WO2005020679A1 - 凍結精子幹細胞由来の子孫を作成する方法 - Google Patents
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- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/50—Amphibians, e.g. Xenopus
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
Definitions
- the present invention relates to a reproductive technique, and more particularly, to a method for producing a progeny derived from a frozen sperm stem cell of an animal.
- cryopreserved spermatozoa are available for treatment of reproductive abnormalities in vertebrates including humans, production of livestock, etc., and maintenance of species.
- Embryo and sperm freezing methods are used for preserving strains of livestock such as cattle.
- spermatozoa frozen in liquid nitrogen, thawed, subjected to artificial insemination or in vitro fertilization, transplanted the resulting egg cells into the oviduct of a pseudopregnant foster parent, and bred the transplanted animal for the desired purpose.
- sperm preservation methods vary significantly between species, and general methods have not been established. For example, spermatozoa of C57BL / 6 (B6) mice used in experiments are in a state where there is no effective sperm freezing method.
- the storage of spermatozoa requires the supply of liquid nitrogen, so long-term storage is costly, and special consideration must be given to packaging for its transportation.
- fertilization requires a certain amount of sperm, but cryopreserved spermatozoa cannot be increased in vitro, and a large amount must be collected and cryopreserved.
- spermatogenesis in animals usually involves the testis or its equivalent in adult humans
- Reproductive stem cells eg, spermatogonia
- sperm stem cells spermatogonia
- sperm stem cells become spermatocytes
- sperm cells are formed by meiosis
- these sperm cells change morphologically to become spermatozoa.
- the reproductive stem cells will be described as sperm stem cells.
- sperm stem cells are stable against freezing and thawing and can be easily propagated in vitro (Japanese Patent Application No. 2003-110821), as well as radioactivity and temperature. Extremely high stability against storage, transportation, etc. In other words, sperm stem cells can be used to collect spermatozoa without spermatozoa, or to obtain individual strength with a small amount of sperm. Re has advantages. Therefore, if reproductive techniques to obtain sperm stem cell-derived individuals are established, there is a risk of infertility in breeding livestock, preserving rare animal species, and treating male infertility in humans, chemotherapy, and radiation therapy. It is considered to be extremely useful for infertility recovery of certain patients. At present, it is known that spermatogonial stem cells can be cryopreserved while maintaining their spermatogenesis ability in almost the same manner across species such as hamsters, rats, monkeys, humans, mice and pigs.
- Non-Patent Document 1 A method for transplanting sperm stem cells was introduced by Brinster et al.
- This document describes a method of preparing a cell suspension containing germline stem cells from testis and injecting the suspension into seminiferous tubules.However, it describes the method of spermatogenesis from frozen sperm stem cells. , What? Have subsequently confirmed in vivo the ability of frozen sperm stem cells to form spermatozoa (Non-Patent Document 2). However, there are no reports that progeny derived from sperm generated from frozen sperm stem cells were obtained.
- sperm derived from spermatozoa were obtained by microinsemination using spermatozoa formed by transplanting cryopreserved testis fragments into the testis (Non-Patent Document 3), but testis fragments including supporting cells etc. This is an example of using.
- microinsemination is expensive and requires special techniques, so its application is limited. Therefore, there is a strong demand for the development of a method for obtaining sperm stem cell-derived offspring economically with good reproducibility.
- Patent Document 2 Avarbock, MR, Brinster, CJ and Brinster, RL Reconstitution of spermatogenesis from frozen spermatogonial stem cells.Nat.Med. (1996) 2, 693-696
- Non-Patent Document 3 Shinohara, T et al..Birth of offspring following transplantation of cryopreserved immature testicular pieces and in—vitro microinsemination.Hum.R stamp rod. (2002) 17, 3039-3045
- An object of the present invention is to establish a method for stably obtaining pups derived from sperm stem cells.
- the present inventors have found that spermatozoa derived from frozen sperm stem cells of a donor animal are formed in the testis of a male recipient to obtain a breeding individual, and the sperm stem cell derived from the donor animal is obtained by using the breeding individual. Succeeded in producing a pup, and completed the present invention.
- the present invention provides a male individual for reproduction by forming sperm in the reproductive organ of a male recipient animal using frozen sperm stem cells derived from a donor animal, and using the individual to obtain a sperm stem cell derived from a donor animal.
- the present invention provides a method for preparing an animal individual.
- a frozen sperm stem cell derived from a donor animal is transplanted into a reproductive organ of a male recipient animal, and sperm is formed in the testis of the recipient animal to obtain a male individual for reproduction.
- An object of the present invention is to provide a method for preparing an animal individual derived from a sperm stem cell of a donor animal, wherein a fertilized egg is obtained by using a sperm derived therefrom and an animal individual is generated from the obtained fertilized egg.
- the donor and recipient male animals are vertebrates, invertebrates, and can be displaced.
- Vertebrate includes mammals, birds, fish, amphibians and reptiles.
- the vertebrates include humans, non-human primates, dogs, cats, goats, pigs, mice, rats, gerbils, hamsters, puppies, dermatomes, pests, hedges, pigs, And mammals selected from the group consisting of marine mammals, ducks, geese, turkeys, and chickens , Ostrich, emu, guinea fowl, wild nose, bird, and zizla.
- Invertebrates include, but are not limited to, horses, lobsters, abyss and crustaceans.
- the reproductive organ preferred by vertebrates is preferably the testis.
- the "frozen sperm stem cells” are frozen preparations containing sperm stem cells having spermatogenesis ability, and usually also include preparations after thawing. It is clear from the context whether it means frozen or thawed. In addition, in this specification, the “frozen sperm stem cells” after thawing are sometimes referred to as “frozen-thawed sperm stem cells”.
- Transplantation of frozen sperm stem cells into a male recipient animal can be performed by supplying a suspension of frozen sperm stem cells to the seminiferous tubules or testis plexi.
- Fertilized eggs using sperm produced by the recipient male animal can be produced by natural mating of the recipient male and female animals, artificial insemination by artificially injecting the spermatozoa into the female adult sexual tract, or the recipient male.
- In vitro fertilization and embryo transfer can be performed by artificially fertilizing the sperm of an animal and the egg of a female animal outside the body, allowing the fertilized egg to grow outside the body for a certain period of time, and then returning it to the uterus for implantation. it can.
- micro insemination may also be employed.
- male donor animals and recipient animals may be either mature or immature animals. However, to obtain offspring by natural mating, male recipient animals are preferably immature animals.
- the method of the present invention can be carried out according to the description in the present specification even when the donor and recipient animals are invertebrates.
- sperm stem cells collected at an appropriate time are cryopreserved, grown in a test tube as necessary, and further preserved. It can be used to create offspring at any time. Since sperm stem cells are also present in non-spermatogenous individuals, sperm stem cells are collected from immature individuals, stored and transplanted to other individuals of the same or the same species to form spermatozoa. Offspring derived from stem cells can be produced.
- the sperm stem cell-derived offspring can be created by collecting and storing the sperm stem cells in advance. .
- progeny derived from frozen stem cells can be obtained by natural breeding, progeny can be produced at low cost without the need for techniques and equipment required for microinsemination.
- FIG. 1 is a graph comparing the stem cell activity of fresh ROSA26 testis cells and frozen 'thawed ROSA26 testis cells after transplantation into infertile W recipient mice, wherein (a) shows fresh ROSA26 testis cells ( 3x105 cells; left), photographs showing the macroscopic state of W recipient testes after transplantation of frozen 'thawed ROSA26 testis cells (3x104 cells; right), (b) 2 months after transplantation of frozen' thawed stem cells 3 is a micrograph of a tissue section of a testis of a recipient.
- FIG. 2 shows the results of a fertility recovery experiment using frozen and thawed testis cells in infertile W mice.
- A Non-transplanted mice (left) and transplant recipients (male) on day 241 after frozen stem cell transplantation.
- No. 1156) (right) is a micrograph of the testis,
- (b) is a micrograph of a tissue section of a testis of a non-transplanted W mouse, and
- (c) is a microscope of a tissue section of a testis of a transplanted recipient.
- D is a photograph of a pup (white, mouse number 1156) from an infertile W recipient transplanted with testis cells derived from frozen and thawed testis-retained Green.
- FIG. 3 Photographs showing the state of donor testis cell colony formation in busulfan-treated mature recipient testis.
- A shows the state of macroscopic observation of a recipient testis transplanted with immature Green mouse testis cell nests.
- B is a micrograph of the testis tissue section of (a)
- (c) is a photograph of the epididymis of the testis described in (a).
- the collected sample When prepared from a mature donor, the content of germline stem cells, which are undifferentiated cells in the testis of an adult individual, is low. Therefore, the collected sample should be concentrated by a known method and then frozen. (Experimental Medical Supplement, supra). In the case of immature donors, since a large amount of sperm stem cells are present in the testes, the collected sample can be used as it is. For example, in the case of a mouse, it is convenient to prepare it from an immature individual about one week old. In addition, sperm stem cells can be expanded in vitro (Japanese Patent Application No. 2003-110821) and then frozen after increasing the number.
- frozen sperm stem cells obtained by any method can be used.
- the testes of a donor animal are removed or a part is collected, the white membrane is removed in a solvent (PBS: Phosphate-Buffered Saline), the cells are separated with collagenase, trypsin, and DNase, and the cells are separated into single cells.
- the resulting testis cells are suspended in a cell banker (Cellbanker; DIA_IATRON, Tokyo) containing dimethyl sulfoxide and fetal calf serum albumin, and suspended cells at a concentration of 5 x 106-107 / ml are placed in a 1.5 ml freezing tube. It can be obtained by dispensing at lm concentration and freezing at -80 ° C for 1 day. Store frozen sperm stem cells in liquid nitrogen at 196 ° C.
- Frozen sperm stem cells can be grown in a test tube during the storage period and frozen and stored again, and can be stored almost permanently. When used, it is thawed in a solvent according to a conventional method, and suspended to obtain a cell suspension.
- the method of thawing is not particularly limited, but, for example, in a constant temperature bath at 37 ° C, in Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% fetal calf serum, in DMEM / FCS. Can be. Specifically, a freezing tube is floated in a thermostat, and 10 ml of DMEM / FCS is dropped and thawed. After washing the cells by centrifugation, suspend them in DMEM / FCS and store on ice until transplantation.
- DMEM Dulbecco's Modified Eagle's medium
- the method of transplanting stem cells into the testis of a recipient using a sperm stem cell suspension is also optional, and a method known in the art can be employed.
- a method known in the art can be employed.
- the ability to inject directly into the seminiferous tubules by means of a microinjection, or the injection into the vas deferens by microinjection There is a method to enter the testis network. The latter is preferred.
- the transplanted sperm stem cells engraft in the tubule wall of the recipient's seminiferous tubules, divide and develop into sperm cells and spermatozoa via spermatocytes, migrate to the epididymis, and mature.
- a fertilized egg of sperm derived from a sperm stem cell formed in the testis of a recipient can be obtained by natural mating with a male animal, or by artificial insemination or in vitro fertilization * embryo transplantation according to a conventional method. Microinsemination can be used for in vitro fertilization. These methods are known in the art. Female animals having fertilized eggs are bred under appropriate conditions, and after a certain period of time, offspring from donor male animals are obtained.
- the donor male animal and the recipient male animal may be the same individual or different individuals.
- the sperm stem cell colony forming ability of frozen sperm stem cells prepared from donor mouse testis and fresh sperm stem cells was compared (quantitative experiment, first experiment), and then offspring derived from frozen sperm stem cells were prepared. (Second experiment).
- ROSA B6-TgR (ROSA26) 26Sor transgenic mouse (Jackson Institute, USA)
- Rosa26 mouse expresses E. coli LacZ gene in all spermatogenic cells in seminiferous tubules. Since donor testis cells transplanted into recipient mice produce / 3-galatatosidase, the substrate 5-bromo-4-cloth-3-indolinole i3-D-galactosidase (X-gal) In the presence, it shows a blue color (LacZ staining). The LacZ gene is expressed in all donor spermatogenic cells, and spermatogenesis from donor stem cells can be identified by LacZ staining with X-gal (blue). [0026] 2) Donor mouse (second experiment)
- GFP Green
- C57BL / 6 Tgl4 act_EGFP
- OsbY01 transgenic mouse Okabe, M., et al., (1997), FEBS Lett. 407, 313-319
- GFP spermatogonia and spermatocytes express enhanced green fluorescent protein (EGFP), which expression decreases after meiosis. Therefore, it is possible to identify donor-derived sperm cells based on the fluorescence intensity.
- EGFP gene-positive colonies derived from donor testis cells were observed using a fluorescent stereo microscope (MZ FLIII, manufactured by Leica). In the experiment, transgene-positive male pups (pups, 6 days old) or adult mice (adults, 6-8 weeks old) were used. Donor testis cells were obtained from testes of 6-day-old green mice, testis of mature green mice 2-3 months after treatment of the testicles with stasis.
- B6 mice (busulfan treated or untreated): C57BL / 6 mice (6-12 weeks old) (Shizuoka Experimental Animal Center, designated as "Japan SLC")
- Busulfan treatment B6 mice were treated at 6 weeks of age with busulfan (44 mg / kg) injection to remove endogenous spermatogenic cells, and one month after transplantation. By destroying endogenous sperm stem cells by busulfan treatment, donor cell transplantation has become possible. This treatment mimics the side effects of anticancer drugs that occur in patients with malignant diseases.
- W mouse WBB6F1-W / Wv mouse (5-10 days old or 6-12 weeks old, Japan SLC)
- c-kit receptor-type tyrosine kinase
- the obtained cells were suspended in DMEM / FCS to obtain a cell suspension.
- testis cells made into single cells as described above are suspended in a cell banker (Cellbanker; DIA_IATRON, Tokyo) containing dimethylsulfoxide and fetal calf serum albumin, and a volume of 1.5 ml for freezing is stored. 1 ml of the cell suspension (cell density: 107 / ml) was dispensed into a tube and frozen at _80 ° C for 1 day. Frozen sperm stem cells were stored in liquid nitrogen at -196 ° C until use.
- a cell banker Cellbanker; DIA_IATRON, Tokyo
- the melting treatment was performed in principle according to the instructions of the supplier of the cell bunker. That is, a freezing tube was floated in a thermostat at 37 ° C., and 10 ml of DMEM (DMEM / FCS) containing 10% fetal bovine serum, which is a cell culture medium, was dropped and thawed. After washing the cells by centrifugation at 600 g ⁇ 5 minutes, they were resuspended in DMEM / FCS and stored on ice until transplantation.
- DMEM DMEM / FCS
- Transplantation was performed by microinjection of the donor testis cell suspension suspended in DMEM / FCS into the seminiferous tubules or vas deferens of recipient mice in the usual manner (Experimental Medicine separate volume “Stem cell clone, research protocol” See shrine).
- mice were transplanted into both testes under Avertin (640 mg / kg) anesthesia.
- transplantation was performed on only one testis by the hypothermia method under ice cooling. This is to avoid a decrease in postoperative survival rates due to prolonged hypothermia.
- Table 1 The contents of the experiment are summarized in Table 1 below.
- transplantation was performed at a cell concentration of 7.5x106-3xl07 / ml (suspended in DMEM / FCS) for the frozen cells of the donor, and at a concentration of 108 / ml for the fresh cells.
- a cell concentration of 7.5x106-3xl07 / ml (suspended in DMEM / FCS) for the frozen cells of the donor, and at a concentration of 108 / ml for the fresh cells.
- transplantation of frozen donor testis cells was performed at a concentration of 108 / ml (B6 mouse or mature W mouse) or 3xl07 / ml (suspended in DMEM / FCS).
- Histological examination of the testes of the recipient mice was performed visually or under a microscope. Inspection under a microscope was performed by the following method.
- Testis tissues were fixed using 10% neutral formalin, embedded in paraffin, and sectioned at intervals of 12 ⁇ . All sections were stained with hematoxylin and eosin. Four sections were prepared from each testis. Individual slides were viewed at 400x magnification. In the second experiment, three slides were used to show the degree of spermatogenesis in the testis of the host, where spermatogenesis was observed (defined as multi-layered cells around the entire seminiferous tubule). And the number of those without spermatogenesis were recorded. At least 500 seminiferous tubules were counted and statistical processing was performed using Student's t-test.
- Microinsemination was performed by microscopically injecting donor sperm cells into the cytoplasm of eggs collected from a female mouse (C57BL / 6xDBA / 2F1) that induced superovulation (Kimura, Y. et al. 1995) Development 121, 2397-2405). Embryos that reached the 2-cell stage 24 hours later were implanted into the oviduct of pseudopregnant-treated female mice (ICR).
- Table I summarizes the procedures of the first experiment and the second experiment.
- the first experiment is a quantitative experiment to evaluate the effect of freezing on sperm stem cells
- the second experiment is an experiment for producing pups derived from frozen-thawed sperm stem cells.
- b ROSA26 maturation: 6-8 weeks, GFP maturation: 14-20 weeks, GFP immature: 6 days
- c W maturation: 6-12 weeks, B6 maturation: 10-12 weeks, W immature: 5 -10 days old
- the average recovery of viable cells relative to cells before freezing was 37.6 ⁇ 5.1% (mean ⁇ SEM; n 8).
- mice were implanted with 3 x 1 of a molten donor testis cell suspension (7.5 x 106-3xl07 / ml) or 3 ⁇ l of a fresh donor testis cell suspension (lxl 08 / ml).
- mice were bred for 2 months under the normal breeding conditions of the animals, the laparotomy was performed, and the testes of each animal were collected and stained with X-gal.
- the blue area (colonies) in the seminiferous tubules indicates the presence of sperm derived from a single transplanted sperm stem cell (Nagano, M et al. (1999) Biol.
- R mark rod. 60, 1429-1436 That is, other cells of the testis are unrelated to spermatogenesis, and the host's endogenous germ cells are stained with X-gal. Therefore, the number of blue colonies indicates the number of stem cells in the transplanted cell population.
- FIG. 1 is a diagram comparing the colony forming ability of fresh ROSA26 testis cells and frozen and thawed ROSA26 testis cells after transplantation into infertile W recipient mice.
- A is a photograph showing macroscopic observation of W recipient testis after transplantation of fresh ROSA26 testis cells (3x105 cells; left) and frozen'thawed ROSA26 testis cells (3x104 cells; right).
- Spermatogenesis from the donor is stained blue with X-gal, but is represented by gray to black spots in the attached figure la.
- Fig. La One spermatogenesis was observed in the testis on the left (fresh) and four spermatozoa were observed in the testis on the right (frozen). ing. Freezing despite low concentration • High sperm formation from donor testis cells derived from molten donor testis cells.
- B Freezing despite low concentration • High sperm formation from donor testis cells derived from molten donor testis cells.
- Injection volume 3 ⁇ l for testes of W mice, 10 ⁇ l for testes of 6 mice treated with busulfan
- Table II shows that in the case of W recipient mice, colonies derived from frozen 'thawed donor testis cells were 11.7 times (62.1: 5.3 colonies / 105 donor cells, ⁇ ⁇ 0.05) colonies derived from fresh donor testis cells. Show that there is. Similarly, in the case of busulfan-treated # 6 recipient mice, colonies derived from frozen and thawed donor testis cells are 5.1 times as high as those derived from fresh donor testis cells (high 0.01). The results shown in Table II and FIG. 1 indicate that frozen and thawed donor testis cells have higher spermatogenesis activity than fresh donor testis cells. These results also indicate that the method of the present invention enables the formation of a large amount of spermatozoa stably so that fertilization by natural mating is possible, and that the method of the present invention is suitable for practical use. .
- the above-mentioned transgenic mouse GFP (Green) was used as a donor.
- the freezing and thawing of the donor testis cells and the preparation of the donor testis cell suspension were carried out according to the method described in “(2) Donor cells (donor sperm stem cells)”.
- Sperm stem cells were obtained from 6-day-old mice (pups) or mature mice (adult, 6-8 weeks old) 2-3 months after the treatment of the testicles that were retained, and frozen.
- the spermatogonia and spermatocytes of this transgenic mouse have enhanced green It expresses fluorescent protein (EGFP) and its expression decreases after meiosis.
- EGFP fluorescent protein
- Donor testis cell suspension from mature GFP mice was microinjected into B6 mice (mature, busulfan-treated) and W mice (mature or immature) as described in Table 1. .
- a donor testis cell suspension derived from an immature GFP mouse was microinjected into a W mouse (immature). After transplantation of the donor testis cells, the recipient mice were bred under the normal breeding conditions for the animals. As a control, non-transplanted mice were bred under the same conditions.
- mice reared under the above rearing conditions were reared together with female B6 wild-type mice under the normal rearing conditions of these animals, spontaneously mated, and the development of offspring was examined. Mating was attempted after 2 weeks for mature mice and 6 weeks for immature mice.
- Recipient mice were bred under normal conditions, and 213 to 246 days after transplantation of the donor testis cells, the abdomen was opened, the testes of each animal were collected, and the transplantation efficiency of the donor testis cells was determined. Testicular sections were prepared in the same manner as in Example 1, and individual slides were observed using an upright microscope at a magnification of 400 times. To show the degree of spermatogenesis in the host testis, we show that spermatogenesis is observed (defined as multi-layered cells around the circumference of seminiferous tubules) and non-spermatogenesis. Was recorded from three slides. At least 500 tubules were scored. Statistical processing was performed by Student's t-test.
- FIG. 2 is a diagram showing the results of a fertility recovery experiment using frozen and thawed testis cells in infertile W mice.
- A is a micrograph of the testis of a non-transplanted mouse (left) and the testis (right) of a transplant recipient (mouse number 1156) on day 241 after frozen sperm stem cell transplantation. It can be seen that the testes of the recipient are growing significantly larger than the non-transplanted mice.
- (B) is a micrograph of a tissue section of a testis of a non-transplanted W mouse.
- (c) is a micrograph of a tissue section of a testis of a transplanted recipient.
- the lumen is white and empty, and there is no sperm, but in (c), a large number of sperm indicated by black dots and dots are formed around the lumen, Power.
- Table IV provides detailed data for the five recipients that have restored fertility.
- Table III Spermatogenesis after transplantation of frozen 'thawed testis cells
- spermatogenesis Percentage of spermatogenesis in the recipient testis cross section (%). Those in which multiple layers of cells were observed over the entire circumference of the seminiferous tubules were judged as positive for spermatogenesis.
- N.D. means that measurement was not possible due to endogenous spermatogenesis.
- Table IV Offspring from W recipient mice microinjected with frozen and thawed stem cells
- transplantation was performed only in the right testis. In an adult recipient, transplantation was performed in both testes.
- N.D . Means that the transplant is reasonable, and that the measurement is reasonable.
- FIG. 3 is a photograph showing the state of donor testis cell colony formation in busulfan-treated mature recipient testis.
- A is a photograph showing macroscopic observation of a recipient testis transplanted with immature Green mouse testis cell nests. The green seminiferous tubules under UV indicate the presence of donor testis cell colony formation, which is represented in white-grey in the attached Figure 3a.
- the germ cells recovered in this manner were frozen again by the method described previously and stored until microinsemination before being used for microinsemination. After cryopreservation for 3 days, mature sperm or elongated sperm cells were injected into the ova (in the cytoplasm) of female mice C57BL / 6XDBA / 2F1 (B6D2F1). Eggs were collected from female mice that induced superovulation. Regardless of the male germ cells used, about 80% of the eggs reached the 2-cell stage within 24 hours. 101 diploid conjugates constructed by 80 sperm and 21 elongated sperm cells were transferred to oviducts. Of these, 68 (67%) were transplanted into the uterus, giving a total of 31 pups (31%). Donor origin was confirmed by fluorescence under ultraviolet light. The offspring were found to be fertile.
- spermatozoa can be formed in a mature or immature recipient to produce offspring by spontaneous mating, using sperm stem cells obtained from both immature and mature individuals as donor testis cells. It became clear that we could do that. In addition, it was found that immature recipients tend to be more successful in producing pups by natural mating than mature recipients.
- frozen sperm stem cells can be used instead of frozen sperm in vertebrate reproductive techniques, and complicated processing during freezing and preservation, and a decrease in the ability of thawed sperm to grow.
- various problems associated with sperm use such as difficulty in obtaining large amounts of sperm, will be resolved, opening the way to establishing more reliable and stable reproductive techniques.
- the method of the present invention not only maintains the lineage of domestic animals and experimental animals, but also protects rare animals, and further treats human patients secondary to infertility by treating innate infertility and malignant tumors. It is also useful.
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Abstract
本発明は、凍結精子幹細胞由来の子孫を作成する方法であって、ドナー動物由来の凍結精子幹細胞を用いて雄性レシピエント動物の生殖器官内で精子を形成させて繁殖用雄性個体を得、該個体を用いてドナー動物の精子幹細胞由来の動物個体を作成する方法を提供する。
Description
明 細 書
凍結精子幹細胞由来の子孫を作成する方法
技術分野
[0001] 本発明は、生殖技術に関し、さらに詳しくは動物の凍結精子幹細胞由来の子孫を 作成する方法に関する。
背景技術
[0002] 現在、ヒトを含む脊椎動物における生殖異常の治療や家畜等の生産、種の維持等 において、凍結保存した精子を用いる方法が利用可能であり、実際に、マウス等の実 験動物や牛等の家畜の系統保存には胚凍結法と精子凍結法が行われている。通常
、精子を凍結し、液体窒素中で保存し、融解し、人工授精や体外受精を行い、得ら れた卵細胞を偽妊娠仮親の卵管に移植し、移植された動物を飼育して目的の子孫 を得ている。し力しながら、精子の保存法は種によって著しく異なっており、一般的な 方法は確立されていなレ、。例えば実験に用いられる C57BL/6(B6)マウスの精子など はまだ有効な精子凍結法がない状態である。また、精子の凍結保存には、液体窒素 の供給が必要であるため、長期間の保存はコストが高くつき、また、その輸送には梱 包等に特別な配慮が必要である。しかも、受精には一定量以上の精子が必要である が、凍結保存した精子をインビトロで増やすことはできず、多量に採取し凍結保存し なければならない。しかし、比較的精子の採取が容易な家畜の場合でも精子を多量 に得ることは容易でなぐ特に、ヒトにおいては、化学療法や放射線療法による精巣 障害が原因となって起こる不妊の治療のために、事前に精子を多量に保存すること は困難である。
[0003] さらに、精子を使用する方法の場合、精子が形成されていない未成熟な個体や何 らかの原因で精子形成が阻害されている個体の場合には、生殖細胞系列（germline) を保存することができない。凍結乾燥した精子の使用も試みられ、水で戻した精子の 受精能がマウスで確認されているが、保存期間が長くなるほど受精能が低下するな ど未だ確立された方法になっていないのが実情である。
[0004] 動物における精子形成は、通常、成体内のヒトにおける精巣またはそれに相当する
雄性生殖器官に存在する生殖幹細胞 (例、精原細胞）が増殖して形態的に変化する ことからなる一連の分化発達過程を経て行われる。ヒト等の場合、精子幹細胞 (精原 細胞）は精母細胞となり、減数分裂によって精子細胞が形成され、この精子細胞が形 態的に変化して精子となる。以下、生殖幹細胞を精子幹細胞として説明する。
[0005] 精子幹細胞は、他の幹細胞と同様に、凍結'融解に対して安定であり、試験管内で 容易に増殖させることができる（特願第 2003— 110821号）ばかりか、放射能や温度等 に対する安定性が極めて高ぐ保存、運搬などの取扱が容易である。すなわち、精子 幹細胞は、精子が形成されていなレ、、あるいは精子量が少ない個体力もも採取でき、 また、たとえ少量しか得られなくても試験管内で増殖させて量を増やすことができると レ、う利点を有する。従って、精子幹細胞由来の個体を得る生殖技術が確立されれば 、家畜の育種、希少動物の種の保存、さらにはヒトの男性不妊の治療、化学療法、放 射線療法などで不妊になる恐れのある患者等の不妊回復処置などに極めて有用と 考えられる。現在、精子幹細胞の凍結に関しては、ハムスター、ラット、サル、ヒト、ゥ シ、ブタなど種を越えてほぼ同一の方法で精子形成能を維持して凍結保存できるこ とが知られている。
[0006] 精子幹細胞の移植法はブリンスターら（非特許文献 1)により紹介された。この文献 には、精巣から生殖幹細胞を含む細胞浮遊液を調製し、精細管に注入する方法が 記載されてレ、るが、凍結精子幹細胞からの精子形成にっレ、ては記載されてレ、なレ、。 ブリンスターらは、その後凍結精子幹細胞の精子形成能に関してインビボで確認して いる（非特許文献 2)。しかし、凍結精子幹細胞から発生した精子由来の子孫を得た という報告はない。なお、凍結保存した精巣断片の精巣内への移植により形成された 精子を用いて顕微受精によりその精子由来の仔を得た例はある (非特許文献 3)が、 支持細胞等も含む精巣断片を用いる例である。また、顕微受精は費用がかかる上、 特殊な技術を必要とするため、適用対象が限られる。従って、再現性良く経済的に精 子幹細胞由来の仔を得る方法の開発が強く求められている。
[0007」 ^^特 文献 1： Bnnster, R. L. and Zimmermann, J. W. permatogenesis following male germ-cell transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91，
11298-11302
特許文献 2 : Avarbock, M. R. , Brinster, C. J. and Brinster, R. L. Reconstitution of spermatogenesis from frozen spermatogonial stem cells. Nat. Med. (1996) 2, 693-696
非特許文献 3 : Shinohara, T et al.. Birth of offspring following transplantation of cryopreserved immature testicular pieces and in—vitro microinsemination. Hum. R印 rod. (2002) 17， 3039-3045
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は精子幹細胞由来の仔を安定的に得る方法を確立することを目的とするも のである。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、ドナー動物の凍結精子幹細胞由来の精子を雄性レシピエントの精 巣内で形成させて繁殖用個体を得、該繁殖用個体を用いることによりドナー動物の 精子幹細胞由来の仔を作成することに成功し、本発明を完成するに至つた。
即ち、本発明は、ドナー動物由来の凍結精子幹細胞を用いて雄性レシピエント動 物の生殖器官内で精子を形成させて繁殖用雄性個体を得、該個体を用いてドナー 動物の精子幹細胞由来の動物個体を作成する方法を提供するものである。
本発明は一つの実施態様として、ドナー動物由来の凍結精子幹細胞を雄性レシピ ェント動物の生殖器官に移植し、該レシピエント動物の精巣内で精子を形成させて 繁殖用雄性個体を得、該個体由来の精子を用いて受精卵を得、得られた受精卵か ら動物個体を発生させることを特徴とする、ドナー動物の精子幹細胞由来の動物個 体を作成する方法を提供するものである。
[0010] 明細書および特許請求の範囲に記載の本発明の目的に従い、ドナーおよびレシピ ェント雄性動物は脊椎動物、無脊椎動物のレ、ずれでもよレ、。
「脊椎動物」としては、哺乳動物、鳥、魚、両性動物および爬虫類動物が挙げられる 。好ましくは、脊椎動物としては、ヒト、非ヒト霊長類、ィヌ、ネコ、ャギ、ブタ、マウス、ラ ット、スナネズミ、ハムスター、ゥサギ、厚皮動物、ゥマ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、及び海生 哺乳類から成る群から選択される哺乳動物、ァヒル、ガチョウ、シチメンチヨウ、ニヮトリ
、オーストリッチ、エミュ、ホロホロチョウ、ノ、トおよびゥズラからなる群から選択される鳥 を挙げること力 Sできる力 これらに限定されない。
「無脊椎動物」としてはゥ二、ロブスター、ァヮビおよび甲殻類を挙げることができる 力、これらに限定されない。
本発明には、脊椎動物が好ましぐ生殖器官は精巣であることが好ましい。
[0011] 「凍結精子幹細胞」とは、精子形成能を有する精子幹細胞を含有する凍結された調 製物であり、通常は、融解後の調製物をも包含する。凍結状態、融解状態のいずれ を意味するかは、文脈から明らかである。なお、本明細書中では特に融解後の「凍結 精子幹細胞」を「凍結 ·融解精子幹細胞」と表現する場合もある。
[0012] 凍結精子幹細胞の雄性レシピエント動物への移植は、凍結精子幹細胞の浮遊液 を精細管または精巣網に供給することにより行うことができる。
レシピエント雄性動物が産生する精子を用いる受精卵の作成は、レシピエント雄性 動物と雌性動物の自然交配、該精子を人工的に雌成体の性管内に注入する人工授 精法、またはレシピエント雄性動物の精子と雌性動物の卵子を体外で人工的に受精 させ、受精卵を一定期間体外で発育させた後、子宮内に戻して着床させる、体外受 精 ·胚移植法などによって行うことができる。体外受精には顕微受精も採用しうる。
[0013] 本発明の目的に照らして、雄性のドナー動物、レシピエント動物は成熟または未成 熟動物のいずれでも良い。しかし、自然交配で仔を得るためには、雄性レシピエント 動物は未成熟動物であることが好ましレ、。
なお、本発明方法はドナーおよびレシピエント動物が無脊椎動物である場合も、本 明細書の記載に従って実施することができる。
発明の効果
[0014] 本発明により、凍結精子幹細胞から仔を作成することが可能となったので、適当な 時期に採取した精子幹細胞を凍結保存し、必要に応じて試験管内で増殖させ、さら に保存を続け、随時、子孫の作成に供することができる。精子幹細胞は精子形成さ れていない個体にも存在するので、未成熟な個体から精子幹細胞を採取して保存し ておき、同一または同種の他の個体に移植し、精子を形成させ、該精子幹細胞由来 の仔を作成することができる。化学療法や環境ホルモン（内分泌攪乱物質）による暴
露等で精子形成能が低下または損傷され、不妊になる場合には、事前に精子幹細 胞を採取して保存しておくことにより、該精子幹細胞由来の仔を作成することが可能 となる。
このように、本発明によれば、希少動物、実験動物、家畜類等の系統保存、化学療 法や放射線療法等で不妊になるヒト患者の不妊の回復が可能となる。また、 自然交 配により凍結幹細胞由来の子孫を得ることができるので、顕微受精等に必要な技術 や設備を必要とせず低コストで子孫を作成することが可能となる。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]新鮮な ROSA26精巣細胞と凍結'融解 ROSA26精巣細胞の、不妊 Wレシピエント マウスへの移植後の幹細胞活性を比較した図であり、（a)は新鮮な ROSA26精巣細胞 (3x105細胞；左側）、凍結'融解 ROSA26精巣細胞（3x104細胞；右側）を移植した後 の、 Wレシピエント精巣の肉眼視の状態を示す写真、（b)は凍結'融解幹細胞移植 後 2ヶ月目のレシピエント精巣の組織切片の顕微鏡写真である。
[図 2]不妊 Wマウスにおける凍結 ·融解精巣細胞による稔性回復実験の結果を示す 図であり、（a)は非移植マウス (左)と凍結幹細胞移植後 241日目の移植レシピエント（マ ウス番号 1156) (右)の精巣の顕微鏡写真であり、（b)は非移植 Wマウスの精巣の組織 切片の顕微鏡写真であり、（c)は移植されたレシピエントの精巣の組織切片の顕微鏡 写真であり、（d)は凍結 ·融解睾丸停留 Green由来の精巣細胞を移植された不妊 Wレ シピエントからの仔（白,マウス番号 1156)の写真である。
[図 3]ブスルファン処理成熟レシピエント精巣におけるドナー精巣細胞コロニー形成 の状態を示す写真であり、（a)は未成熟 Greenマウス精巣細胞巣を移植されたレシピ ェント精巣の肉眼視で観察した状態を示す写真、（b)は (a)の精巣の組織切片の顕微 鏡写真、（c)は (a)に記載の精巣の精巣上体の精細管の写真である。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 以下に主としてマウスの場合を例に挙げて本発明の方法を説明する力 マウス以外 の哺乳動物、さらには脊椎動物、無脊椎動物の場合にも、本明細書に記載の方法お よび当該技術分野で既知の方法を用いて本発明を実施することができることは、当 業者にとって明らかである。
[0017] 凍結精子幹細胞の調製、融解処理などは他の幹細胞の場合と実質的に同様であ る（非特許文献 2ほか)。具体的には文献 (実験医学別冊「幹細胞クローン、研究プロ トコル」羊土社)記載の方法で調製することができる。
[0018] 成熟したドナーから調製する場合、成熟個体精巣中の未分化細胞である生殖幹細 胞含有量が少なレ、ため、採取した試料を既知の方法で濃縮してから凍結処理するこ とが好ましい (実験医学別冊、前掲)。未成熟ドナーの場合は精巣内に多量の精子 幹細胞が存在しているので、採取した試料をそのまま使用することができる。例えば、 マウスの場合、 1週齢程度の未成熟個体から調製すると好都合である。また、精子幹 細胞は試験管内で増幅して（特願 2003-110821号)数を増やしてから凍結することも 可能である。
[0019] 本発明には、任意の方法で得た凍結精子幹細胞を用いることができる。一例として 、ドナー動物の精巣を摘出するか、一部を採取し、溶媒（PBS : Phosphate-Buffered Saline)中で白膜を除去し、コラゲナーゼ、トリプシン、 DNaseで細胞をばらばらにし、 単一細胞になった精巣細胞をジメチルスルホキシドとゥシ胎仔血清アルブミン含有セ ルバンカー（Cellbanker; DIA_IATRON、東京）を用いて懸濁し、濃度 5 X 106— 107 /mlの浮遊細胞を容量 1.5mlの凍結用チューブに約 lm 呈度づつ分注し、 -80°C で 1日凍結することにより得ることができる。凍結した精子幹細胞は一 196°Cの液体窒 素中で保存する。
[0020] 凍結精子幹細胞は、保存期間中に試験管内で増殖させて再度凍結保存すること が可能であり、ほぼ永久に保存することができる。使用に際しては、常法に従って溶 媒中で融解し、懸濁して細胞浮遊液とする。融解の方法も特に限定されないが、例 えば、 37°Cの恒温槽で、 10%ゥシ胎仔血清を含有するダルベッコの改良イーグル培 地（Dulbecco's Modified Eagle's medium, DMEM) DMEM/FCS中で行うことができる。 具体的には、恒温槽に凍結チューブを浮かべ、 10mlの DMEM/FCSを滴下して融解 する。細胞を遠心して洗った後、 DMEM/FCSに懸濁し移植まで氷上で保存する。
[0021] 精子幹細胞浮遊液を用いて幹細胞をレシピエントの精巣に移植する方法も任意で あり、当該技術分野で既知の方法を採用することができる。例えば、精細管へ直接マ イク口インジェクション等により注入する力、、輸精管にマイクロインジェクションにより注
入し精巣網へ到達させる方法などがある。後者が好ましい。移植された精子幹細胞 はレシピエントの精細管の管壁内に生着し、精母細胞を経て精子細胞、精子へと分 化発達し精巣上体へと移動して成熟する。
[0022] レシピエントの精巣で形成された精子幹細胞由来の精子による受精卵は、雄性動 物との自然交配、または常法に従って人工授精、体外受精 *胚移植により得ることが できる。体外受精には顕微受精 (microinsemination)を採用することができる。それら の方法は当該技術分野で既知である。受精卵を有する雌性動物を適当な条件下で 飼育し、一定期間後にドナー雄性動物由来の子孫を得る。
上記の方法において、ドナー雄性動物とレシピエント雄性動物は同一個体であつ ても、別の個体であっても良い。
[0023] 以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、該実施例は本発明を限定す るものではない。
実施例
[0024] 実施例では、ドナーマウス精巣から調製した凍結精子幹細胞と新鮮な精子幹細胞 の、精子幹細胞コロニー形成能を比較し (定量実験、第一実験）、次いで、凍結精子 幹細胞由来の子孫を作成した (第二実験)。
以下に、実施例で用いたドナー、レシピエントマウス、ドナー細胞 (凍結'融解精子 幹細胞）の調製、ドナー細胞の移植、 精巣の組織学的検査および顕微 受精の方法を説明する。
[0025]
1)ドナーマウス (第一実験）
ROSA: B6-TgR(ROSA26)26Sorトランスジヱニックマウス（米国ジャクソン研究所） 特徴: Rosa26マウスは大腸菌の LacZ遺伝子を精細管内の全ての精子形成細胞に 発現している。レシピエントマウスに移植されたドナー精巣細胞は /3—ガラタトシダー ゼを産生しているので、基質である 5-ブロモ -4-クロ口- 3-インドリノレ i3 -D-ガラクトシ ダーゼ (X-gal)の存在下、青色を呈する（LacZ染色）。 LacZ遺伝子はドナーの精子形 成細胞の全てに発現しており、ドナーの幹細胞由来の精子形成は X-galによる LacZ 染色 (青色)で同定できる。
[0026] 2)ドナーマウス（第 2実験）
GFP (Green):C57BL/6 Tgl4(act_EGFP)OsbY01トランスジエニックマウス（大阪大 学岡部勝先生供与、 Okabe, M., et al.，（1997)， FEBS Lett. 407, 313-319)
特徴: GFPの精原細胞と精母細胞は増強された緑色の蛍光性蛋白（EGFP)を発現 しており、その発現は減数分裂以降減少する。従って、蛍光強度に基づいてドナー 由来の精細胞を同定することが可能である。以下の実施例において、ドナー精巣細 胞由来の EGFP遺伝子陽性のコロニーは蛍光実体顕微鏡 (MZ FLIII,ライカ製）を用 いて観察した。実験には雄の子供 (pup，生後 6日齢)もしくは成熟マウス (adult, 6-8 週齢)で導入遺伝子が陽性である個体を用いた。ドナー精巣細胞の採取は生後 6日 齢の Greenマウスの精巣力 \停留睾丸処置後 2— 3ヶ月後の成熟 Greenマウスの精巣 より得た。これらのマウスの精巣には分化した細胞が欠損しており、幹細胞が濃縮さ れているので、該マウスから得たドナー精巣細胞を用いると、移植効率が高く不妊回 復が促進されると考えられる。停留睾丸手術は文献記載の方法に従って行った (Shinohara, Τ·， et al. (2000) Dev. Biol. 220, 401—411)。
[0027] 3)レシピエントマウス（第一、第二実験）
B6マウス（ブスルファン処理または未処理）： C57BL/6マウス（6_12週齢）（静岡実 験動物センター、「日本 SLC」と呼称）
特徴：ブスルファン処理 B6マウスは、 6週齢の時にブスルファン（44mg/kg)注射に より内因性精子形成細胞除去処理を施し、その一力月後に移植に供した。ブスルファ ン処理によって内因性の精子幹細胞を破壊することにより、ドナー細胞移植が可能と なっている。この処理は悪性疾患患者に起こる抗癌剤の副作用を模するものである。
[0028] Wマウス： WBB6F1-W/Wvマウス（5—10日齢もしくは 6—12週齢、 日本 SLC)
特徴：生殖細胞に発現している c-kitというレセプター型のチロシンキナーゼに遺伝 子変異があるために内因性の精子形成能を欠損している。
これらブスルファン処理 B6マウスと先天不妊の Wマウスは、レ、ずれも凍結されてレヽ ない新鮮な精子幹細胞を移植した際に、精子形成を支持する能力を有することが知 られている (〇gawa， T. et al.(2000) Nat. Med. 6， 29-34; Shinohara, T. et al.,Dev. Biol. 220, 401-411)o
[0029] (2)ドナー細胞（ドナー由来の精子幹細胞）（一般手法）
1)ドナーマウスの精巣を摘出し PBS中で白膜を除去し、 lmg/mlコラゲナーゼ (I型） 、 7mg/ml DNaseを含むハンクス液中、 37°Cにて適宜振盪しながら 15分間インキュべ ートし精細管をほぐした。 PBSにより 2回洗浄してはがれた間質の細胞を除去した後 、 0. 25%トリプシンを含む PBS中で 37°Cにて適宜振盪しながら 15分間インキュべ ートし、精細管をばらばらにした。 PBSをカロえ、トリプシンを不活化した後、ピぺッティ ングを行って細胞浮遊液を得た。これを 20 30 μ mのナイロンメッシュに通して未消 化細胞塊を除去し、 600 X gで 5分間遠心して細胞を集めた。
新鮮な細胞調製物を移植に用いる場合は、得られた細胞を DMEM/FCSに懸濁し て細胞浮遊液を得た。
[0030] 凍結保存する場合は、上記で単一細胞にした精巣細胞をジメチルスルホキシドとゥ シ胎仔血清アルブミンを含有するセルバンカー（Cellbanker; DIA_IATRON、東京）中 に懸濁し、容量 1.5mlの凍結用チューブに細胞浮遊液（細胞密度： 107/ml) 1mlを分 注し、 _80°Cで 1日凍結処理した。凍結した精子幹細胞は - 196°Cの液体窒素中で 使用まで保存した。
[0031] 2)凍結ドナー細胞の融解
融解処理は原則としてセルバンカーの供給者の指示に従って行った。即ち、 37°C の恒温槽中に凍結チューブを浮かべ、細胞培養用の培地である 10%ゥシ胎仔血清 含有 DMEM(DMEM/FCS) 10mlを滴下して融解した。細胞を 600g X 5分間遠心して 洗浄した後、 DMEM/FCSに再懸濁して移植まで氷上で保存した。
[0032] (3)ドナー細胞の移植
移植は DMEM/FCS中に懸濁したドナー精巣細胞浮遊液をレシピエントマウスの精 細管または輸精管に常法通りマイクロインジヱクシヨンして行った（実験医学別冊「幹 細胞クローン、研究プロトコル」羊土社参照）。成熟マウスの場合は、 Avertin (640 mg/kg)麻酔下、両方の精巣に移植した。未成熟マウスの場合は氷冷下、低体温法 により、片方の精巣のみに移植した。これは、長時間低体温に維持することによる術 後の生存率低下を避けるためである。実験の内容は下記の表 1にまとめて示した。原 貝 IJとして、 B6マウスを用いた実験では、約 10 μ ΐのドナー精巣細胞を含む溶液を精
巣の精細管または精輸管の中にマイクロインジヱクシヨンした力 成熟した wマウスの 場合、精巣のサイズが小さいので 3 μ 1をマイクロインジェクションした。未成熟な Wマ ウスを用いた場合は 2 / lのドナー精巣細胞を用いた。個々の移植された精巣におい ては、 75_85。/0の精細管がドナー由来の細胞で満たされた。
[0033] 第一実験における移植は、ドナーの凍結細胞は 7.5x106— 3xl07/mlの細胞濃度（ DMEM/FCSに懸濁）で行ったのに対し、新鮮な細胞は 108/mlの濃度で行った。これ は、細胞を凍結融解した場合にはその回収率が実験ごとに異なるからである。
第二実験における移植は、凍結したドナー精巣細胞の移植を 108/ml(B6マウスもし くは成熟 Wマウス)または 3xl07/mlの濃度（DMEM/FCSに懸濁）で行った。
[0034] (4)組織学的分析
レシピエントマウスの精巣の組織学的な検查は肉眼視または顕微鏡下で行った。 顕微鏡下での検查は以下の方法で実施した。
精巣組織は 10%中性ホルマリンを用いて固定し、パラフィンに包埋し、 12 μ ΐηの間 隔で切片の作成を行った。全ての切片はへマトキシリン'ェォジン染色にて染色を行 つた。個々の精巣より 4枚の切片を作成した。個々のスライドは 400倍の拡大率で観 察した。第二実験では、 3枚のスライドより、ホストの精巣内での精子形成の度合いを 表すために、精子形成の見られるもの（精細管の全周にわたって多層の細胞が見ら れるものと定義）と精子形成の見られないものの数を記録した。最低 500本の精細管 のカウントを行い、統計学的な処理は Studentの t-testで行った。
[0035] (5)顕微受精
顕微受精はドナーの精細胞を過排卵を誘導した雌マウス（C57BL/6xDBA/2 F1)か ら採取した卵の細胞質内に顕微鏡下でインジェクションすることにより行った（Kimura, Y. et al.(1995) Development 121， 2397-2405)。 24時間後に 2細胞期に到達した胚 を偽妊娠処理した雌マウス (ICR)の卵管に移植した。
[0036] 第一実験および第二実験の手順を表 Iにまとめて示す。
表 I： 第一実験および第二実験の手順
[表 1]
十一 b 細胞 ドナ-細胞濃度 注入容量 レシ 宝輪 a ピエント の型 (xl06cell/ml) ( μ ΐ) の数
W, 成熟 凍結 7.5-30 3 6 第 B6, 成熟，
一 Rosa26, ί . i n
フ'スルファン処理
W, 成熟 新鮮 100 3 6 非処理
験 B 6 , 成熟，
新條 on i n
フ スルファン処理
B 6 , 成熟，
GFP, 凍結 100 10 12 第 フ、、スルファン処理
成熟，
W, 成熟 凍結 100 3 9 停留精巣
W, 未成熟 凍結 30 2 7 験 GFP,
W, 未成熟 凍結 30 2 1 未成熟 a :第一実験は凍結の精子幹細胞に及ぼす影響を評価するための定量実験である
第二実験は凍結一融解精子幹細胞由来の仔の作成のための実験である。 b : ROSA26成熟: 6-8週齢、 GFP成熟: 14-20週齢、 GFP未成熟: 6日齢 c :W成熟: 6_12週齢、 B6成熟: 10-12週齢、 W未成熟: 5-10日齢
[0037] 実施例 1 精子幹細胞の定量実験 (第一実験）
ドナーマウスから得たドナー精巣細胞中の精子幹細胞を定量した。
(1)ドナーとして成熟 ROSA26を用いた。ドナー精巣細胞の凍結'融解およびドナー 精巣細胞浮遊液の調製は、上記「（2)ドナー細胞の調製 (一般手法)」に記載の方法 で行った。既述のごとぐ ROSA26から得た幹細胞由来の精子は X_galによる LacZ染 色で青色を呈することに基づいて同定することができるので、ドナー精巣細胞調製物 中の幹細胞量の定量が可能である。
[0038] (2)ドナー精巣細胞の移植
細胞浮遊液の調製
移植に先立ち、 5ヶ月間液体窒素中で凍結保存し、融解したドナー精巣細胞調製 物を含有する DMEM/FCS中浮遊液と新鮮なドナー精巣細胞調製物の DMEM/FCS 中浮遊液を用いた。細胞調製物中の細胞の生存率をトリパンブルーで判定した。 トリパンブルー判定に基づく凍結'融解後のドナー精巣細胞の生存率は、凍結'融 解処理してレ、なレ、新鮮な細胞に比較して有意に低下してレ、た (凍結'融解細胞の生
存率： 67.4 ± 5.9%, mean ± SEM; n=8 ;新鮮細胞の生存率： 93.6 ± 1.7%, mean ± SEM; n = 7; Pく 0.01)。凍結前の細胞に対する生存細胞の平均回収率は 37.6 ± 5. 1% (mean ± SEM; n = 8)であった。
凍結 ·融解細胞調製物中、生存していたドナー精巣細胞のみをカウントして、細胞 移植に用いた。
[0039]
先天性不妊の Wマウス（5—10日齢または 6—12週齢）とブスルファン処理 B6マウス（ 6— 12週齢）を用いた。
凍結'融解幹細胞の精子形成能を試験するために、同数の細胞をレシピエントに移 植した。ドナー精巣細胞はいずれも DMEM/FCS中浮遊液として用いた。
B6マウスには、融解ドナー精巣細胞浮遊液（7.5x106— 3xl07/ml) 3 x l、または新 鮮なドナー精巣細胞の浮遊液（lxl 08/ml) 3 μ 1を移植した。
上記（4)に記載の通り、 Avertin (640mg/kg)麻酔下、レシピエントの精巣に各精子 幹細胞浮遊液 10 μ 1をマイクロインジェクションした。
[0040] マウスを該動物の通常の飼育条件下で 2ヶ月間飼育した後、開腹し、各動物の精 巣を回収し、 X— gal染色した。精細管における青色領域 (コロニー)は移植した単一の 精子幹細胞に由来する精子の存在を示している (Nagano, M et al.(1999) Biol.
R印 rod. 60, 1429-1436)。即ち、精巣の他の細胞は精子形成と無関係であり、ホスト の内因性の生殖細胞は X— galで染まらなレ、。従って、青色コロニーの数は移植された 細胞集団中の幹細胞の数を示してレ、る。
[0041] 結果を表 IIと図 1に示す。図 1は新鮮な ROSA26精巣細胞と凍結 ·融解 ROSA26精巣 細胞の、不妊 Wレシピエントマウスへの移植後のコロニー形成能を比較した図である 。（a)は新鮮な ROSA26精巣細胞（3x105細胞;左側）、凍結'融解 ROSA26精巣細胞（ 3x104細胞;右側）を移植した後の、 Wレシピエント精巣の肉眼視により観察した状態 を示す写真である。ドナー由来の精子形成は X-galで青色に染色されるが、添付の 図 l aでは灰色乃至黒色の斑点で表されている。図 l a左側 (新鮮）では精巣中に 1つ 、右側（凍結）では、精巣中に 4つの精子形成が認められ、この結果は、凍結'融解し たものの方が精子形成能が高いことを示している。低濃度であるにも拘わらず、凍結
•融解ドナー精巣細胞由来のドナー精巣細胞由来精子形成が高レ、こと力 S分力る。 （b
)は凍結'融解精巣細胞移植後 2ヶ月目のレシピエント (W)精巣の組織切片の顕微 鏡写真である。生殖細胞は正常な精子形成像を呈している。へマトキシリンおよびェ ォシン染色した。 Bar = 1 mm (a)および 25 mm (b)。
[0042] 表 Π: 凍結'融解幹細胞および新鮮幹細胞のコロニー形成能の比較
[表 2]
mean± SEM,データは各セットについて 2回実験して得た。
注入量: Wマウス精巣には 3 μ 1、ブスルファン処理 Β6マウスの精巣には 10 μ 1をィ
[0043] 表 IIは、 Wレシピエントマウスの場合、凍結'融解ドナー精巣細胞由来のコロニーは 新鮮なドナー精巣細胞由来のコロニーの 11.7倍 (62.1 : 5.3コロニー/ 105ドナー細胞、 Ρ < 0.05)であることを示してレ、る。同様に、ブスルファン処理 Β6レシピエントマウスの 場合も、凍結 ·融解ドナー精巣細胞由来のコロニーは新鮮なドナー精巣細胞由来の コロニーの 5.1倍 (Ρく 0.01)と高くなつている。表 IIおよび図 1に記載の結果は、凍結. 融解ドナー精巣細胞が新鮮なドナー精巣細胞より精子形成活性が高いことを示して いる。これらの結果はまた、本発明方法によれば、安定に多量の精子が形成されるの で自然交配による受精が可能となること、さらには本発明方法が実用化に適すること を示すものである。
[0044] 実施例 2 凍結精子幹細胞を移植したレシピエントの稔性回復およびドナー幹細胞 由来の仔の作成 (第二実験）
( 1 )ドナーとして上記のトランスジエニックマウス GFP (Green)を用レ、た。ドナー精巣細 胞の凍結'融解およびドナー精巣細胞浮遊液の調製は、上記「 (2)ドナー細胞（ドナ 一由来の精子幹細胞）」に記載の方法に準じて行った。生後 6日齢のマウス (pup)もし くは停留睾丸処置後 2 - 3ヶ月後の成熟マウス (adult, 6 - 8週齢)から精子幹細胞を得 、凍結した。このトランスジエニックマウスの精原細胞と精母細胞は増強された緑色の
蛍光性蛋白（EGFP)を発現しており、その発現は減数分裂以降減少する。
[0045] (2)ドナー細胞の移植
移植用ドナー細胞
上記の方法にしたがい、 2_3週間液体窒素中で凍結保存した後、融解したドナー 精巣細胞を含有する DMEM/FCS中浮遊液を用いた。
[0046] 移植
上記の「（3)ドナー細胞の移植」に記載の方法で行った。
表 1に記載の要領で、成熟 GFPマウス (停留精巣処理）由来のドナー精巣細胞浮 遊液を B6マウス（成熟，ブスルファン処理）および Wマウス（成熟または未成熟）にマイ クロインジヱクシヨンした。一方、未成熟 GFPマウス由来のドナー精巣細胞浮遊液を Wマウス (未成熟）にマイクロインジヱクシヨンした。ドナー精巣細胞移植後、レシピエ ントマウスを該動物の通常の飼育条件下で飼育した。対照として、非移植マウスを同 一条件下で飼育した。
[0047] 自然交配による仔の作成
ドナー精巣細胞移植後、上記の飼育条件下で飼育したレシピエントマウスを、雌性 B6野生型マウスと共にこれら動物の通常の飼育条件下で飼育し、 自然交配させ、仔 の発生を検討した。成熟マウスの場合は 2週間後、未成熟マウスの場合は 6週間後に 、交配を試みた。
[0048] レシピエント精巣の組織学的検査
レシピエントマウスを通常の条件下で飼育し、ドナー精巣細胞移植後 213— 246日 目に、開腹し、各動物の精巣を回収し、ドナー精巣細胞の移植効率を判定した。実 施例 1と同様に精巣の切片を作成し個々のスライドを正立顕微鏡を用いて 400倍の 拡大率で観察した。ホストの精巣内での精子形成の度合いを表すために、精子形成 の見られるもの（精細管の全周に渡って、多層の細胞が見られるものと定義）と精子 形成の見られないものとの数を 3枚のスライドより記録した。最低 500本の精細管の力 ゥントを行った。統計学的な処理は Studentの t-testで行った。
また、雌マウスからの仔の出産が認められたレシピエント（稔性レシピエント）、認め られなかったレシピエント（不稔性レシピエント）および移植しないで飼育した対照動
物の精巣重量を測定した。
[0049] 結果を表 III、表 IVおよび図 2に示す。図 2は、不妊 Wマウスにおける凍結 ·融解精 巣細胞による稔性回復実験の結果を示す図である。（a)は非移植マウスの精巣 (左)と 凍結精子幹細胞移植から 241日目の移植レシピエント（マウス番号 1156)の精巣 (右） の顕微鏡写真である。レシピエント精巣が非移植マウスに比較してかなり大きく成長 していることが分かる。（b)は非移植 Wマウスの精巣の組織切片の顕微鏡写真である。
(c)は移植されたレシピエントの精巣の組織切片の顕微鏡写真である。 (b)では管腔 内が白く抜け、空になっており、精子が存在しないが、（c)では管腔内の周辺部に黒 レ、点で表された精子が多数形成されてレ、ること力わ力、る。（d)は凍結 ·融解睾丸停留 Green由来の精巣細胞を移植された Wレシピエントと雌性 B6(黒)から産まれた仔の写 真である（白，マウス番号 1156)。組織はへマトキシリンおよびェォシン染色した。 Bar = 1 mm (aノぉよび 50 mm (b, c)。
[0050] 表 IIIの実験結果は各移植細胞型について 2— 3回の実験データに基づいて mean
土 SEMで表した。
表 IVに、稔性を回復した 5匹のレシピエントの詳細なデータを記載する。
[0051] 表 III：凍結'融解精巣細胞の移植後の精子形成
[表 3]
a :レシピエント精巣横断面における精子形成の割合（％)。精細管の全周に渡って 多層の細胞が見られるものを精子形成陽性と判定した。
b : N. D.は内因性精子形成があるため測定できなかったことを意味する。
[0052] 表 IV：凍結 ·融解幹細胞をマイクロインジヱタトされた Wレシピエントマウス由来の子
[表 4]
接O傲 b 5 [# ； i¾ [ ¾
卜 1 *e * I 醫
7— v i fエノ! ^ T 接 : fl¾
T 'vT s 朱里 ¾ ^X /J 5*Χ¾ΐΚ レシヒ°ェント 細胞型 a の日数 (mg) 精細管の割合 (％ までの日数 d
1 ΛΑ 7
adult pup 241 190
L 11. 3 N. D.
58. 5 87. 6
adult pup 241 81
L 12. 0 Ν. D.
1860R 23. 9 87. 7
adult pup 228 72 L 6. 5 Ν. D.
1868R 35. 8 67. 0
u pup 240 136 し 11. 5 Ν. D.
2711R 33. 7 65. 9
adult adult 221 221 L 32. 2 59. 2 a :ドナー細胞型； adult,睾丸停留
b：未成熟 (pup)レシピエントの場合は右側精巣のみに移植した力 成熟 (adult)レシ ピエントには両側精巣に移植した。
c：レシピエント精巣横断面における精子形成の割合（％)。精細管の全周に渡って 多層の細胞が見られるものを精子形成陽性と判定した。
d：移植から雌マウスが最初の仔を産むまでの日数。
N.D.：移植してレヽなレ、ため測定してレヽなレ、ことを意味する。
[0053] 表 IIIに示すように、凍結'融解ドナー精巣細胞を移植された 8匹の W (pup)マウスの うち、 4匹が稔性を回復し移植から 72-190日の間に雌マウスに仔を産ませた。表 IVに 示すように、そのうち 3匹は成熟睾丸停留マウス由来のドナー精巣細胞を移植され、 1 匹は未成熟マウス由来のドナー精巣細胞を移植されたものである。ドナー精巣細胞 の起源は、 UV測定による緑色蛍光により確認した。
[0054] 稔性レシピエントの精巣重量 (40.7 ± 7.3mg;n = 4)は不稔性レシピエントの精巣重 量 (22.6 ± 2.2 mg;n = 4 Pく 0.05)または非移植対照動物の精巣重量（10.4土 0.8 mg; n = 7 Pく 0.01)より有意に大きかった（図 2aをも参照）。組織学的な分析により、 稔性レシピエントの精巣中のドナー生殖細胞コロニー（77.4土 4.8%;n = 4)は、不稔 性レシピエントの精巣中のドナー生殖細胞コロニー (27.0土 2.3%;n = 4)より広範囲に 及ぶことが分かった（Pく 0.001)。図 2bおよび図 2c参照。
[0055] Wマウスは精子形成能を持たないので、レシピエントの精巣での精子形成は全てド ナー精巣細胞由来である。し力しながら、精子形成能の回復は 8匹の未成熟 Wレシ ピエントの全てで認められ、そのうち 7匹の精巣上体切片では精子形成が認められ（
7/8、 87.5%)、潜在的な稔性を示していた。雌マウスから仔を産生した 4匹のレシピエ ントは分析の時点まで稔性を維持した (即ち、移植後少なくとも 228日後まで)。図 2d、 表 3参照。これは、移植した精子幹細胞が連続的に分裂し正常に分化したことを示し ている。
以上の結果から、未成熟ドナーまたは睾丸停留成熟ドナー由来の凍結幹細胞移 植は、先天的に不妊である Wレシピエントマウスに正常な稔性を回復させることが明 らかになつた。
[0056] 一方、成熟レシピエントにおいては、稔性の回復はさほど有効でなかった。 1/9の成 熟 Wレシピエントは自然交配で雌マウスに仔を産ませた力 その仔は移植から 221日 目に初めて得られた。そして、精子形成能の回復は全例で認められたものの、精巣 上体における精子の含有率は未成熟レシピエントの含有率より低い（55.6%対 87.5% 、表 ΠΙ参照)。また、 7力月後においても、ブスルファン処理レシピエントは稔性を回復
[0057] 図 3はブスルファン処理成熟レシピエント精巣におけるドナー精巣細胞コロニー形 成の状態を示す写真である。（a)は未成熟 Greenマウス精巣細胞巣を移植されたレシ ピエント精巣の肉眼視で観察した状態を示す写真である。 UV下緑色の精細管は、ド ナー精巣細胞のコロニー形成の存在を示しており、添付の図 3aでは白一灰色で表さ れている。（b)は (a)の精巣の組織切片の顕微鏡写真である。精子形成が幾つかの精 細管で認められている。しかし、（a)に記載の精巣の精巣上体の精細管には精子が存 在しない（c)。へマトキシリンおよびェォシン染色した。 Bar = 1 mm (a)および 200 mm (b， c)。
[0058] 2つの型の成熟レシピエント（W， B6)でドナー由来の精子形成が認められた力 精 子形成レベルは未成熟レシピエントより有意に低ぐ精巣上体の図から明らかなよう に、精子数が少ないために自然交配で雌マウスを妊娠させることができなかったと考 えられる。これは、ブスルファン処理レシピエント精巣の移植から 12ヶ月後に行った 組織学的検査の結果に示されている（図 3bおよび c)。
[0059] 顕微受精
自然交配では不妊であるブスルファン処理レシピエントマウスを用いて、ヒトの不妊
治療における方法により顕微受精を行った（Palermo, G.et al.(1992) Lancet 340, 17-18; Kimura, Y. et. al. (1995) Development 121, 2397-2405)。凍結ドナー精巣細 胞（未成熟ドナー由来）を移植した後、 180日目にブスルファン処理マウス（1匹）を犠 牲にし、 UV光の下、ドナー精巣細胞由来の EGFP遺伝子陽性のコロニーを蛍光実 体顕微鏡 (MZ FUII,ライカ製）を用いて観察した。この精細管を機械的に何度もピぺ ッティングすることで生殖細胞を回収した。こうして回収した生殖細胞は顕微受精に 用いる前に、以前報告した方法で再度凍結し、顕微受精まで保存した。 3日間凍結 保存した後、成熟精子または伸長精子細胞を雌マウス C57BL/6 X DBA/2 F1 (B6D2F1)の卵子（細胞質内）にインジェクションした。卵は過排卵を誘導した雌マウス より採取した。使用した雄性生殖細胞に関係なく約 80%の卵子が 24時間以内に 2細 胞期に到達した。 80の精子と 21の伸長精子細胞により構築された 101のディプロイド 接合体を輸卵管に移した。そのうち 68個（67%)が子宮に移植され合計 31匹の仔（31 %)が産まれた。ドナー起源は紫外線下、蛍光により確認された。子孫は、稔性であ ることが分かった。
[0060] 以上から、ドナー精巣細胞は未成熟な個体および成熟した個体のいずれから得た 精子幹細胞を用いても、成熟または未成熟なレシピエント内で精子を形成させ自然 交配により仔を産生することができることが明らかになった。また、 自然交配による仔 の産生は、成熟レシピエントより未成熟レシピエントの方が成功率が高い傾向にある ことも明らかになった。
産業上の利用可能性
[0061] 本発明により、従来、脊椎動物の生殖技術において、凍結精子に代えて凍結精子 幹細胞を使用することが可能となり、凍結や保存の際の煩雑な処理、融解精子の生 殖能力の低下、多量の精子取得の困難さなど、精子の使用に伴う様々な問題が解 決され、より確実で安定な生殖技術を確立する途が拓かれる。本発明方法は、家畜 や実験動物の系統維持のみならず、希少動物の保護、さらには先天的な不妊症や 悪性腫瘍の治療等により二次的に不妊症に罹患しているヒト患者の治療にも有用で める。
Claims
[1] ドナー動物由来の凍結精子幹細胞を用いて雄性レシピエント動物の生殖器官内で 精子を形成させて繁殖用雄性個体を得、該個体を用いてドナー動物の精子幹細胞 由来の動物個体を作成する方法。
[2] ドナー動物由来の凍結精子幹細胞を雄性レシピエント動物の生殖器官に移植し、 該レシピエント動物の精巣内で精子を形成させて繁殖用雄性個体を得、該個体由来 の精子を用いて受精卵を得、得られた受精卵から動物個体を発生させることを特徴と する請求項 1記載の方法。
[3] 受精卵を、繁殖用雄性個体と雌性動物との自然交配、または該繁殖用雄性個体の 精子を用いる人工授精もしくは体外受精 ·胚移植法によって得る請求項 2記載の方 法。
[4] 受精卵を、繁殖用雄性個体と雌性動物との自然交配によって得る請求項 3記載の 方法。
[5] 雄性レシピエント動物が未成熟な動物である、請求項 1一 4のいずれかに記載の方 法。
[6] ドナーおよびレシピエント動物が脊椎動物である、請求項 1一 5のいずれかに記載 の方法。
[7] 脊椎動物が哺乳動物、鳥、魚、両性動物および爬虫類動物から選択される請求項 6記載の方法。
[8] ドナーおよびレシピエント動物が無脊椎動物である請求項 1一 5のいずれかに記載 の方法。
[9] 凍結精子幹細胞を雄性レシピエント動物の精細管または精巣網に供給する、請求 項 1一 8のいずれかに記載の方法。
[10] 凍結精子幹細胞を雄性レシピエント動物の輸精管をガイドとして精巣網に供給する
、請求項 9記載の方法。
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