CN102713614A - 生殖系干细胞储存系统 - Google Patents

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查德·马科
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托马斯·拉莫斯
凯尔·霍尔顿
杰林德·王
马涅·奥尔姆斯蒂德
周永强
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Abstract

本发明提供了用于分离、表征、冷冻保存和储存人类生殖系干细胞和性腺组织的方法和系统。还公开了移植冷冻保存的细胞以再迁入不育的繁殖器官的方法。

Description

生殖系干细胞储存系统
相关申请的交叉引用
在35U.S.C.§119(e)下，本申请要求2009年11月5日提交的美国临时申请号61/258,535的权益，其全部内容通过引用并入本文
发明领域
本发明涉及下述系统，所述系统储存来自由于损伤其生殖系干细胞(germline stem cell)而处于生育力风险的患者的生殖系干细胞并在稍后的日子恢复患者的生育力。具体地，本发明涉及收集和分离生殖系干细胞、处理细胞并冷冻保存和测定细胞的繁殖能力。本发明还公开了恢复患者生育力的的方法，生殖系干细胞分离自所述患者。
发明背景
生殖系干细胞存在于繁殖器官即卵巢和睾丸中，它们潜在地代表哺乳动物体内最重要、最受保护的干细胞种类之一。已报道了在得自这些组织的干细胞中的遗传保守和高端粒酶活性，以及由染色质染色体修饰的广泛的DNA修饰。科学家们对于成年繁殖组织中存在何种干细胞以及它们在分化中的潜能持不同观点。
化学疗法和放射治疗不但以癌细胞为目标，还以快速分裂细胞为目标。在睾丸中，快速分裂的生殖细胞对这些暴露是高度敏感的。在青春期前的睾丸中，生殖系干细胞同样敏感并在放射暴露后严重地剂量依赖性地衰竭。低剂量的细胞毒性药物或辐射使分化的精原细胞衰竭，而较不敏感的精原干细胞以及精母细胞和精细胞可存活。分化中的生殖细胞可继续它们的成熟成为精子细胞，并可用产生于存活的干细胞群的干细胞再定殖(re-colonize)生精小管(seminiferous tubule)。
然而，在严重衰竭的情况下，精子生成仅可在非常少的生精小管中恢复，从而限制生育力。在睾丸干细胞全部衰竭后患者会永久性的不育。对精子生成的影响在青春期时或之前表现得最严重，因为精子典型地不能在青春期后雄性中获得和冷冻保存。如果给予足够的时间重新开始精子生成，甚至少数干细胞可再定殖生精小管。
直到最近，人们相信，包括人类的大多数哺乳动物物种的雌性性腺，容纳有封在原始卵泡内的有限数目的减数分裂-停止的生殖细胞(卵母细胞)，其作为在每个月经周期期间排卵时释放的卵的储备库存。通过多种机制包括细胞凋亡，卵母细胞数目在出生后生命期间减少，其被广泛认为最终导致卵巢不再含有生殖细胞。人类中，卵母细胞储备耗尽典型地在生命的第五个十年期间发生，而推动绝经。
根据这些基本的繁殖生物学理论，人们还认为，一旦衰竭，卵巢生殖细胞库不能再补充。因此，加速卵母细胞损失的任何治疗对生育力下降有危险并会在比期望的更早的年龄引起绝经。例如，女性暴露于损伤卵巢的广范围的试剂(例如化疗剂和放射疗法)，通常导致过早绝经和不可逆的不孕。目前，在各种不利条件下保存生育力和正常卵巢功能的有限的治疗选择(例如，冷冻保存卵巢组织碎片或单个卵母细胞)是侵入性的并通常需要在先的激素疗法，这对许多患有激素反应性肿瘤的女性而言可能是医学上不适当的。而且，目前没有能推迟绝经期的正常卵巢衰退的治疗选择。
已发现了针对在雄性和雌性二者中恢复功能性生殖细胞的两种主要途径。第一种是在存活的组织上移植(graft)未成熟组织(卵巢或睾丸)的组织碎片，第二种以干细胞的分离和移植为基础。
生殖细胞移植已在啮齿动物模型中开发。将来自小鼠或密切相关物种的生殖细胞显微注射进小鼠的生精小管再次刺激了从供体精原干细胞的精子生成。在转移之前，精原细胞可被冷冻保存或培养。类似地，冷冻保存的卵巢皮质组织已在绵羊和人类中移植，引起发情恢复并在正常交配后产生活的后代。
因此，需要人类的生殖系细胞储存系统(banking system)，以恢复没有能力储存成熟的精子或卵子的患者的繁殖潜能。
发明内容
本公开提供了提供了生殖系细胞储存系统，其包括从雄性和雌性二者中收集、分离、扩展、处理、冷冻保存、检验、释放和移植生殖系细胞的方法。
在本文公开的一种实施方式中，提供了储存生殖系干细胞的方法，其包括从处于生育力丧失风险下的哺乳动物中收集性腺组织；将所述性腺组织运输至中心储存设施；处理所述性腺组织；冷冻保存所述性腺组织；并测定所述冷冻保存的性腺组织的生育力潜能。
在本方法的一种实施方式中，性腺组织是睾丸组织。在另一种实施方式中，处理睾丸组织包括制备约0.5-2.0mm2的睾丸组织片。在另一种实施方式中，处理睾丸组织包括用选自下述组的至少一种酶消化所述睾丸组织：胶原酶、DNase、透明质酸酶和胰蛋白酶；并使所述至少一种酶失活，因而获得离解的睾丸细胞的悬液。在另一种实施方式中，方法还包括从所述离解的睾丸细胞中分离雄性生殖系干细胞的步骤，其中所述雄性生殖系干细胞特征在于它们不表达黄体生成素受体。在另一种实施方式中，方法还包括从所述离解的睾丸细胞中分离雄性生殖系干细胞的步骤，其中所述雄性生殖系干细胞特征在于它们表达SSEA-4。在另一种实施方式中，雄性生殖系干细胞还表达GFR-α1和VASA。
在本发明的另一种实施方式中，测定生育力潜能是所述睾丸组织体外分化为成熟的精子的能力。在另一种实施方式中，测定生育力潜能是通过减数分裂标记物和减数分裂后的标记物的表达以及尺寸和形态学的至少一种来测定睾丸细胞的特征。
在本方法的一种实施方式中，性腺组织是卵巢组织。在另一种实施方式中，处理卵巢组织包括制备制备约0.5-3.0mm2卵巢组织片。在另一种实施方式中，处理还包括用选自下述组的至少一种酶消化所述卵巢组织：胶原酶、DNase、透明质酸酶和胰蛋白酶；并使所述至少一种酶失活，因而获得离解的卵巢细胞悬液。
在另一种实施方式中，测定生育力潜能通过所述卵巢组织体外分化为成熟的卵子的能力来进行测定。在另一种实施方式中，测定生育力潜能是通过减数分裂标记物和减数分裂后的标记物的表达以及尺寸和形态学的至少一种来测定卵巢细胞的特征。
在另一种实施方式中，所述方法还包括将所述冷冻保存的性腺组织植入从中分离该性腺组织的相同个体的剩余性腺组织中。
在本文公开的一种实施方式中，提供了生殖系干细胞储存系统其包括，收集性腺组织的手段；运输性腺组织的手段；处理性腺组织以分离生殖系干细胞的手段；冷冻保存性腺组织或所述生殖系干细胞的手段；测所述冷冻保存的性腺组织或所述冷冻保存的生殖系干细胞的生育力潜能的手段。
附图简述
图1描绘了使用流式细胞计量术从转基因OG2小鼠中分离的睾丸干细胞GFP(绿色荧光蛋白)阳性亚群的富集。GFP表达指出的Oct-4阳性细胞在与野生型(图1A)比较的新生(图1B)和成年(图1C)OG2小鼠二者中作为不同的细胞群体被发现。在Oct-4阳性细胞中，发现由c-Kit阳性(R5)和c-Kit阴性(R2)组成的两种清晰的亚群(图1D-1E)。还展示了GFP和c-Kit表达之间的关联(图1F-1H)。
图2描绘了培养物中专能生殖细胞(mGC)系发育期间的形态改变。在培养前于细胞制备物中观察小鼠Oct-4+/GFP+细胞(图2A；箭头；第1-3天)。培养后不久观察到Oct-4的下调(图2B；第3-7天)。在培养第二周细胞黏附后，发生明显的形态改变(图2C第7-15天；图2D第15-20天)。培养约三周后，形成含有小圆细胞的集落(图2E；第20-30天)。培养约一个月后观察到Oct-4的上调(图2F；第30-40天)。图2G-I中分别展示了来自于新生OG2、成年OG2或新生OG2-LacZ的三种确立的mGC株系的图像(图2G，新生OG2；图2H，成年OG2；图2I，OG2LacZ)。标度棒：50μm。
图3描绘了在补充有15％胎牛血清(FBS)的PM-1TM培养基中，在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养的专能生殖系前体细胞。在培养期间的不同时间点上，使用荧光辅助的细胞分选(FACS)测定GFP阳性细胞的数量(图3A-3D)。图3E描绘了细胞数量与时间相比的图。标度棒等于60μm。
图4描绘了mGC的表型特征和分子特征。多能和生殖细胞标记物的免疫定位展示于图4A-4D(Oct-4)、图4E-4H(Nanog)、图4M-4O(SSEA-1)和图4I-4L(生殖细胞标记物VASA)中。标度棒：图4A-4H：25μm；图4I-4O：20μm。图4Q中展示了通过RT-PCR测定的多能和生殖特异性标记物的表达。图4P中展示了免疫沉淀(IP)之前和之后对mGC细胞中Oct-4、Nanog和Sox2的蛋白质含量的Western印迹分析。
图5描绘了成年的来自脂肪的干细胞(ADSC)、小鼠ES细胞、c-Kit分选后新鲜分离的生殖系干细胞和第10代专能生殖系干细胞(新生OG2)的端粒酶活性和核型分析。生殖系干细胞中的端粒酶活性与小鼠ES细胞中相当，并且高于ADSC细胞中的活性(图5A)。图5B描绘了相同的新生OG2细胞系的核型。该图代表了分析的80个中期涂片。15代后细胞显示正常的核型。
图6描绘了培养之前(NGC)和之后(GC)专能生殖系前体细胞的印迹分析，并针对有差异地被甲基化的区域Meg3、Peg10、Oct-4、Igf2r和Rasgrf1与小鼠ES细胞比较。
图7描绘了mGC的自发分化。图7D-7F中展示了胚状体(EB；图7A)的原肠胚形成和指示极化上皮的标记物的表达(E-钙黏着蛋白和层粘连蛋白1；图7B-7C)和三种胚层的早期发育，即外胚层(ZIC1，PAX6，SOX1)、内胚层(GATA4，FOXA2)和中胚层(BRACHYURY、BMP4和COL2A1)。在培养中，再程序化mGC也自发分化为心肌细胞(图7G-7J)、脂肪细胞(图7K)和神经细胞(图7L和7M)。标度棒：图7A和7I：50μm；图7C和7E：30μm；图7B和7D：25μm；图7G、7H和7L：45μm；图7K：12μm。
图8描绘了诱导的mGC成为谱系特异性表型的分化。图8A-8G中展示了表达神经标记物的细胞的共聚焦图像。图8J中展示了神经基因标记物的表达。图8I中展示了分化为心肌细胞的mGC的共聚焦图像。图8L中展示了心基因标记物的表达。图8H中展示了mGC分化后阿利新蓝(alcian blue)阳性的软骨细胞。图8K中展示了软骨细胞特异性基因的表达。标度棒：图8A、8C和8G：20μm；图8B和8H：50μm；图8D-8F和8J：10μm。
图9描绘了小鼠ES细胞移植进皮肤、肌肉和睾丸中后形成畸胎瘤(图9A-9F)，但是专能的LacZ-GFP mGCs(图9G-9L)移植进皮肤、肌肉和睾丸中后则不形成畸胎瘤。通过H&E染色在薄石蜡切片上鉴定来自ESC的畸胎瘤的形态，而移植的专能生殖细胞(mGCs)的命运则通过以蓝色显示的LacZ染色鉴定。移植后六周，在皮肤(在毛囊的膨胀区域和邻近的皮脂腺中，箭头头部；图9G-9H)、肌肉(箭头；图9I-9J)和睾丸(箭头；图9K)中发现GFP-LacZ+mGCs。在培养之前和之后移植生殖干细胞后的睾丸再生展示于图9M-9R中。免疫缺陷小鼠的正常睾丸的横向切片展示于图9M中。白消安处理一个月后，大部分生精小管的内部精子生成衰竭(图9N)。用新鲜分离的Oct-4阳性细胞移植的小鼠的睾丸在多于50％的生精小管横向切片中显示精子生成，表明在该群体中存在具有SSC特性的细胞(图9O)。尽管用Oct-4阳性c-Kit阴性细胞移植的小鼠的多于80％生精小管显示一些程度的精子生成(图9P)，但是接受Oct-4阳性c-Kit阳性细胞的小鼠中的大部分生精小管横向切片是空的(图9Q)。移植的mGC也不能够再迁入(repopulate)受者睾丸，表明它们不具有SSC特性(图9R)。标度棒：图9A和图9K：275μm；图9B、9D和9I：60μm；图9C：140μm；图9E：100μm；图9F：50μm；图9G和9L：125μm；图9H和9J：40μm；图9M-9R：60μm。
图10描绘了将mGC掺入胚泡和宿主胚胎中后嵌合体的形成。图10A-10D中展示了早期胚胎发育和胚泡形成期间LacZ-GFP+mGC细胞的掺入。在8细胞阶段注入的大部分GFP-lacZ细胞已在胚胎发育的第2天被掺入(箭头头部)，一些细胞尚未掺入(箭头)。在第3.5天时，进一步发现GFP阳性细胞被掺入胚泡的内部细胞团(箭头)中。图10E中作为全胚胎染色展示了显示不同程度嵌合状态的四种嵌合胚胎。为了使内部器官可见，还显示了两种胚胎(用星号标明)的纵向切片(图10F和10G)。图10H-10K显示切片器官中的嵌合模式，图10L-10O显示脑、心、肝和生殖腺脊中组织学切片中的嵌合细胞群体(嵌合的LacZ-GFP细胞显示为蓝色)。图10P和10Q中分别展示了嵌合幼兽的组织中GFP和LacZ DNA的扩增。标度棒：图10A和10C：50μm；图10B和10D：25μm；图10E-10D：1250μm；图10H-10K：625μm；图10L-10N：50μm；图10O：10μm。
图11在流式细胞计数图中以图形方式描绘了从转基因OG2小鼠中新鲜分离的新生和成年卵巢细胞，其中Oct-4启动子驱动GFP的表达。图11A显示成年卵巢生殖系干细胞，其通过GFP的荧光强度以图形方式描绘。图11B显示新生卵巢生殖系干细胞，其通过GFP的荧光强度(GFP+细胞上的c-Kit水平)以图形方式描绘。图11C以图形方式描绘了表达c-Kit的新生GFP阳性细胞的荧光强度，所述细胞也已知为CD117。
图12描绘了出生后第2天转基因OG2小鼠的卵巢横向切片中可以通过绿色荧光蛋白的表达来鉴定的生殖系干细胞。图12A和12B展示了总体荧光，图12C展示经计算机强化的去除了自发荧光的图像。
图13描绘了对从分离自OG2转基因小鼠的小鼠胚胎干细胞(第3道)、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF，第4道)、GFP阳性生殖系干细胞(第5道)和GFP阴性细胞(第6道)中分离的mRNA的RT-PCR分析结果。
图14描绘了确立并作为集落在MEF细胞饲养层上生长的、经分离和基本纯化的卵巢生殖系干细胞的显微镜图像。图14A展示了培养4天后的集落；图14B展示了第一类代表性集落形态；图14C展示了第二类代表性集落形态；图14D展示了用胶原酶传代后的集落形态；图14E展示了胶原酶传代后具有清楚确定边缘的第三类代表性集落形态；图14F展示了胶原酶传代后具有不确定边缘的第四类代表性集落形态；图14G展示了传代#1后的集落形态；图14H展示了传代#2后的集落形态；图14I展示了传代#3后的集落形态；图14J和14K展示了传代#4后两种不同放大率的卵巢生殖系干细胞集落。
图15描绘了经分离和基本纯化的卵巢生殖系干细胞的免疫细胞化学染色，所述细胞被染色以揭示以下的表达：多能干细胞标记物Oct-4(图15A)；多能干细胞标记物Nanog(图15B)；生殖细胞标记物VASA(图15C)；和多能干细胞标记物碱性磷酸酶(图15D)。
图16描绘了分化中的卵巢生殖系干细胞的图像。图16A展示了GFP阳性细胞，其类似于在雌性生殖细胞集落中心生长的初级卵母细胞；图16B展示了滤泡样结构的图像；图16C展示了GFP阳性细胞，其类似于在雌性生殖细胞集落附近生长的初级卵母细胞；并且图16描绘了有颜色的集落。
图17在散射图中以图形方式描绘了图16培养的卵巢细胞的流式细胞尺寸分析的结果，验证和表征了大(＞15mm)的卵母细胞样细胞：图17A描绘了MEF对照细胞(＜15mm)；图17B描绘了图16的卵母细胞样细胞。
图18描绘了精原干细胞和生殖系细胞标记物在成年灵长类睾丸中的免疫组织化学定位。
图19描绘了灵长类睾丸生精小管的基底膜上用干细胞标记物阳性染色的细胞的分布。
图20描绘了使用流式细胞计量术对灵长类生殖干细胞的表型表征。
图21描绘了灵长类生殖系干细胞的流式细胞分析。
图22描绘了不同的富集的灵长类生殖系细胞群体中GFRα阳性/VASA阳性的细胞。
图23描绘了灵长类生殖系干细胞亚群的羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CSFE)活性。
图24描绘了用白消安处理过的带有灵长类生殖系干细胞的灵长类睾丸的再迁入：用未分选的细胞移植的受者小鼠的生精小管(图24A)；通过三种标记物分选的细胞(图24B)；SSEA-4阳性分选的细胞(图24C)；和假移植的对照睾丸(图24D)。
图25描绘了通过碘化丙啶染色的灵长类生殖系干细胞群体的流式细胞计量术测定的DNA含量。
图26描绘了对灵长类生殖系干细胞中PLZF表达(图26A)和端粒酶活性(图26B)的定量PCR分析。
图27描绘了通过增殖细胞核抗原(PCNA)测定的增殖中的灵长类生殖系干细胞的百分比。
图28描绘了灵长类生殖系干细胞亚群的基因表达谱。
图29描绘了在MEF饲养层上培养10天后扩展的灵长类生殖系干细胞集落的形态(图29A)；扩展的灵长类生殖系干细胞集落的SSEA-4染色(图29B和C)；和传代4次后扩展的灵长类生殖系干细胞集落的GFR-α染色(图29D)。
图30描绘了用SSEA-4(图30A)和VASA(图30B)染色的人类全睾丸组织(THT)。
图31描绘了用GFR-α(图31A)和VASA(图31B)染色的THT。
图32描绘了针对VASA(图32A)和Nanog(图32B)染色的THT。
图33描绘了针对SSEA-4(图33A)和α6-整联蛋白(图33B)染色的THT。
图34描绘了图30-33的阴性对照，其由仅用第二抗体染色的人类睾丸切片组成。
图35描绘了THT SSEA-4阳性磁珠分选的细胞移植进用白消安处理的受者小鼠睾丸中，并在一个月以后用SSEA-4(图35A)和人类核蛋白(图35B)染色。图35C和D描绘了阴性对照。
图36描绘了THT SSEA-4+磁珠分选的细胞移植进用白消安处理的受者小鼠睾丸中，并在一个月以后用α6-整联蛋白(图36A)和人类核蛋白(图36B)染色。
图37描绘了THT SSEA-4+磁珠分选的细胞移植进用白消安处理的受者小鼠睾丸并在一个月以后用SSEA-4(图37A)和α6-整联蛋白(图37B)染色。
图38描绘了图36和37的阴性对照，其由仅用第二抗体染色的人类睾丸切片组成。
图39描绘了来自对照和移植的动物的睾丸的重量。
图40描绘了能育的(图40A)和不育的(图40B)睾丸。
图41描绘了在能育和不育动物中的精子生成(空的和部分满的生精小管的百分比)阶段。
图42描绘了在不育和能育的小鼠中GFP阳性生精小管的百分比。
图43描绘了成年人类睾丸细胞的形态学和细胞表面标记物分析。注意到，得自梗塞性无精子症男人的睾丸的形态学(图43A)与正常人类睾丸类似(图43B)。分离后从正常睾丸(图43C)和从无精子症患者收集的睾丸(图43D)二者也获得了具类似形态学的细胞。注意到，SSC在两种睾丸分离物中都存在并可鉴定为具有大的细胞核的圆形：细胞质比率，1-3核仁和细胞质内含物。从成年人类睾丸中分离的细胞(图43E-H)的表面标记物SSEA-4、CD49f和CD90的流式细胞计量术分析。在成年人类睾丸活组织检查中发现了SSEA-4+、CD49f+和CD90+细胞的不同群体，且在成年人类睾丸中未发现CD49f和CD90的双染色的细胞(图43E-F)。在图43I中列出四种独立的流式分析的直方图表示。
图44描绘了在成年人类睾丸中的精原细胞干细胞标记物的免疫组织化学定位。生精小管的基底膜处的SSEA-4和CD49f的共定位(图44A-C)。SSEA-4特别位于生精小管的基底膜处的精原细胞亚群，可能为(persumabely)SSCs。所有的SSEA-4+细胞针对CD49f也是阳性的，而有一些是SSEA-4-的CD49f+细胞。C-Kit在位于生精小管的基底膜处的两种细胞中和更高级的生殖细胞中被发现(图44E-F)。SSEA-4和c-Kit的共定位揭示了，一些SSEA-4+细胞具有c-Kit并且一些是c-Kit-。CD49f与c-Kit的共定位(图44G-I)显示了生精小管横向切片的基底膜处的大多数CD49f+细胞就c-Kit而言也是阳性染色的。在成年人类睾丸中的Nanog的表达模式与c-Kit类似且其在未分化的和分化的生殖细胞中都存在(图44K-L)。SSEA-4与Nanog的共定位显示了在成年人类睾丸中的一些SSEA-4+细胞是Nanog+。
图45描绘了从成年人类睾丸中分离的SSC的富集群体的定量RT-PCR分析和端粒酶活性。SSEA-4+细胞显示了SSC特异性基因(包括GFR-α1、C-Ret、GPR-125和hTERT)的显著(P＜0.05)较高的表达水平(图45A)。另外，c-Kit在SSEA-4+细胞中较之阴性细胞显著增加。SSEA-4+细胞的端粒酶活性也显著(P＜0.01)高于新鲜分离的非分选的细胞(图45B)。
图46描绘了人类精原干细胞再迁入小鼠睾丸中的特异性标记物表达。小鼠睾丸中的人类细胞的鉴定是通过人类核蛋白(HNP)抗体检测的(图46A)。注意到，注意到，在小鼠睾丸中建群的人类细胞就生殖细胞特异性标记物VASA而言是阳性染色的(图46B-C)。小鼠睾丸的基底膜处的一些人类细胞共定位CD49f并且一些就该标记物而言是阴性的(图46D-F)。SSEA-4与c-Kit的共定位显示了在小鼠睾丸中的所有SSEA-4+细胞表达c-Kit(图46G-I)。小鼠睾丸中建群的人类细胞之中，一些与GPR-125共定位且一些是用多能标记物Nanog阳性染色的(图46J-L)。HNP与c-Kit的共定位揭示了小鼠睾丸中的所有人类细胞是c-Kit+(图46M-O)。
图47描绘了用于通过流式细胞计量术表征的人类精原干细胞的细胞表面标记物的表达模式。在成年人类睾丸中发现有微小量的细胞(1-2％)表达GFR-α1、CD24、CD117和CD166。BCRP、CD29、MHCI和MHCII在成年人类睾丸细胞中被适当(2-5％)表达。CD90、CD49f、CD34和SSEA-4在从成年人类睾丸细胞中分离的细胞上大量发现。值表示阳性细胞减去任何自动荧光事件的实际数量。
图48描绘了在组织冷冻之前或之后从小鼠睾丸分离的细胞的活力。
图49描绘了在不同的细胞浓度下冷冻的解冻猪睾丸细胞的平均活力。
图50描绘了三个不同的时间(图50A)和在三个不同的细胞浓度(图50B)下在三个不同的培养基中运送的解冻的人类睾丸细胞的活力。
图51描绘了在三个不同浓度和运送条件中从冷冻样品中总细胞(图51A)和活力(51B)的百分比恢复。
图52描绘了随着时间的过去，运送的大鼠睾丸的平均睾丸细胞活力的改变。
图53描绘了不育小鼠的右侧(图53A)和左侧(图53B)睾丸中的GFP+精子和生精小管的流式细胞分析。
术语定义
提供以下的术语定义，作为对读者有帮助的参考。本专利中使用的术语与本发明相关时具有特定的含义。我们尽一切努力根据术语的常规和常见含义使用所述术语。然而，当常见的常规含义与以下定义之间存在偏差时，下述定义优先于常见的用法。
定型(committed)：本文中使用的“定型”指，细胞被认为永久定型为特定功能。定型的细胞也被称为“终末分化的细胞”。
培养：本文中使用的“培养”或“培养的”是指受控条件下的细胞繁殖，从而发生细胞分裂和细胞数量的增加。
分化：本文中使用的“分化”指细胞被改造为特定的形式或功能。在细胞中，分化导致更为定型的细胞。
胚胎干细胞：本文中使用的“胚胎干细胞”指：全能的、从发育中的胚胎(已达到附着于子宫壁上的发育阶段)获得的任何细胞。在本发明上下文中，胚胎干细胞和前胚胎干细胞是等同的术语。类胚胎干细胞(类ESC)细胞是并非从胚胎直接分离出的全能细胞。类ESC细胞可从经分离和扩展的原性细胞获得。
扩展的：本文中使用的“扩展的”是指生长中的细胞培养物，与其最初浓度相比其细胞数增加。
胎儿干细胞：本文中使用的“胎儿干细胞”指专能的、从发育中的多细胞胎儿(不再处于早期或中期器官生成阶段)获得的细胞。
生殖系细胞：本文中使用的“生殖细胞”、“生殖系细胞”或“生殖系组织”是指繁殖细胞，例如精母细胞(spermatocyte)或卵母细胞(oocyte)，或将发展成为繁殖细胞的细胞或含有此类细胞的组织。
生殖系前体干细胞：本文中使用的“生殖系前体干细胞”是指繁殖细胞，例如精原干细胞的前体或卵母细胞前体干细胞。
生殖系干细胞：本文中使用的“生殖系干细胞”是指繁殖细胞，例如精原干细胞(SSC)或卵母细胞前体干细胞。
性腺：在本文中使用时，“性腺”是指动物中产生繁殖细胞(配子)的任何配对器官。这些包括产卵的雌性卵巢和产精子的雄性睾丸。
长期培养物：本文中使用的“长期培养物”是指细胞在受控条件下繁殖长于至少两个月或多于10代。优选地，长期培养物被培养多于4个月，多于6个月或多于1年。优选地，长期培养物被传代多于15代，多于18代或多于20代。长期培养物的持续时间高度依赖于个体细胞，并且在细胞系之间可存在差异性。
成熟：本文中使用的“成熟”是指导向终末分化的细胞的经协调的生物化学步骤的过程。
专能(multipotent)：在本文中使用时，“专能”是指能产生若干其他细胞类型的细胞，但这些细胞类型数量有限。专能细胞的例子是造血细胞——能发育为数种血细胞但是不能发育为脑细胞的血液干细胞。。
专能成年祖细胞：在本文中使用时，“专能成年祖细胞”指从骨髓中分离的且具有分化为外胚层、中胚层和内胚层谱系的潜力的专能细胞。
多能(pluripotent)：在本文中使用时，“多能”指能产生除了胎盘细胞或子宫的其它支持细胞之外的任何细胞类型的细胞。
出生后干细胞：本文中使用的“出生后干细胞”指从出生后的多细胞生物获得的任何细胞。
青春期之前：在本文中使用时，“青春期之前”或“青春期前”是指还没有进入青春期的个体。青春期的开始与高促性腺素释放激素(GnRH)脉冲发生关联，这在性激素、黄体生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)升高之前发生。青春期一贯性地在女孩47kg左右和男孩55kg左右时开始。尽管有正常年龄的宽的范围，平均起来，女孩比男孩早约1-2年开始青春期过程(对于女孩平均年龄为9至14岁，对于男孩为10至17岁)，并在更短的时间内完成，女孩通常17岁完成青春期。
原生殖细胞：本文中使用的“原生殖细胞”(PGC)指在胚胎发生早期存在的、预定成为生殖细胞的细胞。
原生殖系性干细胞：本文中使用的“原生殖系性干细胞”(也简称为“生殖系性细胞”，缩写为PGLSC)是指下述细胞，其来自于成年雄性或雌性繁殖组织，并且能够产生生殖系干细胞及其后代，这通过其再迁入在例如辐射或化学疗法后繁殖性方面不育的睾丸或卵巢组织的能力证实。成年繁殖组织中生殖系性细胞可以是静止的或积极分裂的。
再程序化：本文中使用的“再程序化”指重建细胞的遗传程序，使得细胞展示出多能性，并且具有产生完全发育的生物的潜力。另外，所述再程序化给予经历再程序化的细胞下述特征，所述特征在细胞的再程序化前状态中通常不表达或不存在。
选择：本文中使用的“选择”是指荧光活化的细胞分选、磁珠分选或收集带有具体标记物谱的细胞的其它手段。
性细胞：本文中使用的“性细胞”是指来自哺乳动物雄性或雌性繁殖组织的二倍体或单倍体细胞。这些细胞的代表性例子包括雄性生殖母细胞、雌性生殖母细胞、卵原细胞、A型精原细胞和B型精原细胞。
体细胞：本文使用的“体细胞”是指除性细胞及其前体之外的体内的任何组织细胞。
体干细胞：本文中使用的“体干细胞”指二倍体专能或多能干细胞。体干细胞不是全能干细胞。
干细胞：本文中使用的“干细胞”是指能够自我更新(经过大量细胞分裂循环同时维持未分化的状态的能力)并且至少是专能(分化成为多于一种专门化细胞类型的能力)的细胞。
基本纯净的：本文中使用的“基本纯净的”是指细胞群体，其中大于75％、大于85％、大于90％、大于95％、大于98％或大于99％的细胞具有期望的特征。
全能：本文中使用的“全能”指，含有产生机体加胎盘的所有细胞所需的全部遗传信息的细胞。人类细胞仅在受精卵最初的极少数次分裂期间具有这种全能能力。
发明详述
为了在处于生育力丧失风险的患者中保存生育力的目的，本公开提供了将来自雄性和雌性二者的生殖系干细胞收集、分离、扩展、处理、冷冻保存、检验、释放和移植的方法。
骨髓干细胞移植之前，在治疗癌症以及其他非恶性疾病(比如，但不限于镰刀状细胞贫血症和地中海贫血)中使用的化学疗法和放射疗法对经历这些治疗的患者的生育力具有详尽记载的有害的作用。这些治疗可永久性地损害患者的繁殖能力，有30％的机会患者将变得不育。
雄性不育的风险
本公开提供了储存来自青春期之前患者的睾丸性腺组织和/或生殖系干细胞的方法。
其中组织和生殖系干细胞储存是有利的雄性中的病症或情况包括包括，但不限于双侧隐睾病、睾丸扭转、隐睾、精索静脉曲张、癌症(包括生殖性和非生殖性癌症)、细胞毒素疗法、骨髓移植。在一种实施方式中，供体是青春期前雄性。在另一种实施方式中，供体是青春期后的雄性。
对于成年患者，治疗之前的预防步骤是选择冷冻精子用于体外受精或其他辅助繁殖技术，以防患者治疗后可能变得不育。对于在化学疗法/辐射疗法时没有发育成熟精子的青春期之前的患者，除了组织或细胞保存没有其他选择。在本发明人发明目前的方法之前，对于恢复雄性青春期之前患者的生育力没有切实可行的选择。用于生育力保存的提取和冷冻保存精原干细胞是可考虑的研究主题。另外，冷冻保存睾丸组织(不是单个细胞悬液)的移植已经在动物模型中成功但在人类中还未成功。睾丸组织移植之后生育力恢复概念的证据已经在包括鼠、牛、猪的许多动物模型和灵长类模型以及人类中完善。
雌性不育的风险
本公开提供了储存青春期之前患者的卵巢组织和细胞和来自成年患者的卵巢组织、卵泡和细胞的方法。
其中组织和生殖系干细胞储存是有利的雌性中的病症或情况包括直接或间接影响生育力的病症或情况，比如，但不限于卵巢囊肿、子宫外孕、子宫切除、癌症，包括繁殖和非繁殖癌症、细胞毒素治疗、骨髓移植、卵巢切除、子宫内膜异位或为了计划生育目的，如果女性想维持繁殖潜能但接近或超过她的繁殖黄金时期。在一种实施方式中，供体是青春期前雌性。在另一种实施方式中，供体是青春期后的雌性。
在雌性中，细胞毒素治疗造成卵泡破坏并导致过早绝经和不育。除了降低的繁殖潜能，雌激素和其他激素的损失可导致长期的健康问题，比如骨质疏松和心血管病。超过6％的雌性儿童癌症幸存者遭受严重的卵巢衰退。已经经历癌症治疗的成年女性有30％过早绝经的发病率。其他医学程序，比如卵巢切除和子宫切除直接危及或可影响女性的生育力。当患者被诊断为恶性或良性卵巢肿瘤、子宫外孕、子宫内膜异位和卵巢囊肿时，通常需要这些程序。乳腺癌症患者，或处在发展乳腺或卵巢癌症风险的那些，通常进行卵巢切除以减少她们由于激素复杂性和遗传易感性发展这种癌症的机会。
对于进行细胞毒素治疗的女性，仅有有限的选择来确保将来的繁殖能力。作为预防步骤，在细胞毒素或抑制细胞生长疗法之前或外科手术去除(一个或多个)生殖器官之前，卵母细胞或卵可被去除并冷冻保存用于辅助繁殖技术，以防患者在治疗之后变得不育。然而，冷冻的和解冻的人卵母细胞的活力相当低，因为冷冻具有低的面积体积比的非常大的细胞的固有的难点，其不允许冷冻保护剂容易地渗透细胞膜。因此，组织、原始卵泡或卵巢细胞(可能包含生殖系干细胞)储存是代替或除了卵母细胞冷冻之外的可行的选择。
如果患者变得不育，在治疗之后当他们准备恢复他们的生育力的时候，储存的、冷冻保存的卵巢组织或卵泡可被移植回患者。可选地，对于正在进行治疗癌症或不具有(一个或多个)完整生殖器官的患者，冷冻组织或卵泡可用于本文描述的宿主外成熟方法中并且在与本申请同日提交的，题目为“Ex host maturation of germline stem cells”(代理人案号1951314-00063)共同待决申请xx/xxx,xxx中公开，并且其全部通过引用并入本文，或者在体外或者在动物宿主(仅仅用作使卵母细胞/卵泡成熟的支持系统)中，并且成熟的卵可通过辅助繁殖技术受精。
本文公开的生殖系细胞分离自来自哺乳动物包括，但不限于啮齿动物、家养动物、狗、猫和灵长类的性腺组织。术语“灵长类”包括，但不限于人类。
生殖系细胞基于它们的表达或缺乏表达许多生殖系细胞标记物、胚胎细胞标记物和多能细胞标记物而被分离。生殖系细胞标记物包括，但不限于VASA、前髓细胞白血病锌因子(PLZF)、源自神经胶质的神经营养因子受体α1(GFR-α1)、α6-整联蛋白、Thy-1、CD9、CD90、CD49f、二花豆凝集素(DBA)、神经细胞黏附分子(NCAM)、生殖细胞核抗原1(GCNA1)和DAZL。
多能细胞标记物包括，但不限于Oct-4(POU5F1)、Nanog、碱性磷酸酶、SSEA-4、TRA1-60和TRA1-81。
此外，生殖系细胞也可基于生殖系干细胞基因和/或多能干细胞基因的表达而被分离。生殖系干细胞基因包括，但不限于端粒酶、VASA、c-RET、c-Kit、PLZF、DAZL和GFR-α1。多能细胞基因包括，但不限于Oct-4、Nanog、Dppa-5、Sox2、碱性磷酸酶和Crypto。
本文呈现的其他实施方式包括生殖系细胞某些群体的长期培养物，以便产生长期专能或多能细胞系。这些细胞系可用作细胞源，用于分化成组织特异性谱系。长期培养本发明生殖系细胞包括下列步骤：基于生殖系细胞标记物和/或多能细胞标记物和生殖系基因和/或多能基因的表达或表达缺乏，分离基本纯净的期望生殖系细胞的群体；如在实施例部分公开的在生长培养基中培养细胞，其允许连续的细胞分裂同时保持未分化的专能或多能状态。本文描述的长期培养物可被冷冻保存用于将来使用。
在某些实施方式中，分离的、基本纯净的生殖系细胞或生殖系细胞系群体可用于在再生性医疗中的治疗应用。本文公开的生殖系细胞能够形成更分化的生殖系细胞，比如雄性中的精母细胞(spermatocyte)、精细胞(spermatid)和精子(sperm)，和雌性中的卵泡(follicle)和卵母细胞(oocyte)并能够再迁入(re-populate)不育生殖器官体内。
本公开的生殖系组织储存系统包括下列组成和/或步骤：1)组织收集；2)将组织转运至中心储存地点；3)在中心储存库处理组织；4)在中心储存库冷冻保存组织和分离的细胞；和5)组织和/或分离的细胞的质量保证和释放。任选的第六步骤包括再植入组织和/或分离的细胞进入供体。
1.来自雄性的组织收集
在启动细胞毒素程序之前或在可导致生殖细胞组织破坏的损伤后不久从睾丸中取出生殖系细胞。在外科无菌环境和麻醉下摘除至少1克生精小管组织。形成单个细胞悬液的组织的物理消化和酶消化可在装运组织至中心储存设施之前或之后进行。
在一种实施方式中，睾丸生精小管组织被切成约10x10mm的小块并且最多5小块放置在包含灭菌运输培养基的灭菌管中。在另一种实施方式中，组织保持单个小块并放置在包含灭菌运输培养基的灭菌管中。
运输培养基包括可维持睾丸生精小管组织和/或解离的细胞的活力达24hr的任何培养基。组织维持培养基的非限制性例子包括PBS、FRS、补充HEPES和抗生素(青霉素和链霉素)的DMEM以及美国专利申请公开号2007/0020759公开的专有培养基，其通过引用对于它关于组织培养基的所有并入本文。
2.来自雌性的组织收集
在启动细胞毒素程序之前、可导致生殖细胞组织破坏的损伤后不久或在卵巢切除或子宫切除时，从卵巢中取出生殖系细胞。在外科无菌环境和全身麻醉下摘除至少1克卵巢组织。形成单个细胞悬液的组织的物理消化和酶消化可在装运组织至中心储存设施之前或之后进行。在一种实施方式中，卵巢组织被切成约10x10mm的小块并且最多5小块放置在包含灭菌运输培养基的灭菌管中。在另一种实施方式中，组织保持单个小块并放置在包含灭菌运输培养基的灭菌管中。
运送培养基包括可维持卵巢组织和/或解离的细胞的活力达24hr的任何培养基。组织维持培养基的非限制性例子包括PBS、FRS、补充HEPES和抗生素(青霉素和链霉素)的DMEM以及美国专利申请公开号2007/0020759公开的专有培养基。
3.运输组织
收获的睾丸或卵巢组织保持在约4℃并运输至中心储存设施以便它在组织收获的24小时内到达中心储存设施。我们的数据显示，在48小时装运后细胞的活力不会改变并在72小时装运后下降。我们倾向于在收获后24小时内得到组织。
4.处理组织
收获的卵巢和睾丸组织被酶解离，评价活力和细胞标记物，然后冷冻保存。在一种实施方式中，从组织中富集生殖系干细胞，然后冷冻保存。在另一种实施方式中，不富集生殖系干细胞的总的睾丸或卵巢细胞被冷冻保存。
在另一种实施方式中，通过流式细胞计数分选使用对雄性和/或雌性生殖系干细胞特异性的抗体进行生殖系干细胞的富集。
5.冷冻保存
许多培养基和程序可用于冷冻性腺组织和/或生殖系干细胞。
在一种实施方式中，生殖系干细胞冷冻保存在溶液中，所述溶液包含：包括但不限于二甲亚砜(DMSO)、乙二醇、丙三醇和丙二醇的至少一种冷冻保护剂；包括但不限于上面公开的DMEM、MEM和专有培养基的至少一种培养基；包括但不限于蔗糖、葡聚糖、血清替代品和HEPES缓冲液的至少一种添加剂。在一种实施方式中溶液包括CryoStorTM CS-10培养基(BioLife Solutions Inc.，Bothell，WA)。在另一种实施方式中，血清替代品是敲除血清替代物(Knockout Serum Replacement)(Invitrogen 10828-028)。
接着以可控速过程或通过“手工”过程冷冻细胞。通过打开可控速的制冷机开始可控速冷冻程序并为组织或细胞冷冻设置冷冻程序。可控速制冷机将使用液氮以降低内室的温度(并因此降低该室任何内容物的温度)。通过将内室冷却至4℃开始细胞的冷冻程序并保持在那里直到启动继续程序。当可控速制冷机被冷却时，细胞被悬浮在冷却至4℃的冷冻保存培养基中。该细胞悬液等量分装至冷冻管，每个冷冻管1mL。冷冻管接着贴标签并放置在可控速制冷机室中并且启动程序继续。首先，室温度保持在4℃另外的10分钟。接下来，室被以-1℃/分钟的速率冷却直到温度到达-80℃。接着室被以-50℃/分钟的速率冷却直到它达到-120℃的温度。在-120℃下5分钟后冷冻的细胞的温度将平衡至-120℃。冷冻的细胞的冷冻管接着转移至液氮杜瓦(Dewar)用于长期储存。。
通过制备用于缓慢冷冻细胞的“严寒先生(Mr.Frosty)”冷冻容器(Nalgene)开始手工冷冻程序。“严寒先生”容器是聚碳酸酯装置，其提供成功细胞冷冻保存和复苏所需要的关键的、可重复的-1℃/分钟的冷却速率。“严寒先生”的底部填充250mL的100％异丙醇。管架放置在顶部，盖子向下螺旋超过管架并且在使用前“严寒先生”放置在4℃下至少1小时。细胞悬浮在冷却至4℃的冷冻保存培养基中。该细胞悬液等量分装至冷冻管，每个冷冻管1mL。冷冻管接着贴标签并放置在预先冷却的“严寒先生”中。“严寒先生”放回4℃10分钟。“严寒先生”接着放置在-80℃制冷机中过夜。保持在-80℃制冷机中过夜之后，冷冻管转移至液氮杜瓦用于长期储存。
6.源自卵巢和源自睾丸的生殖系组织和/或细胞的质量保证和释放
在冷冻保存之前或在特定的时间点(对于稳定性)，和当释放时，对样品进行效能、纯度、身份、活力和稳定性测定，以确保组织或细胞处在用于移植的合适条件。这些测定量化组织/细胞样品中的具体的相关标记物，从而提供存在的生殖系干细胞的量(以推断如果移植时再迁入睾丸的“效能”)的信息、细胞的活力和任选的DNA分析以确认细胞的身份。稳定性测定由每隔一定间隔被解冻的组织或细胞的小样品组成，以检查冷冻保存的质量。
7.源自睾丸的生殖系组织和/或细胞的再植入
通过使用本领域普通技术人员已知的标准注射方式的直接注射完成将分离的基本纯净的生殖系干细胞群体移植进入受者(recipient)。在另一种实施方式中，支持细胞，比如为精原细胞分化提供激素刺激的莱迪希或塞尔托利细胞，与生殖系干细胞一起被转移至受者睾丸。这些转移的支持细胞是未修饰的，或被遗传修饰的。这些转移的支持细胞可以是自体的或与供体或受者睾丸异源的。在转移流体中细胞的示例浓度通过简单的实验可容易地确定，但将很可能在约103-1010个细胞每ml的范围内。细胞被引入输精管、睾丸网或生精小管通过手工完成。合适的染料或泡沫(直径小于2μm)可任选并入载体流体以便简单地识别符合要求的移植生殖系干细胞至睾丸的输送。配备适当变频器的超声波可有助于将针放置在注射部位。
合适的细胞移植工具为本领域普通技术人员所知，并包括分子，比如血清白蛋白，胆固醇和/或卵磷脂，硒和无机盐以及血清成分和/或生长因子和/或细胞因子。通常，细胞移植工具为大体上生理学的pH，即7.0至7.6。
本发明细胞组合物可单独施用或结合一种或多种药学上可接受的载体施用，以单个剂量或多个剂量施用。合适的药学载体可包括惰性生物输送凝胶或生物可降解半固体基质，以及稀释液或填充物，无菌水溶液和各种非毒性溶剂。药学上可接受的载体一般执行下列3个功能：(1)在本发明细胞组合物中维持并保存细胞；(2)在需要再生、恢复或恢复活力的组织部位处保留细胞；和(3)改善技术人员处理本发明组合物的简单性，比如，但不限于改善可注射组合物的性质或处理外科移植。通过本发明细胞组合物结合药学上可接受的载体形成的药学组合物可以以各种剂型比如可注射的溶液等施用。如果需要，药学载体可包含另外的成分，比如粘合剂、赋形剂等。如果必要，水溶液可被适当地缓冲并且首先用充足的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这类水溶液适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内注射。使用的无菌水性介质可以通过本领域技术人员已知的标准技术获得。
8.源自卵巢的生殖系组织和/或细胞的再植入
在化学疗法或放射疗法之前，卵巢生殖系干细胞可从患者中分离，体外扩展其数目并保持冷冻直到患者需要它们以恢复他们的生育力。从人类卵巢分离的细胞使用精细针可直接移植到卵巢表面上皮或可选地细胞可被凝聚在纤维蛋白凝块中。纤维蛋白凝块从患者自己的血液制备并在植入过程期间支持细胞的活力和存活。纤维蛋白凝块可被移植回患者并种植在卵巢囊下。
在一种实施方式中，为了在具有恶性肿瘤的患者中移植卵巢细胞，使用阳性-阴性选择程序从恶性细胞中分离生殖细胞。然而，在非恶性患者中，卵巢表面上皮(OSE)的移植可能更实际。在收集组织时，OSE被解剖刀从剩余卵巢组织中切片至直径1mm的0.5cm x 0.5cm的小块。这些小块使用透明化(vitrification)程序冷冻并保持冷冻直到患者需要它们用于生育力恢复。当需要时，OSE小块被解冻并缝合在一起形成更大的块并移植至不育卵巢的表面。
另外，在不同发育阶段的卵巢卵泡可被冷冻并再移植回患者或用于体外培养成为成熟卵泡。来自这些卵泡的卵母细胞可接着通过ICSI(胞质内精子注射)或其他辅助繁殖技术受精。卵巢生殖系干细胞的移植是永久性的生育力恢复。
9.源自卵巢的生殖系干细胞的宿主外成熟
在超低粘性培养皿中使用没有生长因子和β-巯基乙醇的凝聚物随后在海藻酸钠或存在生长激素的纤维蛋白凝块中3D培养，从人类卵巢中分离的雌性生殖系干细胞可分化成原始卵泡。为进一步支持生殖细胞发育成成熟卵，这些细胞用来自青春期前年龄供体的未成熟颗粒细胞凝聚。该方法允许初级卵母细胞发育成可受精的中期-II卵母细胞。为分离颗粒细胞，来自青春期前人类卵巢的卵巢被切片并且通过两步分化粘附程序将颗粒细胞与生殖细胞分离。该方法适用于具有恶性肿瘤的患者，并将无恶性细胞的卵泡接着移植回患者卵巢，允许进一步的成熟和卵泡发育。或者这些卵泡在体外成熟。从患者中分离的卵巢卵泡可被冷冻并且随后进行该方案。在每个情况下，源自这些卵泡的MII卵母细胞用于体外受精或ICSI用于受精和随后的胚胎发育。
10.源自睾丸的生殖系干细胞的宿主外成熟
在生殖系干细胞再植入患者睾丸不可行的的情况下(即在恶性肿瘤、睾丸扭转、隐睾情况下)或在由于睾丸支持细胞的衰退生殖细胞发育受损(即成熟停止)的情况下，睾丸生殖系干细胞在代用动物中或在体外分化至进一步发展阶段并用于ICSI或其他辅助繁殖技术。在一种实施方式中，精原干细胞(SSCs)与适当的支持细胞和生精小管细胞外基质(ECM)混合以制造可支持生殖细胞进一步发育的环境。
在青春期前患者中精子生成已经开始但未完成的情况下，已经进入减数分裂的部分成熟的生殖细胞(初级和次级精母细胞)可被储存并用于进一步分化成圆形或伸长的精细胞。精细胞接着可用于ICSI以允许受精和随后的胚胎发育。
本发明公开了适于在任何哺乳动物中使用的方法，所述哺乳动物包括但不限于，人类、小鼠、家养动物，比如牛、猪、绵羊和山羊、狗、猫等等。
生殖系细胞库或储藏所或存储设施是指其中生殖系细胞或生殖系干细胞可被安全保管的地方。存储设施可以这样的方式设计：如果发生自然灾害、在延长时间期间并在受控的环境中，干细胞被安全保管。在本发明的一种实施方式中，提供了储藏所，例如生殖系细胞库，用于存储预期需要恢复供体生育力的生殖系细胞单元。公开的方法的范围不仅包括提供此类储藏所，还包括管理此类储藏所的方法。
本发明的范围包括记录生殖系细胞单元的方法使得当生殖系细胞单元需要被定位时，其可被容易地检索到。任何索引和检索系统可用来满足该目的。还提供了存储系统，使得生殖系细胞或组织可被存储。在一种实施方式中，生殖系细胞可以下述方式存储：存储设施将能存储数百、数千、甚至数百万不同的生殖系细胞单元。
还提供了存储与生殖系细胞单元相关的鉴别信息的方法。鉴别信息可包括标识信息，患者标识信息和/或表型信息的基因型。其还可包括维护信息。其还包括下述信息，比如生殖系细胞单元的体积或每单元的细胞的总数目。该患者标识指示信息可以是名字或密码标识码的形式。
每个生殖系细胞单元，例如，特别是来自个体的单元，将被以可靠的和准确的鉴别和检索的方式被编入索引。任何常规的索引系统可工作，只要其可靠准确即可。例如，每个生殖系细胞单元的每个容器可用字母数字码、条形码或任何其他可识别的方法或其组合标记。在储藏所和储藏所外部的位置，可以是能够识别每个单元和其在储藏所中的位置和能够识别单元的来源和/或类型的可得到的可读的信息列表。该索引系统可以本领域已知的任何方式例如手工或非手工(例如可使用计算机和常规软件)管理。
在一种实施方式中，生殖系细胞库包括存储与多个个体和多种生殖系细胞单元关联的多个记录的系统。每个记录可包含与生殖系细胞单元或具体个体关联的类型信息、基因型信息或表型信息。
生殖系细胞单元的存储可以是短期的或长期的。存储生殖系细胞是低温保存的。可以使用任何存储方法，只要存储产物保留用于本文讨论的治疗目的的活力即可。
存储生殖系细胞的存储装置的许多类型是本领域中已知的并可根据本公开被使用。对可被存储在一个特定的库中的生殖系细胞单元的数目没有上限。在一种实施方式中，来自不同个体的数百个生殖系细胞单元可存储在一个库或存储设施下。
存储生殖系细胞产物的设施可以相当小，但仍可存储来许多人的许多样品。在一种实施方式中，生殖系细胞单元以使需要的空间量最小化的方式存储。
存储设施可包括组织和索引所存储的产品的任何方法，例如，自动机器人检索和/或操作生殖系细胞的单元。设施可包括显微操作处理此类生殖系细胞单元的器件。超过一个存储设施可被用来存储生殖系细胞单元。这些设施可以在相隔数英里的不同位置。在一些实施方式中，存储设施可以在不同的州、不同的国家。存储设施可以是地下的或地上的。
容错计算机和冗余系统可在存储设施各处使用，以消除潜在的问题并提供故障保险系统。已知的常规技术可用于有效存储和检索生殖系细胞单元，例如，机器视觉(Machine Vision)、机器人、自动导向车系统，自动存储和检索系统、计算机整合制造、计算机辅助工艺计划、统计过程控制。也可使用较不先进的设施，例如包含许多在其上做索引并保存生殖细胞单位的支架的保持在合适的温度下的大区域。
储藏所、存储设施或生殖系细胞库可包括用于存储生殖系细胞样品的一个或多个存储单元和用于处理存储或移植的生殖系细胞单元的一个或多个处理站。处理可通过内部单位或外包单位(例如专攻生殖系细胞处理和存储的实验室)进行。在一些实施方式中，整个过程——取得、处理、分型、记录和存储干细胞是通过数据处理和控制单元管理的。
在一些实施方式中，该系统的操作可用专用软件辅助管理。软件可管理潜在受者的登记、从供体得到生殖系细胞单元、数据库管理、存储检测、质量检查。在一些实施方式中该系统可在典型的计算机系统上操作。计算机系统可包括输入器件，例如，键盘或鼠标、处理器例如通用处理器或具有增加的数据库处理能力的更进一步开发的处理器、内存例如RAM、ROM和外存储器(例如磁盘、CD、ROM、ASICs、外RAM、外ROM)。计算机系统能在任何操作系统上运行。在特殊的实施方式中，数据库系统存储库中的每个生殖系细胞单元的信息。与每个单元关联的某些信息被存储。信息可与特定的供体关联，例如，供体和供体的医学史的鉴定。备选地或额外地，信息可以是样品类型信息。例如，信息可包括产物的生殖系细胞单元的体积或总细胞计数。与每个样品一起存储的信息是可检索的，并以下述方式来标识样品：其可被定位并立即供应至客户。
实施例
下述实施例意图阐明一个或多个实施方式，所述实施方式不限于下文描述的实施方式。
实施例1
对不同鼠雄性生殖系干细胞群体的分离
通过分选Oct-4-GFP生殖细胞分离了纯生殖系干细胞的群体。然后以c-Kit受体分子的表达为基础，再细分Oct-4阳性生殖细胞。酪氨酸激酶受体C-Kit及其配体干细胞因子(SCF；也已知为Kit配体或Steel因子)是PGC生长和存活的关键调节器。C-Kit从PGC的初始隔离到达到生殖脊期间均在PGC中表达。在出生后小鼠睾丸中，据报道c-Kit可以用作未分化和分化中的A型精原细胞分化的标记物。Oct-4和c-Kit的组合允许分离生殖系干细胞中的两种不同群体：一种含有更原始的生殖细胞或生殖系祖先(Oct-4+/ckit+)，另一种含有预定成为SSC(Oct-4+/c-Kit-)并且能够再生不育睾丸的生殖系干细胞。在培养之前和之后分析这些细胞的分子和表型特征，并且比较它们在具有生长因子混合物的确定的培养条件下产生专能细胞系的能力。另外，使用精原干细胞移植技术评价这些亚群和它们派生的mGC株系再迁入受者睾丸的功能性。
雄性生殖干细胞(GSC)通过SSC的自我更新和定型至分化的精原细胞的产生维持精子生成。在某些体外条件下，据报道来自新生和成年小鼠睾丸的GSC均能产生专能干细胞(mGC)系，所述专能干细胞系具有与ESC类似的特征和分化潜能。然而，在不同实验室产生的mGC显示不同的生殖细胞特征，例如一些保留它们的SSC特性，一些则将所述特性完全丢失。因此仍然存在下述可能性，衍生的专能生殖细胞系可来自于小鼠睾丸中存在的不同亚群的生殖系干细胞。为了研究这一问题，使用在生殖细胞特异性Oct-4启动子控制下表达GFP的转基因小鼠模型。关于对转录因子Oct-4和c-Kit受体的表达，在生殖系干细胞中找到了两种不同的群体。只有小鼠生殖系干细胞的Oct-4+/c-Kit+亚类在从新生或成年睾丸中分离并在生长因子的复合混合物中培养时产生下述细胞系，所述细胞系表达多能ES标记物(即Oct-4、Nanog、Sox2、Rex-1、Dppa5、SSEA-1、碱性磷酸酶)，显示高端粒酶活性，并且在诱导型分化方案后分化为多种谱系，包括搏动的心肌细胞、神经细胞和软骨细胞。所述数据清楚地显示生殖系干细胞中不同群体的存在，所述群体中只有生殖系祖先能够产生具有一些多能特征的专能细胞系。
为了富集生殖系干细胞，将新生和成年睾丸组织在涂有明胶的培养皿上培养2小时，获得差异黏附以去除体细胞而不去除生殖细胞。在差异黏附后，可以回收含有GFP阳性细胞(新生中4-10％；成年中0.01-0.05％)的细胞悬液(图1A-C)。GFP和c-Kit的表达之间存在相关(图1F-1H)。
在培养皿上含有所述生长因子混合物的干细胞培养基中培养收获的新生生殖细胞。培养若干天后初始GFP信号(图2A)消失(图2B)。之后，细胞经历不同的形态改变，形成不具GFP信号的持续生长的链样集落(图2C-2D)。通过集落内GFP阳性细胞的出现表明的Oct-4的上调在培养3-4周后出现(图2F)。培养2-4周后，将GFP阳性集落机械转移进下述培养皿中，所述培养皿在补充有15％FBS的相同培养基中含有经细胞色素C处理的鼠胚胎成纤维细胞饲养层(MEF)。通过机械转移至新的MEF培养物而传代3-4次后，集落确立并且能够从培养平板上酶促(胶原酶1mg/ml，5-10分钟)取出用于进一步扩展和/或储存于液氮中。为了从成年小鼠衍生细胞系，使用流式细胞计量术分选在差异黏附后收获的GFP阳性细胞，并直接在MEF上培养。使用OG2或OG2-lacZ小鼠总计产生19个细胞系(10个新生和9个成年)。所有的细胞系或者表达GFP(14个株系)，或者表达GFP-LacZ(5个株系)(图2G-2I)。
另外，从新生野生型CD-1小鼠中产生mGC株系表明该方法不限于转基因OG2小鼠。所选择的细胞系已被冻/融和繁殖多于40代，估计的细胞倍增时间为72小时(使用手动细胞计数和GFP分选二者(图14))。在培养期间的不同时间点(第2天，图3A；第5天，图3B；第9天，图3C；第15天，图3D)，通过FACS分析GFP阳性细胞数(图3E)。
通过流式细胞计量术将C-kit阳性/GFP阳性细胞与c-Kit阴性/GFP阳性细胞分离(图1D-E)，并在MEF养料上培养。只有c-Kit阳性群体产生mGC集落，并且c-Kit阴性池不能产生细胞系。在该研究中使用的生长因子中，GDNF的去除产生更小的集落，表明GDNF在mGC自我更新中的作用。相反，FGF2的去除导致集落的分化，表明FGF2在mGC维持其未分化阶段中的可能作用。LIF或EGF的去除不影响mGC的扩展或分化。
mGC集落中的大部分细胞表达Oct-4(图4A-4D)、Nanog(图4E-4H)、VASA(图4I-4L)和SSEA-1(图4M-4O)。它们也表达多能基因Sox2、DPPa5、Rex-1、eRas和Cripto，以及生殖系特异性标记物，包括Stella、Dazl、Vasa和cRet(图4Q)。另外，通过Western印迹分析证实了Oct-4、Nanog和Sox2的表达(图4P)。
第20代的小鼠细胞系显示高端粒酶活性(图5A，与ESC类似)和正常核型(40，XY)(图5B)。
还在培养之前和之后分析了mGC的全局基因表达和印迹模式，并与ESC比较。有趣的是培养条件未改变测试的所有DMR(差异甲基化区域)中mGC的印迹模式。与仅显示部分产雄(androgenetic)印迹的小鼠ESC相反，mGC清楚地展示100％的产雄印迹模式(图6)。有些令人惊讶的是，微阵列分析显示mGC的全局基因表达谱在培养之前和之后具有87％的相似性。
当mGC聚集形成胚状体(EB)时，在9-15天内观察到原肠胚形成(7A)。EB中的细胞表达早期发育标记物，包括E-钙黏着蛋白和层粘连蛋白1(极化的上皮的标记物，图7B-7C)，Zic1、PAX6和Sox1(早期外胚层标记物，图7D和7F)，GATA4和FoxA2(早期内胚层标记物，图7E-7F)和Brachyury、BMP4和COL2A1(早期中胚层标记物，图7F)。在培养中，mGC集落自发地分化为心肌细胞(图7G-7J)、脂肪细胞(图7K)和神经细胞(图7L和7M)表达标记物的表型。自发地分化为心肌细胞的一些细胞展示至多3天的有节律的收缩。使用定向分化方案，可以将mGC株系诱导以分化为代表神经祖先(巢蛋白，neuroD1)、神经元(MAP2、NF-68、GAD67)和胶质细胞(GFAP、MBP、A2B5、O4、NG2)的神经细胞，如图8A-8G和8J中所示。它们也可以被诱导以形成心肌细胞(肌钙蛋白1、心肌球蛋白、结蛋白、Nkx2.5、GATA4，图8I和8L)或软骨细胞(胶原Xa1，和通过阿利新蓝染色，图8H和8K)。
在单独的使用mGC的分化研究中，在培养物中的7个集落内计数使用或不使用神经标记物染色的细胞(核)数量，平均百分比估计为：GFAP+细胞17.6％，Tuj-1+细胞2.5％，MAP-2+细胞2.3％。一般而言，与mGC相比，通过这些方案在ES细胞中诱导的分化高得多。
移植后四周，对照动物以及接受Oct-4阳性/c-Kit阳性细胞的动物的睾丸显示在大部分生精小管中无精子生成。然而，接受新鲜分离的Oct-4阳性/c-Kit阴性睾丸细胞的小鼠中80％显示在整个睾丸中一些程度的精子生成，表明细胞悬液中功能性SSC的存在。只有生殖系干细胞的c-Kit-阴性亚群在受者睾丸中建群。图9M-9R和表1中展示了用培养后和培养前的生殖系干细胞移植后的睾丸再生。图9M中展示了免疫缺陷小鼠的正常睾丸的横向切片。白消安处理后一个月，大部分生精小管的内源精子生成衰竭(图9N)。尽管用Oct-4-阳性/c-Kit-阴性细胞移植的小鼠的生精小管中73％显示一些程度的精子生成(图9O)，但是接受Oct-4-阳性/c-Kit-阴性细胞的小鼠的大部分生精小管横向切片是空的(图9P)。图9R中展示了Oct-4-阳性/c-Kit-阴性细胞移植后不久CSFE-标签为阳性的集落。在用mGC移植的受者小鼠睾丸的大部分生精小管中未发现精子生成，表明这些细胞不具有SSC特性(图9Q)。
表1.受者小鼠睾丸中生殖系干细胞亚群和专能生殖细胞系移植后精子生成的重建
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对畸胎瘤形成而言，将等量的小鼠ESC(作为阳性对照)或Oct-4-GFP/LacZ mGCs注射进不同组裸鼠的皮肤、肌肉和睾丸中(1x106个细胞/位点)。接受ESC的所有受者小鼠(6/6)在所有三种组织类型中发育出畸胎瘤。相反，接受mGC的小鼠中均未(0/20)产生畸胎瘤(图9A-9F)。移植后六周，在皮肤、肌肉和睾丸组织中发现Oct-4-GFP/LacZ细胞(图9G-9I)。数据显示mGC与ESC不同是非致瘤的。
通过将培养的Oct-4-GFP/LacZ细胞注射进CD-1小鼠的8-细胞胚胎和胚泡中，测量嵌合体形成。如图10A-10D中所示，将Oct-4-GFP/LacZ细胞掺入小鼠胚泡的内细胞团中。将胚胎转移至假妊娠小鼠的子宫内(来自119个转移的胚胎的总计45个胎儿)。在12.5dpc(交配后天数)，针对LacZ(β-半乳糖苷酶活性)的全胚胎染色显示眼、脑和四肢中特征性的模式(图10E)。与用专能生殖细胞系注射的相比，接受小鼠ES细胞的嵌合体胚胎中LacZ染色强度高得多。还在脑、心、生殖腺脊和肝的组织学切片中证明了嵌合体细胞的分布(图10L-10O)。与用LacZ-GS细胞注射的相比，用LacZ-ES细胞注射的嵌合体胚胎中LacZ阳性细胞的强度和数量高得多。Oct-4-GFP/LacZ嵌合体组织的证实得到以下事实支持：嵌合体幼兽的外胚层(脑)、中胚层(心)、内胚层(肝)和睾丸中GFPDNA序列的存在(图10P)，以及所有4种组织中LacZ DNA的存在(图10Q)。这些组合的结果清楚地证明培养的mGC是具有一些多能特征的非畸形形成干细胞。
专能生殖细胞系可以由成年小鼠睾丸产生而不需再程序化生长因子，表明成年睾丸中可能存在具有多能特征的细胞亚群。
独立地，如前文所述，来自出生后小鼠生殖系干细胞的生殖系性细胞系和生殖系前体细胞利用ESC的一些而非所有多能特征产生。这些细胞系类型均与其它实验室获得的专能生殖细胞系有特征性差异，最值得注意的是关于多能性扩展程度和畸胎瘤形成的差异。
以微阵列分析为基础，小鼠Oct-4阳性/c-Kit阳性生殖系细胞系表达多能基因Nanog和crypto，但是水平比ESC中低1000倍和5000倍。类似地，生殖细胞系表达癌基因，包括但不限于p53、Eras、Bak、Int-2和c-myc，但是表达水平比ES细胞低数倍。值得注意的是，生殖细胞系在体内移植后不形成畸胎瘤，但是它们在小鼠胚胎中形成有限的嵌合体细胞群。
若干项证据支持下述观点：Oct-4阳性/c-Kit阳性生殖系前体细胞保留其生殖细胞特性，从而与ESC和其它先前报道的睾丸细胞不同：即，1)衍生的生殖系前体细胞系具有在约72小时内倍增其细胞数的细胞周期时间(通过GFP分选和手工计数二者测定)，并且该细胞周期时间与生殖系干细胞更为相似，并且是ESC的约3倍长；2)以阵列中的全局基因表达分析为基础，本发明生殖系前体细胞似乎具有与ESC或其它专能生殖细胞系中不同的分子特征。在所测试的基因中，本发明生殖系前体细胞系显示显著更高的生殖系特异性基因(Vasa、Plzf、GFR-α1、Dazl)表达水平，和更低的多能基因(Oct4、Nanog、Dppa-5、Sox2、Crypto)表达水平；3)这些细胞系的自我修复更依赖于GDNF而不是LIF或FGF2。GDNF被提出是雄性生殖系干细胞自我更新的关键调节器，而LIF和FGF2在ESC的自我更新中发挥决定性作用；4)这些细胞系中SSEA-1的表达水平低于小鼠ES细胞或报道的其它专能生殖细胞系中发现的水平。已经显示，在某些动物模型中SSEA-1可能涉及肿瘤侵入和转移，提示更高的表达水平可能反映了肿瘤发生的更高潜力；和5)专能GC显示与小鼠ESC或其它实验室报道的其它mGC株系不同的雄性印迹模式。
尽管与其生殖系祖先具有所有这些相似性，但是本发明生殖系前体细胞系在移植后不使睾丸再生，证明它们不是生殖系性细胞。
转基因小鼠模型允许以Oct-4表达为基础从新生和成年睾丸二者中分离生殖系干细胞。通过以下的观察，将生殖系干细胞根据其c-Kit表达进一步分割为两个亚群：1)只有具有c-Kit受者的Oct-4阴性/GFP阳性细胞细胞应答培养和产生的专能生殖细胞系；和2)只有c-Kit阴性亚群在精原干细胞移植后再迁入睾丸。结果清楚地表明繁殖组织内存在至少两种不同的生殖系干细胞亚类：(1)能够成为专能生殖系干细胞的c-Kit阳性池，即生殖系前体细胞，以及(2)丧失其c-Kit表达并且获得在睾丸建群的能力的生殖系干细胞亚类，即生殖系性细胞。显然，在成年组织中繁殖器官中的生殖系干细胞存在于不同的发育阶段，或者它们具有应答生长因子信号转导和/或转录因子的不同能力。
材料和方法
如下分离睾丸细胞。将新生小鼠幼兽(出生后2-5天龄)或成年小鼠的睾丸从体内无菌取出。将睾丸的被膜去掉，并将生精小管悬浮于酶溶液中，所述酶溶液由PBS中1mg/mL胶原酶1A和10单位/mL DNase组成。将睾丸在水浴中于37℃消化，直至所有生精小管被消化。用胎牛血清(FBS)终止反应。
制备小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)养料：使用12.5dpc CD-1小鼠胚胎通过标准步骤制造MEF。将胚胎取出，进行胰蛋白酶消化，并将离解的细胞涂布在150-mm的平板上，涂布密度为每个平板约1.5个胚胎。初始涂布后，将MEF 1∶5分开，然后冷冻(第1代)。在丝裂霉素C处理之前，将融化的MEF(P1)为了扩展的目的仅传代一次。MEF养料以每cm250-60x103的密度涂布。每7-10天使用新的MEF养料用于多能生殖细胞培养。所有的动物实验遵守实验室动物护理和使用指南(guide lines for thecare and use of laboratoryanimals，National Research Council)。
端粒酶活性评价和核型分析：为了测定端粒酶活性，使用含有150U/ml RNase的CHAPS裂解缓冲液，从生殖细胞系(第10代或更高)、新鲜分离的Oct-4阳性/c-Kit阳性分选的细胞和Oct-4阳性/c-Kit阴性分选的细胞分离细胞提取物。将细胞裂解物在12,000x g，4℃下离心20分钟，并将上清液储存于-80℃。使用BSA作为标准，用Bradford试剂测定蛋白质浓度。使用TRAPEZE检测试剂盒(Chemicon)，通过基于PCR的测定法检测端粒酶活性。向总体积50μl PCR反应混合物中以750μg/μl添加两微升细胞提取物，所述PCR反应混合物含有TRAP反应缓冲液、dNTP、底物寡核苷酸、端粒酶引物、内标引物和Taq聚合酶。对每个实验样品而言，向反应混合物中添加2μl mESC细胞提取物作为阳性对照，并使用单独的CHAPS裂解缓冲液和热失活的端粒酶作为阴性对照。将每个样品在30℃孵育30分钟，用于端粒酶延伸，然后进行PCR扩增。对核型分析而言，在含0.1μg/ml KaryoMAX Colcemid(Invitrogen)的培养物中将增殖中的细胞孵育3-4小时，之后将其重悬于低渗溶液(0.075M KCL)中并于室温孵育10分钟。然后将细胞重悬于冷的固定剂(3∶1甲醇∶乙酸)中，并于4℃储存至少30分钟。用固定剂洗涤后，将细胞置于清洁的载玻片上并晾干。制备分裂中期染色体并使用Applied Spectral Imaging BandView数码成像系统建立核型。
体外分化：为了产生胚状体(EB)，用胶原酶离解mGSC集落并涂布在非粘附性培养平板中的含15％FBS的PMTM培养基(公开于2006年7月17日提交的共同未决的美国专利申请no.11/488,362，其含有的关于组织培养基的所有内容通过引用并入本文)中。在一些实验中，EB在悬滴中形成。将用于分化形成代表三种胚层的细胞的EB培养15天，每3天取样用于标记物测定。对诱导的分化而言，将EB在PM培养基中培养四天，之后在用于谱系选择的无血清N1培养基中培养，所述无血清N1培养基即补充有ITS(胰岛素，10mg/l；转铁蛋白，5.5mg/l；硒，0.67mg/l)和纤连蛋白(50μg/ml)的DMEM/F12(Invitrogen)。5-7天后，将N1处理的细胞聚集物转移至涂有明胶的培养平板中用于扩展神经祖细胞的N2培养基(含ITS、无纤连蛋白并补充有10ng/ml bFGF的N1培养基)中。为了分化为心肌细胞，在存在不同心源性化合物时将EB培养两周，所述心源性化合物包括0.06M DMSO、5mM 5’-氮杂-2’-脱氧-胞苷(AZA)和25-50μM cardiogenol-C。在分化过程期间，分析细胞的形态，并针对通过RT-PCR和免疫组织化学染色二者的基因表达分析进行采样。通过添加补充有10ng/ml TGF-3β和20％FBS的软骨形成诱导培养基(Chondrogenic SingleQuots，Cambrex)诱导mGSC的软骨细胞分化。
免疫细胞化学(ICC)和免疫组织化学(IHC)染色：将培养的细胞在4％低聚甲醛中于室温固定10-30分钟，并在4℃下PBS中储存。对荧光免疫细胞化学而言，用1xCytoperm(BD Biosciences)或0.2％Triton X-100将细胞通透化(permeablize)15分钟，随后在2％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)、2％(v/v)正常山羊血清(GS)/1x Cytoperm-PBS中于室温下孵育30-60分钟。将一级抗体以最适浓度稀释于2％BSA 2％GS/1x Cytoperm-PBS中，并在4℃孵育3小时，或者稀释于封闭缓冲液中，4℃过夜。洗涤两次后，将荧光第二抗体相应地稀释于2％BSA/2％山羊血清/1x Cytoperm-PBS中，并在4℃暗中孵育1小时。将细胞在PBS中洗涤两次，包在铝箔中并储存于4℃，直至进行显微镜分析。使用装有数码成像硬件和软件的OlympusIX71显微镜或Ziess LSM510共聚焦显微镜记录图像。
对于亮视野免疫细胞化学而言，将细胞在1x PBS中洗涤一次。用3％(v/v)H2O2将将内源过氧化物酶活性封闭15分钟，然后通透化——用2％BSA/2％GS/1x Cytoperm-PBS封闭30分钟。将一级抗体相应地稀释于2％BSA/2％GS/1x Cytoperm-PBS中并在4℃下孵育3小时。根据制造商说明书，使用ABC染色试剂盒完成染色的剩余部分。用溶于纯净水的二氨基联苯(DAB)底物片剂增强成像并孵育5-10分钟。对于阴性对照而言，省略一级抗体。
流式细胞计量术：针对使用Influx细胞分选仪(Cytopeia，Inc)的流式细胞计量分析优化特异性抗体(包括SSEA-1和c-Kit)。对c-Kit分选而言，用CD117 APC(BD Biosciences)染色含有Oct-4-GFP构建体的新鲜分离的睾丸细胞。对一些实验而言，将新鲜的生殖细胞集落解离，并用抗-SSEA-1抗体以及之后用与PE-Cy7缀合的山羊抗小鼠IgM对细胞染色。
基因表达、印迹分析和GFP扩增：使用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)分离总RNA，并将RNA用于RT-PCR、定量PCR或微阵列分析。对RT-PCR而言，用Sensiscript RT试剂盒合成cDNA，并用HotStarTaq DNA聚合酶进行PCR。所有的PCR反应以95℃15分钟使酶活化的初始孵育开始。之后是95℃15秒、适当的退火温度1分钟和72℃1分钟的35个循环，然后是72℃10分钟用于最终延伸的1个循环。反应使用iCyclerTMThermal Cycler(Bio-Rad)进行。用于RT-PCR的步骤使用特异性引物进行，所述特异性引物包括Oct-4、Nanog、Rex-1、DPPa5、Dazl、β-肌动蛋白、Nkx2.5、巢蛋白、Mab2和GFAP。对内部对照而言，使用GADPH作为细胞样品的看家基因，在小鼠胚胎中使用β-肌动蛋白或白细胞介素-2(IL-2)。
通过基于PCR的分析测定mGSC和mESC中的印迹模式。通过特异性引物进行PCR，从经重亚硫酸盐处理的DNA中扩增每个二甲基化的区域(DMR)。为了分析有印迹的基因，使用UVP图像软件定量条带强度。对GFP和LacZ扩增而言，通过解剖小心地收集来自嵌合体胚胎的个体组织，将其切碎成小片，并根据制造商的方案置于DNA提取缓冲液(DNeasy试剂盒)中用于DNA分离和纯化。
精原干细胞移植：为了测定mGC用于再生精子生成的功能性，使用精原干细胞移植。用白消安(40mg/kg)处理20只6-8周的免疫缺陷型雄性裸鼠(Harlan)，将它们用作为受者。白消安处理后一个月，将2x105个细胞通过睾丸网注射移植进生精小管中。四只小鼠接受mGC(GFP分选的细胞)。另外四只小鼠注射新鲜分离的GFP阳性分选的细胞。用新鲜分离的GFP阳性c-Kit阳性分选的细胞移植四只小鼠，并用新鲜分离的GFP阳性c-Kit阴性分选的细胞注射四只小鼠。剩余的四只小鼠用作假对照并且不注射。移植后一个月将动物处死，收获睾丸并用于组织学评价。为了评价移植的效力，计数具有精子生成的生精小管横切片的总数。
畸胎瘤和嵌合体形成测试：为了测试mGC形成畸胎瘤或嵌合体的能力，将OG2小鼠(Jackson实验室)与Rosa 26小鼠(Jackson实验室)杂交，产生新的株系(OG2-R26)。这些小鼠的生殖细胞中具有GFP构建体以及LacZ构建体。如所述进行培养，并且生产新的Oct-4-GFP/LacZ生殖细胞系用于测试畸胎瘤和嵌合体形成。通过皮下、肌内或注射进入裸鼠的生精小管内，检查小鼠Oct-4-GFP/LacZ mGSC体内形成畸胎瘤的能力。作为畸胎瘤形成的阳性对照，在一些小鼠中注射ES细胞。对皮下、肌内或睾丸注射而言，注射约1x106个细胞。六周后处死小鼠，收获组织用于形态学和组织学分析。
在注射进宿主胚泡后，或通过与桑椹胚期胚胎或八细胞期胚胎的聚集反应，测定小鼠Oct4-GFP/LacZ GSC形成嵌合体细胞群的能力。使用从CD-1小鼠中收集的第3.5天胚泡进行15-20个细胞的胚泡注射。注射后将胚泡(每个子宫角7-8个胚泡)转移进先前与切除输精小管的雄性交配的2.5天假妊娠的CD-1雌性中。通过β-半乳糖苷酶染色试剂盒(Sigma)在嵌合体12.5dpc胚胎的不同区域中检查lacZ细胞的掺入。另外，在从Oct-4-GFP/LacZ细胞形成的嵌合体胚胎的脑、心、肝和生殖腺脊中分离的DNA中进行lacZ和GFP的PCR。
实施例2
灵长类生殖系干细胞的分离、鉴定和表征
因为静止和积极分裂的生殖系干细胞作为两种离散的细胞群存在于小鼠睾丸中(实施例1)，所以研究了这两种细胞群也存在于成年灵长类睾丸中的可能性。
精子生成是高度受调控的过程，其中被归类为精原干细胞(SSC)的未分化的生殖细胞分裂并成熟，产生精子。在啮齿动物中，As(Asingle)精原细胞被认为是负责精子生成的居留干细胞，因为它们能够自我更新以及分化。与啮齿动物不同，在灵长类和人中，其它研究人员先前的组织学研究报道，睾丸生精小管上皮的基底膜上居留具有两种不同类型核染色的细胞，即称作A深色和A浅色精原细胞的细胞。
下文描述了灵长类睾丸生殖系干细胞的基本纯化的标记物和分离方法。
使用猕猴睾丸表征灵长类生殖系干细胞。使用免疫组织化学检查、表面标记物和荧光活化的细胞分选来鉴定、表征和基本纯化来自成年猕猴睾丸的生殖系干细胞。使用端粒酶、RT-PCR和免疫组织化学染色证实了每个细胞群中生殖系干细胞的存在，所述免疫组织化学染色使用生殖特异性标记物VASA和SSC-特异性标记物GFR-α1。使用精原细胞移植确定富集之前和之后细胞群的功能能力。
使用免疫组织化学方法鉴定、表征和定位灵长类睾丸中的生殖系干细胞。对这些研究而言，使用针对细胞外基质组分(ECM)α6-整联蛋白、SSEA-4和GFR-α1特异的抗体，对灵长类睾丸的组织学切割进行可视染色。
对α6-整联蛋白具有特异性的抗体将位于生精小管中基底膜附近的细胞以及生精小管基底膜染色(图18)。在每个生精小管组织学横向切片中平均发现13个α6-整联蛋白阳性细胞。在生精小管切片内，大部分α6-整联蛋白阳性细胞也是VASA阳性的，证实它们的生殖系干细胞状态。定量而言，每个生精小管横向切片中有比GFR-α1更多的α6-整联蛋白阳性细胞，并且共定位研究显示约60％的α6-整联蛋白阳性细胞也是GFR-α1阳性的。灵长类睾丸的这些组合的免疫组织化学研究揭示了与生精小管基底膜邻近的细胞，所述细胞与α6-整联蛋白和SSEA-4细胞表面标记物共定位，并且与生殖细胞特异性标记物VASA和SSC特异性标记物GFR-α1(即在雄性生殖系干细胞中特异表达的标记物)共定位(图19)。
GFR-α-1细胞表面标记物在位于生精小管基底膜上的细胞中特异表达。所有的GFR-α-1阳性细胞针对生殖细胞特异性标记物VASA也是阳性的。
所有的SSEA-4阳性细胞也位于成年灵长类生精小管的基底膜上，并且这些细胞也是针对VASA染色阳性的。大部分SSEA-4阳性细胞也是α6-整联蛋白阳性的。SSEA-4和GFR-α1之间也存在显著的共定位，显示SSEA-4对生殖系干细胞而言是重要的细胞表面标记物。灵长类睾丸组织学横向切片中生精小管基底膜上约40％的精原细胞表达SSEA-4。
在灵长类睾丸中几乎没有发现c-Kit阳性细胞。在生精小管横向切片中，仅在位于生精小管腔的细胞中发现c-Kit染色。所有的c-Kit阳性细胞也是VASA阳性的，显示它们是分化的生殖细胞。在位于生精小管横向切片的基底膜上的细胞中未发现c-Kit染色。这些发现表明灵长类生殖腺干细胞是c-Kit阴性的。
Nanog在灵长类睾丸中丰富表达。Nanog显示为核染色，并且在生精小管中几乎所有生殖细胞中与VASA共定位。与位于基底膜上未分化的生殖细胞相比，位于生精小管腔中先进的生殖细胞中Nanog表达更强。Nanog与GFR-α1的共定位研究显示，所有生殖系干细胞都显示低水平的Nanog表达。
CD90抗体仅染色基底膜，并且不染色睾丸中的任何细胞组织。
灵长类睾丸样品的免疫组织化学表征显示，成年灵长类睾丸中生殖系干细胞对α6-整联蛋白、SSEA-4和GFR-α1而言是阳性的，对c-Kit而言是阴性的。
手术取出来自安乐死的3-7岁猕猴的睾丸；置于补充了青霉素/链霉素(分别来自Cellgro和Invitrogen)的PBS中，并在冰上过夜运输。手术取出睾丸被膜后，取出活组织检查样品用于组织学分析和分子分析。将剩余的生精小管组织精细地切碎，并在往复的37℃水浴中用胶原酶A(1mg/mL)(Roche)和DNase(10U/mL)(Invitrogen)消化15分钟。胶原酶消化后，在单位重力下使未消化的组织沉降，并取出上清液中的细胞。将未消化的组织在酶混合物中于往复的37℃水浴中进一步消化20分钟，所述酶混合物由DMEM中1.5mg/mL胶原酶A、1.5mg/mL V型透明质酸酶(Sigma)、0.5mg/mL胰蛋白酶(Worthington Biochemical Corporation)和10单位/mL DNAse组成。使经消化和未经消化的组织经过70μm过滤器进入FBS(胎牛血清，Hyclone)中，使酶失活。在400xg离心10分钟后，将细胞沉淀物重悬于DMEM+10％FBS中，并置于5％CO2/95％空气的潮湿培养箱中涂有组织培养物的15cm平皿中。
使用流式细胞计量术鉴定对成年灵长类睾丸生殖系干细胞特异的细胞表面标记物(图20)。与来自使用非灵长类SSC的其它研究人员的报道相反，新鲜分离的成年灵长类睾丸细胞不表达上皮细胞黏附/活化分子(EpCAM)。然而，通过细胞表面上GDNF受者GFR-α1的表达，将生殖系干细胞鉴定为总成年灵长类睾丸细胞群的非常小的部分，少于总睾丸细胞分离物的1％。类似地，与使用鼠睾丸生殖系干细胞(实施例1)的经验相反，新鲜分离的成年灵长类生殖系干细胞不表达c-Kit。然而，成年灵长类生殖系干细胞(经分离的睾丸细胞群的约2％)表达与凝集素(Dolichos biflourus凝集素(DBA))结合的细胞表面碳水化合物决定簇。另外，成年灵长类生殖系干细胞表达CD9、CD90和CD49f细胞表面标记物(图21)。
为了分离灵长类生殖系干细胞，将c-Kit作为阴性/亲本分选窗口的门栅，针对所述门栅绘制CD90阳性和CD49f阳性，以鉴定双阳性CD90+/CD49f+细胞。针对双阳性细胞的分选导致生殖系干细胞的分离，所述生殖系干细胞代表了成年睾丸分离物中总细胞的约5.77％。收集后一CD90+/CD49f+双阳性细胞用于进一步的用途。通过选择对SSEA4而言为阳性的c-Kit阴性细胞实现额外的纯化，导致第二基本纯化的细胞群的分离，所述第二基本纯化的细胞群构成总成年灵长类睾丸细胞的约2％。通过选择对CD90、CD49f和SSEA4而言均为阳性的c-Kit阴性细胞实现另一额外的纯化，导致第三基本纯化的细胞群的分离，所述第三基本纯化的细胞群构成总成年灵长类睾丸细胞的约1.47％。
这些组合的流式细胞计量分析导致从成年灵长类睾丸中分离和基本纯化了两种离散的生殖系干细胞群：即，(1)Thy-1阳性和α6-整联蛋白阳性的细胞，和(b)表达GFR-α1以及VASA细胞表面标记物和高端粒酶活性的SSEA-4阳性细胞，其中多于50％的细胞对GFR-α1和VASA细胞而言均为阳性的细胞群。
为了进一步扩展流式细胞分析和免疫组织化学染色，如下分选新鲜分离的成年灵长类睾丸细胞：(i)α6-整联蛋白阳性；(ii)CD-90阳性；(iii)CD-90阳性、α6-整联蛋白阳性和c-Kit阴性(三重分选)；和(iv)SSEA-4+细胞。针对生殖细胞标记物VASA和SSC标记物GFR-α1的存在，测试不同的经分离和纯化的睾丸细胞群(图22)。未分选的细胞含有约70％VASA阳性细胞，但是这些细胞中仅10％针对GFR-α1是阳性染色。仅针对α6-整联蛋白分选导致具有生殖系和SSC两种标记物的细胞(即具有42.6％VASA阳性和GFR-α1阳性细胞的群体)显著增加。针对单独或与c-Kit-组合(三重分选)的CD90进行分选也分别将VASA阳性/GFR-α1阳性细胞的比例显著地提高至30％和46.4％。针对单独的SSEA4+分选也导致表达生殖系和SSC标记物的细胞(即其中37.5％细胞为VASA阳性和GFRα-1阳性的经分选的细胞群)富集。
通过测试在用化疗药物白消安处理的免疫缺陷裸鼠睾丸中再迁入生精小管基底膜的能力，在基本纯化之前和之后测定不同的灵长类睾丸细胞群的功能特性。对这些研究而言，用白消安(40mg/kg)处理9只6-8周龄SCID雄性小鼠(Harlan)。白消安处理后一个月，将2x105个成年灵长类睾丸细胞通过睾丸网注射移植进生精小管中。对这些研究而言，三只小鼠接受由新鲜分离的未经分选的细胞组成的移植物，三只小鼠接受由新鲜分离的c-Kit阴性/SSEA-4阳性的分选的细胞组成的移植物，三只小鼠接受由新鲜分离的c-Kit阴性/SSEA-4阴性的分选的细胞组成的移植物。
为了在受者小鼠睾丸中更好地鉴定所移植的灵长类细胞，使用活体染料羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CSFE)作为荧光标记物。CSFE是无色和非荧光的化合物，直至乙酸基团被细胞内脂酶切割，得到强荧光产物。将后一荧光产物充分保持并用醛固定剂固定，然而，随着每次细胞分裂，荧光强度指数式地消除。对该活体染色而言，收集细胞，并在含1％BSA的1XPBS中洗涤一次，然后在1XPBS中洗涤一次，之后在1XPBS中8μM CSFE中于37℃孵育10分钟。用含2％FBS的MEMα(Invitrogen)洗涤得到的经活体染色的细胞，通过在400Xg离心5分钟收集；重悬于培养基中并计数。
移植后两周，将小鼠处死并通过显微镜测定小鼠睾丸的组织学切片中CSFE阳性细胞集落数(图23)。理论上，如果生殖系干细胞具有约72小时的细胞周期数，则在移植后两周，细胞应当经历2-3次细胞倍增，产生约4-8个细胞的集落。对统计学分析而言，应用ANOVA测试并认为p＜0.05是显著的。
这些组合的移植研究显示，只有含有表达GFR-α1和VASA标记物的细胞的SSEA-4阳性细胞群体能够再迁入经白消安处理的小鼠睾丸(图24)。这些发现显示这些细胞是原生殖系干细胞。
为了研究各个细胞群的细胞分裂状态，使用流式细胞计量术研究了两个群体的DNA含量(图25)。该分析显示，SSEA-4阳性细胞群具有与细胞周期G0-G1期的细胞相似的细胞DNA含量。相反，具有Thy-1和α6-整联蛋白细胞表面标记物的细胞具有两种离散和不同的DNA含量，与细胞周期的G0-G1期或S期相似。数据显示，具有SSC细胞表面标记物的SSEA-4+细胞群体代表了静止的祖先生殖系干细胞群体，而Thy-1+和α6-整联蛋白+细胞群代表了积极分裂的SSC群(图27)。
结果清楚地显示，成年灵长类睾丸中的生殖系精原干细胞具有相似的但与啮齿动物中SSC明显不同的分子和表型特征。使用多种干细胞、生殖细胞和精原干细胞特异性标记物的免疫组织学检查揭示，在灵长类中，GFR-α1在沿着生精小管基底膜的精原干细胞表面特异表达。GFR-α1是GDNF的受者，所述GDNF是SSC自我更新的重要调节器。GFR-α1阳性细胞是VASA阳性的，表明它们是生殖细胞。在位于成年灵长类生精小管中的细胞中，α6-整联蛋白与GFR-α1共定位为80％。通过选择α6-整联蛋白阳性细胞而富集的FACS细胞群显示与GFR-α1的非常高水平的共定位，证实了使用免疫组织化学方法在睾丸切片中鉴定生殖系干细胞的发现。灵长类SSC上α6-整联蛋白的表达表明该标记物在物种小鼠、猕猴和人之间是保守的，并且SSC在其细胞表面上也具有该标记物。一些α6-整联蛋白阳性细胞在生精小管外间质细胞中的定位表明，该标记物不能单独用于从成年灵长类睾丸中分离高纯度的SSC群。
SSC与其它干细胞，尤其是造血干细胞共享一些而不是所有的表型和分子特征。使用多种细胞表面标记物的流式细胞计量术分析揭示，在成年猕猴睾丸中，存在表达α6-整联蛋白和Thy-1的不同的细胞群，并且灵长类睾丸中的大部分细胞是c-Kit阴性的。灵长类睾丸的免疫组织化学染色也显示：沿着生精小管基底膜的所有细胞是c-Kit阴性的，表明α6-整联蛋白阳性细胞是c-Kit阴性的。单独针对α-6整联蛋白或Thy-1分选导致SSC标记物的富集，如通过免疫组织化学染色、RT-PC和端粒酶测定所示。有趣的是，分选α6-整联蛋白+、Thy-1+和c-Kit-细胞导致如定量RT-PCR所示最高的SSC标记物PLZF表达水平(图26A)，和提高最多的端粒酶活性(图26B)，表明这些标记物的组合将SSC富集若干倍。另外，灵长类睾丸中还存在清楚的SSEA-4阳性细胞群，其也显示高水平的端粒酶活性，并且表达高水平的生殖和SSC标记物(图28)。
免疫组织化学染色显示：SSEA-4阳性细胞也位于生精小管的基底膜上，并且与α6-整联蛋白和GFR-α1高度共定位。流式细胞计量术分析显示，成年灵长类睾丸中存在约5-7％的α6-整联蛋白+、Thy-1+、c-Kit分选的细胞，但是仅存在2-3％SSEA-4阳性细胞。这也与针对睾丸切片的免疫组织化学数据一致，所述数据显示与α6-整联蛋白阳性相比，每个生精小管横向切片中存在显著更少的SSEA4阳性细胞。这也表明灵长类睾丸中的SSC具有α6-整联蛋白+、Thy-1+和c-Kit-与SSEA4+的表型特征。SSEA-4是阶段特异性的胚胎抗原，并且主要存在于多能细胞如胚胎干细胞中。有趣的是所有SSEA-4阳性细胞共表达生殖细胞标记物VASA，然而这些细胞中仅部分与GFR-α1共定位，表明该标记物仅在猴睾丸中精原干细胞亚群上表达。
以核染色强度为基础的灵长类睾丸的形态学分析揭示，该物种中存在两类未分化的精原细胞：A深色和A浅色。A深色精原细胞被认为是储备干细胞，并且不是积极分裂的，而A浅色精原细胞显示是灵长类睾丸中的活性SSC。
与流式细胞计量术组合使用DNA染料碘化丙啶(PI)，我们发现，生殖系干细胞的SSEA-4阳性群具有与Thy-1+，α6-整联蛋白+细胞不同的DNA含量。而SSEA-4阳性细胞则具有与积极分裂的细胞类似的DNA谱，Thy-1+，α6-整联蛋白+细胞显示累积的细胞量停留在细胞周期的S期。另外，如通过PCNA染色所示，SSEA-4阳性细胞显示比Thy-1+，α6-整联蛋白+细胞显著更高的增殖活性。
在将ES细胞维持在未分化阶段中起决定性作用的多能标记物Nanog在灵长类睾丸中大量表达。在所有生殖细胞而不仅是SSC中的Nanog表达表明与ES细胞相比，该转录因子在生殖系干细胞中的不同作用。已经显示生殖细胞中Nanog的缺失诱导细胞凋亡而不是分化，表明Nanog是生殖细胞的存活因子。
显示：成年小鼠睾丸中3000分之一的细胞是SSC。以免疫组织化学染色为基础，成年猴睾丸中SSC的百分比与针对啮齿动物所述非常相似，所述免疫组织化学染色使用SSC特异性标记物GFRα1和PLZF。精原细胞移植研究也显示在成年猴睾丸中存在约0.3％SSC。
本文显示，三重分选(CD90+，CD49f+，c-Kit-)的细胞和SSEA-4阳性细胞显示出SSC的分子和表型特征，然而仅SSEA-4阳性细胞在精原细胞移植后再迁入受者睾丸。这表明SSEA-4阳性细胞可能代表了积极分裂的SSC，并且三重分选的细胞可能与静止的干细胞类似。有趣的是，SSEA-4和三重分选的细胞均表达GDNF受体(C-ret)，但是仅三重分选的细胞显示PLZF表达。已知GDNF和PLZF均为精原干细胞自我更新的主要调节器。尽管GDNF通过BCL6b转录因子的上调而调节SSC自我更新，但是PLZF以尚且未知的基质维持SSC自我更新。髓细胞性白血病锌因子(PLZF)显示通过阻抑细胞周期蛋白A而在G1/S转换处抑制细胞生长并转换通过S-期，所述细胞周期蛋白A可以在多种细胞类型中获得。PLZF也显示抑制G1/S转换的另一调节器P21。因此，高水平的PLZF导致细胞周期的阻断和静止。维甲酸受体α(RAR-α)显示通过增强细胞周期蛋白A的表达而逆转PLZF诱导的细胞周期抑制。
材料和方法
通过流式细胞计量术基本纯化灵长类生殖细胞：使用InFlux细胞分选仪完成流式细胞计量术分选。对表面表征和分选而言，用对非灵长类物种中干细胞表面标记物和精原干细胞标记物特异的抗体试剂染色细胞，所述抗体试剂包括抗-CD90-FITC、抗-CD49f-PE和抗-CD117-APC。对这些标记物分析而言，将细胞在完全培养基中于冰上染色30分钟，在冷的染色缓冲液中洗涤一次，重悬于完全培养基中并置于冰上，直至进行细胞荧光计量分析。
灵长类生殖细胞磁性分选：通过用磁性微珠标记并使细胞经过磁性柱，富集灵长类生殖细胞群。用针对SSEA-4或针对α6-整联蛋白和Thy-1的生物素酰化抗体(分别来自Ebioscience、Abcam、BD Pharrmigen)标记新鲜分离的灵长类睾丸细胞。被生物素酰化后，用链霉亲和素磁性微珠(Miltenyi Biotec)标记细胞。通过在存在磁体时使细胞经过柱来选择有磁性标记的细胞。通过将柱从磁体上拿开，使细胞从柱上洗脱而从柱上取下有磁性标记的细胞。这一方法成功地将针对每个标记物而言为阳性的细胞群体富集至新鲜分离的细胞中初始百分比的高达22倍。另外，磁性分选能够提供高达90％纯标记细胞的群体。这一富集方法与荧光流式细胞计量术组合使用。通过在进行荧光流式细胞计量术之前磁性分选细胞分离物，大幅减少了分选带有荧光标记的细胞所需的时间量，并且大幅提高了能够分选出的带有荧光标记的细胞数。
灵长类生殖细胞免疫组织化学染色：将组织在4％低聚甲醛(PF；Electron Microscopy Science)固定过夜；转移进20％蔗糖(Sigma)中并冷冻于OCT(VWR)中。以8μm的厚度制备冷冻切片并储存于-80℃。将分选的细胞固定于4％PF(Electron Microscopy Science)中，以约25,000个细胞/10μl重悬于100mM蔗糖中；将10μl等分式样转移在涂有鸟氨酸/赖氨酸的载玻片上；并将载玻片置于37℃加热板上直至干燥。将载玻片储存于-80℃直至分析。
对免疫组织化学染色而言，使用0.1％Triton-X100使睾丸切片和FACS分选的样品中的细胞通透化，并在含2％BSA和5％绵羊血清的溶液中封闭，或者在含2％BSA、5％山羊血清和0.1％Triton-X100的溶液中封闭。使用DAPI(Invitrogen)使核可见。在1X PBS+2％BSA中洗涤多次后，使用Permafluor(Beckman Coulter)对细胞防腐。使用装有SlideBookTM成像软件的Olympus BX-61显微镜评价组织切片和分选的细胞中表面标记物的分布。为了在小鼠或灵长类组织中定位灵长类睾丸细胞，分析50个不同的生精小管。对每种不同的标记物染色步骤而言，分析3到4个不同的切片；并且对FACS细胞样品而言，以至少三种不同的等分式样分析至少200种不同的细胞。
灵长类生殖细胞RNA提取、RT-PCR分析和QRT-PCR分析：根据制造商的推荐使用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)分离总细胞RNA。然后使用Quantitect RT试剂盒将分离的RNA转录为cDNA，并用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化。对每个RT-PCR反应而言，在含HotStar Taq Plus和各自不同引物的25μL反应体积中使用20ng cDNA模板。将所有靶标cDNA扩增30个循环。在2％琼脂糖凝胶上通过大小鉴定扩增产物。对QRT-PCR而言，在含Quantitect Sybr Green PCR母液混合物(Qiagen)的25μL反应体积中使用5ng cDNA模板，并使用BioRad iCycler扩增样品。每个样品一式三份测定，并针对GAPDH对照进行标准化。
灵长类生殖细胞端粒酶测定：使用SYBR Green实时定量端粒重复扩增方案(RQ-TRAP)。将组织或细胞沉淀物在PBS中洗涤一次，以1000个细胞/μL和400单位/mL RNaseOut抑制剂的终浓度，将其重悬于含RNaseOut抑制剂(Invitrogen)的1x Chaps裂解缓冲液中并匀化。在冰上孵育25分钟后，将细胞裂解物于4℃微量离心机中以16,000rpm离心10分钟。将上清液转移至新鲜的微量离心管中，并使用ND-1000分光光度计(Nanodrop)通过测量280nm的吸光度测定蛋白质浓度。在含500ng蛋白质裂解物、Quantitect SYBR Green PCR混合物、1μg TS引物、0.5μg ACX引物和无核酸酶蒸馏水的溶液中，端粒酶反应体积为25μL。每个样品与无模板对照(裂解缓冲液)、阳性对照(ESC细胞)一起一式三份测试，并根据含有1000ng、200ng、40ng、8ng或1.6ng蛋白质的人ESC裂解物的等分式样制备标准曲线。使用iCycler iQ5(Bio-Rad)，将反应在25℃孵育20分钟，在95℃孵育15分钟，并在以下的循环条件下扩增40个PCR循环：95℃30秒和60℃90秒。阈值循环值(Ct)由半对数扩增曲线(荧光的对数增长相对于循环数)测定，并与标准曲线比较。阈值的软件默认设置是在排除循环1的最初10个循环中每个孔荧光读数的标准偏差均值的10倍。从标准曲线上读出不同灵长类睾丸细胞样品的端粒酶活性，和/或表述为用人ESC裂解物标准记录的数值的百分比。
表2.MEM-X灵长类培养基组成
  组分   终浓度
  DMEM/F12   N/A
  睾酮   50ng/mL
  雌二醇   50ng/mL
  牛血清白蛋白   5μg/mL
  丙酮酸钠   30μg/mL
  氢化的可松   0.05mM
  D/L乳酸   1μl/mL
  谷氨酰胺   1X
  MEM维生素   2X
  MEM NEAA   1X
  胰岛素-转铁蛋白-硒   1X
  青霉素/链霉素   1X
  表皮生长因子   20ng/mL
  碱性成纤维细胞生长因子   10ng/mL
  人白血病抑制因子   10ng/mL
  来自胶质的神经营养因子   40ng/mL
实施例3
灵长类生殖系干细胞的培养物扩展
将分离后的生殖系干细胞(实施例2)转移至MEF平板上并在不同的无血清培养基中培养，所述培养基包括小鼠无血清培养基(MSFM)、大鼠无血清培养基(RSFM)或MEM-X
Figure BPA00001577241000441
培养基。
培养后十天，所有培养基中出现扁平的集落(图29A)。MEM-X中的集落比其它两种培养基中更好地保持其形态。存在于未分选群体中的集落数比分选的细胞更低。在测试的细胞表面标记物中，SSEA-4和三重分选的细胞导致集落形成。从三重分选细胞中排除SSEA-4阳性细胞导致非常少的集落；然而，从SSEA-4阳性细胞中排除三重分选细胞不改变集落形成能力。对SSEA-4和三重分选均为阳性的细胞在培养中形成最大量的集落，从SSEA-4和三重分选中排除的细胞未形成任何集落。然后针对SSEA-4(图29B-C)、GFR-α(图29D)和α6-整联蛋白对集落染色。
实施例4
对雌性生殖系干细胞的分离
在显微解剖镜下从40-60只2-5天龄的转基因OG2出生后幼鼠中切下小鼠卵巢，并用于细胞分离。首先将卵巢收集在含有冷D-PBS的培养皿中，所述D-PBS补充有4mM EDTA。随后使用5ml吸液管，将卵巢转移至50ml圆锥形管中。离心和洗涤后，去除D-PBS洗涤溶液，并将卵巢重悬于胶原酶(1mg/ml)和DNase-I(20unit/ml)中；并置于37℃水浴中。每10分钟通过吸液管物理破坏消化中的卵巢组织，并在孵育(30分钟)结束时添加5ml胎牛血清(PBS)来中和酶。将得到的细胞悬液经过40μm滤过器去除组织碎片，并通过400xG离心10分钟收集分离的细胞。去除上层的酶-FBS溶液，将细胞重悬于培养基中并置于冰上直至使用。
如下基本纯化卵巢生殖系干细胞：通过鉴定绿色荧光强度的流式细胞计量术收集GFP阳性细胞(图11A)，开放针对c-Kit的三条通道(R2、R3和R4)(图11B)；然后针对c-Kit强度分选R3(图11C)。
使用流式细胞计量术分析，在新生(图11A)和成年(图11B)小鼠中检测GFP/Oct-4阳性细胞，表明出生后卵巢中生殖系干细胞的存在。小鼠卵巢中生殖系干细胞的百分比随着年龄而显著减少。尽管在新生小鼠的卵巢中发现1-2％GFP阳性细胞，但是成年卵巢中仅存在0.05％。在Oct-4阳性细胞中，60％是c-Kit阴性的或表达低水平的c-Kit，40％显示高水平的c-Kit表达(图11C)，表明生殖系干细胞中存在两种群体。免疫组织化学分析揭示了GFP-Oct-4阳性细胞存在于卵巢上皮各处(图12A-12C)。RT-PCR分析显示从新生小鼠卵巢中分离的GFP阳性细胞表达多能标记物Oct-4以及生殖细胞标记物VASA和c-Kit，证实了该群体中生殖系干细胞的存在，而GFP阴性细胞仅显示生殖细胞标记物的表达(图13)。
与预期相反，新鲜分离的成年或新生卵巢细胞显示非常低的端粒酶活性。然而，RT-PCR分析证实，培养开始时的GFP阳性细胞如ESC表达Oct-4(图13)。GFP阳性细胞表达Oct-4(图13，第5道)而GFP阴性细胞则不表达(图13，第6道)。GFP阳性细胞表达比GFP阴性细胞更高水平的VASA(图13，第5道)。GFP阴性细胞比GFP阳性细胞表达更高水平的c-Kit。
在某些现有科学报道中，标记物c-Kit与雄性生殖系干细胞相关。在Oct-4阳性细胞中，60％是c-Kit阴性的或表达低水平c-Kit，40％显示更高水平的c-Kit表达。从新生小鼠卵巢中分离的GFP阳性细胞表达多能标记物Oct-4以及生殖细胞标记物VASA和c-Kit。组合的结果证实从OG2小鼠的卵巢中分离的GFP阳性细胞群体中存在生殖系干细胞。
在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的饲养层上培养的GFP阳性细胞形成圆形和扁平的集落，其中一些具有清楚确定的边缘(图14A-14C和14E)，但是其它则没有(图14F)。挑取清楚边缘和不清楚边缘集落的代表(图14B)并使用胶原酶在MEF上传代(图14D)。传代后细胞集合成为可以如下识别的区别性集落：小圆形细胞的紧密的卵形中心簇，周围是扁平的紧凑的细胞，所述细胞具有更像上皮的形状(图14G-14I)。该集落外观保持到传代4以后(图14J-14K)。
如所预期的，GFP阳性卵巢细胞集落对Oct-4而言是阳性染色的(图15A)。支持它们作为生殖系细胞身份的是，这些集落中的细胞对多能转录因子Nanog而言也是阳性染色的(图15B)。另外，这些细胞还表达生殖系特异性标记物VASA(图15C)和干细胞标记物碱性磷酸酶(图15D)。组合的结果证实雌性生殖系干细胞的分离、鉴定、表征和组织培养物中的传代。
GFP阳性集落耐受使用胶原酶的酶促消化，并产生新的集落。然而，它们不耐受胰蛋白酶消化，并且大部分集落在胰蛋白酶处理后分化。GFP阴性细胞仅显示生殖细胞标记物的表达，无干细胞标记物的表达。若干代(例如15代)之后，这些分化的集落保持其形态，但是大部分细胞不再表达GFP，表明Oct-4启动子的下调和可能的分化。每个集落中只有小量细胞，主要是集落中心的大细胞，显示GFP表达。随时间变化，这些GFP阳性细胞似乎形成非常大的(高达40μm)卵形细胞，所述细胞停留在与卵泡具有形态学相似性的结构中(图16A、16B)。最后，卵形GFP-阳性细胞从集落中分开，即呈现初级卵母细胞的外观(图16C)。总之，结果支持下述观点：经分离和基本纯化的卵巢生殖系干细胞体外分化并且成熟，得到初级卵母细胞。
这些大卵母细胞样细胞的存在和表征通过如下从图16的培养物中充分分离和纯化它们来验证：使用标准FACS分筛珠(sizing bead)，产生显示所有15微米(μ)和更小事件的门栅(gate)(R1)；MEF细胞是均在R1中累积的同质群体(图17A)；图206的生殖细胞培养物中大量大细胞(＞15μ)在MEF上生长(图208B)。这些细胞中的一些直径约60-70微米。
材料和方法
培养卵巢生殖系干细胞：以4孔板每孔5000-10000的浓度，在PM-1TM培养基中小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)养料上培养GFP阳性+细胞。将培养物在37℃下维持，并且每隔一天更换一半培养基。每两周将细胞机械或酶促(胶原酶)转移至新的MEF平板上。
卵巢生殖系干细胞的表征：将新鲜分离的GFP-阳性细胞用于端粒酶测定和基因表达分析。对卵巢组织学而言，将卵巢在1M蔗糖中4％低聚甲醛(PFA)中于4℃固定过夜，并包埋在低温恒温冷冻介质(cryostatfreezing medium)中。制备五微米切片，并使用荧光显微术确定GFP-阳性细胞的定位。通过Oct-4和VASA双标记验证生殖系干细胞在卵巢中的定位。对免疫细胞化学(ICC)而言，在室温下将培养的生殖系干细胞于2％PFA中固定30分钟，在PBS中洗涤并保存于4℃。为了表征所培养的卵巢生殖系干细胞，使用亮视野ICC进行VASA、Oct-4、Nanog和碱性磷酸酶染色，如下文进一步所述。
RT-PCR和QRT-PCR分析：根据制造商的推荐使用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)分离总细胞RNA。然后使用Quantitect RT试剂盒将分离的RNA转录为cDNA。使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化转录的cDNA。对每个RT-PCR反应而言，在含HotStar Taq Plus(Qiagen)和适当引物的25μL反应体积中使用20ng cDNA。所有靶标扩增30个循环。在2％琼脂糖凝胶上通过大小鉴定扩增产物。对QRT-PCR而言，在含Quantitect SybrGreen PCR母液混合物的25μL反应体积中使用5ng cDNA模板，并使用BioRad iCycler扩增反应混合物。每个样品一式三份测定，并针对GAPDH对照标准化。
实施例5
人类雄性生殖系干细胞的分离
该研究使用作为睾丸活组织检查从患有非梗塞性精子缺乏的患者中收集的人睾丸，或在睾丸切除术后收集的睾丸组织残余物。所有组织都由患者知情同意捐赠。在收集的24小时内将组织转移至PBS-抗生素中。加工人睾丸组织的步骤与实施例2中所述用于灵长类的相似。
在细胞分离前，采取组织样品用于ICC，并采取两小片睾丸用于RNA和DNA提取。细胞分离和生存力与细胞数测定后，采取样品用于RNA和DNA分析。用于ICC、RNA和DNA提取的方法与实施例2中所述用于灵长类的相似。另外，用先前为了通过磁性细胞分选和流式细胞计量术分离灵长类生殖系干细胞所开发的细胞表面标记物的表达标记细胞。用于流式细胞计量术的抗体和方法与实施例2中所述用于分离灵长类生殖系干细胞的相似。
还通过用磁性微珠标记并使细胞通过磁性柱来富集生殖细胞群体。用针对SSEA-4或针对α6-整联蛋白和Thy-1的生物素酰化抗体标记新鲜分离的睾丸细胞。被生物素酰化后，用链霉亲和素磁性微珠标记细胞。通过在存在磁体时使细胞经过柱来选择有磁性标记的细胞。
通过将柱从磁体上拿开，使细胞从柱上洗脱而从柱上取下有磁性标记的细胞。这一方法成功地将针对每个标记物而言为阳性的细胞群体富集至新鲜分离的细胞中初始百分比的高达22倍。另外，磁性分选能够提供高达90％纯标记细胞的群体。这一富集方法与荧光流式细胞计量术组合使用。通过在进行荧光流式细胞计量术之前磁性分选细胞，大幅减少了分选带有荧光标记的细胞所需的时间量，并且大幅提高了能够分选出的带有荧光标记的细胞数。
然后使用分选的细胞进行RT-PCR和DNA分析。还在一些样品中，使用免疫缺陷小鼠作为受者对细胞进行精原移植测定。精原干细胞移植的技术与实施例1和2中所述针对小鼠和灵长类的相似。
对由睾丸活组织检查和残余睾丸组织制备的冷冻切片的免疫组织化学染色揭示了生精小管横向切片的基底膜上存在许多α6-整联蛋白阳性细胞。还在生精小管的基底膜上发现了SSEA-4阳性细胞和GFRα1阳性细胞。
进行了下述ICC：SSEA4和VASA染色的全人类睾丸组织(THT)(图30)；用GFR-α和VASA染色的THT(图31)；VASA和Nanog染色的THT(图32)；针对SSEA-4和α6-整联蛋白染色的bHT-1(活组织检查人类睾丸组织)(图33)。由仅用第二抗体染色的人睾丸切片组成阴性对照(图34)。将人THT SSEA-4阳性磁珠分选的细胞移植进用白消安处理的受者小鼠睾丸中，在一个月后切片并用以下标记物染色：SSEA-4和人核蛋白(HNP，图35)，α6-整联蛋白和HNP(图36)，SSEA-4和α6-整联蛋白(图37)。由仅用第二抗体染色的小鼠睾丸切片中人THT移植的细胞组成的阴性对照(图38)。所有菌株均含有一般的核染料。
流式细胞计量术分析证实了免疫组织化学观察结果，并且在从人睾丸收集的样品中发现α6-整联蛋白阳性群体。另外还发现了不同的Thy-1阳性细胞群体。Thy-1和α6-整联蛋白的共定位显示人睾丸中存在三种Thy-1阳性细胞亚群：1)Thy-1中和α6-整联蛋白低，2)Thy-1高和α6-整联蛋白中，和3)Thy-1高和α6-整联蛋白阴性。大部分α6-整联蛋白阳性细胞是Thy-1阴性的。还在人睾丸中发现SSEA-4(10-12％)和GFR-α(1-5％)的明显的群体。磁性分选显著地将SSEA-4阳性细胞的百分比提高至44％，表明该标记物的4倍增加。
定量RT-PCR分析揭示：在测试的样品中，SSEA-4阳性细胞和GFR-α阳性细胞表达最高水平的精原干细胞标记物(包括C-RET、PLZF和TERT)和生殖细胞标记物(包括VASA和DAZL)。端粒酶活性是精原干细胞的标志。精原干细胞移植揭示了SSEA-4阳性细胞在受者小鼠的睾丸中建群并再迁入，表明这些细胞是功能性的精原干细胞。
已显示，通过移植来自供体小鼠的雄性生殖系干细胞(GSC’s)，可使不育雄性小鼠能生育，并且这些小鼠可接着产生后代。然而，得自该方法的小鼠特性先前没被检查。该研究的目标是确定得自GSC移植并与亲本株系的已知生长模式比较的小鼠特性。图54描绘了通过得自雄性GSC移植的小鼠育种产生的雄性(图54A)和雌性(图54B)F1小鼠的平均生长。这些生长速度与由供应商提供的亲本小鼠的生长速度类似(数据没有显示)。
实施例6
人类精原干细胞的表型特征
通过SSEA-4的磁性分选，富集精原干细胞(SSC)的人类睾丸细胞并且富集的群体被显微注射进受者小鼠的睾丸中。移植后一个月，收获睾丸并制作冷冻切片。使用与alexa-488缀合的人类核蛋白(HNP)抗体确定小鼠睾丸中的人类细胞的身份。HNP与生殖细胞、体细胞、干细胞和多能标记物(表3)的共定位用来评定小鼠睾丸中的人类SSC的表型特征。
如通过小鼠睾丸中HNP染色所检测的人类细胞的广泛建群表明在SSEA-4磁性分选的细胞中存在高度富集的SSC群体。在小鼠睾丸中建群的所有人类细胞对生殖细胞标记物VASA而言是阳性染色的并对LHR(睾丸塞尔托利(sertoli)细胞和莱迪希(leydig)细胞的标记物)而言是阴性染色的。这表示所有建群的细胞是生殖细胞。在该研究中使用的标记物中，仅15％的人类细胞在其表面上表达SSEA-4，31％的表达α6-整联蛋白和45％的细胞表达GPR125。在小鼠睾丸中建群的几乎所有的人类细胞表达c-Kit，表明SSC的自我更新需要该标记物。在多能标记物睾丸中，没发现Oct-4+或TRA-160+细胞，但29％的人类细胞显示Nanog表达。这表示在人类SSC中存在有多能特征的细胞群。几乎所有的SSEA-4细胞对α6-整联蛋白而言也是阳性的。所有的SSEA-4+细胞对c-Kit而言也是阳性的，这表示仅SSC的c-Kit+群具有在受者睾丸中建群的能力。
表3
  标记物   阳性细胞的百分比
  VASA   100
  LH-R   0
  SSEA-4   15
  α-6整联蛋白   31
  GPR-125   45
  c-Kit   96
  Nanog   29
  Oct-4   0
  TRA1-60   0
该研究清楚地表明人类SSC具有VASA+、c-Kit+、LHR-、TRA1-60-、Oct4-的表型特征并且人类SSC的亚群是SSEA4+、α6-整联蛋白+、GPR125+和Nanog+。这表明在人类睾丸中存在SSC的不同群体。
如通过VASA、SSEA4、GFR和α6-整联蛋白共定位研究所示，黄体生成素受体(LHR)不与猴、人类或小鼠生殖细胞共定位。如这些阳性细胞的定位和形态学所指出，LHR在塞尔托利和莱迪希细胞上表达。连接蛋白-43似乎染色位于基底膜的两种生殖细胞、塞尔托利细胞并可能染色莱迪希细胞。
实施例7
雄性生殖系组织的冷冻保存
按照实施例6获得含有精原干细胞的人类雄性睾丸组织。分离的细胞或睾丸组织被冷冻保存。另外，保存小段的生精小管用于宿主外成熟。
细胞或组织冷冻保存在溶液中，所述溶液包含：包括但不限于二甲亚砜(DMSO)、乙二醇、丙三醇和丙二醇的至少一种冷冻保护剂；包括但不限于上面公开的DMEM、MEM和专有培养基的至少一种培养基；包括但不限于蔗糖、葡聚糖、血清替代品和HEPES缓冲液的至少一种添加剂。在一种实施方式中，溶液包含CryoStorTM CS-10培养基(BioLife SolutionsInc.)。细胞或组织通过常规方法或在受控的速率下被冷冻
对于解冻，冷冻保存的生殖系干细胞被悬浮在具有10％的DMSO浓度的1.5mL DMEM中。细胞悬液接着用培养基被稀释至50mL，使DMSO浓度为0.3％。然后离心细胞，吸出培养基，且将细胞再悬浮在培养基中，使剩余的DMSO浓度不超过0.012％。
为了测定睾丸应该以细胞悬液还是以组织形式被冷冻保存，获得2-5天大的青春期前小鼠睾丸，并且一些睾丸作为组织被冷冻保存且一些被离解至单细胞悬液，之后冷冻保存。在两种情况中都使用控制速率冷冻方案。解冻之后，回收总细胞数目，分析活力和细胞表面标记物以测定在每一悬液中的生殖细胞、体细胞和生殖系干细胞的比例。结果指示冷冻保存细胞好于冷冻保存组织。冷冻保存的小鼠睾丸细胞大约95％是有活力的，而从冷冻组织中分离的细胞大约80％是有活力的(图48)。
使用猪睾丸细胞，还测定了每体积的冷冻保存培养基的大约数目的细胞。细胞获得自青春期前猪睾丸(～3个月大)并以2.5、5、10和20x106/ml的浓度再悬浮在冷冻培养基中，在控制速率冷冻方案下冷冻。解冻后，分析恢复的总细胞数目、活力和细胞表面标记物，以测定在每一悬液中生殖细胞、体细胞和生殖系干细胞的比例。细胞浓度对它们的活力或细胞组合没有影响(图49)。细胞可被冷冻在袋子或冷冻管中
由于无法获得青春期前人类睾丸材料的，还研究了得自成年人类的睾丸。得自经历变性手术的年轻成年男性的睾丸样品(两个样品)被用于储存。来自生育临床捐赠的睾丸活组织检查(三个样品)也用于组织和细胞储存。结果表明使用控制速率冷冻解冻后睾丸细胞有高活力且活力不被细胞密度或不同的运输培养基所影响但活力在72hr运输后下降(图50A和B)。
另外，测定了使用手工冷冻还是通过在受控的环境中缓慢冷冻能更好地保存睾丸细胞。2-5天大青春期前小鼠和3个月大的青春期前猪睾丸用于该实验，一些细胞被手工冷冻，一些用控制速率的冷冻方案冷冻。解冻后，分析恢复的总细胞数目、活力和细胞表面标记物，以测定在每一悬液中的生殖细胞、体细胞和生殖系干细胞的比例。在受控冷冻方案下冷冻保存鼠细胞产生了具有与手工冷冻类似特征的细胞(表4)。
表4
Figure BPA00001577241000521
na＝不可得到的；M＝手工冷冻；CRF＝控制速率冷冻
表5
实施例8
雌性生殖系组织的冷冻保存
雄性和雌性配子发生之间的主要差异在于雌性卵子比在青春期前阶段的雄性在更晚阶段进行卵子发生。在睾丸中，可以看见的仅有的生殖细胞是精原干细胞及其前体，而在卵巢中，原始卵泡内的卵母细胞被认为是功能性繁殖单元。目前，对于青春期之前年龄的雌性生育力的保存，可利用两种选择：1)冷冻保存卵巢片段。2)冷冻保存原始卵泡。用缓慢冷冻方案或用玻璃化(vitrification)冷冻，已成功进行了人类卵巢的冷冻保存。基于这些结果，需要制备非常薄的卵巢表面上皮层，以保存卵巢再生需要的卵泡组分。冷冻/解冻之后并移植的卵巢可导致在小鼠中一致的生育力恢复并产生健康后代。
为了冷冻保存卵巢，制备来自青春期前年龄雌性的卵巢薄片(＜1mm)并切成小片。在DMEM中的DMSO、乙二醇(EG)和血清替代品(SS)的组合物可用作冷冻培养基。根据下述方案进行玻璃化：(1)在20％SS中的7.5％EG和7.5％DMSO中平衡25min，(2)在0.5M蔗糖中的20％EG和20％DMSO中平衡15min或直到组织下沉，并(3)将组织放在金属条上并直接浸没在液氮中。为了解冻组织，金属条被直接浸在37℃下的1M蔗糖中至少1min，然后在室温下转移进0.5M蔗糖中5min。然后在没有冷冻保护剂的基础培养基中洗涤解冻的组织两次。
还测定了在与人类更接近的动物模型中，卵巢在组织冷冻保存还是在细胞悬液冷冻保存后更好地保持。在该研究中使用了来自青春期之前和成年猴的卵巢组织。收到后，切割卵巢并将皮质与髓质分开。然后将卵巢皮质切成小片(2x2mm)。一半的小片用于组织冷冻，另一半经受组织切碎机和酶消化用于分离卵泡和细胞。使用了不同的冷冻保护剂和冷冻方案。在不同的条件下冷冻的细胞和卵泡的活力和存活在解冻后通过流式细胞计量术和细胞凋亡分析。
实施例9
生殖细胞和组织的运输
该研究测定了哪种运输培养基更适于运送睾丸。还研究了冷冻保存睾丸细胞的合适的细胞密度。由于无法获得来自青春期之前男孩的人类睾丸，使用了猪睾丸。每个睾丸被切成10片和相等数目的片被分进两个管中：1)含有MEM，和2)含有PBS。收到后，组织被离解为单个细胞，并以从2.5-20x106/ml的不同的密度冷冻细胞。结果指示MEM和PBS二者都可在装运期间支持人类睾丸以及细胞活力还不受细胞密度影响(图51A和B)。
另外，测定了在细胞处理之前，组织可在合格的运送箱中保持的最大时间。青春期之前的大鼠睾丸用于该实验并且组织在从身体去除后在合格的运送箱中保持高达96小时。结果清楚地表明了活力被保持高达48h(图52)。细胞活力在装运72h后显著下降，但是仍有85-90％的细胞在装运4天后存活。
实施例10
小鼠效能检验-生育力评定
先前已描述了将来自供体动物的雄性生殖系干细胞移植进不育受者的睾丸中。供体生殖细胞在受者的睾丸中建群并产生源于供体的精子，使得受者雄性可分配生殖细胞供体的遗传物质。生殖细胞移植表示雄性生殖系干细胞的功能重建测定以及因此极大增强了我们研究睾丸中的干细胞生物学并定义不育表型的能力。首先在啮齿动物中开发的技术现已在许多动物物种中使用，所述动物物种包括家养哺乳动物、鸡和鱼。该技术在动物中有许多应用：第一，来研究雄性生殖系干细胞生物学和雄性生育力的基础方面；第二，通过在物种内或物种之间的雄性生殖细胞移植来保存遗传上有价值个体的繁殖潜能。因此，雄性生殖细胞的移植是研究、保存和操作动物的雄性生育力的独特有价值的途径。为验证GFP生殖细胞移植试验，确定移植进入白消安处理的小鼠的GFP生殖细胞的最佳移植数目。通过将移植了GFP生殖细胞的雄性裸小鼠与雌性裸小鼠交配确定GFP生殖细胞的最佳移植细胞数目。来自这些交配的GFP+后代将确定移植的GFP生殖细胞是否恢复了生育力并产生了可存活的GFP后代。然后通过比较下文描述的参数与总细胞移植和/或其他参数(标记物表达、睾丸重量等等)，GFP后代用于验证GFP生殖细胞移植试验。GFP幼兽出生后，来自移植了GFP生殖细胞种畜(sire)的那些GFP后代通过再次与裸小鼠交配用来检验GFP生殖细胞的生育力和生殖系传向下一代。
每只单独的GFP+移植的雄性小鼠与4只雌性裸小鼠交配。每夜两只雌性小鼠与每只雄性小鼠交配。根据它们的发情周期，四只雌性每夜循环交配。雄性小鼠将交配三周，中断一周，如果雌性小鼠还没有形成阴栓，将开始另一个三周的交配。这些程序将为雌性小鼠提供受孕的最佳时机，而中断时间使得雄性小鼠从连续的交配中恢复。每天早上，检查小鼠作为成功交配的阳性标志的阴栓。该交配程序在移植后持续进行5-7个月。如果没有雌性怀孕，交配将持续另外的2个月。
交配周期后，停止交配并通过流式分析、针对GFP的精子分析和组织学分析来自GFP移植小鼠的睾丸，以确定在在睾丸中表达的GFP+和SSC+标记物的数目。还使用荧光和PCR针对GFP对F1代进行测定。因为裸小鼠没有毛，所以有毛的任何幼兽应是从GFP阳性精子产生的。
为了评定来自F1代GFP的生育力和生殖系传递或毛色，使他们被成熟至2个月龄，然后与2只裸小鼠(雄性或雌性)交配两个月以确保怀孕。F1小鼠产生F2代后，用荧光和PCR，针对GFP，筛选F2GFP+和/或毛色+的小鼠。这将检验GFP+细胞的隔代生殖系传递。接着处死被证明是GFP+的F2代并收集生殖器官用于组织学分析以用GFP+精子检验完整的精子生成。
从青春期之前小鼠分离的新鲜睾丸细胞可在白消安-处理的小鼠中恢复生育力并且通过天然交配或使用辅助繁殖技术交配使87％的小鼠重新获得其生育力。为了确定是否冷冻保存的睾丸细胞可恢复生育力，5-8周大的雄性裸小鼠用白消安处理并且动物在一个月之后变得不能生育。将来自2-5天大的青春期之前GFP+幼兽的细胞冷冻并用作移植的供体细胞。小鼠接受下列四个处理方案(regimen)中的一个：九只小鼠接受已被手动冷冻的细胞(5x105)；九只接受已用控制速率的冷冻方法冷冻的细胞(5x105)；九只接受已用受控冷冻方案冷冻的细胞(1.25x105)；和另外九只接受已用控制速率的冷冻方案冷冻的较少数目的细胞(5x104)。移植三个月后，动物与两只雌性小鼠各自交配并且通过栓检查确定交配的效力并记录妊娠和GFP幼兽的数量。处死重新获得生育力但产生裸幼兽的这些动物的一只，并使用流式细胞计量术和荧光显微镜确定存在GFP精子(图53)。该流式细胞计量术分析显示在左侧睾丸中有小群体的GFP+精子，而在右侧睾丸中没有发现GFP+精子。在小鼠的右侧和左侧睾丸中都发现GFP+生精小管表示移植的细胞已在受者睾丸中存活并建群。基于流动数据，仅0.5％的精子是GFP阳性的。
实施例11
睾丸形态学和生育力之间的相关性：
在效能检验中使用的小鼠组保持交配5个月，它们中的一些已证明是能育的且一些不能诱导任何妊娠并因而被记为不育的(通过自然交配的手段；这些小鼠可能具有低的精子计数)。这些动物被处死，手术去除睾丸，收集精子并冷冻。冷冻的精子随后通过流式细胞计量术分离GFP+精子，所述GFP+精子将用于细胞质内精子注射(ICSI)。首先将睾丸称重，然后在装有荧光灯的适于GFP和CFP检测的显微解剖镜下分析。在大体检查后，将睾丸固定在4％PFA中并制得冷冻切片用于组织学检查。
移植的动物的睾丸显著重于未移植的对照组(图39)。在微解剖镜对睾丸的大体检查揭示了用GFP供体细胞移植的所有动物发育了如通过GFP管指示的GFP+生精细胞。基于GFP-染色区域的强度、长度和分布，对睾丸进行1-5评分，其中1为最少且5为最高整合记分。令人感兴趣地，能育的小鼠(n＝2)显示出最高整合记分(5)，而在不育的动物(n＝4)之间有大的变动，平均记分为2.75(表6)。大体检查后能育的和不育的睾丸的代表性图像在图40和55中示出。这些睾丸的组织学检查表明，较之不育小鼠，能育的动物具有显著更高的百分比的有精子的生精小管。如期望的，不育的动物显示了显著更高百分比的空的或部分满的生精小管(图41)。出乎意料地，含有GFP+细胞的生精小管的百分比在不育小鼠中比在能育小鼠中更高(图42)。
表6.大体检查后的GFP记分
Figure BPA00001577241000571
结果清楚地表明睾丸重量在移植后显著增加。组织学和大体检查都显示了GFP+细胞在所有移植的动物中广泛再生。同时基于大体检查的GFP记分显示了与生育力的正相关性，GFP+生精小管的百分比显示了反相关性。具有完全精子生成的生精小管的数目与生育力之间正相关，空生精小管得到数目与生育力负相关。
结果表明睾丸重量、GFP记分和睾丸组织学是生育力的可靠的指示并且可在将来用于预测移植的成功性。
实施例12
用冷冻保存的睾丸组织恢复生育力
在已通过白消安处理而不育的雄性小鼠中，77.78％的小鼠可通过睾丸细胞移植手术恢复它们的生育力。约101,563至1,000,000个细胞被移植进每个睾丸中，导致生育力恢复。另外，可导致生育力恢复的注射的GFR-α+细胞的范围是41至6,675，和可恢复生育力的注射的c-Kit-/α6-整联蛋白+细胞的范围是22,648至166,500。SSEA-1+细胞在青春期前的小鼠中不显示存在，并因而不与移植后的生育力相关，但人类的相同的标记物(SSEA-4)对生育力恢复可能是关键的。另外，Thy-1和三重染色(Thy-1+，c-Kit-，α6-整联蛋白+)的细胞不与小鼠的生育力恢复相关，但在人类中是重要的。
实施例13
用冷冻保存的小鼠卵巢组织恢复生育力
该项目的目的是研究卵巢组织以组织形式还是细胞悬液形式能被更成功地移植。小鼠被摘除卵巢并且一些接受新鲜卵巢移植，一些接受冷冻/解冻卵巢移植，一些接受含有新鲜卵巢细胞和卵泡的凝块移植，一些接受含有冷冻/解冻卵巢细胞和卵泡的凝块移植，一些保留完整作为正常育种对照。血管内皮生长因子(VEGF)被添加至凝块，以促进移植的凝块血管生成和血管发生。
实施例14
使用超薄内窥镜显微注射技术将精原干细胞移植进人类睾丸
超过十年以前，使用玻璃毛细管和纤维切割显微镜，在啮齿动物中开发了精原干细胞移植技术。在小鼠中，睾丸的构造和尺寸提供了通过输出管进入睾丸网的可行的方法，其允许通过单次注射进输出管，将足够数目的SSC快速可靠的移植进生精小管的管腔。啮齿动物中的睾丸网从睾丸外部是可见的并位于距离睾丸动脉和静脉足够远的位置。
但在较大的哺乳动物中，睾丸的构造和尺寸不同。第一，睾丸网位于睾丸中紧邻睾丸血液供给。第二，有将睾丸网连接至附睾的多个输出管。最后，睾丸的尺寸需要更大体积的细胞悬液以充满睾丸(毫升体积而不是微升体积)。在牛和猴中，已开发了超声引导的方法，用于通过将大针注射进睾丸管腔而将SSC移植进睾丸。然而这些方案效率低下并且是侵入性的，因为在两种方法中，在一些情况下注射导致睾丸网损伤和出血。
本文也公开了人类睾丸的显微注射器件，其允许从外部进入人类睾丸片段(包括附睾)，并具有操纵进入个体输出管的能力，其允许进入睾丸网而不损伤动脉和静脉。该器件由两部分组成：内窥镜毛细管导管，其具有光源和允许操作者指导导管的照相机；和内部变窄导管，其通过输出管并将细胞悬液移进睾丸网。导管经小的切口插入附睾并引导至输出管。在细胞注射之前，注入超声造影溶液(Levovist)并通过超声器件监测溶液的流动以确保溶液通过睾丸网进入生精小管。
该器件的优势是非侵入性并可靠地进入人类睾丸管腔中。该器件还用于雄性不育的诊断目的，例如找到梗塞性精子缺乏的准确定位。该器件还可用来以较少侵入性的方式从附睾和睾丸网中收集细胞和组织。
实施例15
青春期之前雄性生殖系干细胞和它们在不育治疗中的用途
对最常见的儿童癌症-血源性癌症的治疗趋向于需要结合全身辐射和骨髓移植的烷化剂。这些治疗不仅毁坏恶性细胞，而且也可对快速分裂的精原细胞具有细胞毒性作用。结果，生精衰退并可在成年期期间出现不育。青少年和成年男人在癌症治疗前具有冷藏他们的精液的选择，并且通过人工授精、IVF或ICSI，他们可做遗传学上是他们自己的孩子的父亲。
青春期之前的患者处于丧失其生育力的巨大风险下，因为他们还没有完成精子生成。他们的生精上皮仅含有塞尔托利细胞和不同类型的精原细胞，其中间是干细胞。因为缺乏成熟配子，冷冻保存未成熟组织是目前仅有的方式，通过所述方式可保存少年男孩的生育力。
使用来自广泛的多种动物的供体睾丸，大多使用免疫系统受损的小鼠作为受者，已进行了睾丸细胞移植。在其中受者是小鼠的实验中，已用作供体的动物包括小鼠、大鼠、仓鼠、兔和狗、黄牛、猴和人类。得自供体睾丸细胞的后代仅在小鼠和大鼠中示出。
保存青春期之前患者的生育力的策略包括分离并冷冻保存生殖系干细胞。这些生殖系干细胞可被自体移植进化学疗法和/或放射疗法之后的患者。然而，来自癌症患者的生殖系细胞的自体移植有传递恶性细胞的风险。因此，生殖系细胞应完全与恶性细胞分离。本文公开了基于流式细胞计量术分选的方法，其差异化选择生殖系干细胞并将它们从癌细胞中纯化出来。
本文还公开了生殖系干细胞移植的生理相关试验。试验的结果将对恢复生育力需要的干细胞的量做出判断。其还用来评估组织收集时和释放之前生殖系干细胞的稳定性，活力和效能。使用小鼠模型，因为该物种中的精原干细胞的表面标记物已被充分表征并且移植技术可得到。该移植技术将测试生殖系干细胞在允许在受者动物中完成供体细胞的一系列精子生成的白消安-处理的免疫缺陷型小鼠睾丸中的功能性。
1.睾丸支持细胞的合适的抗体的确定。
黄体生成素受体(LHR)是区分生殖细胞与体细胞的特异性标记物。LHR在睾丸中仅与塞尔托利细胞和莱迪希细胞结合。
表7
Figure BPA00001577241000601
2.将生殖系干细胞与癌细胞分开
该研究的目标是富集生殖系干细胞，同时从患者样品中去除任何肿瘤细胞，开发了下述方法，所述方法从混杂的细胞群中差异化选择并分离生殖系干细胞；以使选择过程量化至下述点，其中污染性癌细胞对于临床应用已经充分衰竭。这包括评价需要多少癌细胞来开始肿瘤生长。为了根据其疾病表型治疗每个患者，将开发针对疾病特异性免疫表型的方法。为了达到这一点，评估具体癌症类型的特异性细胞表面标记物表达并被用于使来自患者样品的癌细胞衰竭。
该程序的主要关注点是分离生殖系干细胞。用对在血癌细胞中表达的两种表面标记物(包括MHC I类和白细胞共同抗原(CD45))的抗体，已建立了通过流式细胞计量术分选从白血病小鼠中阴性选择的程序。程序导致将小鼠生殖系细胞成功移植进受者睾丸中，而不会在小鼠中传递白血病。为了进一步排除恶性细胞，用生殖细胞的特异性标记物(CD90、CD49f、SSEA-4和GFR-α)阳性选择人类生殖细胞。另外，可利用癌症的其他表示物，例如DNA倍体检测。该模型的目标是恢复生育力而不会将癌症再引入患者中。
实验将确定针对生殖系干细胞的阳性或阴性选择的可行性、当肿瘤可被再移植进小鼠模型时的阈值和疾病特异性表面标记物表达拓扑结构。
3.精原干细胞效能检验
为了得到关于不同的生殖系干细胞群在白消安-处理的睾丸中恢复生育力的能力的结论，需要效能检验。每个群体与阴性对照进行比较以确定效力增加。这还使得就共移植的细胞类型，例如莱迪希细胞，塞尔托利细胞或肌样细胞的必要性得出结论。增加生殖系干细胞的量应产生移植细胞的较高效力和生育力的恢复。为了能够明确地从受者中识别供体细胞，生殖系干细胞分离自转基因GFP小鼠(NAGY，Jackson Labs)睾丸。为模仿青春期之前人类患者，7-10天之间的青少年雄性小鼠用于生殖系干细胞的收集。
表8
Figure BPA00001577241000621
移植效力分析。精子生成的一个活性轮次在小鼠中持续大约35天，因此除了2个之外所有的移植小鼠在移植后4周被处死。睾丸被切下来并称重，作为活性精子生成的表示。接着将睾丸消化为单细胞悬液并通过流式细胞计量术检测GFP的表达。这允许确定源于供体干细胞的GFP+细胞的数目。还针对相同的标记物通过流式细胞计量术评定睾丸以就源自供体和内源性受者的生殖系干细胞存在的量得出结论。
生育力恢复的检测。两个剩余的小鼠用于在移植后交配8周。每只雄性与两只雌性裸小鼠交配。对产生的后代针对它们的GFP表达或皮毛颜色进行检验，以表明源于什么株系。对来自每一移植小鼠的后代就最终的异常进行观察。表9中描述了结果。
实施例16
区分并测试小鼠卵巢培养的生殖细胞的功能
卵巢组织移植(OTT)就生育力保存和卵泡繁殖而言是越来越流行的策略。范围包括在不一致的过早卵巢衰退(POF)的双胞胎中的OTT和使用来自匹配的供体在患有卵巢发育不全的女性中恢复卵巢功能(OF)，即异源性移植。另一被提议的指征是另外在健康女性中延长繁殖寿命。针对收获的卵巢组织提议的潜在用途有：原始卵泡的体内/体外成熟、卵巢组织的异种移植，或使用随后使生殖细胞分化同时使用血浆凝块并将生殖细胞与卵巢组织移植用于使卵母细胞成熟和发育的新颖方法。
通过将小鼠OG2生殖细胞与在血浆凝块中的卵巢组织细胞一起移植到有功能的卵巢上，或通过使其它们发育移植进入在裸小鼠背部的皮下间隙开发一种方法，使雌性小鼠OG2生殖细胞分化成卵泡和/或卵母细胞。本实验的目标是确定血浆凝块是否作为移植培养基起作用以使生殖细胞分化为未成熟或成熟卵母细胞同时将它们与功能性卵巢共培养。为测试早期阶段的卵泡发育，4个细胞-凝块被移植进裸小鼠背部的皮下间隙，28天中每7天一次去除一块凝块并通过组织学检查针对卵泡和卵母细胞检查凝块。为了测试共移植进宿主卵巢中的分化的移植细胞的功能性，将小鼠天然交配，以查看是否有已分化的、可受精的并能从移植细胞产生活的幼兽的任何功能性卵母细胞。
Figure BPA00001577241000641
为了测试哪种凝块方法对分化和繁殖而言是最成功的，使用了在卵巢囊和皮下间隙中共移植至宿主卵巢的四个凝块条件：1)在MEF上培养OG2雌性GS细胞(0天)；2)来自培养的OG2雌性GS细胞的早期EB(2天大)；3)来自培养的OG2雌性GS细胞的EB(6天大)的晚期卵母细胞样细胞；4)来自4-6天大的FVB GFP小鼠的新鲜分离的卵巢细胞卵泡(用作阳性对照)。
方法
生殖细胞胚状体形成：OG2雌性集落培养物的6-孔平板在～80％汇合下获得(集落与彼此具有最小接触)。将培养基吸出并用PBS洗涤孔一次，将700μL温暖的胰胰蛋白酶添加至每个孔。接着将平板放置在37℃孵育器中4min。将6-孔平板的每一孔研磨以将MEF层的OG2雌性细胞洗涤下来并接着将MEF层尽可能破碎。每个孔研磨后，所有的孔被微量移液进含有等体积(4.2mL)的PM1TM+15％FBS+GFs的50mL圆锥管中。1mL的PM-1+15％FBS+GFs用来洗涤6孔平板的前三个孔并与来自先前步骤的细胞组合，对6孔平板的后三个孔重复该步骤。接着讲细胞在400xg下旋转5min并用真空吸引将上清液吸出，然后200μL的吸管用来吸出剩余的上清液。将细胞在没有β-巯基乙醇没有GFs的8mL的PM-1+15％FBS中再悬浮。2mL的该细胞悬液吸进6-孔非粘连平板的4个孔的每一个中并将平板放置在37℃孵育器中2-9天，每两天换一次用50％培养基更换。通过吸1000μL的孔中的培养基来更换培养基。
支持卵巢组织的消化。将4-8天大的LacZ/Oct4 GPF OG2小鼠的卵巢分离并用细解剖剪切成两份。切成两份的卵巢被转移至含有5％FCS和胶原酶(1.5mg/ml)的2ml的HEPES-缓冲的DMEM中。消化溶液中的卵巢在37℃水浴中孵育30min，每10min轻柔的吸。30min后，添加含有5％FCS的12ml的HEPES-缓冲的DMEM来停止卵巢和消化混合物的消化。细胞在80xG下4℃下旋转10min。去除上清液并通过离心洗涤细胞两次。
制备具有生殖细胞的卵巢支持细胞混合物用于分化。将来自一个卵巢的消化的细胞用作针对每个条件的生殖细胞的支持细胞。将来自每个条件的100K的GS细胞添加至一个完全消化的OG2/LacZ卵巢细胞球团。对于来自GS细胞(6天)仅晚期的EB，而不是使用100K的GS细胞，手工挑选100个卵母细胞-样细胞(40-70μm)并添加至完全消化的OG2/LacZ卵巢细胞球团。轻柔的敲打将细胞混合物完全混合物。细胞在80xG下在4℃下旋转10min，然后去除所有的上清液。
制造血浆凝块。在80xG下将制备的细胞混合物旋转5min。小心地去除上清液并添加20μl静脉血浆。通过轻柔的敲打旋起细胞和血浆来将细胞再悬浮。去除20μl的血浆和细胞并在6cm的平皿上制造滴液并将0.5μl的1M CaCl2添加至血浆滴。将平皿盖上盖子并将血浆滴和细胞放进37℃孵育器中。孵育30min以允许凝块形成。孵育30min后，凝块变硬至胶样粘稠并准备移植进紧靠卵巢的卵巢囊。
将有生殖细胞静脉凝块移植进卵巢囊。用0.5ml的阿佛丁麻醉6-8周的裸小鼠。用70％乙醇擦拭受者小鼠的背部并接着用在最末肋骨的水平面处接近中间线用细解剖剪在皮肤中做两个单个的小纵向切口(小于1cm)(一个切口在中间线的右侧和另一个在中间线的左侧)。向左侧或右侧滑动皮肤直到切口越过卵巢(橙色-粉色)或脂肪垫(白色)，这二者通过体壁是可见的。接着用镊子拿起体壁并用镊子刚好越过卵巢做一个小的切口(远离较大的血管)。使用钝的镊子，拿起脂肪垫，并将与脂肪垫相连的左侧卵巢，输卵管和子宫拉出来。在脂肪垫上滑动弹簧夹并将脂肪垫在背部上面放下使得卵巢，输卵管和子宫留在体壁的外部。轻轻地拿起小鼠并将其头朝左放在体视显微镜的平台上。小心地找卵巢并用细解剖剪做一个进入卵巢囊中的很小的切口(2mm)。拿起先前制得的有细胞的血浆凝块并小心地将凝块插进卵巢囊的很小的切口中。用镊子轻轻地将凝块放进卵巢囊切口部位。打开弹簧夹并从体视显微镜的平台上去除小鼠。用镊子拿起脂肪垫并将卵巢，输卵管和子宫放回体壁内部。用一根或两根缝线(任选的)缝合体壁并用创伤夹封闭皮肤。在小鼠的对侧(右侧)重复。随后一天检查移植小鼠的总体健康。移植后7去除创伤夹。
将具有生殖细胞的静脉凝块移植进小鼠背部的皮下间隙。当小鼠仍处于来自卵巢囊中的移植的麻醉下时，使用剪子从两个原始切口部位的皮肤中分开肌肉。针对每个切口部位将两个凝块(每只小鼠总共4个凝块)插进皮下间隙。将一个凝块插进切口部位的右侧和另一个凝块插进切口部位的左侧。就其他两个凝块而言对第二个切口部位重复程序。28天中通过外科切除将一个皮下插入的凝块每7天去除一次。去除的凝块在5ml的4％低聚甲醛中固定，在OTC中包埋，以8μm冷冻切片并用苏木色精和曙红染色以通过形态学定位(shoe)卵泡的分化和繁殖正在形成。必要的话用卵母细胞特异性抗体进行载玻片染色。
移植裸小鼠的交配。检查手术后21天的移植裸小鼠并接着每日确定小鼠是否在发情中。将阴道口(introitu)闭合作为雌激素缺乏的指示和再打开作为雌激素卵泡已在移植中出现的信号。阴道打开后或操作后3周(无论哪个为更早的)，雌性宿主与能生育的雄性配对。针对交配(阴栓)信号每日视察雌性。交配的那些被允许产仔。移植后6-12周，对所有的宿主尸检，检查生殖道状态，并去除从卵巢囊的移植体并在5ml的4％低聚甲醛中固定，在OTC中包埋，以8μm冷冻切片并用苏木色精和曙红染色。
实施例17
对再迁入的来自成年人类睾丸的的精原干细胞的鉴定和表征
精原干细胞(SSC)通过在整个生命期间自我更新和持续的产生精子而维持精子生成。组织学和超结构研究揭示在非灵长类哺乳动物中，As(Asingle)精原细胞被认为是精子生成的干细胞。当A个精原细胞分裂时，子细胞或者迁移远离彼此并变成两个新的干细胞，或通过分子间桥呆在一起并变成A对(Apr)精原细胞。Apr精原细胞进一步发育成4、8或16串A排列(Aal)精原细胞。Aal精原细胞分化成A1精原细胞并且6次有丝分裂后产生A2、A3、A4并最后产生B精原细胞，其在最后一次有丝分裂产生精母细胞。
不像啮齿动物，在人类和其他灵长类经典的细胞核形态学的组织学研究中指示有两类未分化的精原细胞存在于睾丸生精上皮的基底膜上，称为A深色和A浅色精原细胞。对来自因为恶性肿瘤和放射和化学疗法已经经历睾丸摘除的患者的睾丸活组织检查的精原干细胞形态学表征显示人类睾丸的干细胞很可能是A浅色精原细胞，最近在成年猕猴睾丸中的研究也显示A深色精原细胞代表储备干细胞群，其很少分裂并在细胞毒性损伤后被活化，而A浅色精原细胞是活跃的干细胞，其在正常环境下进行常规的自我更新分裂以维持精子生成。这指示两种人类和灵长类精子生成具有类似的个体发生，因此这两个物种之间SSC亚群的特征可能类似。
一般而言，由于无法利用特异性标记物，成年人类睾丸中SSC的表型和分子特征不易理解。使用猕猴，表征并分离来自成年灵长类睾丸的富集的SSC群体。使用在灵长类SSC的表面上发现的选择的标记物，研究在成年人类睾丸中SSC不同群体的身份。另外，人类SSC的富集群体被移植进入受者小鼠睾丸并且研究受者小鼠睾丸中的再迁入的人类精原干细胞的身份。
材料和方法
组织制备和细胞分离。不含肿瘤污染的睾丸组织获得自经历睾丸切除术的患者并被两个患者慷慨地捐献。睾丸活组织检查获得自经历TESE(睾丸活组织检查和睾丸精子提取)程序的患者。在组织收集之前所有患者已经在知情同意书上签名了。抽取一小部分组织并用于该研究。外科去除睾丸组织和活组织检查，放置在补充青霉素/链霉素的PBS中并在尽量小于2小时内转移到冰上过夜。睾丸组织样品进行组织学和分子生物学分析。剩余组织的生精小管被精细切碎并用胶原酶A(1mg/mL)和DNase(10U/mL)在往复的37℃水浴中消化15分钟。胶原酶消化后，使未消化的组织沉淀并去除在悬液中的细胞。将未消化的组织在酶混合物中于往复的37℃水浴中进一步消化20分钟，所述酶混合物由DMEM中1.5mg/mL胶原酶A、1.5mg/mL V型透明质酸酶(Sigma)、0.5mg/mL胰蛋白酶和10U/mLDNAse组成。使剩余未消化的组织染色后，分离的细胞在400g下离心10分钟。细胞球团在MEM+HEPES+5％FBS中再悬浮并放置在5％CO2潮湿的孵育器的覆盖15cm皿的组织培养物中直到分析。睾丸活组织检查样品仅在酶混合物中消化并由于其小的尺寸通常仅仅用于一个目的。
流式细胞计量术和磁性分选。为了细胞表面表征和分选，细胞用所选择的用于灵长类SSC表征的干细胞标记物，包括CD90-FITC，CD49f-PE和CD117-APC和SSEA-4染色(表10)。细胞在MEM+HEPES+5％FBS(完全培养基)中在冰上染色30分钟，洗涤一次，并再悬浮于完全培养基中并保持在冰上直到流式分析。流式分析在InFlux细胞分选仪中完成。用488nm 200mW的激光激发荧光素(FITC)和藻红蛋白(PE)并分别用530/40和580/30带通滤波器收集发射。用638nm 25mW的激光激发别藻蓝蛋白(APC)并用670/40带通滤波器收集发射。对于磁性分选，细胞(达200x106)再悬浮在DMEM+10％FBS中并且添加SSEA-4-生物素(1∶200)并在冰上孵育1小时。制备包含PBS、BSA(0.5％)和2mM EDTA的标签缓冲液并脱气10分钟。标签缓冲液添加至SSEA-4染色的细胞中并在400g下离心10分钟。SSEA-4细胞再悬浮在1.8mL的缓冲液中并添加200μL的抗生蛋白链菌素微珠。也添加100μL的SSEA-4-FITC缀合抗体以能够检查通过流式细胞计量术磁性分开的细胞的纯度。并在4℃下孵育20分钟。添加10mL的缓冲液到管中，在400g下离心7分钟。
组织学和免疫组织化学染色。组织在4％低聚甲醛(PFA)中固定过夜并转移至20％的蔗糖中过夜平衡。将组织冷冻在OCT化合物中并且制备8μm厚度的冷冻切片并在-80℃下保存。对于组织学，在PBS中洗涤切片并用Mayer苏木精染色5分钟，用蒸馏水洗涤5分钟并用含水包埋剂包埋。接着使用明视野显微镜分析切片。对于免疫组织化学染色，使用0.1％Triton-X/2％BSA/5％绵羊血清封闭睾丸切片并可渗透化处理。接着用如在表10中所述的对生殖细胞和SSC特异性的抗体染色载玻片。DAPI用于细胞核可视化。在蒸馏水中多次洗涤之后，使用含水荧光防腐剂保存细胞。使用Olympus BX-61显微镜用SlideBookTM图像软件分析载玻片。对于定量研究，每个载玻片计数大约25个生精小管横向切片并且将来自4个载玻片的数据收集在一起并用于该研究。
RNA提取和实时PCR分析。根据制造商的推荐使用RNeasy Mini Kit(Qiagen Inc.)分离总的细胞RNA。分离的RNA接着使用Quantitect RT kit(Qiagen)转录成cDNA并且稍后用QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。对于每个RT-PCR反应，HotStar Taq Plus(Qiagen)和各自引物(表11)的25μL反应体积使用20ng的cDNA模板。所有靶标被扩增30个循环。通过在2％琼脂糖凝胶上的大小确认扩增产物。对于QRT-PCR，具有Quantitect Sybr Green PCR主要混合物(Qiagen)的25μL反应体积使用5ng的cDNA模板并在BioRad iCycler上运行。每个样品测定三次并相对于GAPDH对照标准化。
表10
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表11
Figure BPA00001577241000711
端粒酶测定。SYBR Green实时定量端粒重复扩增方案(RQ-TRAP)是从Wege等人的方案(Wege H，Chui MS，Le HT，Tran JM，Zern MA(2003)SYBR Green real-time telomeric repeat amplification protocol for therapid quantification of telomerase activity.Nucl.Acids Res.31，e3.)修改而来。组织或细胞球团在PBS中洗涤一次并在制备的以1,000细胞/μl的体积包含1x Chaps裂解缓冲液和400U/ml RNaseOut抑制剂的裂解缓冲液中再悬浮和匀化。在冰上孵育25分钟后，在4℃下以最大速度离心细胞裂解物10分钟。接着上清液转移至新的微量离心管并在A280nm下用ND-1000分光光度计测定蛋白质的浓度。反应在包含500ng蛋白溶解产物、QuantitectSYBR Green PCR混合物(Qiagen)、1μg TS引物、0.5μg ACX引物和不含核酸酶的水的25μl体积中进行。对于每个反应板试验，每个样品与非模板对照(裂解缓冲液)、阳性对照(ESC细胞)和从人类ESC蛋白质溶解产物制备的标准曲线(1000ng，200ng，40ng，8ng，1.6ng)一起测量三次。使用iCycler iQ5(Bio-Rad)，反应在25℃下孵育20分钟，在95℃下孵育15分钟，并在95℃下30秒和60℃下90秒扩增40个PCR循环。阈值循环值(Ct)从半对数扩增图(荧光相对于循环数量成对数增加)中确定并与标准曲线比较。软件对于阈值的默认设置是10乘以每孔前10次循环(不包括循环1)的荧光读数的平均标准差。端粒酶活性表示为相对于人类ESC的百分数。
精原干细胞移植。精原干细胞移植技术通过在受者小鼠睾丸中建群用来测试细胞群的功能性。用单独腹膜内白消安注射(40mg/kg)处理8周大的免疫缺陷无胸腺裸-Foxn1nu雄性小鼠(Harlan)并用作受者。白消安处理1个月后，0.3-0.8x106SSEA-4+磁性分选的成年人类睾丸细胞经睾丸网注射被移植进入生精小管。移植4周后，处死小鼠并将睾丸固定在4％PFA的中并制备冷冻切片。使用人类核蛋白抗体结合其他干细胞或生殖细胞标记物确认小鼠睾丸中人类精原干细胞的身份。所有动物试验按照国家研究委员会(National Research Council)的实验室动物护理和使用指南(Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals)进行。
统计分析。除非另外指出，所有的实验重复3次。2个样本学生T检验和ANOVA检验用于统计分析并且P＜0.05认为是显著的。
结果
分离和富集精原干细胞。从收集自梗塞性无精子男子的睾丸活组织检查分离的细胞显示与正常人类睾丸类似的生精细胞形态学和分布，其表明在这些患者中正在进行精子生成。平均从每个样品分离具有87％活力的0.5x106个细胞。作为具有大的细胞核与细胞质比、1-3核仁和细胞质内含物的圆形细胞，精原干细胞在其他细胞之间在形态学上是可检测的(图39)。为了富集精原干细胞，使用流式细胞计量术对从成年人类睾丸组织解离的细胞分析各种细胞表面标记物。用各种干细胞标记物染色的成年人类睾丸细胞的表达谱呈现在图43中。在用于表征SSC的表面标记物中，已经显示表达在成年猕猴睾丸中的SSC上的SSEA-4在人类睾丸中大量表达。检测分离自睾丸活组织检查和捐赠的组织二者中的人类睾丸细胞并且发现13.3±1.4％的细胞在其表面表达SSEA-4。已经在啮齿类和灵长类睾丸中描述的另一亚组的SSC标记物是CD49f(α6-整联蛋白)、CD90(Thy-1)、CD117(c-Kit)，以及CD49f+/CD90+/CD117组合-(三重染色)。在成年人类睾丸中，25±2.5％的细胞表达CD49f并且13±5％的是CD90+。有趣的是，与猴睾丸相反，在人类睾丸中没有三重染色的细胞群体。(图39E-H)
睾丸切片的组织学和免疫组织化学染色。组织学检查揭示当与捐赠的组织在苏木精-伊红染色后比较时，睾丸活组织检查具有类似的形态学(图39A-B)。对人类睾丸组织进行免疫组织化学检查以更好地理解人类SSC的分布和标记物表达。SSEA-4和CD49f(也称作α6-整联蛋白)在成年人类睾丸中具有有趣的染色模式，其与在猴睾丸中之前观察到的非常类似(图40)。根据组织学量化，几乎所有的靠近生精小管基底膜的生殖细胞表达都CD49f(每个生精小管横向切片28.7±1.2)，其是已经在啮齿类动物和猴SSC以及其他专能干细胞的表面出现的标记物。而且，许多沿着生精小管的基底膜的细胞表达SSEA-4(每个生精小管横向切片18±1)，其是在人类胚胎干细胞(ES)和胚胎生殖(EG)细胞以及成年猕猴SSC中出现的多能标记物。有趣的是，大部分(88.3％)的SSEA-4+细胞与CD49f共定位。在成年人类睾丸中没有出现对CD90的特异性反应。出人意料地，发现大部分生殖细胞位于c-Kit，其是干细胞因子的受体和生殖细胞分化的早期标记物，在细胞核中而非在其表面。大约75％的SSEA-4+细胞与c-Kit共定位，提示在成年人类睾丸中存在SSC的两个不同群体的可能性。而且，CD49f和c-Kit的共定位显示大部分(73.6％)的CD49f+细胞在生精小管基底膜处共表达c-Kit，这与SSEA-4的非常相似。所有的SSEA-4+细胞对于生殖细胞标记物VASA也是阳性的，而仅仅50％的CD-49f+细胞显示VASA染色，表明CD-49f也在睾丸体细胞的表面表达。与此相反，黄体生成素受体(LHR)不在生精小管中的VASA+细胞上表达，但好像染色人类睾丸中的塞尔托利和莱迪希细胞，表明LHR仅仅在体细胞中表达而不在成年人类睾丸的生殖细胞上表达(图44)。在人类睾丸的基底膜处有清晰的表达Oct-4的细胞群体，表明在人类SSC中存在具有多能特征的细胞群体。
实时PCR和端粒酶测定。对SSEA-4+和SSEA-4-细胞进行基因表达分析以检测精原细胞干细胞的特异性表达。在SSEA-4+群体中，包括c-Kit、GFRα-1、PLZF、c-RET和GPR-125的所有基因表达至少3倍并达到超过7倍(图41A)。引人注目地，SSEA-4+细胞显示对于FGFR-3非常高的(24倍)表达水平(数据未显示)，表明FGFR-3和其配体FGF9可能参与人类SSC增殖和自我更新。而且在SSEA-4分选的细胞中更高表达水平的h-TERT表明它们高水平的端粒酶活性和其再迁入能力。比较SSEA-4阳性分选的细胞与来自睾丸的未分选的细胞以及人类胚胎干细胞(hESCs)的端粒酶活性(图41B)。与hESCs(100％)相比，未分选的细胞显示平均10.4％±10.32％的端粒酶活性，而与未分选的细胞54.6％(+/-7.8％)相比，SSEA-4+细胞具有大于约5倍的表达，其也小于hESC端粒酶表达大约2倍。这支持上调的h-TERT表达的发现并提示在SSEA-4阳性细胞中至少延长的复制能力。
精原干细胞移植。在已经移植富集的人类精原干细胞群体的小鼠睾丸上进行共定位研究，以检测其建群效力并阐明在再迁入小鼠睾丸中的人类SSC上表达的标记物。这些标记物的定位的总结呈现在表12中。与对人类核蛋白阳性的细胞的SSEA-4、CD49f和c-Kit一起使用HNP，对于CD49f，28.1％(±3.6％)为阳性，对于c-Kit，94.9％(±1.3％)为阳性，并且对于SSEA-4，14.2％(±3.6％)为阳性。此外，我们观察到100％的SSEA4+细胞对c-Kit也是阳性，进一步指示仅仅SSEA-4+/c-Kit+细胞可整合进入受者小鼠睾丸的可能性并因此是在SSEA-4+群体中自我更新的SSC。用α6-整联蛋白和SSEA-4的共定位研究已经表明95.63％(±1.6％)的SSEA-4+细胞对于α6-整联蛋白也为阳性。考虑这些结果，以及α6-整联蛋白与HNP共定位，两倍于SSEA-4和HNP的事实，α6-整联蛋白阳性细胞的两个群体，即α6-整联蛋白+/SSEA4+和α6-整联蛋白+/SSEA-4-是可再迁入受者睾丸的SSC。应当注意到α6-整联蛋白+细胞仅仅占整合细胞的约1/4，意思是约75％的已经整合的SSC仍将通过流式细胞计量术用表面标记物表征。虽然几乎所有的整合细胞株对于c-Kit为阳性，但是其在大部分细胞中位于细胞核中并且通过流式细胞计量术未发现c-Kit+细胞(图43)。HNP与其他细胞表面标记物的共定位揭示在小鼠睾丸中建群的人类SSC不表达CD-29(β1-整联蛋白)，其是在小鼠SSC表面上表达的标记物(图42)。然而42.8％的HNP细胞与GPR-125共定位，指示该标记物表达在再迁入人类SSC群体的表面上。而且，28.3％的HNP阳性细胞与多能标记物Nanog共定位，表明约1/3的再迁入人类SSC可能具有多能特征。
表12
  标记物   与HNP共定位(％)
  VASA   100
  c-Kit   49.8±2.9
  GPR-125   42.8±2.6
  LH-R   0
  CD49f   28.1±3.6
  CD29   0
  SSEA-4   14.2±3.6
  Nanog   28.3±1.5
  Oct-4   未检测出
  Tra-1-60   0
讨论
本研究清楚地显示成年人类睾丸中的精原干细胞具有不同于小鼠且与灵长类SSC类似但不相同的表型和分子特征。第一，研究了在人类睾丸切片和分离的细胞中所选择的标记物的定位和表达。免疫组织化学研究表明在测试的标记物中，SSEA-4尤其表达在人类SSC表面上。所有的SSEA-4细胞位于生精小管的基底膜上并与生殖细胞标记物VASA共定位。这与之前在成年灵长类睾丸中的观察非常类似。然而在成年人类睾丸中SSEA-4+细胞的百分数在人类(13％)中比猴(2％)睾丸更高。分子生物学分析也揭示SSEA-4分选的细胞对所有SSC特异性基因具有更高的表达水平和高水平的端粒酶活性，表明在该群体中存在精原干细胞。之前的研究显示从小鼠和成年灵长类睾丸分离的SSC表达CD49f和CD90和对于CD117为阴性。已经报道了在分离的人类睾丸细胞中CD49f和CD90的表达。该免疫组织化学研究揭示在人类睾丸中的CD49f沿着生精小管的基底膜定位，提示该标记物表达在SSC以及分化型A精原细胞二者中。而且，在生精小管外一些CD49f阳性细胞的表达指示CD49f，虽然表达在人类SSC中，但不是特异性标记物并不能单独用于富集来自人类睾丸的SSC。流式细胞计量术分析确认免疫组织化学染色并显示在对CD49f或CD90阳性染色的成年人类睾丸中具有不同群体的细胞，然而与灵长类相反，在人类睾丸中不存在双阳性细胞群体。与SSEA-4类似，与猴睾丸相比成年人类睾丸中CD49f+和CD90+细胞的百分数也更高。
尽管流式细胞计量术分析揭示在中成年人类睾丸中有非常少的CD117+细胞，但是免疫组织化学染色显示在c-Kit在生精小管的基底膜的许多细胞中定位以及在人类睾丸细胞腔室中的细胞中定位。由其他研究人员已经报道了在人类睾丸中c-Kit蛋白类似的定位模式。最近显示在未分化的精原细胞中c-Kit表达是阶段特异性的，指示该蛋白参与人类精子生成的早期阶段。C-Kit是酪氨酸激酶膜蛋白，其被表达在造血干细胞和祖细胞中并表达在包括性腺的许多非造血组织中。有大量的证据显示在生殖细胞发育期间c-Kit和其配体干细胞因子(SCF)参与各种功能，包括迁移和定居(建群)、增殖和分化。成年人类睾丸中的细胞在它们的细胞核中而不在其膜上表达c-Kit蛋白。c-Kit的细胞核定位可能解释为什么这些细胞不能通过流式细胞计量术被检测。虽然c-Kit一般是膜蛋白，但是已经报道了其细胞质和细胞核定位。SSEA-4与c-Kit的双定位显示在成年人类睾丸中有两个SSEA-4+细胞群体，一个具有c-Kit表达而另一个没有c-Kit表达。基于在在小鼠中的研究，SSC显示为c-Kit阴性。
在成年灵长类中，SSEA-4+细胞是能够再迁入受者小鼠睾丸的精原干细胞的活跃分裂群体。通过SSEA-4磁性分选纯化人类SSC并且SSEA-4+细胞被移植进入白消安处理的受者小鼠睾丸的睾丸。移植后，SSEA-4+细胞出现在大部分小鼠生精小管的基底膜上，其指示在该群体中存在有功能的SSC。令人惊讶地，所有的人类细胞建群受者睾丸是c-Kit+，指示仅仅c-Kit+部分的SSEA-4分选的细胞能够建群受者睾丸并因此在人类睾丸中是活性的SSC。RT-PCR分析也揭示SSEA-4分选的细胞具有非常高表达水平的c-Kit和FGFR3。在人类SSC中c-Kit的表达可能指示该受体和其配体SCF参与人类SSC的定居和/或再迁入。有大量的证据表明c-Kit和SCF是生殖细胞迁移黏附和增殖的主要调节子。而且，在人类SSC中高表达的FGFR3可能指示其配体参与人类SSC的增殖和自我更新。成纤维细胞生长因子(FGF)和其受体(FGFR)是用于早期胚胎和生殖细胞发育的主要信号分子。已经显示FGF促进小鼠和人类SSC的存活和维持。体外研究显示FGF9对于FGFR3是非常强有力的配体。因此，添加FGF9和SCF至人类SSC的培养基可能对于它们的体外存活和增殖有益。
而且，小鼠睾丸中整合的人类细胞亚群在其表面表达GPR-125，指示该标记物也在正在再迁入的人类SSC上表达。已经报道了在小鼠中和人类睾丸切片中GPR-125的表达。小鼠睾丸中正在再迁入的人类SSC对于多能标记物Nanog被阳性染色。多能标记物Nanog和SSEA-4在一些SSC中的表达指示在成年人类睾丸中SSC亚群体可能具有专能能力以分化成其他细胞谱系。来自小鼠和人类睾丸的专能细胞系的产生支持人类SSC的专能性，提示这些细胞对于再生性疾病而非生育力恢复的临床应用。另一方面，在人类睾丸中Nanog的免疫定位不仅限于未分化的SSC，而是也定位于所有的生殖细胞中，甚至在生精小管的管腔中。该观察与成年灵长类睾丸的非常相似，提示转录因子Nanog在高级生殖细胞中的不同作用。对于Nanog这种作用的性质仍待确定，然而已经报道多能标记物Oct-4是生殖细胞的存活因子并且其下调将导致凋亡和细胞死亡而不是分化。
移植研究也表明人类和小鼠生精小管对于精原细胞干细胞定居的小生境兼容性。有趣的是，SSEA-4+(14％)细胞和CD49f+(28％)细胞在受者小鼠睾丸中的百分数与在人类睾丸中的(对于SSEA-4为13％且对于CD49f为27％)非常相似，指示人类SSC具有以与其自然环境非常相似的水平建群和再迁入空小鼠睾丸的能力，提示小鼠睾丸已经提供了对于人类SSCS定居非常合适的环境。然而，在该研究中和在之前使用牛、猪、灵长类或人类SSC的研究中都未出现除了受限的精原细胞增殖之外的任何发育。虽然小鼠睾丸不能提供合适的环境以支持来自高级物种的完全的精子发生，但是其生精小管的基底膜具有以人类睾丸非常类似的方式选择性攻击并容纳人类精原干细胞的能力。
总的来说，在成年人类睾丸中的再迁入精原干细胞具有SSEA-4+、CD49f+、CD90+、GPR-125+和c-Kit+的表型特征。约1/3的SSC表达Nanog，指示在成年人类睾丸中存在具有多能特征的精原干细胞群体。该结果对于分离和纯化来自成年人类睾丸的精原干细胞用于临床应用、培养扩展或分化目的具有直接的推论。另外，多能标记物在人类SSC亚群中的表达指示这些细胞的潜能应用用于细胞补充治疗和组织再生。
实施例18
人类雄性生殖系组织和细胞的收集、处理、冷冻保存和储存
基于参与的主要研究者的建议，在研究中对研究受试者登记。一旦确定了受试者符合研究标准，受试者完成知情(并在未成年的情况下同意)过程。受试者已被手术去除部分性腺组织并且该组织在特别的条件下被运送至处理设施。保存少部分组织用于组织化学分析。处理设施使用化学和酶方法从组织中分离细胞。针对活力、细胞表面标记物和微生物污染对少部分细胞进行检验。剩余的细胞被低温冷冻并存储在液氮气相中。
在不同的条件下收集睾丸组织。首先，手术期间，为了医治隐睾症或扭转，重约1克的一小片的睾丸组织在无菌条件下被去除。对于睾丸癌患者，手术期间去除较大片的睾丸组织以去除癌生长。对于需要干细胞移植的癌患者、地中海贫血或镰状细胞性贫血患者或患有其他非恶性血液适应症的患者，进行手术以去除部分睾丸组织。
手术。在阴囊操作期间，为了医治隐睾症、睾丸扭转或精索静脉曲张，使用15-刀片解剖刀，在睾丸的白膜的前表面上做一个小的切口，约1-2mm长。睾丸被手工压缩(挤压)以导致生精小管组织溢出。获得挤出的组织，放在管中并通过运输业者在提供的控温箱中被送回至处理设施。然后用可吸收缝线材料将白膜中的小切口闭合以缝合(reapproximate)白膜并提供止血(控制来自切口的任何出血)。带入手术室的患者的初次程序紧跟着正常的计划。对于患有原发性恶性肿瘤的通过化学疗法或放射疗而致使不育的患者，基于父母偏好，进行了通过核芯针活组织检查技术对睾丸组织的经皮收获或类似于患者经历其他程序的上述程序的开放式提取。
术后追访：手术后追访患者，他们的程序后10-14天一次、6个月时一次、12个月时一次，在恢复室中观察并发症的体征，接着在研究中的登记期间每一年一次。患者/家庭选择停止登记的情况下，追访将基于针对追访的正常临床指征。在每个周年，当他们继续登记或直到他们愿意舒适地进行他们自身的身体检查时，针对正在进行的睾丸生长/无萎缩评价患者。在每一次探视时，指导父母和患者进行睾丸自我检查。当他们决定希望继续生育时，患者将被指示重新跟踪调查并在此时间咨询。在手术后第一次时在恢复室中评定血肿(出血)的早期术后并发症。在六个月的探视时进行阴囊超声，以评定睾丸循环和尺寸。
装运至处理实验室。通过代理人挑选组织并运输至处理设施。组织被放在能保持温度从2℃至8℃48小时的预先检查合格的集装箱内。组织通过个人车辆运输并且一旦到处理中心其被立即处理。
组织处理。在ISO7级超净室环境内的II级2A型生物安全柜中进行组织处理。进行组织处理的必要的所有材料在处理前放在生物安全柜内并且如果需要的话将任何额外的物品灭菌。助理帮助操作员并且确保材料进出生物安全柜的合适的通道。穿无菌手术服的操作员将不会接触生物安全柜外面的任何东西或之前未被灭菌的任何东西。首先，去除一小片组织被用于形态学分析并且将剩余的组织在生物安全柜内部的称上称量。剩下的程序像这样进行：用滴管吸取25mL的无菌PBS+EDTA加入四个50mL圆锥管中的每一个。使用无菌镊子，将睾丸组织放进有PBS+EDTA的管中并浸没5秒钟。从第一个管中去除组织片并对第二、第三和第四个管重复进行。在PBS+EDTA中洗涤后，将组织放在空的无菌50mL管中。用滴管吸取2mL的PBS+EDTA加入有组织的管中。用无菌手术剪，切碎组织一旦睾丸组织被切碎，用PBS+EDTA使体积升至10mL。用滴管吸取10mL的2X胶原酶/DNA酶并用石蜡膜紧紧密封。在干燥的孵育器中将管孵育20min并当完成时在400x g下离心1分钟。去除石蜡膜并去除液体，当心不要搅动在管底部的未消化的睾丸组织。用PBS+EDTA使体积升至10mL。添加10mL的2x酶溶液。盖紧盖子并用石蜡膜密封。将管放在摇动的干燥孵育器中并孵育25min。当结束时，去除石蜡膜并添加2.2mL的血清替代品并彻底混合。将混合物通过100μM的过滤器并进入一个新的50mL管中。在室温下在400xg下离心10分钟。吸出上清液并添加10mL的MEM+10％，以产生均匀细胞悬液。分离的细胞现已准备好可以进行细胞计数和活力测定检验，流动检验和冷冻保存。
效能、身份、纯度和稳定性检验(冷冻前和解冻后)。对分离的细胞计数。该数据应该与应从标准组织处理获得每重量的组织的已知量的细胞(细胞/g)相关。如果其不相关，则表明了组织的问题或来自方案的偏差。在冷冻制备中，接着将细胞调至合适的浓度，每ml的冷冻培养基3-5×106个细胞。
测试分离的细胞，以测定可存活的细胞的百分比。这将用两种类型的活力测定在计数过程期间进行：台盼蓝染色排除活力检验和7AAD流式细胞计量检验：
对于7AAD流式细胞计量检验，制备细胞用于用单克隆的/多克隆的抗体的单种颜色染色或多种颜色染色。需要时，完成第二抗体染色。最后的洗涤步骤之后，再悬浮1ml缓冲液细胞(一千万个细胞)，用于分析。将7-AAD原液添加到每个管至终浓度(1μg)并孵育10分钟。避光在4℃下保持该溶液直到在流式细胞仪上分析。仅在咨询医疗主任后，具有＜20％活力的样品将被低温冷冻。
在用于形态学分析的相差显微镜下评定细胞，以测定细胞的健康、品质、尺寸和一般外观。还分析了组织消化为单个细胞的效率和存在的细胞簇。在相差下，健康的细胞保持明亮的圆的结构并且不会看起来是暗的或碎片状的。关于胞内结构的更详细的信息，包括细胞核和细胞质，可用Hoffmann或Normarski显微镜获得。在这些显微镜下，生殖系细胞看起来是圆的，具有大的核质比率，1-3核仁和细胞质内含物。塞尔托利细胞大并且形状不规则，而莱迪希细胞在它们的细胞质中具有大量的脂滴，所述脂滴看起来像是小的囊泡泡。
流式细胞计量的标记物：精子：X-染色体大于Y-染色体。将荧光DNA染料(Hoechst 33342)应用至精子并孵育20分钟。基于它们的相对亮度，流式细胞仪将它们分开；XX比XY更亮。
生殖系细胞：人类和灵长类SSEA4、CD49f、CD114、CD90、GFR-α、大鼠和小鼠CD49f、SSEA1、GFR-α。
莱迪希细胞：这些细胞缺少特异性标记物，但是我们已经使用的一个是黄体生成素受体(LHR)。
染色方案：以每ml染色培养基5-10x106个细胞的浓度悬浮细胞。用FBS和/或针对Fc受体的特异性抗体进行封闭。添加第一抗体至1μg每百万细胞。在黑暗中在冰上孵育30min。洗涤。添加第二抗体至终浓度为0.5μg每百万细胞(如果需要的话)。在黑暗中在冰上孵育30min。洗涤。悬浮至浓度为5-10x106细胞每ml的染色培养基。保持在黑暗中在冰上直到分析。
免疫组织化学标记物：生殖系细胞免疫组织化学标记物包括但不限于VASA。石蜡切片或冷冻切片染色精原生殖系细胞标记物的其他IHC标记物是SSEA-4、CD49f且生殖细胞标记物是VASA，c-Kit，GFR-α和PLZF。这些标记物用在评定存在不同类型的生殖系细胞和它们恢复生育力的潜能的检验中。
冷冻组织切片的荧光染色方案。使用超级免疫组化笔在组织切片的周围画一条整齐的界限。用PBS洗涤组织切片两次以去除OCT。使用在PBS中的5％山羊或绵羊血清+1％BSA+0.1％Triton-X在室温下封闭1hr(封闭溶液应在3天内制得并在4℃下存储)。没有Triton-X的相同的封闭溶液可被用于表面标记物。在1％BSA中的第一抗体中在4℃下孵育过夜。用PBS洗涤切片5min 3次。在1％BSA中的第二抗体中在室温下孵育1hr。去除第二抗体。用核染剂染色[Hoechst(1∶5000)，DAPI(1∶5000)，ToPro-3(1∶200)]。用PBS洗涤切片5min 3次。
分子生物学标记物。生殖系细胞分子标记物包括但不限于VASA。RT-PCR、实时PCR或多重PCR的其他基因表达标记物：精原生殖系细胞标记物(SSEA-4，CD49f)和生殖细胞标记物(VASA，c-Kit，GFR-α和PLZF)。这些标记物用在评定存在不同的类型生殖系细胞和它们恢复生育力的潜能的检验中。
HLA A/B/DR分型&ABO/Rh分型。进行ABO/Rh分型以证实患者身份。使用基于DNA的方法进行HLA分型以证实患者身份。收集的血液的一个管被送到ASHI-批准的实验室用于HLA分型。类似地，收集的血液的一个管被送到CLIA-批准的实验室用于ABO/Rh分型。根据方案，所述管发自处理设施。
如下将进行传染病测试以确保安全：血清学：HIV-1/2、HTLV-I/II、HCV、HBsAg、HBc、Syphilis、CMV、Chagas疾病；NAT：HIV、HCV和WNV。收集的血液的一个管将被送到CLIA-批准的实验室用于传染病测试；真菌、需氧和厌氧菌培养测试、物种形成&抗生素敏感性测试(如果培养是阳性的)；进行微生物培养以确保安全。如果培养是阳性的，进行物种形成和敏感性测试，所以在移植时，可对患者使用适当的抗生素治疗。
冷冻保存。从组织处理中分离的细胞被悬浮在含有临床级冷冻保护剂的专用培养基中，所述冷冻保护剂被设计用于冷冻保存生殖系细胞。接着控制速率的冷冻器被用来以-1℃/分钟从+4℃至-60℃和以-10℃/分钟从-60℃至-90℃缓慢冷冻细胞。接着将细胞放在-150℃和-196℃之间的临时隔离(隔离)存储液氮气相中。
隔离存储。冷冻保存的产物被保存在在-150℃和-196℃之间的临时隔离液氮罐的气相中。万一产物被肿瘤细胞、需氧菌、厌氧菌，或真菌污染，或对HIV-1/2、HTLV-I/II、HCV、HBsAG、HBc或WNV有活性，污染的产物被移至永久隔离液氮罐的气相中。当在临时隔离罐中的所有产物没有污染时，接着临时隔离罐改变状态至永久存储罐。
永久存储。没有微生物污染且对HIV-1/2、HTLV-I/II、HCV、HBsAG、HBc和WNV无活性的产物被存储在在-150℃和-196℃之间的永久存储液氮冷冻器罐的气相中。
发现被肿瘤细胞、需氧菌、厌氧菌、或真菌或对HIV-1/2、HTLV-I/II、HCV、HBsAG、HBc和WNV有活性的产物被临时存储在在-150℃和-196℃之间的永久隔离液氮罐的气相中。针对肝炎和HIV测试对登入名单者研究需要知情同意。任何阳性结果将公开给同意方并将提供关于适当咨询和治疗的治疗安排。
研究分析将包括测定处理和冷冻保存损失的细胞和活力(冷冻前与解冻后比较)；测定产物在冷冻存储中的稳定性(冷冻后在不同的时间点下的解冻后分析)；针对多种适应症测定生育力率；针对手术收集程序测定副反应或并发症的比率；针对解冻后的细胞的活力测定受试者的年龄的影响；测定有效冷冻保存方案对解冻后活力的影响。
方案中断规则。如果有直接由外科收集程序导致的任何死亡或严重副反应，将暂缓试验增加患者并经受通过IRB的评审。只有当IRB认为重新开始试验是合理的，患者增加将继续。
实施例19
人类雌性生殖系组织和细胞的收集、处理，冷冻保存和储存
患者登记：基于医师的建议，在研究中对研究受试者登记。一旦确定了受试者符合研究标准，受试者完成知情(并在未成年的情况下同意)过程。
手术和卵巢组织收集。在不同的条件下收集卵巢组织。手术期间，在无菌条件下重约1-2克的一小片的卵巢皮质组织被去除。对于需要卵巢切除术或卵巢子宫切除术的情况，比如卵巢囊肿患者，在手术期间，一大片的卵巢组织被去除以去除癌生长或整个卵巢，或两个卵巢。对于癌患者、地中海贫血或患有其他非恶性血液适应症的患者，进行随意选择的手术以去除部分卵巢组织或卵巢。
装运至处理实验室。通过代理人挑选组织并运输至处理设施。组织将被放在能保持温度从2℃至8℃48小时的预先检查合格的集装箱内。
组织处理：一旦组织到处理设施，在无菌条件下在ISO7级超净室环境内的II级2A型生物安全柜中化学和酶消化组织。首先，运送培养基被转移至有盖培养皿并在双目显微镜下收集漂浮的卵泡和卵。对于卵巢组织冷冻，卵巢皮质被切成小的薄片并制备用于冷冻保存。为解剖并分离小的卵泡和细胞，卵巢被切成小片和酶消化。接着分离的细胞和卵泡被进一步处理用于冷冻保存。进行组织处理的必要的所有材料在处理前放在生物安全柜内并且如果需要的话将任何额外的物品灭菌。穿无菌手术服的操作员不会接触生物安全柜外面的任何东西或之前未被灭菌的任何东西。助理帮助操作员并且确保材料进出生物安全柜的合适的通道。
效能、身份、纯度和稳定性检验(冷冻前和解后)。将分离的细胞计数。该数据应该与应从标准组织处理获得每重量的组织的已知量的细胞(细胞/g)相关。
稳定性是处理后的卵巢细胞的表征。其包括活力和形态学分析。约小于五十万的细胞被用于测试并且10年中一年一次再次检验样品。
测试分离的细胞，以测定可存活的细胞的百分比。这用两种类型的活力测定在计数过程期间进行：台盼蓝染色排除活力检验(仅在咨询医疗主任后，具有＜50％活力的样品被低温冷冻)和7AAD流式细胞计量检验(仅在咨询医疗主任后，具有＜20％活力的样品被低温冷冻)。
在用于形态学分析的相差显微镜下评定细胞，以测定细胞的健康、品质、尺寸和一般外观。还分析了组织消化为单个细胞的效率和存在的细胞簇。在相差下，健康的细胞保持明亮的圆的结构并且不会看起来是暗的或碎片状的。关于胞内结构的更详细的信息，包括细胞核和细胞质，可用Hoffmann或Normarski显微镜获得。在双目显微镜下，可观察到存在可能松散的和漂浮的卵母细胞。卵母细胞是圆的大的细胞并且取决于它们的核成熟期可具有核囊泡(GV)或伴有一个极体(MI)或两个极体(MII)。可在形态学上从卵巢解剖的其他结构是从原始卵泡的不同发育阶段成为各种尺寸的囊状卵泡的卵泡。卵泡包含在中间的卵母细胞和在它们周围的一个或若干个粒层细胞和膜细胞。原始卵泡和初级卵泡在从200-500μm的尺寸中改变并且囊状卵泡可达到若干毫米且排卵前卵泡可达到2-3cm。由于卵泡被埋在卵巢中并紧紧附在卵巢上，不用机械或酶离解找到它们的机会是非常低的。
细胞被染色并用台式流式细胞仪评定，以测定细胞的健康、品质、尺寸和具体特征。生殖系细胞流动标记物包括但不限于VASA、Oct-4、c-Kit、SSEA-4。
卵母细胞IHC标记物包括但不限于，GDF9、ZP1、ZP4、Scp3。皮质颗粒IHC标记物包括但不限于PNA。这些标记物的组合被用在评定存在不同的类型卵巢细胞(包括潜在的生殖系细胞)和它们恢复生育力的潜能的检验中。
生殖系细胞分子标记物包括但不限于，VASA、Oct-4、c-Kit、SSEA-4。卵母细胞分子标记物包括但不限于，BicD1、GDF9、ZP1、ZP4、Ybx2、Scp3。皮质颗粒分子标记物包括但不限于PNA。这些标记物的组合被用在评定存在不同的类型卵巢细胞(包括在的生殖系细胞)和它们恢复生育力的潜能的检验中。
进行ABO/Rh分型以证实患者身份。使用基于DNA的方法进行HLA分型以证实患者身份。根据批准的实验室方案，在组织收集时收集的血液样品被送至ASHI批准的实验室用于HLA分型和CLIA批准的实验室用于ABO/Rh分型。
进行传染病测试以确保安全。针对血清学：HIV-1/2、HTLV-I/II、HCV、HBsAg、HBc、Syphilis、CMV、NAT、HIV、HCV和WNV，根据批准的实验室方案，在组织收集时收集的血液样品被送至CLIA批准的实验室用于测试。进行真菌、需氧和厌氧菌培养测试、物种形成和抗生素敏感性测试(如果培养是阳性的)确保。如果培养是阳性的，接着在卵巢组织或细胞的任何未来自体移植之前，进行物种形成和抗生素敏感性测试以根除任何微生物。
冷冻保存。从组织处理中分离的细胞被悬浮在含有临床级冷冻保护剂的专用培养基中，所述冷冻保护剂被设计用于冷冻保存生殖系细胞。接着控制速率的冷冻器被用来以-1℃/分钟从+4℃至-60℃和以-10℃/分钟的冷冻速率从-60℃至-90℃缓慢冷冻细胞。接着将细胞放在-150℃和-196℃之间的临时隔离(隔离)存储液氮气相中。对于较大的细胞、卵泡、和卵巢组织条，使用了其他冷冻保存方法比如玻璃化。细胞接着被放在在-150℃和-196℃之间的隔离存储液氮气相中。
隔离存储。冷冻保存的产物被保存在在-150℃和-196℃之间的临时隔离液氮罐的气相中。万一产物被肿瘤细胞、需氧菌、厌氧菌，或真菌污染，或对HIV-1/2、HTLV-I/II、HCV、HBsAG、HBc或WNV有活性，污染的产物被移至永久隔离液氮罐的气相中。当在临时隔离罐中的所有产物没有污染时，接着临时隔离罐改变状态至在-150℃和-196℃之间的永久存储罐。
永久存储。没有微生物污染且对HIV-1/2、HTLV-I/II、HCV、HBsAG、HBc和WNV无活性的产物被存储在在-150℃和-196℃之间的永久存储液氮冷冻罐的气相中。
发现被肿瘤细胞、需氧菌、厌氧菌、或真菌或对HIV-1/2、HTLV-I/II、HCV、HBsAG、HBc和WNV有活性的产物被临时存储在在-150℃和-196℃之间的永久隔离液氮罐的气相中。针对肝炎和HIV测试对登入名单者研究需要知情同意。任何阳性结果将公开给同意方并将提供关于适当咨询和治疗的治疗安排。
研究分析将包括测定处理和冷冻保存损失的细胞和活力(冷冻前与解冻后比较)；测定产物在冷冻存储中的稳定性(冷冻后在不同的时间点下的解冻后分析)；针对多种适应症测定生育率；针对手术收集程序测定副反应或并发症的比率；针对解冻后的细胞的活力测定受试者的年龄的影响；测定有效冷冻保存方案对解冻后活力的影响。
方案中断规则。如果有直接由外科收集程序导致的任何死亡或严重副反应，将暂缓试验增加患者并经受通过IRB的评审。只有当IRB认为重新开始试验是合理的，患者增加将继续。
除非另有指明，本说明书和权利要求书中使用的表示成分数量，以及分子量、反应条件等性质的所有数字都应当被理解为：在所有情况下，用术语“大约”加以了修饰。因此，除非有相反含义的说明，本说明书和所附权利要求书中示出的数量参数都是约数，它们可以根据本发明想要获得的性质而变动。至少，并且并非对权利要求书范围等同原则的应用加以限制，每个数量参数至少应按照报道的有效数字的数，以及应用普通的凑整技术来解释。虽然示出本发明宽广范围的数字范围和参数是约数，但是特别实施例中所示的数值却被尽可能地精确报道。但是，任何数值，必然含有一定误差，这是它们分别的测试测量方法中发现的标准偏差必然导致的。
除非本文另有指明，或与上下文明显矛盾，描述本发明的上下文中使用的术语“一个”、“一种”和“这个”以及类似提法应当被理解为既包括单数又包括复数。本文中数值范围的复述仅仅用作速记方法，用于该范围内每个单独的值。除非本文另有指明，每个单独的值被包括进说明书，这与在本文个别复述一样。本文所述的所有方法都可以以任何合适的顺序来进行，除非本文另有指明，或与上下文明显矛盾。除非另有指明，本文提供的任何及所有例子，或者示例性的语言(例如，“例如”)仅用来更好地阐述本发明，而非对发明范围加以限制。说明书中任何语句都不应被解释为表示任何未要求保护的元素对于本发明的实践而言是必要的。
本文公开的本发明的替换性要素或实施方式的分组不应被理解为限制。每个组成员可被个别提到或被个别要求保护，或以与该组其它成员或本文中找到的其它要素的任何组合被提到或要求保护。可以预见到，为了方便和/或可专利性的理由，组中的一个或多个成员可被包括进一组或从中删除。当任何此类包括或删除发生时，说明书在本文中被看作为含有经过改动的组，因此满足所附权利要求书中所用的马库什组的撰写描述。
本文中描述了本发明的某些实施方式，其包括发明人已知用来开展本发明的最佳模式。当然，在阅读前述说明书的基础上，对这些实施方式中的改动对于本领域普通技术人员来说将是明显的。本发明的发明人期待本领域技术人员合适地采用此类改动，发明人希望本发明以除了本文特别描述的方式之外的方式被实现。因此，只要适用法律允许，本发明包括对所附权利要求中提到的主体进行的所有改动和等同物。此外，所有可能的变化中，上面提到的要素的任何组合都被包括进本发明，除非本文另有指明，或与上下文明显矛盾。
此外，本说明书中提到了大量参考文献。上述参考文献和印刷公开物中的每种在此都通过引用被个别地整体包括进本文。
本文中公开的具体实施方式可使用由…组成或基本由…组成的语言在权利要求中进一步限制。当在权利要求中使用时，无论作为提交的或每次修改添加的，转换术语“由…组成”包括未在权利要求中详细说明的任何元件、步骤或成分。转换术语“基本由…组成”将权利要求的范围限制在指定的材料或步骤以及不在本质上影响基本和新颖特征的那些。这样要求的本发明的实施方式在本文中被固有地或清楚地描述和被授予权利。
最后，应当理解，本文公开的本发明实施方式是为了阐述本发明的原理。可以进行的其它改动也落在本发明的范围内。因此，举例而言，而非限制，可按照本文的教导来使用本发明的替代性构造。因此，本发明不被限制为：与本文所述和所示出的完全准确地一致。
Figure IPA00001577240500011
Figure IPA00001577240500021

Claims (16)

1.储存生殖系干细胞的方法，其包括：
从处于生育力丧失风险下的哺乳动物中收集性腺组织；
运输所述性腺组织至中心储存设施；
处理所述性腺组织；
冷冻保存所述性腺组织；并
对所述冷冻保存的性腺组织测定生育力潜能。
2.根据权利要求1的方法，其中所述性腺组织是睾丸组织。
3.根据权利要求2的方法，其中处理所述睾丸组织包括制备约0.5-2.0mm2的睾丸组织片。
4.根据权利要求2的方法，其中处理所述睾丸组织包括：
用选自下述组的至少一种酶消化所述睾丸组织：胶原酶、DNase、透明质酸酶和胰蛋白酶；并且
使所述至少一种酶失活，因而获得离解的睾丸细胞悬液。
5.根据权利要求4的方法，还包括从所述离解的睾丸细胞中分离雄性生殖系干细胞的步骤，其中所述雄性生殖系干细胞特征在于它们不表达黄体生成素受体。
6.根据权利要求4的方法，还包括从所述离解的睾丸细胞中分离雄性生殖系干细胞的步骤，其中所述雄性生殖系干细胞特征在于它们表达SSEA-4。
7.根据权利要求6的方法，其中所述雄性生殖系干细胞还表达GFR-α1和VASA。
8.根据权利要求2的方法，其中所述测定的生育力潜能是所述睾丸组织能体外分化为成熟的精子的能力。
9.根据权利要求2的方法，其中所述测定的生育力潜能是通过减数分裂标记物和减数分裂后标记物的至少一种的表达以及尺寸和形态学来测定睾丸细胞的特征。
10.根据权利要求1的方法，其中所述性腺组织是卵巢组织。
11.根据权利要求10的方法，其中处理所述卵巢组织包括制备约0.5-3.0mm2的卵巢组织片。
12.根据权利要求11的方法，其中所述处理还包括：
用选自下述组的至少一种酶消化所述卵巢组织：胶原酶、DNase、透明质酸酶和胰蛋白酶；并
使所述至少一种酶失活，因而获得离解的卵巢细胞悬液。
13.根据权利要求10的方法，其中所述测定的生育力潜能通过所述卵巢组织体外分化为成熟的卵子的能力来进行测定。
14.根据权利要求10的方法，其中所述测定的生育力潜能是通过减数分裂标记物和减数分裂后标记物的至少一种的表达以及尺寸和形态学来测定卵巢细胞的特征。
15.根据权利要求1方法，还包括将所述冷冻保存的性腺组织植入从中分离该性腺组织的相同个体的剩余性腺组织中。
16.生殖系干细胞储存系统，其包括：
收集性腺组织的手段；
运输性腺组织的手段；
处理性腺组织以分离生殖系干细胞的手段；
冷冻保存性腺组织或所述生殖系干细胞的手段；
测所述冷冻保存的性腺组织或所述冷冻保存的生殖系干细胞的生育力潜能的手段。
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