KR20180115209A

KR20180115209A - 불임증의 처치에 사용되는 의약 조성물 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR20180115209A
Application number: KR1020170182254A
Authority: KR
Inventors: 신고 미야모토; 후사노리 요츠모토
Original assignee: 신고 미야모토; 후사노리 요츠모토
Priority date: 2017-04-12
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2018-10-22
Also published as: US20200078409A1; JP6256786B1; US20180296604A1; TW201836635A; SG10201710666UA; KR102190883B1; JP2018177687A

Abstract

[과제] 불임증을 개선 가능한 의약 조성물 및 그 제조 방법을 제공한다.
[해결수단] 지방 줄기 세포, 혈관 내피 세포 및 혈관 주피 세포를 포함하는 지방 조직에서 유래되는 재생 세포를 포함하는 자궁내강 투여용 의약 조성물이다. 또한, 지방 조직을 탈응집제로 처리해서 탈응집 조직을 얻는 것과, 탈응집 조직으로부터 원심 분리 처리에 의해 재생 세포를 농축하는 것과, 농축되는 재생 세포를 회수하는 것을 포함하는, 불임증의 처치에 사용되는 의약 조성물의 제조 방법이다.

Description

불임증의 처치에 사용되는 의약 조성물 및 그 제조 방법{PHARMACEUTICAL COMPOSITION USED IN THE TREATMENT OF INFERTILITY AND PROCESS FOR MANUFACTURING THE SAME}

본 발명은 불임증의 처치에 사용되는 의약 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

일본에서는, 현재 6쌍 중 1쌍의 부부가 불임증으로 진단받고 있다. 불임증의 원인 중, 여성 인자로서 자궁 인자, 경관 인자, 배란 인자 및 난관 인자가 있다. 자궁 원인 이외의 3가지에 대해서는 인공 수정이나 체외 수정 등 이미 확립된 치료법이 있다. 또한 자궁 인자 중, 자궁 자체의 구조가 문제가 되는 기질성 질환(예를 들어 자궁선근막증, 자궁 기형 등)이 있는데, 이것들은 수술로 치료 가능하게 되었다. 한편, 자궁의 기능에 문제가 있는 기능성 질환으로 자궁내막 비박증(菲薄症), 소위 착상 부전증에 기인하는 불임증에 대해서는, 유효한 치료 방법이 없는 것이 현 실정이다.

그런데, 일본 특허 공개 제2012-75439호 공보에는, 생체 조직으로부터 재생 세포를 분리하기 위한 자동화 시스템이 기재되어 있으며, 재생 세포가 다양한 질환 및 장애에 적용 가능한 것이 기재되어 있다. 또한 일본 특허 공개 제2012-51923호 공보에는, 지방 조직으로부터 얻어지는 재생 세포를 심혈관 상태의 치료에 사용할 수 있는 것이 기재되어 있다. 또한, Human Reproduction, 2012년, Vol.27, Suppl.2, Abstract Number: P-587에는, 불임증으로, 이전에 성공하지 못했던 체외 수정(IVF)에 있어서 자궁내막의 두께가 3 내지 5mm인 여성에 대하여, 세포 배양에 의해 얻어진 지방 유래 줄기 세포(adipose derived stem cells; ASC)를 자궁내막하 영역에 주입한 결과, 자궁내막의 두께가 ASC 투여 후의 제2 인공 주기 및 제3 인공 주기에서 7 및 8mm였던 것, 또한 제3 주기에 배반포를 이식하고 나서 30일째에는 자궁임신이 보인 것이 기재되어 있다.

본 발명은, 불임증을 개선 가능한 의약 조성물 및 그 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 구체적 수단은 이하와 같으며, 본 발명은 이하의 형태를 포함한다.

제1 형태는, 지방 줄기 세포, 혈관 내피 세포 및 혈관 주피 세포를 포함하는 지방 조직 유래 재생 세포를 포함하며, 불임증의 처치에 사용되는 자궁 내강 투여용 의약 조성물이다.

제2 형태는, 지방 조직을 탈응집제로 처리해서 탈응집 조직을 얻는 것과, 탈응집 조직으로부터 원심 분리 처리에 의해 재생 세포를 농축하는 것과, 농축되는 재생 세포를 회수하는 것을 포함하는, 불임증의 처치에 사용되는 자궁내강 투여용 의약 조성물의 제조 방법이다.

제3 형태는, 대상의 불임증을 처치하는 방법이며, 지방 줄기 세포, 혈관 내피 세포 및 혈관 주피 세포를 포함하는 지방 조직 유래 재생 세포를 포함하는 의약 조성물을, 처치 대상의 자궁내강에 투여하는 것을 포함하는 불임증의 처치 방법이다.

본 발명에 따르면, 불임증을 개선 가능한 의약 조성물 및 그 제조 방법을 제공할 수 있다.

도 1a는 지방 조직의 일례를 나타내는 전자 현미경 사진이다.
도 1b는 지방 조직의 일례를 나타내는 모식도이다.
도 2a는 마우스 ADRCs의 플로우 사이토메트리에서의 Sac-1의 검출 결과이다.
도 2b는 마우스 ADRCs의 플로우 사이토메트리에서의 CD105의 검출 결과이다.
도 2c는 마우스 ADRCs의 플로우 사이토메트리에서의 CD29의 검출 결과이다.
도 2d는 마우스 ADRCs의 플로우 사이토메트리에서의 CD45의 검출 결과이다.
도 3은 정상 마우스의 자궁내막을 나타내는 조직 염색도이다.
도 4a는 대조군 마우스의 자궁의 시상단면을 나타내는 조직 염색도이다.
도 4b는 대조군 마우스의 자궁의 횡단면을 나타내는 조직 염색도이다.
도 5a는 시험군 마우스의 자궁의 시상단면을 나타내는 조직 염색도이다.
도 5b는 시험군 마우스의 자궁의 횡단면을 나타내는 조직 염색도이다.
도 6a는 마우스 ADRCs의 자궁내막 증식능을 도시하는 도면이다.
도 6b는 마우스 ADRCs에 의한 자궁선수의 증가능을 도시하는 도면이다.
도 7은 마우스 ADRCs의 자궁내막 증식능을 도시하는 도면이다.
도 8a는 마우스에 대한 인간 ADRCs에 의한 자궁내막 증식능을 도시하는 도면이다.
도 8b는 마우스에 대한 인간 ADRCs에 의한 자궁선수의 증가능을 도시하는 도면이다.
도 9a는 대조군 마우스의 자궁의 시상단면을 나타내는 형광 면역 염색도이다.
도 9b는 시험군 마우스의 자궁의 시상단면을 나타내는 형광 면역 염색도이다.
도 10은 마우스 ADRCs의 혈관 신생능을 도시하는 도면이다.
도 11은 ADRCs 유효성 평가에 사용한 실험 스케줄의 개략도이다.
도 12a는 대조군 마우스의 배 이식 후의 적출 자궁을 도시하는 도면이다.
도 12b는 시험군 마우스의 배 이식 후의 적출 자궁을 도시하는 도면이다.
도 13은 마우스 ADRCs의 착상율 평가의 결과를 도시하는 도면이다.
도 14는 마우스에 대한 인간 ADRCs의 착상율 평가의 결과를 도시하는 도면이다.

본 명세서에서, 조성물 중의 각 성분의 함유량은, 조성물 중에 각 성분에 해당하는 물질이 복수 존재하는 경우, 특별히 언급하지 않는 한, 조성물 중에 존재하는 당해 복수의 물질의 합계량을 의미한다. 이하, 본 발명을 실시 형태에 기초하여 설명한다. 단, 이하에 기재하는 실시 형태는, 본 발명의 기술 사상을 구체화하기 위한, 불임증의 처치에 사용되는 의약 조성물 및 그 제조 방법을 예시하는 것으로서, 본 발명은 이하에 나타내는 의약 조성물 및 그 제조 방법에 한정되지 않는다.

의약 조성물

본 발명의 불임증 처치에 사용되는 의약 조성물은, 지방 조직 유래 재생 세포(Adipose Tissue Derived Reproductive Cells: 이하, 「ADRCs」라고도 함)를 포함하는 것을 특징으로 한다. ADRCs는, Cytotherapy(2008), Vol.10, No.4, 417-426, Japanese Journal of Transfusion and Cell Therapy, Vol.59, No.359(3): 450-456, 2013 등에 기재되어 있는 바와 같이 지방 세포 유래 줄기 세포 외에도, 혈관 내피 세포, 혈관 주피 세포 등을 포함하고 있다. ADRCs는, 예를 들어 혈관 신생, 조직 수복 등을 촉진하는 특성이 있고, 자궁내막에 접하도록 자궁내강에 투여됨으로써, 비박화(菲薄化)한 자궁내막을 수복할 수 있다고 생각된다. 그 결과, 수정란의 자궁내막으로의 착상율을 개선할 수 있어, 불임증을 개선하는 것이 가능해진다고 생각된다.

의약 조성물은 불임증의 처치에 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 「처치」란, 불임증에 대해서 실시되는 어떠한 처치이면 되며, 예를 들어 불임증의 치료, 개선, 악화의 방지 등을 들 수 있다.

불임증의 여성 인자 중, 자궁 인자로서 자궁의 기능에 문제가 있는 기능성 질환으로서, 착상 부전이 알려져 있다. 착상 부전이란, 3회 이상, 체외 수정에 의해 양호한 배를 이식했음에도 불구하고, 임신되지 않거나 유산이 된 상태를 말한다. 그 원인의 하나로서, 자궁내막이 두꺼워지지 않는(자궁내막 비박증이라고도 함) 것을 들 수 있다. 자궁내막 비박증은, 예를 들어 여성호르몬(예를 들어, 에스트로겐과 프로게스테론)의 분비 저하에 의해, 착상에 적합한 자궁내막의 증식이 일어나지 않는 상태이다. 자궁내막 비박증에 대하여 여성호르몬을 투여함으로써 개선을 시도할 수 있지만, 효과가 나타나지 않는 경우가 있다. 그 원인은 불분명한데, 자궁내막의 증식능 자체는 유지되고 있는 경우가 있다.

자궁내막 비박증에 의한 착상 부전에 대해서는 이하와 같이 생각할 수 있다. 수정이 성립된 후, 수정란은 난관으로부터 자궁 내부로 이동하여, 자궁내막에 착상해서 임신이 성립된다. 그런데, 자궁내막이 비박화되어 있으면, 난관으로부터 자궁 내부로 이동한 수정란은, 자궁내막과 접착할 수 없어, 자궁내막으로의 착상이 잘 되지 않는다고 여겨지고 있다. 예를 들어, 비박화된 자궁내막에서는 혈관 신생이 부족하고, 자궁내막 증식 작용을 갖는 에스트로겐에 대한 반응성이 낮은 것으로 알려져 있다. 이러한 경우에는, 자궁내막 비박증에 의한 착상 부전에 대하여 호르몬제 치료를 시도해도, 치료에 효과가 없게 된다. 그래서 본 발명자들은, 자궁내막 비박증에 대하여 자궁 내에 지방 줄기 세포를 주입하는 치료 방법을 착안하여, 본 발명을 완성하기에 이른 것이다.

본 발명에 사용되는 지방 조직 유래 재생 세포(ADRCs)란, 지방 조직으로부터 후술하는 방법에 의해 조제할 수 있는 재생 세포이며, 예를 들어 지방 줄기 세포, 전구 세포 등의 적어도 1종을 포함하고, 혈관 내피 세포, 혈관 주피 세포 등을 더 포함하는 것이다. 그 중에서도 ADRCs는, 적어도 지방 줄기 세포와, 혈관 내피 세포와, 혈관 주피 세포를 포함하는 것이 바람직하다. 또한 ADRCs는, 적어도 혈관 신생 유도 작용(혈관 신생능이라고도 함)을 갖는 것이 바람직하고, 자궁내막 증식능을 갖는 것도 또한 바람직하다.

ADRCs는, 양성 마커로서 Sca-1, CD105 및 CD29로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하고 있는 것이 바람직하고, Sca-1, CD105 및 CD29 모두를 발현하고 있는 것이 보다 바람직하다. 또한 ADRCs는, 음성 마커인 CD45를 발현하고 있지 않은 것이 바람직하다. ADRCs의 표면 항원의 상세에 대해서는, Cytotherapy(2008), Vol.10, No.4, 417-426을 참조할 수 있다.

재생 세포가 얻어지는 지방 조직은, 생체의 어느 부위에 존재하는 것이어도 되며, 피하 조직에 존재하는 피하 지방인 것이 바람직하다. 피하 지방은 생체의 어느 부위로부터 채취되는 것이어도 되며, 예를 들어 요배부, 대퇴부 등으로부터 채취해도 된다. 피하 지방의 일례를 도 1a의 현미경 화상(Matsumoto D, et al., Tissue Engineering. Dec 2006, 12(12): 3375-3382.의 Figure 1A로부터 개변) 및 도 1b의 모식도에 나타낸다. 도 1b에서는, 큰 세포로서 지방 세포(10)의 주위에 작은 세포로서 지방 줄기 세포(20)가 도시되어 있다. 도 1b에는, 또한 혈관(30) 및 세포외 기질(40)도 도시되어 있다. 피하 지방에서의 지방 세포(10)의 존재율은, 예를 들어 20％ 정도이고, 지방 줄기 세포(20)의 존재율은, 예를 들어 1％ 내지 5％ 정도이다. 또한 혈관(30)은 15％ 내지 20％ 정도 포함되어 있다. 지방 줄기 세포는, 심장, 골격근, 뼈·연골, 혈관 등의 다양한 장기로 분화될 수 있다. 또한, 지방 줄기 세포는 생리 활성 물질을 분비함과 함께, 혈관 신생을 유도하는 작용을 갖고 있다.

의약 조성물에 포함되는 ADRCs는 용시 조제한 것이어도 되고, 동결 보존한 ADRCs여도 된다. 또한, 동결 보존한 ADRCs는, 연일 투여가 가능해서 착상율을 더욱 개선하는 것을 기대할 수 있으므로 더욱 바람직하다. 또한, ADRCs의 동결 보존에는, 통상 사용되는 세포의 동결 보존 조건을 적용할 수 있다. 또한 ADRCs는, 투여 대상으로부터 채취한 지방 조직으로부터 조제된 것이어도 되고, 투여 대상과는 상이한 개체로부터 채취한 지방 조직으로부터 조제된 것이어도 된다. 또한 ADRCs는, 투여 대상과는 이종의 동물로부터 채취한 지방 조직으로부터 조제된 것이어도 된다.

의약 조성물은 ADRCs에 더해, 필요에 따라, 약학적으로 허용되는 부형제 등 기타 성분을 더 포함하고 있어도 된다. 기타 성분으로서는, 약학적으로 허용되는 부형제 외에, 계면 활성제, 생리 활성 물질, 안정화제, 액상 매체 등을 들 수 있다. 기타 성분으로서 구체적으로는, 히알루론산, 콘드로이틴 황산 등의 글리코사미노글리칸 및 그의 유도체; 에스트로겐, 프로게스테론 등의 여성호르몬 수용체 활성화 인자를 들 수 있다. 글리코사미노글리칸 유도체에는, 글리코사미노글리칸의 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염이 포함된다. 의약 조성물이 글리코사미노글리칸 및 그의 유도체를 포함함으로써, 예를 들어 의약 조성물의 점도가 상승하고, 자궁 내에서의 체류 시간이 길어진다. 또한, 의약 조성물이 여성호르몬 수용체 활성화 인자를 포함함으로써, 자궁내막의 증식, 성숙 등이 보다 촉진된다. 또한 액상 매체로서는, 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수(PBS) 등을 들 수 있다.

의약 조성물의 형태는, 불임증의 처치로서 투여 가능한 제제의 형태인 한 특별히 한정되지 않는다. 투여 시에 있어서의 형태가 액체인 것이 바람직하고, 자궁 내에서 겔화 가능한 액체인 것이 보다 바람직하다.

의약 조성물의 투여 방법으로서는, 예를 들어, 유효량의 의약 조성물을 대상의 자궁 내, 즉 자궁내강에 주입하는 방법을 들 수 있다. 의약 조성물은 자궁내강에 주입되어, 자궁내막의 표면에 접촉함으로써, 예를 들어 자궁내막에서의 혈관 신생을 촉진하고, 에스트로겐 불응성의 비박화된 자궁내막을 증생시킴으로써 착상 부전을 개선할 수 있다. 또한 자궁내막의 성숙을 촉진할 수 있어, 착상 부전이 개선된다. 의약 조성물은 자궁내강에 주입됨으로써 자궁내막을 증식 가능하기 때문에, 자궁근체 등의 조직에 상처를 입히지 않고, 침습성이 매우 낮다. 그 때문에 반복 투여가 용이하며 또한 안전하게 가능하다. 의약 조성물의 자궁내강으로의 주입은, 예를 들어 자궁 카테터 등으로 행할 수 있다.

의약 조성물의 제조 방법

불임증의 처치에 사용되는 의약 조성물의 제조 방법은, 지방 조직을 탈응집제로 처리해서 탈응집 조직을 얻는 것과, 탈응집 조직으로부터 원심 분리 처리에 의해 재생 세포를 농축하는 것과, 농축되는 재생 세포를 회수하는 것을 포함한다.

제조 방법에 사용되는 지방 조직은, 예를 들어 피하 조직으로부터 채취된다. 피하 조직으로부터 채취된 지방 조직은, 생리 식염수, 완충 또는 비완충 전해질 용액 등으로 세정 처리되어도 된다. 지방 조직은 탈응집제로 처리되어 탈응집 조직이 얻어진다. 탈응집제로서는, 예를 들어 중성 프로테아제, 콜라게나아제, 트립신, 리파아제, 히알루로니다아제, 데옥시리보뉴클레아제, 펩신 등을 들 수 있고, 그 중에서 콜라게나아제가 바람직하다. 탈응집제는 생리 식염수 등의 다른 용액과 함께 지방 조직에 첨가되어도 된다. 탈응집제에 의한 처리는, 예를 들어 37℃ 또는 그 부근의 온도에서 20분 내지 120분 진탕해서 실시할 수 있다.

탈응집제로 처리되어 얻어지는 탈응집 조직으로부터, 원심 분리 처리에 의해 재생 세포가 농축된다. 원심 분리 처리에 앞서 탈응집 조직으로부터 비부유물 성분을 제거하여, 부유물층을 포함하는 획분을 얻는 것이 바람직하다. 부유물층을 포함하는 획분에는 재생 세포가 포함된다. 재생 세포를 포함하는 부유물층은, 필요에 따라 세정 처리되어도 된다.

원심 분리 처리에 의해 농축된 재생 세포는, 통상의 방법에 의해 회수되어 의약 조성물을 구성한다. 상술한 지방 조직으로부터 재생 세포를 회수하는 방법의 상세에 대해서는, 예를 들어 일본 특허 공개 제2012-51923호 공보, 일본 특허 공개 제2012-75439호 공보, 국제 공개 제2015/042182호, 국제 공개 2006/127007호 등을 참조할 수 있다. 또한, 지방 조직으로부터의 재생 세포의 회수는, 시판되고 있는 사이토리(Cytori)사 제조의 셀루션 시스템(Celution System)을 사용해서 실시해도 된다.

불임증의 처치 방법

불임증의 처치 방법은, 대상의 불임증을 처치하는 방법이며, 지방 조직 유래 재생 세포(ADRCs)를 포함하는 의약 조성물의 유효량을, 처치 대상의 자궁내강에 투여하는 것을 포함한다. 자궁내강에 투여되는 의약 조성물에 포함되는 지방 조직 유래 재생 세포에 의해, 착상 부전이 개선되고 착상율이 향상된다. 의약 조성물에 포함되는 지방 조직 유래 재생 세포는 용시 조제한 것이어도, 동결한 것이어도 된다. 또한 불임증의 처치 방법은 불임증의 치료 방법이어도 된다.

불임증의 처치 방법의 대상이 되는 동물은 포유동물이면 되며, 포유동물에는 인간이 포함된다. 유효량의 ADRCs는, 대상이 되는 동물종, 개체의 상태 등에 따라서 적절히 선택하면 된다. 유효량의 ADRCs의 세포수는, 예를 들어 5×10⁵ 내지 5×10⁶개로 할 수 있다. 또한 의약 조성물의 자궁내강으로의 투여는, 자궁 카테터 등을 사용하는 통상의 방법에 의해 행할 수 있다.

착상 부전 개선 방법

착상 부전 개선 방법은, 대상의 착상 부전을 개선하는 방법이며, 지방 조직 유래 재생 세포(ADRCs)를 포함하는 의약 조성물의 유효량을, 처치 대상의 자궁내강에 투여하여, 자궁내막 세포를 증식시키는 것을 포함한다. 의약 조성물에 포함되는 지방 조직 유래 재생 세포는 용시 조제한 것이어도, 동결한 것이어도 된다.

착상 부전 개선 방법의 대상이 되는 동물은 포유동물이면 되며, 포유동물에는 인간이 포함된다. 유효량의 ADRCs는, 대상이 되는 동물종, 개체의 상태 등에 따라서 적절히 선택하면 된다. 유효량의 ADRCs의 세포수는, 예를 들어 5×10⁵ 내지 5×10⁶개로 할 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1)

마우스(ICR, 암컷, 5주령)의 양쪽 다리의 피하로부터, 마우스 지방 조직을 채취하였다. 채취한 지방 조직 1g 내지 2g에 대하여 10ml의 0.2％ 콜라게나아제 용액(GIBCO 17100-017)을 가해서 지방 조직을 침지한 상태에서, 가위로 잘게 잘랐다. 잘게 자른 지방 조직에 0.2％ 콜라게나아제 용액 20ml를 가하고, 37℃에서 120rpm, 1시간 진탕하였다. 그 후 셀 스트레이너(FALCON사 제조, REF 352360)로 여과하고, 여과액을 400G로 5분간 원심 처리하였다. 상청을 제거하고, 얻어진 펠릿을 인산 완충 생리 식염수(PBS) 10ml에 현탁해서 400G로 5분간 원심 처리하는 것을 3회 반복해서 세포 펠릿을 얻었다. 얻어진 세포 펠릿을 마우스 ADRCs로 하였다.

얻어진 마우스 ADRCs에 대해서, 멀티 컬러 플로우 사이토메트리 키트(R & D 시스템사 제조, 카탈로그 번호: FMC003)를 사용하여, 양성 마커인 Sca-1, CD105 및 CD29, 그리고 음성 마커인 CD45의 항체를 사용해서 염색하여 양성 세포를 플로우 사이토메트리로 검출하였다. 결과를 도 2에 도시한다. 도 2로부터, 상기에서 얻어진 ADRCs는, Sca-1, CD105 및 CD29가 양성이고, CD45가 음성인 것을 알 수 있다.

(실시예 2)

서면으로 사전동의서에 동의한 피험자에 대해서, 전신 마취하에 요배부 및 대퇴부의 피하 조직으로부터 인간 지방 조직을 채취하였다. 채취한 인간 지방 조직으로부터, 사이토리사 제조의 셀루션 시스템을 사용해서 재생 세포를 추출해서 얻어진 세포 펠릿을 인간 ADRCs로 하였다.

자궁내막 비박화 모델 마우스의 제작

마우스(ICR, 암컷, 5주령)의 배부를 절개하고, 자궁 주위의 지방 조직을 동정하였다. 동정한 자궁 주위의 지방 조직을 견인해서 자궁을 고정하고, 자궁 내에 95％ 에탄올을 주입하여, 자궁내막 비박화 모델 마우스를 제작하였다.

(시험예 1)

ADRCs 유효성 평가 1 자궁내막 증식능의 평가

상기에서 제작한 자궁내막 비박화 모델 마우스를 사용하여, 이하와 같이 해서 마우스 ADRCs의 자궁내막 증식능의 평가를 행하였다. 95％ 에탄올을 주입하고 나서 10일 후(월경 주기 2사이클 후)의 자궁내막 비박화 모델 마우스의 자궁내강에 피검약을 주입하였다. 피검약을 주입하고 나서 7일 후에 자궁내막의 상태를 조사하였다. 또한, 피검약으로서, 시험군에는 마우스 ADRCs를 1×10⁶개 포함하는 조성물(PBS 30μl)을 주입하고, 대조군에는 생리 식염수(30μl)를 주입하였다. 또한, 시험군에는 9마리의 모델 마우스를 사용하고, 대조군에는 8마리의 모델 마우스를 사용하였다. 자궁내막의 조직 헤마톡실린·에오진(HE) 염색도(100배)를 도 3, 도 4a, 도 4b, 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.

도 3은 정상 마우스의 자궁내막을 나타내는 조직 HE 염색도이다. 도 4a는 자궁내막 비박화 모델 마우스에 생리 식염수를 주입한 대조군의 자궁의 시상단면을 나타내고, 도 4b는 그 자궁의 횡단면을 나타내는 조직 HE 염색도이다. 도 5a는 자궁내막 비박화 모델 마우스에 마우스 ADRCs를 주입한 시험군의 자궁의 시상단면을 나타내고, 도 5b는 그 자궁의 횡단면을 나타내는 조직 HE 염색도이다. 또한 도 6a에 자궁내막의 두께를, 도 6b에 자궁선의 수를 나타낸다. 자궁내막의 두께는, 대조군에서는 54±5.2㎛(mean±SD, N=8)이며, 시험군에서는 268±28.6㎛(mean±SD, N=9)로 ADRCs를 주입한 시험군에서 유의미하게 높은 값이었다(p<0.01). 또한 자궁선의 수는, 대조군에서는 2.4±0.8개(mean±SD, N=8)이며, 시험군에서는 37±8.6개(mean±SD, N=9)로 ADRCs를 주입한 시험군에서 유의미하게 높은 값이었다(P<0.01). 또한, 통계학적 검토에는, 만-휘트니 U 시험(Mann-Whitney's U test)을 사용하였다. 이상으로, 마우스 ADRCs를 자궁내강에 투여함으로써 자궁내막 비박화 모델 마우스의 자궁내막이 증식하는 것을 알 수 있다.

(시험예 2)

피검약으로서, 마우스 ADRCs에 히알루론산을 첨가한 조성물, 마우스 ADRCs에 히알루론산 및 에스트로겐을 첨가한 조성물, 동결 마우스 ADRCs에 히알루론산을 첨가한 조성물, 및 동결 마우스 ADRCs에 히알루론산 및 에스트로겐을 첨가한 조성물을 사용하여, 시험예 1과 마찬가지로 해서 자궁내막 증식능을 평가하였다. 여기서 마우스 ADRCs로서는, 마우스 ADRCs를 1×10⁶개 포함하는 PBS를 사용하고, 조성물 중의 히알루론산의 첨가량은 20μL(0.2mg), 에스트로겐의 첨가량은 3μL(3pg)이었다. 자궁내막의 두께를 측정한 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7로부터, ADRCs에 히알루론산을 첨가함으로써 자궁내막 증식능이 향상되는 경향이 있고, 또한 에스트로겐을 첨가함으로써 자궁내막 증식능이 더욱 향상되는 것을 알 수 있다. 또한 ADRCs는 동결 보존 후에도 신선한(용시 조제한) ADRCs와 동등한 자궁내막 증식능을 갖는 것을 알 수 있다.

(시험예 3)

피검약으로서, 마우스 ADRCs 대신에 인간 ADRCs를 사용하여, 시험예 1과 마찬가지로 하여 마우스에서의 자궁내막 증식능을 평가하였다. 결과로서 도 8a에 자궁내막의 두께를, 도 8b에 자궁선의 수를 나타낸다.

도 8a 및 도 8b로부터, 인간 ADRCs를 자궁내막 비박화 모델 마우스의 자궁내강에 주입한 경우에도, 자궁내막 증식능을 나타내는 것을 알 수 있다.

(시험예 4)

ADRCs 유효성 평가 2 혈관 신생능의 평가

조직을 HE 염색하는 대신에, 혈관 내피 세포 증식 인자(VEGF) 형광 면역 염색용 항체(abcam사 제조, ab46154)를 사용해서 염색한 것 이외는, 시험예 1과 마찬가지로 하여, 자궁내막 비박화 모델 마우스를 사용한 마우스 ADRCs의 자궁내막에서의 혈관 신생능의 평가를 행하였다. 자궁내막의 VEGF 형광 면역 조직학적 염색의 결과를, 도 9a, 도 9b 및 도 10에 도시한다.

도 9a는 자궁내막 비박화 모델 마우스의 자궁내강에 생리 식염수를 주입한 대조군의 자궁의 시상단면을 나타내고, 도 9b는 자궁내막 비박화 모델 마우스의 자궁내강에 마우스 ADRCs를 주입한 시험군의 자궁의 시상단면을 나타내는 형광 면역 조직 염색도(200배)이다. 또한 도 10은 VEGF 발현량을, 자궁내막 영역에서의 발광 면적의 비율(％)로 평가한 도이다. 자궁내막에서의 VEGF 발현량은, 대조군에서는 3.4±2.5％(mean±SD, N=8)이며, 시험군에서는 34.8±9.5％(mean±SD, N=9)로 ADRCs를 주입한 시험군에서 유의미하게 높은 값이었다. 또한 VEGF는, 특히 자궁내막의 간질 부위에서 고발현하고 있는 것을 알 수 있다.

(시험예 5)

ADRCs 유효성 평가 3 착상율의 평가

상기에서 제작한 자궁내막 비박화 모델 마우스를 사용하여, 도 11에 도시하는 실험 스케줄에 따라서, 착상율에 관한 ADRCs 유효성 평가를 실시하였다.

구체적으로는 95％ 에탄올을 주입하고 나서 10일 후의 자궁내막 비박화 모델 마우스의 자궁내강에 피검약을 주입하였다. 그 후, 교배한 배를 이식하였다. 배 이식하고 나서 5일 후에 도살해서 수정란의 착상 상태를 조사하였다. 피검약으로서, 시험군에는 마우스 ADRCs를 1×10⁶개 포함하는 조성물을 사용하고, 대조군에는 생리 식염수를 사용하였다. 도 12a에 대조군에서 적출한 자궁의 화상을, 도 12b에 시험군에서 적출한 자궁의 화상을 나타낸다.

도 12a 및 도 12b에 도시한 바와 같이, 자궁내막 비박화 모델 마우스의 자궁내강에, 생리 식염수를 주입한 대조군의 자궁에서는, 이식 배의 착상은 확인되지 않았지만, ADRCs를 주입한 시험군의 자궁에서는, 이식 배의 착상이 확인되었다.

(시험예 6)

피검약으로서, 마우스 ADRCs에 히알루론산을 첨가한 조성물, 마우스 ADRCs에 히알루론산 및 에스트로겐을 첨가한 조성물, 동결 마우스 ADRCs에 히알루론산을 첨가한 조성물, 및 동결 마우스 ADRCs에 히알루론산 및 에스트로겐을 첨가한 조성물을 사용하여, 시험예 5와 마찬가지로 해서 착상 상태를 조사하여 착상율을 평가하였다. 여기서 마우스 ADRCs로서는, 마우스 ADRCs를 1×10⁶개 포함하는 PBS를 사용하고, 조성물 중의 히알루론산 첨가량은 20μL(0.2mg)이며, 에스트로겐의 첨가량은 3μL(3pg)이었다. 결과를 도 13에 나타내었다.

마우스 ADRCs를 포함하는 조성물을 자궁내강에 주입한 시험군은 모두, 생리 식염수를 주입한 대조군에 비해 착상율이 향상되어 있는 것을 알 수 있다. 특히, 마우스 ADRCs에 히알루론산을 첨가한 조성물에 있어서, 착상율이 보다 향상되는 경향이 확인되고, 히알루론산과 에스트로겐을 첨가한 조성물에 있어서, 착상율이 더욱 향상되는 경향이 확인되었다.

(시험예 7)

피검약으로서, 마우스 ADRCs 대신에 인간 ADRCs를 사용하여, 시험예 5와 마찬가지로 해서 자궁내막 비박화 모델 마우스의 착상 상태를 조사하여 착상율을 평가하였다. 결과를 도 14에 도시한다.

도 14로부터, 인간 ADRCs를 자궁내막 비박화 모델 마우스의 자궁내강에 주입한 경우에도, 착상율이 향상되는 것을 알 수 있다.

(시험예 8)

ADRCs의 품질 검증

전신 마취하에 미니 돼지의 둔부로부터 지방 조직을 채취하고, 사이토리사 제조의 셀루션 시스템을 사용해서 ADRCs를 채취하였다. 전신 마취하의 미니 돼지를 개복하여 자궁을 노출시켜 자궁체부의 2군데에, 이하의 ADRCs액 또는 컨트롤액을 주입하고 폐복하였다. 또한, ADRCs액은 지방 조직을 채취한 개체와 동일한 개체에 주입하고, 컨트롤액은 다른 개체에 주입하였다. 그 후 4주일간, 미니 돼지의 전신 상태의 관찰과 체중 측정(주입 전, 주입 후 2주, 주입 후 4주)을 실시하였다. 또한 주입 전 및 주입 후 4주에 혈액 검사를 행하였다. 또한 주입 후 4주에 부검하였다.

(1) ADRCs액 2ml: PBS로 현탁한 ADRCs(1×10⁶cells) 0.7ml+히알루론산^* 1.1ml+에스트로겐^** 0.2ml

(2) 컨트롤액 2.0ml: PBS 0.7ml+히알루론산^* 1.1ml+에스트로겐^** 0.2ml

* 히알루론산: 나트륨 「세이가가꾸」(알츠 25mg/2.5ml, 세이가가꾸 고교 가부시키가이샤)

** 에스트로겐: 17β-Estradiol(에스트라디올) (EtOH 중 10μg/ml, Abcom(ab120657))

<결과>

ADRCs액 투여 개체는, 컨트롤액 투여 개체와 비교하여, 4주간, 전신 상태에 변화가 없고, 체중 감소도 나타나지 않았다. 혈액 검사에 대해서는, 주입 전 및 주입 후 4주에서 유의한 차는 없었다. 뇌(대뇌, 소뇌, 연수), 폐(기관지를 포함함), 심장, 간장(담낭을 포함함), 비장, 신장, 신부 및 이식한 자궁에서 육안적인 이상은 없으며, 기관 중량도 주입 전 및 주입 후 4주에서 유의한 차는 없고, 병리학적 이상도 나타나지 않았다.

일본 특허 출원 2017-079148호(출원일: 2017년 4월 12일)의 개시는 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 도입된다. 본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허 출원 및 기술 규격은, 개개의 문헌, 특허 출원 및 기술 규격이 참조에 의해 도입되는 것이 구체적이며 또한 개별적으로 기재된 경우와 동일 정도로, 본 명세서에 참조에 의해 도입된다.

Claims

지방 줄기 세포, 혈관 내피 세포 및 혈관 주피 세포를 포함하는 지방 조직 유래 재생 세포를 포함하며, 불임증의 처치에 사용되는 자궁내강 투여용 의약 조성물.
제1항에 있어서, 글리코사미노글리칸 및 그의 유도체에서 선택되는 적어도 1종을 더 포함하는 의약 조성물.
제2항에 있어서, 상기 글리코사미노글리칸이 히알루론산인 의약 조성물.
제1항에 있어서, 에스트로겐 수용체 활성화 인자를 더 포함하는 의약 조성물.
제4항에 있어서, 상기 에스트로겐 수용체 활성화 인자가 에스트로겐인 의약 조성물.
제1항에 있어서, 착상 부전의 개선에 사용되는 의약 조성물.
제1항에 있어서, 혈관 신생 유도 작용을 갖는 의약 조성물.
제1항에 있어서, 자궁내막 증식능을 갖는 의약 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지방 조직 유래 재생 세포가 용시 조제한 것 또는 동결한 것인 의약 조성물.
지방 조직을 탈응집제로 처리해서 탈응집 조직을 얻는 것과, 탈응집 조직으로부터 원심 분리 처리에 의해 재생 세포를 농축하는 것과, 농축되는 재생 세포를 회수하는 것을 포함하는, 제1항에 기재된 의약 조성물의 제조 방법.
제10항에 있어서, 상기 지방 조직은 피하 조직에서 유래되는, 제조 방법.
지방 조직 유래 재생 세포 또는 제1항에 기재된 의약 조성물을, 대상의 자궁내강에 투여해서 자궁내막 세포를 증식시키는 것을 포함하는 착상 부전 개선 방법.
제12항에 있어서, 상기 지방 조직 유래 재생 세포 또는 상기 의약 조성물에 포함되는 지방 조직 유래 재생 세포가 용시 조제한 것 또는 동결한 것인 착상 부전 개선 방법.
지방 조직 유래 재생 세포 또는 제1항에 기재된 의약 조성물을, 대상의 자궁내강에 투여하는 것을 포함하는 불임증 치료 방법.
제14항에 있어서, 상기 지방 조직 유래 재생 세포 또는 상기 의약 조성물에 포함되는 지방 조직 유래 재생 세포가 용시 조제한 것 또는 동결한 것인 불임증 치료 방법.