CN104745525A

CN104745525A - 一种猪肠道隐窝的分离液及其分离方法

Info

Publication number: CN104745525A
Application number: CN201510080396.XA
Authority: CN
Inventors: 王修启; 黎相广; 高春起; 严会超; 傅厚龙; 陈明霞; 翟振亚; 范宏博
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2015-02-15
Filing date: 2015-02-15
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2035-02-15
Also published as: CN104745525B

Abstract

本发明属于组织分离技术领域，具体公开了一种用于分离猪肠道隐窝的分离液及其分离方法，该分离液包括以下浓度各组分：5.0～10.0mM HEPES；5.0～30.0 mM Na₂EDTA-2H₂O；0.50～1.0 mM DTT；0.25～0.50 mM BSA；2.5～3.0 mM 葡萄糖；0.5～2.5 mM谷氨酰胺；0.50～1.0 mM DL-β-羟丁酸钠；2～10 mM Y-27632；1.5～2.7 mM KCl；1.0～1.5 mM KH₂PO₄；130～138 mM NaCl；5～8 mM Na₂HPO₄-7H₂O；在低温条件下仔猪小肠通过上述分离液和HBSS的配合获得结构完整、活性和纯度都较高的猪肠道隐窝。

Description

一种猪肠道隐窝的分离液及其分离方法

技术领域

本发明涉及组织分离技术领域，更具体地，涉及一种猪肠道隐窝的分离液及其分离方法。

背景技术

肠道是哺乳动物营养物质吸收的主要部位和最大的免疫器官。肠道上皮平均3～5天更新一次，是成年哺乳动物自我更新速度最快的组织，小肠上皮由肠绒毛-隐窝轴（villus-crypt axis）构成，伸向肠腔的绒毛包含3类成熟的上皮细胞：吸收细胞（enterocyte）、杯状细胞（goblet cell）和内分泌细胞（enteroendocrine cell），可划分为功能区和增殖区；功能区由不具备分化能力的成熟上皮细胞组成，这些具有不同功能的细胞共同构成了绒毛结构，其中，吸收细胞占肠道上皮细胞数量的90%以上，发挥吸收营养素的功能；杯状细胞分泌粘液，形成保护屏障；分泌细胞可分泌胃肠激素。增殖区位于隐窝，是肠道上皮不断更新的源泉，肠道上皮更新失调和更新受损会引起肠癌、溃疡、慢性炎症应答和败血症等。因此，肠道隐窝是维持肠道健康和肠道功能的结构基础。

现代社会，炎症性及肿瘤性等肠道疾病越来越突出，而伦理问题限制了以人或其肠道作为材料研究肠道上皮更新。因此，亟需开发一个肠道解剖学、生理学以及疾病和损伤过程都与人相近的研究模型。猪的采食习性、肠粘膜屏障生理、肠道微生物组成和主要肠道疾病与人相近，可作为一个良好的研究模型。为了能够获得结构完整且高纯度的猪肠道隐窝，为肠道上皮更新研究和组织特异性移植提供材料，现有技术已有关于猪肠道隐窝的分离和纯化的研究，目前各种研究证据表明，可通过EDTA螯合的方法，将猪肠道隐窝分离出来，但是，用这种方法获得的隐窝的结构完整性、纯度和活性却遭到了一定程度的破坏。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术所存在的上述缺陷，提供一种用于分离猪肠道隐窝的分离液。

本发明的第二个目的是提供一种猪肠道隐窝的分离方法。

本发明的第三个目的是提供一种猪肠道隐窝的纯化方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种用于分离猪肠道隐窝的分离液，包括以下浓度各组分：5.0～10.0mM HEPES；5.0～30.0 mM Na₂EDTA-2H₂O；0.50～1.0 mM DTT；0.25～0.50 mM BSA；2.5～3.0 mM 葡萄糖；0.5～2.5 mM 谷氨酰胺；0.50～1.0 mM DL-β-羟丁酸钠；2～10 mM Y-27632；1.5～2.7 mM KCl；1.0～1.5 mM KH₂PO₄；130～138 mM NaCl；5～8 mM Na₂HPO₄-7H₂O。

现有技术中有EDTA螯合剂用于分离小鼠的肠道隐窝，其所用的螯合剂为EDTA和多种盐溶液的组合，发明人通过前期研究发现，将用于分离小鼠的肠隐窝的螯合剂用于分离猪的肠道隐窝时，会对猪肠道隐窝的结构、活性造成一定程度的破坏，因此，发明人在现有技术的基础上对猪肠道隐窝的分离液做出了改进，得到本发明所述专用于分离猪肠道隐窝的分离液。

本发明所述分离液的组成中，谷氨酰胺是肠道上皮细胞主要的能量供体和重要的功能调节剂；在分离猪肠道隐窝时可起到保护隐窝细胞活性的作用；β-羟丁酸钠是一种神经传递的抑制剂，起到麻醉和减缓肠道应激的作用。

优选地，本发明所述分离液包括以下浓度各组分：10.0mM HEPES；30.0 mM Na₂EDTA-2H₂O；0.50 mM DTT；0.25 mM BSA；2.5 mM 葡萄糖；2.5 mM 谷氨酰胺；0.50 mM DL-β-羟丁酸钠；10 mM Y-27632；2.7 mM KCl；1.5 mM KH₂PO₄；138 mM NaCl；8 mM Na₂HPO₄-7H₂O。

在得到上述分离液的基础上，本发明还提供上述分离液在猪肠道隐窝分离中的应用。

本发明对现有技术中猪肠道隐窝的分离方法也做出了改进，即在低温条件下通过上述分离液和HBSS的配合获得结构完整且活性和纯度都较高的猪肠道隐窝。

本发明所述猪肠道隐窝的分离方法，包括以下步骤：

S1. 将清洗过的仔猪小肠剪成小段，低温条件下，在上述分离液中通过孵育-振动去除肠绒毛；

S2. 去除分离液，将小肠置于HBSS中振动一段时间，重复步骤S2，即可分离获得肠道隐窝。

优选地，上述分离方法中，步骤S1中孵育-振动重复1～2遍，步骤S2重复2～4遍。

优选地，S1所述孵育在低速离心的条件下进行，更优选地，所述孵育是在100r/min的条件下进行，孵育的时间为10～20min。

优选地，S1和S2所述振动的时间为2～10min。

本发明所述小肠可以选择空肠、十二指肠和回肠；优选地，可以是空肠。

不同日龄仔猪肠道绒毛和隐窝大小不同，筛选合适日龄的仔猪可以达到最优分离肠道隐窝的目的；因此，优选地，所述仔猪为5日龄仔猪。

优选地，所述低温为0～8℃；更优选地，所述低温是在4℃条件下进行。

作为一种优选的技术方案，本发明上述猪肠道隐窝的分离方法包括以下步骤：

S1. 取仔猪空肠，用冰冷的HBSS将内容物冲洗干净，将空肠剪成小段；

S2. 空肠小段转移至离心管中，并加入4倍于肠段体积的冰冷的分离液，4℃且100r/min条件下孵育10min后，以约1次/s的频率颠倒震摇2min，此时分离得到的主要为绒毛；

S3. 去除液体，保留空肠小段，加入冰冷的分离液，4℃且100rpm条件下孵育20min后，以约1次/s的频率手动颠倒震摇2min；

S4. 去除液体，保留空肠小段，加入冰冷的HBSS，以约1次/s的频率手动颠倒震摇10min；

S5. 重复S4 2～4次，即可分离到隐窝。

本发明还提供上述猪肠道隐窝的纯化方法，是将上述任一种方法获得的猪肠道隐窝通过差速沉淀的方法进行纯化，纯化后的猪肠道隐窝的纯度达95%。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种用于分离猪肠道隐窝的分离液，利用该分离液，选择合适日龄的仔猪的小肠，在低温条件下对仔猪小肠进行孵育，通过人工摇晃，将绒毛除去，再次低温孵育，通过多次在HBSS中人工摇晃，获得结构完整，活性和纯度都较高的隐窝，将获得的隐窝再通过差速沉淀的方法进行纯化，即可进一步获得高纯度的隐窝，纯化后的猪肠道隐窝的纯度达95%。所获得的隐窝为肠道上皮更新研究和组织特异性移植提供材料，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1为1日龄长白隐窝绒毛轴结构示意图。

图2为不同日龄长白仔猪隐窝大小观察（4×）；其中，图a、图b、图c和图d分别为1日龄、5日龄、7日龄和21日龄仔猪隐窝。

图3为不同方法分离到的隐窝的形态（4×）；其中，图a、图b、图c分别为刮粘膜法、外翻肠囊法和小肠片段法。

图4为纯化后的隐窝（4×）；随机选择6个视野计算隐窝的比例为0.95±0.04（n=6）。

图5为对比例1所述方法分离得到的隐窝观察（4×）。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1隐窝-绒毛轴结构观察

麻醉1日龄长白仔猪，放血处死后剖开仔猪腹部，取出空肠，用冰冷的HBSS将肠腔中的内容物冲洗干净，将空肠纵向剖开，再用冰冷的HBSS将粘附在肠道上皮上的杂质彻底洗涤干净；在解剖显微镜下，用镊子将空肠的肌肉层和上皮分开，取少量的猪肠道上皮置于载玻片上，制成压片，在显微镜下观察，结果如图1。

实施例2筛选合适日龄的仔猪

本实例涉及仔猪处死方法与实施例1相同；分别选择1、3、5、7和21日龄仔猪，取其空肠用下述方法分离肠道隐窝：

（1）取15cm空肠并外翻成肠囊，用HBSS将肠囊洗涤干净；

（2）结扎肠囊一端，往肠囊中灌注最大量的分离液1，再结扎另一端；

（3）将灌注好分离液1的肠囊置于100mL锥形瓶中，加入50mL分离液1（30.0mM Na₂EDTA-2H₂O），在37℃空气摇床中孵育，摇床转速为150r/min，孵育10～20min后，分离出来的主要为绒毛；

（4）更换新的分离液1，在37℃空气摇床中孵育，摇床转速为150r/min，孵育15～20min后，分离出来的主要为绒毛且混杂有少量隐窝；

（5）更换新的分离液1，在37℃空气摇床中孵育，摇床转速为150r/min，孵育20～30min后，分离出来的主要为隐窝。

实验结果如图2，从图2中可以看出，图中黑色箭头所指的为隐窝，随着仔猪日龄增长，隐窝长度不断增加，但是，日龄大的仔猪的隐窝分离时间也较日龄小的仔猪长，综合最终结果，选取5日龄仔猪进行隐窝分离最为合适。

实施例3猪肠道隐窝的分离方法

本实例涉及仔猪处死方法与实施例1相同。

选择5日龄的长白仔猪，取出空肠，用HBSS将内容物清洗干净后，分别用三种不同的方法分离隐窝。为达到为肠道组织提供足够的营养及抑制隐窝失巢性凋亡从而获得高活性隐窝的目的，本实例中所用的分离液命名为分离液2，其配方组成为：10.0mM HEPES；30.0mM Na₂EDTA-2H₂O；0.50mM DTT；0.25mM BSA；2.5mM D-glucose；2.5mM L-glutamine；0.50mM DL-β-羟丁酸钠；10mM Y-27632；2.7 mM KCl；1.5 mM KH₂PO₄；138 mM NaCl；8 mM Na₂HPO₄-7H₂O。

方法一：刮粘膜法

取10cm左右的空肠，纵向剖开，用HBSS清洗干净粘附在肠上皮上的杂质，用盖玻片将肠上皮逐层刮下，然后用HBSS重悬至合适的浓度。显微镜观察结果显示，首先刮下的是绒毛，最后刮下的是隐窝。

方法二：外翻肠囊法

除分离液不同外，操作步骤与实施例2相同。

方法三：肠道小片段法

（1）取15cm空肠，用冰冷的HBSS将内容物冲洗干净，用剪刀剪为1～2cm²的小片段；

（2）将肠道小片段转移至50 mL离心管中，并加入4倍于肠段体积的冰冷的分离液2，4℃且100r/min条件下孵育10min后，以约1次/s的频率颠倒震摇2min，此时分离得到的主要为绒毛；

（3）去除液体保留肠道小片段后加入约20mL冰冷的分离液2，4℃且100r/min条件下孵育20min后，以约1次/s的频率手动颠倒震摇2min；

（4）去除液体保留肠道小片段后加入约20mL冰冷的HBSS，以约1次/s的频率手动颠倒震摇10min；

（5）重复步骤（4）2～4次，可分离到隐窝。

上述三种分离方法获得的猪肠道隐窝在显微镜下观察如图3，从图3可以看出：方法一容易把隐窝的结构形态破坏；方法二需要在37℃下长时间分离，容易使隐窝活性下降；方法三可在低温条件下且较短时间内分离到结构完整的隐窝。

实施例4 分离及纯化

选择5日龄的长白仔猪，取出空肠，用HBSS将内容物清洗干净后，按照实施例3中的方法三：肠道小片段法分离得到隐窝，此时隐窝中混杂有部分绒毛，可进一步借助差速沉淀的方法纯化隐窝，步骤如下：

（1）用5mL移液器将含有隐窝和绒毛混合物的悬浮液转移至新的50mL离心管中，4℃静置1.5 min，体积较大的细胞团块沉淀到管底；

（2）将上清转移至新的50 mL离心管中，4℃静置5 min，此时沉淀的细胞团多为隐窝，吸出上清，获得隐窝。

（3）重复步骤（1）～（2），可获得纯度高达90%以上的隐窝，结果如图4。

对比例1

实验方法同实施例3，唯一不同的是所用的分离液的配方组成为：30.0mM Na₂EDTA-2H₂O；0.50 mM DTT；2.5 mM D-glucose；2.7 mM KCl；1.5 mM KH₂PO₄；138 mM NaCl；8 mM Na₂HPO₄-7H₂O，结果如图5，从图5中可以看出，用该分离液分离得到的隐窝有些没用被分离开来，有些隐窝的结构形态遭到破坏。

Claims

1.一种用于分离猪肠道隐窝的分离液，其特征在于，包括以下浓度各组分：5.0～10.0mM HEPES；5.0～30.0 mM Na₂EDTA-2H₂O；0.50～1.0 mM DTT；0.25～0.50 mM BSA；2.5～3.0 mM 葡萄糖；0.5～2.5 mM 谷氨酰胺；0.50～1.0 mM DL-β-羟丁酸钠；2～10 mM Y-27632；1.5～2.7 mM KCl；1.0～1.5 mM KH₂PO₄；130～138 mM NaCl；5～8 mM Na₂HPO₄-7H₂O。

2. 根据权利要求1所述的分离液，其特征在于，包括以下浓度各组分：10.0mM HEPES；30.0 mM Na₂EDTA-2H₂O；0.50 mM DTT；0.25 mM BSA；2.5 mM 葡萄糖；2.5 mM 谷氨酰胺；0.50 mM DL-β-羟丁酸钠；10 mM Y-27632；2.7 mM KCl；1.5 mM KH₂PO₄；138 mM NaCl；8 mM Na₂HPO₄-7H₂O。

3. 权利要求1或2所述分离液在猪肠道隐窝分离中的应用。

4. 一种猪肠道隐窝的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 将清洗过的仔猪小肠剪成小段，低温条件下，在权利要求1或2所述分离液中通过孵育-振动去除肠绒毛；

5. 根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，S1中孵育-振动重复1～2遍，步骤S2重复2～4遍。

6. 根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，S1所述孵育在低速离心的条件下进行，孵育的时间为10～20min。

7. 根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，S1和S2所述振动的时间为2～10min。

8. 根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述仔猪为5日龄仔猪。

9. 根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述低温为0～8℃。

10. 一种猪肠道隐窝的纯化方法，其特征在于，将权利要求4～9任一项所述方法获得的猪肠道隐窝通过差速沉淀的方法进行纯化。