JP2008531061A

JP2008531061A - 成人膵臓由来間質細胞

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Inventors: オーネイル・ジョン; シュー・ジーン; アリレザ・レザニア
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Abstract

【課題】臨床的必要性に対応して、患者に移植可能で、インビトロで増殖可能で、且つ後期継代でもβ細胞系統への分化能も維持する成人膵臓由来細胞系統樹立のための、膵臓からの細胞単離方法と培養条件を提供する。
【解決手段】膵臓組織からの膵臓間質細胞単離の方法を提供する。本発明に従って単離された膵臓間質細胞は、インビトロで増殖し、膵臓β細胞系統の細胞に分化することが可能である。単離された膵臓間質細胞は、移植を必要とする患者に移植するための、完全に、もしくは部分的に分化した膵臓細胞にインビトロで分化を誘導可能である。あるいは、単離された膵臓間質細胞は、移植を必要とする患者に直接移植され、インビトロで目的の細胞タイプに分化することも可能である。
【選択図】図１

Description

開示の内容

〔発明の分野〕
本発明は、β細胞系統に分化され得る成人膵臓由来細胞の増殖可能な集団に関する。本発明は、そのような成人膵臓細胞の単離および増殖のための方法と、このような細胞を糖尿病の治療に利用するための関連する方法および組成も提供する。

〔発明の背景〕
臓器機能の喪失は、先天性欠損症、損傷または疾患に起因する場合がある。臓器機能の喪失の原因となる疾患の例の一つは糖尿病（diabetes mellitusまたはdiabetes）である。糖尿病の大部分の症例は、若年発症糖尿病もしくはインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）としても知られる１型と、成人発症型糖尿病としても知られる２型の二つの臨床型に該当する。それぞれの型は、異なる予後、治療および原因がある。双方の種類は、患者の血糖値の調節能の喪失を特徴とする。結果として、代謝要求に見合うようにグルコースが細胞内に入ることができないため、血糖値が上昇する。この適切な血糖代謝の不能は、例えば、高血糖、異常な空腹感、口渇、多尿症、糖尿（glycouria）に始まり、その後例えば、神経障害、大血管疾患（macro-vascular disease）、および微小血管疾患（micro-vascular disease）に発展する、複雑な一連の初期および後期の総合的症状を引き起こす。

１型糖尿病の一般的な治療方法は、一般的に注射器もしくはポンプでの注射による外因性のインスリン投与を必要とする。この方法は完全には血糖値を正常化せず、しばしば低血糖症の危険を伴う。更に効果的な血糖コントロールは、移植または細胞に基づく治療によって膵臓の機能が復元または回復され得るなら達成され得る。

胎児または胚の組織由来の前駆細胞は膵臓ホルモン産生細胞への分化能をもつことが証明されている。例えば、ヒト胎児および胚に由来する細胞のβ細胞系統への分化能を報告している米国特許第６，４３６，７０４号、国際公開番号第ＷＯ０３／０６２４０５号、国際公開番号第ＷＯ０２／０９２７５６号、欧州特許第０３６３１２５Ａ２号を参照。しかし、これらの発表から、ヒト胚細胞はしばしば増殖に支持細胞層と多分化能の維持が必要であり、細胞の容易なスケールアップと最終的な糖尿病の細胞治療が可能でないことに気づくのは重要である。

成人組織由来の前駆細胞が膵臓β細胞表現型に分化可能であることも実証されている。例えば、成人骨髄由来細胞（間葉細胞と造血細胞（hematopoetic cells））の、インビトロでの膵臓β細胞の特徴を備える細胞、もしくはインビボで損傷した膵臓の再生に役立つ栄養素を分泌する細胞への分化能を報告している、国際公開番号第ＷＯ２００４／０８７８８５Ａ２号、ヘスら（Hess et al.）(ネイチャー・バイオテクノロジー２１（Nature Biotechnology 21）, 763 770, 2003)、およびイアヌスら（Ianus et al.） (ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J. Clin. Invest.） 111: 843-850, 2003)を参照。

膵臓細胞に分化可能なその他の前駆細胞の供給源には、齧歯類の肝臓卵形幹細胞（国際公開番号第ＷＯ０３／０３３６９７号）と分娩後胎盤（米国公開出願第２００４／０１６１４１９Ａ１号）がある。

β細胞を含むランゲルハンス島の内分泌細胞は、アポトーシスと新しい膵島細胞の増殖（proliferation）（新生）の過程によって、常にターンオーバーしている。膵臓自体は、膵臓ホルモン産生細胞に分化可能な前駆細胞の供給源であると考えられている。膵臓前駆細胞の供給源となる可能性がある、膵臓から単離される３種類の異なる組織型である、膵島リッチ画分、腺管細胞リッチ画分、および腺房細胞リッチ画分がある。

前駆細胞または粗製膵臓組織抽出物から部分的に分化した細胞の単離は、細胞表面マーカーに対して作成した抗体を用いて実現される可能性もある。例えば、米国公開出願第２００４／０２４１７６１号は、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、Ｍｓｘ-２およびＰＤＸ-１に対して陽性（後述の、表Ｉの細胞１）でインスリン発現が陽性のマウス細胞の単離を公開している。

ゲルシェンゴルンら（Gershengorn et al.） (サイエンス（Science） 306: 2261-2264, 2004)は、膵島様の細胞凝集を形成することができる増殖型細胞の産生を説明している。この細胞は、単離されたインビトロのヒト膵島の培養から出現した接着細胞の不均一集団に由来した。単離されたランゲルハンス島は、最初に組織培養皿上に播種され、１０％の血清を含む培地で培養された。繊維芽様細胞が培養された膵島の外に遊走し、単層を形成するのが観察された。これらの細胞は、ネスチン、平滑筋アクチン、およびビメンチンを発現した（後述の表Ｉの細胞２）。

膵臓前駆細胞は、シーバーグら（Seaberg et al.） (ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology） 22: 1115 1124, 2004)に述べられたように、膵島と単細胞に分離させた腺管組織の培養から作成することもできる。シーバーグら（Seaberg et al.）により開示されたマウス前駆細胞は、増殖の間にネスチンを発現した（後述の表Ｉの細胞３）。

米国公開出願第２００３／００８２１５５号は、幹細胞の機能的分子的特徴を備えたヒト膵臓ランゲルハンス島由来の細胞集団の単離と同定の方法を公開している。特に、これらの細胞は、ネスチン染色陽性、ネスチン遺伝子発現、ＧＬＰ-１Ｒ染色陽性、ＧＬＰ-１Ｒ遺伝子発現、ＡＢＣＧ２染色陽性、ＡＢＣＧ２遺伝子発現、Ｏｃｔ３／４染色陽性、Ｏｃｔ３／４遺伝子発現、ラトロフィリン（タイプ２）染色陽性、ラトロフィリン（タイプ２）遺伝子発現、Ｈｅｓ-１染色陽性、Ｈｅｓ-１遺伝子発現、インテグリンサブユニットα６およびβ１染色陽性、インテグリンサブユニットα６およびβ１遺伝子発現、Ｃ-ｋｉｔ染色陽性、Ｃ-ｋｉｔ遺伝子発現、ＭＤＲ-１染色陽性、ＭＤＲ-１遺伝子発現、ＳＳＴ-Ｒ、２、３、４染色陽性、ＳＳＴ-Ｒ、２、３、４遺伝子発現、ＳＵＲ-１染色陽性、ＳＵＲ-１遺伝子発現、Ｋｉｒ６．２染色陽性、Ｋｉｒ６．２遺伝子発現、ＣＤ３４染色陰性、ＣＤ４５染色陰性、ＣＤ１３３染色陰性、ＭＨＣクラスＩ染色陰性、ＭＨＣクラスＩＩ染色陰性、サイトケラチン１９染色陰性、培養中での長期間の増殖、および培養中での偽膵島への分化能を特徴とする（後述の表Ｉの細胞４）。

米国特許第５，８３４，３０８号、米国特許第６，００１，６４７号、および米国特許第６，７０３，０１７号で述べられたように、別のアプローチでは、増殖中の培養として１年以上維持可能で、インスリンの分泌が可能な膵島様の集団への分化能を示すようにみえる、ＮＯＤマウス由来の膵島培養の粗製標品が、上皮様培養の樹立に用いられる場合もある（後述の表Ｉの細胞５）。

膵島様構造は、ボナー−ワイアーら（Bonner-Weir et al.） (プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc Nat Acad Sci） 97: 7999-8004, 2000)と米国特許第６，８１５，２０３Ｂ１号に述べられたように、腺管組織が濃縮され消化されたヒト膵臓の画分から作成される場合もある。膵島様集団は、サイトケラチン１９に対して陽性に染色され、またインスリンに対して免疫活性を示すことがこれらの発表で開示された（後述の表Ｉの細胞６）。

国際公開番号第ＷＯ２００４／０１１６２１号は、ヒト膵臓腺管断片からのインスリン陰性の接着細胞の作成を公開している（後述の表Ｉの細胞７）。

国際公開番号第ＷＯ０３／１０２１３４号は、ヒト膵臓消化物の腺房画分からのサイトケラチン１９陽性上皮細胞の作成を公開している。作成された細胞は、誘導培地の存在下で、制限された増殖能、およびインスリン産生細胞への制限された分化能を有する。（後述の表Ｉの細胞８。）

米国公開出願第２００４／０１５８０５Ａ１号は、ヒト膵臓幹細胞の小集団が細胞表面マーカーＣＤ５６（ＮＣＡＭとしても知られる）に対するリガンドを用いて単離され得ることを報告している。これらの細胞は、インスリン産生細胞とインスリン産生凝集体へ分化することができる（後述の表Ｉの細胞９）。

従って、後期継代でもβ細胞系統への分化能を維持する一方で、現在の臨床的必要性に対応するために増殖可能な、成人膵臓由来細胞系統樹立のための培養条件開発の重大な必要性が依然として残っている。

〔発明の概要〕
本発明は、β細胞系統の特性を有する細胞への分化能を維持したままでの成人膵臓由来細胞集団の単離、および約２０集団倍加までの細胞集団の増殖のための方法を目的とする。あるいは、β細胞系統の特性を有する細胞への分化能を維持したままでの、約５０集団倍加まで、もしくは約７０集団倍加まで細胞集団が増殖する場合もある。

ある実施形態において、本発明は、ほ乳類成人膵臓由来間質細胞の単離のための方法を提供する。本発明に従い、膵臓細胞は、分化した膵臓細胞と未分化の膵臓間質細胞を含む膵臓組織の消化物から得られる。間質細胞を選別し濃縮するために、膵臓組織の消化物から得た細胞を、５％未満の血清と３０ｍＭ未満の濃度のグルコースとを含む栄養豊富な培地である選択培地で培養する。グルコースの範囲はより少なくてもよく、例えば６ｍＭ以下の場合もある。培養はそのまま約２週間から約４週間、培地を交換せずに細胞が培養基質に接着するまで放置される。

選択と細胞接着の最初の段階の後、選択培地を１％より大きく２０％未満の濃度の血清と、３０ｍＭ未満の濃度のグルコースとを含む栄養豊富な増殖培地に切り換えても良い。

結果として得られる細胞集団は、成人膵臓由来間質細胞が濃縮されている。このような間質細胞集団は、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１８４、ＮＣＡＭ、ＡＢＣＧ２、サイトケラチン７、８、１８もしくは１９のマーカーのうち少なくとも一つが実質的に陰性であり、β細胞系統の細胞への分化能を失わずに複数世代にわたって増殖することも可能である。

成人膵臓由来間質細胞が濃縮された細胞集団は、成人膵臓由来間質細胞を同定し、選択して、実質的に純粋な成人膵臓由来間質細胞の集団、つまり認識されたタンパク質マーカーが細胞集団の少なくとも５０％で発現されている集団を得るために、例えば、間質細胞が発現するタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば抗体）と接触させることもできる。

別の実施形態では、本発明は、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１８４、ＮＣＡＭ、ＡＢＣＧ２、サイトケラチン７、８、１８もしくは１９のマーカーのうち少なくとも一つに対して実質的に陰性である、単離された純粋な成人膵臓由来間質細胞の集団を提供する。

ある実施形態では、本発明に従って単離、増殖される成人膵臓由来間質細胞は、β細胞系統に細胞を分化させることができる薬剤のスクリーニングのためのインビトロアッセイに用いられる場合もある。

本発明に従って単離、増殖される成人膵臓由来間質細胞は、適切なインビトロもしくはインビボ条件下でβ細胞系統の細胞への分化を誘導される場合もある。あるいは、本発明に従って選択、増殖される成人膵臓由来間質細胞は、成人膵臓由来間質細胞由来の分化した細胞と同様に、１型糖尿病と２型糖尿病の治療に有用である。

〔発明の詳細な説明〕
限定の目的ではなく開示の明確化を目的として、発明の詳細な説明は、特定の特徴、実施形態もしくは本発明の応用を述べる、または示す以下の小区分に分割される。

〔定義〕
「膵臓由来細胞」とは、腺房細胞、腺管細胞、膵島細胞タイプに加え、間質細胞、星細胞、ニューロン、血管細胞、幹細胞、および前駆細胞といった支持細胞を含む、ほ乳類種由来の腎臓初代細胞もしくはほ乳類の膵臓より単離された初代細胞を指す。

「腺房細胞」とは、膵臓の細胞の約８０％を占める膵臓細胞を指し、アミラーゼ、リパーゼ、トリプシン、キモトリプシン、およびエラスターゼなどの多くの様々な酵素を産生する。

「腺管細胞」とは、膵臓の細胞の約１０％を占める膵臓細胞を指し、腺房からの膵臓酵素を排出する、より大きい小葉間腺管と小葉内管に加えて、最も小さい介在腺管を規定する。腺管細胞は、炭酸水素塩と、酵素を希釈する水も産生し、これらの管構造から腸への放出で腸のｐＨを変化させる。腺管細胞は、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）によって同定することもできる。

「膵島細胞」とは、膵臓の細胞の約１から２％を占める内分泌細胞を指し、様々なホルモンを作る様々な細胞タイプを含む膵島と呼ばれる特徴ある細胞凝集体として存在する。β細胞は膵島凝集体の約６０から８０％を占め、体内のほとんどの細胞へのグルコース移行を可能にするインスリンを分泌する。α細胞は膵島の約１０から３０％を占め、正常の血糖を維持するためにグルコースの肝臓からの放出を可能にする、飢餓の間に放出されるグルカゴンを分泌する。Δ細胞は膵島細胞の約５から１０％を占め、グルコース濃度を更に調節するソマトスタチンを分泌する。膵臓ポリペプチド産生細胞（膵島細胞の約５から１０％）は、外分泌機能と胃腸機能を変化させるホルモンを放出する。内皮細胞、神経細胞、および前駆細胞などといった、その他の膵島細胞タイプもある。

「膵臓由来間質細胞」とは、インビトロで増殖能があり、膵臓ホルモン産生細胞、膵島細胞、β細胞系統の細胞、もしくはβ細胞の特徴であるマーカーが一切欠如した、膵臓に由来する線維芽様細胞を指す。

「β細胞系統」とは、転写因子ＰＤＸ-１と、ＮＧＮ-３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ-１、ＨＮＦ-３ｂｅｔａ、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、およびＰａｘ６のうちの少なくとも一つの転写因子と、に対して陽性の遺伝子発現を示す細胞を指す。

「膵島様構造」とは、本発明の方法の実践によって得られる膵島の外観を示す三次元的な細胞集団を指す。膵島様構造の細胞は少なくともＰＤＸ-１遺伝子と、グルカゴン、ソマトスタチン、もしくはインスリンから選択された一つのホルモンと、を発現する。

「低酸素圧」の語は、１％以上で２０％未満、あるいは１０％未満、あるいは５％未満の酸素濃度を指す。

「正常酸素圧」の語は、約２０％の大気酸素濃度を指す。

「実質的に陽性」の語は、特定のマーカー（例えば、膜受容体、細胞質もしくは核タンパク質、または転写因子など）の発現と関連する細胞集団との繋がりで用いられた場合、マーカーが細胞集団全体の少なくとも約５０％、望ましくは少なくとも約６０％、より望ましくは少なくとも約７０％に存在もしくは発現されていることを意味する。

「実質的に陰性」の語は、特定のマーカー（例えば、膜受容体、細胞質もしくは核タンパク質、または転写因子など）の発現と関連する細胞集団との繋がりで用いられた場合、マーカーが細胞集団全体の約７０％、あるいは約８０％、あるいは約９０％に存在していない、もしくは発現していないことを意味する。

「実質的に純粋」の語は、細胞集団との繋がりで用いられた場合、目的の細胞が細胞集団全体の少なくとも約５０％、望ましくは少なくとも約６０％、より望ましくは少なくとも約７０％、そして最も望ましくは＞８０％を占めることを意味する。

本明細書で用いられる場合、「幹細胞」とは、インビボもしくは生体外で大規模に増殖可能であり、その他の細胞タイプに分化可能である未分化の細胞を指す。

「前駆細胞」とは、分化によって幹細胞に由来し、更により成熟した細胞タイプに分化可能な細胞を指す。前駆細胞は、幹細胞と比較して一般的により限られた増殖能を有する。あるいは、「前駆細胞」は完全に、もしくは部分的に分化した細胞の脱分化から生じる場合もある。

「増殖可能な集団」とは、細胞培養システムにおいて少なくとも約２０集団倍加、あるいは少なくとも約５０集団倍加、あるいは少なくとも約７０集団倍加までの、単離された細胞集団の増殖能を指す。

「未分化細胞」とは、膵臓から単離された細胞との繋がりで用いられた場合、ＰＤＸ-１もしくはインスリンの発現が実質的に陰性の膵臓由来細胞の集団を意味する。

「分化した細胞」とは、膵臓から単離された細胞との繋がりで用いられた場合、ＰＤＸ-１もしくはインスリンの発現が実質的に陽性の膵臓由来細胞の集団を意味する。

本明細書で用いられる場合、「マーカー」とは目的の細胞で特異的に発現されている核酸分子またはポリペプチド分子である。この背景において、特異的な発現とは陽性マーカーについてはマーカーのレベルの増大、陰性マーカーについてはマーカーのレベルの減少を意味する。検出可能なレベルのマーカー核酸もしくはマーカーポリペプチドは、当業者に知られる様々な任意の方法を用いて目的の細胞が特定され他の細胞と区別できるように、他の細胞と比較して目的の細胞内で十分に高レベルもしくは低レベルである。

「ネスチン」とは、Ｇｅｎｂａｎｋの受入番号Ｘ６５９６４に公開された配列を有する中間径フィラメントタンパク質、または自然に生じたその変異配列（例えば、対立遺伝子多型）を指す。

「βＩＩＩチューブリン」は、細胞形態の発生と維持、および膜系小器官の輸送といった様々な細胞質機能に関わる細胞骨格成分の一部である。βＩＩＩチューブリンは、神経細胞に存在することが示されている。

「ビメンチン」は、間充組織に由来する細胞の一般的なマーカーである細胞骨格の中間径フィラメントタンパク質である。

「ＡＢＣＧ２」とは、Ｇｅｎｂａｎｋの受入番号ＸＭ０３２４２４に公開された配列を有する、ＡＴＰ結合カセット多薬剤耐性トランスポーターＧ２（ATP-binding cassette multi-drug resistance transporter G2）、もしくは自然に生じたその変異配列（例えば、対立遺伝子多型）を指す。当業者は、ＡＢＣＧ２をコードするＤＮＡ配列は異なる可能性もあるが、コードされたアミノ酸配列は依然同一のままである、同等のものが存在することを認めるだろう。

「表面抗原分類」（ＣＤ）分子は、抗体の特異的なセットで認識されるため、細胞タイプ、分化段階、および細胞の活性状態の同定に用いられる細胞表面上のマーカーである。ＣＤマーカーの機能と意味は、技術的に十分確立されている。例として、白血球抗原実情調査書第２版，バークレーＡ．Ｎ．ら，アカデミック・プレス，ロンドン（The Leukocyte Antigen Fact Book, 2^nd edition, Barclay, A. N. et al. Academic Press, London） 1997を参照。

「ＣＤ４９ｂ」は、「ＶＬＡ-２」とも呼ばれ、例えばラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、およびｅ-カドヘリンといった細胞外タンパク質に対する表面受容体である。ＣＤ４９ｂは、凝固と血管新生の両方に関与し、主に血小板、活性化されたＢ細胞とＴ細胞に認められる。

「ＣＤ４９ｅ」は、「ＶＬＡ-５」とも呼ばれ、フィブロネクチンとフィブリノゲンに対する受容体としての役目を果たす。ＣＤ４９ｅは主に血小板、単球、好中球で発現される。

「ＣＤ４９ｆ」は、「α６インテグリン」と「ＶＬＡ-６」とも呼ばれ、ラミニンを結合するインテグリンβ１サブユニットに関連する。ＣＤ４９ｆは、主に上皮細胞、トロホブラスト、血小板、および単球で発現される。

「ＣＤ９０」は、「Ｔｈｙ-１」とも呼ばれ、主に造血幹細胞、結合組織細胞、および様々な線維芽細胞と間質細胞で発現される。

「ＣＤ９１」は、リポタンパク質と結合するα２-マクログロブリン受容体とも呼ばれ、熱ショックタンパク質に対する表面受容体としても役割を果たす。ＣＤ９１は主に線維芽細胞、樹状細胞、およびマクロファージで発現される。

「ＣＤ９５」は、「ＦＡＳ」もしくは「ＡＰＯ-１」とも呼ばれ、ＦＡＳリガンドに対する受容体である。ＣＤ９５は主に、活性化されたＢ細胞とＴ細胞、および特定のタイプの上皮細胞で発現される。

「ＣＤ１０５」は、「エンドグリン」とも呼ばれ、主に内皮細胞、単球、マクロファージ、間質細胞、および骨髄間葉系細胞で発現される。

「ＮＣＡＭ」は、「ＣＤ５６」としても知られる神経細胞接着分子（Neural Cell Adhesion Molecule）を指し、神経系と膵臓組織を含む多くの組織で発現されるＣａ²⁺非依存性の細胞接着分子である。

「ＰＥＣＡＭ」は、血小板／内皮細胞接着分子（Platelet/Endothelial Cell Adhesion Molecule）を指し、細胞-細胞相互作用に関与する細胞表面糖タンパク質である細胞接着分子ファミリーに属する。

「ＥＰＣＡＭ」は、主に上皮細胞で細胞-細胞相互作用に関与する細胞表面糖タンパク質である上皮細胞接着分子（Epithelial Cell Adhesion Molecule）を指す。

「ｃ-ＭＥＴ」とは、肝細胞増殖因子に対する受容体を指す。

「ＣＤ４４」は「ヘルメス抗原」とも呼ばれ、ヒアルロン酸に対する主要な細胞表面受容体である。このＣＤは、主に肝細胞、一部の上皮細胞、および心筋といった組織・細胞を除くほとんどの細胞で発現される。

「ＣＤ７３」は「ｅｃｔｏ-５'-ヌクレオチダーゼ」とも呼ばれ、主にＢ細胞とＴ細胞で、骨髄間質細胞、様々な上皮細胞、線維芽細胞、および内皮細胞のサブセットで発現される。

「ＣＤ８１」は抗増殖抗体標的（Target of an Anti-Proliferative Antibody, TAPA1）とも呼ばれ、主にリンパ球、内皮細胞、および上皮細胞で発現されている。

「ＣＤ１２４」はインターロイキン４受容体とも呼ばれ、成熟したＢ細胞、Ｔ細胞、造血前駆細胞、線維芽細胞、内皮細胞で発現される。

「ＣＤ１３８」は、細胞接着を仲介するヘパリン硫酸プロテオグリカン（heparin sulfate proteogycan）またはシンデカン-１（ｓｙｎｄｅｃａｎ-１）とも呼ばれ、Ｂ細胞の分化の後期に関与している。ＣＤ１３８は、Ｂ前駆細胞、形質細胞、および一部の上皮細胞タイプに普通認められる。

「ＣＤ１５１」は、インテグリンの機能およびシグナル伝達を修飾すると考えられ、内皮細胞、血小板、巨核球、上皮細胞に一般的に見いだされる。

「ＣＤ１６６」は活性型白血球細胞接着分子（Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule, ALCAM）とも呼ばれ、ニューロンの軸索伸張、胚の造血、および胚の血管新生に関与する。ＣＤ１６６は、主にニューロン、活性型Ｔ細胞、活性型単球、上皮細胞、および線維芽細胞で発現される。

「ＣＤ１８４」は、ＣＸＣＲ４もしくは間質細胞由来因子１（stromal cell Derived Factor 1, SDF1）とも呼ばれる。ＣＤ１８４は、ＣＸＣケモカインＳＤＦ-１の受容体であり、全ての成熟した血液細胞、血液前駆細胞、内皮細胞、上皮細胞、星状細胞、およびニューロンに見いだされる。

「ｃ-Ｋｉｔ」と「ＣＤ１１７」は共に、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ０６１８２に開示される配列を有する細胞表面受容体チロシンキナーゼ、もしくは自然に生じたその変異配列（例えば、対立遺伝子多型）を指す。

「ＣＤ４５」とは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｙ００６３８に開示される配列を有する白血球共通抗原、もしくは自然に生じたその変異配列（例えば、対立遺伝子多型）を指す。

「ＣＤ１３３」とは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ００６０１７に開示される配列を有する膜５回貫通造血幹細胞抗原を指す。

「アルカリホスファターゼ」は、肝臓、骨および胎盤で産生される酵素であり、通常、成長中の骨と胆汁中に高濃度で存在する。未分化の多能性幹細胞の際だった特徴は、細胞表面における高レベルのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）の発現である。

「合成基礎細胞培地（basic defined cell culture medium）」は、血清を含まない、もしくは血清を含む化学的に合成された細胞増殖培地（cell growth medium）を意味する。このような培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α改良最小必須培地（alpha modified Minimum Essential Medium）（αＭＭＥＭ）、基礎必須培地（Basal Medium Essential , BME）、ＣＭＲＬ-１０６６、ＲＰＭＩ１６４０、Ｍ１９９培地、ＨａｍのＦ１０栄養培地、およびＤＭＥＭ／Ｆ１２を含むがそれに限定されない。これら、およびその他の有用な培地は、例えばＧＩＢＣＯ（ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手可能である。これらの数多くの培地は、アカデミック・プレス社（Academic Press Inc.）発行のウィリアムＢ．ジャコビーおよびアイラＨ．パスタン（William B. Jakoby and Ira H. Pastan）編、メソッド・イン・エンジモロジーLVIII「細胞培養」（Methods in Enzymology, Volume LVIII, "Cell Culture,"） pp. 62-72に概説されている。

「医薬的担体」とは、ほ乳類細胞の移植のための担体としての役割を果たす、生分解性もしくは非分解性の多孔性もしくは非多孔性のマトリックスを指す。

本明細書で用いられる場合「移植」とは、例えばヒトの患者といったほ乳類に細胞もしくは細胞集団、もしくは組織を導入する方法を含む場合がある。「移植」とは、医薬的担体への細胞または組織の組み込み、および例えばヒトの患者といったほ乳類への担体の埋め込みも含む場合もある。

＜成人膵臓由来間質細胞の単離＞
本発明の一態様において、膵臓由来間質細胞は図１に示された多段階の方法によって単離される。この方法は、基本的に以下の段階を含む。
- 酵素溶液による死体膵臓、生体ドナーもしくは自家膵臓の潅流。
- 潅流された膵臓の機械的分離。
- ポリスクロース、またはフィコールなどの密度勾配上への消化された組織の重層の後、３つの明瞭な界面を得るための遠心。
- 各界面の組織と細胞の除去。
- ５％未満の血清を含む栄養豊富な選択培地で標準的組織培養プレートでの組織と細胞の培養。
- 約２週間から約４週間まで培地交換無しでそのまま培養を放置。

死体膵臓の潅流は、当業者によく知られた任意の酵素溶液により達成されることもできる。本発明での使用に適した酵素溶液の一例は、ＬＩＢＥＲＡＳＥＨＩ（商標）（Ｒｏｃｈｅ、０．５ｍｇ／ｍＬ）とＤＮａｓｅＩ（０．２ｍｇ／ｍＬ）を含む。

膵臓組織の機械的分離は、組織プロセッサの利用で迅速に行われる場合もある。あるいは、膵臓組織の機械的分離はリコルディ・チャンバー（Ricordi Chamber）もしくは他の方法と比較して組織の破壊的な分離が少なく分離可能なその他の同等の装置を用いて行われる場合もある。

消化された膵臓組織は次に、膵島、腺管組織、および腺房組織からそれぞれ細胞が濃縮された３つの明確な界面を得るために、ポリスクロースもしくはフィコール勾配遠心に供された。一実施形態では、組織と細胞は、各界面から取り除かれ、別々に培養される。別の実施形態では、全ての界面の組織と細胞が混合されて培養される。本発明に従って、成人膵臓由来間質細胞は３つの界面のいずれからも得られることが見いだされている。あるいは、消化された膵臓組織は、膵島が濃縮された組織、腺管組織、および腺房組織を集めることもできる、連続密度勾配に供される場合もある。

本発明に従い、一つ以上の界面から回収された組織と細胞は、細胞集団中の成人膵臓由来間質細胞を選択的に濃縮する選択培地で培養される。選択培地は栄養が豊富であり、低濃度のグルコースと血清を含む。一般的に言えば選択培地は５％未満の血清、あるいは約１から約３％の血清、あるいは約２％の血清と、３０ｍＭ未満のグルコースを含む。一実施形態では、選択培地は、ドナー膵臓が採取されたのと同一のほ乳類種由来の血清２％を添加されている。あるいは、ウシ胎児もしくは仔ウシの血清、その他の種の血清、またはその他の血清添加物もしくは代替品が選択培地に添加するのに用いられる場合もある。適切な選択培地の一例は、ＤＭＥＭ（５ｍＭグルコース）、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／μｇペニシリン／ストレプトマイシン、インスリン-トランスフェリン-セレニウム（ＩＴＳ）、２ｍＭＬ-グルタミン、０．０１６５ｍＭＺｎＳＯ₄、および０．３８μＭ２-メルカプトエタノールからなる。

選択培地での培養中（「選択段階」）、細胞は低酸素圧または正常酸素圧条件下で培養される場合もある。低酸素条件下では、酸素濃度は１％より大きく、２０％未満、もしくは１０％未満、もしくは５％未満である。

一実施形態では、培養は一般的に、用いられた培養基質に細胞が接着する約２週間から約４週間培地交換なしで、選択培地でそのまま維持される。選択段階は、接着細胞の数がそれ以上増加しなくなった時点で完了と見なされる。

本発明に従った組織の採取と培養の方法は、成人膵臓由来間質細胞が濃縮された細胞集団をもたらすことが見いだされてきた。「濃縮された」とは、成人膵臓由来間質細胞が集団の全細胞の少なくとも約３０％、あるいは約４０％、あるいは約５０％を占めることを意味する。

選択と細胞接着の初期段階の結果、（成人膵臓由来間質細胞が濃縮された）細胞は、以下に更に述べられるような条件下で増殖された。

望ましければ、成人膵臓由来間質細胞が濃縮された細胞集団は、成人膵臓由来間質細胞を特定して選択し、実質的に成人膵臓由来間質細胞の純粋な集団を得るために、例えば、間質細胞により発現されるタンパク質マーカーの発現を特異的に認識する薬剤（例えば、抗体など）に曝露される場合もある。

＜単離された成人膵臓由来間質細胞の性質決定＞
培養中もしくは単離された細胞内でのタンパク質マーカーおよび核酸マーカー発現の評価方法は、技術的に標準的である。これらの方法は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ-ＰＣＲ）、ノーザンブロット、インサイチュー・ハイブリダイゼーション（例としてキュレント・プロトコル・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology） (アウスベルら編（Ausubel et al., eds.） 2001 サプルメント（supplement）)を参照）、および例えば、切片化された材料の免疫組織化学解析、ウェスタンブロット、無傷の細胞に利用可能なマーカーのためのフローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）（例えば、ハーロウおよびレーン，抗体の使用，ラボラトリー・マニュアル，ニューヨーク，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press） (1998)を参照）といったイムノアッセイを含む。

特定のタンパク質マーカー検出に有用な抗体の例は、表ＩＩおよび表Ｖに記載されている。表ＩＩと表Ｖに挙げられた抗体によって認識される同じマーカーを対象とするその他の抗体が入手可能で、容易に開発され得ることは留意されなければならない。このようなその他の抗体は、本発明に従って単離された細胞におけるマーカーの発現の評価にも使用される場合もある。

β細胞系統の細胞特性は、当業者によく知られており、β細胞系統の更なる特性が確認され続けている。これらの特性は、本発明に従って単離された成人膵臓由来間質細胞がβ細胞系統の性質特性を獲得するよう分化したことを確認するために用いられる場合もある。β細胞系統特異的な特性には、例えば、特にインスリン、ＰＤＸ-１（膵臓および十二指腸ホメオボックス遺伝子-１）、ＮＧＮ-３（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ-３）、Ｈｌｘｂ９、Ｎｋｘ６、Ｉｓｌ１、Ｐａｘ６、ＮｅｕｒｏＤ、Ｈｎｆ１ａ、Ｈｎｆ６、Ｈｎｆ３Ｂｅｔａ、およびＭａｆＡ等といった一つ以上の転写因子の発現を含む。これらの転写因子は、内分泌細胞の特定のために、技術的に十分確立されている。例として、エドランド（Edlund） (ネイチャー・レビュー・ジェネティック３（Nature Reviews Genetics 3）: 524-632 (2002))を参照。

本発明者は、β細胞系統の特性を有する細胞への分化能を維持する一方で約２０集団倍加までの増殖能を持つ、ほ乳類の膵臓由来の成体間質細胞集団を特定し単離した。別の実施形態では、本発明者は、β細胞系統の特性を有する細胞への分化能を維持する一方で約５０集団倍加までの増殖能を持つ、ほ乳類の膵臓由来の成体間質細胞集団を特定し単離した。別の実施形態では、本発明者は、β細胞系統の特性を有する細胞への分化能を維持する一方で約７０集団倍加までの増殖能を持つ、ほ乳類の膵臓由来の成体間質細胞集団を特定し単離した。

具体的には、本発明に従って単離された成人膵臓由来間質細胞は、とりわけＣＤ１１７、ＮＣＡＭ、ＡＢＣＧ２、サイトケラチン７、８、１８、もしくは１９のタンパク質マーカーの少なくとも一つが実質的に欠けていることが明らかにされている。ある特定の実施形態においては、本発明に従って単離された成人膵臓由来間質細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ９０、ＣＤ９５、ＣＤ１０５、ＣＤ１５１、またはＣＤ１６６のタンパク質マーカーの少なくとも一つが実質的に陽性であることが明らかにされている。

＜成人膵臓由来間質細胞の増殖＞
さらに別の態様では、本発明は本発明に従って得られた成人膵臓由来間質細胞増殖方法を提供する。前述のように、膵島、腺管断片、および外分泌組織の不均一な混合物を含む可能性がある膵臓の消化物は、目的の成人膵臓由来間質細胞を選択的に濃縮するために低血清の選択培地中で約２週間から約４週間、望ましくは培地の交換なしに培養される。その結果得られた成人膵臓由来間質細胞が濃縮された細胞集団は、次に細胞集団中の成人膵臓由来間質細胞を増殖させるための増殖培地に切り換えられる。

本発明で用いるのに適切な増殖培地は、例えば、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）と２％から２０％、望ましくは約５％の濃度の血清を含むＤＭＥＭといった培地からなる可能性がある。特定の実施形態では、増殖培地はＤＭＥＭ（２７５０ｍｇ／ＬＤ-グルコース、８６２ｍｇ／Ｌグルタミン）、５％ウシ胎児血清、および０．０１６５ｍＭ硫酸亜鉛からなる。特定の実施形態では、増殖培地にはドナー膵臓が採取されたものと同一ほ乳類種由来の血清が添加される。あるいは、ウシ胎児もしくは仔ウシの血清、または、例えば血清アルブミンのようなその他の血清添加物もしくは血清代替物が増殖培地に添加するために用いられる場合もある。

さらに、成人膵臓由来間質細胞は、本発明の細胞の増殖を刺激する薬剤を含む合成増殖培地での培養によって増殖される場合もある。これらの因子は、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ-β１、２、および３を含むＴＧＦ-βファミリーのメンバー、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ-２、-４、６、-７、-１１、-１２、および-１３）、血清アルブミン、線維芽細胞増殖因子ファミリー、血小板由来増殖因子-ＡＡおよび-ＢＢ、多血小板血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ-Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ-５、-６、-８、-１０、１１）、グルカゴン様ペプチド-ＩおよびＩＩ（ＧＬＰ-Ｉ、およびＩＩ）、ＧＬＰ-１およびＧＬＰ-２模倣剤（mimetobody）、エキセンディン-４（Exendin-4）、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩおよびＩＩ、トリエチレンペンタミンなどの銅キレート剤、ＴＧＦ-α、ホルスコリン、酪酸ナトリウム、アクチビン、ベータセルリン、インスリン／トランスフェリン／セレニウム（ＩＴＳ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ウシ下垂体抽出物、膵島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）、プロテアソーム阻害剤、notch経路阻害剤、ソニック・ヘッジホッグ阻害剤、もしくはそれらの組合せなどを含む場合もある。あるいは、成人膵臓由来間質細胞は、培養上清（conditioned media）での培養で増殖される場合もある。「培養上清」とは、細胞集団を基礎合成細胞培養培地で増殖させ、可溶性の因子を培地に提供することを意味する。このような使用において、細胞が産生する可溶性因子を残したまま細胞は培地から除かれる。この培地は、次に別の細胞集団に栄養を与えるために用いられる。

ある実施形態において、成人膵臓由来間質細胞は、標準的組織培養プレート上で培養される。あるいは、培養プレートは例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、テネイシン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、胎盤抽出物、もしくはその組み合わせといった細胞外マトリックスタンパク質で被覆される場合もある。

更に、成人膵臓由来間質細胞は、インビトロで低酸素圧条件もしくは正常酸素圧条件下で増殖される場合もある。

上記の増殖のための成長条件（growth condition）下で、本発明に従って単離された成人膵臓由来間質細胞は、β細胞系統の特性を持つ細胞への分化能を維持しながら、約２０集団倍加より多いか、あるいは約５０集団倍加より多いか、あるいは約７０集団倍加より多く増殖することもできる。

＜成人膵臓由来間質細胞の分化＞
一態様において、本発明は、β細胞系統のマーカー特性を持つ細胞への、増殖した本発明の成人膵臓由来間質細胞の分化が可能な組成を提供する。

一つ以上の成分が供給される場合、成人膵臓由来間質細胞の増殖を維持し、分化を誘導する量の一つ以上の増殖因子を含む合成基礎培養培地は、「誘導培地」と呼ばれる。本発明に基づき、誘導培地は２％以下の血清を含む。一実施形態において、ウシ胎児血清が用いられる場合もある。あるいは、ウシ胎児血清が任意のほ乳類の血清、あるいはヒトアルブミン、ウシアルブミン、または成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統への分化を可能にする、もしくは強化するその他の化合物で置き換えられる場合もある。あるいは、誘導培地は培養上清である場合もある。

誘導培地に用いるのに適切な因子は、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ-β１、２、および３を含むＴＧＦ-βファミリーのメンバー、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ-２、-４、６、-７、-１１、-１２、および１３）、血清アルブミン、線維芽細胞増殖因子ファミリー、血小板由来増殖因子-ＡＡおよび-ＢＢ、多血小板血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ-Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ-５、-６、-８、-１０、１１）、グルカゴン様ペプチド-ＩおよびＩＩ（ＧＬＰ-Ｉ、およびＩＩ）、ＧＬＰ-１およびＧＬＰ-２模倣剤、エキセンディン-４（Exendin-4）、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩおよびＩＩ、トリエチレンペンタミンなどの銅キレート剤、ＴＧＦ-α、ホルスコリン、酪酸ナトリウム、アクチビン、ベータセルリン、ＩＴＳ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ウシ下垂体抽出物、膵島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）、プロテアソーム阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、notch経路阻害剤、ソニック・ヘッジホッグ阻害剤、もしくはそれらの組合せなどを含む場合もある。

本発明の一態様では、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統への分化をサポートするために、ｂＦＧＦ、Ａｃｔｉｖｉｎ-Ａ、ＦＧＦ５、Ｎ２およびＢ２７補助剤（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡ）、例えばソニック・ヘッジホッグシグナル経路を阻害するシクロパミン（ＥＭＤ、ＣＡ）といったステロイドアルカロイド、例えばＭＧ１３２（ＥＭＤ、ＣＡ）といったプロテアソーム阻害剤などといった増殖因子と化学薬剤の組合せが、合成基礎培地に添加される。一態様では、細胞は１０μＭのＭＧ-１３２を含むＤＭＥＭ（低グルコース、５．５ｍＭ）から成る誘導培地で約１日から約２日間培養され、その後、１ｘＢ２７（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡ）と１ｘＮ２（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡ）を添加した誘導培地で約３日間から約７日間、そして更にシクロパミン（１０μＭ；ＥＭＤ、ＣＡ）、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）、アクチビンＡ（２０ｎＭ；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）もしくはＦＧＦ５（２０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）を添加した誘導培地でさらに５日間、追加のインキュベーションが行われる。

本発明の別の態様では、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統への分化をサポートするために、例えばＭＧ１３２（ＥＭＤ、ＣＡ）といったプロテアソーム阻害剤を含む、増殖因子と化学薬剤の組合せが合成基礎培地に供給される。一態様では、細胞は１μＭから１０μＭの範囲の濃度のＭＧ-１３２を含むＤＭＥＭ（低グルコース、５．５ｍＭ）から成る誘導培地で約１日から約２日間培養された後、例えばトリコスタチンＡ（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）のようなヒストンデアセチラーゼ阻害剤で約１日から約２日間、更に追加のインキュベーションが行われる。これらの阻害剤の除去後、目的の程度のβ細胞系統への分化を達成するために、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ-β１、２、および３を含むＴＧＦ-βファミリーのメンバー、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ-２、-４、６、-７、-１１、-１２、および１３）、血清アルブミン、線維芽細胞増殖因子ファミリー、血小板由来増殖因子-ＡＡおよび-ＢＢ、多血小板血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ-Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ-５、-６、-８、-１０、１１）、グルカゴン様ペプチド-ＩおよびＩＩ（ＧＬＰ-Ｉ、およびＩＩ）、ＧＬＰ-１およびＧＬＰ-２模倣剤、エキセンディン-４（Exendin-4）、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩおよびＩＩ、トリエチレンペンタミンなどの銅キレート剤、ＴＧＦ-α、ホルスコリン、酪酸ナトリウム、アクチビン、ベータセルリン、ＩＴＳ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ウシ下垂体抽出物、膵島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）、プロテアソーム阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、notch経路阻害剤、ソニック・ヘッジホッグ阻害剤、もしくはそれらの組合せなどを含む場合もある誘導培地で用いるのに適切な因子を添加した誘導培地で更に追加の期間にわたって細胞が培養される。

効果的な分化を達成するために、例えばβ細胞系統の特性を持つ細胞に分化した細胞の割合をモニターすることによって、増殖因子の組合せと濃度、培養の長さ、およびその他の培養条件が当業者によって至適化される場合もある。約１週間から４週間の期間にわたってβ細胞系統のマーカーを有する細胞への本発明の膵臓間質細胞の分化を誘導するために十分な量で、一つ以上の増殖因子が添加される場合もある。

あるいは、本発明の成人膵臓由来間質細胞は、β細胞系統への細胞分化の誘導能を有する薬剤を試験するためのインビトロアッセイに用いられる場合もある。細胞は、一つ、もしくは一つ以上の薬剤と接触させられ、遺伝子発現の変化が長期間モニターされる。使用される可能性がある方法の一例が、下記の実施例９に開示される。

＜本発明の細胞の治療上の使用＞
本発明の方法に従って単離され、増殖させられた成人膵臓由来間質細胞が膵臓β細胞系統の細胞への分化能を維持していることが認められた。本発明の細胞は、１型および２型糖尿病の治療に利用される可能性もある。

一態様において、本発明は１型糖尿病を患う、もしくは発症の危険があるほ乳類のための治療方法を提供する。この方法は、成人膵臓由来間質細胞の単離と培養、単離された細胞集団の増殖、インビトロでのβ細胞系統への培養細胞の分化、および、分化した細胞の直接的、あるいは医薬的担体中のいずれかでほ乳類への移植を伴う。もし適切であれば、ほ乳類は、移植された細胞の生存と機能を促進する医薬品もしくは生物活性物質により更に治療される可能性もある。これらの薬剤は、例えば、特にインスリン、ＴＧＦ-β１、２、および３を含むＴＧＦ-βファミリーのメンバー、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ-２、-３、-４、-５、-６、-７、-１１、-１２、および１３）、線維芽細胞増殖因子-１および-２、血小板由来増殖因子-ＡＡおよび-ＢＢ、多血小板血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ-Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ-５、-６、-８、-１０、１５）、血管内皮細胞由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンを含む可能性もある。その他の医薬的化合物は、例えばニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド-ＩおよびＩＩ（ＧＬＰ-Ｉ、およびＩＩ）、ＧＬＰ-１およびＧＬＰ-２模倣剤、エキセンディン-４（Exendin-4）、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、例えば米国公開出願第２００４／０２０９９０１号、およびに米国公開出願第２００４／０１３２７２９号に開示された化合物などのＭＡＰＫ阻害剤を含む可能性もある。

更に別の様態では、本発明は２型糖尿病を患う、もしくは発症の危険があるほ乳類のための治療方法を提供する。この方法は、本発明に従う成人膵臓由来間質細胞の単離と培養、単離された細胞集団の増殖、インビトロでのβ細胞系統への培養細胞の分化、および、分化した細胞の直接的、あるいは医薬的担体中いずれかでのほ乳類への移植を伴う。

更に別の実施形態では、本発明の成人膵臓由来間質細胞は、間質細胞の生存を高めるために、もしくはβ細胞系統への間質細胞の更なる分化を誘導するために、同じ動物種もしくは異なる動物種の成熟した膵島と共に移植される可能性もある。

本発明の間質細胞が単離される膵臓組織の供給源は、治療を受けるほ乳動物の自家組織である場合もある。あるいは、供給源は同種異系もしくは異種である場合もある。ほ乳動物に投与される細胞は、増殖および／または分化を増強するため、または免疫拒絶の危険性を予防もしくは軽減するために遺伝子操作も行われる可能性もある。あるいは、本発明に従って得られた成人膵臓由来間質細胞は、本発明に従って調製された分化した細胞の移植前に、レシピエントの免疫反応を制御するために用いられる可能性もある。例として米国特許第６，３２８，９６０号、および、米国特許第６，２８１，０１２号を参照。

本発明の成人膵臓由来間質細胞は、レシピエントへの移植前にインスリン産生細胞に完全に分化される場合もある。特定の実施形態において、本発明の成人膵臓由来間質細胞は、レシピエントへの移植前にβ細胞に完全に分化される場合もある。あるいは、本発明の成人膵臓由来間質細胞は、未分化もしくは部分的に分化した状態でレシピエントに移植される場合もある。更なる分化はレシピエント内で行われる可能性もある。

未分化もしくは別の細胞は、肝門静脈に注入される可能性がある分散された細胞、もしくは凝集体を形成した細胞として用いられる場合もある。あるいは、細胞は成体適合性の分解性のポリマー支持体、多孔性の非分解性の装置、もしくは宿主の免疫反応から防御するためにカプセル化されて提供される可能性もある。細胞は、レシピエントの適切な部位に移植される可能性がある。移植部位は、例えば、肝臓、自然の膵臓、腎臓被膜下腔、網、腹膜、漿膜下腔、もしくは皮下ポケットを含む。

更に移植細胞の分化、生存、活性を高めるために、増殖因子、抗酸化剤、もしくは抗炎症剤などといった更なる因子が細胞の投与前、投与と同時に、もしくは投与後に投与される場合もある。特定の実施形態では、投与された細胞をインビボで分化させるために増殖因子が利用される。これらの因子は、内因性の細胞によって分泌され、投与された間質細胞がインサイチューで曝露される可能性もある。移植された間質細胞は、当技術分野で周知の内因性の増殖因子と外因的に投与された増殖因子の任意の組合せにより分化が誘導される可能性もある。

移植に用いられる細胞の量は、患者の状態、および治療への反応などの多くの要因に依存し、当業者によって決定される場合がある。

一態様では、本発明は糖尿病を患う、もしくは発症の危険があるほ乳類のための治療方法を提供する。この方法は、本発明にしたがう成人膵臓由来間質細胞の単離と培養、単離された細胞集団の増殖、インビトロでのβ細胞系統への培養間質細胞の分化、および、三次元支持体への細胞の組み込みを伴う。細胞は、ほ乳類への移植前にこの支持体上にインビトロで維持される可能性もある。あるいは、細胞を含む支持体は、インビトロでの更に追加の培養なしに、ほ乳類に直接移植される場合もある。支持体は任意で、移植された細胞の生存、分化、および機能を促進する少なくとも一つの医薬品と共に組み込まれる場合もある。

本発明の目的のために用いるのに適切な支持体の材料は、組織テンプレート、導管、障壁、および組織修復に有用な容器などを含む。具体的には、生体組織の再建または再生と、組織増殖誘導のための走化性物質の送達とのためにインビトロおよびインビボで用いられた発泡体、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、および不織布構造の形の合成材料および天然材料が本発明の方法の実施において有用である。例として、米国特許第５，７７０，４１７号、米国特許第６，０２２，７４３号、米国特許第５，５６７，６１２号、米国特許第５，７５９，８３０号、米国特許第６，６２６，９５０号、米国特許第６，５３４，０８４号、米国特許第６，３０６，４２４号、米国特許第６，３６５，１４９号、米国特許第６，５９９，３２３号、米国特許第６，６５６，４８８号、米国特許第６，３３３，０２９号に開示された材料を参照。本発明に用いるのに適した典型的なポリマーは、米国公開出願第２００４／００６２７５３Ａ１号、および米国特許第４，５５７，２６４号に開示されている。

医薬品が組み込まれた支持体を形成するために、支持体の形成前に医薬品がポリマー溶液と混合される場合もある。あるいは、医薬品は、加工された支持体上に、望ましくは医薬的担体の存在下で被覆される可能性もある。医薬品は、液体、細かく分割された固体、もしくは任意のその他の適切な物理的形状として存在する可能性もある。あるいは、医薬品の放出速度を変化させるために、支持体に賦形剤が添加される可能性もある。代替の実施形態では、支持体は、例えば米国特許第６，５０９，３６９号に開示された化合物のような抗炎症化合物である、少なくとも一つの医薬的化合物が組み込まれる。

一実施形態では、支持体は、例えば米国特許第６，７９３，９４５号に開示された化合物のような抗アポトーシス化合物である、少なくとも一つの医薬的化合物が組み込まれる。

別の実施形態では、支持体は、例えば米国特許第６，３３１，２９８号に開示された化合物のような線維化阻害剤である、少なくとも一つの医薬的化合物が組み込まれる。

更なる実施形態では、支持体は、例えば米国公開出願第２００４／０２２０３９３号、および米国公開出願第２００４／０２０９９０１号に開示された化合物のような血管新生の増進が可能な、少なくとも一つの医薬的化合物が組み込まれる。

更に別の実施形態では、支持体は、例えば米国公開出願第２００４／０１７１６２３号に開示された化合物のような免疫抑制化合物である、少なくとも一つの医薬的化合物が組み込まれる。

さらなる実施形態では、支持体は、例えば、特にＴＧＦ-β１、２、および３を含むＴＧＦ-βファミリーのメンバー、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ-２、-３、-４、-５、-６、-７、-１１、-１２、および１３）、線維芽細胞増殖因子-１および-２、血小板由来増殖因子-ＡＡおよび-ＢＢ、多血小板血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ-Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ-５、-６、-８、-１０、-１５）、血管内皮細胞由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンといった増殖因子である、少なくとも一つの医薬的化合物が組み込まれる。その他の医薬的化合物は、例えばニコチンアミド、低酸素誘導性因子１-α、グルカゴン様ペプチド-ＩおよびＩＩ（ＧＬＰ-Ｉ、およびＩＩ）、ＧＬＰ-１およびＧＬＰ-２模倣剤、エキセンディン-４（Exendin-4）、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、テネイシン-Ｃ、トロポエラスチン、トロンビン由来ペプチド、カセリシジン（cathelicidin）、デフェンシン、ラミニン；フィブロネクチンとビトロネクチンのような接着性の細胞外マトリックスタンパク質の細胞結合ドメインとヘパリン結合ドメインを含む生体ペプチド、例えば米国公開出願第２００４／０２０９９０１号、およびに米国公開出願第２００４／０１３２７２９号に開示された化合物などのＭＡＰＫ阻害剤を含む可能性もある。

本発明の細胞の足場への組み込みは、足場への細胞の簡単な沈着によって実現される可能性もある。細胞は、単純な拡散によって足場内に侵入することもできる（ジャーナル・オブ・ペディアトリック・サージェリー２３（J. Pediatr. Surg. 23） (1 Pt 2): 3-9 (1988)）。細胞播種の効率を向上させるその他のいくつかのアプローチが開発されてきた。例えば、ポリグリコール酸の足場上への軟骨細胞の播種に、撹拌フラスコが用いられてきた(バイオテクノロジー・プログレス（Biotechnol. Prog.） 14(2): 193-202 (1998))。細胞播種のための別のアプローチは、播種された細胞に最低限のストレスを与え、播種効率を向上させる遠心の利用である。例えば、ヤングら（Yang et al．）は遠心細胞固定化法（Centrifugational Cell Immobilization、ＣＣＩ）と呼ばれる細胞の播種方法を開発した（ジャーナル・オブ・バイオメディカル・マテリアル・リサーチ（J. Biomed. Mater. Res.） 55(3): 379-86 (2001)）。

本発明は、以下の実施例によって説明されるが、これだけに留まらない。

〔実施例１〕
＜ヒト成人膵臓由来間質細胞株の確立＞
膵臓の調製−
臨床移植に適さないヒトの膵臓は、研究利用のための適切な承諾の後に、ザ・ナショナル・ディジーズ・リサーチ・インターチェンジ（The National Disease Research Interchange）（ペンシルバニア州フィラデルフィア（Philadelphia,PA））から入手された。膵臓は、臓器保存溶液で氷上のステンレス製の皿に移され、無関係な組織は全て切り取られた。膵管に１８ゲージのカテーテルが挿入され、膵臓に、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に溶解した、ＬＩＢＥＲＡＳＥＨＩ（商標）酵素（Ｒｏｃｈｅ、０．５ｍｇ／ｍＬ）とＤＮａｓｅＩ（０．２ｍｇ／ｍＬ）とを含む酵素溶液が注入された。

急速な機械的分離後の酵素消化−
酵素が注入された膵臓は、組織プロセッサで３から５秒間／パルスのパルスを３から５回行ってホモジナイズされ、分離した組織は攪拌機のバーを入れた２つの５００ｍＬのトリプシン処理フラスコ（Ｂｅｌｌｃｏ）に移された。次に、５０ｍＬから１００ｍＬの酵素溶液が各フラスコに添加された。フラスコは、３７℃の水浴中の水中撹拌プレート上に置かれ、中程度の撹拌速度で１０分間インキュベートさせた。撹拌を止め、細かく消化された組織がフラスコから取り除かれ、酵素過程を急冷するために４℃のＤＰＢＳ、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および０．１ｍｇ／ｍＬＤＮａｓｅＩ（ＤＰＢＳ＋）が入った２５０ｍＬの試験管に移された。フラスコに５０ｍＬから１００ｍＬの酵素溶液が補充され、水浴中に戻され、更に１０分間撹拌が再開された。再び、フラスコが取り除かれ、細かい消化物が回収され、氷上の２５０ｍＬ試験管に移された。この過程は、膵臓が完全に消化されるまで、さらに３〜５回繰り返された。

同時酵素消化での緩やかな機械的分離−
酵素が注入された膵臓は、糖尿病３７（Diabetes 37）:413-420 (1988)に述べられた様な方法に従って処理された。簡潔に述べると、膵臓は無関係な組織が取り除かれ、上述の酵素溶液を注入された。次に膵臓はビーズと共にリコルディ・チャンバー（Ricordi Chamber）中に置かれ、組織のより大きな塊を保つために、メッシュサイズ４００から６００μｍのスクリーンで覆われた。チャンバーはふたをされ、酵素溶液はおよそ３７℃でチャンバーを循環させられ、酵素が膵臓を消化する一方で膵臓組織をビーズでバラバラにするためチャンバーは振盪された。十分な分離と消化が得られたら、消化は停止され組織が回収された。

組織の分離−
回収された組織は、４℃で１５０ｘｇで５分間遠心された。上清が吸引され、ＤＰＢＳ＋中で組織は更に２回洗浄された。最後の洗浄後、組織は精製のため非連続的密度勾配に供された。消化された組織は、密度１．１０８ｇ／ｍＬのポリスクロース（バージニア州のメディアテック（Mediatech,VA））に、１０ｍＬのポリスクロース溶液当たり１から２ｍＬの組織ペレットの割合で懸濁された。組織懸濁液は丸底のポリカーボネート遠心管に移され、密度１．０９６と１．０３７のポリスクロース溶液は注意深く遠心管に注がれた。ＤＭＥＭの最後の層で非連続精製密度勾配を完成させた。密度勾配の遠心管は４℃で、２０００ｒｐｍで２０分間、ブレーキをかけずに遠心された。遠心後、組織は各界面（３界面）から回収され、ＤＰＢＳ＋で上述のように数回洗浄され、５０ｍＬの試験管に回収された。

細胞塊の更なる分離−
任意で、上記のプロトコルを用いて得た大きな細胞塊を更に分離させて、より小さな塊もしくは単細胞の懸濁液にすることもできる。最後の洗浄の後、各画分からの組織は２００Ｕ／ｍＬＤＮａｓｅＩを含む１０ｍＬ１Ｘトリプシン／ＥＤＴＡ溶液に懸濁された。試験管は水浴中に置かれ、ほぼ単細胞の懸濁液が得られるまで１０ｍＬの血清用ピペットで５から６分、繰り返し吸引排出された。消化物は４℃のＤＰＢＳ＋の添加で急冷され、試験管は８００ｒｐｍで５分間遠心された。細胞懸濁液はＤＰＢＳ＋で洗浄され、下記のように培養された。

膵臓細胞培養−
最後の洗浄後、各界面からの細胞はＤＭＥＭ、２％ＦＢＳ、１００Ｕ／μｇペニシリン／ストレプトマイシン、ＩＴＳ、２ｍＭＬ-グルタミン、０．０１６５ｍＭＺｎＳＯ₄（Ｓｉｇｍａ）、０．３８μＭ２-メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）（以後「選択培地」）に懸濁された。６ｍＬの細胞懸濁液がＴ-２５組織培養フラスコに播種され、１２ｍＬの細胞懸濁液がＴ-７５フラスコに播種された。フラスコは５％ＣＯ₂の３７℃のインキュベーターに置かれた。２週間から約４週間の培養後、全面的な培地交換が行われ、接着細胞は、５％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＵＴ）、１％Ｐ／Ｓ、０．０１６５ｍＭＺｎＳＯ₄を含むＤＭＥＭ（２７５０ｍｇ／ＬＤ-グルコース、８６２ｍｇ／Ｌグルタミン）（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡ）（以後「増殖培地」）の培養に戻され、ほぼコンフルエンスに達するようにされ（この段階は「０代継代」または「Ｐ０」と称される）、この時点で継代された。その後の細胞培養は、増殖培地中で５０００細胞／ｃｍ²だった。培養は、約７０から９０％の密集度で７日から１０日ごとに継代された。図２は本発明の典型的な成人膵臓由来間質細胞を示す。

〔実施例２〕
＜集団倍加時間＞
上記の実施例１に従って単離および増殖させられた１０代および１２代継代の成人膵臓由来間質細胞は、増殖培地において、１００００細胞／ウェル（２４ウェル組織培養プレート）（マサチューセッツ州のコーニング（Corning,MA））で播種された。細胞は様々なタイムポイントでＴＲＹＰＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（カリフォルニア州のインビトロゲン（Invitrogen,CA））を用いてプレートの３つのウェルから取り除かれ、ＧｕａｖａＰＣＡ-９６細胞解析システムとＶＩＡＣＯＵＮＴ（登録商標）試薬（カリフォルニア州のグアバ（Guava,CA））とを用いて計数された。図３は、正常酸素圧条件下で培養された１０代継代細胞の増殖曲線を示す。直線期の対数曲線が細胞の集団倍加時間の推定に用いられた。１０代および１２代継代細胞の集団倍加時間は、それぞれ３６時間と３８時間だった。

〔実施例３〕
＜成人膵臓由来間質細胞の増殖能＞
実施例１に従って単離された成人膵臓由来間質細胞は、７５ｃｍ²の組織培養用処理済みのフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＡ）で選択培地で正常酸素圧条件下（５％ＣＯ₂、２０％Ｏ₂、７５％Ｎ₂）で３週間培養された。培養はその後、増殖培地に切り換えられ、週に２回から３回新しい培地を与えた。細胞はほぼコンフルエンスに達するようにして、その時点で継代された。培養は、最初の９代継代は７〜１４日毎におよそ７０〜９５％の密集度で継代され、その間の細胞集団倍加時間は、１００時間より長かった。１０回目の継代の後、細胞増殖速度は加速し、細胞は４から６日毎に継代され、集団倍加時間はおよそ４０時間に減少した。細胞は、各継代の際にＴＲＹＰＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Invitrogen,CA）を用いてフラスコから回収され、ＧｕａｖａＰＣＡ-９６細胞解析システムとＶＩＡＣＯＵＮＴ（登録商標）試薬（Guava,CA）とを用いて計数された。細胞は増殖培地中で１３２日間増殖し続け、現在４０集団倍加に達し、細胞数は１０¹²倍の増加と推定された。（図６を参照）

〔実施例４〕
＜複数の成人膵臓由来間質細胞系統の増殖能＞
実施例１に従って単離された成人膵臓由来間質細胞は、低酸素圧条件下（５％ＣＯ₂、３％Ｏ₂、９２％Ｎ₂）または正常酸素圧条件下（５％ＣＯ₂、２０％Ｏ₂、７５％Ｎ₂）で選択培地で２から４週間培養された。培養はその後、増殖培地に切り換えられ、週に２回から３回新しい培地を与えた。最初の培養期間後、低酸素圧条件下と正常酸素圧条件下で培養されたプレート中で接着細胞が観察された。更に、最初の２から４週間の培養後、膵島様または腺管構造はプレート中にほとんど残っていなかった。

複数のドナー膵臓から単離された成人膵臓由来間質細胞系統のインビトロ増殖能が、異なる培地を用いて試験された。画分３、４および５由来の細胞は、正常酸素圧条件下で組織培養用処理済みのフラスコでＤＭＥＭ、５％ＦＢＳ、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、０．０１６５ｍＭＺｎＳＯ₄からなる培地中で培養された。これと同等の細胞集団がＣＭＲＬ１０６６、１０％ＦＢＳ、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、もしくはＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２５ｍＭＨＥＰＥＳで培養され、全ての培養は抗生物質が添加された。培養は継代前にコンフルエンスに達するようにした。表ＶＩは、試験された条件下の細胞系統培養の、集団倍加時間（population doubling time, PDT）、集団倍加（population doublings, PD）の総数、および推定細胞数（projected cell number）を表す。

〔実施例５〕
＜ＣＤ１０５陽性細胞の選択＞
実施例１に従って単離されたＰ０成人膵臓由来細胞は、約７０％の密集度でＴＲＹＰＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Invitrogen,CA）溶液を用いて遊離され、次に増殖培地（ＤＭＥＭ、５％ＦＢＳ、０．０１６５ｍＭＺｎＳＯ₄、および１％Ｐ／Ｓ）で洗浄された。細胞懸濁液は１４００ＲＰＭで５分間遠心され、上清は廃棄された。その結果得られた細胞ペレットは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁され、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と２ｍＭＥＤＴＡとが添加された。細胞は、製造業者の取扱説明書（カリフォルニア州のミルテニー・バイオテック（Miltenyi Biotech,CA））に従って、ＣＤ１０５陽性集団が選択された。ＣＤ１０５陽性画分の単離は、抗ヒトＣＤ１０５ＰＥ-標識マウス抗体（カリフォルニア州のサンタ・クラッツ（Santa Cruz,CA））を用いたフローサイトメトリーで確認された。陽性画分は増殖培地で培養された。ＣＤ１０５陽性画分は、主に増殖中の成人膵臓由来間質細胞で構成されていた。

〔実施例６〕
＜蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）解析＞
ＴＲＹＰＬＥ（商標）ｅｘｐｒｅｓｓ溶液（カリフォルニア州のギブコ（Gibco,CA））で５分間のインキュベーションにより、接着した細胞が継代９〜１２のプレートから取り除かれた。遊離された細胞は、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中に再懸濁され、遠心で回収され、次に細胞はＰＢＳ中に２％ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）を含む染色用緩衝液中で洗浄、再懸濁された。適切であれば、細胞は０．１％のγグロブリン（Ｓｉｇｍａ）溶液を１５分間用いてＦｃ受容体がブロックされた。小分注（約１０⁵細胞）は、表ＩＩ-Ａに示されたようにフィコエリトリン（ＰＥ）かアロフィコシアニン（ＡＰＣ）を結合したモノクローナル抗体（１０⁶細胞あたり、抗体５μＬ）のいずれか、もしくは結合されていない一次抗体でインキュベートされた。コントロールにはイソタイプに適合した抗体、非染色細胞、および結合された２次抗体のみで染色された細胞を含めた。全ての抗体インキュベーションは４℃で３０分間行われ、細胞は次に染色緩衝液で洗浄された。結合されていない一次抗体で染色された試料は、ＰＥまたはＡＰＣで標識された結合された二次抗体で４℃で更に３０分間インキュベートされた。使用された二次抗体の一覧表として、表ＩＩ-Ｂを参照。洗浄された細胞はペレットにされ、染色緩衝液に再懸濁され、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences））を用いて、少なくとも１０，０００イベントを回収して細胞表面分子が同定された。

細胞内染色には、細胞は最初に４％パラフォルムアルデヒドで１０分間固定され、次に染色緩衝液で２回洗浄され、細胞は遠心され、ＰＢＳ中に０．５％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ（Ｓｉｇｍａ）を含む透過緩衝液中に室温（ＲＴ）で５分間再懸濁された。透過性細胞は洗浄緩衝液で２回洗浄され、遠心され、染色緩衝液に再懸濁され、表ＩＩ-Ｃに示されたように、結合された適切な抗体（１０⁶細胞当たり抗体５μＬ）と共に４℃で３０分間インキュベートされた。結合されていない一次抗体で染色された試料は、ＰＥまたはＡＰＣで標識された結合された二次抗体で、４℃で更に３０分間インキュベートされた（表ＩＩＢ）。洗浄された細胞は、ペレットにされ、染色緩衝液に再懸濁され、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（BD Biosciences）を用いて少なくとも１０，０００イベントを回収して内部タンパク質が同定された。検討された表面および内部マーカーの発現レベルは、表ＩＩＩおよび表ＩＶに挙げられた。図４は、９代継代細胞のＦＡＣＳプロファイルのサンプルを示している。

〔実施例７〕
＜成人膵臓由来間質細胞の免疫染色＞
実施例１に従って培養された、１０代継代の成人膵臓由来間質細胞１０，０００細胞／ｃｍ²は、３５ｍｍのマイクロウェルディッシュ（マサチューセッツ州のメイテック社（Matek Corp,MA））のガラス底の増殖培地に播種された。培養３日後、細胞は４％パラフォルムアルデヒドで１０分間固定され、次にＰＢＳで２回洗浄され、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ（Ｓｉｇｍａ）を含む透過緩衝液中に室温（ＲＴ）で５分間の添加の後、更にＰＢＳでの３回の洗浄が行われた。固定され、透過処理された細胞は、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もしくは二次抗体が作成された種からの４％血清（ヤギ、ロバ、もしくはウサギ）のいずれかでブロッキングされた。使用された一次および二次抗体は、表ＶＡ-Ｂに記載されている。コントロール試料は、一次抗体が除外された反応、あるいは一次抗体が一次抗体と同じ濃度に相当する免疫グロブリンで置き換えられた反応が含まれた。染色された試料は、核の対比染色のための二塩酸ジアミジノ-２-フェニルインドール（diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride）（ＤＡＰＩ）を含むＰＲＯＬＯＮＧ（登録商標）抗退色剤（Invitrogen,CA）で洗浄された。画像はＮｉｋｏｎＣｏｎｆｏｃａｌＥｃｌｉｐｓｅＣ-１倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｊａｐａｎ）と６０ｘの対物レンズを用いて得られた。増殖期の間、大部分の細胞が平滑筋アクチン、ネスチン、ビメンチン、βＩＩＩチューブリン、およびＧＡＴＡ４に対して陽性に染色され（図５）、少数の細胞（５％未満）がＧＦＡＰに対して陽性に染色され、ＣＫ７もしくはＣＫ１９に陽性に染色された細胞は無かった。

〔実施例８〕
＜成人膵臓由来間質細胞のＰＣＲ解析＞
ＲＮＡは、増殖培地で培養された９代継代細胞から抽出された。膵臓の発達に関わる重要遺伝子の発現について、ヒトの膵臓から採取されたＲＮＡがポジティブコントロールとして使用され、骨髄由来間葉系細胞（メリーランド州のキャンブレックス（Cambrex,MD））がネガティブコントロールとして用いられた。

ＲＮＡ抽出、精製、およびｃＤＮＡ合成
ＲＮＡ試料は、エタノールを含む高塩濃度緩衝液の存在下でのシリカゲル膜（ＲｎｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ、カリフォルニア州のキアゲン（Qiagen,CA））への結合によって精製され、混入物は洗い流された。ＲＮＡはカラムに結合させると同時にＤＮａｓｅＩ（Qiagen,CA）で１５分間の処理により更に精製された。高品質ＲＮＡは、水で溶出された。収量と純度は、分光光度計のＡ２６０とＡ２８０の読み取りにより評価された。ｃＤＮＡコピーは、ＡＢＩ（カリフォルニア州のＡＢＩ（ABI, CA））ｈｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙｃＤＮＡａｒｃｈｉｖｅＫｉｔを用いて、精製されたＲＮＡから作成された。

リアルタイムＰＣＲ増幅および定量的解析
特に明記しない限り、全ての試薬はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入された。リアルタイムＰＣＲ反応は、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）７０００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍを用いて実施された。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＵＮＩＶＥＲＳＡＬＰＣＲＭＡＳＴＥＲＭＩＸ（登録商標）（ＡＢＩ、ＣＡ）が総反応体積２０μＬ中に２０ｎｇの逆転写されたＲＮＡと共に用いられた。ピペット操作によるエラーを補正するため、各ｃＤＮＡ試料は二つ組で（試験が）実施された。プライマーとＦＡＭ標識されたＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブは２００ｎＭの濃度で用いられた。各標的遺伝子の発現レベルは、展開前のＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍの１８ＳリボゾームＲＮＡもしくはヒトのグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）内在性コントロールキットを用いて標準化された。プライマーとプローブは、いずれもＡＢＩＰＲＩＳＭＰＲＩＭＥＲＥＸＰＲＥＳＳ（商標）ソフトウェアを用いて設計されたか、または展開前のＡＢＩｇｅｎｅａｎａｌｙｓｉｓＫｉｔが用いられた。各遺伝子について、プライマーもしくはプローブのいずれか一つは、エクソンの境界に及ぶように設計された。これは、存在する任意のゲノムＤＮＡへのプライマー／プローブの結合の可能性を排除した。プライマーとプローブのセットを以下に列挙する。Ｎｋｘ２．２（Ｈｓ００１５９６１６）、Ｐｄｘ-１（Ｈｓ００４２６２１６）、Ｎｋｘ６．１（Ｈｓ００２３２３５５）、Ｎｇｎ３（Ｈｓ００３６０７００）、Ｐａｘ４（Ｈｓ００１７３０１４）、Ｐａｘ６（Ｈｓ００２４０８７１）、インスリン（Ｈｓ００３５５７７３）、Ｇｌｕ２（Ｈｓ００１６５７７５）、グルカゴン（Ｈｓ００１７４９６７）、Ｉｓｌ-１（Ｈｓ００１５８１２６）、ソマトスタチン（Ｈｓ００１７４９４９）、ＦｏｘＡ２（Ｈｓ００２３２７６４）、ＨｌｘＢ９（Ｈｓ００２３２１２８）、ＧＡＴＡ-４（Ｈｓ００１７１４０３）、ＧＦＡＰ（Ｈｓ００１５７６７４）、ＭＡＰ２（Ｈｓ００１５９０４１）、Ｏｌｉｇ２（Ｈｓ００３７７８２０）およびＯｃｔ-４（ＣＧＡＣＣＡＴＣＴＧＣＣＧＣＴＴＴＧＡＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）とＣＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＡＴＴＣＣＴＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２））、Ｒｅｘ-１（ＣＡＧＡＴＣＣＴＡＡＡＣＡＧＣＴＣＧＣＡＧＡＡＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）ならびにＧＣＧＴＡＣＧＣＡＡＡＴＴＡＡＡＣＴＣＣＡＧＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４））。最初の５０℃２分間、および９５℃１０分間の後、試料は９５℃１５秒の変性ステップ後、６０℃１分間のアニーリング・伸長ステップの２ステップを４０サイクル行った。データ解析はＧＥＮＥＡＭＰ（登録商標）７０００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍソフトウェアを用いて行われた。各プライマー・プローブセットに対して、Ｃ_t値は蛍光強度が増幅の指数関数的部分の中央の特定の値に達した時点のサイクル数として決定された。相対的遺伝子発現レベルは、比較Ｃ_t法を用いて計算された。簡潔に述べると、各ｃＤＮＡ試料について、内在性コントロールＣ_t値を目的の遺伝子のＣ_tから差し引いて、デルタＣ_t値（ΔＣ_t）を求める。標準化された標的値は、１００％の効率で増幅されたと仮定して、２^-ΔCtとして計算された。最後に、データは較正試料に対して相対的に表現された。比較Ｃ_t法は、標的と内因的コントロールの増幅効率がおよそ等しい場合のみに有効である。従って、各プライマー・プローブセットについて連続希釈したｃＤＮＡ試料によって予備的な検証実験を行い、ΔＣ_t値が求められた。これらのΔＣ_t値は、増幅効率が等しい場合には希釈範囲にわたって一定のままである。

ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ、もしくはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳもしくはＣＭＲＬ＋１０％ＦＢＳのいずれかで培養された成人膵臓由来間質細胞から得られたＰＣＲデータは、細胞を単離後、最初にＰＤＸ-１、インスリン、およびＨＮＦ-３βを発現したことを示した。しかし、これらの遺伝子の発現は、９代継代のように、急速に低下し、これらの遺伝子の発現はリアルタイムＰＣＲでは検出できなくなった（図７〜１９）。これらの遺伝子の発現は、３０代継代まで検出できないままだった。これらのデータは、上述のように単離された成人膵臓由来間質細胞は、増殖条件下で培養される間、完全に未分化の細胞のままであることを示唆した。

〔実施例９〕
＜分化プロトコル＞
１ｘ１０⁴細胞／ｃｍ²の１３代継代成人膵臓由来間質細胞は、２４ウェルのプレート（カリフォルニア州のコーニング（Corning,CA））に播種され、５％ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃の標準的条件下の増殖培地で１００％コンフルエントまで培養された。その後、細胞は１０μＭのＭＧ１３２（カリフォルニア州のＥＭＤ（EMD,CA））を含むＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／ＬＤ-グルコース）中で２４時間培養された。細胞はＰＢＳで１回洗浄され、１ｘＢ２７（カリフォルニア州のギブコ（Gibco,CA））および１ｘＮ２（Gibco,CA）を添加したＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／ＬＤ-グルコース）中で培養され、更に５日間、シクロパミン（１０μＭ； EMD,CA）、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ；ミネソタ州のＲ＆Ｄシステム（R&D Systems,MN））、アクチビンＡ（２０ｎＭ； R&D Systems,MN）もしくはＦＧＦ５（２０ｎｇ／ｍＬ； R&D Systems,MN）が添加された。ＲＮＡが細胞から採取され、実施例７に概略が説明された方法でＰＤＸ-１とインスリンの発現について解析された。これらの培養条件は、ＰＤＸ-１の発現を誘導したが、インスリンは誘導しなかった。

別の実験においては、画分３由来の１２代継代と１９代継代の成人膵臓由来間質細胞は、１０⁵細胞／ウェルで６ウェル組織培養プレート（ニュージャージー州のＢＤファルコン（BD Falcon,NJ））に播種され、コンフルエンスに達したら直ぐに１もしくは１０μＭのγセクレターゼ阻害剤のＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎ（商標）ＭＧ-１３２（カリフォルニア州のカルバイオケム（Calbiochem,CA））が１日加えられた。ＲＮＡが細胞から採取され、ＨＮＦ３β、ＰＤＸ-１、Ｎｋｘ６．１、およびインスリンの発現が解析された。ＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎ（商標）ＭＧ-１３２単独での処理は、ＨＮＦ３β、ＰＤＸ-１、Ｎｋｘ６．１、またはインスリンといった重要なβ細胞系統遺伝子の発現を引き起こさなかった。ＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎ（商標）ＭＧ-１３２での１日の処理後、細胞は１．２５もしくは２．５μＭのヒストンデアセチラーゼ阻害剤トリコスタチンＡ（ミズーリ州のシグマ（Sigma,MO））で１日処理された。ＲＮＡが細胞から採取され、ＨＮＦ３β、ＰＤＸ-１、Ｎｋｘ６．１、およびインスリンの発現が解析された。二つの薬剤の組合せは、ＨＮＦ３β、ＰＤＸ-１、Ｎｋｘ６．１、およびインスリンの発現を引き起こした（表ＶＩＩおよび図２０）。

別の実験では、画分３由来の１８代継代の成人膵臓由来間質細胞は、１０⁵細胞／ウェルで６ウェル組織培養プレート（ニュージャージー州のＢＤファルコン（BD Falcon,NJ））に播種され、コンフルエンスに達したら直ぐに１０μＭのγセクレターゼ阻害剤の［（２Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）-２-ベンジル-５（ブチルオキシカルボニル-アミノ）-４-ヒドロキシ-６-フェニル-ヘクサノイル］-Ｌｅｕ-Ｐｈｅ-ＮＨ₂（[(2R, 4R, 5S)-2-Benzyl-5 (Boc-amino)-4-hydroxy-6-phenyl-hexanoyl]-Leu-Phe-NH₂）（ミズーリ州のシグマ（Sigma,MO）、以後Ｂ５３０６）が１、３、７、１０、１４日間加えられた。ＲＮＡが細胞から採取され、ＨＮＦ３β、ＰＤＸ-１、Ｎｋｘ６．１、およびインスリンの発現が解析された。Ｂ５３０６単独での処理は、ＨＮＦ３β、ＰＤＸ-１、Ｎｋｘ６．１、またはインスリンといったβ細胞系統遺伝子の発現を引き起こさなかった。１、７、または１４日間のＢ５３０６処理後、細胞は１．２５または２．５μＭのヒストンデアセチラーゼ阻害剤トリコスタチンＡ（Trichostatin A）（Sigma,MO）で１日処理された。ＲＮＡが細胞から採取され、ＨＮＦ３β、ＰＤＸ-１、Ｎｋｘ６．１、およびインスリンの発現が解析された。二つの薬剤の組合せは、ＨＮＦ３β、ＰＤＸ-１、Ｎｋｘ６．１、の発現を引き起こしたが、インスリンの発現は引き起こさなかった（表ＶＩＩＩ）。

別の実験では、５代継代の成人膵臓由来間質細胞は、１０⁵細胞／ウェルで６ウェル組織培養プレートに播種され、表ＩＸに挙げられた誘導培地に、週に２回完全培地で交換しながら２週間インキュベートされた。２週間のインキュベーション後、ＲＮＡが代表のウェルから採取され、膵臓遺伝子の発現について解析された。細胞はグルカゴン、Ｎｋｘ６．１、およびソマトスタチンに対して陽性だが、インスリン、ＰＤＸ-１、もしくはＨＮＦ３βに対しては陽性でないことが見いだされた（表Ｘ-分化のカラムを参照）。類似の実験では、膵臓遺伝子発現における細胞凝集の影響が検討された。様々な誘導培地での２週間のインキュベーションの後、誘導培地が除かれ、成人膵臓由来間質細胞は０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Invitrogen,CA）で２分間処理され、直ちに除かれた。次にＣＭＲＬ１０６６（Invitrogen,CA）、１％ＢＳＡ（Sigma,MO）、およびＩＴＳ（Invitrogen,CA）から成る無血清培地が残りの各ウェルに添加された。翌日、細胞は膵島様の凝集を形成し、ＲＮＡが採取され、膵臓遺伝子の発現が解析された。実施例７に概略が説明された方法により、細胞はインスリンとＨＮＦ３βに対して陽性であることが見いだされた（表Ｘ-凝集のカラムを参照）。

別の実験では、１３代継代の成人膵臓由来間質細胞は、１０⁵細胞／ウェルで６ウェル組織培養プレートに播種され、表ＩＸに挙げられた誘導培地に、週に２回完全培地で交換しながら２週間インキュベートされた。２週間のインキュベーション後、ＲＮＡが代表のウェルから採取され、膵臓遺伝子の発現について解析された。細胞はグルカゴン、Ｎｋｘ６．１、Ｐａｘ６、およびソマトスタチンに対して陽性だが、インスリン、ＰＤＸ-１、もしくはＨＮＦ３βに対しては陽性でないことが見いだされた（表Ｘ-分化のカラムを参照）。類似の実験では、膵臓遺伝子発現における細胞凝集の影響が検討された。様々な誘導培地での２週間のインキュベーションの後、誘導培地が除かれ、細胞は０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Invitrogen,CA）で２分間処理され、直ちに除かれた。次にＣＭＲＬ１０６６（Invitrogen,CA）、１％ＢＳＡ（Sigma,MO）、およびＩＴＳ（Invitrogen,CA）から成る無血清培地が残りの各ウェルに添加された。翌日、細胞は膵島様の凝集を形成し、ＲＮＡが採取され、膵臓遺伝子の発現が解析された。実施例７に概略が説明された方法により、細胞はインスリンとＨＮＦ３βに対して陽性であることが見いだされた（表Ｘ-凝集のカラムを参照）。

総合すれば、これらのデータは、本発明の成人膵臓由来間質細胞はβ細胞系統への分化能があることを示唆している。

〔実施例１０〕
＜成人膵臓由来間質細胞の凍結保存＞
実施例１で述べられた方法に従って単離された成人膵臓由来間質細胞は目的とする継代数で回収され、１から２ｍＬの９０％ＦＢＳ（ユタ州のハイクローン（HyClone,UT））と１０％ＤＭＳＯ（Sigma,MO）に１から５ｘ１０⁶細胞／ｍＬの濃度で再懸濁された。細胞懸濁液は低温用バイアル（ニューヨーク州のコーニング（Corning,NY））に小分注され、ＮａｌｇｅｎｅＣｒｙｏ１℃ ＦｒｅｅｚｉｎｇＣｏｎｔａｉｎｅｒに移され、最低４時間−８０℃の冷凍庫に置かれた。バイアルは−８０℃から取り出され、必要とされるまで液体窒素貯蔵タンクの気相に移された。細胞は液体窒素貯蔵タンクの気相から低温用バイアルを取り出して、直ちに３７℃の水浴に移し、１、２分間または小さな氷の結晶が残るのみになるまで解凍された。細胞は培地で洗浄され、上述の実施例で述べられたように３７℃の培養中に置かれた。細胞はその後必要に応じて継代された。図２１に示されたデータは、凍結保存が増殖能（expansion porential）と増殖速度（growth rate）にほとんど影響しないことを示した。

〔実施例１１〕
＜成人膵臓由来間質細胞の増殖に対する栄養枯渇の影響＞
実施例１で述べられた方法に従って単離された成人膵臓由来間質細胞は様々な培養条件に供され、その後の細胞増殖動態に対するこれらの条件の影響が評価された。膵島が欠乏した腺房に富んだ画分から単離された細胞、Ｈ８Ｆ５は、ＤＭＥＭ、５．５ｍＭグルコース（Invitrogen,CA）、１０％ＦＢＳ（HyClone,UT）、２ｍＭＧｌｕｔａｍａｘ、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、および１ｘＡＢ／ＡＭ（Invitrogen,CA）で培養された。ある培養では、細胞は、コンフルエンスに達した８日目まで、新鮮な培地を２から３日ごとに与えられた。細胞はその後、細胞が培養フラスコ内でコンフルエンスに達する、週に１度継代された。第二の培養では、細胞はより頻繁に再度培地が交換される場合と比較して、より程度が低い細胞の接着と増殖を引き起こした、培地交換前に７日間増殖させた。この培養は、細胞が継代されたフラスコへの播種後１２日までコンフルエンスに達しなかった。従って、両方の細胞は２、３日毎に培地が交換され、コンフルエンスに達したら継代された。細胞は各継代時に計数され、推定細胞数が最初にフラスコに播種された細胞数と回収された細胞数とから計算された。

最初に、細胞は図２２に見られるように、同じペースで増殖した。しかし最初の数回の継代後、培養が確立されたあと２、３日ごとに完全培地が交換された細胞と比べて、初期の培養で培地交換が行われなかった細胞では増殖速度の上昇が示された。図２２に示されるように、集団倍加時間は、この最初の培養で８４．２時間、培養が確立された後の最初の７日間に培地が枯渇した細胞では５８．５時間と計算された。これらの結果は、栄養枯渇が従来の細胞培養技術と比較して、増殖能が向上した成人膵臓由来間質細胞の選択的な確立手段であることを示唆している。

〔実施例１２〕
＜本発明の成人膵臓由来間質細胞の典型的集団の細胞遺伝子型解析＞
細胞遺伝子型解析を行った１３代継代の成人膵臓由来間質細胞は、ＣＦＲＴｉｔｌｅ２１、Ｐａｒｔ５８に説明された食品医薬品局安全性試験実施基準に従って実施された。細胞は単層でＴ-７５組織培養フラスコ中で、ＤＭＥＭ、５．５ｍＭグルコース（Invitrogen,CA）、１０％ＦＢＳ（HyClone,UT）、２ｍＭＧｌｕｔａｍａｘ、２５ｍＭＨＥＰＥＳおよび１ｘＡＢ／ＡＭ（Invitrogen,CA）で増殖させられた。培養物に適量の有糸分裂細胞があると判断されたら、染色体の収集が行われた。細胞はコルセミド（０．０２から０．０３μｇ／ｍＬ）で２から１８時間、３７℃で処理された。その後、細胞はトリプシン処理され、２００ｘｇで６から７分間遠心され、上清が除かれた。

細胞は温めた低張液に３７℃で１０から１６分間再懸濁され、次に上述のように遠心された。細胞はその後、室温で３６から５０分間、カルノワ固定液（Carnoy's fixative）（３：１メタノール：氷酢酸）で固定され、カルノワ固定液で２回洗浄され、次に、乳白色の細胞懸濁液を作るため新しく調製された固定液に再懸濁された。最終的な細胞懸濁液数滴を清浄なスライドに乗せ、風乾した。

１００中期細胞当たりの染色体数。
解析された１００の中期細胞で認められた染色体数の分配が表ＸＩＩに示されている。染色体数は、中期当たり最頻染色体数が４６で、４５から４６染色体の範囲だった。解析された１０００細胞あたり、６細胞の倍数性中期（０．６％）が認められた。

染色体異常。
解析された１００の中期細胞の染色体異常データは、表ＸＩＩＩに要約されている。細胞遺伝子型データは、異常が解析された細胞総数、異常細胞の総数、および異常の総数を含んだ。解析された１００細胞中、染色体異常は認められなかった。

Ｇバンド染色体解析／核型。
五つの核型が準備された（ヒト核型＃１から＃５）。細胞遺伝子型解析は、細胞系統がヒト由来であることを示している（図２３から２７を参照）。ＸおよびＹ染色体がそうであったように、正常な常染色体は全ての核型に存在した。識別不能な全ての染色体と再編成は、識別不能染色体（ＵＣ）として分類された。解析された５つの核型中、２つが核型あたり一つのＵＣを含んでいた。

〔実施例１３〕
＜ヒト膵臓の画分３、４、および５由来の成人膵臓由来間質細胞のマイクロアレイ解析＞
ヒト膵臓Ｈ５系統は、実施例１に概略が説明された方法に従って処理された。膵島に富む画分（画分３）、腺管に富む画分（画分４）、外分泌腺に富む画分（画分５）から単離された６〜８代継代の細胞は遺伝子発現プロファイリングに用いられた。ヒトＨ５細胞系統（画分３、４、および５）、ならびにヒト膵臓ＲＮＡ（アンビオン（Ambion））から、ＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｋｉｔ（キアゲン（Qiagen））を用いて総ＲＮＡが単離された。試料調製、ハイブリダイゼーション、および画像解析は、ＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare）、ニュージャージー州のアマシャム・バイオサイエンス（Amersham Biosciences,NJ））に従って実施された。Ｃｏｄｅｌｉｎｋ（商標）ＨｕｍａｎＷｈｏｌｅＧｅｎｏｍｅアレイが用いられた。標的遺伝子の転写産物にわたり保存されたエクソンに対して設計された、約５５，０００の３０merのプローブから成っている。チップは〜４５０００の独立ＵｎｉｇｅｎｅＩＤを含む。標準化と対数変換の後、ＯｍｎｉＶｉｚ（登録商標）ソフトウェア（ＭＡ）とＧＥＮＥＳＩＦＴＥＲ（ワシントン州のビズ・エックス・ラボ（VizXLabs, WA））を用いてデータ解析が行われた。クロスサンプル標準化に伴う分散安定化変換が、対数変換されたアレイデータセットに適用された。ピアソンの相関係数を用いて、各細胞系統内と異なる細胞系統内の分散（variability）が比較された。各細胞系統について、三つの生物学的複製と、二つの技術的複製が用いられた。解析された全試料で、細胞系統内の相関係数は系統間の比較より高かった。異なる細胞系統間の遺伝子発現プロファイルの変動が図２８に示されている。細胞の種類の間での遺伝子発現の有意差は、分散の解析と補正Ｐ値＜０．０５のＦ検定を用いて評価された。表ＸＩＶ〜ＸＶＩは、様々な細胞系統の間で少なくとも５倍発現が異なる遺伝子を記載している。

〔実施例１４〕
＜二つの典型的ドナー膵臓由来の成人膵臓由来間質細胞のマイクロアレイ解析。＞
ヒトの二つのドナー膵臓が、実施例１に概略が説明された方法に従って処理された。膵島に富む画分（画分３）から単離された９〜１１代継代の成人膵臓由来間質細胞が遺伝子発現プロファイリングに用いられた。ＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｋｉｔ（キアゲン（Qiagen））を用いて総ＲＮＡが細胞から単離された。製造業者のプロトコル（カリフォルニア州のアフィメトリックス（Affymetrix,CA））に従って、ＲＮＡが精製され、ｃＲＮＡが標識され、断片化された。標識されたｃＲＮＡは、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐＡｎａｌｙｚｅｒでスキャンされるＵ１３３２．０ｐｌｕｓＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒト遺伝子チップにハイブリダイズされた。各細胞系統について、三つの生物学的複製と、二つの技術的複製が用いられた。データはＯｍｎｉＶｉｚ（登録商標）ソフトウェア（ＭＡ）とＧＥＮＥＳＩＦＴＥＲ（VizXLabs, WA）を用いてデータ解析された。Ｈ８の複製間の平均相関係数は、０．８９３（０．８９２〜０．８９５、ｎ＝３）で、Ｈ９の複製間では０．９０６（０．９０３〜０．９０９、ｎ＝３）だった。Ｈ８Ｆ３細胞とＨ９Ｆ３細胞間の遺伝子発現プロファイルを比較する散布図が、図２９に示されている。表ＸＶＩＩおよびＸＶＩＩＩは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘソフトウェアで本細胞に割り当てられた遺伝子を記載している。

本文書を通じて引用された資料は、その全体を参照することにより本書に組み込まれる。本発明の各種の態様が、実施例と好ましい実施形態を参照することにより上記に説明されたが、当然のことながら、本発明の範囲は上述した記載によって定義されるのではなく、特許法の原則に基づいて適切に解釈される特許請求の範囲によって定義される。

〔実施の態様〕
（１）成人膵臓由来間質細胞において、
実質的に純粋な集団である、成人膵臓由来間質細胞。
（２）実施態様１に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
前記細胞集団は、ＮＣＡＭ、ＡＢＣＧ２、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１８、もしくはサイトケラチン１９からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質マーカーの発現が実質的に陰性である、成人膵臓由来間質細胞の集団。
（３）実施態様１に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
前記細胞集団は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、もしくはＣＤ１０５からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質マーカーの発現が実質的に陽性である、成人膵臓由来間質細胞の集団。
（４）実施態様１に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
インビトロで増殖（propagate）可能な、成人膵臓由来間質細胞の集団。
（５）実施態様４に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
低酸素条件で増殖可能な、成人膵臓由来間質細胞の集団。

（６）実施態様１に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
β細胞系統の特徴を示す細胞へ分化可能な、成人膵臓由来間質細胞の集団。
（７）実施態様１に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質を過剰発現するよう遺伝子操作された、成人膵臓由来間質細胞の集団。
（８）実施態様１に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質発現が減少するよう遺伝子操作された、成人膵臓由来間質細胞の集団。
（９）実施態様２に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質が過剰発現するよう遺伝子操作された、成人膵臓由来間質細胞の集団。
（１０）実施態様２に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質発現を減少するよう遺伝子操作された、成人膵臓由来間質細胞の集団。

（１１）実施態様３に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質を過剰発現するよう遺伝子操作された、成人膵臓由来間質細胞の集団。
（１２）実施態様３に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質発現を減少するよう遺伝子操作された、成人膵臓由来間質細胞の集団。
（１３）実施態様１に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（１４）実施態様２に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（１５）実施態様３に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。

（１６）実施態様１に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（１７）実施態様２に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（１８）実施態様３に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（１９）実施態様１に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（２０）実施態様２に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。

（２１）実施態様３に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（２２）実施態様７に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（２３）実施態様８に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（２４）実施態様９に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（２５）実施態様１０に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。

（２６）実施態様１１に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（２７）実施態様１２に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（２８）実施態様７に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（２９）実施態様８に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（３０）実施態様９に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。

（３１）実施態様１０に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（３２）実施態様１１に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（３３）実施態様１２に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（３４）実施態様７に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（３５）実施態様８に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。

（３６）実施態様９に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（３７）実施態様１０に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（３８）実施態様１１に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（３９）実施態様１２に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
（４０）ほ乳類の膵臓由来の間質細胞中に濃縮された細胞集団取得の方法において、
ａ．前記ほ乳類膵臓から膵臓細胞を単離する段階と、
ｂ．前記細胞を、血清および約３０ｍＭ未満の濃度でグルコースを添加した基礎栄養培地中で培養する段階と、
ｃ．前記細胞を、前記培地で少なくとも約２週間増殖（grow）させ、それによって間質細胞が濃縮された細胞集団を取得する段階と、
を含む、方法。

（４１）実施態様４０に記載の方法において、
前記血清濃度は、ほぼ５％未満である、方法。
（４２）実施態様４０に記載の方法において、
前記細胞集団は、ＮＣＡＭ、ＡＢＣＧ２、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１８、もしくはサイトケラチン１９からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質マーカーの発現が実質的に陰性である、方法。
（４３）実施態様４０に記載の方法において、
前記細胞集団は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、もしくはＣＤ１０５からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質マーカーの発現が実質的に陽性である、方法。
（４４）実施態様４０に記載の方法において、
前記細胞集団中の前記間質細胞は、インビトロで増殖可能である、方法。
（４５）実施態様４０に記載の方法において、
前記細胞集団中の前記間質細胞は、β細胞系統の特徴を示す細胞へ分化可能である、方法。

（４６）実施態様４０に記載の方法において、
ａ．前記間質細胞をＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、もしくはＣＤ１０５からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質マーカーに基づいて選択し、単離する段階、
を更に含む、方法。
（４７）ほ乳類の膵臓由来の成人膵臓由来間質細胞の純粋集団取得の方法において、
ａ．前記ほ乳類膵臓から膵臓細胞を単離する段階と、
ｂ．前記細胞を、血清および約３０ｍＭ未満の濃度でグルコースを添加した基礎栄養培地中で培養する段階と、
ｃ．成人膵臓由来間質細胞を濃縮させた細胞集団を得るために、前記細胞を、前記培地で少なくとも約２週間増殖させる段階と、
ｄ．前記成人膵臓由来間質細胞で特異的に発現されるタンパク質マーカー特異的な薬剤に特異的に結合する細胞を単離し、その結果として成人膵臓由来間質細胞の純粋集団を取得する段階と、
を含む、方法。
（４８）実施態様４７に記載の方法において、
前記血清濃度は、ほぼ５％未満である、方法。
（４９）実施態様４７に記載の方法において、
前記タンパク質マーカーは、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、もしくはＣＤ１０５からなる群から選択される、方法。
（５０）実施態様４７に記載の方法において、
前記細胞集団は、ＮＣＡＭ、ＡＢＣＧ２、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１８、もしくはサイトケラチン１９からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質マーカーの発現が実質的に陰性である、方法

（５１）実施態様４７に記載の方法において、
前記細胞集団は、インビトロで増殖可能である、方法。
（５２）実施態様４７に記載の方法において、
前記細胞集団は、低酸素条件で増殖可能である、方法。
（５３）実施態様４７に記載の方法において、
前記細胞集団は、β細胞系統の特徴を示す細胞へ分化可能である、方法。
（５４） β細胞系統の特徴を示す細胞取得の方法において、
ほ乳類膵臓由来の成人膵臓由来間質細胞の実質的に純粋な集団を取得する段階と、
前記成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統の特徴を示す細胞への分化を誘導する有効量の薬剤で前記成人膵臓由来間質細胞を処理する段階と、
を含む、方法。
（５５）実施態様５４に記載の方法において、
前記成人膵臓由来間質細胞の集団は、
ａ．前記ほ乳類膵臓から膵臓細胞を単離する段階、
ｂ．前記細胞を、血清および約３０ｍＭ未満の濃度でグルコースを添加した基礎栄養培地中で培養する段階、
ｃ．成人膵臓由来間質細胞を濃縮させた細胞集団を得るために、前記細胞を、前記培地で少なくとも約２週間増殖させる段階、ならびに、
ｄ．前記成人膵臓由来間質細胞で特異的に発現されるタンパク質マーカー特異的な薬剤に特異的に結合する細胞を単離し、その結果として成人膵臓由来間質細胞の純化された集団を取得する段階、
によって得られる、方法。

（５６）実施態様５５に記載の方法において、
前記血清濃度は、ほぼ５％未満である、方法。
（５７）実施態様５４に記載の方法において、
成人膵臓由来間質細胞の前記集団は、分化を誘導するための処理前に培養液中で増殖（expand）される、方法。
（５８）実施態様５４に記載の方法において、
β細胞系統の特徴を示す細胞は、インスリン産生細胞である、方法。
（５９）糖尿病もしくは糖尿病発症の恐れがある患者の治療の方法において、
（ａ）ドナーの膵臓組織から成人膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
（ｂ）前記成人膵臓由来間質細胞を前記患者に移植する段階と、
を含み、
前記成人膵臓由来間質細胞は、膵臓ホルモン産生細胞に分化する、方法。
（６０）実施態様５９に記載の方法において、
前記患者は、膵臓組織のドナーである、方法。

（６１）実施態様５９に記載の方法において、
前記膵臓ホルモン産生細胞は、インスリン産生細胞である、方法。
（６２）糖尿病もしくは糖尿病発症の恐れがある患者の治療の方法において、
（ａ）ドナーの膵臓組織から成人膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
（ｂ）前駆細胞を作成するために前記間質細胞を生体外で増殖させる段階と、
（ｃ）前記前駆細胞を前記患者に移植する段階と、
を含み、
前記前駆細胞は、膵臓ホルモン産生細胞に分化する、方法。
（６３）実施態様６２に記載の方法において、
前記膵臓ホルモン産生細胞は、インスリン産生細胞である、方法。
（６４）実施態様６２に記載の方法において、
前記患者は、前記膵臓組織のドナーである、方法。
（６５）糖尿病もしくは糖尿病発症の恐れがある患者の治療の方法において、
（ａ）ドナーの膵臓組織から成人膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
（ｂ）成人膵臓由来間質細胞の前記集団をインビトロで増殖させる段階と、
（ｃ）増殖させた前記成人膵臓由来間質細胞を前記患者に移植する段階と、
を含み、
前記間質細胞は、膵臓ホルモン産生細胞に分化する、方法。

（６６）実施態様６５に記載の方法において、
前記膵臓ホルモン産生細胞は、インスリン産生細胞である、方法。
（６７）実施態様６５に記載の方法において、
前記患者は、前記膵臓組織のドナーである、方法。
（６８）糖尿病もしくは糖尿病発症の恐れがある患者の治療の方法において、
（ａ）ドナーの膵臓組織から成人膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
（ｂ）成人膵臓由来間質細胞の前記集団をインビトロで増殖させる段階と、
（ｃ）増殖させた前記成人膵臓由来間質細胞を膵臓β細胞系統に分化させる段階と、
（ｄ）分化した前記細胞を前記患者に移植する段階と、
を含む、方法。
（６９）実施態様６８に記載の方法において、
前記膵臓β細胞系統細胞は、インスリン産生細胞である、方法。
（７０）実施態様６８に記載の方法において、
前記患者は、前記膵臓組織のドナーである、方法。

（７１）糖尿病もしくは糖尿病発症の恐れがある患者の治療の方法において、
（ａ）ドナーの膵臓組織から成人膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
（ｂ）ドナーから成熟膵島を得る段階と、
（ｃ）前記成人膵臓由来間質細胞、および前記膵島の両方を前記患者に移植する段階と、
を含み、
前記膵島は、前記患者における前記成人膵臓由来間質細胞の生存および機能を増進する、方法。
（７２）実施態様７１に記載の方法において、
前記成熟膵島の前記ドナーは、前記患者に対して同種異系もしくは異種である、方法。
（７３）糖尿病もしくは糖尿病発症の恐れがある患者の治療の方法において、
（ａ）ドナーの膵臓組織から成人膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
（ｂ）ドナーから成熟膵島を得る段階と、
（ｃ）前記成人膵臓由来間質細胞、および前記膵島の両方を前記患者に移植する段階と、
を含み、
前記成人膵臓由来間質細胞は、前記患者における前記膵島の生存および機能を増進する、方法。
（７４）実施態様７３に記載の方法において、
前記成熟膵島の前記ドナーは、前記患者に対して同種異系もしくは異種である、方法。
（７５）実施態様５９、６２、６５、６８、７１もしくは７３のいずれか一つに記載の方法において、
前記患者に移植された前記細胞の生存および機能を促進する医薬的担体もしくは生体活性剤を前記患者に投与する段階、
をさらに含み、
前記担体もしくは薬剤は、前記患者への前記細胞の前記移植の前、前記移植の後、もしくは前記移植と同時に、投与される、方法。

（７６）実施態様５９、６２、６５、６８、７１もしくは７３の任意の一つに従う方法において、
前記患者に移植される前記細胞は、ポリマー支持材に取り込まれている、方法。
（７７）実施態様７６に従う前記方法において、
前記ポリマー支持材は、前記患者において前記細胞の生存および機能を促進する医薬的担体もしくは生体活性剤をも担持（load）している、方法。

本発明の成人膵臓由来間質細胞の単離に用いられる多段階の過程の概要をまとめる。５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、０．０１６５ｍＭの硫酸亜鉛を添加した基礎培地で１２継代培養した、接着した未分化の成人膵臓由来間質細胞の形態（拡大倍率１００倍）を示す。本発明の成人膵臓由来間質細胞の典型的な増殖曲線を示す。示された曲線は、１０代継代細胞のものである。本発明の成人膵臓由来間質細胞の９代継代の典型的なＦＡＣＳ解析を示す。ａ）イソタイプコントロール、ｂ）Ｘ軸はＣＤ１１７でＹ軸はアルカリホスファターゼ、ｃ）Ｘ軸はＣＤ１０５でＹ軸はＣＤ４４、ｄ）Ｘ軸はＣＤ７３でＹ軸はＣＤ９０、ｅ）ＥＰＣＡＭ、ｆ）ＡＢＣＧ２、ｇ）汎サイトケラチン（Pan cytokeratin）１４、１５、１６、および１９、ｈ）汎サイトケラチン５、６、８、１０、１３、および１８、ｉ）ビメンチン。１１代継代細胞の免疫染色を示す。細胞はビメンチン、ネスチン、βＩＩＩチューブリン、平滑筋アクチンに対して陽性に染色され、また汎サイトケラチン（ＣＫ７とＣＫ１９を含む）に対して陰性だった。本発明に従って単離された成人膵臓由来間質細胞集団の増殖能を示す。リアルタイムＰＣＲによって培養時間に伴って定量された、選択された遺伝子の発現を示す。示された結果は、ヒト膵臓で観察された発現量の割合として表現された、ＰＤＸ-１（パネルＡ）、インスリン（パネルＢ）、ＨＮＦ-３β（パネルＣ）、およびＣＫ１９（パネルＤ）の発現である。継代数として示されたように、培養時間はＸ軸に示されている。データはドナー膵臓Ｈ４の画分３由来の成人膵臓由来間質細胞から得られた。細胞は、２％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭで培養された。リアルタイムＰＣＲによって培養時間に伴って定量された、選択された遺伝子の発現を示す。示された結果は、ヒト膵臓で観察された発現量の割合として表現された、ＰＤＸ-１（パネルＡ）、インスリン（パネルＢ）、ＨＮＦ-３β（パネルＣ）、およびＣＫ１９（パネルＤ）の発現である。継代数として示されたように、培養時間はＸ軸に示されている。データはドナー膵臓Ｈ４の画分４由来の成人膵臓由来間質細胞から得られた。細胞は、２％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭで培養された。リアルタイムＰＣＲによって培養時間に伴って定量された、選択された遺伝子の発現を示す。示された結果は、ヒト膵臓で観察された発現量の割合として表現された、ＰＤＸ-１（パネルＡ）、インスリン（パネルＢ）、ＨＮＦ-３β（パネルＣ）、およびＣＫ１９（パネルＤ）の発現である。継代数として示されたように、培養時間はＸ軸に示されている。データはドナー膵臓Ｈ４の画分５由来の成人膵臓由来間質細胞から得られた。細胞は、２％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭで培養された。リアルタイムＰＣＲによって培養時間に伴って定量された、選択された遺伝子の発現を示す。示された結果は、ヒト膵臓で観察された発現量の割合として表現された、ＰＤＸ-１（パネルＡ）、インスリン（パネルＢ）、ＨＮＦ-３β（パネルＣ）、およびＣＫ１９（パネルＤ）の発現である。継代数として示されたように、培養時間はＸ軸に示されている。データはドナー膵臓Ｈ４の画分３由来の成人膵臓由来間質細胞から得られた。細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭで培養された。リアルタイムＰＣＲによって培養時間に伴って定量された、選択された遺伝子の発現を示す。示された結果は、ヒト膵臓で観察された発現量の割合として表現された、ＰＤＸ-１（パネルＡ）、インスリン（パネルＢ）、ＨＮＦ-３β（パネルＣ）、およびＣＫ１９（パネルＤ）の発現である。継代数として示されたように、培養時間はＸ軸に示されている。データはドナー膵臓Ｈ４の画分４由来の成人膵臓由来間質細胞から得られた。細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭで培養された。リアルタイムＰＣＲによって培養時間に伴って定量された、選択された遺伝子の発現を示す。示された結果は、ヒト膵臓で観察された発現量の割合として表現された、ＰＤＸ-１（パネルＡ）、インスリン（パネルＢ）、ＨＮＦ-３β（パネルＣ）、およびＣＫ１９（パネルＤ）の発現である。継代数として示されたように、培養時間はＸ軸に示されている。データはドナー膵臓Ｈ４の画分５由来の成人膵臓由来間質細胞から得られた。細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭで培養された。リアルタイムＰＣＲによって培養時間に伴って定量された、選択された遺伝子の発現を示す。示された結果は、ヒト膵臓で観察された発現量の割合として表現された、ＰＤＸ-１（パネルＡ）、インスリン（パネルＢ）、ＨＮＦ-３β（パネルＣ）、およびＣＫ１９（パネルＤ）の発現である。継代数として示されたように、培養時間はＸ軸に示されている。データはドナー膵臓Ｈ４の画分３由来の成人膵臓由来間質細胞から得られた。細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＣＭＲＬで培養された。リアルタイムＰＣＲによって培養時間に伴って定量された、選択された遺伝子の発現を示す。示された結果は、ヒト膵臓で観察された発現量の割合として表現された、ＰＤＸ-１（パネルＡ）、インスリン（パネルＢ）、ＨＮＦ-３β（パネルＣ）、およびＣＫ１９（パネルＤ）の発現である。継代数として示されたように、培養時間はＸ軸に示されている。データはドナー膵臓Ｈ４の画分４由来の成人膵臓由来間質細胞から得られた。細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＣＭＲＬで培養された。リアルタイムＰＣＲによって培養時間に伴って定量された、選択された遺伝子の発現を示す。示された結果は、ヒト膵臓で観察された発現量の割合として表現された、ＰＤＸ-１（パネルＡ）、インスリン（パネルＢ）、ＨＮＦ-３β（パネルＣ）、およびＣＫ１９（パネルＤ）の発現である。継代数として示されたように、培養時間はＸ軸に示されている。データはドナー膵臓Ｈ４の画分５由来の成人膵臓由来間質細胞から得られた。細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＣＭＲＬで培養された。リアルタイムＰＣＲによって培養時間に伴って定量された、選択された遺伝子の発現を示す。示された結果は、ヒト膵臓で観察された発現量の割合として表現された、ＰＤＸ-１（パネルＡ）、インスリン（パネルＢ）、ＨＮＦ-３β（パネルＣ）、およびＣＫ１９（パネルＤ）の発現である。継代数として示されたように、培養時間はＸ軸に示されている。データはドナー膵臓Ｈ８の画分３由来の成人膵臓由来間質細胞から得られた。細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＣＭＲＬで培養された。リアルタイムＰＣＲによって培養時間に伴って定量された、選択された遺伝子の発現を示す。示された結果は、ヒト膵臓で観察された発現量の割合として表現された、グルカゴン（パネルＡ）、Ｇｌｕｔ-２（パネルＢ）、Ｐａｘ-４（パネルＣ）、およびＰａｘ-６（パネルＤ）の発現である。継代数として示されたように、培養時間はＸ軸に示されている。データはドナー膵臓Ｈ８の画分３由来の成人膵臓由来間質細胞から得られた。細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＣＭＲＬで培養された。リアルタイムＰＣＲによって培養時間に伴って定量された、選択された遺伝子の発現を示す。示された結果は、ヒト膵臓で観察された発現量の割合として表現された、ソマトスタチン（パネルＡ）、ｎｅｕｒｏＤ１（パネルＢ）、Ｎｋｘ２．２（パネルＣ）、およびＮｋｘ６．１（パネルＤ）の発現である。継代数として示されたように、培養時間はＸ軸に示されている。データはドナー膵臓Ｈ８の画分３由来の成人膵臓由来間質細胞から得られた。細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＣＭＲＬで培養された。リアルタイムＰＣＲによって培養時間に伴って定量された、選択された遺伝子の発現を示す。示された結果は、ヒト膵臓で観察された発現量の割合として表現された、ＨＮＦ-１α（パネルＡ）、およびＳｏｘ-１７（パネルＢ）の発現である。継代数として示されたように、培養時間はＸ軸に示されている。データはドナー膵臓Ｈ８の画分３由来の成人膵臓由来間質細胞から得られた。細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＣＭＲＬで培養された。リアルタイムＰＣＲによって処理後に定量された、選択された遺伝子の発現を示す。本発明に従って単離された２つの成人膵臓由来間質細胞集団の、冷凍保存前および冷凍保存からの回復後の増殖能を示す。本発明に従って単離された成人膵臓由来間質細胞集団の増殖能に対する栄養枯渇の影響を示す。本発明に従って単離された典型的な成人膵臓由来間質細胞集団の核型を示す。本発明に従って単離された典型的な成人膵臓由来間質細胞集団の核型を示す。本発明に従って単離された典型的な成人膵臓由来間質細胞集団の核型を示す。

本発明に従って単離された典型的な成人膵臓由来間質細胞集団の核型を示す。本発明に従って単離された典型的な成人膵臓由来間質細胞集団の核型を示す。ドナー膵臓Ｈ５の画分３、４、および５由来の成人膵臓由来間質細胞で発現される遺伝子の散布図を示す。各比較に対するピアソン相関係数も記載されている。ドナー膵臓Ｈ５およびドナー膵臓Ｈ８の画分３由来の成人膵臓由来間質細胞で発現される遺伝子の散布図を示す。ピアソン相関係数も記載されている。

Claims

成人膵臓由来間質細胞において、
実質的に純粋な集団である、成人膵臓由来間質細胞。
請求項１に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
前記細胞集団は、ＮＣＡＭ、ＡＢＣＧ２、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１８、もしくはサイトケラチン１９からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質マーカーの発現が実質的に陰性である、成人膵臓由来間質細胞の集団。
請求項１に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
前記細胞集団は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、もしくはＣＤ１０５からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質マーカーの発現が実質的に陽性である、成人膵臓由来間質細胞の集団。
請求項１に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
インビトロで増殖可能な、成人膵臓由来間質細胞の集団。
請求項４に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
低酸素条件で増殖可能な、成人膵臓由来間質細胞の集団。
請求項１に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
β細胞系統の特徴を示す細胞へ分化可能な、成人膵臓由来間質細胞の集団。
請求項１に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質を過剰発現するよう遺伝子操作された、成人膵臓由来間質細胞の集団。
請求項１に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質発現が減少するよう遺伝子操作された、成人膵臓由来間質細胞の集団。
請求項２に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質が過剰発現するよう遺伝子操作された、成人膵臓由来間質細胞の集団。
請求項２に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質発現を減少するよう遺伝子操作された、成人膵臓由来間質細胞の集団。
請求項３に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質を過剰発現するよう遺伝子操作された、成人膵臓由来間質細胞の集団。
請求項３に記載の成人膵臓由来間質細胞の集団において、
タンパク質発現を減少するよう遺伝子操作された、成人膵臓由来間質細胞の集団。
請求項１に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項２に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項３に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項１に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項２に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項３に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項１に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項２に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項３に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項７に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項８に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項９に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項１０に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項１１に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項１２に記載の細胞を用いた、成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、細胞のβ細胞系統細胞への分化誘導が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における膵臓マーカーの発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項７に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項８に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項９に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項１０に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項１１に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項１２に記載の成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、遺伝子発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞における遺伝子発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項７に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項８に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項９に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項１０に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項１１に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
請求項１２に記載の成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現の変更が可能な薬剤スクリーニング方法において、
ａ．前記成人膵臓由来間質細胞を培養する段階と、
ｂ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
ｃ．前記成人膵臓由来間質細胞を、タンパク質発現の変更が可能な薬剤に接触させる段階と、
ｄ．前記細胞および前記薬剤をインキュベーションする段階と、
ｅ．前記成人膵臓由来間質細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する段階と、
を含む、薬剤スクリーニング方法。
ほ乳類の膵臓由来の間質細胞中に濃縮された細胞集団取得の方法において、
ａ．前記ほ乳類膵臓から膵臓細胞を単離する段階と、
ｂ．前記細胞を、血清および約３０ｍＭ未満の濃度でグルコースを添加した、基礎栄養培地中で培養する段階と、
ｃ．前記細胞を、前記培地で少なくとも約２週間増殖させ、それによって間質細胞が濃縮された細胞集団を取得する段階と、
を含む、方法。
請求項４０に記載の方法において、
前記血清濃度は、ほぼ５％未満である、方法。
請求項４０に記載の方法において、
前記細胞集団は、ＮＣＡＭ、ＡＢＣＧ２、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１８、もしくはサイトケラチン１９からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質マーカーの発現が実質的に陰性である、方法。
請求項４０に記載の方法において、
前記細胞集団は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、もしくはＣＤ１０５からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質マーカーの発現が実質的に陽性である、方法。
請求項４０に記載の方法において、
前記細胞集団中の前記間質細胞は、インビトロで増殖可能である、方法。
請求項４０に記載の方法において、
前記細胞集団中の前記間質細胞は、β細胞系統の特徴を示す細胞へ分化可能である、方法。
請求項４０に記載の方法において、
ａ．前記間質細胞をＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、もしくはＣＤ１０５からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質マーカーに基づいて選択し、単離する段階、
を更に含む、方法。
ほ乳類の膵臓由来の成人膵臓由来間質細胞の純粋集団取得の方法において、
ａ．前記ほ乳類膵臓から膵臓細胞を単離する段階と、
ｂ．前記細胞を、血清および約３０ｍＭ未満の濃度でグルコースを添加した、基礎栄養培地中で培養する段階と、
ｃ．成人膵臓由来間質細胞を濃縮させた細胞集団を得るために、前記細胞を、前記培地で少なくとも約２週間増殖させる段階と、
ｄ．前記成人膵臓由来間質細胞で特異的に発現されるタンパク質マーカー特異的な薬剤に特異的に結合する細胞を単離し、その結果として成人膵臓由来間質細胞の純粋集団を取得する段階と、
を含む、方法。
請求項４７に記載の方法において、
前記血清濃度は、ほぼ５％未満である、方法。
請求項４７に記載の方法において、
前記タンパク質マーカーは、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、もしくはＣＤ１０５からなる群から選択される、方法。
請求項４７に記載の方法において、
前記細胞集団は、ＮＣＡＭ、ＡＢＣＧ２、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１８、もしくはサイトケラチン１９からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質マーカーの発現が実質的に陰性である、方法
請求項４７に記載の方法において、
前記細胞集団は、インビトロで増殖可能である、方法。
請求項４７に記載の方法において、
前記細胞集団は、低酸素条件で増殖可能である、方法。
請求項４７に記載の方法において、
前記細胞集団は、β細胞系統の特徴を示す細胞へ分化可能である、方法。
β細胞系統の特徴を示す細胞取得の方法において、
ほ乳類膵臓由来の成人膵臓由来間質細胞の実質的に純粋な集団を取得する段階と、
前記成人膵臓由来間質細胞のβ細胞系統の特徴を示す細胞への分化を誘導する有効量の薬剤で前記成人膵臓由来間質細胞を処理する段階と、
を含む、方法。
請求項５４に記載の方法において、
前記成人膵臓由来間質細胞の集団は、
ａ．前記ほ乳類膵臓から膵臓細胞を単離する段階、
ｂ．前記細胞を、血清および約３０ｍＭ未満の濃度でグルコースを添加した、基礎栄養培地中で培養する段階、
ｃ．成人膵臓由来間質細胞を濃縮させた細胞集団を得るために、前記細胞を、前記培地で少なくとも約２週間増殖させる段階、ならびに、
ｄ．前記成人膵臓由来間質細胞で特異的に発現されるタンパク質マーカー特異的な薬剤に特異的に結合する細胞を単離し、その結果として成人膵臓由来間質細胞の純化された集団を取得する段階、
によって得られる、方法。
請求項５５に記載の方法において、
前記血清濃度は、ほぼ５％未満である、方法。
請求項５４に記載の方法において、
成人膵臓由来間質細胞の前記集団は、分化を誘導するための処理前に培養液中で増殖される、方法。
請求項５４に記載の方法において、
β細胞系統の特徴を示す細胞は、インスリン産生細胞である、方法。
糖尿病もしくは糖尿病発症の恐れがある患者の治療の方法において、
（ａ）ドナーの膵臓組織から成人膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
（ｂ）前記成人膵臓由来間質細胞を前記患者に移植する段階と、
を含み、
前記成人膵臓由来間質細胞は、膵臓ホルモン産生細胞に分化する、方法。
請求項５９に記載の方法において、
前記患者は、膵臓組織のドナーである、方法。
請求項５９に記載の方法において、
前記膵臓ホルモン産生細胞は、インスリン産生細胞である、方法。
糖尿病もしくは糖尿病発症の恐れがある患者の治療の方法において、
（ａ）ドナーの膵臓組織から成人膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
（ｂ）前駆細胞を作成するために前記間質細胞を生体外で増殖させる段階と、
（ｃ）前記前駆細胞を前記患者に移植する段階と、
を含み、
前記前駆細胞は、膵臓ホルモン産生細胞に分化する、方法。
請求項６２に記載の方法において、
前記膵臓ホルモン産生細胞は、インスリン産生細胞である、方法。
請求項６２に記載の方法において、
前記患者は、前記膵臓組織のドナーである、方法。
糖尿病もしくは糖尿病発症の恐れがある患者の治療の方法において、
（ａ）ドナーの膵臓組織から成人膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
（ｂ）成人膵臓由来間質細胞の前記集団をインビトロで増殖させる段階と、
（ｃ）増殖させた前記成人膵臓由来間質細胞を前記患者に移植する段階と、
を含み、
前記間質細胞は、膵臓ホルモン産生細胞に分化する、方法。
請求項６５に記載の方法において、
前記膵臓ホルモン産生細胞は、インスリン産生細胞である、方法。
請求項６５に記載の方法において、
前記患者は、前記膵臓組織のドナーである、方法。
糖尿病もしくは糖尿病発症の恐れがある患者の治療の方法において、
（ａ）ドナーの膵臓組織から成人膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
（ｂ）成人膵臓由来間質細胞の前記集団をインビトロで増殖させる段階と、
（ｃ）増殖させた前記成人膵臓由来間質細胞を膵臓β細胞系統に分化させる段階と、
（ｄ）分化した前記細胞を前記患者に移植する段階と、
を含む、方法。
請求項６８に記載の方法において、
前記膵臓β細胞系統細胞は、インスリン産生細胞である、方法。
請求項６８に記載の方法において、
前記患者は、前記膵臓組織のドナーである、方法。
糖尿病もしくは糖尿病発症の恐れがある患者の治療の方法において、
（ａ）ドナーの膵臓組織から成人膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
（ｂ）ドナーから成熟膵島を得る段階と、
（ｃ）前記成人膵臓由来間質細胞、および前記膵島の両方を前記患者に移植する段階と、
を含み、
前記膵島は、前記患者における前記成人膵臓由来間質細胞の生存および機能を増進する、方法。
請求項７１に記載の方法において、
前記成熟膵島の前記ドナーは、前記患者に対して、同種異系もしくは異種である、方法。
糖尿病もしくは糖尿病発症の恐れがある患者の治療の方法において、
（ａ）ドナーの膵臓組織から成人膵臓由来間質細胞の集団を単離する段階と、
（ｂ）ドナーから成熟膵島を得る段階と、
（ｃ）前記成人膵臓由来間質細胞、および前記膵島の両方を前記患者に移植する段階と、
を含み、
前記成人膵臓由来間質細胞は、前記患者における前記膵島の生存および機能を増進する、方法。
請求項７３に記載の方法において、
前記成熟膵島の前記ドナーは、前記患者に対して同種異系もしくは異種である、方法。
請求項５９、６２、６５、６８、７１もしくは７３のいずれか一つに記載の方法において、
前記患者に移植された前記細胞の生存および機能を促進する医薬的担体もしくは生体活性剤を前記患者に投与する段階、
をさらに含み、
前記担体もしくは薬剤は、前記患者への前記細胞の前記移植の前、前記移植の後、もしくは前記移植と同時に、投与される、方法。
請求項５９、６２、６５、６８、７１もしくは７３の任意の一つに従う方法において、
前記患者に移植される前記細胞は、ポリマー支持材に取り込まれている、方法。
請求項７６に従う前記方法において、
前記ポリマー支持材は、前記患者において前記細胞の生存および機能を促進する医薬的担体もしくは生体活性剤をも担持している、方法。