JP6751933B1

JP6751933B1 - 子宮内膜症の処置に用いられる医薬組成物

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Publication number: JP6751933B1
Application number: JP2020012497A
Authority: JP
Inventors: 新吾宮本; 房典四元
Original assignee: 新吾宮本; 房典四元
Priority date: 2020-01-29
Filing date: 2020-01-29
Publication date: 2020-09-09
Anticipated expiration: 2040-01-29
Also published as: JP2021116277A

Abstract

【課題】子宮内膜症の症状を改善可能な医薬組成物及びその製造方法を提供する。【解決手段】脂肪組織由来再生細胞を含み、子宮内膜症の処置に用いられる医薬組成物である。医薬組成物は腹腔内投与又は静脈内投与に用いられてよく、脂肪組織由来の間葉系幹細胞を含んでいてよい。医薬組成物の製造方法は、脂肪組織を脱凝集剤で処理して脱凝集組織を得ることと、脱凝集組織から遠心分離処理により再生細胞を濃縮することと、濃縮される再生細胞を回収することとを含む。【選択図】図４

Description

本発明は、子宮内膜症の処置に用いられる医薬組成物に関する。

子宮内膜症は月経のある女性の約１０％から１５％が罹患し、月経困難症、不妊症等の原因となる疾患である。また、子宮内膜症は閉経後には癌化をきたす場合があり、女性の一生を通じて生活の質（ＱｕａｌｉｔｙｏｆＬｉｆｅ）を著しく損なう疾患である。子宮内膜症の治療としては、ホルモン療法、外科的治療が挙げられる。しかしながら、従来の治療方法では、再発を繰り返す場合があり、また卵巣機能又は妊娠機能を残すことが出来ない場合があった。

脂肪組織に由来する再生細胞には、種々の疾患、障害への適用等の再生医療用途が期待されている。例えば、特許文献１には脂肪由来前駆細胞の分化方法が記載され、移植療法等に適用できるとされている。また、特許文献２では、脂肪組織由来再生細胞を含む不妊症の処置に用いられる医薬組成物が提案されている。

特開２００８−２７１９７１号公報特開２０１８−１７７６８７号公報

本発明は、子宮内膜症の症状を改善可能な医薬組成物及びその製造方法を提供することを目的とする。

前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りであり、本発明は以下の態様を包含する。第一態様は、脂肪組織由来再生細胞を含み、子宮内膜症の処置に用いられる医薬組成物である。医薬組成物は腹腔内投与又は静脈内投与に用いられてよい。腹腔内投与に用いられる医薬組成物は、グリコサミノグリカン及びその誘導体から選択される少なくとも１種を含んでいてよい。また医薬組成物は、脂肪組織由来の間葉系幹細胞を含んでいてよい。

第二態様は、脂肪組織を脱凝集剤で処理して脱凝集組織を得ることと、脱凝集組織から遠心分離処理により再生細胞を濃縮することと、濃縮される再生細胞を回収することとを含む、前記医薬組成物の製造方法である。脂肪組織は皮下組織に由来してよい。また製造方法は回収される再生細胞を培養することを更に含んでいてよい。

本発明によれば、子宮内膜症の症状を改善可能な医薬組成物及びその製造方法を提供することができる。

（Ａ）は子宮内膜症の病変個数の変化を示し、（Ｂ）は子宮内膜症の病変総重量の変化を示し、（Ｃ）は子宮内膜症の病変総表面積の変化を示す。（Ａ）は子宮内膜症の病変個数の変化を示し、（Ｂ）は子宮内膜症の病変重量の変化を示し、（Ｃ）は子宮内膜症の病変総表面積の変化を示す。（Ａ）は子宮内膜症の病変個数の変化を示し、（Ｂ）は子宮内膜症の病変重量の変化を示し、（Ｃ）は子宮内膜症の病変総表面積の変化を示す。（Ａ）は子宮内膜症の病変個数の変化を示し、（Ｂ）は子宮内膜症の病変重量の変化を示し、（Ｃ）は子宮内膜症の病変総表面積の変化を示す。

本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、医薬組成物及びその製造方法を例示するものであって、本発明は、以下に示す医薬組成物及びその製造方法に限定されない。

医薬組成物
子宮内膜症の処置に用いられる医薬組成物は、脂肪組織由来再生細胞（Adipose Tissue Derived Reproductive Cells：以下、「ＡＤＲＣｓ」ともいう）を含む。ＡＤＲＣｓには、例えば、炎症反応、間質反応等を改善する特性がある。この特性により、子宮内膜症を有する対象にＡＤＲＣｓを腹腔内投与又は静脈内投与することで、子宮内膜症病変を顕著に抑制することができると考えられる。

医薬組成物は子宮内膜症の処置に用いられる。本明細書において用いられる「処置」とは、子宮内膜症について施される何らかの処置であればよく、例えば、子宮内膜症の治療、改善、悪化の防止、予防等が挙げられる。

医薬組成物に用いられる脂肪組織由来再生細胞（ＡＤＲＣｓ）とは、脂肪組織から後述の方法により調製することができる再生細胞である。ＡＤＲＣｓは、例えば、Cytotherapy(2008), Vol.10, No.4, 417‐426、Japanese Journal of Transfusion and Cell Therapy, Vol.59, No.3 59(3):450―456, 2013等に記載されているように、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）、前駆細胞等の少なくとも１種を含み、血管内皮細胞、血管周皮細胞、コラーゲンなどの細胞外マトリックス等を更に含むものであってよい。ＡＤＲＣｓは、少なくとも脂肪由来幹細胞と、血管内皮細胞と、血管周皮細胞とを含んでいてよい。ここで、脂肪由来幹細胞には、例えば、脂肪組織由来の間葉系幹細胞（Ａｄ−ＭＳＣ）が含まれる。脂肪組織由来の間葉系幹細胞は、例えば、脂肪組織由来再生細胞を通常の培養条件で培養することで得ることができる。

医薬組成物が間葉系幹細胞を含む場合、医薬組成物に含まれる全細胞中の間葉系幹細胞の割合は、例えば、１％以上であってよく、好ましくは３％以上、１０％以上又は３０％以上であってよい。また、間葉系幹細胞の割合は、例えば、７０％以下であってよく、好ましくは５０％以下であってよい。

再生細胞が得られる脂肪組織は、生体のいずれの部位に存在するものであってもよく、皮下組織に存在する皮下脂肪であることが好ましい。皮下脂肪は生体のいずれの部位から採取されるものであってもよく、例えば、腰背部、大腿部等から採取してもよい。皮下脂肪には、比較的大きな脂肪細胞と小さい脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）が含まれ、血管、細胞外基質等も含まれる。皮下脂肪における脂肪細胞の存在率は、例えば２０％程度であり、脂肪由来幹細胞の存在率は、例えば１％から５％程度である。また血管は１５％から２０％程度含まれている。脂肪由来幹細胞は、心臓、骨格筋、骨・軟骨、血管などの様々な臓器に分化することができる。また、脂肪由来幹細胞は生理活性物質を分泌するともに、血管新生を誘導する作用を有していてよい。

医薬組成物に含まれるＡＤＲＣｓは、用時調製したものであってもよく、凍結保存したＡＤＲＣｓであってもよい。なお、ＡＤＲＣｓの凍結保存には、通常用いられる細胞の凍結保存条件を適用することができる。またＡＤＲＣｓは、投与対象から採取した脂肪組織から調製されたものであってもよく、投与対象とは異なる個体から採取した脂肪組織から調製されたものであってもよい。さらにＡＤＲＣｓは、投与対象とは異種の動物から採取した脂肪組織から調製されたものであってよい。

医薬組成物は、ＡＤＲＣｓに加えて、必要に応じて、薬学的に許容される賦形剤等のその他の成分を更に含んでいてもよい。その他の成分としては、薬学的に許容される賦形剤の他、界面活性剤、生理活性物質、安定化剤、液状媒体等を挙げることができる。その他の成分として具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等のグリコサミノグリカン及びその誘導体を挙げることができる。グリコサミノグリカン誘導体には、グリコサミノグリカンのナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩が含まれる。医薬組成物がグリコサミノグリカン又はその誘導体を含むことで、例えば医薬組成物の粘度が上昇し、腹腔内での滞留時間が長くなる。また液状媒体としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を挙げることができる。

ＡＤＲＣｓに加えてグリコサミノグリカン又はその誘導体を含む医薬組成物は、腹腔内投与に用いられてよく、腹腔内でゲル化するように投与されてよい。医薬組成物におけるグリコサミノグリカン又はその誘導体の含有率は、例えば、０．１質量％以上であってよく、好ましくは０．２質量％以上、０．３質量％以上又は０．４質量％以上であってよい。含有率の上限は、例えば５質量％以下であってよく、好ましくは３質量％以下、２質量％以下又は１質量％以下であってよい。

医薬組成物の形態は、子宮内膜症の処置として投与可能な製剤の形態である限りにおいて特に限定されない。医薬組成物の投与方法としては、例えば、有効量の医薬組成物を対象の腹腔内に投与する方法、有効量の医薬組成物を対象の静脈内に投与する方法等が挙げられる。腹腔内への投与は、例えば、１８から２２ゲージ針を用いて腹腔内に散布する方法を用いて行うことができる。また、静脈への投与は、静脈内に開口部を有して配置される注射針を通過させて行うことができる。

医薬組成物の製造方法
子宮内膜症の処置に用いられる医薬組成物の製造方法は、脂肪組織を脱凝集剤で処理して脱凝集組織を得ることと、脱凝集組織から遠心分離処理により再生細胞を濃縮することと、濃縮される再生細胞を回収することとを含む。

製造方法に用いられる脂肪組織は、例えば皮下組織から採取される。皮下組織から採取された脂肪組織は、生理食塩水、緩衝若しくは非緩衝電解質溶液等で洗浄処理されてもよい。脂肪組織は、脱凝集剤で処理されて脱凝集組織が得られる。脱凝集剤としては、例えば、中性プロテアーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ペプシン等を挙げることができ、中でもコラゲナーゼが好ましい。脱凝集剤は生理食塩水等の他の溶液と共に脂肪組織に添加されてもよい。脱凝集剤による処理は、例えば、３７℃またはその付近の温度で２０分から１２０分振とうして実施することができる。

脱凝集剤で処理されて得られる脱凝集組織から、遠心分離処理により再生細胞が濃縮される。遠心分離処理に先立ち脱凝集組織から非浮遊物成分を除去して、浮遊物層からなる画分を得ることが好ましい。浮遊物層からなる画分には再生細胞が含まれる。再生細胞を含む浮遊物層は、必要に応じて洗浄処理されてもよい。

遠心分離処理により濃縮された再生細胞は、常法により回収されて医薬組成物を構成する。上述した脂肪組織から再生細胞を回収する方法の詳細については、例えば、特開２０１２−５１９２３号公報、特開２０１２−７５４３９号公報、国際公開第２０１５／０４２１８２号、国際公開２００６／１２７００７号等を参照することができる。また、脂肪組織からの再生細胞の回収は、市販されているサイトリ（Ｃｙｔｏｒｉ）社製のセリューションシステム（ＣｅｌｕｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）を用いて実施してもよい。

医薬組成物の製造方法は、回収した再生細胞を培養する工程を含んでいてよい。再生細胞を培養することで、脂肪組織由来の間葉系幹細胞を含む医薬組成物が得られる。再生細胞の培養条件は、通常用いられる培養条件から適宜選択してよい。例えば、マウス由来再生細胞の場合はＭＥＭα／ＧｌｕｔａＭＡＸ培地等、ヒト由来再生細胞の場合はＫＢＭＡＤＳＣ−２培地等を用いて、５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で、６０％コンフルエント以上、好ましくは８０％又は９０％コンフルエントになるまで培養し、その後必要に応じて継代することができる。継代は、例えば５世代程度以下又は２世代程度以下としてよい。培養時間に関しては、細胞発育の状況に応じて１２時間以上から、前述の細胞発育状態になるまで継続とすることができる。

子宮内膜症の処置方法
子宮内膜症の処置方法は、対象の子宮内膜症を処置する方法であり、脂肪組織由来再生細胞（ＡＤＲＣｓ）を含む医薬組成物の有効量を、処置対象の腹腔内又は静脈内に投与することを含む。腹腔内又は静脈内に投与される医薬組成物に含まれる脂肪組織由来再生細胞により、子宮内膜症病変が改善される。子宮内膜症の処置方法は、子宮内膜症の症状の改善方法、治癒方法、予防方法等であってよい。

子宮内膜症の処置方法の対象となる動物は、哺乳動物であればよく、哺乳動物にはヒトが含まれる。有効量のＡＤＲＣｓは、対象となる動物種、個体の状態、投与形態等に応じて適宜選択すればよい。有効量のＡＤＲＣｓの細胞数は、例えばマウスの場合、１×１０^５から１×１０^７個とすることができ、ヒトの場合、１×１０^５から１×１０^７個とすることができる。

本発明は、別の態様として、子宮内膜症の処置に用いられる医薬組成物の製造における脂肪組織由来再生細胞（ＡＤＲＣｓ）の使用、子宮内膜症の処置に脂肪組織由来再生細胞（ＡＤＲＣｓ）の使用、子宮内膜症の処置に使用される脂肪組織由来再生細胞（ＡＤＲＣｓ）を包含する。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（参考例１）
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌、５週齢）の両肢の皮下から、マウス脂肪組織を採取した。採取した脂肪組織１ｇから２ｇに対して１０ｍｌの０．２％コラゲナーゼ溶液（Ｇｉｂｃｏ１７１００−０１７）を加えて脂肪組織を浸漬した状態で、はさみで細切りにした。細切りにした脂肪組織に０．２％コラゲナーゼ溶液２０ｍｌを加え、３７℃で１２０ｒｐｍ、１時間振とうした。その後セルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ社製、ＲＥＦ３５２３６０）で濾過し、濾液を４００Ｇで５分間遠心処理した。上清を除去し、得られたペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１０ｍｌに懸濁して４００Ｇで５分間遠心処理することを３回繰り返して細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットをマウスＡＤＲＣｓとした。

（参考例２）
参考例１で得られたマウスＡＤＲＣｓをＭＥＭα／ＧｌｕｔａＭＡＸ培地（Ｇｉｂｃｏ３２５６１−０３７，ＦＢＳ（２０％）および抗生剤（１％）添加)を用いて、５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で２４時間、細胞培養した。上清を除去し、残存した接着細胞をＭＥＭα／ＧｌｕｔａＭＡＸ培地で８０％コンフルエントになるまで培養した。その後０．５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ１５４００−０５４）を用いて細胞を剥離し、継代した。同様に継代を繰り返し、２回継代したものをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１０ｍｌに懸濁して４００Ｇで５分間遠心処理をして細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットを脂肪組織由来の間葉系幹細胞（Ａｄ−ＭＳＣ）とした。

（参考例３）
子宮内膜症マウスモデルの作製
子宮内膜症マウスモデルは、卵巣が摘出除去されホルモン周期が同調されたドナーマウスとレシピエントマウスを準備し、ドナーマウスから取り出した子宮組織をレシピエントマウスの腹腔内に移植することで作製した。具体的には、以下の通りである。ドナーマウス及びレシピエントマウスとして６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスのメスを準備し、それぞれから卵巣を摘出した。卵巣摘出後及び卵巣摘出から１週間後にエストラジオールを１００μｇ／ｋｇ／週で投与した。卵巣摘出から２週間後にドナーマウスから子宮を摘出し、結合組織及び卵管を除去した。摘出した子宮を片刃剃刀で１ｍｍ^２以下に細砕して２つに分割し、それぞれにＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）及びＡｎｔｉ−Ａｎｔｉ（Ｇｉｂｃｏ）を含むメディウムを加えて混和して０．６ｍＬの子宮組織液をそれぞれ得た。０．６ｍＬの子宮組織液をレシピエントマウスの腹腔内に移植することで、子宮内膜症マウスモデルを作製した。なお、作製したモデルマウスは、エストラジオールを１００μｇ／ｋｇ／週で週に１回投与し続けながら飼育した。

（試験例１）
作製した子宮内膜症マウスモデルに、子宮組織を移植してから２４時間後に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２ｍＬ、又はＡＤＲＣｓ（細胞数１×１０^６個／匹）を含むＰＢＳ２ｍＬを投与した。その後、マウスの飼育を、エストラジオールを１００μｇ／ｋｇ／週で週に１回投与し続けながら４週間継続した。その後、腹腔内をＰＢＳ５ｍＬで洗浄し、腹水を氷結保存した。また、腹腔内の子宮内膜症病変をホルマリン及びＲＮＡレーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて保存した。腹腔内における子宮内膜症病変の個数、表面積及び重量を測定した。病変個数を図１（Ａ）に、病変総重量を図１（Ｂ）に、病変総表面積を図１（Ｃ）に示す。なお、統計的有意差は、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定により検定した。

図１（Ａ）から（Ｃ）に示されるように、ＰＢＳを投与した対照群に比べて、ＡＤＲＣｓ投与群では、病変の個数、病変総表面積及び病変総重量が有意に低下した。

（試験例２）
作製した子宮内膜症マウスモデルに、子宮組織を移植してから２４時間後に、対象群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２ｍＬを投与し、投与群１（Ａｄ−ＭＳＣＳｉｎｇｌｅ）及び投与群２（Ａｄ−ＭＳＣＷｅｅｋｌｙ）にはＡｄ−ＭＳＣ（細胞数１×１０^６個／匹）を含むＰＢＳ１ｍＬと１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液（生化学工業＃Ｄ０３３５４）１ｍＬを混和したものを投与した。また、投与群２（Ａｄ−ＭＳＣＷｅｅｋｌｙ）には、子宮組織を移植してから、１週間後、２週間後及び３週間後にもＡｄ−ＭＳＣとヒアルロン酸ナトリウム溶液を混和したものを投与した。マウスの飼育を、エストラジオールを１００μｇ／ｋｇ／週で週に１回投与し続けながら４週間継続した。その後、上記と同様にして、腹腔内における子宮内膜症病変の個数、重量及び表面積を測定した。病変個数を図２（Ａ）に、病変総重量を図２（Ｂ）に、病変総表面積を図２（Ｃ）に示す。

図２（Ａ）から（Ｃ）に示されるように、ＰＢＳを投与した対照群に比べて、投与群１及び投与群２では、病変の個数、病変総重量及び病変総表面積が有意に低下した。

（試験例３）
作製した子宮内膜症マウスモデルに、子宮組織を移植してから２４時間後に以下のようにＰＢＳ又は組成物を投与した。対象群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２ｍＬを腹腔内投与した。投与群１（Ａｄ−ＭＳＣｉ．ｐ．）にはＡｄ−ＭＳＣ（細胞数１×１０^６個／匹）を含むＰＢＳ１ｍＬと１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液（生化学工業＃Ｄ０３３５４）１ｍＬを混和したものを腹腔内投与した。投与群２（Ａｄ−ＭＳＣｉ．ｖ．）にはＡｄ−ＭＳＣ（細胞数１×１０^６個／匹）を含むＰＢＳ０．５ｍＬを静脈内投与した。マウスの飼育を、エストラジオールを１００μｇ／ｋｇ／週で週に１回投与し続けながら４週間継続した。その後、上記と同様にして、腹腔内における子宮内膜症病変の個数、重量及び表面積を測定した。病変個数を図３（Ａ）に、病変総重量を図３（Ｂ）に、病変総表面積を図３（Ｃ）に示す。

図３（Ａ）から（Ｃ）に示されるように、ＰＢＳを投与した対照群に比べて、投与群１及び投与群２では、病変の個数、病変総重量及び病変総表面積が有意に低下した。

（試験例４）
作製した子宮内膜症マウスモデルに、子宮組織を移植してから２４時間後に以下のようにＰＢＳ又は組成物を投与した。対象群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２ｍＬを腹腔内投与した。ＨＡ投与群（ＨＡｉ．ｐ．）にはＰＢＳ１ｍＬと１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液（生化学工業＃Ｄ０３３５４）１ｍＬを混和したものを腹腔内投与した。ＡＤＲＣｓ投与群（ＡＤＲＣｓｉ．ｐ．）にはＡＤＲＣｓ（細胞数１×１０^６個／匹）を含むＰＢＳ１ｍＬと１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液１ｍＬを混和したものを腹腔内投与した。ＡＳＣ投与群１（Ａｄ−ＭＳＣｉ．ｐ．）にはＡｄ−ＭＳＣ（細胞数１×１０^６個／匹）を含むＰＢＳ２ｍＬ腹腔内投与した。ＡＳＣ投与群２（Ａｄ−ＭＳＣｐｌｕｓＨＡｉ．ｐ．）にはＡｄ−ＭＳＣ（細胞数１×１０^６個／匹）を含むＰＢＳ１ｍＬと１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液１ｍＬを混和したものを腹腔内投与した。ＡＳＣ投与群３（Ａｄ−ＭＳＣｉ．ｖ．）にはＡｄ−ＭＳＣ（細胞数１×１０^６個／匹）を含むＰＢＳ０．５ｍＬを静脈内投与した。マウスの飼育を、エストラジオールを１００μｇ／ｋｇ／週で週に１回投与し続けながら４週間継続した。その後、上記と同様にして、腹腔内における子宮内膜症病変の個数、重量及び表面積を測定した。病変個数を図４（Ａ）に、病変総重量を図４（Ｂ）に、病変総表面積を図４（Ｃ）に示す。

図４（Ａ）から（Ｃ）に示されるように、ＰＢＳを投与した対照群及びヒアルロン酸のみを腹腔内投与したＨＡ投与群に比べて、ＡＤＲＣｓまたはＡｄ−ＭＳＣを含む組成物を投与した投与群では、病変の個数、病変総重量及び病変総表面積が低下した。

Claims

脂肪組織由来再生細胞を含み、子宮内膜症の処置に用いられる医薬組成物。
腹腔内投与に用いられる請求項１に記載の医薬組成物。
グリコサミノグリカン及びその誘導体から選択される少なくとも１種を含む請求項２に記載の医薬組成物。
静脈内投与に用いられる請求項１に記載の医薬組成物。
脂肪組織由来の間葉系幹細胞を含む請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
脂肪組織を脱凝集剤で処理して脱凝集組織を得ることと、脱凝集組織から遠心分離処理により再生細胞を濃縮することと、濃縮される再生細胞を回収することとを含む請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の医薬組成物の製造方法。
前記脂肪組織は、皮下組織に由来する請求項６に記載の製造方法。
回収される再生細胞を培養することを更に含む請求項６又は請求項７に記載の製造方法。