JP2013514760A - 生殖系列幹細胞の生体外での成熟 - Google Patents
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Abstract
患者の生殖能力の回復のために、未成熟な生殖系列細胞を、半数体の配偶子に宿主外で成熟させる方法が提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
本発明は、生殖系列幹細胞の損傷のために不妊のおそれのある患者由来の生殖系列幹細胞の、宿主を除くまたは宿主外での成熟(生体外であっても、代理動物の生体内であっても)における成熟システムと、当該患者のその後の生殖能力の回復に関する。患者が悪性腫瘍に対する化学治療または放射線治療を受けた場合、生体外受精および、それに続く宿主外成熟と子宮への移植を組み合わせる必要がある。新たに移植された精巣または卵巣組織に混入する可能性のある腫瘍細胞を再び取り込む恐れがあるので、宿主である患者への直接の再移植または自己移植は避けるべきである。
生殖系列幹細胞は、生殖器官、例えば、卵巣および精巣に属し、潜在的には、哺乳類の体内で最も重要かつ保護された幹細胞の種類の1つである。遺伝的保存および高いテロメラーゼ活性に加え、クロマチン染色体の修飾を伴う多くのDNA修飾がこれらの組織由来の幹細胞で報告されている。科学者の間では、成体の生殖組織に内在する幹細胞のタイプおよび分化におけるそれらの可能性についての意見が異なる。
化学治療および放射線治療は、癌性細胞のみならず急速に分裂する細胞も標的とする。精巣では、急速に分裂する幹細胞は、化学物質や放射線の暴露の影響を受けやすい。思春期前の精巣では、生殖系列幹細胞は、同様に影響を受けやすく、放射線への暴露によって急激かつ濃度依存的に激減する。低濃度でも細胞毒性のある薬剤および放射線照射は、分化している精原細胞を激減させるが、影響をほとんど受けない精原幹細胞、精母細胞および精子細胞は生存する。分化している生殖細胞は、精子細胞への成熟を継続することができ、生存している幹細胞群から発生する幹細胞を伴う精細管に再定着できる。
しかし、深刻な激減の場合、精子形成は、ごく少ない精細管で回復されるだけであって、その結果、生殖能力を制限してしまう。患者は、精巣の生殖細胞の完全な喪失後に、永久に不妊となる。精子形成への影響が思春期の時又はその前に強く現れるのは、通常精子が得られないし、思春期後の雄では低温保存されてもいないためである。もし精子形成を再び開始するのに十分な時間が与えられたら、わずかな幹細胞であっても精細管に再定着できる。
最近まで、ヒトを含むほとんどの哺乳類種の雌の生殖腺は原始卵胞に含まれる減数分裂で停止した有限個数の生殖細胞(卵母細胞)を有し、該生殖細胞は、各月経サイクルの間の排卵において放出される卵子の備蓄として機能することが信じられていた。卵母細胞の個数は、出産後生活を経てアポトーシスに関連する機序を介して減少し、ついには生殖細胞を欠く卵巣が残されるということが広く信じられていた。ヒトでは、50歳代の間に卵母細胞の備蓄の完全な消耗が通常起こり、更年期障害が進む。
また、発生生物学のこの基本原理に従って、一度消耗してしまうと卵巣の生殖細胞のプールは再び満たされないことが信じられていた。このため、卵母細胞の消失を加速する処置はいずれも生殖能力を減少させる恐れがあって、予想よりも若い年齢で更年期障害が出る。例えば、卵巣を損傷する様々な手段、化学治療剤および放射線治療のようなものを女性が受けることは、一般には、早発閉経および不可逆の不妊につながる。現在、生殖能力および多様な悪条件下における通常の卵巣の機能を維持する治療の選択肢は限られていて、侵襲的な、例えば、卵巣の組織断片または単一の卵母細胞の低温保存のようなものであって、かつ事前のホルモン療法を必要とすることが多く、ホルモン反応性腫瘍を伴う多くの女性にとって医学的に妥当でない。さらに、今のところ、更年期障害において通常の卵巣障害を遅らせるための治療の選択肢はない。
雄及び雌両方における機能的な生殖細胞の回復のために、2つの主なアプローチが特定された。第1は、未成熟な組織(卵巣または精巣のどちらか)断片を生存している組織に移植することであって、第2は、幹細胞の単離と移植に基づく。
生殖細胞の移植は、げっ歯動物モデルで開発された。マウスまたは近縁関係にある種マウス由来の生殖細胞の、マウスの精細管への顕微注射は、供与された精原幹細胞からの精子形成を再亢進した。精原細胞は、移植前に低温保存又は培養されてもよい。同様に、低温保存された卵巣皮質組織がヒツジ及びヒトに移植された結果、発情が再開され、通常の交配に続いて子が産まれた。しかし、このような直接の自己移植を、ドナー生物に行うことは、もともと悪性腫瘍に対する治療を受けていた患者にとって最適ではない。これは、患者が化学治療または放射線治療後に再発した場合、再発が化学治療または放射線治療で殺されなかった体内の悪性細胞の蓄積によるものなのか、低温保存された生殖腺組織および細胞の再移植が当該悪性細胞を抱えていたのか明らかにならないからである。だから、そのような患者に対する最適な方法は、低温保存された生殖腺組織を機能のある精子または卵子に成熟させ、自然のまたは類似する宿主外で成熟させた相手の卵子または精子を用いて、生体外での受精(卵細胞質内精子注入法またはICSIの使用または不使用)を行い、それから、受精した胚を雌の相手に再移植することである。受精した胚は混入のない宿主外で成熟させた精子または卵子から作製されるだけなので、この方法は、腫瘍の混入の可能性は全くない。
従って、成熟した精子または卵子を保存する能力を欠く患者の生殖能力を回復するため、および成熟した精子または卵子を産生するために宿主外/生体外または宿主外/生体内で保存された生殖系列細胞を成熟させるために、生殖系列細胞の保存システムがヒトにとって必要とされている。
本開示は、成熟した生殖細胞を産生するために未成熟な生殖系列幹細胞を成熟させる方法を提供する。
本明細書で開示される1つの実施の形態では、宿主外で、未成熟な生殖系列細胞を単一の配偶子に成熟させる方法は、精巣または卵巣から未成熟な生殖系列細胞を得るステップと、細胞が生体内で成熟する条件を模擬した条件下で、未成熟な生殖系列細胞を生体外で培養し、培養が機能的な精子または卵子への生殖系列細胞の成熟をもたらすこととを、含む。
他の実施の形態では、未成熟な生殖系列細胞は、思春期前の患者から得られる。他の実施の形態では、未成熟な生殖系列細胞は、成熟前に低温保存される。他の実施の形態では、未成熟な生殖系列細胞は、生殖系列幹細胞または減数分裂前の生殖細胞である。
1つの実施の形態では、培養は、人工の精細管での未成熟な精巣の生殖系列細胞の培養を含む。他の実施の形態では、培養は、グリア細胞株由来成長因子、線維芽細胞増殖因子、白血病抑制因子および上皮細胞増殖因子からなる群から選択される少なくとも1つの成長促進因子の存在下での未成熟な精巣の生殖系列細胞の培養を含む。他の実施の形態では、培養は、卵胞刺激ホルモン、幹細胞因子およびレチノイン酸からなる群から選択される少なくとも1つの成熟誘導因子の存在下での未成熟な精巣の生殖系列細胞の培養を含む。
他の実施の形態では、人工の精細管は、細胞外基質で被覆された生体適合性のチューブを備える。他の実施の形態では、細胞外基質は、精巣の細胞外基質である。また、他の実施の形態では、精巣の細胞外基質は、精巣の生殖系列細胞に自己移植される。
1つの実施の形態では、培養は、顆粒膜細胞およびフィブリン塊の存在下における未成熟な卵巣の生殖系列細胞の培養を含む。他の実施の形態では、培養は、グリア細胞株由来成長因子、線維芽細胞増殖因子、白血病抑制因子、上皮細胞増殖因子および成長ホルモンを含む成長促進因子の存在下で培養された未成熟な卵巣の生殖系列細胞の培養を含む。また、他の実施の形態では、培養は、卵胞刺激ホルモン、幹細胞因子およびレチノイン酸を含む成熟誘導因子の存在下で培養された未成熟な卵巣の生殖系列細胞の培養を含む。
他の実施の形態では、フィブリン塊は、卵巣の生殖系列細胞に自己移植される。他の実施の形態では、顆粒膜細胞は、卵巣の生殖系列細胞に自己移植される。
(用語の定義)
以下の用語の定義は、読者にとって有用な参考として提供される。本明細書で使われる用語は、本発明に関連する場合に特別な意味を持つ。用語を使うためにそれらの通常かつ共通の意味に準じて、あらゆる努力がなされてきた。しかし、共通の通常の意味と以下の定義との間に矛盾が存在する場合には、それら定義が共通の使われ方に優先する。
以下の用語の定義は、読者にとって有用な参考として提供される。本明細書で使われる用語は、本発明に関連する場合に特別な意味を持つ。用語を使うためにそれらの通常かつ共通の意味に準じて、あらゆる努力がなされてきた。しかし、共通の通常の意味と以下の定義との間に矛盾が存在する場合には、それら定義が共通の使われ方に優先する。
関係づけられた:ここで用いられた場合、「関係づけられた」は、特異的な機能に不変に関係づけられると考えられる細胞を意味する。また、関係づけられた細胞は、“最終分化した細胞”を意味する。
培養:ここで用いられた場合、「培養」または「培養された」は、細胞分裂および細胞数の増加が起きるように調整された条件下での細胞の増殖を意味する。
分化:ここで用いられた場合、「分化」は、細胞がある形状または機能に適合することを意味する。細胞では、分化はさらに関係づけられた細胞をもたらす。
胚幹細胞:ここで用いられた場合、「胚幹細胞」は、全能性かつ成長中の胚であって、子宮壁に付着するまでの発生段階に達したものに由来するあらゆる細胞を意味する。本明細書では、胚幹細胞と前胚幹細胞とは同等の用語である。胚幹細胞様(ESC様)細胞は、全能性細胞であって、胚から直接単離されたものではない。ESC様細胞は、単離され、増殖された始原性細胞から派生し得る。
宿主外:ここで用いられた場合、「宿主外」は、ドナーの体外での生殖系列細胞の成熟を意味する。本開示の目的において、宿主外での成熟は、ドナーの生殖系列細胞の生体外、生体外および生体内(ドナー以外の他のヒトまたはその他の種)での成熟を含む。
増殖された:ここで用いられた場合、「増殖された」は、元の濃度から細胞数が増加する細胞の成長培養を意味する。
胎児幹細胞:ここで用いられた場合、「胎児幹細胞」は、多分化能、かつもはや初期または中期段階の器官形成ではない成長中の多細胞胎児由来の細胞を意味する。
配偶子:ここで用いられた場合、「配偶子」は、完全なヒトを形成するために必要な遺伝物質の半分を含む生殖細胞を意味する。受精の間、雄および雌の配偶子は(それぞれ精子と卵子)、融合し、受精卵を産生する。
生殖細胞:ここで用いられた場合、「生殖細胞」、「生殖系列細胞」または「生殖系列組織」は、精母細胞もしくは卵母細胞のような生殖細胞、または生殖細胞もしくはそのような細胞を含む組織に成長する細胞を意味する。
生殖系列前駆細胞:ここで用いられた場合、「生殖系列前駆細胞」は、精原幹細胞の前駆体または卵母前駆幹細胞のような生殖細胞を意味する。
生殖系列幹細胞:ここで用いられた場合、「生殖系列幹細胞」は、精原幹細胞(SSC)または卵母前駆幹細胞のような生殖細胞を意味する。
生殖腺:ここで用いられた場合、「生殖腺」は、生殖細胞(配偶子)を産生する、動物のあらゆる対器官を意味する。これらは、卵子を産生する雌の卵巣、精子を産生する雄の精巣を含む。
未成熟な:ここで用いられた場合、用語「未成熟な」は、成熟し、機能的に分化した状態に達していない生殖系列細胞を意味する。
長期培養:ここで用いられた場合、「長期培養」は、少なくとも2ヶ月より長く、または10継代を超えての調整された条件下での細胞の増殖を意味する。好ましくは、長期培養は、4ヶ月を超えて、6ヶ月を超えて、または1年を超えて培養される。好ましくは、長期培養は、15継代を超えて、18継代を超えて、または20継代を超えて継代されることである。長期培養の継続時間は、個々の細胞にかなり依存しており、細胞株によってばらつきがある。
成熟:ここで用いられた場合、「成熟」は、最終分化した細胞タイプに導く協調的な生化学ステップの過程を意味する。
多分化能の:ここで用いられた場合、「多分化能の」は、数種の他の細胞タイプを生じさせることができるがそれら細胞タイプの数が有限である細胞を意味する。多分化能の細胞の例は、造血細胞‐数種類の血液細胞に成長し得るが脳細胞には成長し得ない血液幹細胞である。
多分化能の成熟前駆細胞:ここで用いられた場合、「多分化能の成熟前駆細胞」は、骨髄から単離された多分化能の細胞を意味し、当該細胞は外胚葉、中胚葉および内胚葉系統の細胞に分化することができる。
多能性の:ここで用いられた場合、「多能性の」は、胎盤のまたはその他子宮を支持する細胞を除くあらゆる細胞タイプを生じさせることができる細胞を意味する。
出生後幹細胞:ここで用いられた場合、「出生後幹細胞」は、出生後の多細胞生物由来のあらゆる細胞を意味する。
思春期前の:ここで用いられた場合、「思春期前の(pre−pubescent)」または「思春期前の(pre−pubertal)」は、思春期に入っていない個体を意味する。思春期の始まりは、高いゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)パルスに関連し、性ホルモン、黄体形成ホルモン(LH)および卵胞刺激ホルモン(FSH)の増加に先行する。思春期は、少女では47kg前後、少年では55kg前後で常に始まる。正常な年齢の幅は広いが、平均して、少女は少年よりも約1‐2年早く思春期の進行が始まり(平均年齢は少女で9‐14歳および少年で10‐17歳)、少女のほうがより短い時間で完了し、通常17歳までに思春期が終わる。
始原生殖細胞:ここで用いられた場合、「始原生殖細胞」(PGC)は、初期の胚形成に存在する細胞を意味し、該細胞は生殖細胞になることが決まっている。
始原生殖系列性幹細胞:ここで用いられた場合、「始原生殖系列性幹細胞」は、「生殖系列性細胞」、略してPGLSCと言われることもあり、成体の雄または雌の生殖組織由来の細胞であって、例えば放射線または化学治療後に不妊の精巣または卵巣組織を生殖可能に再定着できることからも分かるように、生殖系列幹細胞およびそれらの子孫を発生することができる細胞を意味する。生殖系列性細胞は、成体の生殖組織で休眠または活発に分裂できる。
再プログラミング:ここで用いられた場合、「再プログラミング」は、細胞の遺伝的プログラムのリセットを意味し、当該細胞は多能性を示し、完全に成長した生物を産生する能力を有する。加えて、この再プログラミングは、再プログラミング前の状態では通常細胞で発現してない、またはみられない再プログラミング特性を細胞に与える。
選択:ここで用いられた場合、「選択」は、蛍光活性化細胞選別、電磁粒子選別または所定のマーカーのプロファイルを有する細胞を収集する他の手段を意味する。
性細胞:ここで用いられた場合、「性細胞」は、哺乳類の雄または雌の生殖組織由来の2倍体または半数体を意味する。これらの細胞の代表例は、雄の原生殖細胞、雌の原生殖細胞、卵原細胞、A型精原細胞およびB型精原細胞を含む。
体細胞:ここで用いられた場合、「体細胞」は、性細胞およびそれらの前駆体を除く体内のあらゆる組織細胞を意味する。
体性幹細胞:ここで用いられた場合、「体性幹細胞」は、2倍体の多分化能のまたは多能性幹細胞を意味する。体性幹細胞は、全能性幹細胞ではない。
幹細胞:ここで用いられた場合、「幹細胞」は、自己再生(細胞分裂の多くのサイクルを経過できる一方、未分化状態および少なくとも多分化能(1種より多くの特殊な細胞タイプに分化する能力)であることを維持する)できる細胞を意味する。
十分に純粋な:ここで用いられた場合、「十分に純粋な」は、75%より多く、85%より多く、90%より多く、95%より多く、98%より多く、または99%より多くの細胞が、要求される特性を有する細胞の集団を意味する。
全能性:ここで用いられた場合、「全能性」は、体に加えて胎盤の細胞全てを形成するために必要な遺伝情報の全てを含む細胞を意味する。ヒトの細胞は、受精卵の最初の数回の分裂の間に限って全能性となる能力を有する。
本開示は、雄および雌由来の生殖系列幹細胞の宿主外での成熟のため、および例えば、腫瘍細胞の再取り込みの恐れがあるような、自身の体内における生体内の生殖細胞を成熟できない個体における生殖能力または受精の可能性の回復のための方法を提供する。
骨髄幹細胞移植を施行する前に、癌および他の悪性でない疾患(これらに限定されないが、鎌状赤血球貧血および地中海貧血等)の治療で行われる化学治療および放射線治療がよく知られており、これらの治療を受けている患者の生殖能力に有害な影響を及ぼす。これらの治療は、患者の生殖能力を永久に損ない、患者が不妊になる危険性は30%である。
生殖系列細胞の保存方法に関連する方法が、同時係属出願xx/xxx,xxxに開示され、該出願は、タイトルが“生殖系列幹細胞の保存システム”(代理人明細書第1951314−00061)であって、本願とともに同日付けで出願され、その全体をここで参照することで本明細書に援用される。
男性における不妊のリスク
思春期前の患者由来の精巣の生殖腺組織および/または生殖系列幹細胞を保存し、後に、これらの細胞を宿主外で成熟し、その患者の生殖能力を回復することが望ましい。
思春期前の患者由来の精巣の生殖腺組織および/または生殖系列幹細胞を保存し、後に、これらの細胞を宿主外で成熟し、その患者の生殖能力を回復することが望ましい。
男性において組織および生殖系列幹細胞の保存が求められる疾患または状態は、これらには限定されないが、両側停留精巣、精巣捻転、停留精巣、精索静脈瘤、生殖器および非生殖器癌を含む癌、細胞傷害性療法、骨随移植を含む。1つの実施の形態では、ドナーは、思春期前の男性である。他の実施の形態では、ドナーは、思春期後の男性である。
成人患者に対して、治療前の予防段階は生体外受精のために精子を凍らせること、または他の補助的な生殖技術の選択であり、その患者は治療後に不妊になるだろう。化学/放射線治療の時点で成熟精子を発達させていない思春期前の患者にとって、組織又は細胞の保存の他に選択肢はない。本発明者による本方法の発明以前には、思春期前の男性患者の生殖能力を維持するためにふさわしい選択肢はない。生殖能力を保存するための精原幹細胞の抽出および低温保存は、多くの研究の主題である。さらに、低温保存した卵巣組織(単個細胞の懸濁液ではない)の移植は、動物モデルでは成功したが、ヒトではまだ成功していない。精巣組織の移植に続く生殖能力の回復というコンセプトの証明が、マウス、ウシ、ブタ、霊長類モデルを含む様々な動物モデルに加えてヒトでもなされている。
しかし、患者が悪性腫瘍を患っている場合、精巣組織および細胞の直接の再移植または移植が何らかの腫瘍細胞が混入した状態を宿主に再導入する恐れがある;従って、精巣細胞および組織の成熟した精子への宿主外での成熟(生体外または他の非ヒトの代理動物の生体内のどちらか)、さらに卵子に対する生体外での受精を行うために成熟した精子を使用することが望ましい。そして、そのような受精卵は、腫瘍の混入の恐れがなく、患者が選んであらかじめ準備された子宮に移植される。
女性における不妊のリスク
思春期の患者由来の卵巣組織および細胞、成人の患者由来の卵巣組織、卵胞および細胞を保存すること、その患者の生殖能力を回復するために宿主外でこれら細胞を後に成熟することが望ましい。
思春期の患者由来の卵巣組織および細胞、成人の患者由来の卵巣組織、卵胞および細胞を保存すること、その患者の生殖能力を回復するために宿主外でこれら細胞を後に成熟することが望ましい。
女性において組織および生殖系列幹細胞の保存が求められる疾患または状態は、直接的または間接的に生殖能力に影響する疾患または状態を含み、例えば、これらには限定されないが、卵巣嚢胞、子宮外妊娠、子宮摘出、生殖器および非生殖器癌を含む癌、細胞傷害性療法、骨随移植、卵巣切除、子宮内膜症、もしくは生殖の全盛期に近づくか経過したが生殖能力を維持したい女性に対する家族計画を目的とする場合である。1つの実施の形態では、ドナーは、思春期前の女性である。他の実施の形態では、ドナーは、思春期後の女性である。
女性では、細胞傷害性治療は、卵胞破壊を引き起こし、早発閉経および不妊をもたらす。生殖能力の減少に加え、エストロゲンおよび他のホルモンの消失は、骨粗鬆症および心血管疾患のような長期の健康問題につながる。女性の小児期における癌の生存者の6%より多くが急性の卵巣障害を経験した。癌治療を受けた成人女性の、早発閉経の発生率は30%である。卵巣切除および卵巣摘出のような他の医療処置は、女性の生殖能力を直接的に危険にさらし、あるいは影響を与える。これらの処置は、患者が悪性または良性卵巣腫瘍、子宮外妊娠、子宮内膜症および卵巣嚢胞と診断されたときに頻繁に必要とされる。乳癌患者、または乳癌もしくは卵巣癌に発展する危険のある患者がよく卵巣切除を受けるのは、ホルモンの複雑な関係および遺伝性素因のせいで癌に発展する可能性を減らすためである。
将来の生殖能力を確保するために細胞傷害性治療を受けている女性に対する選択肢は限られている。細胞傷害性もしくは細胞増殖抑制治療または生殖器官の外科的除去の前における予防段階で、卵母細胞または卵子が取り出され、補助的な生殖技術で用いるために低温保存され、患者は治療後に不妊になるだろう。しかし、凍結および解凍されたヒトの卵母細胞の生存能力がとても低いのは、体積に対する表面の比が小さく、抗凍結剤が細胞膜を容易に透過できない巨大な細胞の凍結における固有の困難さのためである。したがって、組織、原始卵胞または卵巣細胞(生殖系列幹細胞を含む)の保存は、卵母細胞の凍結に代わる、または追加する実行可能な選択肢である。
保存された、低温保存された卵巣組織または卵胞は、患者が不妊になった場合に治療後患者が生殖能力を回復する状態になった時点で患者に移植され戻される。また、癌に対する治療を受けているか無傷の生殖器官をもっていない患者に対しては、凍結された組織または卵胞が、ここで開示される宿主外の成熟方法において用いられ、生体外または動物宿主(卵母細胞または卵胞の成熟のための支持システムとしてのみ用いられる)のどちらかで、さらに成熟した卵子が補助的な生殖技術によって受精され得る。
ここで開示される生殖系列細胞は、哺乳動物の生殖腺組織から単離され、該哺乳動物は、これらには限定されないが、げっ歯類、家畜動物、イヌ、ネコおよび霊長類を含む。「霊長類」の用語は、これに限定されないが、ヒトを含む。
生殖系列細胞は、種々の生殖系列、胚および多能性細胞マーカーの発現、または発現の欠如に基づいて単離される。生殖系列細胞のマーカーは、これらには限定されないが、VASA、前骨髄球性白血病亜鉛因子(PLZF)、グリア由来神経栄養因子受容体α1(GFR‐α1)、α6‐インテグリン、Thy‐1、CD9、CD90、CD49f、ドリコス凝集素(DBA)、神経細胞接着分子(NCAM)、生殖系列細胞核抗原1(GCNA1)およびDAZLを含む。
多能性細胞マーカーは、これらには限定されないが、Oct‐4(POU5F1)、Nanog、アルカリホスファターゼ、SSEA‐4、TRA1‐60およびTRA1‐81を含む。
さらに、生殖系列細胞は、生殖系列および/または多能性幹細胞遺伝子の発現に基づいても単離される。生殖系列幹細胞遺伝子は、これらには限定されないが、テロメラーゼ、VASA、C‐Ret、c‐Kit、PLZF、DAZLおよびGFR‐α1を含む。多能性細胞遺伝子は、これらには限定されないが、Oct‐4、Nanog、Dppa‐5Sox‐2、アルカリホスファターゼおよびCryptoを含む。
ここで開示される付加的な実施の形態は、長期間、多分化能または多能性の細胞株が発生するように、生殖系列幹細胞の所定の集団を長期培養することを含む。これらの細胞株は、組織特異的系統への分化のための細胞のもととして使用される。本生殖系列細胞の長期培養は、生殖系列および/または多能性細胞マーカーおよび生殖系列および/または多能性遺伝子の発現、または発現の欠如に基づいて、所望の生殖系列細胞の十分に純粋な集団を単離するステップ;実施例に開示された成長培地で細胞を培養し、細胞分裂を継続させる一方で未分化であって多分化能または多能性の状態を維持することを含む。ここに開示された長期培養は、将来の使用のために低温保存される。
ある実施の形態では、単離され、十分に純粋な生殖系列細胞または生殖系列細胞株の集団は、再生医療における治療用途に用いられる。ここで開示される生殖系列細胞は、より分化した生殖系列細胞、例えば雄の精母細胞、精子細胞および精子、ならびに雌の卵胞および卵母細胞等を形成でき、さらに生体内で不妊の生殖器官を再生できる。
本明細書で開示される生殖系列組織の保存システムは、次の構成要素および/またはステップを含む:1)組織の収集;2)中央保存場所への組織の輸送;3)中央保存で組織を処理すること;4)組織および単離された細胞を中央保存で低温保存すること;および5)品質保証および組織および/または単離された細胞の放出。任意の6番目のステップは、組織および/または単離された細胞のドナーへの再移植、あるいは宿主外での成熟に続く生体外での受精および胚移植を含む。
本明細書で開示されるのは、保存されたまたは新鮮な生殖系列細胞、例えば生殖系列幹細胞、精原幹細胞、卵巣幹細胞、精巣組織または卵巣組織の宿主外での成熟の方法であって、この方法によって自然な方法で妊娠できない患者が生殖能力を回復できる。
1.雄からの組織の収集
生殖系列細胞は、細胞傷害性治療の開始に先立って、または生殖細胞組織の破壊につながる傷害直後に精巣から取り出される。外科的な無菌状態および麻酔下で精細管組織の少なくとも1gが取り出される。物理的および酵素による単個細胞懸濁液への組織の分解は、中央保存設備への組織の輸送の前または後に行われる。
生殖系列細胞は、細胞傷害性治療の開始に先立って、または生殖細胞組織の破壊につながる傷害直後に精巣から取り出される。外科的な無菌状態および麻酔下で精細管組織の少なくとも1gが取り出される。物理的および酵素による単個細胞懸濁液への組織の分解は、中央保存設備への組織の輸送の前または後に行われる。
1つの実施の形態では、精巣の精細管組織は、約10×10mmの切片に切られ、5つまでの切片が無菌の輸送培地を含む無菌のチューブに入れられる。他の実施の形態では、組織は、1個の部分で維持され、無菌の輸送培地を含む無菌の容器に入れられる。
輸送培地には、あらゆる培地が含まれ、該培地は、精巣の精細管組織および/または分離された細胞の生存を24時間まで支持する。組織維持培地の限定しない例は、HEPESと抗生物質(ペニシリンおよびストレプトマイシン)とを添加されたPBS、FRS、DMEM、さらに組織培養培地に関してそれが含む全てをここで参照することで援用される米国特許出願公開第2007/0020759号明細書に開示された独自の培地も含む。
2.雌からの組織の収集
生殖系列細胞は、細胞傷害性治療の開始に先立って、もしくは生殖細胞組織の破壊または卵巣切除もしくは卵巣摘出につながる傷害直後に卵巣から取り出される。外科的な無菌状態および麻酔下で卵巣組織の少なくとも1gが取り出される。物理的および酵素による単個細胞懸濁液への組織の分解は、中央保存設備への組織の輸送の前または後に行われる。
生殖系列細胞は、細胞傷害性治療の開始に先立って、もしくは生殖細胞組織の破壊または卵巣切除もしくは卵巣摘出につながる傷害直後に卵巣から取り出される。外科的な無菌状態および麻酔下で卵巣組織の少なくとも1gが取り出される。物理的および酵素による単個細胞懸濁液への組織の分解は、中央保存設備への組織の輸送の前または後に行われる。
1つの実施の形態では、卵巣組織は、約10×10mmの切片に切られ、5つまでの切片が無菌の輸送培地を含む無菌のチューブに入れられる。他の実施の形態では、組織は、1個の部分で維持され、無菌の輸送培地を含む無菌の容器に入れられる。
輸送培地には、各種の培地が含まれ、該培地は、卵巣組織および/または分離された細胞の生存を24時間まで支持する。組織維持培地の限定しない例は、HEPESと抗生物質(ペニシリンおよびストレプトマイシン)とを添加されたPBS、FRS、DMEM、さらに米国特許出願公開第2007/0020759号明細書に開示された独自の培地も含む。
3.組織の輸送
収集された精巣または卵巣組織は、約4℃に維持され、組織の収集から24時間以内に中央保存設備に到着するように中央保存設備に輸送される。我々のデータは、細胞の生存能力は、輸送の48時間後まで変化せず、輸送の72時間後に減少することを示している。我々は収集後24時間以内に組織を扱うことが好ましいと考える。
収集された精巣または卵巣組織は、約4℃に維持され、組織の収集から24時間以内に中央保存設備に到着するように中央保存設備に輸送される。我々のデータは、細胞の生存能力は、輸送の48時間後まで変化せず、輸送の72時間後に減少することを示している。我々は収集後24時間以内に組織を扱うことが好ましいと考える。
4.組織の処理
収集された卵巣および精巣組織は、酵素で分解され、低温保存の前に生存能力および細胞マーカーに関して評価される。1つの実施の形態では、生殖系列幹細胞は、低温保存の前に組織から濃縮される。他の実施の形態では、精巣および卵巣細胞の全てが、生殖系列幹細胞を濃縮せずに低温保存される。
収集された卵巣および精巣組織は、酵素で分解され、低温保存の前に生存能力および細胞マーカーに関して評価される。1つの実施の形態では、生殖系列幹細胞は、低温保存の前に組織から濃縮される。他の実施の形態では、精巣および卵巣細胞の全てが、生殖系列幹細胞を濃縮せずに低温保存される。
他の実施の形態では、生殖系列幹細胞の濃縮は、雄および/または雌の生殖系列幹細胞に特異的な抗体を用いてフローサイトメトリー選別によって行われる。
5.低温保存
種々の培地および方法が生殖腺組織および/または生殖系列幹細胞の低温保存に用いられる。
種々の培地および方法が生殖腺組織および/または生殖系列幹細胞の低温保存に用いられる。
1つの実施の形態では、生殖系列幹細胞は、これらには限定されないが、ジメチルスルホキシド(DMSO)、エチレングリコール、グリセロールおよびプロパンジオールを含む少なくとも1つの抗凍結剤と;これらには限定されないが、DMEM、MEMおよび上記独自の培地を含む少なくとも1つの培養培地と;これらには限定されないが、スクロース、デキストラン、血清代替物およびHEPES緩衝液を含む少なくとも1つの物質と;を含む溶液に低温保存される。1つの実施の形態では、上記溶液は、CryoStor(商標) CS‐10培地(バイオライフソリューション社、米国ワシントン州バセル)を含む。他の実施の形態では、血清代替物は、Knockout Serum Replacement(インビトロジェン社、10828−028)である。
次に、細胞は、調整された凍結速度で、または「手動」作業によって凍結される。調整された凍結速度での凍結処理は、凍結速度を調整できる凍結装置をオンにし、組織または細胞凍結のための凍結プログラムを設定する。凍結速度を調整できる凍結装置は、内部のチャンバーの温度を下げるために液体窒素を使用してもよい(こうすることでチャンバー内のあらゆるものの温度が下がる)。細胞の凍結プログラムは、内部チャンバーを4℃に冷やすことに始まり、この処理が進むまで継続して維持する。凍結速度を調整できる凍結装置が冷えている間、4℃に冷やされた低温保存培地に細胞が懸濁される。細胞懸濁液は、冷凍バイアルにつき1mLで、冷凍バイアルに分注される。そして、冷凍バイアルは、標識され、凍結速度を調整できる凍結装置のチャンバーに置かれ、プログラムは継続される。はじめに、さらに10分間で4℃に維持された温度になる。次に、チャンバーは、温度が−80℃に達するまで−1℃/分の速度で冷却される。さらに、チャンバーは、温度が−120℃に達するまで−50℃/分の速度で冷却される。−120℃になって5分後、凍結された細胞の温度は−120℃に平衡しているはずである。そして、凍結された細胞の凍結バイアルは、長期保存のために液体窒素のデューア瓶に移される。
手動の凍結処理は、細胞をゆっくり凍結するために用いられる「Mr.Frosty」凍結容器(ナルゲン社)を準備することから始まる。「Mr.Frosty」容器は、ポリカーボネートユニットであって、細胞の低温保存および回復を成功させるために求められる、重要で、再現可能な−1℃/分の冷却速度を与える。「Mr.Frosty」の基部は、250mLの100%イソプロパノールで満たされる。チューブ入れは上端にあり、チューブ入れを覆って蓋がねじ止めされて、「Mr.Frosty」は、使用される前少なくとも1時間、4℃に置かれる。細胞は、4℃に冷却された低温保存倍地に懸濁される。細胞懸濁液は、冷凍バイアルにつき1mLで、冷凍バイアルに分注される。そして、冷凍バイアルは、標識され、事前に冷却された「Mr.Frosty」に置かれる。「Mr.Frosty」は10分間4℃に戻されて置かれる。次に、「Mr.Frosty」は、−80℃の凍結装置に一晩置かれる。−80℃の凍結装置に一晩置かれた後で、凍結バイアルは、長期保存のために液体窒素のデューア瓶に移される。
6.品質保証ならびに卵巣および精巣由来の生殖系列組織および/または細胞の放出
有効性、純度、同一性、生存能力および安定性の評価が、低温保存の前または特定の時点(安定性について)で、かつ組織または細胞が移植のために正常な状態であることを確かめるために放出されたうえで、試料に対して行われる。これらの評価は、組織/細胞サンプルにおいて関連する特定のマーカーを定量化することで、存在する生殖系列幹細胞の量(移植された場合に精巣を再生できる「有効性」を推定するため)、細胞の生存能力、および細胞の同一性を確認するための任意のDNA解析に関する情報を提供する。安定性の評価は、低温保存の質を確認するために一定間隔で解凍される組織または細胞の小さなサンプルを対象とする。
7.精巣由来の生殖系列組織および/または細胞の再移植
生殖系列幹細胞の十分に純粋な単離された集団の受容個体への移植は、当業者に知られる標準的な注射手段を用いる直接的な注入によってなされる。他の実施の形態では、支持細胞、例えば精原細胞への分化に関するホルモン刺激を与えるようなライディッヒ細胞またはセルトリ細胞が、生殖系列幹細胞とともに受容個体の精巣に移される。これらの移された支持細胞は、修飾されていないか、または遺伝的に修飾されているかのどちらかである。これらの移された支持細胞は、ドナーまたは受容個体の精巣のいずれかにおいて自己のものでもよいし、異種のものであってもよい。輸送流体における細胞の濃度の例は、単純な実験で簡単に決定されるが、約103‐1010細胞/mlの範囲内であるのが好ましい。輸精管、精巣網または精細管への細胞の導入は、手作業で行われる。ふさわしい染料または泡(直径2μm未満)が、移植される生殖系列幹細胞の精巣への十分な供給を容易に確認するために、任意に輸送流体に含まれてもよい。適切な変換器を装備した超音波が注射部位に針を位置決めするのに有用である。
適切な細胞移植媒体は、当業者に知られており、血清アルブミン、コレステロールおよび/またはレクチン、セレンおよび無機塩類の他に血清成分および/または成長因子および/またはサイトカイン等の分子を含む。通常は、細胞移植媒体は、おおよそ生理学的な例えば7.0から7.6のpHを有する。
本細胞組成物は、単独でまたは1種または複数の薬学的に許容される担体と組み合わせて、単一または複数の濃度で投与されてもよい。適切な薬学的な担体は、不活性な生体輸送ゲルまたは生分解性の半固体のマトリクスに加え、希釈剤または充填剤、無菌の水溶液および種々の毒性のない溶媒を含んでもよい。薬学的に許容される担体は、一般に、3つの機能を発揮する:(1)本細胞組成物において細胞を維持し保存すること;(2)再生、修復または活性化を必要とする組織部位で細胞を保持すること;および(3)実行者による本組成物の操作の容易さを改良すること、例えば、これらには限定されないが、注射可能な組成物の性質または手術による移植の操作性を改良すること。本細胞組成物と薬学的に許容される担体との組み合わせによって形成された薬学的な組成物が注射溶液等で様々な濃度にされて投与される。薬学的な担体は、必要であれば、結合体、賦形剤等のような付加的な組成物を含んでもよい。水溶液は、必要であれば適度に緩衝化され、かつ希釈液は、最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張させるのが好ましい。このような水溶液は、静脈内、筋肉内および腹腔内注射に適している。使用される無菌の水媒体は、当業者によく知られた一般的な技術で得ることができる。
8.卵巣由来の生殖系列組織および/または細胞の再移植
卵巣の生殖系列幹細胞は、化学または放射線治療の前に患者から単離され、生体外で数が増やされ、患者が生殖能力を取り戻すことを希望するまで凍結維持される。ヒトの卵巣から単離された細胞は、細針を用いて卵巣表面上皮に直接移植されるか、細胞はフィブリン塊に集められるかである。フィブリン塊は、患者自身の血液から調製され、移植処理の間、細胞の生存能力および生存を支持する。フィブリン塊は、患者に移植され、卵嚢下に接合される。
1つの実施の形態では、悪性腫瘍の患者における卵巣細胞の移植において、生殖細胞は、陽性‐陰性選択法を用いて悪性腫瘍の細胞と分けられる。しかし、悪性腫瘍でない患者には、卵巣表面上皮(OSE)の移植がより実用的である。組織収集におけるOSEは、外科用メスを用いて、残された卵巣組織から直径1mmで0.5cm×0.5cmの切片に切り取られる。これら切片は、ガラス化法を用いて凍結され、患者が生殖能力の回復を必要とするまで凍結維持される。必要とされたとき、OSE切片は、解凍され、より大きな切片を形成するために縫合され、不妊の卵巣表面に移植される。
さらに、異なる発生段階の卵巣の卵胞は、凍結され、患者に再移植されるか、成熟卵胞への生体外培養のために用いられる。そして、これら卵胞由来の卵母細胞は、ICSI(卵細胞質内精子注入法)または他の補助的な生殖技術によって受精される。卵巣の生殖系列幹細胞の移植は、永続的な生殖能力の回復である。
9.卵巣由来の生殖系列幹細胞の宿主外成熟
ヒトの卵巣から単離された女性の生殖系列幹細胞は、超低粘着性の培養皿での成長因子およびβ‐メルカプトエタノールなしの凝集、それに続く成長ホルモン存在下のアルギン酸ナトリウムまたはフィブリン塊での3次元培養を経て原始卵胞に分化する。さらに生殖細胞の成熟卵子への成長を支持するために、これらの細胞は、思春期前の年齢のドナー由来の未成熟な顆粒膜細胞とともに凝集される。この方法は、初期の卵母細胞が受精可能なメタフェーズIIの卵母細胞に成長させる。顆粒膜細胞の単離のために、思春期前のヒトの卵巣由来の卵巣が切り出され、顆粒膜細胞は、2段階の粘着性の違いを利用する方法によって生殖細胞から分離される。この方法は、悪性腫瘍の患者に適用され、悪性腫瘍の細胞が取り除かれた改変卵胞が患者の卵巣に移植されて、さらに成熟化と卵胞の成長を可能にする。また、これらの卵胞は生体外で成熟されてもよい。患者から単離された卵巣の卵胞は、凍結され、その次に、このプロトコールに従う。生体外での受精か、受精のためのICSIおよび次に続く胚発生かのいずれかの場合で、これらの卵胞由来のMIIの卵母細胞が用いられる。
10.精巣由来の生殖系列幹細胞の宿主外成熟
患者精巣への生殖系列幹細胞の再移植が実行可能でない場合(例えば、悪性腫瘍、精巣捻転、停留精巣)、または生殖細胞の成長が精巣支持細胞の障害のせいで損なわれた場合(成熟停止)、精巣の生殖系列幹細胞は、代理動物または生体外でさらに進んだ段階まで分化され、ICSIまたは他の補助的な生殖技術で用いられる。1つの実施の形態では、精原幹細胞(SSC)が、生殖細胞のさらなる成長を支持できる環境を創り出すために、適切な支持細胞および精細管細胞外マトリクス(ECM)と混合される。
思春期前の患者で、完全ではないが精子形成がすでに始まった場合、すでに減数分裂に入った部分的に成熟した生殖細胞(一次および二次精母細胞)が蓄えられ、円形または細長い精子細胞へのさらなる分化のために用いられる。そして、精子細胞はICSIのために用いられ、受精およびそれに続く胚発生を可能とする。
本明細書で開示されるのは、未成熟な生殖系列細胞を宿主外で半数体の配偶子に分化させる方法であって、細胞が生体内で成熟する条件を模擬する条件下で未成熟な生殖系列細胞を生体外で培養することによる。ここで、培養が機能的な精子または卵子への生殖系列細胞の成熟をもたらす。
未成熟な生殖系列細胞は、思春期前の哺乳類動物または生殖系列細胞の通常の成熟を妨げる状態にある哺乳類動物から得る。開示された方法は、これらには限定されないが、ヒト、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、犬、猫のような家畜動物を含むあらゆる動物に適用するのに適している。
精巣の生殖系列細胞の宿主外成熟において、本明細書で開示される人工の精細管が殺菌されるあらゆる生体適合性チューブで製造される。他の実施の形態では、チューブの内径が約150μmから約400μm、または約200μmから約350μm、あるいは約250μmから約300μmである。チューブ内部の表面は、細胞外基質で被覆されており、精細管の環境を模擬している。1つの実施の形態では、細胞外基質は、精巣の細胞外基質である。細胞外基質は、生殖系列幹細胞のドナーまたは他の個体から単離される。
精巣の生殖系列細胞は、培養培地中の人工の精細菅中で培養される。培養培地は、例えばPM‐1(商標)培地(米国特許出願公開第2007/0020759号明細書参照)である。また、培地は、DMEM、F12等、またはこれらを組み合わせたものを含む。培地は、成長及び成熟因子を添加され、それは、これらには限定されないが、グリア細胞株由来成長因子、線維芽細胞増殖因子、白血病抑制因子および上皮細胞増殖因子、成長ホルモン、卵胞刺激ホルモン、幹細胞因子レチノイン酸、およびこれらを組み合わせたものを含む。
精巣の生殖系列細胞は、成熟した精子が人工の精細管内に形態的に観察されるまで培養され、次に、収集され、生体外での受精を介する卵子の受精、卵細胞質内精子注入法、または膣内のもしくは子宮内受精のいずれかに用いられる。
卵巣の生殖系列細胞の宿主外での成熟において、卵巣の生殖系列細胞は、本明細書で開示されるあらゆる培養培地内で顆粒膜細胞の存在下で培養される。さらに、成熟した細胞は、生体外での受精、卵細胞質内精子注入法で用いられ、あるいはドナーの卵巣に移植される。
実施例
以下の実施例は、1つまたは複数の実施の形態を説明するために示されるが、以下の記載に限定されない。
以下の実施例は、1つまたは複数の実施の形態を説明するために示されるが、以下の記載に限定されない。
実施例1
雄マウスの生殖系列幹細胞の異なる集団の単離
生殖系列幹細胞の純粋な集団が生殖細胞のOct‐4‐GFP選別によって単離された。次に、Oct‐4+生殖細胞は、c‐Kit受容体分子の発現に基づいて細分される。c‐Kit、チロシンキナーゼ受容体およびそのリガンドである幹細胞因子(SCF;Kitリガンドまたは造血幹細胞因子としても知られる)は、PGCの成長および生存の鍵となる調節因子である。c‐Kitは、PGCの初期の分離から生殖隆起における出現までPGCで発現する。出生後のマウスの精巣では、c‐Kitは、未分化の、および分化しているA型の精原細胞の分化に関するマーカーとして用いられる。Oct‐4およびc‐Kitの組み合わせは、生殖系列幹細胞の2つの異なる集団の単離を可能にする:一方は、ほとんど未発達な生殖細胞または生殖系列前駆細胞(Oct‐4+/Kit+)を含み、他方は、SSCになり(Oct‐4+/c‐Kit−)、かつ不妊の精巣を再生する能力を備える生殖系列幹細胞を含む。これらの細胞の分子および表現型の特性は、培養前および培養後の両方で解析され、成長因子の混合物を含む、決められた培養条件下において多分化能の細胞株を発生させる能力が比較された。加えて、これらの分集団および受容個体の精巣を再配置するこれらの派生したmGC系列の機能性が、精原幹細胞移植技術を用いて評価された。
雄マウスの生殖系列幹細胞の異なる集団の単離
生殖系列幹細胞の純粋な集団が生殖細胞のOct‐4‐GFP選別によって単離された。次に、Oct‐4+生殖細胞は、c‐Kit受容体分子の発現に基づいて細分される。c‐Kit、チロシンキナーゼ受容体およびそのリガンドである幹細胞因子(SCF;Kitリガンドまたは造血幹細胞因子としても知られる)は、PGCの成長および生存の鍵となる調節因子である。c‐Kitは、PGCの初期の分離から生殖隆起における出現までPGCで発現する。出生後のマウスの精巣では、c‐Kitは、未分化の、および分化しているA型の精原細胞の分化に関するマーカーとして用いられる。Oct‐4およびc‐Kitの組み合わせは、生殖系列幹細胞の2つの異なる集団の単離を可能にする:一方は、ほとんど未発達な生殖細胞または生殖系列前駆細胞(Oct‐4+/Kit+)を含み、他方は、SSCになり(Oct‐4+/c‐Kit−)、かつ不妊の精巣を再生する能力を備える生殖系列幹細胞を含む。これらの細胞の分子および表現型の特性は、培養前および培養後の両方で解析され、成長因子の混合物を含む、決められた培養条件下において多分化能の細胞株を発生させる能力が比較された。加えて、これらの分集団および受容個体の精巣を再配置するこれらの派生したmGC系列の機能性が、精原幹細胞移植技術を用いて評価された。
雄の生殖系列幹細胞(GSC)は、SSCの自己再生による精子形成および分化に関係する精原細胞の発生を維持する。いくつかの生体外の条件では、新生児および成体両方のマウスの精巣由来のGSCは、多分化能の生殖細胞(mGC)系列を発生できると報告されており、ESCに似た特性および分化能を有する。しかし、異なる研究室で産生されたmGCは、異なる生殖細胞の特性;例えば、一部はそれらSSCの性質を保持し、一部はそれを完全に失っている、を示した。従って、派生した多分化能の生殖細胞株が、マウスの精巣内にある生殖系列幹細胞の異なる分集団由来であるという可能性が残されている。この疑問を調べるために、生殖細胞特異的なOct‐4プロモータの制御下でGFPを発現する遺伝子操作マウスモデルを用いた。転写因子Oct‐4およびc‐Kit受容体の発現に関して、生殖系列幹細胞において2つの異なる集団がみられた。マウスの生殖系列幹細胞のOct‐4+/c‐Kit+の小集団のみが、新生児または成体のどちらかから単離され、成長因子の複合混合物で培養された場合に、細胞株を産生し、該細胞株は多能性ESマーカー、例えば、Oct‐4、Nanog、Sox2、Rex‐1、Dppa‐5、SSEA‐1、アルカリホスファターゼ、提示される高いテロメラーゼ活性および誘導分化プロトコールによって拍動する心筋細胞、神経細胞ならびに軟骨細胞を含む複数の系統への分化等を示す。このデータは、いくつかの多能性特性を有する多分化能の細胞株を産生できる生殖系列前駆細胞のみに由来する生殖系列幹細胞内に異なる集団があることを明示する。
生殖系列細胞の濃縮に関して、新生児および成体両方の精巣組織が、生殖細胞ではなく体細胞を除く異なる接着のために、ゼラチンで被覆された培養皿で2時間培養された。接着の違いによって、GFP陽性細胞(新生児で4‐10%、成体で0.01‐0.05%)の懸濁液が回収された(図1A‐C)。GFPとc‐Kitの発現の間に相関があった(図1F‐1H)。
収集された新生児の生殖細胞が、上述のように培養皿で成長因子の混合物を含む幹細胞培養培地で培養された。初期のGFPシグナル(図2A)は、培養数日後に消失した(図2B)。その後、細胞は異なる形態変化を受け、鎖状のコロニーを形成し、GFPシグナルなしで成長を続けた(図2C‐2D)。コロニー内のGFP陽性細胞の発生によって示唆されるOct‐4の上方調節が培養の3‐4週間後に現れた(図2F)。培養の2‐4週間後、GFP陽性コロニーが15%FBSを添加した同じ培養培地で、マイトマイシンCで処理したマウス胚線維芽細胞支持細胞層(MEF)を含む培養培地に機械的に移された。3‐4回の継代後に、新しいMEF培地への移動を介して、コロニーが確立され、さらなる増殖および/または液体窒素での保管のために、培養皿から酵素的に(1mg/mlのコラゲナーゼ、5‐10分間)剥がされた。成体マウスからの細胞株の派生のために、接着の違いで収集されたGFP+細胞は、フローサイトメトリーで選別され、MEFで直接培養された。OG2またはOG2‐lacZマウスを用いて、19の細胞株(10の新生児および9の成体)が産生された。全ての細胞株は、GFP(14株)またはGFP‐lacZ(5株)のどちらかを発現した(図2G‐2I)。
さらに、mGC株が新生児の野生型CD‐1マウスで産生されたことは、当該方法が遺伝子操作OG2マウスに限定されないことを示唆している。選択された細胞株は、凍結され/解凍され、およそ72時間(手動の細胞計数およびGFP選別両方を用いて)の細胞倍加時間で40継代を超えて増殖された(図3)。培養中の異なる時点で(図3Aが2日目、図3Bが5日目、図3Cが9日目、図3Dが15日目)、GFP+細胞の個数がFACSで解析された(図3E)。
c‐Kit+/GFP+細胞がフローサイトメトリーによってc‐Kit−/GFP+細胞から分離され、MEF支持層で培養された。c‐Kit+の集団だけがmGCのコロニーを形成し、c‐Kit−のプールから細胞株は産生されなかった。この研究で用いられた成長因子のうち、GDNFを除去するとコロニーが小さくなるのは、mGCの自己再生におけるGDNFの役割を示唆する。これに対し、FGF2を除去するとコロニーが分化することは、未分化段階のmGCの維持におけるFGF2の果たし得る役割を示唆している。LIFまたはEGFを除去することは、mGCの増殖または分化に影響しなかった。
mGCのコロニーにおける細胞のほとんどは、Oct‐4(図4A‐4D)、Nanog(図4F‐4H)、VASA(図4I‐4L)およびSSEA‐1(図4M‐4O)を発現した。また、それらは、Stella、Dazl、VasaおよびcRatを含む生殖系列特異的マーカーとともに、多能性遺伝子Sox‐2、DDPa5、Rex‐1、eRasおよびCriptoを発現した(図4Q)。加えて、Oct‐4、NanogおよびSox2の発現は、ウェスタンブロット解析で確認された(図4P)。
20回継代したマウスの細胞株は、高いテロメラーゼ活性(図5A、ESCに類似)および正常核型(40、XY)(図5B)を示した。
また、mGCの広範囲における遺伝子の発現および刷り込みパターンが培養前後に解析され、ESCのそれと比較された。興味深いことに、培養条件は、実験された全てのDMR(特異的なメチル化領域)におけるmGCでの刷り込みパターンを変化させなかった。部分的なアンドロゲンの刷り込みのみを示したマウスのESCとは対照的に、mGCは100%のアンドロゲンの刷り込みを明示した(図6)。多少驚くべきことに、マイクロアレイ解析は、mGCの広範囲における遺伝子発現パターンが培養前後で87%の類似性を有することを示した。
mGCが胚様体(EB)を形成するために凝集したとき、原腸胚形成が9‐15日で観察された(図7A)。EBにおける細胞は、E‐カドヘリンおよびラミニン1(極性上皮のマーカー、図7B‐7C)、Zic1、PAX6およびSox1(初期の外胚葉マーカー、図7Dと7F)、GATA4およびFoxA2(初期の内胚葉マーカー、図7E‐7F)、ならびにBrachyury、BMP4およびCOL2A1(初期の中胚葉マーカー、図7F)を含む初期の発生マーカーを発現した。培養では、mGCのコロニーは、自発的に心筋細胞(図7G‐7J)、脂肪細胞(図7K)および神経細胞(図7Lおよび7M)のマーカーを発現している表現型に分化した。心筋細胞に自発的に分化した細胞の一部は、3日まで律動収縮を示した。分化誘導のプロトコールを用いた場合、mGC株は、神経前駆細胞(nestin、neuro1)、ニューロン(MAP2、NF‐68、GAD67)およびグリア細胞(GFAP、MBP、A2B5、O4、NG2)に相当する神経細胞への分化のために誘導されたことが図8A‐8Gおよび8Jに示された。また、それらは、心筋細胞(トロポニン1、心臓のミオシン、デスミン、Nkx2.5、GATA4、図8Iおよび8L)または軟骨細胞(コラーゲンXa1、およびアルシアンブルーによる染色、図8Hおよび8K)の形成のために誘導された。
mGCに関する別の分化実験では、培養された7つのコロニーにおける神経マーカーの染色があるものとないものについて核の数が計数され、平均の割合は、GFPA+細胞で17.6%、Tuj‐1+細胞で2.5%およびMAP‐2+細胞で2.3%と推定された。一般に、これらのプロトコールで誘導される分化の有効性は、mGCと比較してES細胞でずっと高かった。
移植後4週では、対照動物の精巣もOct‐4+/c‐Kit+細胞を与えられた精巣も精細管の大部分で精子形成が見られなかった。しかし、新鮮分離されたOct‐4+/c‐Kit−の精巣細胞を与えられたマウスの80%が精巣のいたるところである程度の精子形成を示したことは、細胞懸濁液内の機能性SSCの存在を示唆している。生殖系列幹細胞におけるc‐Kit−分集団のみが受容個体の精巣に定着した。培養前後の生殖系列幹細胞の移植に続く精巣の再生が図9M‐9Rおよび表1に示された。免疫不全マウスの正常な精巣の横断面が図9Mに示された。ブスルファン処理の1ヶ月後、精細管の大部分が内因性の精子形成を激減させた(図9N)。Oct‐4+/c‐Kit−細胞を移植されたマウスの精細管の73%がある程度の精子形成を示したが(図9O)、Oct‐4+/c‐Kit−細胞を与えられたマウスの管横断面の大部分は、空だった(図9P)。Oct‐4+/c‐Kit−細胞の移植直後のCSFEで標識された陽性コロニーが図9Rに示されている。mGCを移植された受容個体マウスの精巣内における精細管の大部分での精子形成がみられなかったことは、これらの細胞がSSC特性を有していないことを示唆している(図9Q)。
奇形腫については、同数のマウスESC(陽性対照として)またはOct‐4‐GFP/LacZのmGCが、別のヌードマウス群の皮膚、筋肉および精巣に注射された(1×106細胞/部位)。3つの組織タイプの全てで、ESCを与えられた全ての受容個体マウス(6/6)が奇形腫を生じた。これに対し、mGCを与えられたマウスは(0/20)、奇形腫を生じなかった(図9A‐9F)。移植後6週間で、Oct‐4‐GFP/LacZ細胞は、皮膚、筋肉および精巣組織にみられた(図9G‐9I)。これらのデータは、ESCではなく、mGCが非腫瘍形成性であることを示している。
キメラ形成が、培養したOct‐4‐GFP/LacZ細胞を、CD‐1マウスの8細胞期の胚および未分化胚芽細胞に注射することよって評価された。図10A‐10Dに示すように、Oct‐4‐GFP/LacZ細胞がマウス未分化胚芽細胞の内細胞塊に取り込まれた。擬似的に妊娠したマウスの子宮に、胚が移された(移した119の胚から合計45の胎児)。12.5dpc(性交後の日数)で、LacZに対する胚全体の染色(βガラクトシダーゼ活性)が眼、脳、手足において異なるパターンを示した(図10E)。LacZ染色の強度は、マウスES細胞を与えられたキメラ胚でのほうが、多分化能の生殖細胞株を注射されたそれらよりもずっと大きかった。また、キメラ細胞の分布は、脳、心臓、生殖隆起および肝臓の組織切片にも示された(図10L‐10O)。強度およびLacZ+細胞の数は、LacZ‐ES細胞を注射されたキメラ胚のほうが、LacZ‐GS細胞を注射されたそれらよりもずっと大きかった。Oct‐4‐GFP/LacZキメラ組織の確認は、外胚葉性(脳)、中胚葉性(心臓)、内胚葉(肝臓)およびキメラの子の精巣にGFPのDNA配列が存在し(図10P)、かつ4つの組織全てにLacZのDNAが存在する(図10Q)ことで裏付けられた。これらを組み合わせた結果は、培養されたmGCは、ある程度の多能性特性を伴う非催奇形性の幹細胞であることを明らかに示している。
多分化能の生殖細胞系列は、成長因子の再プログラミングなしで成体マウスの精巣から発生し、;このことは、成体の精巣内に多能性特性を有する細胞の分集団がある可能性を示唆している。
一方、上述のように、出生後のマウスの生殖系列幹細胞由来の生殖系列性細胞および生殖系列前駆細胞は、全てではないが、ESCの多能性特性の一部を備えて生成した。特に注目すべきは、これら細胞株タイプ両方は、他の研究室によって樹立された多分化能の生殖細胞株と、多能性および奇形腫形成の程度の点でまったく異なることである。マイクロアレイ解析によれば、マウスのOct‐4+/c‐Kit+の生殖系列細胞株は、ESCよりも1000倍および5000倍低いレベルではあるが、多能性遺伝子のNanogおよびcryptoを発現した。同様に、生殖系列細胞株は、これらに限られないが、p53、Eras、Bak、Int‐2およびc‐mycを含む癌遺伝子を発現するが、その発現レベルは、ES細胞よりも数倍低い。特に、生殖細胞株は、移植されても生体内で奇形腫を形成しなかったが、それらは、限られたキメラ細胞の集団をマウスの胚で形成した。
いくつかの証拠は、Oct‐4+/c‐Kit+の生殖系列前駆細胞が生殖細胞の特性を保持し、その結果、ESCおよび従来報告されている他の精巣細胞とは異なるという概念を裏付ける。すなわち、1)派生した生殖系列前駆細胞は、約72時間で細胞数が2倍になる細胞周期であり(GFP選別および手作業の計数)、かつこの細胞周期は、生殖系列幹細胞のそれに類似し、かつESCのそれより約3倍長い;2)アレイでの広範囲における遺伝子発現解析に基づいて、本生殖系列前駆細胞は、ESC又は他の多分化能の生殖細胞株と異なる分子特性を備えると思われる。遺伝子を検討したところ、本生殖系列前駆細胞株は、生殖系列特異的遺伝子(Vasa、Plzf、GFR‐α1、Dazl)の顕著に高い発現レベルおよび多能性の遺伝子(Oct‐4、Nanog、Dppa‐5、Sox‐2、Crypto)の低い発現レベルを示した;3)これらの細胞株は、自己再生においてLIFまたはFGF2よりもGDNFにより依存的である。GDNFは、雄の生殖系列幹細胞の自己再生の鍵となる調節因子であると言われており、一方、LIFおよびFGF2は、ESCの自己再生において重要な役割を果たす;4)これらの細胞株におけるSSEA‐1の発現レベルは、報告されたように、マウスのES細胞または他の多分化能の生殖細胞株においてみられたレベルよりも低い。SSEA‐1がある動物モデル系での腫瘍浸潤および転移に関わることが示されたことは、より高い発現が腫瘍形成のより高い可能性を反映していることを示唆している;そして、5)多分化能のGCは、他の研究室で報告されたマウスESCまたは他のmGC株と異なるアンドロゲンの刷り込みパターンを示した。
生殖系列の祖先との全ての類似点にも関わらず、本生殖系列前駆細胞株は、移植後に精巣を再生しなかったことは、それらが生殖系列性細胞ではなかったことを示す。
遺伝子操作マウスモデルは、それらのOct‐4発現に基づいて新生児および成体の精巣両方からの生殖系列細胞の単離を可能にした。生殖系列幹細胞は、次の所見を伴うc‐Kitの発現に従って2つの分集団にさらに分けられた:1)c‐Kit受容体分子をもつOct‐4‐GFP+細胞のみが培養に応答し、多分化能の生殖細胞株を生成した;および、2)c‐Kit−の分集団のみが精原細胞幹細胞の移植後に精巣を再生した。この結果は、生殖能力のある精巣内の少なくとも2つの異なる生殖系列幹細胞の小集団の存在を示唆する:(1)多分化能の生殖系列幹細胞になる能力を有するc‐Kit+プール、例えば生殖系列前駆細胞、および(2)c‐Kitの発現を欠いた、かつ精巣に定着する能力を獲得した生殖系列幹細胞の小集団、例えば生殖系列性細胞である。明らかに、成体組織で生殖器官内の生殖系列幹細胞が異なる発生段階のどこかに存在し、またはその代わり、それらが成長因子シグナルおよび/または転写因子に応答する様々な能力を有する。
材料および方法
精巣細胞の単離:新生児マウス(生後2‐5日)または成体マウスの精巣が無菌で体から取り出された。精巣の被膜が除去され、PBSに1mg/mLでコラゲナーゼ1Aおよび10ユニット/mLでデオキシリボヌクレアーゼを含む酵素用溶液に、精細管が懸濁された。精巣は、全ての管が分解されるまで水槽内で37℃で分解された。反応は、ウシ胎仔血清(FBS)で停止された。
精巣細胞の単離:新生児マウス(生後2‐5日)または成体マウスの精巣が無菌で体から取り出された。精巣の被膜が除去され、PBSに1mg/mLでコラゲナーゼ1Aおよび10ユニット/mLでデオキシリボヌクレアーゼを含む酵素用溶液に、精細管が懸濁された。精巣は、全ての管が分解されるまで水槽内で37℃で分解された。反応は、ウシ胎仔血清(FBS)で停止された。
マウス胚線維芽細胞(MEF)支持細胞層の調製:MEFは、12.5dpcのCD‐1マウスの胚を用いて、標準的な方法で作製した。胚は、トリプシン処理前に取り出され、解離した細胞は、プレートあたり約1.5個の胚となるプレート濃度で、150mmプレートにのせられた。初めにプレートにのせた後、MEFは、1:5に分配され、次に凍結された(継代1)。解凍されたMEF(P1)は、マイトマイシンC処理の前に増殖目的のために1回だけ継代された。MEF支持細胞層が50‐60×103/cm2の密度でプレートにのせられた。新しいMEF支持細胞層が7‐10日ごとに多能性の生殖細胞の培養のために用いられた。全ての動物実験は、実験動物の管理および使用のためのガイドライン(米国学術研究会議)に従った。
テロメラーゼ活性および染色体分析の評価:テロメラーゼ活性を決定するために、細胞抽出物が生殖細胞株(10継代かそれより多くの継代)から単離され、Oct‐4+c‐Kit+で選別された細胞およびOct‐4+/c‐Kit−で選別された細胞を150U/mlでリボヌクレアーゼを含むCHAPS溶解緩衝液を用いて新鮮分離した。細胞溶解物は、12000×g、4℃で20分間遠心分離され、上清が−80℃で保管された。タンパク質の濃度は、BSAを用いたブラッドフォード試薬を標準として評価された。テロメラーゼ活性は、TRAPEZE検出キット(ケミコン社)を用いたPCRに基づく評価で検出された。750μg/μlの細胞抽出物2μlが、TRAP反応緩衝液、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、基質オリゴヌクレオチド、テロメラーゼプライマー、内部標準プライマーおよびTaqポリメラーゼを含むPCR混合物に総容量で50μlになるように加えられた。陽性対照として、2μlのmESC細胞抽出物が反応混合物に加えられ、CHAPS溶解緩衝液単独および加熱不活性化したテロメラーゼが各実験試料に対する陰性対照として用いられた。各試料は、テロメラーゼの拡張のため、30℃で30分間保温され、PCR増幅が行われた。染色体分析では、増殖細胞が0.1μg/mlのKaryoMAX Colcemid(インビトロジェン社)の培養液中で3‐4時間保温され、増殖細胞が低張溶液(0.075MのKCL)に再懸濁され、室温で10分間保温された。次に、細胞は冷却した固定剤(メタノール:酢酸が3:1)に再懸濁され、少なくとも30分間、4℃で保管された。固定剤での洗浄に続いて、細胞は、清潔なガラススライドにのせられ、空気乾燥された。分裂中期の染色体が調製され、アプライド・スペクトル画像解析バンドビュー・デジタル画像システムを用いて核型が作成された。
生体外での分化:胚様体(EB)を生成するために、mGSCのコロニーがコラゲナーゼで分解され、15%FBSを含むPM(商標)培地(2006年7月17日に出願され同時係属している米国特許出願第11/488,362号明細書に開示されており、その全体をここで参照することで本願明細書に援用される)の入った非接着培養プレートにおかれた。一部の実験では、EBは、懸滴で形成された。3つの胚葉である細胞への分化において、マーカー決定のために3日おきに試料が取り出されながら、EBが15日間培養された。分化を誘導するために、EBは、4日間PM培地で培養されてから、それらは、系統選択のために無血清のN1倍地で培養された:例えば、ITS(10mg/lのインシュリン;5.5mg/lのトランスフェリン;0.67mg/lのセレンニウム)とフィブロネクチン(50μg/ml)とを添加したDMEM/F12(インビトロジェン社)。5‐7日後、N1処理された細胞集合体が、神経前駆細胞の増殖のためにN2倍地の入ったゼラチンで被覆された培養プレートに移された(フィブロネクチンを含まず、10ng/mlのbFGFを加えたITSを含むN1倍地)。心筋細胞への分化のために、EBが各種心原性化合物の存在下で2週間培養され、該化合物は、0.06MのDMSO、5mMの5’‐アザ‐2’‐デオキシシチジン(AZA)および25‐50μMのカルディオジェノール‐Cを含む。分化の過程で、細胞の形態が解析され、RT‐PCRによる遺伝子発現解析および免疫組織化学染色のために試料が採取された。mGSCの軟骨細胞への分化は、10ng/mlのTGF‐3βおよび20%のFBSを添加した軟骨形成誘導の培地(軟骨誘導性SingleQuots、キャンブレックス社)を加えることによって誘導された。
免疫細胞化学的(ICC)および免疫組織化学的(IHC)染色:培養細胞が、4%のパラホルムアルデヒドで10‐30分間、室温で固定され、4℃でPBSに保管された。蛍光免疫細胞化学のために、1×Cytoperm‐PBSまたは0.2%のTriton X‐100で15分間、細胞が透過処理され、続いて2%(w/v)のウシ血清アルブミン(BSA)、2%(v/v)の標準ヤギ血清(GS)/1×Cytoperm‐PBSで30‐60分間、どちらも室温で保温された。1次抗体は、最適な濃度で2%BSA、2%ヤギ血清/1×Cytoperm‐PBSで希釈され、かつ4℃で3時間反応させたか、またはブロッキング緩衝液で希釈され4℃に一晩置かれた。2回洗浄後、蛍光2次抗体が、適宜2%BSA/2%ヤギ血清/1×Cytoperm‐PBSで希釈され、4℃の暗室で1時間反応させられた。細胞は、PBSで2回洗浄され、顕微鏡解析までホイルで包まれて4℃に保管された。画像は、オリンパスIX71顕微鏡またはデジタル画像装置およびソフトウェアを備えるツァイスLSM510共焦点顕微鏡を用いて記録された。
明視野の免疫細胞化学のために、細胞は、1×PBSで1回洗浄された。内在性ペルオキシダーゼ活性が3%(v/v)H2O2で15分間ブロックされ、続いて透過処理、2%BSA/2%GS/1%Cytoperm‐PBSで30分間のブロッキングが行われた。1次抗体は、適宜2%BSA/2%GS/1×Cytoperm‐PBSで希釈され、4℃で3時間反応させられた。残りの染色は、ABC染色キットを用いて製造者のマニュアルに従って完了された。可視化は、精製水に溶かしたジアミノベンジジン(DAB)基質剤および5‐10分間の反応で強調された。陰性対照には、1次抗体を加えなかった。
フローサイトメトリー:SSEA‐1およびc‐Kitを含む特異的抗体は、Influx Cell Sorter(サイトピア社)でフローサイトメトリー解析のために最適化された。c‐Kit選別のために、Oct‐4‐GFP構成を含む新鮮分離された精巣細胞が抗CD117APC(BDバイオサイエンス社)で染色された。いくつかの実験のために新鮮な生殖細胞のコロニーが分離され、細胞が抗SSEA‐1抗体で、続いて、PE‐Cy7と結合したヤギ抗マウスIgMで染色された。
遺伝子発現、刷り込み解析およびGFP増幅:全RNAはRNeasy Mini Kit(キアジェン社)を用いて単離され、RNAがRT‐PCR、定量PCRまたはマイクロアレイ解析に用いられた。RT‐PCRのために、cDNAがSensiscript RT Kitで合成され、PCRがHotStarTaq DNAポリメラーゼで実行された。全てのPCR反応は、酵素を活性化させるために、95℃で15分間の最初の反応で始めた。これに続いて95℃で15秒間の35サイクル、適切なアニーリング温度で1分間、そして72℃で1分間、さらに最後の反応のために72℃で10分間の1サイクルが続けられた。反応は、iCycler(商標) Thermal Cycler(バイオラッド社)を用いて行った。RT‐PCRの手順は、Oct‐4、Nanog、Rex‐1、Dppa5、Dazl、βアクチン、Nkx2.5、ネスチン、Mab2およびGFAPを含む特有のプライマーを用いて行った。内部対照に関しては、GADPHが細胞試料に対するハウスキーピング遺伝子として用いられ、βアクチンまたはインターロイキン‐2(IL‐2)がマウス胚で用いられた。
mGSCおよびmESCにおける刷り込みパターンがPCRに基づく解析で決定された。二亜硫酸塩処理したDNA由来の各ジメチル化領域(DMR)のPCR増幅が個別のプライマーによって実行された。刷り込まれた遺伝子の解析のためにUVP画像ソフトウェアがバンド強度の定量化に用いられた。GFPおよびLacZ増幅のために、キメラ胚由来の個々の組織が分離によって慎重に収集され、小片に細分化され、製造者のプロトコールに従ってDNAの単離と精製のためにDNA抽出緩衝液(DNeasy kit)に入れられた。
精原幹細胞の移植:精子形成の再生に関するmGCの機能性を調べるために、精原幹細胞移植が用いられた。26‐28週齢の免疫不全ヌードマウス(Harlan)がブスルファン(40mg/kg)で処理され、受容個体として用いられた。ブスルファン処理から1ヶ月後、2×105細胞が精巣網注射を介して精細管に移植された。4匹のマウスがmGC(GFP選別細胞)を与えられた。他の4匹のマウスは新鮮分離されたGFP+選別細胞を注射された。4匹のマウスは、新鮮分離されたGFP+/c‐Kit+選別細胞を移植され、そして、4匹のマウスは、新鮮分離されたGFP+/c‐Kit−選別細胞を移植された。残りの4匹のマウスは、偽対照とし、注射されなかった。移植の1ヵ月後、動物は安楽死させられ、精巣が収集され、組織学的な評価に用いられた。移植の有効性を評価するために、精子形成を伴う管横断面の総数が計数された。
奇形腫およびキメラ形成に関する精巣:奇形腫またはキメラを形成するmGCの能力を調べるために、OG2マウス(ジャクソン研究所)がRosa 26マウス(ジャクソン研究所)と交配され、新型(OG2‐R26)が作製された。これらのマウスは、生殖細胞にGFPおよびLacZ両方の構成を有している。培養は、上記のように行われ、新しいOct‐4‐GFP/LacZ生殖細胞株が奇形腫およびキメラ形成の試験のために作製された。マウスのOct‐4‐GFP/LacZのmGSCは、ヌードマウスの皮下、筋肉内、または精細管への注射により、生体内で奇形腫を形成する能力について評価された。奇形腫形成における陽性対照として、ES細胞が一部のマウスに注射された。皮下、筋肉内、または精細管への注射では、約1×106細胞が注射された。マウスが6週間後に安楽死させられ、精巣が形態および組織学的な解析のために収集された。
マウスのOct‐4+/GFP+/LacZ GSCのキメラ細胞集団を形成する能力が宿主の未分化胚芽細胞に注射された後に、つまり桑実胚期の胚もしくは8細胞期の胚の凝集により決定された。15‐20個の未分化胚芽細胞の注射がCD‐1マウスから得られた3.5日目の未分化胚芽細胞を用いて行われた。注射後、未分化胚芽細胞は、2.5日目の偽妊娠したCD‐1の雌に移され(子宮の各突起に7‐8個の未分化胚芽細胞)、該雌は事前に精管切除された雄と交尾させておいた。lacZ細胞の取り込みは、β‐ガラクトシダーゼ染色キット(シグマ社)によって、12.5dpcのキメラ胚の異なる領域で検討された。加えて、lacZおよびGFPのPCRが、Oct‐4‐GFP/LacZ細胞から形成されたキメラ胚の脳、心臓、肝臓および生殖隆起から単離されたDNAに対して行われた。
実施例2
霊長類の生殖系列幹細胞の単離、同定および特徴付け
休眠および活性化した分裂している生殖系列細胞は、マウスの精巣における2つの別々の細胞集団として存在するから(実施例1)、成体の霊長類の精巣にこれら2つの細胞集団が存在する可能性が調べられた。
霊長類の生殖系列幹細胞の単離、同定および特徴付け
休眠および活性化した分裂している生殖系列細胞は、マウスの精巣における2つの別々の細胞集団として存在するから(実施例1)、成体の霊長類の精巣にこれら2つの細胞集団が存在する可能性が調べられた。
精子形成は、未分化の生殖細胞において高度に調節された過程であって、精原幹細胞(SSC)分裂および精子を産生するための成熟に分類される。げっ歯類においてAs(Asignal)精原細胞は、自己再生および分化のどちらも可能なので、精子形成に関与する常在幹細胞であると考えられている。げっ歯類とは違って、霊長類およびヒト細胞の組織学的な研究は、精巣の精細管上皮の基底膜内に内在する核染色の異なる2つの別個のタイプ、例えばAdarkおよびApale精原細胞とされるものを示した。
以下には、マーカーおよび霊長類の精巣における生殖系列幹細胞の十分な精製のための単離方法が記載されている。
アカゲザルの精巣が霊長類の生殖系列幹細胞の特徴付けに用いられた。免疫組織化学的な検討で、表面マーカーおよび蛍光活性化細胞の選別が、成体のアカゲザルの精巣由来の生殖系列幹細胞を同定すること、特徴付けることおよび十分に精製することに用いられた。各細胞集団における生殖系列幹細胞の存在は、テロメラーゼ、RT‐PCRおよび胚に特異的なマーカーであるVASAおよびSSCに特異的なマーカーGFR‐α1に対する免疫組織化学染色を用いて確認された。精原細胞の移植は、濃縮前後における細胞集団の機能的能力の決定に用いられた。
免疫組織化学的な方法は、霊長類の精巣の生殖系列幹細胞を同定し、特徴付けし、局在を特定するために用いられた。これらの研究では、細胞外マトリクス(ECM)α6‐インテグリン、SSEA‐4およびGFR‐α1に対する特異的抗体が霊長類の精巣の組織切片を明確に染色するために用いられた。
α6‐インテグリンに特異的な抗体は、精細管内の基底膜近傍に局在する細胞も精細管基底膜も染色した(図18)。平均13個のα6‐インテグリン+細胞が、各精細管染色横断面にみられた。精細管切片では、α6‐インテグリン+細胞の大部分がVASA+であったことは、それら生殖系列幹細胞の状態を裏付けている。定量的に、管横断面ごとのα6‐インテグリン+細胞は、GFR‐α1よりも多くあったうえ、共局在研究は、α6‐インテグリン+細胞の約60%がGFR‐α1+であったことを示した。霊長類の精巣に関してこれらを組み合わせた免疫組織化学研究は、精細管の基底膜近傍の細胞を明らかにし、該細胞は、α6‐インテグリンおよびSSEA‐4細胞表面マーカーの共局在を有し、かつ生殖細胞特異的マーカーであるVASAおよびSSC特異的マーカーであるGFR‐α1、例えば雄の生殖系列幹細胞で特異的に発現したマーカーを有する(図19)。
GFR‐α1細胞表面マーカーは、精細管の基底膜に局在する細胞で特異的に発現した。また、GFR‐α1+細胞の全ては、生殖細胞特異的マーカーのVASAに陽性だった。
SSEA‐4+細胞の全ては、成体霊長類の精細管の基底膜に局在し、かつそれら細胞は、VASA染色で陽性だった。SSEA‐4+細胞のほとんどは、α6‐インテグリン+だった。SSEA‐4およびGFR‐α1の顕著な共局在がみられることは、SSEA‐4が生殖系列幹細胞に対する重要な細胞表面マーカーであることを示している。霊長類の精巣の組織横断面での精細管の基底膜における約40%の精原細胞は、SSEA‐4を発現した。
c‐Kit+細胞は、霊長類の精巣にはほとんど見られなかった。管横断面では、c‐Kit染色が精細管の内腔に局在する細胞でのみ見られた。また、c‐Kit+細胞の全てがVASA+であったことは、それらが分化した生殖細胞だったことを示している。精細管の横断面における基底膜に局在する細胞では、c‐Kit染色が見られなかった。これらの知見は、霊長類における生殖系列幹細胞がc‐Kit−であることを示唆している。
Nanogは、霊長類の精巣で豊富に発現していた。Nanogは、核染色として現れ、精細管におけるほとんど全ての生殖細胞でVASAと共局在していた。Nanogの発現は、基底膜の局在する未分化の生殖細胞と比較して、精細管の内腔に局在する高度な生殖細胞でより強かった。NanogおよびGFR‐α1の共局在研究は、全ての生殖系列幹細胞がNanogの低い発現を示したことを明らかにした。
CD‐90抗体は、基底膜のみを染色し、精巣のいかなる細胞内構造も染色しなかった。
霊長類の精巣試料に対する免疫組織化学的な特性評価は、成体の霊長類の精巣内の生殖系列幹細胞がα6‐インテグリン、SSEA‐4およびGFR‐α1に対して陽性でc‐Kitに対して陰性であることを示した。
安楽死させた3‐7歳のアカゲザル由来の精巣が外科的に取り出され;ペニシリン/ストレプトマイシン(それぞれセルグロ社およびインビトロジェン社)を添加したPBSに入れられ、一晩のうちに氷上で輸送された。精巣嚢の外科的な取り出しの後、生体標本が組織学的および分子的解析のために取り出された。精細管組織の残りは、微細に細分化され、15分間、往復式の37℃の水槽内で、コラゲナーゼA(1mg/mL)(ロシュ社)およびデオキシリボヌクレアーゼ(10U/mL)(インビトロジェン社)で分解された。コラゲナーゼ分解の後、未分解の組織が単位重力で沈降され、上清の細胞が除かれた。さらに未分解の組織が、20分間、往復式の37℃の水槽に置かれたDMEM中で、1.5mg/mLのコラゲナーゼA、1.5mg/mLのヒアルロニダーゼ タイプV(シグマ社)、0.5mg/mLのトリプシン(ワーシントンバイオケミカル社)および10ユニット/mLのデオキシリボヌクレアーゼを含む酵素カクテルで分解された。分解されたおよび未分解の組織は、70μmのろ過器を通され、酵素を不活性化するためにFBS(ウシ胎仔血清;ハイクロン社)に入れられた。400×gで10分間遠心分離後、細胞沈殿物が10%FBSのDMEMに再懸濁され、5%二酸化炭素/95%空気の加湿培養器内で被覆された15cmの組織培養皿に入れられた。
フローサイトメトリーが、成体霊長類の精巣の生殖系列幹細胞に特異的な細胞表面マーカーを同定するために用いられた(図20)。非霊長類のSSCにおける他の研究者からの報告に反して、新鮮分離された成体霊長類の精巣細胞は、上皮細胞接着/活性化分子(EpCAM)を発現しなかった。しかし、生殖系列幹細胞は、GDNF受容体GFR‐α1の細胞表面における発現のおかげで、成体霊長類の全ての精巣細胞の集団のごくわずか一部、全ての単離された精巣細胞の1%未満として同定された。同様に、げっ歯類の精巣の生殖系列幹細胞での結果に反して(実施例1)、新鮮分離された成体霊長類の生殖系列幹細胞は、c‐Kitを発現しなかった。しかし、成体霊長類の生殖系列幹細胞は(単離された精巣細胞の集団の約2%)、Dolichos biflourusの凝集素(DBA)に結合する細胞表面糖質決定基、レクチンを発現した。さらに、成体霊長類の生殖系列幹細胞は、CD9、CD90およびCD49fという細胞表面マーカーを発現した(図21)。
霊長類の生殖系列幹細胞の単離に関して、二重陽性であるCD90+/CD49f+細胞を同定するために、c‐KitがCD90+とCD49f+とを両方ともプロットした陰性/親選別ウインドウに対して調べられた。生殖系列幹細胞の同定における二重陽性の細胞の選別は、成体霊長類の精巣の分離株における全ての細胞の約5.77%という結果であった。後のCD90+/CD49f+二重陽性の細胞は、さらなる使用のために収集された。追加の精製は、SSEA4に対して陽性のc‐Kit−細胞を選択することで行われ、成体霊長類の精巣における全ての細胞の約2%を構成する2番目の十分精製された細胞集団を同定できた。さらに追加の精製が、CD90、CD49fおよびSSEA4の全てに対して陽性だったc‐Kit−細胞を選択することで行われ、成体霊長類の精巣における全ての細胞の約1.47%を構成する3番目の十分精製された細胞集団を同定できた。
これらのフローサイトメトリーを組み合わせた解析は、成体霊長類の精巣から2つの異なる、次の特性を備える生殖系列幹細胞集団の同定および十分な精製をもたらした:つまり、(a)Thy‐1+およびα6‐インテグリン+細胞ならびに(b)GFR‐α1とVASAといった細胞表面マーカーを両方発現し、かつ高いテロメラーゼ活性を備え、50%を超える細胞がGFR‐α1およびVASAの両方に陽性の細胞である細胞集団であるSSEA‐4+細胞。
フローサイトメトリーおよび免疫組織化学染色をさらに拡張するために、新鮮分離された成体霊長類の精巣細胞が次のように選別された:(i)α6‐インテグリン+;(ii)CD‐90+;(iii)CD‐90+/α6‐インテグリン+/c‐Kit−(三重選別);および(iv)SSEA‐4+細胞。単離され、精製された、異なる精巣細胞の集団は、生殖細胞マーカーのVASAおよびSSCマーカーのGFR‐α1の存在について試験された(図22)。非選別の細胞は、約70%のVASA+細胞を含むが、それらの細胞の10%のみがGFR‐α1に対して陽性に染色された。α6‐インテグリンのみでの選別は、生殖系列およびSSCマーカー両方を備える細胞、例えばVASA+およびGFR‐α1+細胞が42.6%の集団の著しい増加をもたらした。また、CD‐90のみまたはc‐Kit−との組み合わせ(三重選別)での選別は、それぞれ30%および46.4%までVASA+/GFR‐α1+細胞を顕著に増加させた。SSEA‐4+単独での選別もまた、生殖系列およびSSCマーカーを発現する細胞の増加をもたらし、37.5%の細胞にあたる選別された細胞の集団がVASA+およびGFRα‐1+であった。
霊長類の精巣細胞の異なる集団における機能特性が、化学治療の薬剤ブスルファンで処理された免疫不全ヌードマウスの精巣における精細管の基底膜を再配置する能力の試験によって、十分な精製の前後に決定された。本試験では、96‐98週齢の無胸腺ヌード雄マウスがブスルファン(40mg/kg)で処理された。ブスルファン処理後1ヶ月で、2×105の成体霊長類の精巣細胞が精巣網への注射を介して精細管に移植された。これらの試験では、3匹のマウスが新鮮分離された非選別の細胞の移植を受け、;3匹のマウスが新鮮分離されたc‐Kit−/SSEA‐4+の選別された細胞の移植を受け、;そして、3匹のマウスが新鮮分離されたc‐Kit−/SSEA‐4−の選別された細胞の移植を受けた。
受容個体マウスの精巣において移植された霊長類の細胞をより確実に同定するために、生体染色色素カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシニミジルエステル(CSFE)が蛍光マーカーとして用いられた。CSFEは、酢酸基が細胞内のエステラーゼで開裂されるまで無色無蛍光の化合物であって、高い蛍光物質を産生する。後の蛍光物質は、よく保持され、アルデヒド固定剤で固定されたが、各細胞分裂において蛍光強度が急激に低下した。この生体染色のために、細胞が収集され、1%BSAを含む1×PBSで1回洗浄され、;次に1×PBSで1回洗浄され、;37℃で10分間、8μMのCSFEを含む1×PBSで反応させた。結果として得られた生体染色された細胞は、2%FBSを含むMEMα(インビトロジェン社)で洗浄され、;400×gで5分間の遠心分離で収集され、;培地に再懸濁され、計数された。
移植から2週間後、マウスが安楽死させられ、CSFE+細胞のコロニー数が、マウスの精巣の組織切片において顕微鏡下で決定された(図23)。理論上は、生殖系列幹細胞が約72時間の細胞周期をもつならば、移植後2週間で細胞が2‐3回の細胞倍化を行い、約4‐8個の細胞から構成されるコロニーを形成する。統計解析については、分散分析が適用され、p<0.05を有意とした。
これらを組み合わせた移植研究は、GFR‐α1およびVASAマーカーを発現する細胞を含むSSEA‐4+のみがブスルファン処理されたマウスの精巣を再配置する能力を備えていたことを示した(図24)。これらの知見は、これら細胞が原発性の生殖系列幹細胞であることを示す。
各細胞集団の細胞分裂の状態を調べるために、2つの集団のDNA含有量が、フローサイトメトリーを用いて測定された(図25)。この解析は、SSEA‐4+の細胞集団が細胞周期のG0‐G1期の細胞に類似する細胞内のDNA含有量であったことを示した。一方、Thy‐1およびα6‐インテグリンといった細胞表面マーカーを有する細胞は、2つの個別の異なるDNA含有量であって、細胞周期のG0‐G1期またはS期のどちらかに類似していた。このデータは、SSCの細胞表面マーカーを伴うSSWA‐4+細胞の集団が生殖系列幹細胞前駆体の休止している集団であり、一方、Thy‐1+およびα6‐インテグリン+細胞の集団が活発に分裂するSSCの集団であることを示す(図27)。
この結果は、成体霊長類の精巣内の生殖系列精原幹細胞がげっ歯類のSSCと類似するが区別できる分子および表現型の特性を有していることを明確に示す。様々な幹細胞、生殖細胞および精原幹細胞に特異的なマーカーを用いた免疫組織的な検討は、霊長類のGFR‐α1が精細管の基底膜の精原幹細胞の表面で特異的に発現することを明らかにした。GFR‐α1は、SSCの自己再生の重要な調節因子であるGDNFに対する受容体である。GFR‐α1+細胞がVASA+であることは、それらが幹細胞であることを示唆している。GFR‐α1とα6‐インテグリンとの共局在は、成体霊長類の精細管内に存在する細胞の80%であった。α6‐インテグリン+細胞を選択することで濃縮される細胞集団は、GFR‐α1との共局在をかなり高いレベルで示したことが、精巣切片における生殖系列幹細胞を同定するための免疫組織化学的な方法を用いたこの結果を支持する。霊長類のSSCにおけるα6‐インテグリンの発現は、マウス、マーモセットおよびヒトのSSCが細胞表面にこのマーカーを有しているため、このマーカーが当該種間で保存されていることを示唆している。管の外側の間質細胞にα6‐インテグリン+細胞がある程度局在していることは、このマーカー単独では、成体霊長類の精巣からSSCの高度に純粋な集団の単離に用いられないことを示す。
SSCは、全てではないがある程度、他の幹細胞、特に造血幹細胞と表現型および分子特性を共有する。種々の細胞表面マーカーを用いたフローサイトメトリーは、成体のアカゲザルの精巣に、α6‐インテグリンおよびThy‐1を発現する異なる細胞集団があり、霊長類の精巣における細胞のほとんどがc‐Kit−だったことを明らかにした。また、霊長類の精巣の免疫組織化学的染色が精細管の基底膜の全ての細胞がc‐Kit−であったことを示し、このことは、α6‐インテグリン+細胞がc‐Kit−であることを示唆している。α6‐インテグリンまたはThy‐1単独による選別は、免疫組織化学的染色、RT‐PCRおよびテロメラーゼ試験で示されたように、SSCのマーカーの濃縮をもたらした。興味深いことに、α6‐インテグリン+、Thy‐1+およびc‐Kit−細胞の選別は、定量的RT‐PCRで示されたように、SSCマーカーPLZFの最も高い発現レベル(図26A)および最も活性化されたテロメラーゼ活性(図26B)をもたらしたことは、これらのマーカーの組み合わせがSSCを数倍濃縮することを示唆している。さらに、霊長類の精巣におけるSSEA‐4+細胞の確実な集団も存在し、これらは、高レベルのテロメラーゼ活性と生殖およびSSCのマーカー両方の高いレベルの発現とを示した(図28)。
免疫組織化学的な染色は、SSEA‐4+細胞が精細管の基底膜にも存在し、α6‐インテグリンおよびGFR‐α1とよく共局在していることを示した。フローサイトメトリー解析は、成体霊長類の精巣に、5‐7%のα6‐インテグリン+、Thy‐1+、c‐Kit−で選別された細胞が存在する一方で、2‐3%のみのSSEA‐4+細胞が存在することを示した。また、これは、管横断面ごとにみられるα6‐インテグリン+細胞よりもSSEA‐4+細胞のほうが顕著に少ないことを示す精巣切片における免疫組織化学染色のデータとも一致する。また、これは、霊長類の精巣におけるSSCがSSEA4+とともに、α6‐インテグリン+、Thy‐1+およびc‐Kit−の表現型の特性を有することも示す。SSEA‐4は、段階特異的な胚の抗原であって、胚幹細胞のような多能性細胞で主に見られる。興味深いことに、SSEA‐4−細胞の全ては、生殖細胞マーカーのVASAを共発現したが、これら細胞のごく一部がGFR‐α1と共局在することは、このマーカーがサルの精巣における精原幹細胞の分集団でのみ発現することを示唆している。
核染色の強度に基づく霊長類の精巣に関する形態解析は、この種に2種類の未分化の精原細胞があることを示し、AdarkおよびApale・Adark精原細胞は、予備の幹細胞であって活発に分裂しないと考えられ、Apale精原細胞は、霊長類の精巣において活性のあるSSCになることが見られる。
フローサイトメトリーと組み合わせたDNA染色のヨウ化プロピジウム(PI)を用いることで、生殖系列幹細胞のSSEA‐4+の集団がThy‐1+、α6‐インテグリン+細胞と異なるDNA含有量であることが見出された。SSEA‐4+細胞は活発に分裂する細胞に類似したDNAプロファイルを有するが、Thy‐1+、α6‐インテグリン+細胞は細胞周期のS期で停止した細胞数の蓄積を示した。さらに、SSEA‐4+細胞は、PCNA染色で示されるようにThy‐1+、α6‐インテグリン+細胞よりも顕著に高い増殖活性を示した。
未分化状態でES細胞を維持する不可欠な役割を有する多能性のマーカーNanogは、霊長類の精巣で豊富に発現していた。SSCのみでなく、全ての生殖細胞におけるNanogの発現は、ES細胞と比較して、生殖系列幹細胞でのこの転写因子としての異なる役割を示している。生殖細胞内のNanogの消失が分化よりはむしろアポトーシスを誘導することは、Nanogが生殖細胞において生存因子であることを示唆している。
成体マウスの精巣内の3000個の細胞のうちの1個がSSCであることが示されている。SSC特異的マーカーGFRα1およびPLZFでの免疫組織化学染色に基づく成体のサルの精巣におけるSSCの割合は、げっ歯類について記載されたものに類似する。また、精原細胞の移植研究は、成体のサルの精巣において、約0.3%のSSCの存在を示した。
ここで示されたことは、3重染色(CD90+、CD49f、c‐Kit−)の細胞およびSSEA‐4+細胞がSSCの分子および表現型の特性を示すが、SSEA‐4+細胞のみが精原細胞の移植後に受容個体の精巣を再配置したことである。これは、SSEA‐4+細胞が活発に分裂するSSCに相当し、3重染色の細胞が休止した幹細胞に類似することを示す。興味深いことに、SSEA‐4および3重染色の細胞はどちらも、GDNFの受容体C‐Retを発現したが、3重選別された細胞のみがPLZFの発現を示した。GDNFおよびPLZF両方は、精原幹細胞の自己再生における主要な調節因子であることが知られている。GDNFは、BCL6b転写因子の上方調節を介してSSCの自己再生を維持するが、PLZFは、いまだに未知の機序でSSCの自己再生を維持する。前骨髄球性白血病ジンクフィンガータンパク質(PLZF)は、様々な細胞のタイプで利用可能なサイクロンAの抑制によって、G1/S移行およびS期への移行で細胞増殖を阻害することが示されている。また、PLZFは、G1/S移行の他の調節因子であるP21を阻害することが示されている。したがって、PLZFの高いレベルは、細胞周期および休眠の阻害をもたらす。レチノイン酸受容体α(PAR‐α)は、サイクリンAの発現を増強することでPLZFによって誘導された細胞周期の阻害を回復することが示されている。
材料および方法
フローサイトメトリーによる霊長類の生殖細胞の十分な精製:フローサイトメトリー選別がInFlux細胞選別器を用いて行われた。表面の特徴付けおよび選別のために、非霊長類で幹細胞表面マーカーおよび精原幹細胞マーカーに特異的な、抗CD90‐FITC、抗CD49f‐PEおよび抗CD117‐APCを含む抗体試薬で細胞が染色された。これらのマーカー解析のために、細胞は、氷上、完全培地中で30分間染色され、冷やした染色緩衝液で1回洗浄され、完全培地に再懸濁され、細胞蛍光分析まで氷上で維持された。
フローサイトメトリーによる霊長類の生殖細胞の十分な精製:フローサイトメトリー選別がInFlux細胞選別器を用いて行われた。表面の特徴付けおよび選別のために、非霊長類で幹細胞表面マーカーおよび精原幹細胞マーカーに特異的な、抗CD90‐FITC、抗CD49f‐PEおよび抗CD117‐APCを含む抗体試薬で細胞が染色された。これらのマーカー解析のために、細胞は、氷上、完全培地中で30分間染色され、冷やした染色緩衝液で1回洗浄され、完全培地に再懸濁され、細胞蛍光分析まで氷上で維持された。
霊長類の生殖細胞の磁化選別:霊長類の生殖細胞の集団が磁化微粒子によって標識され、磁化カラムに細胞が通されて濃縮された。新鮮分離された霊長類の精巣細胞は、SSEA‐4またはα6‐インテグリンとThy‐1とに対するビオチン化抗体(それぞれイーバイオサイエンス社、アブカム社、BDファルミゲン社)で標識された。ビオチン化されると、細胞はストレプトアビジン磁化微粒子(ミルテニーバイオテク社)で標識された。磁化で標識された細胞は、磁石を備えるカラムに細胞を通すことで選択された。磁化で標識された細胞は、磁石からカラムを取り外し、カラムから洗い落として細胞を開放することによってカラムから取り出された。この作業は、各マーカーに対して陽性の細胞の集団を、新鮮分離された細胞における元の割合に対して22倍まで濃縮することに成功した。さらに、磁化選別は、90%という高さで純粋に標識された細胞をもたらした。この濃縮工程は、蛍光フローサイトメトリーと併用された。蛍光フローサイトメトリーを実行する前の磁化による細胞単離選別によって、蛍光で標識された細胞を選別するのに必要な時間が減り、蛍光で標識された選別可能な細胞の数が大きく増加した。
霊長類の生殖細胞の免疫組織化学的染色:組織は、4%パラホルムアルデヒド(PF;エレクトロンマイクロスコピーサイエンス社)で一晩かけて固定され;20%スクロース(シグマ社)に移され、OCT(VWR社)で凍結された。低温切開片は8μmの厚さに作製され、−80℃に保管された。保管された細胞は、4%PFで固定され、約25,000細胞/10μlで100mMのスクロースに再懸濁され;10μlの分割量がオルニチン/リシンで被覆されたガラススライドにのせられ;そして、スライドが乾燥するまで37℃の保温プレートに置かれた。スライドは、解析まで−80℃に保管された。
免疫組織化学染色のために、精巣切片の細胞およびFACSで選別された試料が、0.1%Triton‐X100を用いて透過処理され、2%BSAおよび5%ヒツジ血清を含む溶液、または2%BSA、5%ヤギ血清および0.1%Triton‐X100を含む溶液のどちらかでブロック処理された。DAPI(インビトロジェン社)が核の可視化に用いられた。1×PBS+2%BSAで複数回洗浄した後、細胞は、Permafluor(ベックマンコールター社)を用いて保存された。組織切片および選別された細胞の表面マーカーの分布は、SlideBook(商標)画像ソフトウェアで調整されたオリンパスBX‐16顕微鏡を用いて評価された。マウスまたは霊長類の組織における霊長類の精巣細胞に関して、50個の異なる精細管が解析された。個々のマーカー染色作業それぞれについて、3個から4個の異なる切片が解析され、FACS細胞試料に関しては、少なくとも200個の異なる細胞が少なくとも3つの異なる分割量で解析された。
霊長類の生殖細胞のRNA抽出、RT‐PCR解析およびQRT‐PCR解析:細胞内の全RNAがRNeasy mini kit(キアジェン社)を用いて製造者の説明に基づいて単離された。そして、単離されたRNAは、Quantitect RTキット(キアジェン社)を用いてDNAに転写され、QIAquick PCR 精製キットで精製された。各RT‐PCR反応において、20ngのDNAテンプレートが、HotStar Taq Plusおよび異なる各プライマーと合わせて25μLの反応用量で用いられた。全ての標的cDNAが30サイクルで増幅された。増幅産物は、2%アガロースゲルにおけるサイズで同定された。QRT‐PCRに関して、5ngのcDNAテンプレートが、Quantitect Sybr Green PCR master mix(キアジェン社)およびバイオラッド社のiCyclerを用いて増幅された試料と合わせて25μLの反応用量で用いられた。各試料は、3重に試験され、GAPDH対照で標準化された。
霊長類の生殖細胞のテロメラーゼ試験:SYBR Greenリアルタイム定量的テロメア反復の増幅プロトコール(RQ‐TRAP)が用いられた。組織または細胞沈殿物がPBSで1回洗浄され、再懸濁され、そしてRNaseout阻害剤(インビトロジェン社)を含む1×Chaps溶解緩衝液内で、終濃度が1000細胞/μLおよびRNaseout阻害剤が400ユニット/mLで均質化された。氷上25分間の反応後、細胞溶解物が微小遠心管を用いて4℃で10分間、16,000rpmで遠心分離された。上清が新しい微小遠心管に移され、ND‐1000分光光度計(ナノドロップ社)を用いて280nmの吸光度を測定することでタンパク質濃度が決められた。テロメラーゼ反応の量は、500ngのタンパク質溶解物、Quantitect SYBR Green PCR mix、1μgのTSプライマー、0.5μgのACXプライマーおよびヌクレアーゼを含まない蒸留水を含む溶液で25μLとした。各試料は、テンプレートのない対照(溶解緩衝液)、陽性対照(ESC細胞)とともに3重に試験され、標準曲線は、1000ng、200ng、40ng、8ngまたは1.6ngのタンパク質を含むヒトESC溶解物の分割量から作成された。iCycler iQ5(バイオラッド社)を用いて、反応が25℃で20分間、95℃で15分間行われ、次のサイクル条件:95℃で30秒、60℃で90秒、のもとで40回のPCRサイクルで増幅された。サイクルの閾値(Ct)は、半対数増幅曲線(サイクル数に対する蛍光の対数の増加)から決定され、標準曲線と比較された。閾値に関するソフトウェアの初期値は、1サイクル目を除く最初の10サイクルを通しての各ウェルの蛍光測定値における標準偏差の平均の10倍であった。霊長類の精巣の異なる細胞試料におけるテロメラーゼ活性は、標準曲線で読み取られ、および/またはヒトESC溶解物による標準で記録された値の割合として表された。
実施例3
霊長類の生殖系列幹細胞の培養拡大
単離後の生殖系列幹細胞(実施例2)は、MEFプレートに移され、マウス血清非添加培地(MSFM)、ラット血清非添加培地(RSFM)またはMEM‐X(登録商標)のような異なる血清非添加の培地で培養された。細胞の形態変化およびウェルごとの生殖細胞のコロニー数が培養中に評価された。培地の半分が1日おきに換えられた。
霊長類の生殖系列幹細胞の培養拡大
単離後の生殖系列幹細胞(実施例2)は、MEFプレートに移され、マウス血清非添加培地(MSFM)、ラット血清非添加培地(RSFM)またはMEM‐X(登録商標)のような異なる血清非添加の培地で培養された。細胞の形態変化およびウェルごとの生殖細胞のコロニー数が培養中に評価された。培地の半分が1日おきに換えられた。
培養10日後、平らなコロニーが全ての培地のタイプに形成された(図29A)。MEM‐Xにおけるコロニーは、他の2つの培養培地よりもその形態を維持した。選別されていない集団にみられたコロニーの数は、選別された細胞よりも少なかった。試験された細胞表面マーカーの中では、SSEA‐4および3重選別された細胞がコロニーの形成をもたらした。3重選別された細胞からSSEA‐4+細胞を除くと、コロニーはほとんど形成されなかった;しかし、SSEA‐4+細胞から3重選別の表現型を除くと、コロニー形成の能力に変化がなかった。SSEA‐4および3重選別で陽性の細胞は、培養において最も多くの数のコロニーを形成し、SSEA‐4および3重選別を除いた細胞は、いかなるコロニーも形成しなかった。そして、コロニーは、SSEA‐4(図29B‐C)、GFR‐α(図29D)およびα6‐インテグリンで染色された。
実施例4
げっ歯類の雌の生殖系列幹細胞の単離
出生後2‐5日の遺伝子操作された40‐60匹のOG2子マウスからマウスの卵巣が、顕微鏡下の顕微解剖で取り出され、細胞の単離に用いられた。卵巣は、4mMのEDTAを添加した冷たいD‐PBSを含む培養皿に最初に収集された。次に、5mlのピペットを用いて、卵巣が50mlの円錐管に移された。遠心分離と洗浄の後で、D‐PBS洗浄溶液が除去され、卵巣がコラゲナーゼ(1mg/ml)およびデオキシリボヌクレアーゼ‐I(20ユニット/ml)に再懸濁され;そして、37℃の水槽に置かれた。10分ごとに、分解している卵巣組織がピペットで物理的に破壊され、保温の最後に(30分)5mlのFBSが酵素を中和するために加えられた。残りの細胞懸濁液は、組織の残骸を除くために40μmのろ過器に通され、単離された細胞は400×Gで10分間の遠心分離で集められた。上清の酵素‐FBS溶液が除かれ、細胞が培養培地に再懸濁され、使用するまで氷上で維持された。
げっ歯類の雌の生殖系列幹細胞の単離
出生後2‐5日の遺伝子操作された40‐60匹のOG2子マウスからマウスの卵巣が、顕微鏡下の顕微解剖で取り出され、細胞の単離に用いられた。卵巣は、4mMのEDTAを添加した冷たいD‐PBSを含む培養皿に最初に収集された。次に、5mlのピペットを用いて、卵巣が50mlの円錐管に移された。遠心分離と洗浄の後で、D‐PBS洗浄溶液が除去され、卵巣がコラゲナーゼ(1mg/ml)およびデオキシリボヌクレアーゼ‐I(20ユニット/ml)に再懸濁され;そして、37℃の水槽に置かれた。10分ごとに、分解している卵巣組織がピペットで物理的に破壊され、保温の最後に(30分)5mlのFBSが酵素を中和するために加えられた。残りの細胞懸濁液は、組織の残骸を除くために40μmのろ過器に通され、単離された細胞は400×Gで10分間の遠心分離で集められた。上清の酵素‐FBS溶液が除かれ、細胞が培養培地に再懸濁され、使用するまで氷上で維持された。
卵巣の生殖系列幹細胞がフローサイトメトリーによるGFP陽性の細胞を収集することで十分に精製され、フローサイトメトリーでは、緑色蛍光強度を同定し(図11A)、c‐Kitに対する3種のチャネル(R2、R3およびR4)が調べられ(図11B);さらにc‐Kitの強度についてR3を選別した(図11C)。
フローサイトメトリーの使用で、GFP/Oct‐4+細胞が新生児(図11A)および成体(図11B)のマウスで検出されたことは、出生後の卵巣における生殖系列幹細胞の存在を示唆している。マウスの卵巣での生殖系列幹細胞の割合は、年齢とともに顕著に減少した。1‐2%のGFP+細胞が新生児マウスの卵巣で見られたが、0.05%だけが成体の卵巣に存在した。Oct‐4+細胞では、60%が陰性または低いレベルのc‐Kitを発現し、40%が高いレベルのc‐Kitの発現を示した(図11C)ことは、生殖系列幹細胞に2つの集団があることを示している。免疫組織化学的な解析は、GFP‐Oct‐4+細胞が卵巣上皮のいたるところに存在すること明らかにした(図12A‐12C).RT‐PCR解析は、新生児マウスの卵巣から単離されたGFP+細胞が多能性マーカーOct‐4およびこの集団に生殖系列細胞の存在を裏付ける生殖細胞マーカーVASAおよびc‐Kitのどちらも発現したことを示したが、GFP−細胞は、生殖細胞マーカーの発現のみを示した(図13)。
予想に反して、新鮮分離された成体又は新生児の卵巣細胞は、かなり低いテロメラーゼ活性を示した。しかし、RT‐PCR解析は、GFP+細胞が培養開始時に、ESCのように、Oct‐4を発現することを確認した(図13)。GFP+細胞は、Oct‐4を発現したが(図13、5レーン)、GFP−細胞は発現しなかった(図13、レーン6)。GFP+細胞は、GFP−細胞よりも高いレベルのVASAを発現した(図13、レーン5)。GFP−細胞は、GFP+細胞よりも高いレベルのc‐Kitを発現した。
いくつかの先行する科学文献では、マーカーc‐Kitは、雄の生殖系列幹細胞に関連があるとされている。Oct‐4+細胞では、60%が陰性または低いレベルのc‐Kitを発現し、40%が高いレベルのc‐Kitを発現した。新生児マウスの卵巣から単離されたGFP+細胞は、多能性マーカーOct‐4および生殖細胞マーカーVASAおよびc‐Kitのどちらも発現した。組み合わせた結果は、OG2マウスの卵巣から単離されたGFP+細胞の集団における生殖系列幹細胞の存在を確認した。
MEFの支持層で培養されたGFP+細胞は、円形で平らなコロニーを形成し、そういったコロニーははっきりと明確な境界を有していたが(図14A‐14Cおよび14E)、他は違った(図14F)。明確な境界および不明確な境界を有するコロニーの代表が回収され(図14B)、コラゲナーゼを用いてMEFで継代された(図14D)。継代後、細胞は、さらに類上皮の形状をした平らな密集した細胞で囲まれた小さな円形細胞の締まった楕円形の中心グループとして認識可能な特徴のあるコロニーを作った(図14G‐14I)。このコロニーの出現は、4回の継代を超えて継続した(図14J‐14K)。
予想通り、GFP+の卵巣細胞のコロニーはOct‐4に対して陽性であった(図15A)。生殖系列細胞としての同定を支持することとして、それらのコロニーの細胞は、多能性の転写因子Nanogに対しても陽性に染色された(図15B)。さらに、これら細胞は、生殖系列特異的マーカーVASA(図15C)および幹細胞マーカーアルカリホスファターゼ(図15D)も発現した。これらを組み合わせた結果は、雌の生殖系列幹細胞の組織培養における単離、同定、特徴付けおよび継代を確認した。
GFP+のコロニーは、コラゲナーゼを用いた酵素分解に耐性があり、新たなコロニーを形成した。しかし、それらは、トリプシン処理に耐性がなく、コロニーの大部分は、トリプシン処理後に分化した。GFP−細胞は、生殖細胞マーカーのみを発現し、幹細胞マーカーは発現しなかった。ある程度の継代後(例えば、15継代)、これらの分化したコロニーは形態を維持したがほとんどの細胞はGFPを発現しなくなったことは、Oct‐4プロモータの下方調節および分化の可能性を示唆している。各コロニーのほんの少数の細胞、主にコロニーの中央にある大細胞は、GFPの発現を示した。経時的に、GFP+細胞は、かなり大きな40μm以下の、卵胞に類似する形態を有する構造体に内在した楕円形の細胞を形成した(図16A、16B)。結局は、楕円形のGFP+細胞は、コロニーから分離し、例えば一次卵母細胞の外見を呈する(図16C)。全体として、この結果は、単離され、十分に精製された卵巣の生殖系列幹細胞が分化し、生体外で一次卵母細胞になるまで成熟するという考えを支持する。
これらの大きな卵母細胞様の細胞の存在および特性は、次のように図16の培養からそれらを実質的に単離することおよび精製することで確認された:粒子を区別する標準的なフローサイトメトリーを用いて、15マイクロメートル(μ)かそれ未満の全ての事象を示すゲートが形成され(R1);MEF細胞は、R1に蓄積した全ての均質化した集団であった(図17A);図206の生殖細胞培養におけるかなりの数の大細胞(>15μ)がMEFに成長した(図208B)。これらの細胞の一部は、半径約60‐70マイクロメートルであった。
材料および方法
卵巣の生殖系列幹細胞の培養:GFP+細胞は、4ウェルプレートのウェルごとに5000‐10000の濃度でPM‐1(商標)培地内のMEF支持層で培養された。培養は、37℃で維持され、1日おきに培地の半分が交換された。2週毎に細胞は、機械的に、または酵素を用いて(コラゲナーゼ)、新しいMEFプレートに移された。
卵巣の生殖系列幹細胞の培養:GFP+細胞は、4ウェルプレートのウェルごとに5000‐10000の濃度でPM‐1(商標)培地内のMEF支持層で培養された。培養は、37℃で維持され、1日おきに培地の半分が交換された。2週毎に細胞は、機械的に、または酵素を用いて(コラゲナーゼ)、新しいMEFプレートに移された。
卵巣の生殖系列幹細胞の特徴付け:新鮮分離されたGFP陽性細胞がテロメラーゼ試験および遺伝子発現解析に用いられた。卵巣の組織学に関して、卵巣が4℃で一晩かけて、1Mのスクロースを含む4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定され、低温保持装置用凍結培地に入れられた。5マイクロの切片が作製され、GFP+細胞の局在が蛍光顕微鏡を用いて決定された。卵巣における生殖系列幹細胞の局在は、Oct‐4およびVASAの2重標識によって確認された。免疫細胞化学(ICC)のために、培養された卵巣の生殖系列幹細胞が室温で30分間、2%PFAで固定され、PBSで洗浄され、4℃で維持された。培養された卵巣の生殖系列幹細胞の特徴付けのために、VASA、Oct‐4、Nanogおよびアルカリホスファターゼ染色が、さらに以下に記載されるように明視野のICCを用いて行われた。
RT‐PCRおよびQRT‐PCR解析:細胞内の全RNAがRNeasy mini kit(キアジェン社)を用いて製造者の説明に基づいて単離された。そして、単離されたRNAは、Quantitect RTキット(キアジェン社)を用いてDNAに転写され、QIAquick PCR 精製キットで精製された。各RT‐PCR反応において、20ngのDNAテンプレートが、HotStar Taq Plusおよび異なる各プライマーと合わせて25μLの反応用量で用いられた。全ての標的cDNAが30サイクルで増幅された。増幅産物は、2%アガロースゲルにおけるサイズで同定された。QRT‐PCRに関して、5ngのcDNAテンプレートが、Quantitect Sybr Green PCR master mix(キアジェン社)およびバイオラッド社のiCyclerを用いて増幅された試料と合わせて25μLの反応用量で用いられた。各試料は、3重に試験され、GAPDH対照で標準化された。
実施例5
ヒト男性の生殖系列幹細胞の単離
ヒトの精巣が非閉塞性の無精子症の患者から収集され、また精巣摘出後に回収された精巣組織の残骸が本研究のために用いられた。全ての組織は、患者に対するインフォームドコンセントを得たうえで集められた。組織は、収集から24時間以内に4℃の抗生剤入りPBSに入れられた。ヒトの精巣組織の処理方法は、実施例2に記載された霊長類のものと同様である。
ヒト男性の生殖系列幹細胞の単離
ヒトの精巣が非閉塞性の無精子症の患者から収集され、また精巣摘出後に回収された精巣組織の残骸が本研究のために用いられた。全ての組織は、患者に対するインフォームドコンセントを得たうえで集められた。組織は、収集から24時間以内に4℃の抗生剤入りPBSに入れられた。ヒトの精巣組織の処理方法は、実施例2に記載された霊長類のものと同様である。
細胞の単離の前に、組織試料がICCのために取られ、精巣の2つの小片がRNAおよびDNA抽出のために取られた。細胞の単離および生存能力と細胞数の決定に続いて、試料がRNAおよびDNA解析のために取られた。ICCの方法において、RNAおよびDNA抽出は実施例2に記載された霊長類の場合と同様である。さらに、細胞が霊長類の生殖系列幹細胞の分離のために以前開発された細胞表面マーカーの発現のために標識され、磁化細胞選別およびフローサイトメトリーで使用された。フローサイトメトリーで用いられた抗体および方法は、実施例2に記載された霊長類の生殖系列幹細胞の分離で用いられたものと同様である。
また、生殖細胞の集団は、磁化微粒子によって標識され、磁化カラムに細胞が通されて濃縮された。新鮮分離された精巣細胞は、SSEA‐4またはα6‐インテグリンとThy‐1とに対するビオチン化抗体で標識された。ビオチン化されると、細胞は、ストレプトアビジン磁化微粒子で標識された。磁化で標識された細胞は、磁石を備えるカラムに細胞を通すことで選択された。
磁化で標識された細胞は、磁石からカラムを取り外し、カラムから洗い落として細胞を開放することによってカラムから取り出された。この作業は、各マーカーに対して陽性の細胞の集団を、新鮮分離された細胞における元の割合に対して22倍まで濃縮することに成功した。さらに、磁化選別は、90%という高さで純粋に標識された細胞を提供した。この濃縮工程は、蛍光フローサイトメトリーと併用された。蛍光フローサイトメトリーを実行する前の磁化による細胞単離選別によって、蛍光で標識された細胞を選別するのに必要な時間が減り、蛍光で標識された選別可能な細胞の数が大きく増加した。
次に、選別された細胞は、RT‐PCRおよびDNA解析に用いられた。また、試料の一部が、受容個体として免疫不全マウスを用いた精原細胞移植試験に使われた。精原幹細胞移植の方法は、実施例1および2に記載されたマウスおよび霊長類のものと同様である。
精巣の生検および精巣組織の残骸から調製された凍結切片の免疫組織化学染色は、精細管横断面の基底膜に多くのα6‐インテグリン+細胞があることを明らかにした。また、SSEA‐4+細胞およびGFRα1+細胞が精細管の基底膜にみられた。
次にICCが行われた:ヒト全精巣組織(THT)がSSEA‐4およびVASAで染色された(図30);THTはGFR‐αおよびVASAで染色された(図31);THTはVASAおよびNanogで染色された(図32);ヒトbHT(生検精巣組織)はSSEA‐4およびα6‐インテグリンで染色された(図33);ヒトの精巣切片からなる陰性対照は、2次抗体でのみ染色された(図34)。ヒトTHT SSEA‐4+磁化粒子で選別された細胞が、ブスルファン処理された受容個体マウスの精巣に移植され、1ヵ月後に切り出され、次のマーカーで染色された:SSEA‐4およびヒト核タンパク質(HNP,図35);α6‐インテグリンおよびHNP(図36);SSEA‐4およびα6‐インテグリン(図37)。マウスの精巣切片における細胞を移植されたTHTからなる陰性対照は、2次抗体での染色された(図38)。全ての染色は、通常の核染色を含む。
フローサイトメトリー解析は、免疫組織化学的な所見およびα6‐インテグリンに陽性の集団がヒトの精巣から収集された試料に見られたことを確認した。さらに、Thy‐1+細胞の異なる集団が見られた。Thy‐1およびα6‐インテグリンの共局在は、ヒトの精巣内にThy‐1+細胞の3つの集団があることを示した:1)Thy‐1が中間でα6‐インテグリンが低い、2)Thy‐1が高く、α6‐インテグリンが中間、および3)Thy‐1が高く、α6‐インテグリンが陰性。α6‐インテグリン+細胞のほとんどがThy‐1−であった。また、ヒトの精巣でみられたSSEA‐4+(10‐12%)およびGFR‐α+(1‐5%)細胞の明らかな集団が存在した。磁化選別がSSEA‐4+細胞の割合を44%まで顕著に向上させたことは、このマーカーに対する4倍の増加を示唆している。
定量的RT‐PCR解析は、試験された試料において、SSEA‐4+細胞およびGFR‐α+細胞がC‐RET、PLZFおよびTERTを含む精原幹細胞マーカー、ならびにVASAおよびDAZLを含む生殖細胞マーカーを、最も高いレベルで発現することを明らかにした。精原幹細胞移植はSSEA‐4+細胞が受容個体マウスの精巣に定着し、再配置することを明らかにし、これは、これら細胞が機能的に精原幹細胞であることを示唆している。
不妊の雄マウスがドナーマウス由来の雄の生殖系列幹細胞(GSC)の移植を介して生殖可能になること、さらにこれらのマウスが子を出産できることが示された。しかし、この方法で得られたマウスの性質は、これまで調べられていない。本研究の目的は、GSC移植で得られたマウスの性質を調べ、親株の既知の成長パターンと比較することであった。図45は、雄のGSCの移植から得られたマウスの交配で作製された雄(図45A)および雌(図45B)の1代交配種マウスの平均的な成長を示す。これらの成長のスピードは、製造元によって提供された親マウスの成長スピードと同程度である(データは示さず)。
実施例6
ヒト精原幹細胞の表現型特性
ヒトの精巣細胞がSSEA‐4に関する磁化選別によって精原幹細胞(SSC)のために濃縮され、濃縮された集団が受容個体マウスの精巣に顕微注射された。移植から1ヵ月後、精巣が収集され、低温切開片が作製された。マウスの精巣におけるヒトの細胞の同定は、alexa‐488に結合したヒト核タンパク質(HNP)を用いて行われた。幹細胞、体細胞、幹細胞および多能性マーカーとHNPとの共局在が、マウスの精巣におけるヒトのSSCの表現型特性を評価するために用いられた。
ヒト精原幹細胞の表現型特性
ヒトの精巣細胞がSSEA‐4に関する磁化選別によって精原幹細胞(SSC)のために濃縮され、濃縮された集団が受容個体マウスの精巣に顕微注射された。移植から1ヵ月後、精巣が収集され、低温切開片が作製された。マウスの精巣におけるヒトの細胞の同定は、alexa‐488に結合したヒト核タンパク質(HNP)を用いて行われた。幹細胞、体細胞、幹細胞および多能性マーカーとHNPとの共局在が、マウスの精巣におけるヒトのSSCの表現型特性を評価するために用いられた。
マウスの精巣におけるHNP染色で示されるヒト細胞の広範囲に及ぶ定着は、SSEA‐4磁化選別された細胞内にSSCのかなり濃縮された集団が存在することを示唆している。マウスの精巣に定着したヒトの細胞の全ては、生殖細胞マーカーVASAに対して陽性に染色され、精巣のセルトリおよびライディッヒ細胞に対するマーカーであるLHRに陰性に染色された。これは、定着した細胞の全てが生殖細胞であることを示唆している。本研究で用いられたマーカーでは、表面において、ヒトの細胞の15%のみがSSEA‐4を発現し、31%がα6‐インテグリンを発現し、それらの45%がGPR125を発現した。マウスの精巣に定着したヒトの細胞のほとんど全てがc‐Kitを発現したことは、このマーカーがSSCの自己再生に必要であることを示唆している。精巣の多能性マーカーでは、Oct‐4+またはTRA1‐60+細胞はみられなかったが、ヒトの細胞の29%がNanogの発現を示した。これは、ヒトのSSCに、多能性の特性を備える細胞の集団があることを示す。SSEA‐4細胞のほとんど全てがα6‐インテグリンに対しても陽性であった。また、SSEA‐4+細胞の全てがc‐Kitに対して陽性であったことは、SSCのc‐Kit+の集団のみが受容個体マウスの精巣に定着する能力を有することを示唆している。
本研究は、ヒトのSSCがVASA+、c‐Kit+、LHR−、TRA1‐60−、Oct4−の表現型特性を備え、ヒトのSSCの分集団がSSEA4+、α6‐インテグリン+、GPR125+およびNanog+であることを明示する。これは、SSCの異なる集団がヒトの精巣に存在することを示す。
VASA、SSEA‐4、GFRαおよびα6‐インテグリンの共局在研究で示されたように、黄体形成ホルモン受容体(LHR)は、サル、ヒトまたはマウスの生殖細胞に共局在しない。陽性細胞の局在および形態によって示されたように、LHRは、セルトリおよびライディッヒ細胞で発現する。コネキシン‐43は、基底膜に局在する生殖細胞、セルトリ細胞と、おそらくライディッヒ細胞とを染色すると考えられる。
実施例7
マウス効力試験‐生殖能力の評価
ドナー動物から不妊の受容個体の精巣への雄の生殖系列幹細胞の移植が上述された。ドナーの生殖細胞は、受容個体の精巣に定着し、受容個体の雄がドナーの生殖細胞の遺伝物質を分配できるようにドナー由来の精子を産生する。生殖細胞移植は、雄の生殖系列幹細胞に対する機能的な再構成試験を意味し、精巣における幹細胞の生態に関する我々の理解を非常に高め、不妊の表現型を定義する。最初にげっ歯類で開発され、その技術は、家畜哺乳動物、ニワトリおよび魚類を含むいくつかの動物種で今でも用いられている。動物におけるこの技術に関する主な用途:第1に、雄の生殖系列幹細胞の生物学および雄の生殖能力に関する基本的な側面の理解;第2に、同一種または異種間での雄の生殖細胞移植によって遺伝的に利用可能な個体の生殖能力を保存する、がある。従って、雄の生殖細胞の移植は、この研究、動物の雄の生殖能力の保存および取り扱いにおいて、比類なく価値ある方法である。
マウス効力試験‐生殖能力の評価
ドナー動物から不妊の受容個体の精巣への雄の生殖系列幹細胞の移植が上述された。ドナーの生殖細胞は、受容個体の精巣に定着し、受容個体の雄がドナーの生殖細胞の遺伝物質を分配できるようにドナー由来の精子を産生する。生殖細胞移植は、雄の生殖系列幹細胞に対する機能的な再構成試験を意味し、精巣における幹細胞の生態に関する我々の理解を非常に高め、不妊の表現型を定義する。最初にげっ歯類で開発され、その技術は、家畜哺乳動物、ニワトリおよび魚類を含むいくつかの動物種で今でも用いられている。動物におけるこの技術に関する主な用途:第1に、雄の生殖系列幹細胞の生物学および雄の生殖能力に関する基本的な側面の理解;第2に、同一種または異種間での雄の生殖細胞移植によって遺伝的に利用可能な個体の生殖能力を保存する、がある。従って、雄の生殖細胞の移植は、この研究、動物の雄の生殖能力の保存および取り扱いにおいて、比類なく価値ある方法である。
GFP生殖細胞移植試験を確認するべく、ブスルファン処理されたマウスに移植するためにGFP生殖細胞の妥当な移植数が調べられた。GFP生殖細胞の最適な移植細胞数は、雌のヌードマウスとGFPを移植された雄のヌードマウスとを交配することで決定される。これらの交配由来のGFP+の子孫は、移植されたGFP生殖細胞が生殖能力を回復させ、生存能力のあるGFP子孫を生みだすかを確定する。さらに、GFP子孫は、以下に記載されるパラメータを、移植された全ての細胞および/または他のパラメータ(マーカー発現、精巣の重量等)と比較することによって、GFP生殖細胞移植試験を確認するために用いられる。GFP子孫が生まれた後、GFP生殖細胞を移植された雄親由来のこれらのGFP子孫は、生殖能力およびヌードマウスと再度交配することによる次の子孫へのGFP染色細胞の生殖系列伝達を検証することに用いられる。
GFP+の移植された雄のマウス個体それぞれは、4匹の雌のヌードマウスと交配される。2匹の雌がそれぞれの雄と毎晩交尾した。4匹の雌は、その発情周期に応じて毎晩入れ替えられた。雄は、3週間交尾し、1週間中止し、もし雌が膣栓を形成しなかったら、さらに3週間の交尾を開始する。この手順は、妊娠するために最適な機会を雌に与え、一方で、中止期間に、雄は継続的な交尾から正常な状態に戻る。毎朝、マウスは、交尾の成功の陽性指標としての膣栓を確認される。交配の手順は、移植後5‐7ヶ月間継続される。妊娠する雌がいなかった場合、交配はさらに2ヶ月間継続される。
交配期間が終わると、交尾を終了し、GFPを移植されたマウス由来の精巣が、フロー解析、GFPに関する精子解析および組織学で調べられ、精巣で発現されるGFP+とSSC+の数が決定される。また、1代交配種である子孫は、蛍光およびPCRを用いてGFPに関して試験される。ヌードマウスは毛皮を有していないので、毛皮を有する子孫は全てGFP陽性の精子から生まれるはずである。
生殖能力および1代交配種の子孫からのGFPまたは毛色の生殖細胞系伝達を評価するために、それらは、生後2ヶ月まで成熟させられ、さらに2匹のヌードマウス(雄か雌)と2ヶ月間、妊娠能力を確認するために交配された。1代交配種マウスが2代交配種の子孫を産んだ後、2代交配種のGFP+および/または毛色+のマウスが蛍光およびPCRでGFPに関して選ばれる。これは、GFP+細胞の継代生殖細胞系伝達を検証する。さらに、GFP+であることが証明された2代交配種の子孫が安楽死させられ、組織学的検査のために収集され、GFP+精子の完全な形成が確認される。
思春期前のマウスから単離された新鮮な精巣細胞は、ブスルファン処理されたマウスの生殖能力を回復することができ、そのマウスの87%は、自然な交配または補助的な生殖技術を用いることで生殖能力を取り戻した。低温保存された精巣細胞が生殖能力を回復することができるか確かめるために、5‐8週齢の雄のヌードマウスがブスルファンで処理され、その動物は1ヵ月後に不妊となった。2‐5週齢の思春期前のGFP+である子の細胞が凍結され、移植のために供与される細胞として用いられた。マウスは4つの治療計画:手動で凍結された細胞(5×105)を受けた9匹のマウス;凍結速度を調整できる凍結方法で凍結された細胞(5×105)を受けた9匹のマウス;手動で凍結された細胞(1.25×105)を受けた9匹のマウス;および凍結速度を調整できる凍結方法で凍結されたより少ない個数の細胞(5×104)を受けた他の9匹のマウス;のうちの1つを受けた。移植の3ヵ月後、動物は、それぞれ2匹の雌と交尾し、交尾の効果が、栓の確認および妊娠の数によって評価され、GFPの子が記録された。生殖能力を取り戻したこれら動物のうち1匹は、ヌードの子を産んだものの安楽死させられ、GFPの精子の存在がフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡を用いて決定された(図53)。このフローサイトメトリー解析は、左の精巣にはGFP+精子の小さな集団がある一方で、GFP+精子は、右の精巣で見られなかったことを示した。GFP+管がそのマウスの右および左の精巣両方でみられたことは、移植された細胞が生存し、受容個体の精巣に定着したことを示唆している。フローのデータによれば、精子の0.5%のみがGFP陽性である。
実施例8
生存可能な子孫を産むための、ヒトもしくはマウスにおける精原幹細胞(SSC)あるいは早期段階の精原細胞(ESSC)の生体外または生体内での成熟
哺乳類の精子形成は、有糸分裂の精子形成、減数分裂する精母細胞、および体細胞のセルトリ細胞に密接に関係する配偶子の成長において高度に同期している。精子形成は、主に内分泌因子および精巣の傍分泌/自己分泌成長因子によって調節される。これらの因子はセルトリ細胞、生殖細胞、尿細管細胞および間質細胞、主にライディッヒ細胞とマクロファージとによって産生される。精細管内のセルトリ細胞と生殖細胞との相互作用および比は、精子形成の成功を保証する。精原幹細胞(SSC)の培養は、精巣内の幹細胞の数の少なさ、SSCを同定するための特異的マーカーがないこと、さらに培養においてSSCを生存させて維持することの難しさ等のために妨げられる。最近、SSCの増殖と分化に重要な成長因子、例えばグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、幹細胞因子(SCF)および白血病抑制因子(LIF)等が同定され;また、分化段階でのSSCに対するマーカーが報告された。SSCの生体外での培養は、SSCの成長/増殖および分化の制御に関わる生体分子因子の研究において強力なツールとして用いられる。
生存可能な子孫を産むための、ヒトもしくはマウスにおける精原幹細胞(SSC)あるいは早期段階の精原細胞(ESSC)の生体外または生体内での成熟
哺乳類の精子形成は、有糸分裂の精子形成、減数分裂する精母細胞、および体細胞のセルトリ細胞に密接に関係する配偶子の成長において高度に同期している。精子形成は、主に内分泌因子および精巣の傍分泌/自己分泌成長因子によって調節される。これらの因子はセルトリ細胞、生殖細胞、尿細管細胞および間質細胞、主にライディッヒ細胞とマクロファージとによって産生される。精細管内のセルトリ細胞と生殖細胞との相互作用および比は、精子形成の成功を保証する。精原幹細胞(SSC)の培養は、精巣内の幹細胞の数の少なさ、SSCを同定するための特異的マーカーがないこと、さらに培養においてSSCを生存させて維持することの難しさ等のために妨げられる。最近、SSCの増殖と分化に重要な成長因子、例えばグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、幹細胞因子(SCF)および白血病抑制因子(LIF)等が同定され;また、分化段階でのSSCに対するマーカーが報告された。SSCの生体外での培養は、SSCの成長/増殖および分化の制御に関わる生体分子因子の研究において強力なツールとして用いられる。
精原細胞の宿主外での成熟には3つの選択肢がある:(1)皮下または代理動物、好ましくは非ヒトの精巣において宿主外/生体内での成熟(同じ宿主への精原幹細胞の再移植または自己移植は、宿主外での成熟として見なされず、これは本明細書の他の部分でも記載されている);(2)単離された精原細胞の宿主外/生体内での培養、または(3)精細管の宿主外での培養。様々な動物モデルにおける研究は、皮下の未成熟な段階由来の、または免疫不全マウスの精巣に移植された精巣断片の異種移植が顕著な進展、場合によっては完全な精子形成をもたらすことを示した。驚くべきことに、精巣の構造およびセルトリ生殖細胞の相互作用の完全な崩壊にも関わらず、マウスおよびウシにおいて、ICSIは、これらの半数性の細胞が成熟した卵子を受精させ得ることを示した。精細管の培養の利点は、精細管の損傷のない構造が維持されることであり、これは、精細管が精巣内で精子産生の機能的な単位として考えられているからである。
実施例9
極薄内視鏡での顕微注入技術を用いたヒト精巣への精原幹細胞の移植
ガラス毛管および解剖顕微鏡を用いた、げっ歯類における精原幹細胞移植技術は十年以上前に開発された。マウスでは、精巣の構造および大きさによって精巣輸送管を介して精巣網に接近することができ、精巣輸送管への単回投与で精細管の内腔に十分な数のSSCの迅速でかつ確実な移植が可能となる。げっ歯類の精巣網は精巣の外から見え、精巣の動脈および静脈から十分離れた位置に局在している。
極薄内視鏡での顕微注入技術を用いたヒト精巣への精原幹細胞の移植
ガラス毛管および解剖顕微鏡を用いた、げっ歯類における精原幹細胞移植技術は十年以上前に開発された。マウスでは、精巣の構造および大きさによって精巣輸送管を介して精巣網に接近することができ、精巣輸送管への単回投与で精細管の内腔に十分な数のSSCの迅速でかつ確実な移植が可能となる。げっ歯類の精巣網は精巣の外から見え、精巣の動脈および静脈から十分離れた位置に局在している。
しかし、さらに大きい哺乳動物では、精巣の構造と大きさとが異なる。第1に、精巣網は、精巣にあり、精巣に対する血液供給源のすぐ近くにある。第2に、精巣網を精巣上体につなげる複数の精巣輸送管がある。最後に、精巣の大きさは、精巣を満たすためにより多量の細胞懸濁液を必要とする(マイクロリットルではなくミリリットルの量)。ウシおよびサルでは、超音波誘導の方法が精巣へのSSCの移植のために開発され、精巣内腔に大きな針を注射することによる。しかし、これらの方法は、効果がなく、侵襲的であって、どちらの方法でも場合によっては精巣網の損傷および出血をもたらす。
また、ここで開示されるのは、ヒトの精巣に対する顕微注射装置であって、外部からヒトの精巣上体を含む精巣部位に達することができ、かつ個々の精巣輸送管に動くことができ、動脈および静脈を損傷せずに精巣網に達することを可能にする。この装置は、2つの部分:光源と操作者がカテーテルを導くことを可能にするカメラとを備える内視鏡のような毛細管カテーテル、および内部がより細く、精巣輸送管を通って精巣網に細胞懸濁液を移すカテーテルを含む。カテーテルは、小さい切開を介して精巣上体に挿入され、精巣輸送管に案内される。細胞注射の前に超音波造影液(レボビスト)が注射され、溶液が精巣網を経由して精細管に至ることを確認するために溶液の流量が超音波装置で監視される。
この装置の利点は、非侵襲性でかつヒトの精巣内腔に確実に達することである。また、この装置は、男性の不妊の診断を目的として用いられ、例えば、閉塞性無精子症部位の正確な位置を見つける。また、この装置は、侵襲性が低い態様で精巣上体および精巣網からの細胞と組織との収集に用いられる。
実施例10
思春期前の男性の生殖系列幹細胞およびそれらの不妊治療での使用
血液感染性のがん、小児期によく見られるがんの治療は、全身の放射線と骨髄移植と組み合わされて、アルキル化剤を必要とする傾向にある。これらの治療は悪性細胞を破壊するだけでなく、早い分裂を示す精原細胞にも細胞毒性を有する。結果として、精子形成の欠如および不妊は、成人期に現れる。青年期および成人の男性は、がん治療前の精液の低温保存の選択肢があり、人工授精、IVFまたはICSIによって、彼らは遺伝的に彼ら自身の子供の父親になることができる。
思春期前の男性の生殖系列幹細胞およびそれらの不妊治療での使用
血液感染性のがん、小児期によく見られるがんの治療は、全身の放射線と骨髄移植と組み合わされて、アルキル化剤を必要とする傾向にある。これらの治療は悪性細胞を破壊するだけでなく、早い分裂を示す精原細胞にも細胞毒性を有する。結果として、精子形成の欠如および不妊は、成人期に現れる。青年期および成人の男性は、がん治療前の精液の低温保存の選択肢があり、人工授精、IVFまたはICSIによって、彼らは遺伝的に彼ら自身の子供の父親になることができる。
思春期前の患者は、彼らが完全な精子形成をできないために、生殖能力を失う大きな危険に晒されている。彼らの精上皮は、幹細胞ではセルトリ細胞および精原細胞の異なるタイプだけを含む。成熟した配偶子がないので、未成熟な組織の低温保存が、現時点で若い少年の生殖能力が保存される唯一の手段である。
精巣細胞移植は、様々な動物から供与された精巣を用いて行われ、ほとんどの場合、ドナーとして免疫障害を持つマウスを使う。受容個体がマウスだった実験でドナーとして用いられた動物は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ウシ、サル、およびヒトを含む。供与された精巣細胞由来の子孫は、マウスおよびラットでのみ見られた。
思春期前の患者の生殖能力を保存する戦略は、生殖系列幹細胞の単離と低温保存を含む。これらの生殖系列幹細胞は、化学治療および/または放射線治療後の患者に自己移植される。しかし、がん患者からの生殖系列細胞の自己移植は、悪性細胞の伝達の危険をもたらす。したがって、生殖系列細胞は、悪性細胞から完全に分離されるべきである。ここで開示される方法は、フローサイトメトリー選別に基づき、生殖系列幹細胞を特異的に選択し、がん細胞からそれらを精製する。
また、ここで開示されるのは、生殖系列幹細胞移植に関する生理的関連性試験である。当該試験の結果は、生殖能力を回復するのに必要とされる幹細胞の量を決定することを可能にする。さらにそれは、安定性、生存能力および組織の収集ならびに放出前の時点での生殖系列幹細胞の有効性を評価するために用いられる。マウスモデルが用いられるのは、この種の精原幹細胞における表面マーカーがかなり特徴付けられており、かつ移植技術が利用可能だからである。この移植技術は、ブスルファン処理された免疫不全マウスの精巣における生殖系列幹細胞の機能性を試験し、受容個体動物におけるドナー細胞の精子形成を完全に進行させることができる。
1.精巣支持細胞に適した抗体の決定
2.がん細胞からの生殖系列幹細胞の分離
この研究の目的は、生殖系列幹細胞を濃縮し、あらゆる腫瘍細胞を患者試料から除去することであって、混入しているがん細胞が臨床応用のために十分減らされるまでの選択方法を決定するために、異質の細胞集団から生殖系列幹細胞を特異的に選択および単離する方法が開発された。これは、腫瘍の増殖を始めるためにどれぐらいのがん細胞が必要かを評価することを含む。疾患の状態に応じて各患者を治療するために、疾患に特異的な免疫表現型検査のための方法が開発される。これを行うために、個別のがんのタイプに対する特異的な細胞表面マーカーの発現が評価され、患者試料からがん細胞を減らすために用いられた。
この方法に主に関連するのは、生殖系列幹細胞の単離である。フローサイトメトリー選別による白血病マウスからの生殖細胞の陰性選択のための方法が、血液がん細胞で発現するMHCクラス1および白血球共通抗原(CD45)という2種類の表面マーカーに対する抗体で確立された。この方法によれば、マウスにおいて白血病を伝達することなく受容個体の精巣へのマウスの生殖系列細胞の移植を達成できる。さらに悪性細胞を除外するために、ヒトの生殖細胞は、CD90、CD49f、SSEA‐4およびGFR‐αのような生殖細胞に対する特異的マーカーで陽性として選択される。さらに、倍数性検出のような、がんに対する他の指標が用いられてもよい。このモデルの目的は、患者にがんを再導入することなく生殖能力を回復することである。
実験は、生殖系列幹細胞の陽性または陰性選択の実現可能性、腫瘍がマウスモデルに再移植されるときの閾値および疾患特異的な表面マーカーの発現トポロジーを評価する。
3.精原幹細胞の効力検定
ブスルファン処理された精巣における生殖能力を回復するための異なる生殖系列細胞の集団の能力について結論を得るには、効力検定が必要とされる。効率の増加を評価するために、各集団が陰性対照と比較された。また、これは、ライディッヒ細胞、セルトリ細胞または筋様細胞のように共に移植される細胞タイプの必要性について結論づける。生殖系列幹細胞を増加させることは、移植された細胞と生殖能力の回復に関してより高い有効性を生じるはずである。受容個体において供与された細胞を一義的に認識できるように、生殖系列幹細胞が遺伝子操作GFPマウス(NAGY、ジャクソン研究所)の精巣から単離される。思春期前のヒトの患者を模擬するために、生後7‐10日の幼若マウスの雄が生殖系列幹細胞の収集のために用いられた。
移植効果の解析:精子形成の活発な期間がマウスでは約35日で終わるため、移植されたマウスの2匹全てが移植4週間後に安楽死された。精巣が取り出され、活発な精子形成の指標として体重が計測された。次に、精巣は、単個細胞懸濁液に分解され、GFPの発言がフローサイトメトリーで検出された。これによりドナー幹細胞に由来するGFP+細胞の個数を決定できる。また、精巣は、ドナーおよび受容個体内に由来する生殖系列幹細胞の存在量についての結論を得るために、同じマーカーに関するフローサイトメトリーで評価される。
生殖能力の回復の検出:残りの2匹のマウスが移植後8週の交配に用いられた。各雄は、2匹のヌード雌と交配された。誕生した子は、原株が何であったかを示すためにGFPの発現または毛色が評価された。移植された各マウス由来の子は、結果として生じる異常について観察された。結果は表6に示されている。
実施例11
分化およびマウス卵巣の培養された生殖細胞の機能性試験
卵巣組織移植(OTT)は、生殖能力の保存および卵巣の卵胞の増殖に対して普通の方法に次第になりつつある。その範囲は、早発閉経(POF)に関する形質が不一致の双生児でのOTTや適合したドナーの卵巣組織を用いた卵巣発育不全の女性における卵巣機能(OF)の回復、例えば異種の移植を含む。他の応用例としては、健康な女性に対する生殖可能な期間の延長が主張されている。集められた卵巣組織の使用方法は、生体内/生体外での原始卵胞の成熟、卵巣組織の異種移植、または血液凝固血漿を用いながら生殖細胞をさらに分化させるための新しい方法を使用すること、さらに成熟および卵母細胞の成長のためにそれらを卵巣組織に移植することが可能性として考えられる。
分化およびマウス卵巣の培養された生殖細胞の機能性試験
卵巣組織移植(OTT)は、生殖能力の保存および卵巣の卵胞の増殖に対して普通の方法に次第になりつつある。その範囲は、早発閉経(POF)に関する形質が不一致の双生児でのOTTや適合したドナーの卵巣組織を用いた卵巣発育不全の女性における卵巣機能(OF)の回復、例えば異種の移植を含む。他の応用例としては、健康な女性に対する生殖可能な期間の延長が主張されている。集められた卵巣組織の使用方法は、生体内/生体外での原始卵胞の成熟、卵巣組織の異種移植、または血液凝固血漿を用いながら生殖細胞をさらに分化させるための新しい方法を使用すること、さらに成熟および卵母細胞の成長のためにそれらを卵巣組織に移植することが可能性として考えられる。
雌マウスのOG2生殖細胞を卵胞および/または卵母細胞に分化する方法を開発するために、卵巣組織細胞とマウスOG2生殖細胞を、ともに機能的な卵巣上の血液凝固血漿に移植する、またはヌードマウスの背の皮下領域に生着したそれらを成長させる。この実験の目標は、生殖細胞を未成熟なまたは成熟した卵母細胞に分化させるため、機能的な卵巣とともにそれを培養したうえで、移植媒体として凝固血漿の機能を決定することである。卵胞の成長の早期段階について試験するために、4つの細胞凝塊がヌードマウスの背の皮下領域に移植され、1つの凝塊が28日間で7日に1回取り除かれ、その凝塊が組織学試験によって卵胞および卵母細胞への成長に関して調べられる。宿主の卵巣へともに移植された分化した移植細胞の機能性を試験するために、マウスが自然に交配され、分化可能で、受精可能で、そして移植細胞から生きた子を産み出すことが可能である等あらゆる機能的な卵母細胞があるか調べる。凝塊方法が分化と増殖を最も達成し得ることを検証するために、卵嚢および皮下領域において宿主の卵巣に共移植される4つの凝塊条件:1)MEFで培養された雌OG2のGS細胞(0日目);2)培養された雌OG2のGS細胞由来の早期におけるEB’s(2日目);3)培養された雌OG2のGS細胞由来のEB’sからの末期の卵母細胞様細胞(6日目);4)生後4‐6日のFVB GFPマウス由来の新鮮分離された卵巣細胞および卵胞(陽性対照として使用)が用いられた。
方法
生殖細胞胚様体の形成:培養された雌のOG2のコロニーを含む6ウェルプレートが〜80%の集密で得られる(コロニーは相互に最低限で接触していた)。培地が吸引され、ウェルがPBSで1回洗浄され、700μLの暖めたトリプシンが各ウェルに添加された。次に、プレートが4分間、37℃のインキュベータ内に置かれる。6ウェルプレートの各ウェルは、MEF支持層の雌OG2の細胞が洗い落とされ、さらにMEF支持層をできるだけ分解するためにすりつぶされる。各ウェルがすりつぶされた後、全てのウェルが、同量(4.2mL)のPM1(商標)+15%FBS+GFを含む50mLの円錐管にマイクロピペットで移された。1mLのPM‐1+15%FBS+GFが6ウェルプレートの初めの3つのウェルを洗浄するために用いられ、前回のステップからの細胞と合わせられ、今回のステップが6ウェルプレートの最後の3つのウェルで繰り返される。次に、細胞は400×gで5分間遠沈され、上清が真空吸引で吸引され、さらに200μLピペットが残りの上清を吸引するために用いられる。細胞は、β‐メルカプトエタノールおよびGFを含まない8mLのPM‐1+15%FBSに再懸濁される。2mLのこの細胞懸濁液が6ウェルの非接着プレートの4ウェルそれぞれにピペットで分注され、プレートが2‐9日間、2日おきに50%の培地を交換されながら37℃のインキュベータに置かれる。培地は、ウェルに1000μLの培地をピペットで加えることで交換される。
生殖細胞胚様体の形成:培養された雌のOG2のコロニーを含む6ウェルプレートが〜80%の集密で得られる(コロニーは相互に最低限で接触していた)。培地が吸引され、ウェルがPBSで1回洗浄され、700μLの暖めたトリプシンが各ウェルに添加された。次に、プレートが4分間、37℃のインキュベータ内に置かれる。6ウェルプレートの各ウェルは、MEF支持層の雌OG2の細胞が洗い落とされ、さらにMEF支持層をできるだけ分解するためにすりつぶされる。各ウェルがすりつぶされた後、全てのウェルが、同量(4.2mL)のPM1(商標)+15%FBS+GFを含む50mLの円錐管にマイクロピペットで移された。1mLのPM‐1+15%FBS+GFが6ウェルプレートの初めの3つのウェルを洗浄するために用いられ、前回のステップからの細胞と合わせられ、今回のステップが6ウェルプレートの最後の3つのウェルで繰り返される。次に、細胞は400×gで5分間遠沈され、上清が真空吸引で吸引され、さらに200μLピペットが残りの上清を吸引するために用いられる。細胞は、β‐メルカプトエタノールおよびGFを含まない8mLのPM‐1+15%FBSに再懸濁される。2mLのこの細胞懸濁液が6ウェルの非接着プレートの4ウェルそれぞれにピペットで分注され、プレートが2‐9日間、2日おきに50%の培地を交換されながら37℃のインキュベータに置かれる。培地は、ウェルに1000μLの培地をピペットで加えることで交換される。
担持卵巣組織の分解:生後4‐8日のLacZ/Oct4 GPF OG2マウスが単離され、上質の解剖用はさみで切り取られる。切り取った卵巣は、5%FCSとコラゲナーゼ(1.5mg/ml)とを含む2mlのHPES緩衝されたDMEMに移される。分解溶液中の卵巣は、10分おきに穏やかにピペッティングされながら、37℃の水槽の中で30分間保温される。5%FCSを含む12mlのHEPES緩衝されたDMEMが卵巣および分解混合物の分解の停止のために30分後に加えられる。細胞は、80×Gで10分間、4℃で遠沈される。上清が除去され、細胞が遠心分離で2回洗浄される。
分化のための生殖細胞と卵巣の支持細胞との混合物の調製
1個の卵巣由来の分解された細胞が各条件において生殖細胞のための支持細胞として用いられる。各条件からの100KのGS細胞が完全に分解されたOG2/LacZの卵巣細胞の沈殿物の1つに加えられる。GS細胞由来の末期のEB(6日目)のみに対して、100KのGS細胞を用いる代わりに、100の卵母細胞様細胞(40‐70μm)が手動で取り上げられ、完全に分解されたOG2/LacZの卵巣細胞の沈殿物に加えられる。細胞混合物は、穏やかなタッピングで完全に混合される。細胞は、80×Gで10分間、4℃で遠沈され、上清の全てが除去される。
1個の卵巣由来の分解された細胞が各条件において生殖細胞のための支持細胞として用いられる。各条件からの100KのGS細胞が完全に分解されたOG2/LacZの卵巣細胞の沈殿物の1つに加えられる。GS細胞由来の末期のEB(6日目)のみに対して、100KのGS細胞を用いる代わりに、100の卵母細胞様細胞(40‐70μm)が手動で取り上げられ、完全に分解されたOG2/LacZの卵巣細胞の沈殿物に加えられる。細胞混合物は、穏やかなタッピングで完全に混合される。細胞は、80×Gで10分間、4℃で遠沈され、上清の全てが除去される。
血液凝固血漿の作製:調整された細胞混合物は、80×Gで5分間遠沈される。上清は慎重に除去され、20μlの静脈血漿が加えられる。細胞と血漿とをよく混合するためにやさしくタッピングすることで、静脈血漿に細胞が再懸濁される。20μlの血漿と細胞とを取り、6cmの皿上に滴を形成し、1Mの塩化カルシウムを血漿滴に加える。皿に蓋をし、細胞を含む血漿滴を37℃のインキュベータに置く。30分間保温することで塊が形成される。30分の保温後、塊はゼラチンのような堅さに硬化し、卵巣に隣接する卵嚢に移植できる状態になる。
生殖細胞を含む静脈塊の卵嚢への移植:6‐8週齢のヌードマウスが0.5mlのアバチンで麻酔される。70%エタノールで受容個体マウスの背を拭き取り、上質の解剖用はさみによって、末端の肋骨の高さで正中線の近くで皮膚の2箇所を均一に小さく縦に(1cm未満)切開する(一方の切開が正中線の右側、他方が正中線の左側)。切開部がどちらも体壁を通して見える卵巣(オレンジ‐ピンク)または脂肪体(白)に重なるまで左または右に皮膚をずらす。次に、鉗子で体壁を持ち上げ、鉗子で卵巣のちょうど上を小さく切開する(大きい血管を避けながら)。ピンセットを用いて、脂肪体をつまみ、脂肪体に付着した左の卵巣、卵管および子宮を引き出す。脂肪体上に止血鉗子の留め具を滑らせ、卵巣、卵管および子宮が体壁の外側に維持されるように背にそれを据える。マウスをやさしく持ち上げ、左に頭を向けて立体顕微鏡のステージ上にそれを置く。慎重に卵巣に触れ、上質の解剖用はさみで卵嚢をわずかに切開する(2mm)。事前に作製した細胞を含む血漿塊を取り、卵巣の卵嚢におけるわずかな切開部に、慎重に塊が入れられる。鉗子を用いて、卵嚢の切開部に塊をやさしく置く。止血鉗子の留め具を緩め、立体顕微鏡のステージからマウスを降ろす。脂肪体を取り上げるために鉗子を用いて、卵巣、卵管および子宮を体壁の内側に戻す。1つまたは2つの縫い目(任意)で体壁を縫合し、創傷クリップで皮膚を閉じる。マウスの反対側(右側)でも繰り返す。翌日、移植されたマウスの一般的な健康を確かめる。移植から7日後に創傷クリップが外される。
生殖細胞を含む静脈塊のマウスの背における皮下領域への移植:マウスが卵嚢での移植からの麻酔下のままで、はさみを用いて2箇所の新たな切開部において皮膚から筋肉を分離する。各切開部を介して2個の塊を皮下領域に挿入する(マウスあたり計4個の塊)。一方の塊を切開部の右側、他方を切開部の左側に挿入する。さらに2個の塊のために、2つ目の切開部に対してこの方法を繰り返す。皮下に挿入された1個の塊は、28日間で7日おきに1回、外科的手術で取り出される。取り出された細胞は、5mlの4%パラホルムアルデヒドで固定され、OTCに組み込まれ、8μmで低温切片化され、卵胞の分化および増殖が形態によって生じるかどうかをみるためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色される。スライドは、必要であれば、卵母細胞特異的な抗体で染色される。
移植されたヌードマウスの交配:移植されたヌードマウスが術後21日で検証され、マウスが発情期に入ったか毎日調べられる。入り口の閉鎖はエストロゲン欠如の兆候とされ、再開口はエストロゲンの卵胞が移植片に現れた兆候とされる。膣が開いた後、または術後3週間で(どちらか早かったほう)、宿主の雌は生殖可能な雄と交配される。雌は、交尾の目印(膣栓)を毎日検査される。交尾した雌は、再び出産できる。移植から6‐12週間後、全ての宿主が解剖され、生殖器官が調べられる、卵巣被膜が取り出され、5mlの4%パラホルムアルデヒドで固定され、OTCに組み込まれ、8μmの低温切片化され、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色される。
実施例12
成人の精巣由来の再配置した精原幹細胞の同定と特徴付け
精原幹細胞(SSC)は、一生の間、自己再生および精子の継続的な産生によって精子形成を維持する。組織学的および超微形態的な研究は、非霊長類の哺乳動物においてAs(Aシングル)精原細胞が精子形成の幹細胞になると考えられることを示した。Aの精原細胞の分裂では、娘細胞が互いに離れるように移動し、2個の新たな幹細胞になるか、細胞間の架橋を介して共存し、A‐ペア(Apr)精原細胞になるかである。Apr精原細胞は、さらに4、8または16個の鎖状のA‐アライン(Aal)精原細胞に成長する。Aal精原細胞は、A1精原細胞に分化し、6回の有糸分裂後にA2、A3、A4および最終的に、B精原細胞になり、これらは、最後の有糸分裂で精母細胞に成長する。
成人の精巣由来の再配置した精原幹細胞の同定と特徴付け
精原幹細胞(SSC)は、一生の間、自己再生および精子の継続的な産生によって精子形成を維持する。組織学的および超微形態的な研究は、非霊長類の哺乳動物においてAs(Aシングル)精原細胞が精子形成の幹細胞になると考えられることを示した。Aの精原細胞の分裂では、娘細胞が互いに離れるように移動し、2個の新たな幹細胞になるか、細胞間の架橋を介して共存し、A‐ペア(Apr)精原細胞になるかである。Apr精原細胞は、さらに4、8または16個の鎖状のA‐アライン(Aal)精原細胞に成長する。Aal精原細胞は、A1精原細胞に分化し、6回の有糸分裂後にA2、A3、A4および最終的に、B精原細胞になり、これらは、最後の有糸分裂で精母細胞に成長する。
げっ歯類と異なり、ヒトおよび他の霊長類では核形態の標準的な組織学的研究が、AdarkとApaleと言われる2つの未分化の精原細胞が精細管上皮の基底膜に存在することを示唆している。悪性腫瘍および放射線ならびに化学治療のために半去勢を受けた患者由来の精巣生検の精原幹細胞の形態的な特徴付けは、ヒトの精巣の幹細胞がほとんどApaleである所見を示し、また、成体のアカゲザルの精巣での最近の研究は、Adark精原細胞がめったに分裂せず細胞毒性の損傷に続いて活性化される予備の幹細胞集団に存在し、一方、Apale精原細胞が通常の環境で精子形成を維持するための不変の自己再生分裂する活性のある幹細胞であることを示した。これは、ヒトおよび霊長類両方の精子形成が類似する個体発生であって、これら2つの種間でSSCの分集団の特性が類似すること示唆する。
一般に、特異的なマーカーを利用できないために、成人の精巣におけるSSCの表現型および分子的特性がほとんど理解されていない。アカゲザルを用いて、濃縮された、成体の霊長類の精巣由来のSSCの集団が特徴付けられ、単離された。霊長類のSSCの表面で見出されて選択されたマーカーの使用で、成人の精巣におけるSSCの異なる集団の独自性が研究された。さらに、ヒトSSCの濃縮された集団が受容個体マウスの精巣に移植され、受容個体マウスの精巣でヒトの精原幹細胞を再配置することの独自性が研究された。
物質および材料
組織の調製と細胞の単離:腫瘍の混入していない精巣組織が、精巣摘出を受けた患者から得られ、2人の患者から十分に供与された。精巣生検がTESE(精巣生検および精巣からの精子抽出)処置を受けた患者から得られた。全ての患者は、組織の収集前にインフォームドコンセントに署名していた。組織の小さな一部が抽出され、この研究に使われた。精巣組織および生検が外科的に取り出され、ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したPBSに入れられ、短くとも2時間から一晩、氷上で輸送された。精巣組織試料は、組織学的および分子生物学的解析のために取られた。残りの組織の精細管がよく細分化され、37℃の往復式の水槽で15分間、コラゲナーゼA(1mg/mL)およびデオキシリボヌクレアーゼ(10U/mL)で分解された。コラゲナーゼによる分解後、未分解の組織が沈降され、上清中の細胞が取り除かれた。未分解の組織は、DMEM中の1.5mg/mLのコラゲナーゼA、1.5mg/mLのヒアルロニダーゼV型、0.5mg/mLのトリプシンおよび10U/mLのデオキシリボヌクレアーゼからなる酵素混合物で、37℃の往復式の水槽で20分間、さらに分解された。残りの未分解の組織をこした後、単離された細胞が400gで10分間遠心分離された。細胞沈殿物はMEM+HEPES+5%FBSに再懸濁され、5%二酸化炭素の加湿培養器内に置かれている組織培養用に被覆された15cmの皿に入れられた。精巣生検試料は酵素混合物で分解されただけで、サイズが小さいため、1つの目的だけのために使われた。
フローサイトメトリーおよび磁化選別:細胞表面の特徴付けおよび選別のために、細胞が、CD90‐FITC、CD49f‐PEおよびCD117‐APCおよびSSEA‐4を含む霊長類のSSCの特徴付けに用いられる、選択された幹細胞マーカーで染色された(図10)。細胞は氷上で30分間、MEM+HEPES+5%FBS(完全培地)で染色され、一回洗浄され、完全培地に再懸濁され、フロー解析まで氷上で維持された。フロー解析は、OnFlux Cell Sorterで行われた。フルオレセイン(FITC)とフィコエリトリン(PE)が488nm、200mWのレーザーで励起され、発光が530/40および580/30バンドパスフィルターでそれぞれ集められた。アロフィコシアニン(APC)が638nm、25mWのレーザーで励起され、発光が670/40バンドパスフィルターで集められた。磁化選別では、細胞(200×106まで)がDMEM+10%FBSに再懸濁され、SSEA‐4‐ビオチンが加えられ(1:200)、2mMのEDTAが調製され、10分間脱気された。標識緩衝液がSSEA‐4に染色された細胞に加えられ、400gで10分間遠心分離された。SSEA‐4細胞は1.8mLの緩衝液に再懸濁され、200μLのストレプトアビジン微粒子が加えられた。また、フローサイトメトリーによる磁気的に分離された細胞の純度を調べることができるように、抗体に結合した100μLのSSEA‐4‐FITCが加えられた。さらに4℃で20分間、インキュベートされた。10mLの緩衝液がチューブに加えられ、400gで7分間、遠心分離された。
組織学的および免疫組織化学的染色:組織が4%パラホルムアルデヒド(PFA)で一晩かけて固定され、平衡のために一晩、20%スクロースに移された。組織は、OCT化合物で凍結され、低温切片が8μmの薄さに調製され、−80℃で保存された。組織学のために、切片がPBSで洗浄され、メイヤーヘマトキシンで5分間染色され、蒸留水で5分間洗浄され、水性封入媒体を用いて標本にされた。次に切片は、明視野の顕微鏡を用いて解析された。免疫組織化学染色では、精巣切片がブロックされ、0.1%Triton‐X/2%BSA/5%ヒツジ血清を用いて透過処理された。次にスライドが、表10に示された生殖細胞およびSSC特異的抗体で染色された。DAPIが核の可視化に用いられた。蒸留水での複数回の洗浄後、細胞が水性の蛍光保存料を用いて保存された。スライドは、Slide Book(商標)画像ソフトウェアを備えるオリンパスBX‐61顕微鏡を用いて解析された。定量的解析のため、スライド毎に約25の管横断面が計数され、4枚のスライドからのデータが合わせて集められ、この研究で示された。
RNA抽出およびリアルタイムPCR解析:細胞内の全RNAがRNeasy mini kit(キアジェン社)を用いて製造者の説明に基づいて単離された。そして、単離されたRNAは、Quantitect RTキット(キアジェン社)を用いてDNAに転写され、QIAquick PCR 精製キットで精製された。各RT‐PCR反応において、20ngのDNAテンプレートが、HotStar Taq Plusおよび異なる各プライマー(表11)と合わせて25μLの反応用量で用いられた。全ての標的cDNAが30サイクルで増幅された。増幅産物は、2%アガロースゲルにおけるサイズで同定された。QRT‐PCRに関して、5ngのcDNAテンプレートが、Quantitect Sybr Green PCR master mix(キアジェン社)およびバイオラッド社のiCyclerを用いて増幅された試料と合わせて25μLの反応用量で用いられた。各試料は、3重に試験され、GAPDH対照で標準化された。
テロメラーゼ試験:SYBR Greenリアルタイム定量的テロメア反復の増幅プロトコール(RQ‐TRAP)は、Wegeらの方法を適応させた(Wege H,Chui MS,LeHT,Tran JM,Zern MA(2003)SYBR Green real‐time telomeric repeat amplification protocol for the rapid quantification of telomerase activity.Nucl.Acids Res 31,e3.)。組織または細胞沈殿物がPBSで1回洗浄され、再懸濁され、1×Chaps lysis緩衝液および400U/mlのRNaseOut阻害剤を含む調製されたリシス緩衝液に1000細胞/μlの量で均一化された。氷上でのインキュベーションの25分後、細胞溶解物が4℃で10分間、最高速度で遠心分離された。次に、上清が新しいマイクロ遠心管に移され、タンパク質濃度がND‐1000分光光度計で280nmの吸光度において決定された。反応は、500ngのタンパク質溶解物、Quantitect SYBR Green PCR mix(キアジェン社)、1μgのTSプライマー、0.5μgのACXプライマーおよびヌクレアーゼが入ってない水を含む25μlの量で行われた。試験された全ての反応プレートに関して、各試料が、テンプレートのない対照(リシス緩衝液)、陽性対照(ESC細胞)を加えて3重に試験され、標準曲線がヒトESCタンパク質溶解物(100ng、200ng、40ng、8ng、1.6ng)から作成された。iCycler iQ5(バイオラッド社)を用いて、反応液が25℃で20分間、95℃で15分間インキュベートされ、95℃で30秒間さらに60℃で90秒間の40サイクルのPCRで増幅された。サイクル値の閾値(Ct)は、片対数増幅プロット(サイクル数に対する蛍光の対数増加)から決定され、標準曲線と比較された。ソフトウェアの閾値に関する初期値設定は、サイクル1を除いて、最初の10サイクルにおける各ウェルの蛍光値の標準偏差の平均の10倍である。テロメラーゼ活性は、ヒトESCに対する割合で表された。
精原幹細胞移植:精原幹細胞移植技術が受容個体マウスの精巣に定着した細胞集団の機能性評価に用いられた。8週齢の免疫不全無胸腺ヌード‐Foxn1nu雄マウス(ハーラン社)が腹腔内のブスルファン単回注射(40mg/kg)で処理され、受容個体として用いられた。ブスルファン処理から1ヵ月後、0.3‐0.8×106個の磁化選別された成人の精巣のSSEA‐4+が精巣網への注射を介して精細管に移植された。移植から4週間後、マウスが安楽死させられ、精巣が4%PFAで固定され、低温切片が作製された。マウスの精巣におけるヒトの精原幹細胞の同定は、ヒト核タンパク質抗体を他の幹細胞または生殖細胞マーカーと組み合わせて用いて評価した。全ての動物実験は、実験動物の管理および使用のためのガイドライン(米国学術研究会議)に従った。
統計解析:言及した場合を除いて、全ての実験は3回繰り返された。2標本スチューデントT検定および分散分析検定が統計解析に使われ、P<0.05が有意とされた。
結果
精原幹細胞の同定および濃縮:閉塞性無精子症の男性において収集された精巣生検から単離された細胞が正常なヒト精巣と同様の精原細胞の形態および分布を示したことは、これらの患者で精子形成が進行中であることを示している。平均0.5×106個の細胞が87%の生存能力をもって各試料から単離された。精原幹細胞が、細胞質に対する核の比が大きく、1‐3個の核小体および細胞質内封入体を備える円形細胞として、他の細胞の中で形態的に見分けることができ(図39)。精原幹細胞の濃縮に関して、成人の精巣組織から分離した細胞がフローサイトメトリーを用いて様々な細胞表面マーカーについて解析された。様々な幹細胞マーカーに染色された成人の精巣細胞の発現プロファイルが図43に示された。SSCの特徴付けに用いられた表面マーカーの中で、SSEA‐4は成体のアカゲザルの精巣におけるSSCでの発現を示し、ヒトの精巣で十分に発現した。精巣生検および供与された組織の両方から単離されたヒトの精巣細胞が試験され、13.3±1.4%の細胞が表面にSSEA‐4を発現することがわかった。げっ歯類および霊長類の精巣で挙げられたSSCマーカーの他のサブセットは、CD49f(α6‐インテグリン)CD‐90(Thy‐1)CD‐117(c‐Kit)、およびCD49f+CD‐90+/CD117−(3重染色)の組み合わせである。成人の精巣では、25±2.5%の細胞がCD49fを発現し、13±5%がCD90+である。興味深いことに、サルの精巣と比較して、ヒトの精巣では、3重染色された細胞の集団がなかった(図39E‐H)。
精原幹細胞の同定および濃縮:閉塞性無精子症の男性において収集された精巣生検から単離された細胞が正常なヒト精巣と同様の精原細胞の形態および分布を示したことは、これらの患者で精子形成が進行中であることを示している。平均0.5×106個の細胞が87%の生存能力をもって各試料から単離された。精原幹細胞が、細胞質に対する核の比が大きく、1‐3個の核小体および細胞質内封入体を備える円形細胞として、他の細胞の中で形態的に見分けることができ(図39)。精原幹細胞の濃縮に関して、成人の精巣組織から分離した細胞がフローサイトメトリーを用いて様々な細胞表面マーカーについて解析された。様々な幹細胞マーカーに染色された成人の精巣細胞の発現プロファイルが図43に示された。SSCの特徴付けに用いられた表面マーカーの中で、SSEA‐4は成体のアカゲザルの精巣におけるSSCでの発現を示し、ヒトの精巣で十分に発現した。精巣生検および供与された組織の両方から単離されたヒトの精巣細胞が試験され、13.3±1.4%の細胞が表面にSSEA‐4を発現することがわかった。げっ歯類および霊長類の精巣で挙げられたSSCマーカーの他のサブセットは、CD49f(α6‐インテグリン)CD‐90(Thy‐1)CD‐117(c‐Kit)、およびCD49f+CD‐90+/CD117−(3重染色)の組み合わせである。成人の精巣では、25±2.5%の細胞がCD49fを発現し、13±5%がCD90+である。興味深いことに、サルの精巣と比較して、ヒトの精巣では、3重染色された細胞の集団がなかった(図39E‐H)。
精巣切片の組織学的および免疫組織化学的な染色:組織学的検討は、ヘマトキシリン‐エオシン染色した場合、供与された組織との比較において精巣生検が類似する形態をしていることが明らかになった(図39A‐B)。ヒトの精巣組織が、分布とヒトSSCのマーカーの発現をよく理解するための免疫組織染色試験のために取られた。SSEA‐4およびα6‐インテグリンとしても知られるCD49fが成人の精巣で興味深い発現パターンを有し、それは、サルの精巣で以前観察されたものにとてもよく似ている(図40)。組織学的な定量によれば、精細管の基底膜の近傍にあるほとんど全ての生殖細胞は、げっ歯類およびサルのSSCおよび他の多分化能の幹細胞の表面に見られたマーカーであるCD49fを発現する(管横断面に対して28.7±1.2)。また、精細管の基底膜の間にある多くの細胞はSSEA‐4を発現し(管横断面に対して18±1)、多能性マーカーがヒト胚幹(ES)、胚生殖(EG)細胞および成体のアカゲザルのSSCで見られた。興味深いことに、SSEA‐4+細胞の大部分には(83.3%)、CD49fが共局在している。特異的な免疫反応は、成人の精巣でCD90について見られなかった。予想外に、ほとんどの生殖細胞は、幹細胞因子に対する受容体および生殖細胞分化の早期マーカーであるc‐Kitをその表面よりはむしろ核内にとどめていたことが観察された。約75%のSSEA‐4+細胞がc‐Kitと共局在したことは、成人の精巣に2つの異なる集団の存在の可能性を示唆している。また、CD49fおよびc‐Kitの共局在は、精細管の基底膜でCD49f+細胞のほとんどが(73.6%)、c‐Kitをともに発現しており、これは、SSEA‐4のそれと類似する。全てのSSEA‐4+細胞は、生殖細胞マーカーVASAに対して陽性である一方、CD‐49f+細胞の50%だけがVASAの染色を示したことは、CD‐49fが精巣の体細胞の表面でも発現されることを示唆している。これに対し、黄体形成ホルモン受容体(LHR)が精細管のVASA+細胞で発現しないが、ヒトの精巣においてセルトリおよびライディッヒ細胞の細胞質でのみ発現されることは、LHRが成人の精巣において生殖細胞ではなく体細胞のみで発現されることを示している(図44)。Oct‐4を発現するヒトの精巣の基底膜に明らかな細胞の集団があったことは、多能性特性を備えるヒトのSSCの中に細胞の集団があることを示している。
リアルタイムPCRおよびテロメラーゼ試験:精原幹細胞特異的な発現を調べるために、遺伝子発現解析がSSEA‐4+およびSSEA‐4−細胞に対して行われた。c‐Kit、GFRα‐1、PLZF,C‐RetおよびGPR‐125を含む全ての遺伝子がSSEA‐4+の集団で少なくとも3倍から7倍多く発現した(図41A)。特に、SSEA‐4+細胞は、FGFR‐3においてかなり高い(24倍)発現レベルを示したことは(データを示さず)、FGFR‐3およびそのリガンドFGF9がヒトSSCの増殖および自己再生に関連があることを示している。さらに、SSEA‐4選別された細胞でのh‐TERTのより高い発現レベルは、それらの高いレベルのテロメラーゼ活性およびそれらの再配置能力を示す。SSEA‐4陽性選別された細胞が、テロメラーゼ活性に関して、ヒト胚幹細胞(hESC)と対照して精巣由来の非選別の細胞と比較された(図41B)。非選別の細胞は、hESC(100%)と比較して、平均10.4%±10.32%のテロメラーゼ活性を示したが、SSEA‐4+細胞は、非選別の細胞の54.5%(+/−7.8%)と比較して、約5倍多く発現し、また、hESCのテロメラーゼの発現より約2倍小さかった。このことは、上方調節されたh‐TERTの発現の知見を支持し、少なくともSSEA‐4陽性の細胞での複製能力の延長を示唆する。
精原幹細胞移植:共局在研究は、ヒトの精原幹細胞の濃縮された集団を移植されたマウスの精巣で行われ、それらの定着効率を評価し、およびマウスの精巣で再配置したヒトのSSCの表面で発現されるマーカーを明らかにする。これらマーカーの局在のまとめが表12に示されている。SSEA‐4、CD49f、およびc‐KitとともにHNPを用いて、ヒト核タンパク質に陽性である細胞の28.1%(±3.6%)がCD49fに陽性であって、94.9%(±1.3%)がc‐Kitに陽性であって、14.2%(±3.6%)がSSEA‐4に陽性である。さらに我々はSSEA‐4+細胞の100%がc‐Kitにも陽性であることを見出し、さらに、SSEA‐4+/c‐Kit+細胞のみが受容個体マウスの精巣に統合され得る可能性を示唆し、従って、これは、SSEA‐4+の集団の中で自己再生しているSSCである。α6‐インテグリンおよびSSEA‐4に関する共局在研究は、95.63%(±1.6%)のSSEA‐4+細胞がα6‐インテグリンに対しても陽性であることを示した。これらの結果と、HNPとのα6‐インテグリンの共局在、SSEA‐4ならびにHNPの2倍を超える発現、α6‐インテグリン+細胞の2つの集団、α6‐インテグリン+/SSEA4+およびα6‐インテグリン+SSEA‐4−という事実を考慮すると、SSCは受容個体の精巣に再配置できる。また、α6‐インテグリン+細胞は一体化された細胞の約4分の1だけの割合を占めることが言及されるべきであって、これは、SSCの約75%が一体化されたうえ、フローサイトメトリーによる表面マーカーで特徴付けられたことを意味する。しかし、ほとんど全ての一体化された細胞はc‐Kitで陽性に染色されるが、それはほとんどの細胞において核に局在し、c‐Kit+細胞はフローサイトメトリーで検出されなかった(図43)。他の細胞表面マーカーとHNPの共局在は、マウスの精巣に定着したヒトのSSCがマウスのSSC表面で発現されるマーカーである、CD‐29(β1‐インテグリン)を発現しないことを明らかにした(図42)。しかし、42.8%のHNP細胞がGPR‐125と共局在したことは、このマーカーがヒトのSSCを再配置する集団の表面に発現されることを示している。また、28.3%のHNP陽性細胞が多能性マーカーNanogと共局在することは、ヒトSSCを再配置する約3分の1が多能性特性を備えることを示唆している。
考察
本研究は、成人の精巣における精原幹細胞が表現型および分子的特性においてマウスと異なり、同一ではないが霊長類のSSCに類似することを明示している。第1に、ヒトの精巣切片および単離された細胞における選択されたマーカーの局在と発現が検討された。免疫染色化学的な検討は、試験されたマーカーの中で、SSEA‐4が特異的にヒトのSSCの表面で発現されることを示した。全てのSSEA‐4細胞は、精細管の基底膜に局在し、生殖細胞マーカーVASAを共局在していた。これは、成体の霊長類の精巣においてすでに得られた所見に極めて類似する。しかし、成体の精巣におけるSSEA‐4+細胞の割合は、サル(2%)の精巣よりもヒトでかなり高かった(13%)。また、分子生物学的解析では、SSEA‐4選別された細胞がSSC特異的な全ての遺伝子のより高い発現レベルと高いレベルのテロメラーゼ活性を有することは、この集団に精原幹細胞が存在することを示す。以前の研究は、マウスおよび成体の霊長類の精巣由来のSSCがCD49fおよびCD90を発現し、CD‐117に陰性であることを示した。単離されたヒトの精巣細胞におけるCD49fおよびCD90の発現はすでに報告されている。この免疫組織化学研究が、ヒトの精巣におけるCD49fは精細管の基底膜に局在したことを示したことで、このマーカーがSSCに加えて分化しているA型の精原細胞で発現していることを示唆している。また、精細管の外側での一部のCD49f陽性細胞の発現は、CD49fがヒトのSSCでは発現しているが、特異的なマーカーではなく、ヒトの精巣由来のSSCの濃縮に単独で用いることができないことを示唆している。フローサイトメトリー解析は、免疫組織化学染色を確認し、CD49fまたはCD90に陽性に染色される成人の精巣内における異なる細胞の集団は存在するが、霊長類とは対照的に、ヒトの精巣には、2重陽性の細胞が存在する集団がないことを示した。SSEA‐4と同様に、CD49f+およびCD90+細胞の割合も、サルの精巣と比較して成人の精巣においてずいぶん高かった。
本研究は、成人の精巣における精原幹細胞が表現型および分子的特性においてマウスと異なり、同一ではないが霊長類のSSCに類似することを明示している。第1に、ヒトの精巣切片および単離された細胞における選択されたマーカーの局在と発現が検討された。免疫染色化学的な検討は、試験されたマーカーの中で、SSEA‐4が特異的にヒトのSSCの表面で発現されることを示した。全てのSSEA‐4細胞は、精細管の基底膜に局在し、生殖細胞マーカーVASAを共局在していた。これは、成体の霊長類の精巣においてすでに得られた所見に極めて類似する。しかし、成体の精巣におけるSSEA‐4+細胞の割合は、サル(2%)の精巣よりもヒトでかなり高かった(13%)。また、分子生物学的解析では、SSEA‐4選別された細胞がSSC特異的な全ての遺伝子のより高い発現レベルと高いレベルのテロメラーゼ活性を有することは、この集団に精原幹細胞が存在することを示す。以前の研究は、マウスおよび成体の霊長類の精巣由来のSSCがCD49fおよびCD90を発現し、CD‐117に陰性であることを示した。単離されたヒトの精巣細胞におけるCD49fおよびCD90の発現はすでに報告されている。この免疫組織化学研究が、ヒトの精巣におけるCD49fは精細管の基底膜に局在したことを示したことで、このマーカーがSSCに加えて分化しているA型の精原細胞で発現していることを示唆している。また、精細管の外側での一部のCD49f陽性細胞の発現は、CD49fがヒトのSSCでは発現しているが、特異的なマーカーではなく、ヒトの精巣由来のSSCの濃縮に単独で用いることができないことを示唆している。フローサイトメトリー解析は、免疫組織化学染色を確認し、CD49fまたはCD90に陽性に染色される成人の精巣内における異なる細胞の集団は存在するが、霊長類とは対照的に、ヒトの精巣には、2重陽性の細胞が存在する集団がないことを示した。SSEA‐4と同様に、CD49f+およびCD90+細胞の割合も、サルの精巣と比較して成人の精巣においてずいぶん高かった。
フローサイトメトリー解析が、成人の精巣にCD117+細胞はほとんどないことを示した一方で、免疫組織化学染色は、精細管の基底膜の多くの細胞およびヒトの精巣のルミナー区画の細胞にc‐Kitの局在を示した。ヒトの精巣でのc‐Kitタンパク質の類似する局在パターンが他の研究者によって報告された。最近、未分化の精原細胞におけるc‐Kitの発現が段階特異的であることが示されたことは、ヒトの精子形成の早期段階に対するこのタンパク質の関与を示唆している。c‐Kitは、チロシンキナーゼ膜タンパク質であって、造血幹細胞および前駆体細胞、そして生殖腺を含むいくつかの非造血組織で発現される。移動および定着、増殖および分化を含む生殖細胞の成長における様々な機能にc‐Kitおよびそのリガンドである幹細胞因子(SCF)の関与を示す、かなり具体的な証拠がある。成人の精巣における細胞は、その膜ではなく、その核にc‐Kitタンパク質を発現する。c‐Kitの核での局在は、これらの細胞がなぜフローサイトメトリーで検出されないのかを説明する。c‐Kitは一般には膜タンパク質であるが、細胞質および核での局在が報告されている。SSEA‐4とc‐Kitとの重複する局在は、成人の精巣でのSSEA‐4+細胞の2つの集団、つまり一方はc‐Kitの発現があり、他方はc‐Kitの発現がないことを示した。マウスでの研究に基づいて、SSCはc‐Kitに対して陰性であることが示された。
成体の霊長類では、SSEA‐4+細胞は、受容個体マウスの精巣に再配置でき、活発に分裂する精原幹細胞の集団である。ヒトのSSCは、SSEA‐4の磁化選別によって精製され、SSEA‐4+細胞がブスルファン処理された受容個体マウスの精巣に移植された。SSEA‐4+細胞が移植後にマウスの精細管の大部分の基底膜で見られたことは、この集団に機能的なSSCが存在することを示唆している。驚くべきことに、受容個体の精巣に定着したヒトの全ての細胞がc‐Kit+であったことは、SSEA‐4で選別された細胞のc‐Kit+分画のみが受容個体の精巣に定着でき、ひいては、これが該細胞ヒトの精巣において活性のあるSSCであることを示唆している。また、RT‐PCR解析は、SSEA‐4で選別された細胞がc‐KitおよびFGFR3のかなり高い発現レベルを有することを明らかにした。ヒトのSSCにおけるc‐Kitの発現は、この受容体およびそのリガンドCSFの、ヒトSSCの定着および/または再配置への関与を示唆する。c‐KitおよびSCFが生殖細胞の移動、接着および増殖の鍵となる因子であることを示すかなり具体的な証拠がある。また、ヒトのSSCにおけるFGFR3の高い発現は、ヒトのSSCの増殖および自己再生におけるそのリガンドの関与を示唆するであろう。線維芽細胞増殖因子(FGF)およびその受容体(FGFR)は、初期の胚および生殖細胞の成長に関する鍵となるシグナル分子である。FGFは、マウスおよびヒトのSSCの生存と維持を促進することが示された。生体外での研究は、FGF9がFGFR3に対するかなり可能性のあるリガンドであることを示した。従って、ヒトのSSCの培養培地にFGF9およびSCFを加えることは、生体外でのそれらの生存と増殖に有利である。
また、マウスの精巣に一体化されたヒト細胞の分集団がその表面にGPR‐125を発現したことは、このマーカーもヒトのSSCの再配置において発現することを示唆する。マウスおよびヒトの精巣切片におけるGPR‐125の発現が報告された。マウスの精巣にヒトのSSCを再配置する分集団は、多能性マーカーNanogに陽性に染色される。一部のSSCにおける多能性マーカーNanogおよびSSEA‐4の発現は、成人の精巣内のSSCの分集団が他の細胞系統に分化するための多能性の能力を有することを示唆する。マウスおよびヒトの精巣由来の多分化能の細胞系統の発生は、ヒトのSSCの多分化性を支持し、生殖能力の回復の他に再生疾患に対するこれらの細胞の臨床的な応用を示唆する。一方、ヒトの精巣における免疫学的局在決定において、Nanogは未分化のSSCのみに限定されず、精細管の内腔でさえも含む全ての生殖細胞に局在した。この所見は、成体の霊長類の精巣と酷似しており、進化した生殖細胞での転写因子Nanogの異なる役割を示唆している。Nanogの役割の特性は、未だに決定されていないが、多能性マーカーOct‐4が生殖細胞では生存因子であって、その下方調節は分化よりもむしろアポトーシスおよび細胞死をもたらすことが報告された。
また、移植研究は、精原幹細胞の定着に関して、ヒトとマウスの精細管の間で特定の適合性を示した。興味深いことに、受容個体マウスの精巣におけるSSEA‐4+細胞(14%)およびCD49f+細胞(28%)の割合がヒトの精巣のそれと酷似(SSEA‐4に対して13%およびCD49fに対して27%)したことは、自然の環境にかなり類似したレベルで、ヒトのSSCが空のマウスの精巣に定着し、かつ再配置する能力を備えることを示唆しており、これは、マウスの精巣がヒトのSSCの定着に適した環境を提供することを意味している。しかし、精原細胞の限られた増殖を超えるさらなる成長は、本研究でもウシ、ブタ、霊長類およびヒトのSSCを用いた従来の研究でもまったく見られなかった。マウスの精巣は、より高度な種由来の完全な精子形成を支持するのに適した環境を提供できないが、精細管のその基底膜は、ヒトの精巣と酷似する形式でヒトの精原幹細胞を選択的に引き付け、保護する能力を有する。
まとめると、成人の精巣内で再配置する精原幹細胞は、SSEA‐4+、CD49f+、CD90+、GPR‐125+およびc‐Kit+の表現型の特性を有する。約3分の1のSSCがNanogを発現することは、成人の精巣において多能性特性を備える精原幹細胞の集団の存在を示唆している。この結果は、臨床応用、培養の拡大または分化の目的のために、成人の精巣由来の精原幹細胞の単離および精製に直接的に関係する。さらに、ヒトのSSCの分集団での多能性マーカーの発現は、細胞置換療法および組織再生に関するこれらの細胞の可能性のある用途を示唆する。
実施例13
マウスの精原細胞の宿主外での成熟
本研究は、未成熟なマウスから単離された精巣の細胞が定着でき、かつ人工の精細管で精子形成を再びできるかを調べることを目的とする。内径250μm、外径300μmの医療仕様のポリエチレンチューブ(タイゴン社)が10cm片に切られ、30ゲージ針に接続され、人工の精細管として用いられた。チューブは、1mlの70%エタノールで洗浄され、蒸留水と清浄な空気で3回洗浄された。精巣の細胞外基質がTriton‐X‐100とデオキシコール酸の混合物を用いた37℃、24時間の脱細胞化によって、2匹の成体マウスから抽出され、往復式振とう培養機上で37℃、24時間のトリプシンおよびEDTAによって分解された。抽出されたECMは、37℃で30分間、コラゲナーゼ(1mg/ml)で可溶化され、次に、コラゲナーゼがEDTAを加えることで不活性化された。可溶化されたECMは、小さい分割量で−20℃に保管された。チューブに細胞を入れる前日に、チューブはECMで被覆され、殺菌のため紫外線下、室温で2時間インキュベートされ、使用するまで4℃で保持された。
マウスの精原細胞の宿主外での成熟
本研究は、未成熟なマウスから単離された精巣の細胞が定着でき、かつ人工の精細管で精子形成を再びできるかを調べることを目的とする。内径250μm、外径300μmの医療仕様のポリエチレンチューブ(タイゴン社)が10cm片に切られ、30ゲージ針に接続され、人工の精細管として用いられた。チューブは、1mlの70%エタノールで洗浄され、蒸留水と清浄な空気で3回洗浄された。精巣の細胞外基質がTriton‐X‐100とデオキシコール酸の混合物を用いた37℃、24時間の脱細胞化によって、2匹の成体マウスから抽出され、往復式振とう培養機上で37℃、24時間のトリプシンおよびEDTAによって分解された。抽出されたECMは、37℃で30分間、コラゲナーゼ(1mg/ml)で可溶化され、次に、コラゲナーゼがEDTAを加えることで不活性化された。可溶化されたECMは、小さい分割量で−20℃に保管された。チューブに細胞を入れる前日に、チューブはECMで被覆され、殺菌のため紫外線下、室温で2時間インキュベートされ、使用するまで4℃で保持された。
未成熟な(生後3‐4日)GFPまたはOG2マウス由来の精巣が単離され、1‐2×104/μlの濃度で入れられた。約10μlの細胞懸濁液が各チューブを満たすのに必要だった。次に、チューブは、GDNF、FGF,EGF、およびLIFを含む成長因子を添加した8mlのPM‐1(商標)培地を含む6cmの皿に置かれ、5%二酸化炭素を含む加湿された空気中で、32℃で培養された。培地は、チューブ内に加え、6cmの皿内で1日おきに交換された。培養は21日間継続され、チューブが解剖学的な検討のために光学顕微鏡下で毎日観察された。培養から7日後、FSH(20ng/ml)、SCF(30ng/ml)およびレチノイン酸(0.5μM)を含む成熟誘導因子が添加された。培養から14日後、GDNF、FGF,EGF、およびLIFを培地から除去し、一部のチューブの内容物が1mlの注射器で流し出され、試料が組織学的およびDNA含有量の解析のために採取された。さらに、一部の細胞がRNA抽出と遺伝子発現解析に用いられた。いくつかの実験では、チューブはECMで被覆されず、他のいくつかの実験では、成熟誘導因子単独または他の因子(GDNF、FGF、EGFおよびLIF)の異なる組み合わせで試験された。培養期間の最後に、精子細胞および精子の形態である細胞が収集され、ICSIまたは生体外受精(IVF)によって、卵子を受精する能力が評価された。さらに、受精した卵子を胚に成長させる能力が評価された。また、胚はGFPの発現および成長の能力について試験され、胚が母体に移植されてからの期間が評価された。
生後4日のOG2マウス由来の精巣切片の組織学的検討は、精細管内において、未発達な生殖細胞および未成熟なセルトリ細胞のみが存在し、精巣発生のこの段階で発達した生殖細胞が見られないことを示した。チューブの光学顕微鏡観察は、精巣の細胞がチューブに付着し、培養の最初の1週間でその数が増加したことを明らかにした(図53A)。ECMで被覆されたチューブは、被覆されていないチューブよりも多くの細胞を含んでいた。様々な大きさの生殖細胞コロニーがチューブ外に見られた。一部の領域で、コロニーがより豊富で、一部では、細胞が完全にチューブの表面を覆っていた。7日後のチューブの断片のH&EおよびDAPI染色は、光学顕微鏡での検討を確認し、チューブ内のコロニーおよび細胞の鎖の存在を示した(図53B‐D)。7日および14日後に集められた細胞の光学顕微鏡での観察は、円形で細長い精子細胞に形態的に類似する小さな細胞の存在を示した。また、核が濃縮され、精子の頭部に類似するいくつかのかなり小さい細胞が見られた。H&E染色は、円形の精子細胞および精子の頭部に類似する細胞の存在を確認した。ピーナッツ凝集素(PNA)、アクロソームおよび先体小胞を特異的に染色するレクチンの免疫組織化学的な局在が円形細胞および濃縮された細胞がPNAを発現することを示したことは、これらの細胞における先体構造の存在を示唆している(図53E)。培養から18日後、さらに細長い細胞が見られ、細長い精子細胞に類似していた(図47)。また、頭部、アクロソーム、中央部分および尾を含む成熟した精子に見える細胞が皿に付着して見られた(図48)。培養から10日後、泳ぐ精子が見られ、実験が進むにつれてその数は増加した。
人工の管で産生された精子の受精能力がIVFの手順で試験された。8週齢の雌のCD‐1マウスがPMSG(10 IU)の注射に続けてPMSG注射の62時間後のHCG(20 IU)で特別に排卵させられた。HCGの12時間後、マウスが安楽死させられ、卵子が回収され、0.1%のヒアルロニダーゼで露出され、鉱油下で100μMのM2培地に移された。培養22日後に人工の精細管が1ml注射器で洗い流され、細胞が回収され、4℃で10分間、800×Gで遠心分離された。上清が取り除かれ、細胞が200μlのヒト管液(HTF)に再懸濁され、32℃に維持された。人工管から集められた30μlの細胞懸濁液が卵子に加えられた。37℃で一晩インキュベーションした後、ほとんどの卵子(6/7)が胚に成長した(図49)。生体外で産生された胚の確認は、GFP PCRで行われた。
成体の精巣のECMで被覆された人工管は、精原細胞の成熟を促進する。精母細胞の形態および性質を備える細胞が見られたことは、培養5‐7日後に減数分裂に入ったことを示している。また、円形の精子細胞および細長い精子細胞の形態を備える細胞が見られたことは、生殖細胞の一部が精子形成に入ったことを示している。核濃縮がほとんどの細胞で起きたが、伸長は完全ではなく、遅れた。これらの細胞は、明らかに濃縮された頭部、アクロソーム、中間部分および尾を含む完全に成熟した精子の全ての特徴を含んでいた。人工管で産生された精子が生体外での受精で卵子を受精させたことは、これらの細胞が卵子まで泳ぎ、透明帯に結合し、帯に移行し、卵細胞膜に融合する能力を有することを示唆している。
実施例14
マウスの卵巣生殖系列細胞の宿主外での成熟
マウスの卵巣由来の卵巣生殖系列細胞(OGSC)は、直径40‐60μmであって、初期の卵母細部に類似する卵母細胞様の細胞を産生できる。これらの細胞は、顆粒膜細胞を用いた卵胞工学、それに続く卵胞の生体外での成長または卵巣切除したマウスへの卵胞の移植‐マウス宿主外/生体内での成熟によってさらに成熟される。
マウスの卵巣生殖系列細胞の宿主外での成熟
マウスの卵巣由来の卵巣生殖系列細胞(OGSC)は、直径40‐60μmであって、初期の卵母細部に類似する卵母細胞様の細胞を産生できる。これらの細胞は、顆粒膜細胞を用いた卵胞工学、それに続く卵胞の生体外での成長または卵巣切除したマウスへの卵胞の移植‐マウス宿主外/生体内での成熟によってさらに成熟される。
記載がない限り、本明細書および特許請求の範囲で用いられる構成要素の量、分子量、反応条件、その他のような特性を表す全ての数字は、どの場合においても用語「約」によって修飾されるものとして理解されるべきである。従って、そうでないことが示されない限り、前述の明細書および添付の特許請求の範囲で示される数値パラメータは、本発明で目標とする所望の特性に応じて、変化し得る近似値である。少なくとも特許請求の範囲への均等論の適用の範囲に限らずとも、各数値パラメータは、報告された有効桁の数の知識および通常の周辺技術を適用することによって、少なくとも構成されるべきである。本発明の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例で示されたその数値は、できるだけ正確に報告される。しかしながら、いずれの数値も、それぞれの試験測定系で見られる標準偏差がもたらすある程度の誤りを、やむを得ず本質的に含む。
用語「a」、「an」、「the」および本発明を記載する文脈(特に、添付の特許請求の範囲の文脈)において使用される同様の指示対象は、本明細書中で特に示されないか、または文脈によって明確に否定されない限り、単数形および複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。本明細書中の数値の範囲の記述は、単に、その範囲内に納まるそれぞれ別個の値を個別に参照する略記法として機能することが意図される。本明細書中で特に示されない限り、それぞれ個々の値は、あたかもそれが本明細書に個別に引用されるかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で特に示されないか、そうでなければ文脈によって明確に否定されない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書中に提供される任意かつ全ての例、または例示的な言語(例えば、「等の(such as)」)の使用は、単に、本発明を十分に明らかにすることが意図され、そして別に特許請求された本発明の範囲を限定しない。本明細書中の言語は、本発明の実施に必須である任意の特許請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
本明細書で開示された本発明の択一的な要素および実施の形態の分類は、限定として解釈されない。グループの各構成要素は、個々にまたはその群の他の構成要素または本明細書に記載された他の構成要素とのあらゆる組み合わせにおいて言及され、特許請求される。利便性および/または特許性を理由に、群の1つまたは複数の構成要素が群に含まれ、または除かれることが見込まれる。任意のこのような包含または削除があるときでも、明細書はここで変更され、そうして添付の特許請求の範囲に用いられた全てのマルークシュ群の記載を満たす群を含むものと見なされる。
本発明のいくつかの実施形態が明細書中に記載され、それは、本発明を実施するために本発明者らが知り得る最良の形態を含む。当然に、それらの実施形態の変形例は、上述の説明を読む際に当業者にとって明らかとなる。本発明者は、当業者に、適切な場合にこのような変形例を使用することを期待し、そして本発明者は、本発明について、本明細書中に具体的に記載されるものとは異なる方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適切な原理によって許容されるような、ここに添付された特許請求の範囲において列挙される対象事項の全ての改変および均等なものを含む。さらに、上記の要素のあらゆる組み合わせが、本明細書中で特に示されないか、またはそうでなければ文脈によって明確に否定されない限り、その全ての可能な変形例において本発明に包含される。
さらに、多くの参照は、本明細書全体を通して特許および出版刊行物に対してなされている。上記の引用された参考文献および出版刊行物の各々は、その全体が本明細書中に参考として個別に援用される。
本明細書で開示された特定の実施の形態は、言語の含むまたは実質上含むを用いて特許請求の範囲をさらに限定することができる。特許請求の範囲で用いられるとき、出願または補正時に追加されても、移行用語「を含む」は、特許請求の範囲で特定されていないあらゆる要素、ステップまたは成分を排除する。移行用語「を実質上含む」は、特許請求の範囲を、特定された物質またはステップに限定し、かつそれらは基本のおよび新規の特性に実質的に影響しない。主張した本発明の実施の形態は、本質的に、または明確に記載され、本明細書で使用可能である。
最後に、本明細書中で開示される本発明の実施形態は、本発明の原理の例示であることが理解されるべきである。使用され得る他の改変は、本発明の範囲内である。したがって、限定ではないが例として、本発明の代替的な構成は、本明細書中の教示に従って利用され得る。したがって、本発明は、明確に示されかつ記載されるものに限定されない。
(関連出願の相互参照)
本願は、2009年11月5日に出願された米国仮出願番号第61/258,535号に対する利益を、米国特許法第119条(e)に基づいて主張し、その全体が参照することにより組み込まれる。
本願は、2009年11月5日に出願された米国仮出願番号第61/258,535号に対する利益を、米国特許法第119条(e)に基づいて主張し、その全体が参照することにより組み込まれる。
Claims (15)
- 精巣または卵巣から未成熟な生殖系列細胞を得るステップと、
本来の宿主内で前記細胞が生体内で成熟する条件を模擬した条件下で、前記未成熟な生殖系列細胞を生体外または本来のドナーを除く代理動物の生体内で培養し、前記培養が機能的な精子または卵子への前記未成熟な生殖系列細胞の成熟をもたらすステップと、
を含む、未成熟な生殖系列細胞を配偶子に宿主外で成熟させる方法。 - 前記未成熟な生殖系列細胞は、
思春期前の患者から得られる、
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記未成熟な生殖系列細胞は、
成熟前に低温保存される、
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記未成熟な生殖系列細胞は、
生殖系列幹細胞または減数分裂前の生殖細胞である、
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記培養は、
人工の精細管での未成熟な精巣の生殖系列細胞の培養を含む、
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記培養は、
グリア細胞株由来成長因子、線維芽細胞増殖因子、白血病抑制因子および上皮細胞増殖因子からなる群から選択される少なくとも1つの成長促進因子の存在下での未成熟な精巣の生殖系列細胞の培養を含む、
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記培養は、
卵胞刺激ホルモン、幹細胞因子およびレチノイン酸からなる群から選択される少なくとも1つの成熟誘導因子の存在下での未成熟な精巣の生殖系列細胞の培養を含む、
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記人工の精細管は、
細胞外基質で被覆された生体適合性のチューブを備える、
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記細胞外基質は、
精巣の細胞外基質である、
ことを特徴とする請求項8に記載の方法。 - 前記精巣の細胞外基質は、
前記精巣の生殖系列細胞に自己移植される、
ことを特徴とする請求項9に記載の方法。 - 前記培養は、
顆粒膜細胞およびフィブリン塊の存在下における未成熟な卵巣の生殖系列細胞の培養を含む、
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記培養は、
グリア細胞株由来成長因子、線維芽細胞増殖因子、白血病抑制因子、上皮細胞増殖因子および成長ホルモンを含む成長促進因子の存在下で培養された未成熟な卵巣の生殖系列細胞の培養を含む、
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記培養は、
卵胞刺激ホルモン、幹細胞因子およびレチノイン酸を含む成熟誘導因子の存在下で培養された未成熟な卵巣の生殖系列細胞の培養を含む、
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記フィブリン塊は、
前記卵巣の生殖系列細胞に自己移植される、
ことを特徴とする請求項11に記載の方法。 - 前記顆粒膜細胞は、
前記卵巣の生殖系列細胞に自己移植される、
ことを特徴とする請求項11に記載の方法。
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