JP2017500892A - インビトロ精子形成を実施するための方法及び関連するデバイス - Google Patents
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Abstract
Description
a)生殖細胞;セルトリ(Sertoli)細胞;(特に筋様型の)細管周囲細胞を含み;更にライディッヒ(Leydig)細胞を含んでいてもよい、精細管又は精細管の断片を含む患者の試料;或いは
b)患者から得られた生殖細胞を含む精細管又は精細管の断片と、1又は2以上のドナーの少なくともセルトリ(Sertoli)細胞;(特に筋様型の)細管周囲細胞を含み;更にライディッヒ(Leydig)細胞を含んでいてもよい細胞群との混合物
であってよい。
− 性腺毒性処置又は手術、例えば癌治療等を近々受ける予定の、健常な思春期前又は思春期後患者;
− 胚組織を有するが、例えば遺伝的若しくは後天的非閉塞性無精子症、幼小児期の両側性停留精巣、又は重篤な鎌状細胞疾患等により、精子を産生しない思春期後患者;
− 両側性停留精巣又は重篤な鎌状細胞疾患を有する思春期前患者;
− 絶滅危惧種;
− 医療又は手術的処置、例えば去勢等に供する予定のウマ、ラクダ、ヒトコブラクダ、又は愛玩動物;
− 家畜
から得ることができる。
− 性腺毒性処置又は手術、例えば癌治療等を近々受ける予定の、健常思春期前又は思春期後ヒト又は動物;
− 胚組織を有するが、例えば遺伝的若しくは後天的非閉塞性無精子症、幼小児期の両側性停留精巣、又は重篤な鎌状細胞疾患等により、精子を産生しない思春期後ヒト又は動物;
− 両側性停留精巣又は重篤な鎌状細胞疾患を有する思春期前ヒト
から得られる。
a)胚組織の試料を提供し;
b)本発明に係る、生体材料からなり少なくとも1つの凹部を含むバイオリアクターを提供し、該胚組織を該バイオリアクターの前記少なくとも1つの凹部に導入し;任意により前記バイオリアクターを密閉し;又は、前記バイオリアクターを前記胚組織の周囲に形成し;
c)該胚組織を含む該バイオリアクターを、特に先に定義したような、培地を含むタンク内に配置し;
d)伸長精細胞及び/又は精子が産生されるまで、前記胚組織を成熟させ;
e)伸長精細胞及び/又は精子を前記バイオリアクターから回収する
工程を含む、方法に関する。
− 前記バイオリアクターを開口し;
− 微細操作により、1又は2以上の精子及び/又は伸長精細胞を回収する
ことにより実施される。
a)胚組織の試料を提供し;
b)ヒドロゲル材料(特に、好ましくは物理的にヒドロゲル状態にある、多糖類又はコラーゲン)からなる少なくとも1つの中空繊維を含むバイオリアクター;
c)胚組織を中空繊維の中央管孔内に導入し;任意により中空繊維を封止し;
d)該胚組織を含む該中空繊維を、培地を含むタンク内に配置し;
e)伸長精細胞及び/又は精子が産生されるまで、前記胚組織を成熟させ;
f)伸長精細胞及び/又は精子を中空繊維から回収する
工程を含む、方法に関する。
a)前述の方法に従って、伸長精細胞及び/又は精子を調製し;又は、前述の方法により、伸長精細胞及び/又は精子を提供し;
b)得られた前記伸長精細胞及び/又は精子により、卵母細胞を受精させる
工程を含む方法に関する。
本発明に係る方法を、8又は20日齢雄Sprague−Dawleyラット、2頭の1.5歳齢カニクイザル、及び、男性から女性への性転換ヒトに実施した。麻酔後、ラットを断頭して殺し、即時に睾丸を除去した。カニクイザルの睾丸及び男性から女性への性転換ヒトの睾丸は、手術により採取した。睾丸をハムF−12/ダルベッコ変法イーグル培地(Ham's F-12/Dulbecco's Modified Eagle's Medium:F12/DMEM、1:1)に浸漬した。
睾丸の白膜を機械的に除去し、コラゲナーゼ、2mg/mlのリママメ・トリプシン阻害剤、及び10mg/mlのDNaseを含むF12/DMEM(1:1)中で、33℃で10分間穏やかに攪拌して消化することにより、精細管を単離した。精細管を低速遠心分離で収集し、F12/DMEM(1:1)で二度洗浄した。
生体材料(例えばキトサン等)の溶液を、脱イオン水を用いて調製した。該調製は密閉反応器内で、機械的攪拌の下で実施した。ポリマーの溶解後、溶液をシリンジに入れ、遠心分離(5000g、10分間)により泡を除去した。シリンジポンプを用いて溶液を押し出した。直径3mmの押出穴を有する押出用円錐にシリンジを連結した。押し出しは凝固浴槽(濃度1MのNaOH水溶液)内で実施し、物理的ヒドロゲル、好ましくは物理的キトサンヒドロゲルの形成を誘導した。円筒状押出物の外縁から中央へのNaOH放射状拡散により、管形の外膜を取得した。凝固時間(例:2分間)に応じて、凝固ヒドロゲル管の厚さを、所望の値(例:1mm)に調整することができる。所与の凝固時間の後、依然としてポリマーを含有する管状ヒドロゲル、例えばキトサン溶液を、大容量の脱イオン水に投入し、ゲル化を停止する。水又は空気流を管内に導入して、ゲル化していない内部溶液を除去することにより、長さ1〜100cmの管の内腔を形成した。この予調製管から、所望の長さ(約3cm)のバイオリアクターを切り出すことができる。続いて、バイオリアクターを蒸留水浴で洗浄し、水中オートクレーブ処理(121℃、20分間)にて滅菌した。
前記バイオリアクターは、国際公開第2009/044053号公報に記載の方法で得られたキトサン単層膜中空繊維である。前記バイオリアクターは、イカ甲キチン由来のキトサンに基づく(Mahtaniキトサン、ベラーバル、インド;Mahtaniバッチ指数114)。そのアセチル化度は4%(国際公開第2009/044053号公報に記載のHirai法により決定)であり、これは分子質量Mw550kg/mol(国際公開第2009/044053号公報に記載の、屈折率測定及び多角度光散乱を組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィーにより決定)に相当する。得られた管孔内容積は20〜50mm3である。
20〜50mm3の精細管をキトサン管内に導入した。続いて、キトサン管の両端を密閉し、約8mLの培地を含む従来の培養ウェル内に配置した。2日おきに培地を交換した。培地の組成は、抗生物質を追加した15mMのHepes緩衝化F12/DMEM、1.2g/LのNaHCO3、10μg/mLのインシュリン、10μg/mLのトランスフェリン、10−4MのビタミンC、10μg/mLのビタミンE、3.3×10−7Mのレチノイン酸、3.3×10−7Mのレチノール、10−3Mのピルビン酸(何れもSigma社製)、10−7Mのテストステロン、及び50ng/mLのブタFSHであった。8日齢ラット、1.5歳齢カニクイザル、及び男性から女性への性転換ヒトの各試料について、培養開始数日後に培地にテストステロンを加えた。
選択された日数の培養の後、キトサン管から精細管を押し出し、2枚の顕微鏡用スライドガラスで挟んで潰した。続いて、ハリスのヘマトキシリン溶液(Harris's hematoxylin solution)で核を染色した。実施された方法の結果を図に示す。
20日齢のラットでは、培養開始当初、最も分化が進んでいた生殖細胞はパキテン期精母細胞(段階X)であった。
睾丸内に精原細胞のみを有する思春期前雄幼生と比較しながら、8日齢ラットの精細管培養を実施した。実際に、8日齢のラットはその睾丸内に精原細胞のみを有していた。
睾丸内に精原細胞のみを有する思春期前雄幼生と比較しながら、2頭の1.5歳齢カニクイザルの精細管を培養した。実際に、1.5歳齢サルはその睾丸内に精原細胞のみを有していた。54日間の培養後、培養された精細管を潰して広げ、細胞を採取した。
男性から女性への性転換ヒトの精細管を培養した。精子形成を阻害するホルモン処理の後、この患者の精細管内には精原細胞しか存在せず、前細糸期精母細胞及びセルトリ(Sertoli)細胞は殆ど見られなかった。この患者は、睾丸内に精原細胞のみを有する少年と近い状態であった。
Claims (19)
- 雄胚組織(male germinal tissue)からのインビトロ(in vitro)での精子形成の方法であって、前記胚組織が配置される少なくとも1つの凹部(cavity)を含む、生体材料からなるバイオリアクター内で、生殖細胞(germ cells)を含む精巣組織を成熟させ、伸長精細胞及び/又は精子を回収することを含む方法。
- 胚組織、好ましくは精巣組織が、少なくとも1つの精細管又は少なくとも1つの精細管の断片、好ましくは数個の精細管又は数個の精細管の断片を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記胚組織、好ましくは精巣組織が、2〜50、3〜40、4〜30、又は5〜20個の精細管の断片を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記細管及び/又はその断片が、精細管の機械的分離又は酵素的分離により得られる、請求項2に記載の方法。
- 前記の精細管の断片が、約1mmから約5mmの範囲のサイズを有する、請求項2〜4の何れか一項に記載の方法。
- 前記胚組織、好ましくは精巣組織が、生殖細胞、セルトリ(Sertoli)細胞、及び細管周囲細胞を含み、任意により更にライディッヒ(Leydig)細胞を含む、請求項1〜5の何れか一項に記載の方法。
- 生殖細胞、セルトリ(Sertoli)細胞、及び細管周囲細胞、並びにこれらの混合物からなる群より選択される細胞を、前記胚組織、好ましくは精巣組織に加える、請求項1〜6の何れか一項に記載の方法。
- 前記凹部の体積又は前記胚組織、好ましくは精巣組織の体積が、約1〜約100mm3、好ましくは約0.5〜約150mm3、例えば約1〜約30mm3である、請求項1〜7の何れか一項に記載の方法。
- 前記胚組織、好ましくは精巣組織が:
− 性腺毒性(gonado-toxic)処置又は手術、例えば癌治療等を受ける予定の、健常な思春期前又は思春期後患者;
− 例えば遺伝的若しくは後天的非閉塞性無精子症、幼小児期の両側性停留精巣、又は重篤な鎌状細胞疾患等により、精子を産生しない思春期後患者;
− 両側性停留精巣又は重篤な鎌状細胞疾患を有する思春期前患者;
− 絶滅危惧種;
− ウマ、ラクダ(camel)、ヒトコブラクダ(dromedary)、又は愛玩動物;
− 家畜
に由来する、請求項1〜8の何れか一項に記載の方法。 - 前記生体材料が物理的にヒドロゲル状態にあり、好ましくは多糖類、好ましくは天然多糖類、又は構造タンパク質、好ましくはコラーゲン、又はこれらの混合物を含む、請求項1〜9の何れか一項に記載の方法。
- 前記天然多糖類が、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチン、又は修飾天然多糖類、例えばカルボキシメチルセルロース(carboxymethylcellulose:CMC)を単独又は複数混合で、好ましくはキトサン又はアルギン酸を単独又は複数混合で、好ましくはキトサンを含む、請求項10に記載の方法。
- 当該方法が:
a)胚組織の試料を提供し;
b)生体材料からなり少なくとも1つの凹部を含むバイオリアクターを提供し;
c)該胚組織を該バイオリアクターの前記少なくとも1つの凹部に導入し;任意により前記バイオリアクターを密閉し
d)該胚組織を含む該バイオリアクターを、培地を含むタンク内に配置し;
e)伸長精細胞及び/又は精子が得られるまで前記胚組織を成熟させ;
f)伸長精細胞及び/又は精子を前記バイオリアクターから回収する
工程を含む、請求項1〜11の何れか一項に記載の方法。 - 前記バイオリアクターが前記胚組織の周囲に形成される、請求項1〜12の何れか一項に記載の方法。
- 前記バイオリアクターが、前記胚組織が配置される管孔を含む生体材料の中空繊維である、請求項1〜12の何れか一項に記載の方法。
- 前記バイオリアクターがヒドロゲルからなる、請求項1〜14の何れか一項に記載の方法。
- 前記バイオリアクターが培地内に、又は培地と接触するように配置され、ここで:
− 前記培地が、成長因子、ホルモン、テストステロン、ビタミン、抗生物質、代謝産物等のうち一又は二以上を、単独又は複数混合で含み;又は
− 前記培地が、成長因子、ホルモン、ビタミン、抗生物質、代謝産物等のうち一又は二以上を、単独又は複数混合で含むとともに、当該方法の過程において、テストステロンが前記培地に添加される、請求項1〜15の何れか一項に記載の方法。 - 空気、二酸化炭素、及び前記バイオリアクターが成熟のために配置される前記培地の成分が、前記生体材料内を拡散しうるように構成される、請求項1〜17の何れか一項に記載の方法。
- インビトロでの受精の方法であって:
a)請求項1〜17の何れか一項に記載の方法に従って、伸長精細胞及び/又は精子を調製し;又は、請求項1〜17の何れか一項に記載の方法により、伸長精細胞及び/又は精子を提供し;
b)得られた前記伸長精細胞及び/又は精子により、卵母細胞を受精させる
工程を含む方法。 - 雄胚組織からインビトロで精子形成を実施するためのキットであって、生体材料からなり、胚組織が配置される少なくとも1つの凹部を含む、バイオリアクターを含むキット。
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