変更が可能な薬剤のスクリーニング方法において、
a.前記成体膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
b.前記成体膵臓由来間質細胞における遺伝子またはタンパク質の発現レベルを測定する段階と、
c.前記成体膵臓由来間質細胞を、遺伝子またはタンパク質の発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
d.前記細胞を、前記薬剤を用いてインキュベーションする段階と、
e.前記成体膵臓由来間質細胞における遺伝子またはタンパク質の発現レベルを測定する段階と、
f.前記薬剤による前記成体膵臓由来間質細胞のインキュベーションの前または後に、前記成体膵臓由来間質細胞中の前記遺伝子またはタンパク質の発現レベルを比較する段階と、
を含む、薬剤のスクリーニング方法。 - ヒトの膵臓由来の間質細胞中に濃縮された細胞集団取得の方法において、
a.前記ヒトの膵臓から膵臓細胞を単離する段階と、
b.前記細胞を、血清および約30mM未満の濃度でグルコースを添加した、基礎栄養培地中で培養する段階と、
c.前記細胞を、前記培地で約2週間増殖させ、それによって間質細胞が濃縮された細胞集団を取得する段階と、
を含み、
前記細胞の集団は、請求項1〜6のいずれか1項に記載の成体膵臓由来間質細胞である、
方法。 - 請求項9に記載の方法において、
前記血清濃度は、ほぼ5%未満である、方法。 - 請求項9に記載の方法において、
前記細胞集団中の前記間質細胞は、インビトロで増殖可能である、方法。 - 請求項9に記載の方法において、
前記細胞集団中の前記間質細胞は、β細胞系統の特徴を示す細胞へ分化可能である、方法。 - 請求項9に記載の方法において、前記成体膵臓由来間質細胞で特異的に発現されるタンパク質マーカーに特異的な薬剤に特異的に結合する細胞を単離し、その結果として成体膵臓由来間質細胞の純化された集団を取得する段階dをさらに含む、方法。
- 請求項13に記載の方法において、
前記血清濃度は、ほぼ5%未満である、方法。 - 請求項13に記載の方法において、
前記細胞集団は、インビトロで増殖可能である、方法。 - 請求項13に記載の方法において、
前記細胞集団は、低酸素条件で増殖可能である、方法。 - 請求項13に記載の方法において、
前記細胞集団は、β細胞系統の特徴を示す細胞へ分化可能である、方法。 - β細胞系統の特徴を示す細胞取得の方法において、
ヒトの膵臓由来の成体膵臓由来間質細胞の純化された集団を取得する段階と、
β細胞系統の特徴を示す細胞への前記成体膵臓由来間質細胞の分化を誘導する有効量の薬剤で、請求項1〜6のいずれか1項に記載の成体膵臓由来間質細胞を処理する段階と、
を含む、方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記成体膵臓由来間質細胞の集団は、
a.前記ヒトの膵臓から膵臓細胞を単離する段階、
b.前記細胞を、血清および約30mM未満の濃度でグルコースを添加した、基礎栄養培地中で培養する段階、
c.間質細胞を濃縮させた細胞集団を得るために、前記細胞を、前記培地で約2週間増殖させる段階、ならびに、
d.前記成体膵臓由来間質細胞で特異的に発現されるタンパク質マーカーに特異的な薬剤に特異的に結合する細胞を単離し、その結果として成体膵臓由来間質細胞の純化された集団を取得する段階、
を含む方法によって得られる、方法。 - 請求項19に記載の方法において、
前記血清濃度は、ほぼ5%未満である、方法。 - 請求項18に記載の方法において、
膵臓からの成体膵臓由来間質細胞の前記集団は、分化を誘導するための処理前に培養液中で増殖される、方法。 - 請求項18に記載の方法において、
β細胞系統の特徴を示す細胞は、インスリン産生細胞である、方法。 - 糖尿病もしくは糖尿病発症の恐れがある患者の治療のための医薬品の製造における、請求項1〜6のいずれか1項に記載の成体膵臓由来間質細胞および膵島の使用において、前記間質細胞および膵島が、
(a)ドナーの膵臓組織から成体膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
(b)ドナーから成熟膵島細胞を取得する段階と、
を含み、前記成体膵臓由来間質細胞と膵島との両方を前記患者に移植すると、
(i)前記膵島が、前記患者中の前記成体膵臓由来間質細胞の生存および機能を促進し、
(ii)前記成体膵臓由来間質細胞が、前記患者中の前記膵島の生存および機能を促進する、
方法によって取得される、使用。 - 請求項23に記載の使用において、
前記膵臓β細胞系統細胞は、インスリン産生細胞である、使用。 - 請求項23に記載の使用において、
前記成熟膵島の前記ドナーは、前記患者に対して、同種異系もしくは異種である、使用。
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