CN106459911A - 用于实施体外精子发生的方法和相关装置 - Google Patents

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Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
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Abstract

本发明涉及用于从雄性生殖组织体外精子发生的方法，其包括在由生物材料制成且包含至少一个其中放置生殖组织的腔体的生物反应器中进行包含生殖细胞的睾丸组织的成熟，和回收长形精子细胞和/或精子。

Description

用于实施体外精子发生的方法和相关装置
本发明涉及用于实施体外精子发生的方法和相关装置。
每年，全世界160,000名儿童受到儿童癌症影响。其中儿科癌症是主要受益者的肿瘤学中过去30年期间的进步现在可以在发达国家中实现75-80％的治愈率。然而，在童年期间已经在癌症后存活的男性儿童中的仅33％，当他们为成人时，产生正常质量的精子。的确，已知癌症疗法可以引起不育的配子毒性作用。尽管可以建议成人在开始治疗(例如癌症疗法)之前冷冻精子以保存其能育性，但这对于儿童当然是不可能的。用于这些男孩的目前唯一可行的保存方案是进行其睾丸组织的收集和冷冻保存。然而，目前无法保证将来的科学进步将在医疗辅助亲本项目的背景下恢复其能育性。
因此需要开发技术以保留这些儿童的能育性，以实现其将来的亲本项目。
除了在童年或成年期期间经历的癌症疗法以外，不育可以是由于遗传或获得性非强迫性无精子症、双边隐睾症、严重的镰状细胞病等导致。
因此需要提供使得能够从睾丸组织开始产生精子以恢复能育性的方法。
持续几十年，生殖生物学家一直试图开发技术以实现哺乳动物中的体外(离体)精子发生。精子发生是涉及细胞分裂和细胞分化的几个阶段的独特的复杂过程，其导致形成长形精子细胞和精子。精子发生的完整周期在小鼠中耗时约30天，在大鼠中耗时约54天，且在人中耗时约72天。精子发生在生精小管内发生，在所述生精小管中，生殖细胞与Sertoli细胞(实现该过程所需的体细胞)密切相关。调节精子发生的局部(睾丸内)机制仍然知之甚少。这部分解释了为什么，尽管研究持续投入，但现在没有方法在体外(或离体)复制人中的该整个过程。该领域中的最显著进展是近来的。已经开发器官型培养的方法的日本团队近日宣布，他们已经从未成熟小鼠的精原细胞获得了体外受精精子(Takuya Sato等人,Nature,2011,471,504-508)。尽管允许未成熟雄性生殖细胞成熟为功能精子的培养条件的鉴定是重大突破，但仍然存在几个需要注意的问题。并不令人惊讶的是，效率是主要问题。仅睾丸片段的周围区域在其系统中表现出高度精子发生，尽管在培养40天之后中心失去正常形态并且具有大量退化细胞。与体内正常睾丸中相比，使用目前可用的体外系统，每个输入未成熟雄性生殖细胞产生少得多的长形精子细胞和精子。在来自新生儿睾丸2的11个培养的外植体中的仅5个中和在来自SSC移植睾丸的17个培养的外植体中的仅3个中观察到有鞭毛的精子(Sato等人,Nat Commun.,2011,2,472)。更近期地，德国-以色列团队在3D培养中使用分离的睾丸细胞的共培养。然而，他们没有报道获得的精子产生后代的能力。此外，这些技术具有与其实现复杂性和它们需要且似乎几乎不利于人中适应的大量生物组织相关的缺点。
从Staub等人(Experimental Cell Research,2000,260,85-95)、Godet等人(Developmental Biology,2008,315,173-188)和Perrard等人(Molecular Reproductionand Development,2003,65,86-95)也已知使用双腔室用于实施精子发生。然而，这些方法无法使得能够获得受精精子细胞或受精的精子。
由凝固的多糖水凝胶(诸如基于脱乙酰壳多糖)制成的中空纤维已经被描述和提出作为可以用于组织工程改造、生物膜或缓释载体中的生物反应器。水凝胶是具有高水含量的大分子网络，优选3D弹性的大分子网络，使得它们可以模拟水化天然组织。N.M.S.Bettahalli等人(Acta Biomaterialia 7,2011,3312-3324)公开了在基于与细胞或生物分子组合的支架的组织工程改造的构建体的领域中使用中空纤维膜以改善三维组织构建体中的营养物供给而用于治疗组织缺陷。Wang等人,Membr.Sci.2000,166,31-39公开了环形中空纤维。WO2009/044053公开了由凝固的多糖凝胶(诸如基于脱乙酰壳多糖)制成的单膜或多膜中空纤维。Robert E.Chapin和Kim Boekelheide(Reproductive Toxicology39,2013,63-68)感兴趣在精子发生的领域中使用人细胞生成组织的体外模型，并且建议应当在可能支持多隔室的发展的一些新的水凝胶和/或3D基质中进行睾丸细胞的评估。他们建议，Sertoli细胞和生殖细胞的存在应当对于睾丸组织的体外重构是关键的。
仍然需要提供实施人和动物的体外精子发生的方法。
本发明的目标是提供体外精子发生以获得受精长形精子细胞或受精的精子的方法。
本发明的另一个目标是提供这样的方法，其甚至基于少量生殖组织也是高效的。
本发明的另一个目标是提供体外受精的方法。其它目标将通过阅读下面描述而出现。
上面提及的问题和现有技术缺点令人惊讶地由本发明解决，本发明涉及用于从雄性生殖组织体外(离体)精子发生的方法，其包括在由生物材料制成且包含至少一个其中放置所述生殖组织的腔体的生物反应器中进行所述生殖组织的成熟。在成熟过程或成熟时间结束时，回收长形精子细胞和/或精子。
根据本发明，“生物材料”应当被理解为生物相容的材料，即对于细胞或组织无毒的材料。
本发明基于这样的发现：雄性生殖组织应当使用，并且限于3D生物相容的结构中。生殖组织是包含生殖细胞的睾丸组织。其更优选为生精小管或生精小管的片段。操作小管的片段通常是更方便的，并且混合几个不同小管的片段以具有不同阶段的细胞(生殖细胞和/或Sertoli细胞)是有利的。向小管或片段添加从生精小管或其片段回收的生殖细胞或其它生精细胞也可以是感兴趣的。从剩余的睾丸组织、特别是从周围组织或Leydig细胞解离或分离小管，例如通过机械或化学处理。
本发明因此涉及用于从雄性生殖组织体外精子发生的方法，其包括在由生物材料制成且包含至少一个其中放置生殖组织的腔体的生物反应器中进行包含生殖细胞的睾丸组织的成熟，和回收长形精子细胞和/或精子。
根据本发明，所述睾丸组织包含至少一个生精小管或至少一个生精小管的片段，优选几个生精小管或几个生精小管的片段，更优选来自2、3、4(优选5)、至10、20、30、40或50个生精小管的片段(涵盖每个组合)。例如，所述睾丸组织包含来自2至50、3至40、4至30、5至20个生精小管的片段。这些小管可以源自来自同一患者或供体或来自不同供体的睾丸。
可以通过本领域技术人员已知的方法从睾丸分离生精小管。其可以是就剩余的睾丸和Leydig细胞而言机械或酶促分离小管，例如使用胶原酶和分离。其可以是机械分离，例如使用解剖刀等。“片段”在本发明的意义中意指生精小管的部分。生精小管的片段可以具有便于其操作和将其置入腔体内的大小。通常，其大小包含于约1和约5mm之间，这是小管部分的长度。所述片段，作为原始小管，优选包含生殖细胞、Sertoli细胞和小管周围细胞(特别是肌样型)，通常为完整小管内的天然构型或接近于完整小管内的天然构型。所述睾丸可以来自患者或来自一个或多个供体。在本发明的方法中，所述生殖组织来自可以是人或非人的患者。优选地，所述患者是人或非人哺乳动物。
根据本发明，所述睾丸组织包含生殖细胞、Sertoli细胞和小管周围细胞。也可以存在Leydig细胞。
根据本发明，将选自生殖细胞、Sertoli细胞、小管周围细胞及其混合物的细胞添加至所述睾丸组织。
优选地，所述生殖组织可以是：
a)包含生精小管或生精小管的片段的患者的样品，其包含生殖细胞；Sertoli细胞；小管周围细胞(特别是肌样型)；和可能Leydig细胞；或
b)生精小管或生精小管的片段，其包含获得自患者的生殖细胞和与至少Sertoli细胞的混合物；小管周围细胞(特别是肌样型)；和可能一个或多个供体的Leydig细胞。
除了a)和b)以外，还可能添加从生精小管或其片段回收的生殖细胞和/或Sertoli细胞，所述小管可能已经例如通过机械或化学处理分离，并且进一步处理以回收生殖细胞和/或Sertoli细胞。
所述雄性生殖组织可以来自青春期前或青春期后的患者。例如，其可以来自：
-即将经历性腺-毒性治疗或外科手术、例如癌症-疗法的健康的青春期前或青春期后的患者；
-具有生殖组织、但例如由于在童年或严重的镰状细胞病过程中的遗传或获得性非强迫性无精子症、双边隐睾症而不产生精子的青春期后的患者；
-具有双边隐睾症或严重的镰状细胞病的青春期前的患者；
-濒危物种；
-将送至内科或外科治疗诸如阉割的马、骆驼、单峰骆驼或宠物；
-牲畜。
优选地，所述生殖组织来自：
-即将经历性腺-毒性治疗或外科手术、例如癌症疗法的健康的青春期前或青春期后的人或动物；
-例如由于在童年或严重的镰状细胞病过程中的遗传或获得性非强迫性无精子症、双边隐睾症而不产生精子的青春期后的人或动物；
-具有双边隐睾症或严重的镰状细胞病的青春期前的人。
本发明的生物反应器由生物材料制成，并且包含至少一个其中放置或局限所述生殖组织的腔体。根据本发明，“生物反应器包含至少一个其中放置或局限所述生殖组织的腔体”应当理解为所述生物反应器可以是预先构成的，并且包含其中引入生殖组织的腔体或者在所述生殖组织周围形成生物反应器，所述生殖组织因此包含于在形成生物反应器过程中在其周围形成的腔体中。因此，应当理解的是，表述“将生殖组织置入(或引入或填入)生物反应器的至少一个腔体”意指将生殖组织置入生物反应器的至少一个腔体或在生殖组织周围形成生物反应器以将其局限。通常，所述腔体被生殖组织填充或基本上填充。通常，所述生殖组织被局限或基本上局限于腔体中。有利的是，将维持所述局限，直到成熟结束。如果需要，可以将生物材料的片段连同生殖组织引入通道，以帮助局限效应。根据特征，在成熟过程期间封闭或密封所述腔体。
有利的是，所述生殖组织被局限于腔体中，所述腔体使得能够维持接近于生精小管的体内结构的三维结构。当生精小管或其片段被用作生殖组织(如下所提及)时，该局限允许沿着成熟过程维持其结构。相反，用于一般细胞成熟的实际装置或提出的基于分离细胞的方法不能够将体内结构匹配成生精小管，并且直到期间结束才能够进行细胞成熟。
有利的是，与更刚性的现有装置相比，所述生物反应器是相对柔性的，因此使得生精小管在精子发生过程中能够生长。这是由于用于生物反应器的材料。
腔体的体积取决于使用的生殖组织的量。此外，如本文所解释，可能添加材料，诸如生物材料，以帮助局限于腔体内。通常，腔体的体积可以为约1至约150mm3，优选约0.5至约100mm3，例如约1至约30mm3。
在一个实施方案中，所述生物反应器包含预形成的通道(或通道形式的隔室)，其为例如由生物材料(例如如本领域中已知)制成的管状生物反应器或管或中空纤维。通道的直径因此适合于生殖组织的量和/或大小，使得可以根据本发明的概念将生殖组织放置和局限入通道。换言之，所述通道的体积适合于引入的生殖组织的量，使得将生殖组织局限于通道中。技术人员能够通过改变通道的直径和/或长度而调整通道的体积。该直径可以由技术人员确定，并且通常为约100μm至约5mm，优选约1mm至约4mm。通常，生物反应器的长度为约0.3至约5cm，优选约0.5至约3cm。因此将生殖组织置于通道内。
在一个实施方案中，将硬化(例如，可凝固的，可交联的，可成网状的等)溶液或材料置于生殖组织周围，并使其硬化。生殖组织周围形成的材料的量及其性质适合于局限生殖组织，并且组织局限可以由可以在硬化时使用的额外固体结构帮助，或者甚至其可以得到维持以帮助保持成熟过程中的结构(网、网格、壁、模具、容器诸如Petri皿、管，...)。
优选且有利的是，所述生物材料是水凝胶。水凝胶是具有高水含量的大分子，优选弹性的网络，并且它们能够模拟水化天然组织的细胞外基质。根据本发明，“水凝胶”意指粘弹性质量，其包含至少80％，优选至少90％(重量)的水，例如94至99％(重量)的水，例如96至98.5％(重量)的水。本发明的水凝胶是化学凝胶(负责链间交联的相互作用是共价键类型的)或物理凝胶(负责链间交联的相互作用是物理类型的，例如氢键和/或疏水性相互作用，静电相互作用，cristalites或nanocristalites物理交联)。优选地，本发明的水凝胶是物理凝胶，以避免共价交联剂的毒性。优选地，本发明的水凝胶不含任何化学(共价)或物理(静电)交联剂。
优选地，所述生物反应器在生物材料中，所述生物材料，相对于生物材料的结构和微观结构，特别是与生物材料的孔隙率相关，具有对于用于成熟的培养基、对于空气(O2和N2)和二氧化碳有效的渗透率，(孔隙度和/或扩散)。在一个实施方案中，所述腔体在成熟过程期间是封闭的。例如，如果使用管，即密封其末端。在另一个实施方案中，用对于用于成熟的培养基、空气和二氧化碳可渗透的生物材料，例如用对于用于成熟的培养基、空气和二氧化碳可渗透的生物材料的片材，封闭生物反应器。
根据本发明的生物材料可以是天然的生物材料或合成的生物材料。
例如，所述生物材料包含多糖，优选天然多糖，包括修饰的，特别是化学修饰的，或杂合的多糖，或结构蛋白例如角蛋白或胶原蛋白，优选胶原蛋白，或其混合物。优选地，所述生物材料包含多糖，优选天然多糖，包括修饰的，特别是化学修饰的多糖，或胶原蛋白，或其混合物。“包含多糖或胶原蛋白”意指所述生物材料可以包含至少一种多糖或胶原蛋白，其为基于水凝胶的粗化合物。所述生物材料也将含有产生水凝胶所需的成分，诸如凝固剂、水等，和其它成分。可以说，所述生物材料是多糖或结构蛋白，优选胶原蛋白，或由其制成或基于其。
优选地，所述生物材料包含天然多糖，特别选自单独或呈混合物的脱乙酰壳多糖、透明质酸、藻酸盐、果胶和修饰的天然多糖，诸如羧甲基纤维素(CMC)。通过实例的方式，所述生物材料包含单独或呈混合物的脱乙酰壳多糖或藻酸盐，例如脱乙酰壳多糖。
通常，所述脱乙酰壳多糖具有适合于至少持续一个精子发生过程的持续时间为生物反应器赋予稳定性的乙酰化度，并且该程度可以为0至50％。应当强调的是，乙酰化度增加越多，生物材料的机械特性越低。为了在整个成熟过程中保持结构，优选选择低或中乙酰化度，通常为0至30％，优选0至15％。更优选地，乙酰化度为0至5％。优选地，脱乙酰壳多糖具有约500,000g/mol的摩尔质量。
优选地，所述生物材料中、优选水凝胶中的多糖或胶原蛋白、例如脱乙酰壳多糖的浓度，就水凝胶的重量而言，为1至20％，优选1至6％，例如1.5至4％(重量)。
有利的是，所述生物材料，特别是其内部结构或微观结构，使得其能够使得特别是空气、二氧化碳和生物反应器置于其中用于成熟的培养基的要素(elements)通过其扩散，特别是以便使空气、二氧化碳和培养基的要素通过其扩散并到达生殖组织或生殖组织的附近。优选地，腔体周围的生物材料的厚度必须使得能够扩散上面引用的不同元素，因此依赖于生物材料，特别是生物材料类型及其微观结构。优选地，所述生物材料的厚度为约0.1至约10mm，优选约0.1至约5mm，优选约0.5至约2mm。
优选地，所述生物反应器由包含腔体的生物材料制成，也就是说，所述生物材料中存在放置和局限生殖组织的腔体。
优选地，所述生物反应器呈中空纤维、优选中空粗纤维的形式。WO2009044053中描述了合适的中空纤维和制备方法的实例。本领域技术人员可以参考该文献。
如本文所提及，在根据本发明的方法中，可以将生殖组织引入所述生物反应器的至少一个通道或腔体。优选地，然后在两端或在开口端封闭通道。例如，用中空纤维，可以在两端或在开放端进行结扎，或者如上所提及，可以使用可渗透的生物材料，优选地，可以在两端或在开放端进行结扎。
有利的是，与先前实施的方法(Sato等人,Nat Commun.,2011,2,472)相比，本发明的方法不需要大量生殖组织。优选地，引入生物反应器中的生殖组织的量为约1至约150mm3，优选约0.5至约100mm3，例如约1至约30mm3。这是有利的，因为可能从减少量的生殖细胞产生长形精子细胞或精子。这使得该方法可用于具有非常少生殖细胞的患者。如上所提及，通道的体积适应于引入的生殖组织的体积。
有利的是，将生殖组织引入生物反应器之前，将所述生物反应器与培养基孵育。
可以在两端密封生物反应器，以防止从通道泄漏生殖组织，并将其置于培养基中用于成熟为长形精子细胞或精子。
根据本发明及其各个实施方案，使用培养基。技术人员可以基于其一般知识确定培养基的组成。优选地，所述培养基包含单独或呈混合物的生长因子、激素、维生素、抗生素代谢物等。例如，所述激素可以选自单独或呈混合物的胰岛素、睾酮、FSH(例如绵羊/人FSH)。例如，所述维生素选自单独或呈混合物的维生素C、维生素E、维生素A(视黄酸、视黄醇)。例如，所述代谢物可以选自单独或呈混合物的转铁蛋白、丙酮酸盐。
优选地，在该方法的过程期间在培养基中添加睾酮。添加的睾酮的量优选为约10-8至约10-5M。
优选地，将含有生殖组织的生物反应器置于含有培养基的罐中。可以将所述生物反应器浸入培养基中或置于空气和培养基之间的界面。优选地，将所述生物反应器置于空气和培养基之间的界面。
在一个实施方案中，当将所述生物反应器浸入培养基中时，实施空气的鼓泡，以具有对于成熟足够的氧化作用。
在另一个实施方案中，将所述生物反应器置于空气和培养基之间的界面。可以通过技术人员已知的任何方法和例如通过在包含培养基的罐中在空气和所述培养基之间的界面处添加支持物、优选穿孔的支持物等诸如网格来完成这一点。这有利地改善了氧化作用，并且因此改善了成熟和根据本发明的方法的效率。
如上所提及，有利的是，所述生物反应器具有使得培养基和包含生殖组织的通道之间能够交换的渗透率，其使得生殖组织和培养基之间能够接触。
在技术人员已知使得生殖组织能够成熟的温度条件下，且例如在包含于约30和约37℃之间的温度实施本发明的方法。
根据一个方面，本发明涉及用于体外(离体)精子发生的方法，其包括以下步骤：
a)提供生殖组织的样品；
b)提供根据本发明的由生物材料制成且包含至少一个腔体的生物反应器，并且将所述生殖组织引入所述生物反应器的至少一个腔体；任选地密封所述生物反应器；或在所述生殖组织周围形成所述生物反应器；
c)将含有所述生殖组织的所述生物反应器置于包含培养基(特别如上所定义)的罐中；
d)进行所述生殖组织的成熟，直到产生长形精子细胞和/或精子；
e)从所述生物反应器回收长形精子细胞和/或精子。
优选地，如下实施步骤f)：
-打开所述生物反应器；
-显微操作以回收一个或多个精子和/或长形精子细胞。
优选地，本发明涉及用于体外(离体)精子发生的方法，其包括以下步骤：
a)提供生殖组织的样品；
b)提供包含至少一个中空纤维的生物反应器，所述中空纤维由优选呈物理水凝胶状态的水凝胶材料、特别是多糖或胶原蛋白制成；和
c)将所述生殖组织引入所述中空纤维的中心通道；任选地密封所述中空纤维；
d)将含有所述生殖组织的所述中空纤维置于含有培养基的罐中；
e)进行所述生殖组织的成熟，直到产生长形精子细胞和/或精子；
f)从所述中空纤维回收长形精子细胞和/或精子。
在一个实施方案中，将所述生物反应器(或所述中空纤维)浸入培养基中时，必须实施空气的鼓泡，以具有对于成熟足够的氧化作用。
在另一个实施方案中，将所述生物反应器(或所述中空纤维)置于空气和培养基之间的界面。可以通过技术人员已知的任何方法和例如通过在包含培养基的罐中在空气和所述培养基之间的界面处添加支持物来完成这一点。这有利地改善了氧化作用，并且因此改善了成熟和根据本发明的方法的效率。
在本发明的方法的一个实施方案中，所述培养基包含单独或呈混合物的生长因子、激素、维生素、抗生素代谢物等。例如，所述激素可以选自单独或呈混合物的胰岛素、睾酮、FSH(例如绵羊/人FSH)。例如，所述维生素选自单独或呈混合物的维生素C、维生素E、维生素A(视黄酸、视黄醇)。例如，所述代谢物可以选自单独或呈混合物的转铁蛋白、丙酮酸盐。
在另一个实施方案中，所述培养基包含单独或呈混合物的生长因子、激素、维生素、抗生素代谢物等。例如，所述激素可以选自单独或呈混合物的胰岛素、FSH(例如绵羊/人FSH)。例如，所述维生素选自单独或呈混合物的维生素C、维生素E、维生素A(视黄酸、视黄醇)。例如，所述代谢物可以选自单独或呈混合物的转铁蛋白、丙酮酸盐。然后在该方法的过程中添加睾酮。有利的是，在第一波成熟结束时，生殖组织中仍然存在圆形精子细胞，并且可以再至少一次实施该方法。
在一个实施方案中，冷冻保存回收的长形精子细胞和/或精子，用于将来医疗辅助的亲本项目。
本发明的方法中的生殖组织可以是先前获得自患者的新鲜或冷冻保存的生殖组织片段。
本发明的方法也可以被理解为是针对不育症的治疗和/或用于保存能育性的方法。本发明的方法也可以被理解为用于医疗辅助生殖的方法。
本发明还涉及体外受精的方法，其包括以下步骤：
a)根据上述方法制备长形精子细胞和/或精子；或提供使用该方法制备的长形精子细胞和/或精子；
b)用来自步骤a)的长形精子细胞和/或精子使卵母细胞受精。
本发明还涉及由生物材料制成且包含至少一个腔体的生物反应器用于进行体外精子发生、优选用于产生长形精子细胞和/或精子的用途。
优选地，所述生物反应器如上所定义，并且优选为中空纤维，优选中空粗纤维，如上所述。
本发明还涉及由生物材料制成且包含至少一个如上所述的通道或腔体和该腔体或通道内的如本文定义的生殖组织的生物反应器。作为实例，本发明涉及在其中心通道包含生殖组织的中空纤维。所述生物反应器可以是如本文定义的水凝胶。
本发明还涉及由生物材料制成且包含至少一个如上所述的通道或腔体、且在通道或腔体中包含长形精子细胞和/或精子的生物反应器。作为实例，本发明还涉及如上所述在其中心通道中包含长形精子细胞和/或精子的中空纤维。
本发明还涉及用于实施从雄性生殖组织体外精子发生的试剂盒，其包含由生物材料制成且包含至少一个其中放置生殖组织的腔体的生物反应器。所述生物反应器、生物材料、腔体和生殖组织具有上面提及的定义。
现在将借助实施例描述本发明。
图1、2、9和10代表培养39天后20日龄大鼠的生殖细胞。
图3、4、5、6、7和8代表培养61天后8日龄大鼠的生殖细胞。
图5和6分别代表8日和60日龄大鼠的睾丸横截面。
图11、12和13代表培养54天后1.5岁食蟹猴的生殖细胞。
图14和15代表培养34天后变性人的生殖细胞。
患者
对8或20日龄雄性Sprague-Dawley大鼠、两个1.5岁食蟹猴和变性人实施根据本发明的方法。麻醉之后，通过断头杀死大鼠，并且迅速移取其睾丸。通过外科手术获得食蟹猴的睾丸和变性人的睾丸。将睾丸浸入Ham氏F-12/Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(F12/DMEM,1:1)中。
生精小管的制备
机械移取睾丸的白膜，并且通过在33℃在含有胶原酶、2mg/ml利马豆胰蛋白酶抑制剂和10mg/ml DNA酶的F12/DMEM(1:1)中在温和搅拌下消化10分钟而分离生精小管。通过低速离心收获生精小管，用F12/DMEM(1:1)洗涤两次。
实施例生物反应器的一般制备：
在去离子水中制备生物材料(例如脱乙酰壳多糖)的溶液。这可以在具有机械搅拌的密闭反应器中进行操作。聚合物溶解之后，将溶液置于注射器中并且可以通过离心(5000g,10min)去除气泡。使用注射泵挤出溶液，将注射器连接至具有3mm的挤出孔直径的挤出圆锥体。挤出在凝固浴(具有浓度1M的NaOH水溶液)中操作，所述凝固浴诱导物理水凝胶、优选物理脱乙酰壳多糖水凝胶的形成。通过NaOH从外围径向扩散至圆柱形挤出物的中心而获得管状形式的外部膜。根据凝固时间(例如：2分钟)，可以将凝固的水凝胶管的厚度调整至期望值(例如：1mm)。给定凝固时间之后，将仍含有聚合物(例如脱乙酰壳多糖溶液)的管状水凝胶倒入大体积的去离子水中，以阻止凝胶化。可以通过在管内部引入水或空气通量而去除非凝胶化的内部溶液，因此生成具有1至100cm的长度的管内腔。然后可以以期望长度(约3cm)从该预形成管切割生物反应器。然后将生物反应器在蒸馏水浴中洗涤，并且通过高压灭菌处理(121℃，20分钟)在水中灭菌。
用于实施例的生物反应器的制备：
生物反应器是通过WO2009044053中描述的方法获得的脱乙酰壳多糖的单膜中空纤维。生物反应器基于来自乌贼笔(squid pen)壳多糖的脱乙酰壳多糖(Mahtani脱乙酰壳多糖,Veraval,India；Mahtani批次索引114)，其具有4％的乙酰化度(如通过如WO2009044053中描述的Hirai方法所测定)，具有550kg/mol的平均分子量Mw(如通过如WO2009044053中所述的与折射率测量和多角度光散射偶联的大小排阻层析所测定)，获得的通道的内部具有20至50mm3的体积。
用就脱乙酰壳多糖的胺部分而言化学计算量的乙酸制备在去离子水中具有2％w/w的聚合物浓度的乙酸脱乙酰壳多糖溶液。这可以在具有机械搅拌的密闭反应器中进行操作。聚合物溶解之后，将溶液置于注射器中并且可以通过离心(5000g,10min)去除气泡。
精子发生
将20至50mm3的生精小管引入脱乙酰壳多糖管。然后将脱乙酰壳多糖管在两端密封，然后沉积于含有约8ml培养基的常规培养孔中。每两天更换培养基。培养基由以下组成：补充抗生素的15mM Hepes-缓冲的F12/DMEM，1.2g/L NaHCO3，10μg/ml胰岛素，10μg/ml转铁蛋白，10-4M维生素C，10μg/ml维生素E，3.3 x 10-7M视黄酸，3.3 x 10-7M视黄醇，10-3M丙酮酸盐(都来自Sigma)，10-7M睾酮，和50ng/ml猪FSH。对于8日龄大鼠、1.5岁食蟹猴和变性人，在培养几天之后将睾酮添加至培养基。
组织学研究
在所选培养天数时，将生精小管从脱乙酰壳多糖管挤出，在两个显微载玻片之间压碎。然后通过Harris氏苏木精溶液染核。
实施的过程的结果呈现于图中。
20日龄大鼠上的结果
在20日龄大鼠中，在培养开始时，最分化的生殖细胞是粗线期精母细胞(阶段X)。
在培养不同天时，观察生殖细胞。细胞具有与其体内外观类似的外观。在培养的第11天显现圆形精子细胞(精子发生的步骤1-4)和长形精子细胞(精子发生的步骤9)。培养39天之后，观察到具有其鞭毛的长形精子细胞的簇(图1)。在更高放大率下还观察到长形精子细胞(ES)的头部(图2中的H)和鞭毛(图2中的F)(精子发生的步骤15-17)(图2)。
在第39天观察到大细胞簇(图9和10)：早期减数分裂细胞、细线前期(Prl)和细线期(Lept)精母细胞仍然丰富，并且存在新一波圆形精子细胞(RS)与年轻粗线期精母细胞。
8日龄大鼠上的结果
通过与在其睾丸中仅具有精原细胞的青春期前(prebubertal)男孩类比，进行来自8日龄大鼠的生精小管培养。事实上，8日龄大鼠在其睾丸中仅具有精原细胞。
培养61天之后，在繁殖压碎的培养的生精小管之后获得细胞。
图3显示具有细胞从管的基底(B)关联至内腔(L)的生精上皮的部分。观察到长形精子细胞/精子(图3中的ES/SZ)的簇，其在培养的生精小管的内腔中具有其鞭毛。
在图4中看到生精上皮的边界内的细胞的组织。在生精小管的基底(B)至内腔(L)的上皮内，以相继更高水平鉴定到Sertoli细胞核(SCn)和/或精原细胞核(Gn)、粗线期精母细胞(PS)、圆形精子细胞(RS)和ES/SZ。注意到不存在细线前期精母细胞。观察到ES/SZ的头部(H)和鞭毛(F)(图4)。这些结果显示与不具有内腔的体内8日龄大鼠生精小管相比培养61天过程中培养的生精小管的生长(图5显示8日龄大鼠睾丸的横截面)。图5显示Sertolli细胞(SC)、生精小管的基底(B)和精原细胞簇(G)。
61天培养的生精小管的大小(图4)比体内60日龄大鼠生精小管的大小略小(图6显示60日龄大鼠睾丸的横截面，其具有生精小管的基底(B)和内腔(L)，精原细胞(Spermatogona)(G)粗线期精母细胞(PS)，圆形精子细胞(RS)和精子(SZ)。
图7显示分离的精子(SZ)(精子发生的步骤19)。在更高放大率(图8)，观察到SZ的精子头部(H)、胞质叶(CL)和鞭毛(F)。
这些结果显示，根据本发明的方法使得能够从生殖组织实施精子发生，即，从精原细胞至长形精子细胞或精子。
1.5岁食蟹猴上的结果
通过与在其睾丸中仅具有精原细胞的男孩类比，培养两个1.5岁食蟹猴的生精小管。事实上，1.5岁猴在其睾丸中仅具有精原细胞。培养54天之后，在繁殖压碎的培养的生精小管之后获得细胞。
图11显示精子鞭毛(F)。
图12显示在较高放大率的ES的头部(H)和鞭毛(F)。粗线期精母细胞(PS)在ES旁边。
图13：年轻精母细胞的存在(通过箭头显示)表明新一波减数分裂生殖细胞准备分化成精子。
针对变性人的结果
培养变性人的生精小管。抑制其精子发生的激素治疗之后，该男子在其生精小管中仅具有精原细胞、稀有的细线前期精母细胞和Sertoli细胞。该患者接近于在其睾丸中仅具有精原细胞的年轻男孩。
培养34天之后，在繁殖压碎的培养的生精小管之后获得细胞。
图14显示精子的鞭毛(F)(通过箭头显示)。
在较高放大率，图15显示精子的头部(H)和鞭毛(F)。

Claims (19)

1.用于从雄性生殖组织体外精子发生的方法，其包括在生物反应器中进行包含生殖细胞的睾丸组织的成熟，和回收长形精子细胞和/或精子，所述生物反应器由生物材料制成且包含至少一个其中放置生殖组织的腔体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中生殖组织，优选睾丸组织，包含至少一个生精小管或至少一个生精小管的片段，优选几个生精小管或几个生精小管的片段。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述生殖组织，优选睾丸组织，包含来自2至50、3至40、4至30、5至20个生精小管的片段。
4.根据权利要求2所述的方法，其中通过机械分离或酶促分离生精小管而获得所述小管和/或片段。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中生精小管的片段具有包含于约1mm和约5mm之间的大小。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述生殖组织，优选睾丸组织，包含生殖细胞、Sertoli细胞和小管周围细胞，以及任选Leydig细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中将选自生殖细胞、Sertoli细胞、小管周围细胞及其混合物的细胞添加至所述生殖组织，优选睾丸组织。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述腔体的体积或生殖组织、优选睾丸组织的体积为约1至约100mm3，优选约0.5至约150mm3，例如约1至约30mm3。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述生殖组织，优选睾丸组织，来自：
-即将经历性腺-毒性治疗或外科手术、例如癌症-疗法的健康的青春期前或青春期后的患者；
-例如由于在童年或严重的镰状细胞病过程中的遗传或获得性非强迫性无精子症、双边隐睾症而不产生精子的青春期后的患者；
-具有双边隐睾症或严重的镰状细胞病的青春期前的患者；
-濒危物种；
-马、骆驼、单峰骆驼或宠物；
-牲畜。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物材料呈物理水凝胶状态，且优选包含多糖，优选天然多糖，或结构蛋白，优选胶原蛋白，或其混合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述天然多糖是单独或呈混合物的脱乙酰壳多糖、透明质酸、藻酸盐、果胶或修饰的天然多糖诸如羧甲基纤维素(CMC)，优选单独或呈混合物的脱乙酰壳多糖或藻酸盐，优选脱乙酰壳多糖。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其包括以下步骤：
a)提供生殖组织的样品；
b)提供由生物材料制成且包含至少一个腔体的生物反应器；
c)将所述生殖组织引入所述生物反应器的至少一个腔体；任选地密封所述生物反应器
d)将含有所述生殖组织的所述生物反应器置于包含培养基的罐中；
e)进行所述生殖组织的成熟，直到获得长形精子细胞和/或精子；
f)从所述生物反应器回收长形精子细胞和/或精子。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中在所述生殖组织周围形成所述生物反应器。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述生物反应器是生物材料的中空纤维，其包含其中放置所述生殖组织的通道。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述生物反应器由水凝胶制成。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中将所述生物反应器置于培养基中或培养基的接触处，其中：
-所述培养基包含单独或呈混合物的生长因子、激素、睾酮、维生素、抗生素、代谢物等中的一种或多种；或
-所述培养基包含单独或呈混合物的生长因子、激素、维生素、抗生素、代谢物等中的一种或多种，并且在所述方法的过程中将睾酮添加至所述培养基。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述生物材料使得其能够使得空气、二氧化碳和生物反应器置于其中用于成熟的培养基的要素通过其扩散。
18.体外受精的方法，其包括以下步骤：
a)根据权利要求1至17中任一项所述的方法制备长形精子细胞和/或精子；或通过根据权利要求1至17中任一项所述的方法提供长形精子细胞和/或精子；
b)用获得的长形精子细胞和/或精子使卵母细胞受精。
19.用于实施从雄性生殖组织体外精子发生的试剂盒，其包含由生物材料制成且包含至少一个其中放置生殖组织的腔体的生物反应器。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118109396A (zh) * 2024-03-16 2024-05-31 南京元荟生物科技有限公司 一种用于打印人类精子体外分化成熟的三维结构的方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3034612A1 (en) 2014-12-16 2016-06-22 Greenaltech, S.L. Chitin and chitosan producing methods
JP7399406B2 (ja) * 2019-03-04 2023-12-18 公立大学法人横浜市立大学 精子形成誘導用培地
EP4196769A4 (en) * 2020-08-12 2024-08-07 Allen Inst SYSTEMS, DEVICES AND METHODS FOR QUALITY CONTROL OF CELL PRODUCTION USING PREDICTIVE MARKING
KR20230129251A (ko) * 2021-01-04 2023-09-07 페이터나 바이오사이언시즈 인크. 인간 고환 조직 배양 시스템을 확립하기 위한 프로세스
CN113957039A (zh) * 2021-09-06 2022-01-21 西南民族大学 一种冷冻保存的牛生精细胞体外培养方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102124096A (zh) * 2008-07-16 2011-07-13 儿童医疗中心有限公司 具有微通道的器官模仿装置及其使用和制造方法
US20120040463A1 (en) * 2007-09-07 2012-02-16 Centre National De La Recherche Scientifique Hollow, notably multi-membrane fibers, method for preparation thereof by spinning and device for applying said method

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002094987A2 (en) * 2001-05-18 2002-11-28 Cornell Research Foundation, Inc. In vitro production of haploid germ cells
US20080044395A1 (en) * 2004-04-13 2008-02-21 Sungkwang Educational Foundation In Vitro Method for Isolating, Proliferating and Differentiating Germ-Line Stem Cells
WO2008112170A1 (en) * 2007-03-09 2008-09-18 Corning Incorporated Three dimensional gum matrices for cell culture, manufacturing methods and methods of use
US9522218B2 (en) 2007-10-11 2016-12-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for preparing porous scaffold for tissue engineering, cell culture and cell delivery
CN101903408B (zh) 2007-10-30 2013-08-14 粘凝胶股份公司 壳聚糖组合物
CA2779726C (en) * 2009-11-05 2018-03-06 Primegen Biotech, Llc Dba Reprocyte Ex host maturation of germline stem cells
JP6177687B2 (ja) * 2010-05-07 2017-08-09 ユニバーシティー オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル 実質組織からの細胞の移植用医薬の製造に用いられる混合物の使用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120040463A1 (en) * 2007-09-07 2012-02-16 Centre National De La Recherche Scientifique Hollow, notably multi-membrane fibers, method for preparation thereof by spinning and device for applying said method
CN102124096A (zh) * 2008-07-16 2011-07-13 儿童医疗中心有限公司 具有微通道的器官模仿装置及其使用和制造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JAN-BERND STUKENBORG等: "New horizons for in vitro spermatogenesis? An update on novel three-dimensional culture systems as tools for meiotic and post-meiotic differentiation of testicular germ cells", 《MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION》 *
ROBERT E. CHAPIN等: "Assuring safety without animal testing: The case for the human testis in vitro", 《REPRODUCTIVE TOXICOLOGY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118109396A (zh) * 2024-03-16 2024-05-31 南京元荟生物科技有限公司 一种用于打印人类精子体外分化成熟的三维结构的方法

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Publication number Publication date
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