JP7150604B2 - 無血清合成のためのｗｎｔ組成物及び方法 - Google Patents

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Description

Ｗｎｔタンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄによりコードされる細胞表面受容体及び低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に結合する、高度に保存された分泌性シグナル伝達分子ファミリーを形成する。ＷＮＴ遺伝子ファミリーは、分泌性シグナル伝達タンパク質をコードする構造的に関連した遺伝子からなる。これらのタンパク質は、細胞運命の制御及び胚形成時のパターン形成など、腫瘍形成及び幾つかの発生過程に関与することが示唆されている。一旦結合すると、リガンドにより細胞内の各事象のカスケードが開始され、これにより最終的にβ－カテニンとＤＮＡ結合タンパク質ＴＣＦとの核内活性を介して標的遺伝子の転写がもたらされる（Ｃｌｅｖｅｒｓ Ｈ，２００４ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：Ｉｇ－ｎｏｒｒｉｎ ｔｈｅ ｄｏｇｍａ．Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １４：Ｒ４３６－Ｒ４３７；Ｎｅｌｓｏｎ＆Ｎｕｓｓｅ ２００４ Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｗｎｔ，ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ，ａｎｄ ｃａｄｈｅｒｉｎ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：１４８３－１４８７；Ｇｏｒｄｏｎ＆Ｎｕｓｓｅ ２００６ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐａｔｈｗａｙｓ，ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｒｎ ２８１：２２４２９－２２４３３）。
Ｗｎｔはまた、骨形成プログラムに関連する多種多様な細胞意志決定にも関与している。例えば、Ｗｎｔはｓｏｘ９の発現レベルを調節し、間葉系前駆細胞から骨形成運命への系統分化に影響を与える。Ｗｎｔは、破骨細胞または軟骨細胞のいずれかへの細胞分化に影響を与える。成体動物では、Ｗｎｔシグナル伝達が骨量を調節するという豊富な証拠がある。例えば、ヒトＷｎｔ共受容体ＬＲＰ５における変異は、骨粗鬆症Ｉ型、及び骨内膜骨化過剰症または常染色体優性骨硬化症など、幾つかの高骨量症候群、ならびに骨量減少疾患、骨粗鬆症－偽性神経膠腫に関連している。Ｗｎｔ阻害因子Ｄｋｋｌの高産生は、骨吸収の増加が鑑別時の１つの特徴である多発性骨髄腫に関連している。
ある実施形態では、最小血清条件（例えば、無血清条件）下で生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドを作製する方法及び培養系を本明細書で開示する。ある実施形態では、生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドを最小血清培地（例えば、無血清培地）に分泌するように遺伝子操作された細胞を含む組成物も本明細書で開示する。
ある実施形態では、最小血清条件下で生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドを作製するインビトロ法を本明細書で開示し、かかる方法は、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトした遺伝子操作細胞株から最小血清条件下で細胞を培養すること、及びかかる培地から分泌されたＷｎｔポリペプチドを最小血清条件下で回収することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞株は、ｃＧＭＰに適合する細胞株である。いくつかの実施形態では、ｃＧＭＰに適合する細胞株は、ｃＧＭＰに適合する哺乳類細胞株である。いくつかの実施形態では、ｃＧＭＰに適合する哺乳類細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞株、またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株である。いくつかの実施形態では、ｃＧＭＰに適合する細胞株は、ｃＧＭＰに適合する昆虫細胞株である。いくつかの実施形態では、ｃＧＭＰに適合する昆虫細胞株は、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１細胞株、Ｔｎ－３６８細胞株、またはＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）細胞株である。いくつかの実施形態では、細胞を接着培養または浮遊培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を最高２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、または１５日間増殖させ、それから分泌されたＷｎｔポリペプチドを培地から回収する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ｃＧＭＰに適合するベクターである。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、哺乳類のベクターである。いくつかの実施形態では、哺乳類のベクターは、ＯｐｔｉｃＶｅｃ、ｐＴａｒｇｅｔ、ｐｃＤＮＡ４ＴＯ４、ｐｃＤＮＡ４．０、ＵＣＯＥ発現ベクター、またはＧＳ系発現ベクターである。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、昆虫細胞発現ベクターである。いくつかの実施形態では、昆虫細胞発現ベクターは、ｐＩＥｘベクターまたはｐＢｉＥｘベクターである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、異種シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、天然シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ｂポリペプチド、またはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号１に対する約９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、約１～約３３個のアミノ酸切断を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、切断はＣ末端切断である。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号１のＣ末端が切断されているポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号２に対する約９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号２からなるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で培地中に分泌される。いくつかの実施形態では、最小血清条件は、血清低減培地、タンパク質不含培地、合成培地、または無血清培地を含む。いくつかの実施形態では、最小血清条件は、動物由来成分不含培地を含む。いくつかの実施形態では、最小血清条件は、非ヒト血清を実質的に含まない培地を含む。いくつかの実施形態では、最小血清条件は、非ヒトタンパク質を実質的に含まない培地を含む。いくつかの実施形態では、最小血清条件は、血清が約９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、または０．５％未満である培地を含む。いくつかの実施形態では、最小血清条件は、血清が０％である培地を含む。いくつかの実施形態では、血清はウシ胎児血清である。いくつかの実施形態では、培地は、血清代替物をさらに含む。いくつかの実施形態では、血清代替物は、ＣｅｌｌＥｓｓ、ＩＴＳ（例えば、ＩＴＳ３またはＩＴＳ３＋）、Ｅｘｃｙｔｅ、ＯｎｅＳｈｏｔ、またはＫｎｏｃｋｏｕｔを含む。いくつかの実施形態では、培地は、外来性物質を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、外来性物質は、病原体、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）病原体、またはその組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、方法は、イオン交換法、疎水性精製法、または親和性精製法を利用するＷｎｔポリペプチドの精製をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、精製Ｗｎｔポリペプチドをリポソームを用いて製剤化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、精製Ｗｎｔポリペプチドを薬学的に許容される添加物を用いて製剤化することをさらに含む。生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドは、上述のインビトロ法によって作製される。
ある実施形態では、最小血清培地、最小血清培地中に分泌される生物学的に活性なＷｎｔポリペプチド、及び生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトした遺伝子操作細胞株から得られる細胞を含み、ここで、かかる細胞を最小血清培地の存在下で増殖させる、Ｗｎｔ培養系を本明細書で開示する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞株は、ｃＧＭＰに適合する細胞株である。いくつかの実施形態では、ｃＧＭＰに適合する細胞株は、ｃＧＭＰに適合する哺乳類細胞株である。いくつかの実施形態では、ｃＧＭＰに適合する哺乳類細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞株、またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株である。いくつかの実施形態では、ｃＧＭＰに適合する細胞株は、ｃＧＭＰに適合する昆虫細胞株である。いくつかの実施形態では、ｃＧＭＰに適合する昆虫細胞株は、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１細胞株、Ｔｎ－３６８細胞株、またはＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）細胞株である。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ｃＧＭＰに適合するベクターである。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、哺乳類のベクターである。いくつかの実施形態では、哺乳類のベクターは、ＯｐｔｉｃＶｅｃ、ｐＴａｒｇｅｔ、ｐｃＤＮＡ４ＴＯ４、ｐｃＤＮＡ４．０、ＵＣＯＥ発現ベクター、またはＧＳ系発現ベクターである。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、昆虫細胞発現ベクターである。いくつかの実施形態では、昆虫細胞発現ベクターは、ｐＩＥｘベクターまたはｐＢｉＥｘベクターである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、異種シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、天然シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ｂポリペプチド、またはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号１に対する約９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、約１～約３３個のアミノ酸切断を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、切断はＣ末端切断である。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号１のＣ末端が切断されているポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号２に対する約９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号２からなるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、分泌された生物学的に活性なＷｎｔ３Ａポリペプチドの濃度は培地中少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、培地は、約２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、または１５日経過したものである。いくつかの実施形態では、培地は、血清低減培地、タンパク質不含培地、合成培地、または無血清培地である。いくつかの実施形態では、培地は、動物由来成分不含培地である。いくつかの実施形態では、培地は、非ヒト血清を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培地は、非ヒトタンパク質を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培地は、血清を約９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、または０．５％未満含む。いくつかの実施形態では、培地は、血清を０％含む。いくつかの実施形態では、血清はウシ胎児血清である。いくつかの実施形態では、培地は、血清代替物をさらに含む。いくつかの実施形態では、血清代替物は、ＣｅｌｌＥｓｓ、ＩＴＳ、Ｅｘｃｙｔｅ、ＯｎｅＳｈｏｔ、またはＫｎｏｃｋｏｕｔを含む。いくつかの実施形態では、培地は、外来性物質を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、外来性物質は、病原体、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）病原体、またはその組み合わせを含む。
ある実施形態では、最小血清培地、最小血清培地中に分泌される生物学的に活性なＷｎｔポリペプチド、及び生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトした遺伝子操作細胞株から得られる細胞を含む培地であって、ここで、かかる細胞を最小血清培地の存在下で増殖させることを含む培地を本明細書で開示する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞株は、ｃＧＭＰに適合する細胞株である。いくつかの実施形態では、ｃＧＭＰに適合する細胞株は、ｃＧＭＰに適合する哺乳類細胞株である。いくつかの実施形態では、ｃＧＭＰに適合する哺乳類細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞株、またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株である。いくつかの実施形態では、ｃＧＭＰに適合する細胞株は、ｃＧＭＰに適合する昆虫細胞株である。いくつかの実施形態では、ｃＧＭＰに適合する昆虫細胞株は、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１細胞株、Ｔｎ－３６８細胞株、またはＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）細胞株である。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ｃＧＭＰに適合するベクターである。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、哺乳類のベクターである。いくつかの実施形態では、哺乳類のベクターは、ＯｐｔｉｃＶｅｃ、ｐＴａｒｇｅｔ、ｐｃＤＮＡ４ＴＯ４、ｐｃＤＮＡ４．０、ＵＣＯＥ発現ベクター、またはＧＳ系発現ベクターである。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、昆虫細胞発現ベクターである。いくつかの実施形態では、昆虫細胞発現ベクターは、ｐＩＥｘベクターまたはｐＢｉＥｘベクターである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、異種シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、天然シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ｂポリペプチド、またはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号１に対する約９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、約１～約３３個のアミノ酸切断を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、切断はＣ末端切断である。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号１のＣ末端が切断されているポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号２に対する約９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号２からなるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、分泌された生物学的に活性なＷｎｔ３Ａポリペプチドの濃度は培地中少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、培地は、約２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、または１５日経過したものである。いくつかの実施形態では、培地は、血清低減培地、タンパク質不含培地、合成培地、または無血清培地である。いくつかの実施形態では、培地は、動物由来成分不含培地である。いくつかの実施形態では、培地は、非ヒト血清を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培地は、非ヒトタンパク質を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培地は、血清を約９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、または０．５％未満含む。いくつかの実施形態では、培地は、血清を０％含む。いくつかの実施形態では、血清はウシ胎児血清である。いくつかの実施形態では、培地は、血清代替物をさらに含む。いくつかの実施形態では、血清代替物は、ＣｅｌｌＥｓｓ、ＩＴＳ、Ｅｘｃｙｔｅ、ＯｎｅＳｈｏｔ、またはＫｎｏｃｋｏｕｔを含む。いくつかの実施形態では、培地は、外来性物質を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、外来性物質は、病原体、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）病原体、またはその組み合わせを含む。
ある実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドの調製方法を本明細書で開示し、かかる方法は、（ａ）単離されたＷｎｔポリペプチドを複数のシャペロンと共にインキュベートしてＷｎｔポリペプチド－シャペロン複合体を作製すること、（ｂ）Ｗｎｔポリペプチド－シャペロン複合体と非複合体化シャペロンとを分離すること、及び（ｃ）Ｗｎｔポリペプチド－シャペロン複合体をリポソーム水溶液と接触させてリポソームＷｎｔポリペプチドを作製することを含む。いくつかの実施形態では、複数のシャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄ－８を含む。いくつかの実施形態では、複数のシャペロンの各シャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は切断型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、切断型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８タンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８のシステインリッチ領域（ＣＲＤ）を含む。いくつかの実施形態では、切断型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８タンパク質は、配列番号４のアミノ酸残基２５からアミノ酸残基１７２に及ぶ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、ＩｇＧ Ｆｃ部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、配列番号５に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも１０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、またはそれ以上インキュベートする。いくつかの実施形態では、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを温度約１℃～約３０℃でインキュベートする。いくつかの実施形態では、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを温度約１℃～約１０℃、約１℃～約８℃、または約１℃～約４℃でインキュベートする。いくつかの実施形態では、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを温度約１０℃～約３０℃、約１５℃～約３０℃、約２０℃～約３０℃、約２３℃～約３０℃、または約２５℃～約３０℃でインキュベートする。いくつかの実施形態では、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも１℃、２℃、４℃、８℃、１０℃、２０℃、２３℃、２５℃または３０℃の温度でインキュベートする。いくつかの実施形態では、複数のシャペロンの各々をビーズにさらに固定化する。いくつかの実施形態では、複数のシャペロンの各々をさらにビーズに間接的に固定化し、ここで、各シャペロンは抗体のＦｃ部分を認識するポリペプチドに結合しており、かつポリペプチドはビーズに固定化されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはタンパク質Ａである。いくつかの実施形態では、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとをＷｎｔポリペプチド：シャペロン比を約１：０．５、１：１、１：１．５、１：２、１：２．５、１：３、１：４、または約１：５にしてインキュベートする。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとをＷｎｔポリペプチド：シャペロン比を約１：２．５にしてインキュベートする。いくつかの実施形態では、ステップｂ）での分離は、ｐＨ約３．０を含む緩衝液を用いて単離Ｗｎｔポリペプチド－シャペロン複合体を溶出させることを含む。いくつかの実施形態では、リポソームに含まれるリン脂質は、尾部の炭素鎖長が約１２炭素～約１４炭素である。いくつかの実施形態では、リポソームは、ｐＨ約６．５～約８．０、ｐＨ約７．０～約７．８、またはｐＨ約７．２～約７．６における正味電荷が０である。いくつかの実施形態では、リン脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）である。いくつかの実施形態では、リポソームは、コレステロールをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＰＣとコレステロールとの濃度は約７０：３０～約１００：０の比で定義される。いくつかの実施形態では、ステップａ）でのインキュベーションは、本明細書に記載するＷｎｔ培養系から単離Ｗｎｔポリペプチドを採取することをさらに含む。いくつかの実施形態では、単離されたＷｎｔポリペプチドは、単離されたＷｎｔ５Ｂポリペプチドまたは単離されたＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。いくつかの実施形態では、単離されたＷｎｔポリペプチドは、単離されたＷｎｔ３Ａポリペプチドである。
ある実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドの精製方法を本明細書で開示し、かかる方法は、（ａ）リポソームＷｎｔポリペプチドを複数のシャペロンと共にインキュベートしてリポソームＷｎｔポリペプチド－シャペロン複合体を形成させること、（ｂ）リポソームＷｎｔポリペプチド－シャペロン複合体と非複合体化シャペロンとを分離すること、及び（ｃ）リポソームＷｎｔポリペプチド－シャペロン複合体からリポソームＷｎｔポリペプチドを溶出させて精製リポソームＷｎｔポリペプチドを作製することを含む。いくつかの実施形態では、複数のシャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄ－８を含む。いくつかの実施形態では、複数のシャペロンの各シャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は切断型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、切断型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８タンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８のシステインリッチ領域（ＣＲＤ）を含む。いくつかの実施形態では、切断型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８タンパク質は、配列番号４のアミノ酸残基２５からアミノ酸残基１７２に及ぶ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、ＩｇＧ Ｆｃ部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、配列番号５に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、複数のシャペロンは、低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質６（Ｌｒｐ６）を含む。いくつかの実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも１０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、またはそれ以上インキュベートする。いくつかの実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを温度約１℃～約３０℃でインキュベートする。いくつかの実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを温度約１℃～約１０℃、約１℃～約８℃、または約１℃～約４℃でインキュベートする。いくつかの実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを温度約１０℃～約３０℃、約１５℃～約３０℃、約２０℃～約３０℃、約２３℃～約３０℃、または約２５℃～約３０℃でインキュベートする。いくつかの実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも１℃、２℃、４℃、８℃、１０℃、２０℃、２３℃、２５℃、または３０℃の温度でインキュベートする。いくつかの実施形態では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質をさらにビーズに固定化する。いくつかの実施形態では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質をさらにビーズに間接的に固定化し、ここで、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質はＦｃ部分を認識するポリペプチドに結合しており、かつポリペプチドはビーズに固定化されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはタンパク質Ａである。いくつかの実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを、Ｗｎｔポリペプチド：シャペロン比を約１：０．５、１：１、１：１．５、１：２、１：２．５、１：３、１：４、または約１：５にしてインキュベートする。いくつかの実施形態では、ステップｂ）での分離はリポソームＷｎｔポリペプチド－シャペロン複合体を緩衝液で溶出させることを含み、ここで、緩衝液は任意選択でｐＨ約３．０を含む。いくつかの実施形態では、リポソームに含まれるリン脂質は、尾部の炭素鎖長が約１２炭素～約１４炭素である。いくつかの実施形態では、リポソームは、ｐＨ約６．５～約８．０、ｐＨ約７．０～約７．８、またはｐＨ約７．２～約７．６における正味電荷が０である。いくつかの実施形態では、リン脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）である。いくつかの実施形態では、リポソームは、コレステロールをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＰＣとコレステロールとの濃度は約７０：３０～約１００：０の比で定義される。いくつかの実施形態では、ステップａ）でのインキュベーションは、本明細書に記載するＷｎｔ培養系から得られる単離Ｗｎｔポリペプチドをリポソーム水溶液と接触させてリポソームＷｎｔポリペプチドを作製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、単離されたＷｎｔポリペプチドは、単離されたＷｎｔ５Ｂポリペプチドまたは単離されたＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。いくつかの実施形態では、単離されたＷｎｔポリペプチドは、単離されたＷｎｔ３Ａポリペプチドである。
さらなる態様及び実施形態は、本開示の以降の記載から明らかとなり、それらは本発明に含まれる。
血清代替物Ｅｘｃｙｔｅの存在下、及び血清濃度低下に伴うＷｎｔ３Ａ活性を示す。配列番号１に記載のタンパク質配列をコードする発現ベクターからＷｎｔポリペプチドを得る。血清５％＋ｅｘｃｙｔｅ（青色破線棒）、血清３％＋ｅｘｃｙｔｅ（赤色破線棒）及び血清２％＋ｅｘｃｙｔｅ（紫色破線棒）に馴化させた細胞の条件培地におけるＷＮＴ３ａ活性を、デュアルライトレポーターアッセイを使用して分析した。この活性を、ｅｘｃｙｔｅ無添加の血清５％（青色中塗り棒）、血清３％（赤色中塗り棒）及び血清２％（紫色中塗り棒）に馴化させた細胞の条件培地における活性と比較した。血清１０％（橙色棒）で増殖させた細胞の条件培地を陽性対照として使用した。１０％ＦＢＳと比べると、血清２％及び血清２％＋ｅｘｃｙｔｅに馴化させた細胞の条件培地の活性は６．４％に低下した。血清濃度を低下させると条件培地におけるＷｎｔ３Ａ活性が低下した。Ｅｘｃｙｔｅを添加しても条件培地におけるＷｎｔ３Ａ活性に対する影響はなかった。 血清代替物ＣｅｌｌＥｓｓの存在下、及び血清濃度低下に伴うＷｎｔ３Ａ活性を示す。配列番号１に記載のタンパク質配列をコードする発現ベクターからＷｎｔ３Ａポリペプチドを得る。Ｅｘｃｙｔｅ添加血清７．５％及びＥｘｃｙｔｅ添加血清５％に馴化させた細胞の条件培地におけるＷｎｔ３Ａ活性を、デュアルライトレポーターアッセイを使用して分析した。この活性を、血清１０％で増殖させた細胞の条件培地におけるＷｎｔ３Ａ活性と比較した。培地にＣｅｌｌＥｓｓを存在させても条件培地におけるＷｎｔ３Ａ活性を回復させることはできなかった。 配列番号１に記載のタンパク質配列をコードする発現ベクターから得られるＷｎｔ３Ａ活性を示す。細胞をまずチャコール処理済みｏｎｅ ｓｈｏｔ ＦＢＳ（ＯＳ ＦＢＳ）に馴化させた。ＯＳＦＢＳに馴化させた細胞の条件培地では検出可能な活性は測定されなかった。ＯＳＦＢＳへの馴化の後、ＯＳＦＢＳにＩＴＳ３または脂質ミックス１のいずれかを添加した。条件培地におけるＷＮＴ３Ａ活性をＬＳＬデュアルライトレポーターアッセイを使用して試験した。ＯＳＦＢＳ＋ＩＴＳ試料に馴化させた細胞の条件培地は、陽性対照（１０％ＦＢＳ）と比べて約１０％の活性を示した。ＯＳＦＢＳ＋脂質ミックスの試料に馴化させた細胞の条件培地は、陽性対照である１０％ＦＢＳと比べて２６％の活性を示した。 異なる血清条件下の細胞によるＷｎｔ３Ａポリペプチドの分泌を示す。血清を１０％、１％及び０％含有する各条件で細胞を増殖させた。細胞を誘導し、条件培地を５日間にわたって回収した（２日目、３日目及び５日目）。 Ａは、無血清条件下、ＣＨＯ細胞によって分泌されたＷｎｔ３Ａの活性を示す。ＬＳＬレポーターアッセイを示している。Ｂは、無血清条件下、ＣＨＯ細胞によって分泌されたＷｎｔ３Ａの活性を示す。Ｗｎｔ３Ａの存在を検出するウェスタンブロット法を示している。 無血清条件下で増殖させた安定してトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｓ細胞株によるＷｎｔ３Ａ活性を示す。 本明細書に記載するシャペロンを用いてＷｎｔポリペプチドを精製する図式を示す。 Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質とタンパク質Ａを固定化したビーズとの事前複合体化を表す図式を示す。 Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８－Ｆｃとタンパク質Ａとの比が異なる２例での複合体化を表すウェスタンブロットを示す。 Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質－タンパク質Ａによる方法を使用して精製したＷｎｔ３Ａを表すウェスタンブロットを示す。 Ａは、Ｗｎｔ３Ａへの結合を競合するＦｚ８とリポソームとを示す。リポソームとＷｎｔ３Ａとを室温で６時間インキュベートした後、超遠心分離にかけてＬ－Ｗｎｔ３Ａを作製したことを示している。その後、こうして予備形成されたＬ－Ｗｎｔ３ＡをＦｚ８と共に室温で６時間インキュベートし、その後、超遠心分離にかけてリポソーム会合タンパク質と非会合タンパク質とを分離した。免疫ブロット法により、ほとんど全てのＦｚ８（９８．６％）は上清中にあり、Ｗｎｔ３Ａはリポソームのペレットでしか検出されなかったことが示されている。データは、独立した少なくとも３連から得た平均±ＳＥＭ、または独立した少なくとも３連の代表データである。Ｂは、Ｗｎｔ３Ａへの結合を競合するＦｚ８とリポソームとを示す。Ｆｚ８とＷｎｔ３Ａとを４℃で２４時間プレインキュベートし、その後、このＦｚ８－Ｗｎｔ３Ａ溶液をリポソームと共に室温で６時間インキュベートした後、超遠心分離にかけた結果を示している。これらの条件下、Ｆｚ８は依然上清中にある（９９．６％）ことが認められるが、大部分のＷｎｔ３Ａ（９３．０％）は上清中でＦｚ８と共局在することが認められる。データは、独立した少なくとも３連から得た平均±ＳＥＭ、または独立した少なくとも３連の代表データである。Ｃは、Ｗｎｔ３Ａへの結合を競合するＦｚ８とリポソームとを示す。Ｗｎｔ３Ａ、Ｆｚ８、及びリポソームを合わせて室温で６時間インキュベートした後、超遠心分離にかけた結果を示している。Ｆｚ８は依然上清中にある（９１．８％）ことが認められるが、Ｗｎｔ３Ａは６２．１％がリポソームのペレット中に、また３７．９％が上清中に分配されている。データは、独立した少なくとも３連から得た平均±ＳＥＭ、または少なくとも３つの独立した複製試料の代表データである。 Ａは、異なる３つの条件下でのヒトＷｎｔ３Ａ、マウスＦｚ８、及びリポソームのインキュベーションを示す。リポソームとＷｎｔ３Ａとを室温で１２時間インキュベートした後、超遠心分離にかけてＬ－Ｗｎｔ３Ａを作製したことを示している。その後、こうして予備形成されたＬ－Ｗｎｔ３ＡをＦｚ８と共に室温で６時間インキュベートし、その後、超遠心分離にかけてリポソーム会合タンパク質と非会合タンパク質とを分離した。免疫ブロット法により、約９４．５％のＦｚ８は上清中にあるが、約８８．７％のＷｎｔ３Ａはリポソームのペレット中で検出されたことが示された。データは、少なくとも３連から得た平均±ＳＥＭ、または独立した少なくとも３連の代表データである。Ｂは、異なる３つの条件下でのヒトＷｎｔ３Ａ、マウスＦｚ８、及びリポソームのインキュベーションを示す。Ｆｚ８及びＷｎｔ３Ａを４℃で２４時間プレインキュベートし、その後、このＦｚ８－Ｗｎｔ３Ａ溶液をリポソームと共に室温で１２時間インキュベートした後、超遠心分離にかけた結果を示した。これらの条件下、大部分のＦｚ８は依然上清中にある（７２．８％）ことが認められるが、大部分のＷｎｔ３Ａ（６５．７％）は上清中でＦｚ８と共局在することが認められる。データは、少なくとも３連から得た平均±ＳＥＭ、または独立した少なくとも３連の代表データである。Ｃは、異なる３つの条件下でのヒトＷｎｔ３Ａ、マウスＦｚ８、及びリポソームのインキュベーションを示す。Ｗｎｔ３Ａ、Ｆｚ８、及びリポソームを室温で１２時間インキュベートした後、超遠心分離にかけた結果を示した。Ｆｚ８は依然上清中にある（９４．０％）ことが認められるが、Ｗｎｔ３Ａは２９．９％がリポソームのペレット中に、また７０．１％は上清中に分配されることが認められる。データは、少なくとも３連から得た平均±ＳＥＭ、または独立した少なくとも３連の代表データである。 Ａは、Ｗｎｔ３Ａ、ＬＲＰ６、及びリポソームの結合複合体を示す。リポソームとＷｎｔ３Ａとを室温で６時間インキュベートした後、超遠心分離にかけてＬ－Ｗｎｔ３Ａを作製したことを示している。その後、こうして予備形成されたＬ－Ｗｎｔ３ＡをＬＲＰ６と共に室温で６時間インキュベートし、その後、超遠心分離にかけてリポソーム会合タンパク質と非会合タンパク質とを分離した。免疫ブロット法により、ＬＲＰ６は６１．７％がペレット中に、また３８．３％が上清中に分配されるが、Ｗｎｔ３Ａはリポソームのペレットで検出されることが示されている。データは、独立した少なくとも３連から得た平均±ＳＥＭ、または独立した少なくとも３連の代表データである。Ｂは、Ｗｎｔ３Ａ、ＬＲＰ６、及びリポソームの結合複合体を示す。ＬＲＰ６とＷｎｔ３Ａとを４℃で２４時間プレインキュベートし、その後、このＬＲＰ６－Ｗｎｔ３Ａ溶液をリポソームと共に室温で６時間インキュベートした後、超遠心分離にかけた結果を示している。これらの条件下、ほとんどすべてのＬＲＰ６（９６．２％）は依然上清中にあることが認められ、Ｗｎｔ３Ａは６５．９％がペレット中に、また３４．１％が上清中に分配されることが認められる。データは、独立した少なくとも３連から得た平均±ＳＥＭ、または独立した少なくとも３連の代表データである。Ｃは、Ｗｎｔ３Ａ、ＬＲＰ６、及びリポソームの結合複合体を示す。Ｗｎｔ３Ａ、ＬＲＰ６、及びリポソームを室温で６時間インキュベートした後、超遠心分離にかけた結果を示している。ＬＲＰ６は大部分が上清（８８．９％）中に残ることが認められ、Ｗｎｔ３Ａは７９．７％がリポソームのペレット中に、また２０．３％が上清中に分配されることが認められる。データは、独立した少なくとも３連から得た平均±ＳＥＭ、または独立した少なくとも３連の代表データである。 Ａは、異なる３つの条件下でのヒトＷｎｔ３Ａ、マウスＬＲＰ６、及びリポソームのインキュベーションを示す。リポソームとＷｎｔ３Ａとを室温で６時間インキュベートした後、超遠心分離にかけてＬ－Ｗｎｔ３Ａを作製したことを示している。その後、こうして予備形成されたＬ－Ｗｎｔ３ＡをＬＲＰ６と共に室温で１２時間インキュベートし、その後、超遠心分離にかけてリポソーム会合タンパク質と非会合タンパク質とを分離した。免疫ブロット法により、ＬＲＰ６は４８．２％がペレット中に、また５１．８％が上清中に分配されるが、Ｗｎｔ３Ａはリポソームのペレットでしか検出されなかったことが示されている。データは、独立した少なくとも３連から得た平均±ＳＥＭ、または独立した少なくとも３連の代表データである。Ｂは、異なる３つの条件下でのヒトＷｎｔ３Ａ、マウスＬＲＰ６、及びリポソームのインキュベーションを示す。ＬＲＰ６及びＷｎｔ３Ａを４℃で２４時間プレインキュベートし、その後、このＬＲＰ６－Ｗｎｔ３Ａ溶液をリポソームと共に室温で１２時間インキュベートした後、超遠心分離にかけた結果を示している。これらの条件下、ほとんどすべてのＬＲＰ６（９１．５％）は依然上清中にあることが認められ、Ｗｎｔ３Ａは６１．５％がペレット中に、また３８．５％が上清中に分配されることが認められる。データは、独立した少なくとも３連から得た平均±ＳＥＭ、または独立した少なくとも３連の代表データである。Ｃは、異なる３つの条件下でのヒトＷｎｔ３Ａ、マウスＬＲＰ６、及びリポソームのインキュベーションを示す。Ｗｎｔ３Ａ、ＬＲＰ６、及びリポソームを室温で１２時間インキュベーションした後、超遠心分離にかけた結果を示している。ＬＲＰ６は大部分が上清に残る（９０．８％）ことが認められ、Ｗｎｔ３Ａは７０．８％がリポソームのペレット中に、また２９．２％が上清中に分配されることが認められる。データは、独立した少なくとも３連から得た平均±ＳＥＭ、または独立した少なくとも３連の代表データである。
Ｗｎｔポリペプチドは、細胞の発生過程及び生物学的過程を調整するシグナル伝達分子ファミリーを含む。ある場合には、Ｗｎｔポリペプチドは、幹細胞の自己複製、アポトーシス、及び細胞運動を調節する。他の場合には、Ｗｎｔポリペプチドは、発達、例えば、組織恒常性などに寄与する。Ｗｎｔポリペプチドは、疎水性が高いタンパク質であり、場合によっては（例えば、特定の培地条件下）、生物学的機能が低いかまたはかかる機能を失う。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドと外来性物質（例えば、リポソーム）とを製剤化することにより、Ｗｎｔポリペプチドは生物学的機能を維持することができる。例えば、Ｗｎｔポリペプチドと脂質小胞（例えば、リポソーム）とを組み合わせることによりＷｎｔ製剤が作製され（Ｍｏｒｒｅｌｌ ＮＴ，Ｌｅｕｃｈｔ Ｐ，Ｚｈａｏ Ｌ，Ｋｉｍ Ｊ－Ｂ，ｔｅｎ Ｂｅｒｇｅ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｇｅｎｅｒａｔｅｓ Ｗｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ３（８）：ｅ２９３０；及びＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｗｎｔ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｒｎｏｌ ４６５：３３１－４７（２００９））、かかる製剤は生物学的活性を有する（Ｍｉｎｅａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｗｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｂｏｎｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２，２９ｒａ３０（２０１０）；及びＰｏｐｅｌｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｐｌａｎｔ ｏｓｓｅｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｗｎｔ３Ａ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３１ ９１７３ｅ９１８１（２０１０）；米国特許第７，３３５，６４３号及び同第７，１５３，８３２号）ことが示されている。
ある場合には、Ｗｎｔポリペプチドは、血清存在下で培養細胞から分泌される。血清には多種多様な脂質成分が含有されており、これにより、疎水性が高いＷｎｔポリペプチドがインビトロにおいて安定化する場合がある。疎水性は、場合によってＷｎｔ活性に必要とされる修飾であるグリコシル化及びパルミトイル化の存在に基づく。しかし、安全性の理由から、ＦＤＡ及びＥＭＡなど規制当局は一般に、ヒトでの使用を意図した薬物からあらゆる動物由来製品を排除するように要求する。さらに、ＦＤＡが規制する医療用製品の製造に使用されるウシ胎児血清は、ウイルス及び他の病原体による汚染防止が適切な手順に従わずに行われている場合は使用が禁止されている。
本明細書では、最小血清条件（例えば、無血清条件）下でＷｎｔポリペプチドを作製する方法及び培養系を開示する。いくつかの実施形態では、最小血清条件下で生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドを作製するインビトロ法を本明細書に開示し、かかる方法は、最小血清条件下、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトした遺伝子操作細胞株から細胞を培養すること、及び最小血清条件下、かかる培地から分泌されたＷｎｔポリペプチドを回収することを含む。ある場合には、本明細書の記載には、最小血清培地を含む培地と、最小血清培地中に分泌される生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドと、生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトした遺伝子操作細胞株から得られる細胞とが含まれ、ここで、かかる細胞を最小血清培地の存在下で増殖させる。さらなる場合には、本明細書の記載には、リポソームＷｎｔポリペプチドを調製する方法、及び外来性シャペロンを使用する、最小血清条件から得られたＷｎｔポリペプチドを精製する方法が含まれる。
いくつかの実施形態では、最小血清条件は無血清条件である。ある場合には、本発明は、生物学的に活性なＷｎｔポリペプチド（例えば、ヒトＷｎｔ３Ａ）を分泌させるための無血清プロセスの開発に基づく。いくつかの実施形態では、無血清条件下で生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドを作製するインビトロ法を本明細書に開示し、かかる方法は、無血清条件下、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトした遺伝子操作細胞株から細胞を培養すること、及び無血清条件下、培地から分泌されたＷｎｔポリペプチドを回収することを含む。ある場合には、本明細書の記載には、無血清培地と、この無血清培地に分泌される生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドと、生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトした遺伝子操作細胞株から得られる細胞とを含む培地も含まれ、ここで、かかる細胞を無血清培地存在下で増殖させる。
いくつかの実施形態では、無血清培地中でＷｎｔポリペプチドを作製できるということには臨床使用に対する大きな利点がある。そのことに対応し、ヒトＷＮＴ３ａの無血清分泌及びそれにより得られる組成物のための方法及び組成物を提供する。
特定の用語
本方法を記載する前に、本発明は記載される特定の方法に限定されるものではなく、そのような方法は当然異なり得るということを理解されるべきである。本明細書で使用する用語は個々の実施形態の記載を目的としているにすぎず、また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることから、用語によって制限するものではないということも理解されるべきである。
値の範囲が提供されている場合、その範囲の上限と下限との間に介在する値のそれぞれ（文脈で特に明確な指示がない限り、下限の１０分の１の単位にまで）、及びその記述された範囲における任意の他の記述された値または間に介在する値は、本発明に包含されるものと理解される。これらの小範囲は、その記述された範囲において具体的に除外されない限り、本発明に包含される小範囲に独立して含まれ得る。
特に明記しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を持つ。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４）では、本出願で使用される用語の多くに対する一般指針が当業者に提供されている。
本明細書で言及される刊行物はいずれも、それらの刊行物が引用される方法及び／または材料との関連でかかる方法及び／または材料を開示及び記載するために参照により明白に本明細書に組み込まれる。
本発明の方法、ならびに特定の患者または用途におけるそれらの有効性を決定するための試験は、当技術分野で標準的な手順を用いて本明細書の教示に従って実施することができる。したがって、本発明の実施には、当業者の技術範囲内の分子生物学（組換え技術）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術が採用され得る。そのような技術は、文献、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；及び”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；ならびに上述文献のすべての改訂版などに十分に説明されている。
本発明において、「市販されている」化合物は、商業的供給元から入手され得、それらには、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ ＰＡ）、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ ＷＩ、これにはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ及びＦｌｕｋａが含まれる）、Ａｐｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．（Ｍｉｌｔｏｎ Ｐａｒｋ ＵＫ）、Ａｖｏｃａｄｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｎｃａｓｈｉｒｅ Ｕ．Ｋ．）、ＢＤＨ Ｉｎｃ．（Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）、Ｂｉｏｎｅｔ（Ｃｏｒｎｗａｌｌ，Ｕ．Ｋ．）、Ｃｈｅｍｓｅｒｖｉｃｅ Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）、Ｃｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｈａｕｐｐａｕｇｅ ＮＹ）、Ｅａｓｔｍａｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ ＰＡ）、Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ ＵＫ）、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌｏｇａｎ ＵＴ）、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ ＣＡ）、Ｋｅｙ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｃｏｒｎｗａｌｌ Ｕ．Ｋ．）、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗｉｎｄｈａｍ ＮＨ）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｃｏｒｎｗａｌｌ Ｕ．Ｋ．）、Ｐａｒｉｓｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｏｒｅｍ ＵＴ）、Ｐｆａｌｔｚ＆Ｂａｕｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｗａｔｅｒｂｕｒｙ ＣＮ）、Ｐｏｌｙｏｒｇａｎｉｘ（Ｈｏｕｓｔｏｎ ＴＸ）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）、Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ Ｈａｅｎ ＡＧ（Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）、ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ ＯＲ）、Ｔｒａｎｓ Ｗｏｒｌｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ＶＡ）、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ａｒｇｏｎａｕｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙが挙げられるが、これに限定されるものではない。
化合物は、当業者に公知の方法によっても作製することができる。本明細書で使用する場合、「当業者に公知の方法」は、さまざまな参考書籍及びデータベースにより同定され得る。本発明の化合物の調製に有用な反応物質の合成を詳述する、または調製を記載している論文への参照を提供する好適な参考書籍及び専門書には、例えば、“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓ．Ｒ．Ｓａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，” ２ｎｄ Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３；Ｈ．Ｏ．Ｈｏｕｓｅ，“Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ”，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．１９７２；Ｔ．Ｌ．Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ，“Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２；Ｊ．Ｍａｒｃｈ，“Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２が挙げられる。特定の反応物質及び類似反応物質は、米国化学会のケミカル・アブストラクト・サービスにより作成される既知の化学薬品の目録によっても同定され得、これらは、ほとんどの公共図書館及び大学図書館、及びオンラインデータベース（詳細は、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に問い合わせ可能）を介して利用可能である。既知であるがカタログで市販されていない化学薬品は、受託化学合成企業によって調製され得、その場合、標準的な化学薬品供給企業（例えば、上記収載企業）の多くが受託合成サービスを提供している。
本発明において、最小血清条件には、血清含有量が低い、例えば、血清が約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１．５％、１％、０．５％、０．２５％、０．２％、０．１％、０．０５％、またはそれ以下である血清条件が含まれる。ある場合には、最小血清条件は、血清を９％～０％、５％～０．０５％、５％～０．１％、５％～０．２５％、４％～０．０５％、４％～０．１％、４％～０．２％、３％～０．０５％、３％～０．１％、３％～０．２％、３％～０．２５％、２％～０．０５％、２％～０．０１％、２％～０．２５％、または２％～０．５％含む。ある場合には、最小血清条件は、血清低減培地、タンパク質不含培地、合成培地、または無血清培地を含む。場合によっては、血清低減培地は、血清（例えば、ウシ胎児血清）を約１％～約５％含む。場合によっては、タンパク質不含培地は、動物由来のいかなるタンパク質または成分も含有していないが、植物加水分解物から得られたペプチド及び／またはポリペプチドを含有する場合がある。場合によっては、合成培地は、組換えタンパク質及び／またはホルモン（例えば、組換え型のアルブミン及びインスリン、及び合成脂質）を含み、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含有していない。場合によっては、合成培地はタンパク質不含の合成培地であり、これは、低分子量構成成分を含み、合成のペプチド及び／またはホルモンを含有する場合もある。場合によっては、合成培地はペプチド不含、タンパク質不含の合成培地である。場合によっては、無血清培地（または合成培地）は、組成の不明確な動物由来製品、例えば、血清アルブミン、加水分解物、増殖因子、ホルモン、キャリアタンパク質、及び接着因子などを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で使用する最小血清条件は、血清を９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．２％未満、０．１％未満、または０．０５％未満含む培地条件を指す。いくつかの実施形態では、本明細書で使用する最小血清条件は、血清を９％～０％、５％～０．０５％、５％～０．１％、５％～０．２５％、４％～０．０５％、４％～０．１％、４％～０．２％、３％～０．０５％、３％～０．１％、３％～０．２％、３％～０．２５％、２％～０．０５％、２％～０．０１％、２％～０．２５％、または２％～０．５％含む培地条件を指す。いくつかの実施形態では、本明細書で使用する最小血清条件は、血清低減培地条件を指す。いくつかの実施形態では、本明細書で使用する最小血清条件は、タンパク質不含培地条件を指す。いくつかの実施形態では、本明細書で使用する最小血清条件は、合成培地条件を指す。いくつかの実施形態では、本明細書で使用する最小血清条件は、無血清培地条件を指す。
Ｗｎｔポリペプチド
Ｗｎｔポリペプチドまたはタンパク質は、胚形成時の細胞－細胞相互作用を調節する、高度に保存された分泌性シグナル伝達分子のファミリーを形成する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドには、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ（またはＷｎｔ１３）、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ（Ｗｎｔ１４、またはＷｎｔ１４ｂ）、Ｗｎｔ９ｂ（Ｗｎｔ１４ｂ、またはＷｎｔ１５）、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ（またはＷｎｔ１２）、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ－１６ａ、及びＷｎｔ－１６ｂの各ポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、及びＷｎｔ１０Ｂポリペプチドから選択される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチドである。「Ｗｎｔタンパク質」または「Ｗｎｔ遺伝子産物」または「Ｗｎｔポリペプチド」という用語は、本明細書で使用する場合、天然配列Ｗｎｔポリペプチド、Ｗｎｔポリペプチド変異型、Ｗｎｔポリペプチド断片及びキメラＷｎｔポリペプチドを包含する。
「天然配列」ポリペプチドは、天然由来のＷｎｔポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。そのような天然配列ポリペプチドは、内因性Ｗｎｔタンパク質を産生する細胞から単離することも、また組換え手段もしくは合成手段により作製することもできる。したがって、天然配列ポリペプチドは、例えば、天然に生じるヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、または任意の他の哺乳類種、もしくは非哺乳類種、例えば、ショウジョウバエ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ等に由来するポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。
「天然配列Ｗｎｔポリペプチド」という用語には、限定することなく、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ（またはＷｎｔ１３）、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ（Ｗｎｔ１４、またはＷｎｔ１４ｂ）、Ｗｎｔ９ｂ（Ｗｎｔ１４ｂ、またはＷｎｔ１５）、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ（またはＷｎｔ１２）、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ－１６ａ、及びＷｎｔ－１６ｂの各ポリペプチドが含まれる。ある場合には、「天然配列Ｗｎｔポリペプチド」という用語には、ヒトＷｎｔポリペプチドが含まれる。場合によっては、ヒトＷｎｔポリペプチドには、ヒトのＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ（またはＷｎｔ１３）、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ（Ｗｎｔ１４、またはＷｎｔ１４ｂ）、Ｗｎｔ９ｂ（Ｗｎｔ１４ｂ、またはＷｎｔ１５）、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ（またはＷｎｔ１２）、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ－１６ａ、及びＷｎｔ－１６ｂの各ポリペプチドが含まれる。場合によっては、ヒトＷｎｔポリペプチドはヒトＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、ヒトＷｎｔポリペプチドはヒトＷｎｔ５Ａである。さらなる場合には、ヒトＷｎｔポリペプチドはヒトＷｎｔ１０Ｂである。
ある場合には、Ｗｎｔ１はＧｅｎｂａｎｋリファレンス ＮＰ００５４２１．１及びＡＡＨ７４７９９．１によって言及される。Ｗｎｔ２は、Ｇｅｎｂａｎｋリファレンス ＮＰ００３３８２．１及びＡＡＨ７８１７０．１によって言及される。一般に、Ｗｎｔ２は、脳、視床、胎児及び成人の肺、または胎盤に発現する。Ｗｎｔ２Ｂには２つのアイソフォームがあり、それらのＧｅｎｂａｎｋリファレンス番号はそれぞれ、ＮＰ００４１７６．２及びＮＰ０７８６１３．１である。場合によっては、アイソフォーム１は、成人の心臓、脳、胎盤、肺、前立腺、精巣、卵巣、小腸及び／または結腸に発現する。成人の脳では主に尾状核、視床下核及び視床に見られる。ある場合には、アイソフォーム１は胎児の脳、肺及び腎臓においても検出される。場合によっては、アイソフォーム２は胎児の脳、胎児の肺、胎児の腎臓、尾状核、精巣、及び／またはがん細胞系列に発現する。
Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３Ａは、発生神経管の形態形成時の細胞－細胞シグナル伝達において別個の役割を果たしている。Ｗｎｔ３は、ＧｅｎｂａｎｋリファレンスはＡＢ０６０２８４．１（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ６１０５２．１及びＡＡＩ０３９２４．１も参照のこと）である。Ｗｎｔ３Ａは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託がＢＣ１０３９２２であり、受託番号はＢＣ１０３９２１である。ある場合には、「天然配列Ｗｎｔタンパク質」または「天然配列Ｗｎｔポリペプチド」という用語には、Ｗｎｔ３Ａ天然ポリペプチド（例えば、受託番号ＢＣ１０３９２１及びＢＣ１０３９２２のポリペプチド）が含まれ、Ｎ末端の開始メチオニン（Ｍｅｔ）を含むもの、または含まないもの、及び天然シグナル配列を含むもの、または含まないものが含まれる。場合によっては、かかる用語には、配列番号２の３５２アミノ酸の天然型ヒトＷｎｔ３Ａポリペプチドが含まれ、そのＮ末端メチオニン（Ｍｅｔ）を含むもの、または含まないもの、及び天然シグナル配列を含むもの、または含まないものが含まれる。
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ４のＧｅｎｂａｎｋリファレンスはＮＰ１ １０３８８．２及びＢＡＣ２３０８０．１である。Ｗｎｔ５ＡのＧｅｎｂａｎｋリファレンスはＮＰ００３３８３．１、及びＮＰ００３３８３．２である。Ｗｎｔ５ｂのＧｅｎｂａｎｋリファレンスはＢＡＢ６２０３９．１及びＡＡＧ３８６５９である。Ｗｎｔ６のＧｅｎｂａｎｋリファレンスはＮＰ００６５１３．１及びＢＡＢ５５６０３．１である。Ｗｎｔ７ａのＧｅｎｂａｎｋリファレンスはＮＰ００４６１６．２及びＢＡＡ８２５０９．１である。ある場合には、Ｗｎｔ７ａは、胎盤、腎臓、精巣、子宮、胎児の肺、胎児の脳、または成人の脳に発現する。Ｗｎｔ７ｂのＧｅｎｂａｎｋリファレンスはＮＰ４７８６７９．１及びＢＡＢ６８３９９．１である。場合によっては、Ｗｎｔ７ｂは胎児の脳、肺及び／または腎臓、または成人の脳、肺及び／または前立腺に発現する。Ｗｎｔ８Ａには少なくとも２つの選択的転写物があり、ＧｅｎｂａｎｋリファレンスはＮＰ１１４１３９．１及びＮＰ４９０６４５．１である。Ｗｎｔ８Ｂは、前脳に発現する。ＧｅｎｂａｎｋリファレンスはＮＰ００３３８４．１である。Ｗｎｔ１０ＡのＧｅｎｂａｎｋリファレンスはＡＡＧ４５１５３及びＮＰ０７９４９２．２である。Ｗｎｔ１０Ｂはほとんどの成人組織で検出され、心臓及び骨格筋でのレベルが最も高い。Ｗｎｔ１０ＢのＧｅｎｂａｎｋリファレンスはＮＰ００３３８５．２である。場合によっては、Ｗｎｔ１１は、胎児の肺、腎臓、成人の心臓、肝臓、骨格筋、及び膵臓に発現する。ＧｅｎｂａｎｋリファレンスはＮＰ００４６１７．２である。Ｗｎｔ１４のＧｅｎｂａｎｋリファレンスはＮＰ００３３８６．１である。Ｗｎｔ１５は、胎児の腎臓または成人の腎臓に発現するか、または脳に発現する。ＧｅｎｂａｎｋリファレンスはＮＰ００３３８７．１である。Ｗｎｔ１６には２つのアイソフォーム、Ｗｎｔ－１６ａ及びＷｎｔ－１６ｂがあり、選択的スプライシングによって産生される。アイソフォームＷｎｔ－１６ａは膵臓に発現する。アイソフォームＷｎｔ－１６ｂは、脾臓、虫垂、及びリンパ節などの末梢リンパ系器官、または腎臓に発現するが、骨髄には発現しない。Ｗｎｔ１６ａ及びＷｎｔ１６ｂのＧｅｎｂａｎｋリファレンスはそれぞれ、ＮＰ４７６５０９．１及びＮＰ０５７１７１．２である。掲載したＧｅｎＢａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ及び他のデータベースの配列はいずれも、参照により明白に本明細書に組み込まれるものとする。
「変異型」ポリペプチドは、天然配列ポリペプチドとの配列同一性が１００％未満である、下記に定義するような生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異型には、天然配列のＮ末端もしくはＣ末端、または配列内に、１つ以上のアミノ酸残基が付加されているポリペプチド、約１～４０のアミノ酸残基が欠失し、１つ以上のアミノ酸残基で任意選択で置換されているポリペプチド、及び天然には生じないアミノ酸を有する生成物が得られるようアミノ酸残基が共有結合で修飾されている、上記ポリペプチドの誘導体が含まれる。
ある場合には、生物学的に活性なＷｎｔ変異型は、天然配列Ｗｎｔポリペプチドとのアミノ酸配列同一性が少なくとも約８０％であるアミノ酸配列を有する。ある場合には、生物学的に活性なＷｎｔ変異型は、天然配列Ｗｎｔポリペプチドとのアミノ酸配列同一性が少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９６％、９７％、または９９％であるアミノ酸配列を有する。場合によっては、生物学的に活性なＷｎｔ変異型は、天然配列Ｗｎｔポリペプチドとのアミノ酸配列同一性が少なくとも約９５％であるアミノ酸配列を有する。場合によっては、生物学的に活性なＷｎｔ変異型は、天然配列Ｗｎｔポリペプチドとのアミノ酸配列同一性が少なくとも約９９％であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、生物学的に活性なＷｎｔ変異型はＷｎｔ３Ａ変異型である。いくつかの実施形態では、生物学的に活性なＷｎｔ変異型はヒトＷｎｔ３Ａ変異型である。
ある場合には、生物学的に活性なＷｎｔ変異型は、１つ以上のアミノ酸位置における脂質修飾を含む。場合によっては、脂質修飾は、配列番号１に記載の７７位に相当する、Ｗｎｔ変異型上の位置にある。場合によっては、脂質修飾は、配列番号１に記載の２０９位に相当する、Ｗｎｔ変異型上の位置にある。場合によっては、脂質修飾は、配列番号１に記載の７７位及び２０９位に相当する両位置を含む。ある場合には、Ｗｎｔ変異型は、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ５ＡまたはＷｎｔ１０Ｂである。場合によっては、Ｗｎｔ変異型はＷｎｔ３Ａである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａ変異型は、配列番号１に記載の残基７７に相当する位置における脂質修飾を含む。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａ変異型は、配列番号１に記載の残基２０９に相当する位置における脂質修飾を含む。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａ変異型は、配列番号１に記載の残基７７及び２０９に相当する位置における脂質修飾を含む。場合によっては、修飾はパルミトイル化である。
ある場合には、生物学的に活性なＷｎｔ変異型は、グリコシル化により修飾された残基をさらに含む。場合によっては、修飾は、配列番号１に記載の８２位及び／または２９８位に相当する位置に生じる。場合によっては、Ｗｎｔ変異型はＷｎｔ３Ａである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａ変異型は、グリコシル化により修飾された残基をさらに含む。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａ変異型は、配列番号１に記載の残基８２及び／または残基２９８に相当する１つ以上の位置にグリコシル化された残基をさらに含む。
「アミノ酸」という用語は、アミノ基とカルボキシル基との両方を含有する分子を指す。好適なアミノ酸には、限定することなく、天然に生じるアミノ酸のＤ型及びＬ型の両異性体、ならびに有機合成または他の代謝経路によって調製された天然には生じないアミノ酸が含まれる。本発明において使用される場合、アミノ酸という用語には、限定することなく、α－アミノ酸、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びアミノ酸類似体が含まれる。
「α－アミノ酸」という用語は、α－炭素として表される炭素に結合している、アミノ基とカルボキシル基との両方を含有する分子を指す。
「β－アミノ酸」という用語は、β立体配置をとっている、アミノ基とカルボキシル基との両方を含有する分子を指す。
「天然に生じるアミノ酸」という用語は、自然界で合成されるペプチドに共通して見出され、１文字の略語Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶで知られる２０種のアミノ酸のいずれか１つを指す。
以下の表は天然アミノ酸の特性の概要を示す。
アミノ酸 ３文字 １文字 側鎖極性 側鎖電荷 ハイドロパシー
表記 表記 （ｐＨ７．４） 指標
アラニン Ａｌａ Ａ 非極性 中性 １．８
アルギニン Ａｒｇ Ｒ 極性 正 －４．５
アスパラギン Ａｓｎ Ｎ 極性 中性 －３．５
アスパラギン酸 Ａｓｐ Ｄ 極性 負 －３．５
システイン Ｃｙｓ Ｃ 極性 中性 ２．５
グルタミン酸 Ｇｌｕ Ｅ 極性 負 －３．５
グルタミン Ｇｌｎ Ｑ 極性 中性 －３．５
グリシン Ｇｌｙ Ｇ 非極性 中性 －０．４
ヒスチジン Ｈｉｓ Ｈ 極性 正（１０％） －３．２
中性（９０％）
イソロイシン Ｉｌｅ Ｉ 非極性 中性 ４．５
ロイシン Ｌｅｕ Ｌ 非極性 中性 ３．８
リシン Ｌｙｓ Ｋ 極性 正 －３．９
メチオニン Ｍｅｔ Ｍ 非極性 中性 １．９
フェニルアラニン Ｐｈｅ Ｆ 非極性 中性 ２．８
プロリン Ｐｒｏ Ｐ 非極性 中性 －１．６
セリン Ｓｅｒ Ｓ 極性 中性 －０．８
トレオニン Ｔｈｒ Ｔ 極性 中性 －０．７
トリプトファン Ｔｒｐ Ｗ 非極性 中性 －０．９
チロシン Ｔｙｒ Ｙ 極性 中性 －１．３
バリン Ｖａｌ Ｖ 非極性 中性 ４．２
「疎水性アミノ酸」には、小さい疎水性アミノ酸及び大きい疎水性アミノ酸が含まれる。「小さい疎水性アミノ酸」は、グリシン、アラニン、プロリン、及びその類似体、「大きい疎水性アミノ酸」は、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、及びその類似体である。「極性アミノ酸」は、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、チロシン、及びその類似体であり、「電荷を持つアミノ酸」は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びその類似体である。
「アミノ酸類似体」という用語は、アミノ酸に構造的に類似しており、ペプチド模倣巨大環の形成の際にアミノ酸の代わりに用いられ得る分子を指す。アミノ酸類似体には、限定することなく、β－アミノ酸、及びアミノ基またはカルボキシ基が、反応性の類似した基によって置換（例えば、第一級アミンを第二級アミンもしくは第三級アミンに置換、またはカルボキシ基をエステルに置換）されているアミノ酸が含まれる。
「非天然アミノ酸」という用語は、一般に自然界で合成されるペプチドに見出されるＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶの１文字表記によって知られる２０種のアミノ酸の１つではないアミノ酸を指す。非天然アミノ酸またはアミノ酸類似体には、限定することなく、以下のアミノ酸類似体が含まれる。
アミノ酸類似体には、β－アミノ酸類似体が含まれる。β－アミノ酸類似体の例には以下の、環状β－アミノ酸類似体、β－アラニン、（Ｒ）－β－フェニルアラニン、（Ｒ）－１，２，３，４－テトラヒドロ－イソキノリン－３－酢酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（１－ナフチル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（２，４－ジクロロフェニル）酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－クロロフェニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－シアノフェニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－フルオロフェニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－フリル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－メチルフェニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－ナフチル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－チエニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－トリフルオロメチルフェニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（３，４－ジクロロフェニル）酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（３，４－ジフルオロフェニル）酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－ベンゾチエニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－クロロフェニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－シアノフェニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－フルオロフェニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－メチルフェニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－ピリジル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－チエニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－トリフルオロメチルフェニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－ブロモフェニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－クロロフェニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－シアノフェニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－フルオロフェニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－ヨードフェニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－メチルフェニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－ニトロフェニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－ピリジル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－トリフルオロメチルフェニル）－酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－４－ペンタフルオロ－フェニル酪酸、（Ｒ）－３－アミノ－５－ヘキセン酸、（Ｒ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸、（Ｒ）－３－アミノ－５－フェニルペンタン酸、（Ｒ）－３－アミノ－６－フェニル－５－ヘキセン酸、（Ｓ）－１，２，３，４－テトラヒドロ－イソキノリン－３－酢酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（１－ナフチル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（２，４－ジクロロフェニル）酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－クロロフェニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－シアノフェニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－フルオロフェニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－フリル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－メチルフェニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－ナフチル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－チエニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－トリフルオロメチルフェニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（３，４－ジクロロフェニル）酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（３，４－ジフルオロフェニル）酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－ベンゾチエニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－クロロフェニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－シアノフェニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－フルオロフェニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－メチルフェニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－ピリジル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－チエニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－トリフルオロメチルフェニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－ブロモフェニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－クロロフェニル）酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－シアノフェニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－フルオロフェニル）酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－ヨードフェニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－メチルフェニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－ニトロフェニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－ピリジル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－トリフルオロメチルフェニル）－酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－４－ペンタフルオロ－フェニル酪酸、（Ｓ）－３－アミノ－５－ヘキセン酸、（Ｓ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸、（Ｓ）－３－アミノ－５－フェニルペンタン酸、（Ｓ）－３－アミノ－６－フェニル－５－ヘキセン酸、１，２，５，６－テトラヒドロピリジン－３－カルボン酸、１，２，５，６－テトラヒドロピリジン－４－カルボン酸、３－アミノ－３－（２－クロロフェニル）－プロピオン酸、３－アミノ－３－（２－チエニル）－プロピオン酸、３－アミノ－３－（３－ブロモフェニル）－プロピオン酸、３－アミノ－３－（４－クロロフェニル）－プロピオン酸、３－アミノ－３－（４－メトキシフェニル）－プロピオン酸、３－アミノ－４，４，４－トリフルオロ－酪酸、３－アミノアジピン酸、Ｄ－β－フェニルアラニン、β－ロイシン、Ｌ－β－ホモアラニン、Ｌ－β－ホモアスパラギン酸γ－ベンジルエステル、Ｌ－β－ホモグルタミン酸δ－ベンジルエステル、Ｌ－β－ホモイソロイシン、Ｌ－β－ホモロイシン、Ｌ－β－ホモメチオニン、Ｌ－β－ホモフェニルアラニン、Ｌ－β－ホモプロリン、Ｌ－β－ホモトリプトファン、Ｌ－β－ホモバリン、Ｌ－Ｎω－ベンジルオキシカルボニル－β－ホモリシン、Ｎω－Ｌ－β－ホモアルギニン、Ｏ－ベンジル－Ｌ－β－ホモヒドロキシプロリン、Ｏ－ベンジル－Ｌ－β－ホモセリン、Ｏ－ベンジル－Ｌ－β－ホモトレオニン、Ｏ－ベンジル－Ｌ－β－ホモチロシン、γ－トリチル－Ｌ－β－ホモアスパラギン、（Ｒ）－β－フェニルアラニン、Ｌ－β－ホモアスパラギン酸γ－ｔ－ブチルエステル、Ｌ－β－ホモグルタミン酸δ－ｔ－ブチルエステル、Ｌ－Ｎω－β－ホモリシン、Ｎδ－トリチル－Ｌ－β－ホモグルタミン、Ｎω－２，２，４，６，７－ペンタメチル－ジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル－Ｌ－β－ホモアルギニン、Ｏ－ｔ－ブチル－Ｌ－β－ホモヒドロキシ－プロリン、Ｏ－ｔ－ブチル－Ｌ－β－ホモセリン、Ｏ－ｔ－ブチル－Ｌ－β－ホモトレオニン、Ｏ－ｔ－ブチル－Ｌ－β－ホモチロシン、２－アミノシクロペンタンカルボン酸、及び２－アミノシクロヘキサンカルボン酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。
アミノ酸類似体には、アラニン、バリン、グリシンまたはロイシンの類似体が含まれる。アラニン、バリン、グリシン、及びロイシンのアミノ酸類似体の例には以下の、α－メトキシグリシン、α－アリル－Ｌ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、α－メチル－ロイシン、β－（１－ナフチル）－Ｄ－アラニン、β－（１－ナフチル）－Ｌ－アラニン、β－（２－ナフチル）－Ｄ－アラニン、β－（２－ナフチル）－Ｌ－アラニン、β－（２－ピリジル）－Ｄ－アラニン、β－（２－ピリジル）－Ｌ－アラニン、β－（２－チエニル）－Ｄ－アラニン、β－（２－チエニル）－Ｌ－アラニン、β－（３－ベンゾチエニル）－Ｄ－アラニン、β－（３－ベンゾチエニル）－Ｌ－アラニン、β－（３－ピリジル）－Ｄ－アラニン、β－（３－ピリジル）－Ｌ－アラニン、β－（４－ピリジル）－Ｄ－アラニン、β－（４－ピリジル）－Ｌ－アラニン、β－クロロ－Ｌ－アラニン、β－シアノ－Ｌ－アラニン、β－シクロヘキシル－Ｄ－アラニン、β－シクロヘキシル－Ｌ－アラニン、β－シクロペンテン－１－イル－アラニン、β－シクロペンチル－アラニン、β－シクロプロピル－Ｌ－Ａｌａ－ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩、β－ｔ－ブチル－Ｄ－アラニン、β－ｔ－ブチル－Ｌ－アラニン、γ－アミノ酪酸、Ｌ－α，β－ジアミノプロピオン酸、２，４－ジニトロ－フェニルグリシン、２，５－ジヒドロ－Ｄ－フェニルグリシン、２－アミノ－４，４，４－トリフルオロ酪酸、２－フルオロ－フェニルグリシン、３－アミノ－４，４，４－トリフルオロ－酪酸、３－フルオロ－バリン、４，４，４－トリフルオロ－バリン、４，５－デヒドロ－Ｌ－ｌｅｕ－ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩、４－フルオロ－Ｄ－フェニルグリシン、４－フルオロ－Ｌ－フェニルグリシン、４－ヒドロキシ－Ｄ－フェニルグリシン、５，５，５－トリフルオロ－ロイシン、６－アミノヘキサン酸、シクロペンチル－Ｄ－Ｇｌｙ－ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩、シクロペンチル－Ｇｌｙ－ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩、Ｄ－α，β－ジアミノプロピオン酸、Ｄ－α－アミノ酪酸、Ｄ－α－ｔ－ブチルグリシン、Ｄ－（２－チエニル）グリシン、Ｄ－（３－チエニル）グリシン、Ｄ－２－アミノカプロン酸、Ｄ－２－インダニルグリシン、Ｄ－アリルグリシン－ジシクロヘキシルアンモニウム塩、Ｄ－シクロヘキシルグリシン、Ｄ－ノルバリン、Ｄ－フェニルグリシン、β－アミノ酪酸、β－アミノイソ酪酸、（２－ブロモフェニル）グリシン、（２－メトキシフェニル）グリシン、（２－メチルフェニル）グリシン、（２－チアゾイル）グリシン、（２－チエニル）グリシン、２－アミノ－３－（ジメチルアミノ）－プロピオン酸、Ｌ－α，β－ジアミノプロピオン酸、Ｌ－α－アミノ酪酸、Ｌ－α－ｔ－ブチルグリシン、Ｌ－（３－チエニル）グリシン、Ｌ－２－アミノ－３－（ジメチルアミノ）－プロピオン酸、Ｌ－２－アミノカプロン酸ジシクロヘキシルアンモニウム塩、Ｌ－２－インダニルグリシン、Ｌ－アリルグリシン．ジシクロヘキシルアンモニウム塩、Ｌ－シクロヘキシルグリシン、Ｌ－フェニルグリシン、Ｌ－プロパルギルグリシン、Ｌ－ノルバリン、Ｎ－α－アミノメチル－Ｌ－アラニン、Ｄ－α，γ－ジアミノ酪酸、Ｌ－α，γ－ジアミノ酪酸、β－シクロプロピル－Ｌ－アラニン、（Ｎ－β－（２，４－ジニトロフェニル））－Ｌ－α，β－ジアミノプロピオン酸、（Ｎ－β－１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキサ－１－イリデン）エチル）－Ｄ－α，β－ジアミノプロピオン酸、（Ｎ－β－１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキサ－１－イリデン）エチル）－Ｌ－α，β－ジアミノプロピオン酸、（Ｎ－β－４－メチルトリチル）－Ｌ－α，β－ジアミノプロピオン酸、（Ｎ－β－アリルオキシカルボニル）－Ｌ－α，β－ジアミノプロピオン酸、（Ｎ－γ－１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキサ－１－イリデン）エチル）－Ｄ－α，γ－ジアミノ酪酸、（Ｎ－γ－１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキサ－１－イリデン）エチル）－Ｌ－α，γ－ジアミノ酪酸、（Ｎ－γ－４－メチルトリチル）－Ｄ－α，γ－ジアミノ酪酸、（Ｎ－γ－４－メチルトリチル）－Ｌ－α，γ－ジアミノ酪酸、（Ｎ－γ－アリルオキシカルボニル）－Ｌ－α，γ－ジアミノ酪酸、Ｄ－α，γ－ジアミノ酪酸、４，５－デヒドロ－Ｌ－ロイシン、シクロペンチル－Ｄ－Ｇｌｙ－ＯＨ、シクロペンチル－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｄ－アリルグリシン、Ｄ－ホモシクロヘキシルアラニン、Ｌ－１－ピレニルアラニン、Ｌ－２－アミノカプロン酸、Ｌ－アリルグリシン、Ｌ－ホモシクロヘキシルアラニン、及びＮ－（２－ヒドロキシ－４－メトキシ－Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－ＯＨが挙げられるが、これに限定されるものではない。
アミノ酸類似体には、アルギニンまたはリシンの類似体が含まれる。アルギニン及びリシンのアミノ酸類似体の例には以下の、シトルリン、Ｌ－２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、Ｌ－２－アミノ－３－ウレイドプロピオン酸、Ｌ－シトルリン、Ｌｙｓ（Ｍｅ）２－ＯＨ、Ｌｙｓ（Ｎ３）－ＯＨ、Ｎδ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－オルニチン、Ｎω－ニトロ－Ｄ－アルギニン、Ｎω－ニトロ－Ｌ－アルギニン、α－メチル－オルニチン、２，６－ジアミノヘプタン二酸、Ｌ－オルニチン、（Ｎδ－１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソ－シクロヘキサ－１－イリデン）エチル）－Ｄ－オルニチン、（Ｎδ－１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソ－シクロヘキサ－１－イリデン）エチル）－Ｌ－オルニチン、（Ｎδ－４－メチルトリチル）－Ｄ－オルニチン、（Ｎδ－４－メチルトリチル）－Ｌ－オルニチン、Ｄ－オルニチン、Ｌ－オルニチン、Ａｒｇ（Ｍｅ）（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ａｒｇ（Ｍｅ）２－ＯＨ（非対称）、Ａｒｇ（Ｍｅ）２－ＯＨ（対称）、Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）－ＯＨ、Ｌｙｓ（Ｍｅ）２－ＯＨ．ＨＣｌ、Ｌｙｓ（Ｍｅ３）－ＯＨ塩化物、Ｎω－ニトロ－Ｄ－アルギニン、及びＮω－ニトロ－Ｌ－アルギニンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
アミノ酸類似体には、アスパラギン酸またはグルタミン酸の類似体が含まれる。アスパラギン酸及びグルタミン酸のアミノ酸類似体の例には以下の、α－メチル－Ｄ－アスパラギン酸、α－メチル－グルタミン酸、α－メチル－Ｌ－アスパラギン酸、γ－メチレン－グルタミン酸、（Ｎ－γ－エチル）－Ｌ－グルタミン、［Ｎ－α－（４－アミノベンゾイル）］－Ｌ－グルタミン酸、２，６－ジアミノピメリン酸、Ｌ－α－アミノスベリン酸、Ｄ－２－アミノアジピン酸、Ｄ－α－アミノスベリン酸、α－アミノピメリン酸、イミノ二酢酸、Ｌ－２－アミノアジピン酸、ｔｈｒｅｏ－β－メチル－アスパラギン酸、γ－カルボキシ－Ｄ－グルタミン酸γ，γ－ジ－ｔ－ブチルエステル、γ－カルボキシ－Ｌ－グルタミン酸γ，γ－ジ－ｔ－ブチルエステル、Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）－ＯＨ、Ｌ－Ａｓｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、及びピログルタミン酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。
アミノ酸類似体には、システイン及びメチオニンの類似体が含まれる。システイン及びメチオニンのアミノ酸類似体の例には、Ｃｙｓ（ファルネシル）－ＯＨ、Ｃｙｓ（ファルネシル）－ＯＭｅ、α－メチル－メチオニン、Ｃｙｓ（２－ヒドロキシエチル）－ＯＨ、Ｃｙｓ（３－アミノプロピル）－ＯＨ、２－アミノ－４－（エチルチオ）酪酸、ブチオニン、ブチオニンスルホキシイミン、エチオニン、メチオニンメチルスルホニウムクロリド、セレノメチオニン、システイン酸、［２－（４－ピリジル）エチル］－ＤＬ－ペニシラミン、［２－（４－ピリジル）エチル］－Ｌ－システイン、４－メトキシベンジル－Ｄ－ペニシラミン、４－メトキシベンジル－Ｌ－ペニシラミン、４－メチルベンジル－Ｄ－ペニシラミン、４－メチルベンジル－Ｌ－ペニシラミン、ベンジル－Ｄ－システイン、ベンジル－Ｌ－システイン、ベンジル－ＤＬ－ホモシステイン、カルバモイル－Ｌ－システイン、カルボキシエチル－Ｌ－システイン、カルボキシメチル－Ｌ－システイン、ジフェニルメチル－Ｌ－システイン、エチル－Ｌ－システイン、メチル－Ｌ－システイン、ｔ－ブチル－Ｄ－システイン、トリチル－Ｌ－ホモシステイン、トリチル－Ｄ－ペニシラミン、シスタチオニン、ホモシスチン、Ｌ－ホモシスチン、（２－アミノエチル）－Ｌ－システイン、セレノ－Ｌ－シスチン、シスタチオニン、Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ、及びアセトアミドメチル－Ｄ－ペニシラミンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
アミノ酸類似体には、フェニルアラニン及びチロシンの類似体が含まれる。フェニルアラニン及びチロシンのアミノ酸類似体の例には、β－メチル－フェニルアラニン、β－ヒドロキシフェニルアラニン、α－メチル－３－メトキシ－ＤＬ－フェニルアラニン、α－メチル－Ｄ－フェニルアラニン、α－メチル－Ｌ－フェニルアラニン、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、２，４－ジクロロ－フェニルアラニン、２－（トリフルオロメチル）－Ｄ－フェニルアラニン、２－（トリフルオロメチル）－Ｌ－フェニルアラニン、２－ブロモ－Ｄ－フェニルアラニン、２－ブロモ－Ｌ－フェニルアラニン、２－クロロ－Ｄ－フェニルアラニン、２－クロロ－Ｌ－フェニルアラニン、２－シアノ－Ｄ－フェニルアラニン、２－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、２－フルオロ－Ｄ－フェニルアラニン、２－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、２－メチル－Ｄ－フェニルアラニン、２－メチル－Ｌ－フェニルアラニン、２－ニトロ－Ｄ－フェニルアラニン、２－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン、２；４；５－トリヒドロキシ－フェニルアラニン、３，４，５－トリフルオロ－Ｄ－フェニルアラニン、３，４，５－トリフルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、３，４－ジクロロ－Ｄ－フェニルアラニン、３，４－ジクロロ－Ｌ－フェニルアラニン、３，４－ジフルオロ－Ｄ－フェニルアラニン、３，４－ジフルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、３，４－ジヒドロキシ－Ｌ－フェニルアラニン、３，４－ジメトキシ－Ｌ－フェニルアラニン、３，５，３’－トリヨード－Ｌ－チロニン、３，５－ジヨード－Ｄ－チロシン、３，５－ジヨード－Ｌ－チロシン、３，５－ジヨード－Ｌ－チロニン、３－（トリフルオロメチル）－Ｄ－フェニルアラニン、３－（トリフルオロメチル）－Ｌ－フェニルアラニン、３－アミノ－Ｌ－チロシン、３－ブロモ－Ｄ－フェニルアラニン、３－ブロモ－Ｌ－フェニルアラニン、３－クロロ－Ｄ－フェニルアラニン、３－クロロ－Ｌ－フェニルアラニン、３－クロロ－Ｌ－チロシン、３－シアノ－Ｄ－フェニルアラニン、３－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、３－フルオロ－Ｄ－フェニルアラニン、３－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、３－フルオロ－チロシン、３－ヨード－Ｄ－フェニルアラニン、３－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、３－ヨード－Ｌ－チロシン、３－メトキシ－Ｌ－チロシン、３－メチル－Ｄ－フェニルアラニン、３－メチル－Ｌ－フェニルアラニン、３－ニトロ－Ｄ－フェニルアラニン、３－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン、３－ニトロ－Ｌ－チロシン、４－（トリフルオロメチル）－Ｄ－フェニルアラニン、４－（トリフルオロメチル）－Ｌ－フェニルアラニン、４－アミノ－Ｄ－フェニルアラニン、４－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－ベンゾイル－Ｄ－フェニルアラニン、４－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、４－ビス（２－クロロエチル）アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－ブロモ－Ｄ－フェニルアラニン、４－ブロモ－Ｌ－フェニルアラニン、４－クロロ－Ｄ－フェニルアラニン、４－クロロ－Ｌ－フェニルアラニン、４－シアノ－Ｄ－フェニルアラニン、４－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－フルオロ－Ｄ－フェニルアラニン、４－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、４－ヨード－Ｄ－フェニルアラニン、４－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、チロキシン、３，３－ジフェニルアラニン、チロニン、エチル－チロシン、及びメチルチロシンが挙げられる。
アミノ酸類似体には、プロリンの類似体が含まれる。プロリンのアミノ酸類似体の例には、３，４－デヒドロ－プロリン、４－フルオロプロリン、ｃｉｓ－４－ヒドロキシ－プロリン、チアゾリジン－２－カルボン酸、及びｔｒａｎｓ－４－フルオロ－プロリンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
アミノ酸類似体には、セリン及びトレオニンの類似体が含まれる。セリン及びトレオニンのアミノ酸類似体の例には、３－アミノ－２－ヒドロキシ－５－メチルヘキサン酸、２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、２－アミノ－３－エトキシブタン酸、２－アミノ－３－メトキシブタン酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン酸、２－アミノ－３－ベンジルオキシプロピオン酸、２－アミノ－３－ベンジルオキシプロピオン酸、２－アミノ－３－エトキシプロピオン酸、４－アミノ－３－ヒドロキシブタン酸、及びα－メチルセリンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
アミノ酸類似体には、トリプトファンの類似体が含まれる。トリプトファンのアミノ酸類似体の例には以下の、α－メチル－トリプトファン、β－（３－ベンゾチエニル）－Ｄ－アラニン、β－（３－ベンゾチエニル）－Ｌ－アラニン、１－メチル－トリプトファン、４－メチル－トリプトファン、５－ベンジルオキシ－トリプトファン、５－ブロモ－トリプトファン、５－クロロ－トリプトファン、５－フルオロ－トリプトファン、５－ヒドロキシ－トリプトファン、５－ヒドロキシ－Ｌ－トリプトファン、５－メトキシ－トリプトファン、５－メトキシ－Ｌ－トリプトファン、５－メチル－トリプトファン、６－ブロモ－トリプトファン、６－クロロ－Ｄ－トリプトファン、６－クロロ－トリプトファン、６－フルオロ－トリプトファン、６－メチル－トリプトファン、７－ベンジルオキシ－トリプトファン、７－ブロモ－トリプトファン、７－メチル－トリプトファン、Ｄ－１，２，３，４－テトラヒドロ－ノルハルマン－３－カルボン酸、６－メトキシ－１，２，３，４－テトラヒドロノルハルマン－１－カルボン酸、７－アザトリプトファン、Ｌ－１，２，３，４－テトラヒドロ－ノルハルマン－３－カルボン酸、５－メトキシ－２－メチル－トリプトファン、及び６－クロロ－Ｌ－トリプトファンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
いくつかの実施形態では、アミノ酸類似体はラセミ体である。いくつかの実施形態では、アミノ酸類似体のＤ型異性体を使用する。いくつかの実施形態では、アミノ酸類似体のＬ型異性体を使用する。他の実施形態では、アミノ酸類似体は、立体配置がＲまたはＳであるキラル中心を含む。さらに他の実施形態では、β－アミノ酸類似体のアミノ基（複数可）は、保護基、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基（ＢＯＣ基）、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（ＦＭＯＣ）、トシル基等で置換される。さらに別の実施形態では、β－アミノ酸類似体のカルボン酸官能基は、例えばそのエステル誘導体として、保護される。いくつかの実施形態では、アミノ酸類似体の塩を使用する。
「非必須」アミノ酸残基は、その本質的な生物学的もしくは生化学的活性（例えば、受容体の結合または活性化）を消失または実質的に改変させることなくポリペプチドの野生型配列の改変が可能な残基である。「必須」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型配列を改変した場合に、そのポリペプチドの本質的な生物学的もしくは生化学的活性を消失させるかまたは実質的に消失させる残基である。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を、類似側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるアミノ酸置換である。類似側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、Ｋ、Ｒ、Ｈ）、酸性側鎖（例えば、Ｄ、Ｅ）、電荷を持たない極性側鎖（例えば、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｃ）、非極性側鎖（例えば、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、Ｗ）、ベータ－分岐側鎖（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ）及び芳香族側鎖（例えば、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｈ）を持つアミノ酸が含まれる。したがって、ポリペプチドにおける予測される非必須アミノ酸残基は、例えば、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置き換えられる。許容される置換の他の例は、等価性を考慮した上での置換（例えば、メチオニンの代わりにノルロイシン）または他の特性に基づく置換（例えば、フェニルアラニンの代わりに２－チエニルアラニン、またはトリプトファンの代わりに６－Ｃｌ－トリプトファン）である。
生物学的に活性なＷｎｔポリペプチド
ある実施形態では、最小血清条件（例えば、無血清培地）中に分泌された出発物質から精製される、実質的に同種の生物学的に活性なＷｎｔ組成物を作製するための方法を本明細書で開示する。ある場合には、最小血清条件下で生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドを作製するインビトロ法を本明細書に記載し、かかる方法は、最小血清条件下、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトした遺伝子操作細胞株から細胞を培養すること、及び最小血清条件下、かかる培地から分泌されたＷｎｔポリペプチドを回収することを含む。場合によっては、本明細書に記載するものには、最小血清培地を含む培地、最小血清培地中に分泌される生物学的に活性なＷｎｔポリペプチド、及び生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトした遺伝子操作細胞株から得られる細胞も含まれ、ここで、かかる細胞を最小血清培地の存在下で増殖させる。
発現構成体
いくつかの実施形態では、１つ以上の変異型を含むＷｎｔポリペプチドを組換え法によって作製する。ある場合には、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ５Ａ、またはｗｎｔ１０ｂポリペプチドである。ある場合には、１つ以上の変異型を含むＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。ある場合には、１つ以上の変異型を含むＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ５Ａポリペプチドである。ある場合には、１つ以上の変異型を含むＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。
Ｃ末端で切断されている変異型を含め、アミノ酸配列変異型は、ＷｎｔポリペプチドＤＮＡに適切なヌクレオチド変更を導入することによって調製する。そのような変異型としては、天然に生じるＷｎｔポリペプチドのアミノ酸配列の一端もしくは両端または配列内における残基の挿入、置換、及び／または特定の欠失がある。挿入、置換、及び／または特定の欠失、例えば切断を、任意に組み合わせて最終構成体を得るが、最終構成体は本明細書に定義されるような所望の生物学的活性を有するものとする。アミノ酸の変更により、Ｗｎｔポリペプチドの翻訳後プロセシングは、グリコシル化部位の数または位置の変更、膜アンカー特性の改変、及び／またはＷｎｔポリペプチドのリーダー配列の挿入、欠失、そうでなければ影響を与えることによる、Ｗｎｔポリペプチドの細胞内位置の改変というような改変を受けてもよい。
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドに含まれる１つ以上の変異型は、置換、挿入、欠失、またはその組み合わせを含む。ある場合には、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、置換、挿入、欠失、またはその組み合わせを含む。場合によっては、Ｗｎｔ５Ａポリペプチドは、置換、挿入、欠失、またはその組み合わせを含む。他の場合には、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチドは、置換、挿入、欠失、またはその組み合わせを含む。
場合によっては、Ｗｎｔ３ＡポリペプチドをコードするＤＮＡは配列番号１または配列番号２で表される。場合によっては、Ｗｎｔ３ＡポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１の配列の切断、または配列番号２の配列の利用により作製される。ある場合には、Ｗｎｔポリペプチドをコードする遺伝子を、当該技術分野で公知のオリゴヌクレオチド合成、増幅等によっても得る。
Ｗｎｔポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は発現用複製可能ベクターに挿入される。そのようなベクターの多くが利用可能である。ベクター成分には一般に、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上が挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましくはＧＭＰ適合ベクター、例えば、市販されているベクターのＯｐｔｉｃＶｅｃ、ｐＴａｒｇｅｔ、ｐｃＤＮＡ４ＴＯ４、ｐｃＤＮＡ４．０等などが選択される。
いくつかの実施形態では、最小血清培養条件に耐性がある発現ベクターを使用する。ある場合には、最小血清培養条件には、血清低減培養条件、タンパク質不含培養条件、合成培地培養条件、または無血清培養条件が含まれる。いくつかの実施形態では、血清低減培養条件に耐性がある発現ベクターを使用する。いくつかの実施形態では、タンパク質不含培養条件に耐性がある発現ベクターを使用する。いくつかの実施形態では、合成培地培養条件に耐性がある発現ベクターを使用する。
いくつかの実施形態では、無血清培地条件に耐性がある発現ベクターを使用する。場合によっては、発現ベクターにより、対象タンパク質の所望の転写と分泌とのコピーが多数もたらされる。ある場合には、発現ベクターは、ｃＧＭＰに適合する哺乳類細胞株と適合する。哺乳類の発現ベクターの非限定的な例には、ｐＯｐｔｉｖｅｃベクター、ｐＴａｒｇｅＴ（登録商標）ベクター、ＢａｃＭａｍ ｐＣＭＶ－Ｄｅｓｔベクター、Ｆｌｐ－Ｉｎ（登録商標）コアシステム、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ベクターパッケージ、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ベクター、Ｆｌｅｘｉ（登録商標）ベクター、ｐＣＭＶＴＮＴ（登録商標）ベクター、ｐｃＤＮＡ４．０、及びｐｃＤＮＡ（登録商標）４／ＴＯベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ｐＯｐｔｉｖｅｃ及びｐＴａｒｇｅＴ（登録商標）ベクターから選択される。ｐＯｐｔｉｖｅｃベクターは、バイシストロン性プラスミドを用いるＴＯＰＯ（登録商標）であり、哺乳類の分泌シグナルとＣＭＶプロモーターの対象下流の遺伝子とを含有する遺伝子の短時間クローニングを可能にする。ジヒドロ葉酸レダクターゼ選択マーカーにより素早く選択することができる。場合によっては、このベクターを、ＣＨＯ－Ｓ細胞の一過性トランスフェクションに使用する。ある場合には、ＣＨＯ－Ｓ細胞の一過性トランスフェクション、及びＷｎｔタンパク質（例えば、Ｗｎｔ３Ａ）を発現する安定細胞株の作製にｐＴａｒｇｅＴ（登録商標）ベクターを使用する。
コード配列には、ＷＮＴを分泌させるシグナル配列も含まれるであろう。シグナル配列は、ベクターの成分であっても、またはベクターに挿入されるＷｎｔコードＤＮＡの一部であってもよい。好ましく選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）配列である。哺乳類細胞の発現では、天然シグナル配列を使用してよく、または他の哺乳類のシグナル配列、例えば、他の動物のＷｎｔポリペプチド由来のシグナル配列、及び同種または関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、ならびにウイルスの分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルなどが好適であり得る。
発現ベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有してよい。この遺伝子は、選択培地で増殖させた形質転換した宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は培地で生存しないであろう。一般的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンなどに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性の欠損を補完するタンパク質、または（ｃ）複合培地からは利用できない重要な栄養を供給するタンパク質をコードする。
発現ベクターは、宿主生物によって認識され、かつＷｎｔコード配列に機能的に連結されているプロモーターを含有するであろう。プロモーターは、それらが機能的に連結している特定の核酸配列の転写と翻訳とを制御する、構造遺伝子の開始コドン上流（５’）（一般に約１００～１０００ｂｐ以内）に位置する非翻訳配列である。そのようなプロモーターは典型的に誘導性プロモーターと構成的プロモーターとの２つクラスに分けられる。誘導性プロモーターは、培養条件の何らかの変化、例えば、栄養の有無または温度変化などに応答して、これらのプロモーター制御下にあるＤＮＡからの高レベルの転写を開始するプロモーターである。多種多様な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。Ｗｎｔポリペプチドの発現を導くために、天然型Ｗｎｔポリペプチドのプロモーター配列及び多くの異種プロモーターのいずれを使用してもよい。しかしながら、一般に、優れた転写量と高効率とが可能であることから異種プロモーターが好ましい。
哺乳類宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得たプロモーター、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、または免疫グロブリンプロモーターなどから得たプロモーター、熱ショックプロモーターから得たプロモーターなどによって制御されてよいが、かかるプロモーターは宿主細胞系との適合性があるものに限る。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期のプロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターはＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として好都合に得られる。
ベクターにエンハンサー配列を挿入して転写量を増加させてよい。エンハンサーは、通常約１０～３００ｂｐのシス作用性ＤＮＡエレメントであり、プロモーターに作用してその転写を増加させる。エンハンサーは方向及び位置とは比較的無関係であり、転写単位の５’及び３’、イントロン内、ならびにコード配列自体の内部に見出されている。現在では哺乳類の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、及びインスリン）から多くのエンハンサー配列が知られている。しかし、典型的には、真核細胞のウイルスに由来するエンハンサーが使用されるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、発現ベクターのコード配列に対して５’または３’の位置にスプライシングしてよいが、好ましくはプロモーターから５’側の部位に位置させる。
哺乳類宿主細胞に使用する発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有するであろう。そのような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡもしくはｃＤＮＡの５’、ときに３’の非翻訳領域から共通して利用可能である。これらの領域は、ＷｎｔポリペプチドをコードするｍＲＮＡ非翻訳部分でポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。
上掲成分の１つ以上を含有する好適なベクターの構築では標準的な技術を使用する。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片は、切断、調整され、必要ベクターの作製に所望される形態に再ライゲートされる。
本発明の実施に特に有用であるのは、哺乳類の細胞で一過性に発現する発現ベクターである。一般に、一過性発現では、宿主細胞で効率的に複製を行える発現ベクターを使用し、宿主細胞に発現ベクターのコピーが多数蓄積されて、それにより発現ベクターでコードされる所望ポリペプチドが高レベルで合成されるようにする。好適な発現ベクターと宿主細胞とを含む一過性発現系では、クローンＤＮＡにコードされるポリペプチドの簡便で確実な同定、ならびにそのようなポリペプチドの所望の生物学的または生理的な特性についての短時間スクリーニングが可能になる。
ある場合には、無血清培地を使用する。無血清培地の非限定的な例には、ＣＤ ＣＨＯ培地、ＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ（登録商標）培地、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（登録商標）培地、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ ＩＩ（任意選択でヒポキサンチン及びチミジンが含まれる）、ＣＤ２９３ ＡＧＴ（登録商標）培地、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＥＭ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（登録商標）２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（登録商標）ＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地、ＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ（登録商標）培地、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３２５ ＰＦ ＣＨＯ無血清培地、動物由来成分不含ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ ＣＨＯ－２培地、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ ＣＨＯ－３培地、及び動物由来成分不含ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤＨＯ ＤＨＦＲ－培地が挙げられる。
本発明の方法は、ＧＭＰ製造に関するＦＤＡまたはＷＨＯのガイドラインに従うために実施され得る。上記のためのガイドラインは関連規制当局から入手され得る。例えば、各々が参照により本明細書に具体的に組み込まれる、”ＷＨＯ ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ：ｍａｉｎ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ａｎｎｅｘ ３ ｉｎ：ＷＨＯ Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ｆｏｒｔｙ－ｆｉｆｔｈ ｒｅｐｏｒｔ．Ｇｅｎｅｖａ，Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，２０１１（ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ．９６１）”；“ＩＣＨ Ｑ５Ｂ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒ－ＤＮＡ ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｇｅｎｅｖａ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ，１９９５”；“Ｈａｎｄｂｏｏｋ：ｇｏｏｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＬＰ）：ｑｕａｌｉｔｙ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｎｏｎ－ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２ｎｄ ｅｄ．Ｇｅｎｅｖａ，ＵＮＤＰ／Ｗｏｒｌｄ Ｂａｎｋ／ＷＨＯ，Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒａｉｎｉｎｇ ｉｎ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００９”を参照のこと。
典型的に、組換えＤＮＡ由来の生物学的治療薬は、マスターセルバンクに由来する製造者のワーキングセルバンク（ＷＣＢ）を利用するセルバンクシステムを使用して製造される。本発明には、ＷＮＴ３Ａタンパク質を分泌させるためにベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｓ細胞の凍結分割試料が含まれ、これらの細胞をマスターセルバンクとして、またはワーキングセルバンクとして使用することができる。
方法
本明細書の開示には、生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドを分泌させるための無血清プロセスの開発が含まれる。ある場合には、生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドは、ヒトの生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドである。場合によっては、生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。場合によっては、生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドは、ヒトＷｎｔ３Ａポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターをｃＧＭＰ適合細胞株にトランスフェクトする。例示的なｃＧＭＰ適合細胞株には、哺乳類細胞株、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞株、もしくはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株など、または昆虫細胞株、例えば、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１細胞株、Ｔｎ－３６８細胞株、もしくはＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）細胞株などが含まれる。
ある場合には、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞株、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１細胞株、Ｔｎ－３６８細胞株、またはＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）細胞株から選択されるｃＧＭＰ適合細胞株にトランスフェクトする。ある場合には、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターを、ＣＨＯ細胞株にトランスフェクトする。ある場合には、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターを、ＢＨＫ細胞株にトランスフェクトする。ある場合には、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターを、ＨＥＫ細胞株にトランスフェクトする。ある場合には、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターを、Ｓｆ９細胞株にトランスフェクトする。ある場合には、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターを、Ｓｆ２１細胞株にトランスフェクトする。ある場合には、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターを、Ｔｎ－３６８細胞株にトランスフェクトする。ある場合には、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターを、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞株にトランスフェクトする。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。ある場合には、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞株、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１細胞株、Ｔｎ－３６８細胞株、またはＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）細胞株から選択されるｃＧＭＰ適合細胞株にトランスフェクトする。ある場合には、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターを、ＣＨＯ細胞株にトランスフェクトする。ある場合には、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターを、ＢＨＫ細胞株にトランスフェクトする。ある場合には、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターを、ＨＥＫ細胞株にトランスフェクトする。ある場合には、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターを、Ｓｆ９細胞株にトランスフェクトする。ある場合には、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターを、Ｓｆ２１細胞株にトランスフェクトする。ある場合には、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターを、Ｔｎ－３６８細胞株にトランスフェクトする。ある場合には、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターを、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞株にトランスフェクトする。
場合によっては、ＣＨＯ細胞株はＣＨＯ－Ｓ細胞株である。ある場合には、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターを、ＣＨＯ－Ｓ細胞株にトランスフェクトする。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。ある場合には、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターを、ＣＨＯ－Ｓ細胞株にトランスフェクトする。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの配列番号１または配列番号２をコードする発現ベクターを、ＣＨＯ－Ｓ細胞株にトランスフェクトする。さらなる場合には、変異型（例えば、欠失型または切断型）を含むＷｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターを、ＣＨＯ－Ｓ細胞株にトランスフェクトする。
ある場合には、欠失または切断を含むＷｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｓ細胞を組み合わせることにより、最小血清培地（例えば、無血清条件）中にタンパク質を有効に分泌させることができる。場合によっては、欠失または切断はＣ末端の欠失または切断である。ある場合には、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは配列番号１の記載と同様である。場合によっては、配列番号１（ＢＣ１０３９２１）に対しＣ末端が切断されているＷｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｓ細胞を組み合わせることにより、血清または他の動物由来物質の非存在下で培地中にタンパク質を有効に分泌させることができる。
本明細書の他の箇所に記載があるように、最小血清培地は血清を９％未満含む場合がある。場合によっては、血清はＦＢＳである。場合によっては、最小血清培地中に存在するＦＢＳは最高で約０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、またはそれ以下である。場合によっては、最小血清培地中に存在するＦＢＳは少なくとも約０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、またはそれ以上である。場合によっては、最小血清培地中に存在するＦＢＳは約０．０５％である。場合によっては、最小血清培地中に存在するＦＢＳは約０．１％である。場合によっては、最小血清培地中に存在するＦＢＳは約０．５％である。場合によっては、最小血清培地中に存在するＦＢＳは約１％である。場合によっては、最小血清培地中に存在するＦＢＳは約２％である。場合によっては、最小血清培地中に存在するＦＢＳは約３％である。場合によっては、最小血清培地中に存在するＦＢＳは約４％である。場合によっては、最小血清培地中に存在するＦＢＳは約５％である。場合によっては、最小血清培地中に存在するＦＢＳは約６％である。場合によっては、最小血清培地中に存在するＦＢＳは約７％である。場合によっては、最小血清培地中に存在するＦＢＳは約８％である。場合によっては、最小血清培地中に存在するＦＢＳは約９％である。他の場合には、最小血清培地は無血清培地である。
時には、最小血清培地は、植物加水分解物から得られたペプチド及び／またはポリペプチドなどの成分を含むが、タンパク質または動物由来の成分を含まない。他の場合には、最小血清培地は、組換えタンパク質及び／またはホルモンを含み、ＦＢＳ、ウシ血清アルブミン、またはヒト血清アルブミンを含まない。さらなる場合には、最小血清培地は、低分子量構成成分ならびに任意選択で合成のペプチド及び／またはホルモンを含む。
いくつかの実施形態では、最小血清培地は、１つ以上のさらなる添加物を含有する。いくつかの実施形態では、さらなる添加物は脂質添加物である。脂質添加物の非限定的な例には、Ｌｉｐｉｄ Ｍｉｘｔｕｒｅ １（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌｉｐｉｄ Ｍｉｘｔｕｒｅ ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌｉｐｏｇｒｏ（登録商標）（Ｒｏｃｋｙ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、及びＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、無血清培地は脂質添加物を含有する。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、分泌のためのシグナル配列を含むＣ末端切断型Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド）を含む発現ベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ－Ｓ細胞）を無血清培地中で培養することを含み、かかるシグナル配列は、天然型Ｗｎｔ（例えば、Ｗｎｔ３Ａ）シグナル配列または異種シグナル配列であり得、Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド）が発現し、分泌される条件下でプロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、方法は、発現ベクターを細胞にトランスフェクトする開始ステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、培地からそのようにして作製されたポリペプチドの精製を含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド）をＧＭＰ臨床使用に好適な程度まで精製する。いくつかの実施形態では、このように精製したＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド）を単位用量製剤にして包装する。
いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞を浮遊状態で増殖させる。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞は接着性である。いくつかの実施形態では、培地は血清代替物を含む。いくつかの実施形態では、血清代替物は動物由来物質不含である。いくつかの実施形態では、血清代替物は、精製タンパク質、例えば、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミンなどの１つ以上を含むが、例えば、増殖因子、ステロイドホルモン、グルココルチコイド、細胞接着因子、検出可能Ｉｇ、マイトジェンなどを欠いている。血清代替物は、最高約０．１％、最高約０．２５％、最高約０．５％、最高約０．７５％、最高約１％、最高約２．５％、最高約５％、最高約７．５％、または最高約１０％の培地中濃度で存在してよい。血清代替物は、最高約０．１％の培地中濃度で存在してよい。血清代替物は、最高約０．２５％の培地中濃度で存在してよい。血清代替物は、最高約０．５％の培地中濃度で存在してよい。血清代替物は、最高約０．７５％の培地中濃度で存在してよい。血清代替物は、最高約１％の培地中濃度で存在してよい。血清代替物は、最高約２．５％の培地中濃度で存在してよい。血清代替物は、最高約５％の培地中濃度で存在してよい。血清代替物は、最高約７．５％の培地中濃度で存在してよい。血清代替物は、最高約１０％の培地中濃度で存在してよい。
好適な培地は、当該技術分野で公知の培地から選択してよく、それらとしては、限定するわけではないが、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、ＭＥＭ、イスコフ培地、ＣＨＯ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ等が挙げられる。好適な血清代替物には、動物由来物質を使用せずに製造されたもの、または精製された動物性タンパク質成分のみを使用して製造されたものが含まれる。この目的に好適な市販添加物には、限定することなく、ＣｅｌｌＥｓｓ、ＩＴＳ（例えば、ＩＴＳ３またはＩＴＳ３＋）、Ｅｘｃｙｔｅ、ＯｎｅＳｈｏｔ、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ等、当該技術分野で公知のものが含まれる。ある場合には、ＩＴＳ添加物は、インスリン、トランスフェリン、及びセレニウムの混合物を含む添加物である。培地は、限定することなく、ＧｌｕｔａＭａｘ（登録商標）（グルタミン系ジペプチド）、抗生物質（例えば、ドキシサイクリン）、Ｇ４１８、非必須アミノ酸、ブラストサイジンなどの構成成分をさらに含んでよい。
無血清培地中へのＷｎｔポリペプチド分泌量は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１μｇ／ｍｌ、少なくとも約１．１μｇ／ｍｌ、少なくとも約１．２５μｇ／ｍｌ、少なくとも約１．５μｇ／ｍｌ、少なくとも約１．７５μｇ／ｍｌ、少なくとも約２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも約５μｇ／ｍｌ、少なくとも約７．５μｇ／ｍｌ、少なくとも約１０μｇ／ｍｌまたはそれ以上であってよい。無血清培地中へのＷｎｔポリペプチド分泌量は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔポリペプチド分泌量は、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔポリペプチド分泌量は、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔポリペプチド分泌量は、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔポリペプチド分泌量は、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔポリペプチド分泌量は、少なくとも約２５０ｎｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔポリペプチド分泌量は、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔポリペプチド分泌量は、少なくとも約７５０ｎｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔポリペプチド分泌量は、少なくとも約１μｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔポリペプチド分泌量は、少なくとも約１．１μｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔポリペプチド分泌量は、少なくとも約１．２５μｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔポリペプチド分泌量は、少なくとも約１．５μｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔポリペプチド分泌量は、少なくとも約１．７５μｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔポリペプチド分泌量は、少なくとも約２．５μｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔポリペプチド分泌量は、少なくとも約５μｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔポリペプチド分泌量は、少なくとも約７．５μｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔポリペプチド分泌量は、少なくとも約１０μｇ／ｍｌであってよい。ある場合には、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ５Ａポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。
ある場合には、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、無血清培地中へのＷｎｔ３Ａポリペプチド分泌は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１μｇ／ｍｌ、少なくとも約１．１μｇ／ｍｌ、少なくとも約１．２５μｇ／ｍｌ、少なくとも約１．５μｇ／ｍｌ、少なくとも約１．７５μｇ／ｍｌ、少なくとも約２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも約５μｇ／ｍｌ、少なくとも約７．５μｇ／ｍｌ、少なくとも約１０μｇ／ｍｌまたはそれ以上である。
無血清培地中へのＷｎｔ３Ａポリペプチド分泌量は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔ３Ａポリペプチド分泌量は、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔ３Ａポリペプチド分泌量は、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔ３Ａポリペプチド分泌量は、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔ３Ａポリペプチド分泌量は、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔ３Ａポリペプチド分泌量は、少なくとも約２５０ｎｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔ３Ａポリペプチド分泌量は、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔ３Ａポリペプチド分泌量は、少なくとも約７５０ｎｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔ３Ａポリペプチド分泌量は、少なくとも約１μｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔ３Ａポリペプチド分泌量は、少なくとも約１．１μｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔ３Ａポリペプチド分泌量は、少なくとも約１．２５μｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔ３Ａポリペプチド分泌量は、少なくとも約１．５μｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔ３Ａポリペプチド分泌量は、少なくとも約１．７５μｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔ３Ａポリペプチド分泌量は、少なくとも約２．５μｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔ３Ａポリペプチド分泌量は、少なくとも約５μｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔ３Ａポリペプチド分泌量は、少なくとも約７．５μｇ／ｍｌであってよい。無血清培地中へのＷｎｔ３Ａポリペプチド分泌量は、少なくとも約１０μｇ／ｍｌであってよい。
いくつかの実施形態では、発現し分泌されるＷｎｔポリペプチドのＣ末端は５～４０個のアミノ酸が切断されている。ある場合には、発現し分泌されるＷｎｔポリペプチドのＣ末端は５～３５個のアミノ酸、１０～３５個のアミノ酸、１０～３３個のアミノ酸、１０～３０個のアミノ酸、１５～３３個のアミノ酸、１５～３０個のアミノ酸、２０～３５個のアミノ酸、２０～３３個のアミノ酸、２０～３０個のアミノ酸、２５～３３個のアミノ酸または２５～３０個のアミノ酸が切断されている。
いくつかの実施形態では、発現し分泌されるＷｎｔポリペプチドのＣ末端は１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個またはそれ以上のアミノ酸が切断されており、Ｎ末端またはＣ末端でさらに切断してよいが、タンパク質の生物学的活性は維持されるものとする。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは５個のアミノ酸が切断されている。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは１０個のアミノ酸が切断されている。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは１５個のアミノ酸が切断されている。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは２０個のアミノ酸が切断されている。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは２５個のアミノ酸が切断されている。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは３０個のアミノ酸が切断されている。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは３３個のアミノ酸が切断されている。
ある場合には、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態では、発現し分泌されるＷｎｔ３ＡポリペプチドのＣ末端は１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個またはそれ以上のアミノ酸が切断されており、Ｎ末端またはＣ末端でさらに切断してよいが、タンパク質の生物学的活性は維持されるものとする。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは５個のアミノ酸が切断されている。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは１０個のアミノ酸が切断されている。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは１５個のアミノ酸が切断されている。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは２０個のアミノ酸が切断されている。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは２５個のアミノ酸が切断されている。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは３０個のアミノ酸が切断されている。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは３３個のアミノ酸が切断されている。
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号１に対する配列同一性が少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号１に対する配列同一性が少なくとも７０％である配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号１に対する配列同一性が少なくとも８０％である配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号１に対する配列同一性が少なくとも８５％である配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号１に対する配列同一性が少なくとも９０％である配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号１に対する配列同一性が少なくとも９５％である配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号１に対する配列同一性が少なくとも９６％である配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号１に対する配列同一性が少なくとも９７％である配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号１に対する配列同一性が少なくとも９８％である配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号１に対する配列同一性が少なくとも９９％である配列を有する。
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号２に対する配列同一性が少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号２に対する配列同一性が少なくとも７０％である配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号２に対する配列同一性が少なくとも８０％である配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号２に対する配列同一性が少なくとも８５％である配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号２に対する配列同一性が少なくとも９０％である配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号２に対する配列同一性が少なくとも９５％である配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号２に対する配列同一性が少なくとも９６％である配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号２に対する配列同一性が少なくとも９７％である配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号２に対する配列同一性が少なくとも９８％である配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、配列番号２に対する配列同一性が少なくとも９９％である配列を有する。
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド）を少なくとも約５μｇ／ｍｌの初期濃度、通常は少なくとも約１０μｇ／ｍｌ、より一般には少なくとも約５０μｇ／ｍｌの初期濃度まで精製し、約１００μｇ／ｍｌ超で存在してよい。Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド）は、リポソームに製剤化してよい。Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド）は、界面活性剤を用いて製剤中で安定化させてよい。Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド）は、脂質を用いて製剤中で安定化させてよい。
いくつかの実施形態では、リポソームは、当該技術分野において周知の方法を使用して製造される。リポソームは、ラメラ相の脂質二重層及び水性コアで構成される人工調製される球状小胞である。リポソームには、多重層小胞（ＭＬＶ）、小さい一枚膜リポソーム小胞（ＳＵＶ）、大きい一枚膜小胞（ＬＵＶ）、及び渦巻状の小胞など幾つかの種類がある。ある場合には、リポソームをリン脂質により形成する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ジアシルグリセリド構造を持つもの、またはスフィンゴリン脂質から誘導されるものに分けられる。いくつかの実施形態では、ジアシルグリセリド構造には、ホスファチジン酸（ホスファチダート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ならびに、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、及びホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）などのホスホイノシタイドが含まれる。いくつかの実施形態では、スフィンゴリン脂質には、セラミドホスホリルコリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、及びセラミドホスホリル脂質が含まれる。いくつかの実施形態では、リポソームは、ホスファチジルコリンで形成される。
いくつかの実施形態では、脂質はまた、その相転移温度（Ｔm ）、または液晶相とゲル相間の温度界面に基づいても選択される。いくつかの実施形態では、Ｔm は、頭部基種、炭化水素鎖長、不飽和度、及び電荷により左右される。例えば、短い脂質（尾部炭素８個、１０個、または１２個を含有する鎖長の脂質）は４℃を下回る温度で液晶相である。しかし、これらの短い炭素鎖の脂質で製造されるリポソームは細胞膜を溶解させるため細胞に対する毒性がある。長い炭素鎖の脂質で製造されるリポソームは細胞に対する毒性はないが、その転移温度は高い。例えば、尾部の炭素鎖長１６の１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）は、Ｔm が約４１℃である。いくつかの実施形態では、本明細書で使用する脂質は、Ｔm が約１０℃～約３７℃、１５℃～約３０℃、１８℃～約２７℃、または２１℃～約２５℃である。いくつかの実施形態では、本明細書で使用する脂質は、Ｔm が少なくとも２２℃、２３℃、２４℃、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、本明細書で使用する脂質は、Ｔm が最高で２２℃、２３℃、２４℃、またはそれ以下である。いくつかの実施形態では、本明細書で使用する脂質は、尾部の炭素鎖長が少なくとも約１２、１３、１４、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、本明細書で使用する脂質は、尾部の炭素鎖長が最高で約１２、１３、１４、またはそれ以下である。
いくつかの実施形態では、脂質は、リポソームの正味電荷に基づいてさらに選択される。いくつかの実施形態では、リポソームは、ｐＨが約４．０～約１０．０、約５．０～約９．０、約６．５～約８．０、約７．０～約７．８、または約７．２～約７．６における正味電荷が０である。いくつかの実施形態では、リポソームは、ｐＨが約７．３、約７．４、または約７．５における正味電荷が０である。いくつかの実施形態では、リポソームは、ｐＨが約４．０～約１０．０、約５．０及び約９．０、約６．５及び約８．０、約７．０及び約７．８、または約７．２及び約７．６における正味電荷が正である。いくつかの実施形態では、リポソームは、ｐＨが約７．３、約７．４、または約７．５における正味電荷が正である。いくつかの実施形態では、リポソームは、ｐＨが約４．０～約１０．０、約５．０及び約９．０、約６．５及び約８．０、約７．０及び約７．８、または約７．２及び約７．６における正味電荷が負である。いくつかの実施形態では、リポソームは、ｐＨが約７．３、約７．４、または約７．５における正味電荷が負である。
いくつかの実施形態では、脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１－テトラデカノイル－２－ヘキサデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＭＰＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＭＰＳ）、及び１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＧ）から選択される。いくつかの実施形態では、脂質はＤＭＰＣである。
いくつかの実施形態では、さらなる脂質を用いてリポソームを作製する。いくつかの実施形態では、さらなる脂質はコレステロールである。ある場合には、ＤＭＰＣ及びコレステロールなどのホスファチジルコリンの濃度を、比などの値で定義する。いくつかの実施形態では、ＤＭＰＣ及びコレステロールなどのホスファチジルコリンの濃度の比は約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約９９：１、または約１００：０の間である。いくつかの実施形態では、ＤＭＰＣ及びコレステロールなどのホスファチジルコリンの濃度の比は約９０：１０である。いくつかの実施形態では、濃度単位はモルである。いくつかの実施形態では、比はモル：モルである。
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、リポソームと共に少なくとも約０．０１ｎｇ／μＬ、０．０１５ｎｇ／μＬ、０．０２ｎｇ／μＬ、０．０２５ｎｇ／μＬ、０．０３ｎｇ／μＬ、０．０３５ｎｇ／μＬ、０．０４ｎｇ／μＬ、０．０４５ｎｇ／μＬ、０．０５ｎｇ／μＬ、０．０５５ｎｇ／μＬ、０．０６ｎｇ／μＬ、０．０６５ｎｇ／μＬ、０．０７ｎｇ／μＬ、０．０７５ｎｇ／μＬ、０．０８ｎｇ／μＬ、０．０８５ｎｇ／μＬ、０．０９ｎｇ／μＬ、０．０９５ｎｇ／μＬ、０．１ｎｇ／μＬ、０．１５ｎｇ／μＬ、０．２ｎｇ／μＬ、０．２５ｎｇ／μＬ、０．３ｎｇ／μＬ、０．４ｎｇ／μＬ、０．５ｎｇ／μＬまたはそれ以上の濃度で再構成される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、リポソームと共に最高で約０．０１ｎｇ／μＬ、０．０１５ｎｇ／μＬ、０．０２ｎｇ／μＬ、０．０２５ｎｇ／μＬ、０．０３ｎｇ／μＬ、０．０３５ｎｇ／μＬ、０．０４ｎｇ／μＬ、０．０４５ｎｇ／μＬ、０．０５ｎｇ／μＬ、０．０５５ｎｇ／μＬ、０．０６ｎｇ／μＬ、０．０６５ｎｇ／μＬ、０．０７ｎｇ／μＬ、０．０７５ｎｇ／μＬ、０．０８ｎｇ／μＬ、０．０８５ｎｇ／μＬ、０．０９ｎｇ／μＬ、０．０９５ｎｇ／μＬ、０．１ｎｇ／μＬ、０．１５ｎｇ／μＬ、０．２ｎｇ／μＬ、０．２５ｎｇ／μＬ、０．３ｎｇ／μＬ、０．４ｎｇ／μＬ、０．５ｎｇ／μＬまたはそれ以下の濃度で再構成される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、リポソームと共にＷｎｔポリペプチド対リポソームが少なくとも約０．１：５０、０．５：３０、１：２０、もしくは１：１４、またはそれ以上の比で再構成される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、リポソームと共にＷｎｔポリペプチド対リポソームが最高で約０．１：５０、０．５：３０、１：２０、もしくは１：１４、またはそれ以下の比で再構成される。ある場合には、比は重量対重量比である。ある場合には、Ｗｎｔポリペプチドの単位はナノグラム単位である。
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドをリポソームと共に再構成する温度は少なくとも約１５℃～約３７℃、約１８℃～約３３℃、または約２０℃～約２８℃である。いくつかの実施形態では、温度は少なくとも約２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、温度は最高で約２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、またはそれ以下である。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、リポソーム膜内に組み込まれている。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは、リポソーム膜から脂質膜の表面に突出している。ある場合には、Ｗｎｔポリペプチドはリポソームの水性コア中に組み込まれていない。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、リポソーム膜内に組み込まれている。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、リポソーム膜から脂質膜の表面に突出している。ある場合には、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドはリポソームの水性コア中に組み込まれていない。
いくつかの実施形態では、リポソームと共に再構成されたＷｎｔポリペプチドはリポソームＷｎｔポリペプチドまたはＬ－Ｗｎｔと呼ばれる。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態では、リポソームと共に再構成されたＷｎｔ３ＡポリペプチドはリポソームＷｎｔ３ＡポリペプチドまたはＬ－Ｗｎｔ３Ａと呼ばれる。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態では、リポソームと共に再構成されたＷｎｔ５ＡポリペプチドはリポソームＷｎｔ５ＡポリペプチドまたはＬ－Ｗｎｔ５Ａと呼ばれる。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチドである。いくつかの実施形態では、リポソームと共に再構成されたＷｎｔ１０ＢポリペプチドはリポソームＷｎｔ１０ＢポリペプチドまたはＬ－Ｗｎｔ１０Ｂと呼ばれる。
いくつかの実施形態では、Ｌ－Ｗｎｔを遠心分離ステップに供し、その後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液に懸濁させる。ある場合には、Ｌ－Ｗｎｔを窒素下で保存する。ある場合には、Ｌ－Ｗｎｔは窒素下で安定であり、実質的な活性損失がない。ある場合には、Ｌ－Ｗｎｔを温度約１℃～約８℃で保存する。ある場合には、Ｌ－Ｗｎｔは少なくとも約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、またはそれ以上の温度で安定であり、実質的な活性損失がない。ある場合には、Ｌ－Ｗｎｔは最高で約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、またはそれ以下の温度で安定であり、実質的な活性損失がない。いくつかの実施形態では、Ｌ－Ｗｎｔは少なくとも約１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、３５日間、４０日間、４５日間、５０日間、５５日間、６０日間、６５日間、７０日間、７５日間、８０日間、８５日間、９０日間、９５日間、１００日間、１０１日間、１０２日間、１０３日間、１０４日間、１０５日間、１０６日間、１０７日間、１０８日間、１０９日間、１１０日間、１１５日間、１２０日間、１３０日間、１４０日間、１５０日間、１６０日間、１７０日間、１８０日間、１９０日間、２００日間、３００日間、３５６日間、４００日間、７００日間、１０００日間、またはそれ以上の間安定であり、実質的な活性損失がない。いくつかの実施形態では、Ｌ－Ｗｎｔは最高で約１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、３５日間、４０日間、４５日間、５０日間、５５日間、６０日間、６５日間、７０日間、７５日間、８０日間、８５日間、９０日間、９５日間、１００日間、１０１日間、１０２日間、１０３日間、１０４日間、１０５日間、１０６日間、１０７日間、１０８日間、１０９日間、１１０日間、１１５日間、１２０日間、１３０日間、１４０日間、１５０日間、１６０日間、１７０日間、１８０日間、１９０日間、２００日間、３００日間、３５６日間、４００日間、７００日間、１０００日間、またはそれ以下の間安定であり、実質的な活性損失がない。
いくつかの実施形態では、Ｌ－Ｗｎｔ３Ａを遠心分離ステップに供し、その後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液に懸濁させる。ある場合には、Ｌ－Ｗｎｔ３Ａを窒素下で保存する。ある場合には、Ｌ－Ｗｎｔ３Ａは窒素下で安定であり、実質的な活性損失がない。ある場合には、Ｌ－Ｗｎｔ３Ａを温度約１℃～約８℃で保存する。ある場合には、Ｌ－Ｗｎｔ３Ａは少なくとも約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、またはそれ以上の温度で安定であり、実質的な活性損失がない。ある場合には、Ｌ－Ｗｎｔ３Ａは最高で約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、またはそれ以下の温度で安定であり、実質的な活性損失がない。いくつかの実施形態では、Ｌ－Ｗｎｔ３Ａは少なくとも約１０日間、２０日間、３０日間、４０日間、５０日間、６０日間、７０日間、８０日間、９０日間、１００日間、１１０日間、１２０日間、１３０日間、１４０日間、１５０日間、１６０日間、１７０日間、１８０日間、１９０日間、２００日間、３００日間、３５６日間、４００日間、７００日間、１０００日間、またはそれ以上の間安定であり、実質的な活性損失がない。いくつかの実施形態では、Ｌ－Ｗｎｔ３Ａは最高で約１０日間、２０日間、３０日間、４０日間、５０日間、６０日間、７０日間、８０日間、９０日間、１００日間、１１０日間、１２０日間、１３０日間、１４０日間、１５０日間、１６０日間、１７０日間、１８０日間、１９０日間、２００日間、３００日間、３５６日間、４００日間、７００日間、１０００日間、またはそれ以下の間安定であり、実質的な活性損失がない。
ある場合には、「実質的な活性損失がない」という用語は、リポソームＷｎｔポリペプチドの機能活性が、リポソーム非存在下の対応する天然型Ｗｎｔポリペプチドの機能活性に近いことを指す。ある場合には、リポソームＷｎｔポリペプチドの機能活性は、天然型Ｗｎｔポリペプチドの機能活性と比べて少なくとも約１００％、９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、またはそれ以上である。ある場合には、リポソームＷｎｔポリペプチドの機能活性は、天然型Ｗｎｔポリペプチドの機能活性と比べて最高で約１００％、９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、またはそれ以下である。ある場合には、Ｗｎｔポリペプチドの機能活性は、アッセイ、例えば、質量分析法、本明細書の他の箇所に記載があるバイオマーカー分析関連アッセイ、腎被膜下移植法などの移植手術、脊椎固定術、ＡＬＰ、ＴＲＡＰ、及びＴＵＮＥＬ染色、免疫組織化学、ならびにグラフト成長のマイクロＣＴ解析及び定量などを使用して検出する。
ある場合には、「安定である」という用語は、Ｗｎｔポリペプチドが折り畳まれた状態にあり、折り畳みがほどかれたり分解されたりしないことを指す。ある場合には、「安定である」という用語は、Ｗｎｔポリペプチドが機能活性を維持しており、実質的な活性損失がないことも指す。ある場合には、安定性を決定するために使用されるアッセイは上述のようなＷｎｔポリペプチドの活性を立証するアッセイであり、これには例えば、マウスＬＳＬ細胞ベースアッセイなどのＬＳＬ細胞ベースアッセイなども含まれる。
いくつかの実施形態では、シャペロンを使用するリポソームＷｎｔポリペプチドの調製方法を本明細書に開示する。ある場合には、方法は、（ａ）単離されたＷｎｔポリペプチドを複数のシャペロンと共にインキュベートしてＷｎｔポリペプチド－シャペロン複合体を作製すること、（ｂ）Ｗｎｔポリペプチド－シャペロン複合体と非複合体化シャペロンとを分離すること、及び（ｃ）Ｗｎｔポリペプチド－シャペロン複合体をリポソーム水溶液と接触させてリポソームＷｎｔポリペプチドを作製することを含む。
ある場合には、シャペロンを使用するＷｎｔポリペプチド精製方法も本明細書に開示する。ある場合には、方法は、（ａ）リポソームＷｎｔポリペプチドを複数のシャペロンと共にインキュベートしてリポソームＷｎｔポリペプチド－シャペロン複合体を形成させること、及び（ｂ）リポソームＷｎｔポリペプチド－シャペロン複合体と非複合体化シャペロンとを分離して精製リポソームＷｎｔポリペプチドを作製すること、及び（ｃ）リポソームＷｎｔポリペプチド－シャペロン複合体からリポソームＷｎｔポリペプチドを溶出させて精製リポソームＷｎｔポリペプチドを作製することを含む。
ある場合には、本明細書に記載するシャペロンは、高分子構造の組立てまたは分解を促進するタンパク質もしくはその断片を含む。ある場合には、シャペロンは、精製方法に役立つタンパク質またはその断片を含む。本発明においてＷｎｔポリペプチドとの関連で使用する場合、シャペロンは、単離されたＷｎｔポリペプチドの精製及び／またはリポソームＷｎｔポリペプチドの調製において役立つタンパク質またはその断片を含む。さらに、本発明においてＷｎｔポリペプチドとの関連で使用する場合、シャペロンは、単離されたタンパク質もしくは外因性タンパク質またはその断片であり、これは、単離されたＷｎｔポリペプチドを含む溶液にインビトロで加えられる。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドは、細胞溶液から採取され、精製されているＷｎｔポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、シャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄ－８を含む。ＦＺＤ８遺伝子によってコードされるＦｒｉｚｚｌｅｄ－８は７つの膜貫通ドメインがあるタンパク質であり、Ｗｎｔポリペプチドの受容体である。
ある場合には、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ－８（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＰ＿１１４０７２．１；配列番号４）は、６９４アミノ酸長を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８は、２７アミノ酸のシグナル配列、２４８アミノ酸の細胞外Ｎ末端、及び８９アミノ酸のＣ末端を含む。場合によっては、Ｎ末端は、２つの推定上のＮ－結合型グリコシル化部位、ポリプロリンセグメント及びポリグリシンセグメントをさらに含む。さらに、Ｎ末端は、約１２０アミノ酸長のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を含む。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８のＣ末端は、Ｔｈｒ－ｘ－Ｖａｌトリペプチド、Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－ｘ－ｘ－ｘ－Ｔｒｐモチーフ、及び２５アミノ酸長のポリグリシンリピートを含む。
ある場合には、本明細書に記載するＦｒｉｚｚｌｅｄ－８ポリペプチドは、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ－８に対する約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含む。場合によっては、本明細書に記載するＦｒｉｚｚｌｅｄ－８ポリペプチドは、配列番号４に対する約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するシャペロンは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、切断型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８タンパク質を含む。ある場合には、切断型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８タンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８のシステインリッチ領域（ＣＲＤ）を含む。ある場合には、切断型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８タンパク質は、配列番号４のアミノ酸残基２５からアミノ酸残基１７２に及ぶ領域を含む。
ある場合には、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、抗体のＦｃ部分をさらに含む。ある場合には、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭから選択される。場合によっては、抗体はＩｇＧである。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、切断型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８タンパク質（例えば、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８のＣＲＤ部分）及びＩｇＧのＦｃ部分を含む。
場合によっては、切断型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８タンパク質はＦｃ部分に共有結合で直接連結されている。他の場合には、切断型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８タンパク質はＦｃ部分にリンカーを介して間接的に共有結合で連結されている。ある場合には、リンカーは、一連のグリシン、アラニン、またはその組み合わせを含む。ある場合には、リンカーは、アミノ酸配列ＩＥＧＲＭＤ（配列番号６）を含む。
場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、配列番号５に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、配列番号５に対する少なくとも８０％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、配列番号５に対する少なくとも８５％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、配列番号５に対する少なくとも９０％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、配列番号５に対する少なくとも９５％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、配列番号５に対する少なくとも９６％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、配列番号５に対する少なくとも９７％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、配列番号５に対する少なくとも９８％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、配列番号５に対する少なくとも９９％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、配列番号５に対する１００％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、配列番号５に記載の配列で構成される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するシャペロンは、低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）または低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）を含む。ＬＲＰ５及びＬＲＰ６は、タンパク質のＷｎｔファミリーに対する共受容体として作用するＩ型、１回膜貫通糖タンパク質である。ある場合には、ＬＲＰ５は、２４アミノ酸のシグナル配列、１３６１アミノ酸の細胞外領域、２３アミノ酸のＴＭドメイン及び２０７アミノ酸の細胞質側末端を含む。場合によっては、ＬＲＰ６は、１９アミノ酸のシグナル配列、１３５３アミノ酸の細胞外ドメイン、２３アミノ酸のＴＭセグメント、及び２１８アミノ酸の細胞質側末端を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するシャペロンはＬＲＰ６である。
いくつかの実施形態では、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも１０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、またはそれ以上インキュベートする。ある場合には、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも１０分間またはそれ以上インキュベートする。ある場合には、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも３０分間またはそれ以上インキュベートする。ある場合には、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも１時間またはそれ以上インキュベートする。ある場合には、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも２時間またはそれ以上インキュベートする。ある場合には、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも３時間またはそれ以上インキュベートする。ある場合には、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも４時間またはそれ以上インキュベートする。ある場合には、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも５時間またはそれ以上インキュベートする。ある場合には、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも６時間またはそれ以上インキュベートする。ある場合には、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも１０時間またはそれ以上インキュベートする。ある場合には、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも１２時間またはそれ以上インキュベートする。ある場合には、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも１８時間またはそれ以上インキュベートする。ある場合には、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも２４時間またはそれ以上インキュベートする。場合によっては、最小血清条件からリポソーム非存在下で単離Ｗｎｔポリペプチドを得る。他の場合には、さらなる精製のために、単離されたＷｎｔポリペプチドをリポソームＷｎｔポリペプチドとして製剤化してからシャペロンとインキュベートする。
いくつかの実施形態では、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを温度約１℃～約３０℃でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを温度約１℃～約１０℃、約１℃～約８℃、または約１℃～約４℃でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを温度約１０℃～約３０℃、約１５℃～約３０℃、約２０℃～約３０℃、約２３℃～約３０℃、または約２５℃～約３０℃でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを温度約１℃～約１０℃でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを温度約１℃～約８℃でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを温度約１℃～約４℃でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを温度約１０℃～約３０℃でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを温度約１５℃～約３０℃でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを温度約２０℃～約３０℃でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを温度約２３℃～約３０℃でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを温度約２５℃～約３０℃でインキュベートする。場合によっては、最小血清条件からリポソーム非存在下で単離Ｗｎｔポリペプチドを得る。他の場合には、単離されたＷｎｔポリペプチドをリポソームＷｎｔポリペプチドとして製剤化する。
場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも１℃、２℃、４℃、８℃、１０℃、２０℃、２３℃、２５℃、または３０℃の温度でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも１℃の温度でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも２℃の温度でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも４℃の温度でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも８℃の温度でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも１０℃の温度でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも２０℃の温度でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも２３℃の温度でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも２５℃の温度でインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを少なくとも３０℃の温度でインキュベートする。場合によっては、最小血清条件からリポソーム非存在下で単離Ｗｎｔポリペプチドを得る。他の場合には、さらなる精製のために、単離されたＷｎｔポリペプチドをリポソームＷｎｔポリペプチドとして製剤化してからシャペロンとインキュベートする。
いくつかの実施形態では、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとを、Ｗｎｔポリペプチド：シャペロン比を約１：０．５、１：１、１：１．５、１：２、１：２．５、１：３、１：４、または約１：５にしてインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとをＷｎｔポリペプチド：シャペロン比を約１：０．５にしてインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとをＷｎｔポリペプチド：シャペロン比を約１：１にしてインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとをＷｎｔポリペプチド：シャペロン比を約１：１．５にしてインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとをＷｎｔポリペプチド：シャペロン比を約１：２にしてインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとをＷｎｔポリペプチド：シャペロン比を約１：２．５にしてインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとをＷｎｔポリペプチド：シャペロン比を約１：３にしてインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとをＷｎｔポリペプチド：シャペロン比を約１：４にしてインキュベートする。場合によっては、単離されたＷｎｔポリペプチドと複数のシャペロンとをＷｎｔポリペプチド：シャペロン比を約１：５にしてインキュベートする。場合によっては、最小血清条件からリポソーム非存在下で単離Ｗｎｔポリペプチドを得る。他の場合には、さらなる精製のため、単離されたＷｎｔポリペプチドをリポソームＷｎｔポリペプチドとして製剤化してからシャペロンとインキュベートする。
いくつかの実施形態では、複数のシャペロンの各々をビーズにさらに固定化する。場合によっては、各シャペロンをビーズに直接固定化する。他の場合には、各シャペロンをビーズに間接的に固定化する。
いくつかの実施形態では、複数のシャペロンの各々はＦｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質を直接ビーズに固定化する。他の場合には、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質を間接的にビーズに固定化し、その場合、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は抗体のＦｃ部分を認識するポリペプチドに結合されており、ここで、ポリペプチドはビーズに固定化されている。場合によっては、ポリペプチドはタンパク質Ａである。
ある場合には、分離ステップを実施して、Ｗｎｔポリペプチド－シャペロン複合体及び／または単離Ｗｎｔポリペプチドを複数のビーズから溶出させる。場合によっては、分離ステップを回分方式で行う。他の場合には、シャペロン及び／または抗体のＦｃ部分を認識するポリペプチド（例えば、タンパク質Ａ）にさらに結合しているシャペロンを固定化したカラムを使用して分離ステップを行う。場合によっては、分離ステップ（または溶出ステップ）には酸性ｐＨを含む緩衝液を使用する。場合によっては、緩衝液は、約２、２．５、３、３．５、４、５または約６のｐＨを含む。場合によっては、緩衝液は約３のｐＨを含む。
場合によっては、段階的勾配を使用して、Ｗｎｔポリペプチド－シャペロン複合体及び／または単離Ｗｎｔポリペプチドを複数のビーズから溶出させる。場合によっては、段階的勾配は第１の勾配及び第２の勾配を含む。場合によっては、第１の勾配は、最高で０ｍＭ、０．０１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、またはそれ以下の塩濃度を含む第１の緩衝液を含む。場合によっては、第１の勾配は、少なくとも０ｍＭ、０．０１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、またはそれ以上の塩濃度を含む第１の緩衝液を含む。場合によっては、第１の勾配を含む第１の緩衝液を洗浄ステップとして使用して未結合不純物（例えば、複合体化していないＷｎｔポリペプチド及び／またはシャペロン）を除去する。いくつかの実施形態では、最高で１、２、３、４、５、またはそれ以上の洗浄ステップを使用する。いくつかの実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５またはそれ以下の洗浄ステップを使用する。いくつかの実施形態では、第２の勾配は、少なくとも８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６５０ｍＭ、７００ｍＭ、７５０ｍＭ、８００ｍＭ、８５０ｍＭ、９００ｍＭ、９５０ｍＭ、１０００ｍＭ、１５００ｍＭ、２０００ｍＭ、またはそれ以上の塩濃度を含む第２の緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、第２の勾配は、最高で８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６５０ｍＭ、７００ｍＭ、７５０ｍＭ、８００ｍＭ、８５０ｍＭ、９００ｍＭ、９５０ｍＭ、１０００ｍＭ、１５００ｍＭ、２０００ｍＭ、またはそれ以下の塩濃度を含む第２の緩衝液を含む。例示的な塩には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等が挙げられる。
いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の緩衝液中に界面活性剤も配合する。いくつかの実施形態では、界面活性剤はＣＨＡＰＳまたはＴｒｉｔｏｎＸ－１００である。いくつかの実施形態では、ＣＨＡＰＳまたはＴｒｉｔｏｎＸ－１００の割合は少なくとも０．０１％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、ＣＨＡＰＳまたはＴｒｉｔｏｎＸ－１００の割合は最高で０．０１％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、またはそれ以下である。ある場合には、緩衝液成分、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミンＨＣｌ（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、３－｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（トリシン）、３－［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）等などを使用する。
ある場合には、第１及び／または第２の緩衝液のｐＨは少なくとも４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、またはそれ以上である。ある場合には、第１及び／または第２の緩衝液のｐＨは最高で４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、またはそれ以下である。
ある場合には、さらなる溶出ステップを使用して、Ｗｎｔポリペプチド－シャペロン複合体から単離Ｗｎｔポリペプチドを溶出させる。ある場合には、溶出緩衝液は、例えば、第１の勾配を含み、上記のような第２の勾配及び／または界面活性剤を含む第２の勾配を使用して、Ｗｎｔポリペプチド－シャペロン複合体から単離Ｗｎｔポリペプチドを溶出させる。
ある場合には、リポソーム水溶液を使用してＷｎｔポリペプチド－シャペロン複合体から単離Ｗｎｔポリペプチドを溶出させ、リポソームＷｎｔポリペプチドを作製する。ある場合には、シャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質である。場合によっては、リポソーム水溶液を使用して、Ｗｎｔポリペプチド－Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８複合体から単離Ｗｎｔポリペプチドを溶出させる。
Ｗｎｔポリペプチド組成物
組成物を提供し、その場合、無血清培地中に分泌される生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドは、無血清培地中または薬学的に許容される添加物中に少なくとも約０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも約０．２５μｇ／ｍｌ、少なくとも約０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも約０．７５μｇ／ｍｌ、少なくとも約１μｇ／ｍｌ、少なくとも約２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも約５μｇ／ｍｌ、少なくとも約７．５μｇ／ｍｌ、少なくとも約１０μｇ／ｍｌ、少なくとも約２５μｇ／ｍｌ、少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、少なくとも約７５μｇ／ｍｌ、少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、少なくとも約２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも約５００μｇ／ｍｌ、少なくとも約７５０μｇ／ｍｌ、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約７．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌ、またはそれ以上の濃度で提供される。
いくつかの実施形態では、本発明の方法及び培養系により作製されるＷｎｔポリペプチドは、培地を、ゲルろ過精製ステップを行わずにＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換カラムでの精製に供することによって精製される。一実施形態では、ヘパリン硫酸カラムの精製ステップを行わない精製も実施する。さらなる実施形態では、Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換カラムでの精製は、１５０ｍＭ～１．０Ｍの塩勾配を使用して実施し、その場合、塩は例えば、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムであってよい。他の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、単離Ｗｎｔポリペプチドとシャペロンとの複合体化、及びＷｎｔ－シャペロン複合体からの単離Ｗｎｔポリペプチドの溶出により精製される。精製スキームに続いてリポソームへの製剤化を行ってよい。安定保存などさまざまな目的のために、タンパク質を凍結乾燥してよい。好ましくは、最初に精製した、例えば、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌの調製物で凍結乾燥を実施する。タンパク質の安定性を改善するため、各種成分、例えば、脂質、界面活性剤などを加えてよい。
本発明の方法及び培養系により作製されるタンパク質は、治療投与用の各種製剤中に組み込み可能である。一態様では、薬剤を、適切な薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることにより医薬組成物に製剤化し、また、薬剤を、固形形態、半固形形態、または液体形態の調製物、例えば、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル、ミクロ粒子等などに製剤化する。したがって、タンパク質及び／または他の化合物の投与は、さまざまな方法で達成され得る。タンパク質及び／または他の化合物は、投与後、全身性であっても、または製剤的理由、もしくは移植部位で活性用量を維持するように作用する植込錠の使用により局所性であってもよい。
医薬投与剤形では、タンパク質及び／または他の化合物を、その薬学的に許容される塩形態で投与してよく、またはそれらを単独で使用するかもしくは他の薬学的に活性な成分と適切に併せ、また組み合わせて使用してもよい。薬剤を組み合わせて各種活性のカクテルにしてよい。以下の方法及び添加物は例示であり、本発明を限定するものとして解釈されるものではない。
医薬製剤は単位剤形にして提供されてよく、その場合、「単位剤形」という用語は、ヒト対象に対する単位用量として好適な物理的個別単位を指し、各単位は、所望効果を得るために十分であると計算された量になった所定量のタンパク質と、薬学的に許容される希釈剤、担体またはビヒクルとを含有する。本発明の単位剤形の規格は、採用される特定の組成物と達成すべき効果、及び宿主内における組成物関連の薬力学に応じて異なる。
薬学的に許容される添加物、例えば、ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤などは市販されている。さらに、薬学的に許容される助剤、例えば、ｐＨ調整剤と緩衝剤、等張化剤、安定化剤、湿潤剤等は市販されている。本発明の方法及び組成物において有用ないかなる化合物も、薬学的に許容される塩基付加塩として提供され得る。「薬学的に許容される塩基付加塩」は、遊離酸の生物学的有効性及び特性を保持する塩であり、生物学的もしくは他の面で望ましくない塩ではない塩を指す。これらの塩は、遊離酸に無機塩基または有機塩基を添加して調製される。無機塩基由来の塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム等の各塩が挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましい無機塩は、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウムの各塩である。有機塩基由来の塩には、第一級、第二級、及び第三級のアミン、天然に生じる置換アミンなどの置換アミン、環状アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２－ジメチルアミノエタノール、２－ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ－エチルピペリジン、ポリアミン樹脂等の各塩が挙げられるが、これに限定されるものではない。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン及びカフェインである。
治療される患者と状態及び投与経路に応じて、タンパク質を、平均的個人で１日あたり０．００１ｍｇ～５００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、例えば、２０ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で投与してよい。
当業者は、用量は、特定の酵素、症状の重症度及び副作用に対する対象の感受性と相関して異なり得ることを容易に理解するであろう。タンパク質によっては他のタンパク質よりも強力なものがある。所与の酵素の好ましい用量は、当業者によりさまざまな手段で容易に決定され得る。好ましい手段は、所与の化合物の生理的な効力の測定である。
本発明の組成物は、治療目的だけではなく予防目的に使用可能である。本発明において、「治療する」という用語は、疾患の予防及び疾患または既存の病態の治療の両方を指し、より一般的には、所望の組織、部位、タイミングなどにおけるＷｎｔ３Ａ活性の増強を指す。本発明は、罹患している疾患の治療において著しい進歩を提供し、患者の臨床症状の安定及び／または改善を助ける。そのような治療は、罹患組織の機能損失前に実施することが望ましいが、損失機能の回復またはさらなる機能損失の予防にも有用であり得る。治療効果の証拠は、疾患重症度の低減または病態の改善、例えば、骨治癒の亢進などであってよい。治療効果は、臨床転帰で測定でき、また生化学的検査で決定することもできる。別法として、疾患症状の軽減を探すことができる。
本発明の他の実施形態では細胞組成物を提供し、その場合、かかる細胞は、分泌用シグナル配列を含むＣ末端切断型Ｗｎｔ３Ａタンパク質を含んだ発現ベクターを含み、分泌用シグナル配列は、プロモーターに機能的に連結されている、天然型Ｗｎｔ３Ａシグナル配列または異種シグナル配列であり得る。いくつかの実施形態では、細胞はＣＨＯ－Ｓ細胞である。いくつかの実施形態では、無血清培地を含む組成物として細胞を提供する。他の実施形態では、細胞は凍結され、生存しており、任意選択で、播種培養に好適な分注で提供される。
細胞は、約１０3 細胞／ｍｌ、１０4 細胞／ｍｌ、１０5 細胞／ｍｌ、１０6 細胞／ｍｌ、１０7 細胞／ｍｌ、最高約１０8 細胞／ｍｌまたはそれ以上の濃度で容器に入れて、例えば、凍結した分注にして提供され得る。細胞は、任意の好適な培地に入れて凍結し、細胞の生存を維持することができ、ＤＭＳＯを含めてよい。細胞組成物は、マスターセルバンクまたはワーキングセルバンクで有用な例示組成物のＧＭＰ形式で提供可能であり、それらは条件とクローニング履歴とが明確な、単一宿主細胞から得られ、その後、複数の容器に分注される。
いくつかの実施形態では、組成物中のＷｎｔタンパク質の特定の活性を、機能アッセイでの活性レベル、例えば、β－カテニンの安定化、幹細胞増殖促進などの決定、非機能アッセイ、例えば、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、クマシー染色または銀染色のゲルの定量などにおいて存在するＷｎｔタンパク質量の定量化、及び生物学的に活性なＷｎｔと総Ｗｎｔとの比の決定により測定する。一般に、こうして明確にした、実質的に同種の組成物における特定の活性は、出発物質のそれの少なくとも約５％、通常は出発物質のそれの少なくとも約１０％となり、約２５％、約５０％、約９０％またはそれ以上であってよい。
Ｗｎｔの生物学的活性についてのアッセイには、β－カテニンの安定化が含まれ、これは、例えば、Ｗｎｔ組成物の系列希釈により測定可能である。Ｗｎｔの生物学的活性についての例示的アッセイではＷｎｔ組成物を細胞、例えば、マウスＬ細胞と接触させる。β－カテニンを安定させるために十分な期間、通常は少なくとも約１時間、細胞を培養し、次いで溶解させる。細胞溶解物をＳＤＳ ＰＡＧＥで分離した後、ニトロセルロースに転写し、β－カテニンに特異的な抗体でプローブする。他のアッセイとしては、アフリカツメガエルのアニマルキャップアッセイ法におけるＣ５７ＭＧの形質転換及び標的遺伝子の誘導が含まれる。
キット／製造品
ある実施形態では、本明細書に記載する１つ以上の方法、プロセス、及び組成物と共に使用するためのキット及び製造品を本明細書で開示する。そのようなキットには、担体、包装体、または本明細書に記載する方法で使用する別々の要素の１つを各々が含んでいる容器（複数可）、例えば、バイアル、チューブ等を受け入れる仕切られた容器が含まれる。好適な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。いくつかの実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチックなどのさまざまな材料で形成される。
本明細書で提供する製造品には包装材料が含有されている。包装材料の例には、瓶、チューブ、バッグ、容器、瓶、及び選択された製剤及び意図される投与と治療との方法に好適な任意の包装材料が挙げられるが、これに限定されるものではない。
例えば、容器（複数可）にはＷｎｔタンパク質が含まれている。そのようなキットには任意選択で、識別用の記述もしくはラベルまたは本明細書に記載の方法におけるその使用に関する説明書が含まれる。
キットには典型的に、内容物記載ラベル及び／または使用説明書、ならびに使用に関する説明を記載した添付文書が含まれる。説明書一式も典型的に含まれるであろう。
一実施形態では、ラベルは容器上または容器に付随している。一実施形態では、ラベルが容器上にあるのは、ラベルを形成する文字、数字または他の文字列が容器そのものに貼付、成形またはエッチングされている場合であり、ラベルが容器に付随しているのは、かかる容器も保持される入れ物またはキャリアの内部にラベルが、例えば、添付文書として入っている場合である。一実施形態では、ラベルを使用して、その内容物が特定の治療用途に使用されるものであることを示す。ラベルはまた、本明細書に記載する方法などにおける内容物の使用法も示す。
本発明のさらなる詳細を以下の非限定的な実施例において記載する。
実施例１
ヒトＷｎｔ３Ａポリペプチドの産生及び無血清培地中への分泌
ＷＮＴ３Ａは脂質修飾ヒト幹細胞増殖因子であり、成人幹細胞を活性化させ、それらの自己複製と生存とを刺激する上で有効である。タンパク質はグリコシル化及びパルミトイル化の翻訳後修飾を受ける。
無血清方法の開発に２つの一般方法を同時に行った。第１は、血清を用いて発現している細胞株を無血清条件に段階的に馴化させることを試みた。第２は、新しい細胞株を作製した。第１の方法では、ＷＮＴタンパク質分泌における血清の役割に取って代わるものを目指して５つ以上の別個の血清代替物を試験した。これらの代替物には、市販のＥｘｃｉｔｅ、Ｃｅｌｌ－Ｅｓｓ、脂質ミックス添加物、及びＩＴＳ添加物が含まれる。第２の方法では、以下の組み合わせすべてを厳密に評した。
１．ＷＮＴ３Ａ作製用のＧＭＰ適合細胞株を同定し、それらにはＣＨＯ－Ｋ、ＣＨＯ－Ｓ、ＤＧ４４、及びＴＲｅＸが含まれた。
２．ＷＮＴ３ＡをコードするｃＤＮＡクローンの両方を試験した（例えば、ＢＣ１０３９２２及びＢＣ１０３９２１）。
３．クローニング用ＧＭＰ適合ベクターを同定し、それらにはＯｐｔｉｃＶｅｃ、ｐＴａｒｇｅｔ、及びｐｃＤＮＡ４ＴＯが含まれた。
４．トランスフェクションに２つの方法を使用した（安定したトランスフェクションと一過性トランスフェクション）。
５．誘導に２つの方法を試験した（ドキシサイクリン及びテトラサイクリン）。
これらの方法のいずれにおいてもＣＨＯ細胞株からＷＮＴ３Ａが強く発現したが、分泌はされなかった。場合によっては非常に少量のＷＮＴ３Ａが条件培地に認められたが、このタンパク質の機能を示したものはなかった。
第１の方法を図１～３によりさらに例示する。図１は、血清代替物Ｅｘｃｙｔｅの存在下、及び血清濃度低下に伴うＷｎｔ３Ａ活性を示す。配列番号１に記載のタンパク質配列をコードする発現ベクターからＷｎｔポリペプチドを得る。血清５％＋ｅｘｃｙｔｅ（青色破線棒）、血清３％＋ｅｘｃｙｔｅ（赤色破線棒）及び血清２％＋ｅｘｃｙｔｅ（紫色破線棒）に馴化させた細胞の条件培地におけるＷｎｔ３Ａ活性を、デュアルライトレポーターアッセイを使用して分析した。この活性を、ｅｘｃｙｔｅ無添加の血清５％（青色中塗り棒）、血清３％（赤色中塗り棒）及び血清２％（紫色中塗り棒）に馴化させた細胞の条件培地における活性と比較した。血清１０％（橙色棒）で増殖させた細胞の条件培地を陽性対照として使用した。１０％ＦＢＳと比べると、血清２％及び血清２％＋ｅｘｃｙｔｅに馴化させた細胞の条件培地の活性は６．４％に低下した。血清濃度を低下させると条件培地におけるＷｎｔ３Ａ活性が低下した。Ｅｘｃｙｔｅを添加しても条件培地におけるＷｎｔ３Ａ活性に対する影響はなかった。
図２は、血清代替物ＣｅｌｌＥｓｓの存在下、及び血清濃度低下に伴うＷｎｔ３Ａ活性を示す。配列番号１に記載のタンパク質配列をコードする発現ベクターからＷｎｔ３Ａポリペプチドを得る。Ｅｘｃｙｔｅ添加血清７．５％及びＥｘｃｙｔｅ添加血清５％に馴化させた細胞の条件培地におけるＷｎｔ３Ａ活性を、デュアルライトレポーターアッセイを使用して分析した。この活性を、血清１０％で増殖させた細胞の条件培地におけるＷｎｔ３Ａ活性と比較した。培地にＣｅｌｌＥｓｓを存在させても条件培地におけるＷｎｔ３Ａ活性を回復させることはできなかった。
図３は、配列番号１に記載のタンパク質配列をコードする発現ベクターから得られるＷｎｔ３Ａ活性を示す。細胞をまずチャコール処理済みｏｎｅ ｓｈｏｔ ＦＢＳ（ＯＳＦＢＳ）に馴化させた。ＯＳＦＢＳに馴化させた細胞の条件培地では検出可能な活性は測定されなかった。ＯＳＦＢＳへの馴化の後、ＯＳＦＢＳにＩＴＳ３または脂質ミックス１のいずれかを添加した。条件培地におけるＷＮＴ３Ａ活性をＬＳＬデュアルライトレポーターアッセイを使用して試験した。ＯＳＦＢＳ＋ＩＴＳ試料に馴化させた細胞の条件培地は、陽性対照（１０％ＦＢＳ）と比べて約１０％の活性を示した。ＯＳＦＢＳ＋脂質ミックスの試料に馴化させた細胞の条件培地は、陽性対照である１０％ＦＢＳと比べて２６％の活性を示した。
第２の方法では、血清非存在下でＷｎｔ３Ａの効率的な分泌を可能にする培養条件を作った。無血清条件下でＷｎｔ３Ａを効率的に分泌するＣＨＯ－Ｋ１由来細胞株（例えば、ＣＨＯ－Ｓ）を同定した。ＷＮＴ３Ａ ｃＤＮＡ（ホモ・サピエンスｗｉｎｇｌｅｓｓ型ＭＭＴＶ組込み部位ファミリー、メンバー３Ａ、ｍＲＮＡ完全コード配列をコードするＢＣ１０３９２２）を含有するｐｃＤＮＡ４．０ベクターをＣＨＯ－Ｓ細胞に一過性にトランスフェクトした。それらの細胞により採取された条件培地（ＣＭ）をＷＮＴレポーター（ＬＳＬ）細胞に適用し、ＧＦＰ発現プラスミドをトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｓ細胞を対照として使用した。ＣＭのウェスタンブロット法と併せたこの活性アッセイは、血清または任意の他の動物由来成分の非存在下におけるＷｎｔ３Ａの分泌を実証している。
誘導後３日目～１３日目の間にＣＨＯ細胞培養の条件培地（ＣＭ）を回収し、プールした。連日行ったＣＭ中のタンパク質産生分析に基づき、この範囲の日が本願実施例に使用する培養条件下では最適であると決定された。これらの条件下、タンパク質産生が最も高かったのは３日目～１３日目であり、１３日目以降は細胞が死亡し始めていた。
実施例２
マウスＬＳＬ細胞を用いたアッセイ
細胞数に対するベータガラクトシダーゼ活性を正規化するため、マウスＬＳＬ細胞に、Ｗｎｔ応答性ルシフェラーゼレポータープラスミドであるｐＳｕｐｅｒＴＯＰＦｌａｓｈ（Ａｄｄｇｅｎｅ）及び構成的ＬａｃＺ発現構成体であるｐＥＦ／Ｍｙｃ／Ｈｉｓ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を安定にトランスフェクトした。ヒト胎児由来腎臓上皮（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞に上記２つのプラスミドを安定にトランスフェクトした。細胞（５００００細胞／ウェル、９６ウェルプレート）を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）及び１％Ｐ／Ｓ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）を添加したＤＭＥＭに溶解させたＬ－ＷＮＴ３Ａ（特に明記しない限り、濃度は総容積１５０ｕＬ中１０ｕＬ）で処理する。精製したＷＮＴ３Ａタンパク質の系列希釈もインキュベートした。
細胞を３７℃、５％ＣＯ2 で一晩インキュベートし、その後、溶解バッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で洗浄、溶解し、デュアルライト併用レポーター遺伝子アッセイシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓ）を使用してルシフェラーゼ及びβ－ガラクトシダーゼの発現レベルを定量する。デュアルライト・レディ・ルミノメータ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用いて三連で読み取り、生物発光を定量した。ＷＮＴ３Ａタンパク質の系列希釈により作成した標準曲線からＷＮＴ３Ａ（ｎｇ／ｕＬ）及びＬ－ＷＮＴ３Ａの活性を明確にする。経時測定する実験では、ＷＮＴ３Ａ活性を活性率として表している。活性率は以下のように計算される。
Figure 0007150604000001
初代ＭＥＦを使用したＬ－ＷＮＴ３Ａ用量反応曲線。ＬＳＬ及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｗｎｔ及びＷｎｔアゴニストに対して最大限に感受性となるように遺伝子操作するため、用量、薬物効果、及び臨床反応の間の関係について意義があるデータが得られない場合がある。Ｗｎｔ刺激に対する生体内の細胞応答により近い状態を模倣するため、Ｗｎｔ標的遺伝子Ａｘｉｎ２の発現を経路活性尺度として使用してマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）をアッセイする。
実施例３
ＷＮＴ３Ａの脂質再構成
多くのタンパク質は高温で変性するため、体温でのそのような変性を回避することはタンパク質治療薬の持続時間延長にとって重要である。リポソームパッケージングによりＷｎｔ３Ａの生物学的活性が保たれるため、この製剤は多発性骨損傷での用途に有効である。精製後、組換えＷｎｔ３Ａを、ＤＭＰＣ及びコレステロールからなる脂質小胞内に再構成する。
いくつかの態様では、Ｌ－ＷＮＴ３Ａ製剤は、骨治癒遅延の危険性が高い患者の骨障害を治療する治験用新薬（ＩＮＤ）第Ｉ相試験での使用対象となる。ある場合には、自家骨移植材料（ＢＧＭ）を採取し、生体外でＬ－ＷＮＴ３Ａを用いて処理し、その後、洗浄し、ペレットとして集める。場合によっては、得られる材料、活性化ＢＧＭ（例えば、ＢＧＭＡＣＴ）は製剤とみなされ、すぐに使用可能である。ある場合には、Ｌ－ＷＮＴ３Ａは患者に直接投与されず、自己由来細胞を生体外で活性化させるためにのみ使用されるであろう。場合によっては、プログラムの初期段階として、製剤が、リポソームタンパク質製剤の全身投与のための認められている基準（純度、安定性など）を満たすであろうと予想される。
実施例４
スケールアップ実験
フリーザーストックの細胞を１５ｃｍ組織培養プレートに播種する。３７℃、５％ＣＯ2 で３～４日インキュベーションした後、細胞を４日間、２×１５ｃｍプレートに１：５に増殖させる。これらの細胞を２０×１５ｃｍプレートにさらに１：５に増殖させる。２４時間のインキュベーション後、細胞をドキシサイクリンで誘導する。ＣＭを２４時間おきに採取し、４℃で保存する。ＣＭの活性を測定し、ＷＮＴ３Ａの分泌を確認する。１ＬのＣＭに１％ＴｒｉｔｏｎＸを加え、０．２２μｍフィルターに通してろ過する。その後、ＣＭを１５０ｍｌのブルーセファロースカラムに担持させる。この試験から、８０μｇのＷＮＴ３ＡをＫＣｌの勾配で溶出させる。
実施例５
ＣＨＯ細胞株におけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの産生及び分泌
無血清条件下でＷｎｔ３Ａを分泌する、ＣＨＯ－Ｋ１由来（例えば、ＣＨＯ－Ｓ）細胞株を作製した。ＣＨＯ－Ｓ細胞に、ＷＮＴ３Ａ ｃＤＮＡであるＢＣ１０３９２２を含有するｐｃＤＮＡ４．０ベクターを一過性にトランスフェクトした。２日後に条件培地（ＣＭ）を採取した。ＷＮＴ３Ａ活性を検出するため、ＷＮＴレポーター細胞（ＬＳＬ）をＣＭで処理し、ＧＦＰ発現プラスミドをトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｓ細胞を対照として使用した。
図５に示す活性アッセイでは、ＧＦＰプラスミド対照をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のＣＭは、ＬＳＬレポーターアッセイにおいてベースラインの活性を示すことが示されている（図５Ａのレーン２及び５Ｂのレーン２）。ＢＣ１０３９２２ ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のＣＭは、ＬＳＬアッセイにおいて高い活性を示し、Ｗウェスタンブロット法により、ＷＮＴ３Ａと同一の分子量に表われるバンドの存在が確認される（図５Ｂ、レーン１及びレーン３）。さらなる特徴付けを行った。ｚｅｏｃｉｎを０．８ｍｇ／ｍＬまたは１．０ｍｇ／ｍＬ用いて細胞を選択した。得られた細胞を無血清条件で増殖させた。ＣＭを採取し、濃縮した。ＬＳＬアッセイを使用して活性を測定し、精製したＷＮＴ３Ａの活性（図６、淡青色の棒）と比較した。ＣＭを濃縮した場合（図６、ミディアムブルーの棒）でも、０．８ｍｇ／ｍＬのｚｅｏｃｉｎ下においてクローンでの活性は検出されなかった。１．０ｍｇ／ｍｌのｚｅｏｃｉｎ選択を使用して単離されたクローンでの活性を検出した（図６、紺色の棒）。
実施例６
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質を用いたＷｎｔ３Ａポリペプチドの精製
Ｗｎｔ３Ａの精製ではＦｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質－タンパク質Ａの精製スキームを利用した（図７）。最初に、タンパク質Ａを固定化したビーズを含む樹脂を２本のエッペンドルフチューブに５０μＬ及び２５μＬの容量で分注した。各チューブの樹脂をカラム容量の２０倍のＰＢＳでさらに洗浄した。約１０μＬのＦｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質を各チューブに加え、それぞれの最終濃度をＦｒｉｚｚｌｅｄ－８（約５０μｇ）／タンパク質Ａ（１ｍＬ）またはＦｒｉｚｚｌｅｄ－８（１００μｇ）／タンパク質Ａ（１ｍＬ）とした。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質を４℃で約１．５～２時間インキュベートした。インキュベーション後、未結合のＦｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質をＰＢＳで除去した。
次に、約１００ｎｇのＷｎｔ３Ａを１％ＣＨＡＰＳ含有ＰＢＳ緩衝液に溶解させ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質－タンパク質Ａ樹脂を含む２本のチューブのうち１本に入れて４℃で約１．５～２時間インキュベートした。インキュベーション後、未結合Ｗｎｔ３Ａ除去のため１％ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳ緩衝液を用いて未結合Ｗｎｔ３Ａを除去した。第２のチューブを対照として使用した。
図８は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質とタンパク質Ａ固定化ビーズとの事前複合体化を表す図式を示す。
図９は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８－Ｆｃとタンパク質Ａとの比が異なる２例での複合体化を表すウェスタンブロットを示す。
図１０は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質－タンパク質Ａによる方法を使用して精製したＷｎｔ３Ａを示すウェスタンブロットを示す。
実施例７
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ８とリポソームとはＷｎｔ３Ａ上の同一結合部位を共有
マウスＦｒｉｚｚｌｅｄ８のシステインリッチドメイン（Ｆｚ８－ＣＲＤ）と複合体をなすアフリカツメガエルＷｎｔ８（ＸＷｎｔ８）の結晶構造は、Ｗｎｔ８の脂質修飾が、Ｆｚ８の９残基と接触し、Ｆｚ８－ＣＲＤの間隙を横断してＦｚ８－ＣＲＤの溝と会合することを示している（ＰＭＩＤ：２２６５３７３１）。アフリカツメガエルＷｎｔ８の結晶構造に基づいて、リポソームは、Ｗｎｔ脂質修飾と直接相互作用し、リポソーム二重層が脂質修飾を親水性環境から立体的に遮蔽することによってＷｎｔ３Ａを活性なコンホメーションに維持しているという仮説を立てた。この仮説を試験するため、まずＷｎｔ３Ａをリポソーム内に再構成し（Ｌ－Ｗｎｔ３Ａ）、その後、Ｌ－Ｗｎｔ３Ａ溶液にＦｚ８を加えた。試料を超遠心分離にかけてリポソーム会合タンパク質と非会合タンパク質とを分離した。Ｆｚ８抗体とＷｎｔ３Ａ抗体とを使用したウェスタンブロット法により、約９８％のＦｚ８は上清に存在し、リポソームのペレットとは会合せず（淡灰色の棒、図１１Ａ）、Ｗｎｔ３Ａは１００％がリポソームのペレットと会合していた（暗灰色の棒、図１１Ａ）ことが示された。これらの相互作用動態の経時的変化を試験するため、Ｌ－Ｗｎｔ３ＡをＦｚ８と室温（ＲＴ）で１２時間インキュベートした。これらの条件では、９４．５％のＦｚ８が上清に存在しており（図１２Ａ、Ｆｚ８の淡灰色の棒）、１１％のＷｎｔ３ＡはＦｚ８に富む上清に存在していたが（図１２Ａ、Ｗｎｔ３Ａの淡灰色の棒）、約８９％のＷｎｔ３Ａはリポソームのペレットに認められた（図１２Ａ、Ｗｎｔ３Ａの暗灰色の棒）。これらの結果から、Ｆｚ８及びリポソーム間でＷｎｔ３Ａへの結合を競合したことが示され、このことは、Ｗｎｔ３Ａ上のＦｚ８結合ドメインがリポソームによって閉塞されること、及びＷｎｔ３Ａはその親和性に基づき分離することを示している。
この仮説をさらに試験するため、まずＦｚ８をＷｎｔ３ＡとインキュベートしてＦｚ８－Ｗｎｔ３Ａ相互作用を促進させた。４℃で１２時間のインキュベーションの後、リポソームを加えて試料をさらに２３℃で６時間インキュベートした。これらの試料を超遠心分離にかけてリポソーム会合タンパク質と非会合タンパク質とを分離した。図１１Ａで認められるように、ウェスタンブロット法により９９％超のＦｚ８タンパク質が上清に存在することが示された（図１１Ｂ、淡灰色の棒）。しかし、これらのインキュベーション条件におけるＷｎｔ３Ａ分布に変化があり、９３％のＷｎｔ３Ａが上清に存在し、わずか７％のＷｎｔ３Ａがリポソームのペレットと会合していた。これらの結果から、Ｆｚ８及びリポソームはＷｎｔ３Ａ上の同一ドメインへの結合を競合することが示された。
次に、Ｗｎｔ３Ａ、リポソーム及びＦｚ８を室温で６時間インキュベートした。Ｗｎｔ３Ａとリポソームとを室温で６時間インキュベーションした後、Ｗｎｔ活性は約９０％であり、Ｗｎｔタンパク質はリポソームのペレットと会合していた（ＰＭＩＤ：２４４０００７４）。これらのインキュベーション条件下では、約９２％のＦｚ８が上清に存在し（図１１Ｃ、淡灰色の棒）、８％のＦｚ８はペレットに存在していた（図１１Ｃ、暗灰色の棒）。Ｗｎｔ３Ａは約６２％がペレットに存在し（図１１Ｃ、暗灰色の棒）、Ｗｎｔ３Ａ及びリポソームのみを共にインキュベートした場合の約９０％と対照的であった（ＰＭＩＤ：２４４０００７４）。約３８％のＷｎｔ３ＡがＦｚ８を含む上清画分に存在していたが、１２時間インキュベートした場合は７０％のＷｎｔ３Ａが上清に認められた（図１２Ｃ、Ｗｎｔ３Ａの淡灰色の棒）。Ｗｎｔ３Ａは、リポソーム中に分別されるか、またはＦｚ８と共に上清に存在した。
実施例８
Ｗｎｔ３Ａ上のＬｒｐ６結合部位はリポソームによる閉塞がない
Ｌ－Ｗｎｔ３ＡをＬｒｐ６と室温で６時間とインキュベートした。試料を超遠心分離にかけてペレット状のリポソーム会合画分からリポソーム非会合タンパク質である上清を除去した。約６２％のＬｒｐ６がリポソームと会合しペレットに認められた（図１３Ａ）。約３８％は上清に認められた（図１３Ａ）。Ｌ－Ｗｎｔ３Ａは約１００％がペレットに認められた（図１３Ａ）。Ｌｒｐ６の大半はＷｎｔ３Ａ及びリポソームと共にペレットに見られ、このことは、Ｌｒｐ６が、リポソームによる閉塞がない部位に結合することを示唆している。次に、Ｗｎｔ３ＡをＬｒｐ６と４℃で１２時間プレインキュベートし、Ｌｒｐ６－Ｗｎｔ３Ａの相互作用を促進させた。このタンパク質複合体をリポソームと共にさらに６時間室温でインキュベートし、その後、超遠心分離にかけ、リポソーム会合画分と非会合画分とを分離した。９６％超のＬｒｐ６が上清に存在し（図１３Ｂ）、わずかに約３．８％のＬｒｐ６がリポソームのペレットと会合して存在していた（図１３Ｂ）。これらのインキュベーション条件下では、約３４％のＷｎｔ３ＡはＬｒｐ６に富む上清画分に存在していた（図１３Ｂ）。図１３Ａで観察された１００％とは対照的に、約６６％のＷｎｔ３Ａがリポソームのペレットに存在していた（図１３Ｂ）。
Ｗｎｔ３Ａは、リポソーム及びＬｒｐ６に対する自身の親和性に応じて分離するという仮説を立てた。このことを試験するため、Ｗｎｔ３Ａ、Ｌｒｐ６及びリポソームを合わせて２３℃で６時間インキュベートした。上清及びペレットのウェスタンブロット法により、約９０％のＬｒｐ６は上清に存在し（図１３Ｃ）、約１１％はリポソームのペレットに存在する（図１３Ｃ）ことが示された。約２０％のＷｎｔ３Ａは上清に存在していた（図１３Ｃ）。これらの条件では、図１３Ｂでの条件と比べてより多くのＷｎｔ３Ａ（６１．５％に対し７０．８％）がリポソームのペレットと会合し（図１３Ｃ）、このことは、Ｗｎｔ３ＡはＬＲＰ６に対する結合親和性がリポソームに対する結合親和性よりも低いことを示している。Ｆｚ８のインキュベーションを行った実験結果（図１１Ｃ、図１２Ｃ）とは対照的に、長時間（１２時間）インキュベートしてもＬｒｐ６及びＷｎｔ３Ａの分布に対する影響はなかった（図１４Ｃ）。これらの実験から、Ｌｒｐ６は溶媒に曝露されている領域にあるＷｎｔ３Ａ部位に結合すること、及びＷｎｔ３ＡはＬＲＰ６に対する結合親和性がリポソームに対する結合親和性よりも低いことが実証された。
実施例９
以下の表は、本出願に開示されるＦｒｉｚｚｌｅｄ－８及びＦｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質の配列を示す。
Figure 0007150604000002
Figure 0007150604000003
上述の記載において本発明は特定の実施形態と関連して例示されているが、本発明はそのように限定されるものではない。事実、本明細書に示され記載されている変更に加え、本発明のさまざまな変更が上述の記載により当業者に明らかとなり、それらの変更は添付のクレームの範囲内に含まれる。
相互参照
本願は、２０１６年１月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／２８８，３６５号に対する利益を主張するものであり、その出願は参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (18)

  1. リポソームＷｎｔ３Ａポリペプチドを作製する方法であって、
    ａ）単離されたＷｎｔ３Ａポリペプチドを、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８タンパク質を含む複数のシャペロンと共にインキュベートして単離されたＷｎｔ３Ａポリペプチド－シャペロン複合体を作製すること、
    ｂ）前記単離されたＷｎｔ３Ａポリペプチド－シャペロン複合体と単離された非複合体化Ｗｎｔ３Ａポリペプチドとを分離すること、
    ｃ）前記単離されたＷｎｔ３Ａポリペプチド－シャペロン複合体からＷｎｔ３Ａポリペプチドを溶出すること、及び
    ｄ）前記Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをリポソーム水溶液と接触させて前記リポソームＷｎｔ３Ａポリペプチドを作製すること
    を含む、方法。
  2. 前記複数のシャペロンの各シャペロンは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８のシステインリッチ領域（ＣＲＤ）を含む切断型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８タンパク質からなる、請求項２に記載の方法。
  4. 前記切断型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８タンパク質は、配列番号４のアミノ酸残基２５からアミノ酸残基１７２に及ぶ領域を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、ＩｇＧ Ｆｃ部分を含む、請求項２に記載の方法。
  6. 前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、配列番号５に対する少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項２に記載の方法。
  7. 前記単離されたＷｎｔ３Ａポリペプチド及び前記複数のシャペロンを少なくとも１０分間インキュベートする、請求項１に記載の方法。
  8. ステップａ）で提供される前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質はビーズに間接的に固定化され、前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質はＦｃ部分を認識するポリペプチドに結合している、請求項２に記載の方法。
  9. 前記ポリペプチドはタンパク質Ａである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記単離されたＷｎｔ３Ａポリペプチド及び前記複数のシャペロンを、単離されたＷｎｔ３Ａポリペプチド：シャペロン比を１：０．５、１：１、１：１．５、１：２、１：２．５、１：３、１：４、または１：５にしてインキュベートする、請求項１に記載の方法。
  11. ステップｂ）での分離は、緩衝液を用いて単離されたＷｎｔ３Ａポリペプチド－シャペロン複合体を溶出させることを含む、請求項１に記載の方法。
  12. 前記単離されたＷｎｔ３ＡポリペプチドはＷｎｔ３Ａ培養系から得られ、前記Ｗｎｔ３Ａ培養系は、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトしており、前記Ｗｎｔ３Ａ培養系の培地中にＷｎｔ３Ａポリペプチドを分泌する遺伝子操作された細胞株を含む、請求項１に記載の方法。
  13. 前記遺伝子操作された細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞株、またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株である、請求項１２に記載の方法。
  14. リポソームＷｎｔポリペプチドを作製するために使用される組成物であって、
    単離されたＷｎｔポリペプチドと、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ融合タンパク質と、リポソームとを含む、組成物。
  15. 前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ融合タンパク質は、ＩｇＧ Ｆｃ部分を含む、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ融合タンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質である、請求項１４に記載の組成物。
  17. 前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８融合タンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８のシステインリッチ領域（ＣＲＤ）を含む切断型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８タンパク質からなる、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記単離されたＷｎｔポリペプチドは、単離されたＷｎｔ３Ａポリペプチドである、請求項１４に記載の組成物。
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