CN116496980A - 一种炎症性肠病肠道隐窝分离液、分离方法及体外3d类器官培养方法 - Google Patents
一种炎症性肠病肠道隐窝分离液、分离方法及体外3d类器官培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种炎症性肠病肠道隐窝分离液、分离方法及体外3D类器官培养方法。肠道隐窝分离液包括氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸、乙二醇双四乙酸，可快速分离炎症性肠病肠道隐窝，并可体外培养形成隐窝类器官模型。本发明不论是肠道隐窝的分离方法还是分离后隐窝的体外培养过程，均表现出方法简易，构建迅速，可操作性强的良好特征，适用于炎症性肠病发生发展的基础研究、潜在有效治疗药物的筛选等，具有产业化意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种炎症性肠病肠道隐窝分离液、分离方法及体外3D类器官培养方法。
背景技术
临床统计表明，炎症性肠病可发生于任何年龄的人群，但通常在15到40岁之间被诊断出来。炎症性肠病一词主要用于描述两种情况：溃疡性结肠炎和克罗恩病。溃疡性结肠炎和克罗恩病均为涉及肠道炎症的长期、慢性疾病。其中，溃疡性结肠炎只影响结肠（大肠），而克罗恩病可以影响消化系统的任何部分，即从口腔到肛门。目前尚不清楚导致炎症性肠病的根本原因，但多方的研究认为，炎症性肠病是由多种因素共同造成，包括：遗传学上的患者近亲结婚、免疫系统紊乱以及吸烟等。目前还没有治愈溃疡性结肠炎或克罗恩病的方法，其治疗过程旨在缓解症状并防止其复发，该过程包括特定的饮食、生活方式的改变、药物和手术等。此外，临床上，炎症性肠病的症状可以反反复复，表现为有时症状可能很严重（突然发作），然后是长时间几乎没有或根本没有症状（缓解），给患者的生活带来了极大的困扰。因此，揭开炎症性肠病发生的分子机制及采用有效治疗策略非常重要。目前来说，炎症性肠病的研究模型主要是使用DSS或TNBS诱导小鼠发病。该动物模型虽然在炎症性肠病发生发展的机制和治疗药物筛选上具有一定的参考意义，但是该模型主要为药物诱导模型，致病因素较为明确单一，不符合实际患者的复杂因素致病情况，且研究内容较为宏观。因此，一种更加符合临床真实致病情况，且可以做细胞分子层面深入研究的体外模型亟待开发。
类器官是一种利用细胞干性构建的、具有多种特异细胞类型的体外研究模型，其可以来源于胚胎细胞、成人干细胞、多能干细胞和诱导多能干细胞等。到目前为止，多种人类上皮组织，包括结肠、胰腺、前列腺和乳腺等，均被报道可以形成体外类器官。隐窝作为重要的肠道组织结构单位，不仅含有肠道再生、修复的各种干细胞亚群，而且具有形成体外类器官的能力。关于利用炎症性肠病患者肠组织分离隐窝做3D类器官培养的方法鲜有报道。近些年的研究表明，类器官不但能够很好地保留来源组织的表型和遗传特性，而且还具有复杂的内部结构，在功能及构造上趋近于相应体内结构。因此，基于多细胞组分的隐窝类器官体外疾病模型可以很好地重现炎症性肠病患者肠组织中细胞微环境，保留细胞间的互相作用，为深入研究炎症性肠病发生发展的机制、潜在治疗药物的体外筛选提供了新途径。
发明内容
本发明针对目前炎症性肠病的研究模型主要为药物诱导模型，致病因素较为明确单一，不符合实际患者的复杂因素致病情况的问题，提供一种炎症性肠病肠道隐窝分离液、分离方法及体外3D类器官培养方法，进而获得一种更加符合临床真实致病情况，且可以做细胞分子层面深入研究的体外3D类器官模型。
本发明首先提供一种炎症性肠病肠道隐窝分离液，包括以下浓度的组分：1~2mmol/L 氯化钾、90~100mmol/L 氯化钠、6~10 mmol/L磷酸氢二钾、5~15mmol/L 磷酸二氢钠、2~3 mmol/L 乙二胺四乙酸、400~600 mmol/L 乙二醇双四乙酸。
优选的炎症性肠病肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1.5 mmol/L 氯化钾、96mmol/L 氯化钠、8 mmol/L磷酸氢二钾、10mmol/L 磷酸二氢钠、2.5 mmol/L 乙二胺四乙酸、500 mmol/L 乙二醇双四乙酸。
本发明另外提供一种炎症性肠病肠道隐窝分离方法，包括以下步骤：
步骤一：将炎症性肠病肠道组织清理杂质和黏液；
步骤二：将大块炎症性肠病肠道组织切块，使用配制的隐窝分离液分离肠道隐窝；所述肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1~2 mmol/L 氯化钾、90~100mmol/L 氯化钠、6~10 mmol/L磷酸氢二钾、5~15mmol/L 磷酸二氢钠、2~3 mmol/L 乙二胺四乙酸、400~600mmol/L 乙二醇双四乙酸。
优选的炎症性肠病肠道隐窝分离方法步骤二中将大块炎症性肠病肠道组织切成5-10mm3，肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1.5 mmol/L 氯化钾、96 mmol/L 氯化钠、8mmol/L磷酸氢二钾、10mmol/L 磷酸二氢钠、2.5 mmol/L 乙二胺四乙酸、500 mmol/L 乙二醇双四乙酸。
本发明还提供一种炎症性肠病肠道隐窝体外3D类器官培养方法，包括以下步骤：
步骤一：将炎症性肠病肠道组织清理杂质和黏液；
步骤二：将大块炎症性肠病肠道组织切块，使用配制的隐窝分离液分离肠道隐窝；
步骤三：用基质胶包被分离的肠道隐窝，并等待基质胶凝固；
步骤四：加入肠道隐窝类器官培养基，静置培养；
步骤五：使用肠道隐窝类器官培养基半量换液，维持培养；
步骤六：收集培养好的隐窝类器官。
所述步骤二肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1~2 mmol/L 氯化钾、90~100mmol/L 氯化钠、6~10 mmol/L磷酸氢二钾、5~15mmol/L 磷酸二氢钠、2~3 mmol/L 乙二胺四乙酸、400~600 mmol/L 乙二醇双四乙酸；
所述肠道隐窝类器官培养基包括以下浓度的组分：100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、5~15 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、2~6 mmol/L L-谷氨酰胺（GlutaMAX）、40 ~60mmol/L 表皮生长因子（EGF）、100 mmol/L wnt通路配体蛋白3、10 mmol/L ROCK 抑制剂、500 nmol/L TGF-βI型受体抑制剂(A83-01)、10 mmol/L p38-MAPK 抑制剂、1% (vol/vol)N2细胞培养添加剂、1% (vol/vol) B27细胞培养添加剂、10% (vol/vol) 胎牛血清（FBS）、4% (vol/vol)Rspo-1 条件培养基 和 4% (vol/vol) Noggin-Fc 融合蛋白条件培养基和高级DMEM/F12培养基。
所述步骤二中将大块炎症性肠病肠道组织切成5-10mm3，所述肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1.5 mmol/L 氯化钾、96 mmol/L 氯化钠、8 mmol/L磷酸氢二钾、10mmol/L 磷酸二氢钠、2.5 mmol/L 乙二胺四乙酸、500 mmol/L 乙二醇双四乙酸；
所述步骤五每隔1-3天使用肠道隐窝类器官培养基半量换液，维持培养；
所述步骤六第8~12天收集培养好的隐窝类器官。
所述步骤五每隔2天使用肠道隐窝类器官培养基半量换液，维持培养；
所述步骤六第10天收集培养好的隐窝类器官。
所述步骤三将分离的肠道隐窝使用PBS调整密度为50个隐窝/10ul后，按照基质胶：细胞悬液的体积比为4：1混合均匀制成混悬液，接种于24孔板，每孔接种混悬液的体积为50µL，然后放入37℃二氧化碳培养箱，等待基质胶凝固。
在所述步骤五第3天半量换液一次，使用移液枪紧贴培养基液面，吸弃孔中500µL培养基，并加入等量肠道隐窝类器官培养基，每间隔2天，重复一次该操作。
培养至第10天，使用1mL移液枪，吸弃上清，沿着24孔板壁加入500µL/孔的类器官回收液，冰上孵育60-90min，视基质胶完全溶解即可。
基质胶完全溶解后，使用1000µL移液枪收集24孔板中所有类器官混合液置15mL离心管，离心去上清后，沉淀即为隐窝类器官。
实验结果表明，本发明可快速分离炎症性肠病肠道隐窝，并可体外培养形成隐窝类器官模型。
本发明基于炎症性肠病患者肠道隐窝微环境构成，快速分离并构建形态稳定的3D肠道隐窝模型。本发明不论是肠道隐窝的分离方法还是分离后隐窝的体外培养过程，均表现出方法简易，构建迅速，可操作性强的良好特征，适用于炎症性肠病发生发展的基础研究、潜在有效治疗药物的筛选等，具有产业化意义。
附图说明
图1 为分离的溃疡性结肠炎隐窝形态的光镜拍摄图。
图2 为分离的克罗恩病隐窝形态的光镜拍摄图。
图3 为常规方法（只含有乙二胺四乙酸成分的隐窝分离液）分离溃疡性结肠炎隐窝形态的光镜拍摄图。
图4 为常规方法（只含有乙二胺四乙酸成分的隐窝分离液）分离克罗恩病隐窝形态的光镜拍摄图。
图5为溃疡性结肠炎隐窝类器官光镜拍摄图。
图6 为克罗恩病隐窝类器官光镜拍摄图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，但并不用于限定本发明。
本发明实施例所用产品来源如下：
氯化钾（繁初，Czj7iI0E）、氯化钠（茂捷，10019318）、磷酸氢二钾（西陇科学，XL0015）、磷酸二氢钠（茂捷，10020318）、乙二胺四乙酸（EDTA，西陇科学，XL0075）、乙二醇双四乙酸（EGTA，惠利得，67-42-5）。
青霉素/链霉素（BIOSHARP LIFE SCIENCES，BL505A）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，勋狸粑，7365-45-9）、L-谷氨酰胺（GlutaMAX，Invitrogen，477707）、表皮生长因子（EGF，MCE, HY-P7109）、wnt通路配体蛋白3 （abcam，ab204763）、ROCK 抑制剂（MCE, HY-10071）、TGF-βI型受体抑制剂(A83-01，abcam，HY-10432)、p38-MAPK 抑制剂（selleck，S1076）、N2细胞培养添加剂（Gibco，17502048）、B27细胞培养添加剂（Gibco，17504044）、胎牛血清（FBS，Ausbian，WS500T）、Rspo-1 条件培养基（常规方法自产）、Noggin-Fc 融合蛋白条件培养基（常规方法自产）和高级DMEM/F12培养基（Gibco，12634010），溃疡性结肠炎肠道组织（医某院手术组织），克罗恩病肠道组织（某医院手术组织）。
实施例1
配制含有下列浓度的肠道隐窝分离液备用：1 mmol/L 氯化钾、100mmol/L 氯化钠、10 mmol/L磷酸氢二钾、5mmol/L 磷酸二氢钠、2 mmol/L 乙二胺四乙酸、400 mmol/L 乙二醇双四乙酸。
实施例2
配制含有下列浓度的肠道隐窝分离液备用：1.5 mmol/L 氯化钾、96 mmol/L 氯化钠、8 mmol/L磷酸氢二钾、10mmol/L 磷酸二氢钠、2.5 mmol/L 乙二胺四乙酸、500 mmol/L乙二醇双四乙酸。
实施例3
配制含有下列浓度的肠道隐窝分离液备用：2 mmol/L 氯化钾、90 mmol/L 氯化钠、6mmol/L磷酸氢二钾、15mmol/L 磷酸二氢钠、3mmol/L 乙二胺四乙酸、600 mmol/L 乙二醇双四乙酸。
实施例4
分离溃疡性结肠炎及体外培养溃疡性结肠炎隐窝类器官
步骤一，将新鲜溃疡性结肠炎肠道组织用无菌PBS反复冲洗，直至PBS浣洗液澄清。
步骤二，使用一次性手术刀切割洗净的溃疡性结肠炎肠道组织，切割为大小在5-10mm3左右的小块，浸没入30mL实施例2配制的肠道隐窝分离液中，整体放入50mL离心管，并将50mL离心管盖子拧紧后水平放置于带有一般体积冰的泡沫盒中，做摇床冰浴60min，同时100rpm/min振摇；将离心管在低温下（2-8°C）上下颠倒震摇（约100次/分钟）2分钟，后吸取含肠内容物的悬液于50mL离心管中，一方面收集悬液静置沉淀，另一方面重新加入25mL新的肠道隐窝分离液，上述相同条件下颠倒震摇10分钟，至肉眼可见的针尖样大细胞团出现在悬液中；弃50mL离心管中自然沉降后的上清，并将多管混合于同一50mL离心管中，加入20mL的无菌PBS洗涤收集的隐窝，后4°C下以200g离心5分钟后，弃去上清。再次使用1ml 无菌PBS溶液重悬隐窝沉淀，取10ul于4倍镜下计隐窝数，并换算1ml 无菌PBS溶液中的隐窝总数。分离的溃疡性结肠炎隐窝形态的光镜拍摄图如图1所示。
步骤三，将分离的溃疡性结肠炎隐窝使用PBS调整细胞密度为50个隐窝/10ul后，按照基质胶：细胞悬液（体积比）为4：1快速混合均匀制成混悬液，快速接种于24孔板（37℃二氧化碳培养箱中预热2h以上），每孔接种混悬液一滴，体积为50µL。然后放入37℃二氧化碳培养箱静置，尽量避免移动，等待基质胶凝固。
步骤四，20min后，待基质胶凝固，24孔板每孔加入1ml肠道隐窝类器官培养基。肠道隐窝类器官培养基包括：100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、5~15 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、2~6 mmol/L L-谷氨酰胺（GlutaMAX）、40 ~60mmol/L 表皮生长因子（EGF）、100 mmol/L wnt通路配体蛋白3、10 mmol/L ROCK 抑制剂、500 nmol/L TGF-βI型受体抑制剂(A83-01)、10 mmol/L p38-MAPK 抑制剂、1% (vol/vol) N2细胞培养添加剂、1% (vol/vol) B27细胞培养添加剂、10% (vol/vol) 胎牛血清（FBS）、4% (vol/vol)Rspo-1 条件培养基和4% (vol/vol) Noggin-Fc 融合蛋白条件培养基和高级DMEM/F12培养基。
步骤五，接种后在肠道隐窝类器官培养基中置于37℃，5% CO2培养箱中静置培养，第二天可观察每个孔形成隐窝闭合细胞团。第3天半量换液一次，使用移液枪紧贴培养基液面，吸弃孔中500µL培养基，并加入等量肠道隐窝类器官培养基。每间隔2天，重复一次该操作。
步骤六，培养至第10天，使用1mL移液枪，吸弃上清，沿着24孔板壁加入500µL/孔的类器官回收液，冰上孵育60-90min，视基质胶完全溶解即可；基质胶完全溶解后，使用1000µL移液枪收集24孔板中所有类器官混合液置15mL离心管，用预冷的PBS定容到10ml。4°C下以200g离心5分钟后，弃去上清，沉淀即为溃疡性结肠炎隐窝类器官，光镜拍摄图如图5所示，可进行后续相关研究。
实施例5
参考实施例4步骤，步骤二使用实施例1配制的肠道隐窝分离液中，分离的溃疡性结肠炎隐窝形态的光镜拍摄图和图1基本相同，得到的溃疡性结肠炎隐窝类器官，光镜拍摄图和图1基本相同。
实施例6
参考实施例4步骤，步骤二使用实施例3配制的肠道隐窝分离液中，分离的溃疡性结肠炎隐窝形态的光镜拍摄图和图1基本相同，得到的溃疡性结肠炎隐窝类器官，光镜拍摄图和图1基本相同。
实施例7
分离溃疡性结肠炎及体外培养溃疡性结肠炎隐窝类器官
步骤一，将新鲜克罗恩病肠道组织用无菌PBS反复冲洗，直至PBS浣洗液澄清。
步骤二，使用一次性手术刀切割洗净的克罗恩病肠道组织，切割为大小在5-10mm3左右的小块，浸没入30mL实施例2配制的肠道隐窝分离液中，整体放入50mL离心管，并将50mL离心管盖子拧紧后水平放置于带有一般体积冰的泡沫盒中，做摇床冰浴60min，同时100rpm/min振摇；将离心管在低温下（2-8°C）上下颠倒震摇（约100次/分钟）2分钟，后吸取含肠内容物的悬液于50mL离心管中，一方面收集悬液静置沉淀，另一方面重新加入25mL新的肠道隐窝分离液，上述相同条件下颠倒震摇10分钟，至肉眼可见的针尖样大细胞团出现在悬液中；弃50mL离心管中自然沉降后的上清，并将多管混合于同一50mL离心管中，加入20mL的无菌PBS洗涤收集的隐窝，后4°C下以200g离心5分钟后，弃去上清。再次使用1ml 无菌PBS溶液重悬隐窝沉淀，取10ul于4倍镜下计隐窝数，并换算1ml 无菌PBS溶液中的隐窝总数。分离的克罗恩病隐窝形态的光镜拍摄图如图2所示。
步骤三，将分离的克罗恩病隐窝使用PBS调整细胞密度为50个隐窝/10ul后，按照基质胶：细胞悬液（体积比）为4：1快速混合均匀制成混悬液，快速接种于24孔板（37℃二氧化碳培养箱中预热2h以上），每孔接种混悬液一滴，体积为50µL。然后放入37℃二氧化碳培养箱静置，尽量避免移动，等待基质胶凝固。
步骤四，20min后，待基质胶凝固，24孔板每孔加入1ml肠道隐窝类器官培养基。肠道隐窝类器官培养基包括：100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、5~15 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、2~6 mmol/L L-谷氨酰胺（GlutaMAX）、40 ~60mmol/L 表皮生长因子（EGF）、100 mmol/L wnt通路配体蛋白3、10 mmol/L ROCK 抑制剂、500 nmol/L TGF-βI型受体抑制剂(A83-01)、10 mmol/L p38-MAPK 抑制剂、1% (vol/vol) N2细胞培养添加剂、1% (vol/vol) B27细胞培养添加剂、10% (vol/vol) 胎牛血清（FBS）、4% (vol/vol)Rspo-1 条件培养基和4% (vol/vol) Noggin-Fc 融合蛋白条件培养基和高级DMEM/F12培养基。
步骤五，接种后在肠道隐窝类器官培养基中置于37℃，5% CO2培养箱中静置培养，第二天可观察每个孔形成隐窝闭合细胞团。第3天半量换液一次，使用移液枪紧贴培养基液面，吸弃孔中500µL培养基，并加入等量肠道隐窝类器官培养基。每间隔2天，重复一次该操作。
步骤六，培养至第10天，使用1mL移液枪，吸弃上清，沿着24孔板壁加入500µL/孔的类器官回收液，冰上孵育60-90min，视基质胶完全溶解即可；基质胶完全溶解后，使用1000µL移液枪收集24孔板中所有类器官混合液置15mL离心管，用预冷的PBS定容到10ml。4°C下以200g离心5分钟后，弃去上清，沉淀即为克罗恩病隐窝类器官，光镜拍摄图如图6所示，可进行后续相关研究。
实施例8
参考实施例7步骤，步骤二使用实施例1配制的肠道隐窝分离液中，分离的克罗恩病隐窝形态的光镜拍摄图和图2基本相同，得到的克罗恩病隐窝类器官，光镜拍摄图和图6基本相同。
实施例9
参考实施例7步骤，步骤二使用实施例3配制的肠道隐窝分离液中，分离的克罗恩病隐窝形态的光镜拍摄图和图2基本相同，得到的克罗恩病隐窝类器官，光镜拍摄图和图6基本相同。
对比例1
常规方法（只含有乙二胺四乙酸成分的隐窝分离液）分离溃疡性结肠炎隐窝
参考实施例4的肠道隐窝分离方法：
步骤一，将新鲜溃疡性结肠炎肠道组织用无菌PBS反复冲洗，直至PBS浣洗液澄清。
步骤二，使用一次性手术刀切割洗净的溃疡性结肠炎肠道组织，切割为大小在5-10mm3左右的小块，浸没入30mL配制的乙二胺四乙酸（EDTA，终浓度2.5 mmol/L，pH8.0）肠道隐窝分离液中，整体放入50mL离心管，并将50mL离心管盖子拧紧后水平放置于带有一般体积冰的泡沫盒中，做摇床冰浴60min，同时100rpm/min振摇；将离心管在低温下（2-8°C）上下颠倒震摇（约100次/分钟）2分钟，后吸取含肠内容物的悬液于50mL离心管中，一方面收集悬液静置沉淀，另一方面重新加入25mL新的肠道隐窝分离液，上述相同条件下颠倒震摇10分钟，至肉眼可见的针尖样大细胞团出现在悬液中；弃50mL离心管中自然沉降后的上清，并将多管混合于同一50mL离心管中，加入20mL的无菌PBS洗涤收集的隐窝，后4°C下以200g离心5分钟后，弃去上清。再次使用1ml 无菌PBS溶液重悬隐窝沉淀，取10ul于4倍镜下计隐窝数，并换算1ml 无菌PBS溶液中的隐窝总数。分离的溃疡性结肠炎隐窝形态的光镜拍摄图如图3所示。
对比例2
常规方法（只含有乙二胺四乙酸成分的隐窝分离液）分离克罗恩病隐窝
参考实施例4的肠道隐窝分离方法：
步骤一，将新鲜克罗恩病肠道组织用无菌PBS反复冲洗，直至PBS浣洗液澄清。
步骤二，使用一次性手术刀切割洗净的克罗恩病肠道组织，切割为大小在5-10mm3左右的小块，浸没入30mL配制的乙二胺四乙酸（EDTA，终浓度2.5 mmol/L，pH8.0）肠道隐窝分离液中，整体放入50mL离心管，并将50mL离心管盖子拧紧后水平放置于带有一般体积冰的泡沫盒中，做摇床冰浴60min，同时100rpm/min振摇；将离心管在低温下（2-8°C）上下颠倒震摇（约100次/分钟）2分钟，后吸取含肠内容物的悬液于50mL离心管中，一方面收集悬液静置沉淀，另一方面重新加入25mL新的肠道隐窝分离液，上述相同条件下颠倒震摇10分钟，至肉眼可见的针尖样大细胞团出现在悬液中；弃50mL离心管中自然沉降后的上清，并将多管混合于同一50mL离心管中，加入20mL的无菌PBS洗涤收集的隐窝，后4°C下以200g离心5分钟后，弃去上清。再次使用1ml 无菌PBS溶液重悬隐窝沉淀，取10ul于4倍镜下计隐窝数，并换算1ml 无菌PBS溶液中的隐窝总数。分离的克罗恩病隐窝形态的光镜拍摄图如图4所示。
由图1和图3，图2和图4对比可知，本申请方法分离的肠道隐窝无论数量和质量（完整性）均优于对比例。同样由图5和图6可知，本申请方法培养的隐窝类器官的形成伴随类器官腔内空间的剧烈减小，隆起并逐渐发育为成熟的芽状结构，形成了典型的具有肠隐窝-绒毛结构的肠类器官。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种炎症性肠病肠道隐窝分离液，其特征在于，所述肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1~2 mmol/L 氯化钾、90~100mmol/L 氯化钠、6~10 mmol/L磷酸氢二钾、5~15mmol/L磷酸二氢钠、2~3 mmol/L 乙二胺四乙酸、400~600 mmol/L 乙二醇双四乙酸。
2.根据权利要求1所述的炎症性肠病肠道隐窝分离液，其特征在于，所述肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1.5 mmol/L 氯化钾、96 mmol/L 氯化钠、8 mmol/L磷酸氢二钾、10mmol/L 磷酸二氢钠、2.5 mmol/L 乙二胺四乙酸、500 mmol/L 乙二醇双四乙酸。
3.一种炎症性肠病肠道隐窝分离方法，其特征在于所述分离方法包括以下步骤：
步骤一：将炎症性肠病肠道组织清理杂质和黏液；
步骤二：将大块炎症性肠病肠道组织切块，使用配制的隐窝分离液分离肠道隐窝；所述肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1~2 mmol/L 氯化钾、90~100mmol/L 氯化钠、6~10mmol/L磷酸氢二钾、5~15mmol/L 磷酸二氢钠、2~3 mmol/L 乙二胺四乙酸、400~600 mmol/L乙二醇双四乙酸。
4.根据权利要求3所述的炎症性肠病肠道隐窝分离方法，其特征在于，所述步骤二中将大块炎症性肠病肠道组织切成5-10mm3，所述肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1.5mmol/L 氯化钾、96 mmol/L 氯化钠、8 mmol/L磷酸氢二钾、10mmol/L 磷酸二氢钠、2.5mmol/L 乙二胺四乙酸、500 mmol/L 乙二醇双四乙酸。
5.一种炎症性肠病肠道隐窝体外3D类器官培养方法，其特征在于，所述体外3D类器官培养方法包括以下步骤：
步骤一：将炎症性肠病肠道组织清理杂质和黏液；
步骤二：将大块炎症性肠病肠道组织切块，使用配制的隐窝分离液分离肠道隐窝；
步骤三：用基质胶包被分离的肠道隐窝，并等待基质胶凝固；
步骤四：加入肠道隐窝类器官培养基，静置培养；
步骤五：使用肠道隐窝类器官培养基半量换液，维持培养；
步骤六：收集培养好的隐窝类器官。
6.根据权利要求5所述的肠道隐窝体外3D类器官培养方法，其特征在于，所述步骤二肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1~2 mmol/L 氯化钾、90~100mmol/L 氯化钠、6~10mmol/L磷酸氢二钾、5~15mmol/L 磷酸二氢钠、2~3 mmol/L 乙二胺四乙酸、400~600 mmol/L乙二醇双四乙酸；
所述肠道隐窝类器官培养基包括以下浓度的组分：100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、5~15 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、2~6 mmol/L L-谷氨酰胺（GlutaMAX）、40 ~60mmol/L 表皮生长因子（EGF）、100 mmol/L wnt通路配体蛋白3、10 mmol/L ROCK 抑制剂、500 nmol/L TGF-βI型受体抑制剂(A83-01)、10 mmol/L p38-MAPK 抑制剂、1% (vol/vol)N2细胞培养添加剂、1% (vol/vol) B27细胞培养添加剂、10% (vol/vol) 胎牛血清（FBS）、4% (vol/vol) Rspo-1 条件培养基 和 4% (vol/vol) Noggin-Fc 融合蛋白条件培养基和高级DMEM/F12培养基。
7.根据权利要求5所述的肠道隐窝体外3D类器官培养方法，其特征在于，所述步骤二中将大块炎症性肠病肠道组织切成5-10mm3，所述肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1.5mmol/L 氯化钾、96 mmol/L 氯化钠、8 mmol/L磷酸氢二钾、10mmol/L 磷酸二氢钠、2.5mmol/L 乙二胺四乙酸、500 mmol/L 乙二醇双四乙酸；
所述步骤五每隔1-3天使用肠道隐窝类器官培养基半量换液，维持培养；
所述步骤六第8~12天收集培养好的隐窝类器官。
8.根据权利要求7所述的肠道隐窝体外3D类器官培养方法，其特征在于，所述步骤五每隔2天使用肠道隐窝类器官培养基半量换液，维持培养；
所述步骤六第10天收集培养好的隐窝类器官。
9.根据权利要求5所述的肠道隐窝体外3D类器官培养方法，其特征在于，所述步骤三将分离的肠道隐窝使用PBS调整密度为50个隐窝/10ul后，按照基质胶：细胞悬液的体积比为4：1混合均匀制成混悬液，接种于24孔板，每孔接种混悬液的体积为50µL，然后放入37℃二氧化碳培养箱，等待基质胶凝固。
10.根据权利要求9所述的肠道隐窝体外3D类器官培养方法，其特征在于，在所述步骤五第3天半量换液一次，使用移液枪紧贴培养基液面，吸弃孔中500µL培养基，并加入等量肠道隐窝类器官培养基，每间隔2天，重复一次该操作。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120196312A1 (en) * | 2009-02-03 | 2012-08-02 | Toshiro Sato | Culture medium for epithelial stem cells and organoids comprising the stem cells |
| CN104024401A (zh) * | 2011-06-10 | 2014-09-03 | 荷兰皇家科学院 | 用于干细胞的培养基 |
| CN108728399A (zh) * | 2018-04-09 | 2018-11-02 | 浙江工商大学 | 基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3d培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法 |
| CN109161516A (zh) * | 2018-09-13 | 2019-01-08 | 华中农业大学 | 一种猪肠道隐窝分离和3d类器官培养的方法 |
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- 2023-06-28 CN CN202310768505.1A patent/CN116496980A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120196312A1 (en) * | 2009-02-03 | 2012-08-02 | Toshiro Sato | Culture medium for epithelial stem cells and organoids comprising the stem cells |
| CN104024401A (zh) * | 2011-06-10 | 2014-09-03 | 荷兰皇家科学院 | 用于干细胞的培养基 |
| CN108728399A (zh) * | 2018-04-09 | 2018-11-02 | 浙江工商大学 | 基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3d培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法 |
| CN109161516A (zh) * | 2018-09-13 | 2019-01-08 | 华中农业大学 | 一种猪肠道隐窝分离和3d类器官培养的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 刘鼎新等: "《中华民族永生细胞库的建立 理论与实践》", 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社, pages: 96 - 98 * |
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