TWI623550B - 脂蛋白元ａ１用於促進骨生成之用途 - Google Patents

Abstract

本發明係有關於一種脂蛋白元A-1(ApoA-1)多肽或其變異體或模擬肽、或編碼該等肽之載體、或增進內源ApoA-1含量之藥劑劑用於促進骨生成之用途。具體而言，本發明係可應用於治療需要骨生成之骨疾病或症狀，例如，骨流失疾病(如骨質疏鬆)或骨折。

Description

脂蛋白元A1用於促進骨生成之用途

本發明係有關於脂蛋白元A1(ApoA-1)用於促進骨生成之用途。具體而言，本發明係有關於ApoA-1用於治療需要骨生成之骨疾病或症狀之用途，例如，骨流失疾病(如骨質疏鬆)或骨折。

骨重組(或稱骨代謝)是指骨生成(亦即生成新的骨組織)與骨再吸收(亦即自骨骼移除成熟之骨組織)之連續過程。骨重組的過程係於個體的一生中持續進行，其不僅維持骨之正常功能，例如，全身之結構性支撐及鈣質之儲存，亦在骨發生如骨折之傷害時修復損害。骨生成涉及骨髓中之間葉幹細胞(BM-MSCs)之骨分化。BM-MSCs係為多功能之細胞型態，其可分化為骨系、脂肪系、或軟骨系細胞(Rodan,G.A.,and Reszka,A.A.(2002)Curr Mol Med 2,571-577)，其中於脂肪生成過程(adipogenesis)與骨生成過程(osterogenesis)之間係有時發現有相反關係存在。骨重組之調節失去平衡會導致各種代謝性骨疾病，例如，骨流失。

骨質疏鬆係一種嚴重骨流失的疾病，其為全球性疾病，特別容易發生在年長者、停經後婦女、或曾接受長期賀爾蒙治療或罹患甲狀腺機能亢進或腎上腺腫瘤的病人。現今已有兩種藥物經由美國食品與藥物管理局(FDA)核准可用於骨質疏鬆的治療。其中之一為雙磷酸鹽(bisphosphonate)，其為一種抗骨質吸收劑，可藉由降低骨更新以維持骨完整(Rodan,G.A.,and Reszka,A.A.(2002)Curr Mol Med 2,571-577)。另一種廣泛使用之藥物為副甲狀腺素(PTH)，其為一種同化劑，可協助刺激骨生成(Dempster,D.W.,Cosman,F.,Parisien,M.,Shen,V.,and Lindsay,R.(1993)Endocr Rev 14,690-709)。然而，這些藥物用於治療仍有一些問題。 舉例而言，目前已有報告指出雙磷酸鹽會增加下顎骨壞死的發生率(Zavras,A.I.(2011)Ann N Y Acad Sci 1218,55-61)。此外，PTH可導致高血鈣症(Greenspan,S.L.,Bone,H.G.,Ettinger,M.P.,Hanley,D.A.,Lindsay,R.,Zanchetta,J.R.,Blosch,C.M.,Mathisen,A.L.,Morris,S.A.,and Marriott,T.B.(2007)Ann Intern Med 146,326-339)。近來，一些文獻報導指出高血脂會損害PTH之合成代謝作用(Sage,A.P.,Lu,J.,Atti,E.,Tetradis,S.,Ascenzi,M.G.,Adams,D.J.,Demer,L.L.,and Tintut,Y.(2011)J Bone Miner Res 26,1197-1206)，故PTH不適於具有高血脂之病人。此外，PTH價格昂貴且必須每日進行皮下注射，對於病患而言十分痛苦且不方便。因此仍需要發展其他藥物供骨疾病之治療。

脂蛋白元A-1(ApoA-1)是高密度脂蛋白(HDL)的主要蛋白質成分，其調控膽固醇之移除。ApoA-1激活三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ATP-binding-cassette transporter A1，ABCA1)、細胞外訊號調控激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、轉錄訊息傳遞及活化子蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT3)、及/或Jun氨基末端激酶-有絲分裂活化蛋白質激酶路徑(Jun N-terminal kinase(JNK)-mitogen activated protein kinase(MAPK)pathways)(Liu,D.,Ji,L.,Tong,X.,Pan,B.,Han,J.Y. Huang,Y.,Y. Chen,E.,Pennathur,S.,Zhang,Y.,Liu,L.Y.,Tang,C.(2011)Am J Physiol Cell Physiol 301：C739-C748；Liu,Y.,Tang,C.,(2012)Biochimica et Biophysica Acta 1821：522-529；Nofer,J.R.,Feuerborn,R.,Levkau,B,Sokoll,A.,Seedorf,U and Assmann,G.(2003)J Biol Chem 278,53055-5306)。血漿中降低的ApoA-1含量被發現與心血管疾病、肥胖或其他代謝症候群有關(Peterson,S.J.,Drummond,G.,Kim,D.H.,Li,M.,Kruger,A.L.,Ikehara,S.,and Abraham,N.G.(2008)J Lipid Res 49,1658-1669；and Morgantini,C.,Imaizumi,S.,Grijalva,V.,Navab,M.,Fogelman,A.M.,and Reddy,S.T.(2010)Diabetes 59,3223-3228)。然而，並無先前技術揭露ApoA-1用於促進骨生成之用途。

在本發明中，非可預期地發現了ApoA-1對於促進骨生成有 優異之功效。具體而言，我們基於骨生成過程之早期與晚期標記(鹼性磷酸酶(ALP)活性與鈣沉積(茜素紅檢測))均可由ApoA-1之處理而顯著地誘導產生，而擊低內源ApoA-1表現則抑制骨生成過程之結果，證實ApoA-1是骨生成過程之正調節劑，其可促進hBM-MSCs之骨分化。此外，我們亦證明了ApoA-1抑制hBM-MSCs的脂肪生成過程，其有利於朝向骨生成過程發展。我們亦證明了ApoA-1的骨促進活性涉及三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ATP-binding-cassette transporter A1，ABCA1)、細胞外訊號調控激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、轉錄訊息傳遞及活化子蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT3)、及/或Jun氨基末端激酶-有絲分裂活化蛋白質激酶路徑(Jun N-terminal kinase(JNK)-mitogen activated protein kinase(MAPK)pathways)。再者，我們進行了活體內研究，顯示相較於野生型動物(無ApoA-1轉殖基因)，ApoA-1轉殖動物展現較高的骨體積、骨表密度、骨小梁數目及小梁數目，但展現較少骨流失及降低的骨小梁間隙，證實ApoA-1對於預防及改善骨質疏鬆的功效。

因此，在一方面，本發明提供一種藉由投予有需要的個體有效量之組合物以促進骨生成的方法，其包含(i)脂蛋白元A-1(ApoA-1)多肽或其生物功能變異體或其模擬肽，或(ii)包含編碼ApoA-1多肽或其生物功能變異體或其模擬肽之核酸片段的載體，或(iii)增進內源ApoA-1含量的藥劑；連同(iv)生理上可接受的載劑。

具體而言，本發明之方法可用於治療需要骨生成的骨疾病或症狀，例如骨流失疾病(如骨質疏鬆)或骨折等。

我們亦提供一種刺激間葉幹細胞骨分化的方法，包含以有效量之ApoA-1多肽或其生物功能變異體或其模擬肽接觸該細胞。

本發明亦提供一種促進骨生成的組合物，其包含有效量之(i)脂蛋白元A-1(ApoA-1)多肽或其生物功能變異體或其模擬肽，或(ii)包含編碼ApoA-1多肽或其生物功能變異體或其模擬肽之核酸片段的載體，或(iii)增進內源ApoA-1含量的藥劑；連同(iv)生理上可接受的載劑。

本發明提供(i)脂蛋白元A-1(ApoA-1)多肽或其生物功 能變異體或其模擬肽，或(ii)包含編碼ApoA-1多肽或其生物功能變異體或其模擬肽之核酸片段的載體在製造用於促進骨生成之組合物的用途。在部分具體實施例中，該組合物可為食品或補充物或藥劑。本發明亦提供(iii)增進內源ApoA-1含量的藥劑在製造用於促進骨生成之醫藥之用途。

本發明一或多個具體實施例之詳細敘述係於以下之描述中呈現。經由下列數個具體實施例之詳細敘述以及後附之申請專利範圍，本發明之其他特徵或優點將更為清楚明確。

當伴隨後附圖式一起閱讀時，本發明之發明內容以及實施方式將更易於理解。為了描繪發明之目的，圖式中係呈現目前較佳的實施例。然而應理解的是，本發明並不限於所呈現之精確配置與儀器使用。

在圖式中：圖1顯示人類ORF基因庫建構之流程圖。

圖2顯示對於可增進骨生成過程之潛力亞基因庫進行之獲得功能型篩選(gain-of-function screening)的結果。

圖3顯示(A)於感染候選基因(ApoA-1基因)之MSC選殖株中誘導鹼性磷酸酶(ALP)活性；以及(B)於MSCs中藉由兩個不同的shRNA(選殖株-1及選殖株-2)擊低ApoA-1基因表現之作用，導致ALP活性之抑制。

圖4顯示(A)藉由ApoA-1之處理而劑量依賴地誘導ALP(骨生成過程之早期標記)之活性；(B)藉由ApoA-1之處理增加ALP之RNA量；以及(C)藉由ApoA-1治療而劑量依賴地誘導鈣沉積(骨質疏鬆之晚期標記)之增加。所有實驗皆獨立地進行三重複。結果以平均±SD表示，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。p-values係利用Student’s t-test分析。

圖5顯示(A)藉由擊低內源ApoA-1基因表現而阻斷早期骨生成過程(ALP活性)；以及(B)藉由擊低內源ApoA-1基因表現阻斷晚期骨生成過程(鈣沉積)。

圖6顯示JNK抑制劑SP600125阻斷由ApoA-1所誘導之(A) 早期骨生成過程(ALP活性)以及(B)晚期骨生成過程(鈣沉積)；以及(C)由ApoA-1所誘導之JNK磷酸化(西方墨點法)。

圖7顯示藉由ApoA-1抑制脂肪生成過程。油紅染色證實在(A)ApoA-1不存在或(B)ApoA-1存在下，在hBM-MSCs產生脂肪細胞分化的情形。

圖8顯示藉由ApoA-1模擬胜肽L-4F可誘導MSCs之早期骨生成過程。

圖9顯示ApoA-1於小鼠模型中對於骨質疏鬆疾病的功效。不同的結構參數，包括(A)每個組織體積中的骨體積(BV/TV)，(B)骨表面密度(骨表面/組織體積；BS/TV)，(C)骨小梁數目(TbN)，及(D)骨小梁分離(TbSp)，及(E)ApoA-1轉殖小鼠(ApoA1-TG)及野生型小鼠(WT)的股骨的三維微米級電腦斷層掃描圖片，動物以雙側卵巢切除術或假手術(OVX及Sham)處理。數據以平均±SD表示，p值係以學生氏t測試分析。*P<0.05，**P<0.01。

圖10顯示ApoA-1誘導的成骨細胞分化係經由STAT3調節。(A)在骨生成過程期間，hBM-MSCs以ApoA-1及STAT3抑制劑Stattic(2.5μM)處理或以STAT3之顯性負突變體(STAT3-DN)轉染。在誘導細胞分化七天後，以西方墨點法分析人類BM-MSCs中的STAT3蛋白及phopho-STAT3(Y705或S727)的水平。(B)在細胞以ApoA-1及STAT3抑制劑Stattic(2.5uM)處理或以STAT3之顯性負突變體(STAT3-DN)轉染，誘導細胞分化七天後，測定鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性。數據以相對細胞生存力標準化的ALP活性表示。(C)以ApoA-1及STAT3抑制劑Stattic(2.5μM)處理或以STAT3之顯性負突變體(STAT3-DN)轉染之細胞，以茜素紅S染色21天，以檢測基質礦化(matrix mineralization)，並以分光光度計於450nm定量。(D)MSCs以ApoA-1及STAT3抑制劑Stattic(2.5μM)處理7日。以定量即時聚合酶鏈鎖反應(qPCR)測定ALP及BSP mRNA的相對水平。數據以相對於GADPH mRNA水平的標準呈現。所有實驗皆獨立地進行三重複。結果以平均±SD表示，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。p值係利用 學生氏t測試分析。縮寫：ApoA-1，脂蛋白元A-1；ALP，鹼性磷酸酶；hBM-MSC，人類骨髓間葉幹細胞。

圖11顯示由ApoA-1誘導的骨分化係由ERK-MAPK訊息傳遞系統調節。(A)MSCs於骨生成過程中以ApoA-1及ERK抑制劑U0126(20μM)處理。在誘導hBM-MSC分化7天後，細胞以西方墨點分析偵測ERK及STAT3蛋白水平。(B)以ApoA-1及ERK抑制劑U0126(20μM)處理細胞，經誘導分化7天後，測定ALP活性。數據以相對細胞生存力標準化的ALP活性呈現。(C)以ApoA-1及ERK抑制劑U0126(20μM)處理細胞，以茜素紅S染色21天，以檢測基質礦化，並以分光光度計於450nm定量。(D)MSCs以ApoA-1及ERK抑制劑U0126(20μM)共處理7天。以定量即時聚合酶鏈鎖反應(qPCR)測定ALP及BSP mRNA的相對水平。數據以GADPH mRNA相對水平標準化呈現。所有實驗皆獨立地進行三重複。結果以平均±SD表示，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。p值係利用學生氏t測試分析。縮寫：ApoA-1，脂蛋白元A-1；ALP，鹼性磷酸酶；hBM-MSC，人類骨髓間葉幹細胞。

圖12顯示ABCA1對於BM-MSC中ApoA-1調節的骨生成過程中是必須的。(A)BM-MSCs以針對ABCA1的三個不同的ShRNAs(sh-ABCA1-29092、sh-ABCA1-29093、以及sh-ABCA1-29089)或控制組shRNA(shRFP)感染，然後以西方墨點分析測定ABCA1蛋白及磷酸-STAT3Y705水平。(B)MSCs以三個不同的sh-ABCA1或shRFP感染，且細胞經誘導朝向骨分化。於誘導分化7天後，測量ALP活性。數據以相對細胞生存力標準化的ALP活性的呈現。所有實驗皆獨立地進行三重複。結果以平均±SD表示，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。p-values係利用學生氏t測試分析。縮寫：ApoA-1，脂蛋白元A-1；ALP，鹼性磷酸酶；hBM-MSC，人類骨髓間葉幹細胞。

除非另有定義，此處所使用之技術與科學術語具有與此發明所屬技術領域中具有通常知識者一般所理解的相同意義。

當用於此處時，本文所使用冠詞「一」或「該」意指該冠詞 之文法上受詞為一或一以上(亦即至少為一)。舉例而言，「一元件」代表一元件或多於一元件。

本文所使用之術語「聚核苷酸」或「核酸」係指一核苷酸單元組成的聚合物。聚聚核苷酸包括自然發生的核酸，例如，去氧核醣核酸(DNA)及核醣核酸(RNA)，以及包括帶有非自然發生的核苷酸的核酸類似物。聚聚核苷酸可以合成，例如，使用DNA自動合成器。術語「核酸」通常係指大型的聚聚核苷酸。應被了解的是，當一核苷酸序列以DNA序列表示(即A、T、G、C)，此亦包括RNA序列(即A、U、G、C)，其中「U」置換「T」。術語「cDNA」係指一以單股或雙股形式，互補或相同於mRNA的DNA。

術語「互補」係指二聚核苷酸的表面相互作用的拓撲互容性或相匹配。因此，兩個分子可描述為互補，更進一步而言是該接觸表面的特性可互相互補。若一第一聚核苷酸的核苷酸序列與一第二聚核苷酸的聚核苷酸結合對象的核苷酸序列相同，則該第一聚核苷酸與該第二聚核苷酸互補。因此，序列為5’-TATAC-3’的聚核苷酸與序列為5’-GTATA-3’的聚核苷酸互補。

術語「編碼」係指在一聚核苷酸(例如，基因、cDNA、或mRNA)中特定核苷酸序列的固有性質，可作為模板，以生物方法合成具有界定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA及mRNA)或界定的胺基酸序列及由其產生的生物性質之其他聚合物或巨分子產物。因此，若在細胞或其他生物系統中的蛋白係由一基因所產生的mRNA轉錄及轉譯而得者，則稱該基因編碼該蛋白。本領域技術人員應理解的是，由於遺傳密碼的簡併性，眾多不同的聚核苷酸及核酸可編碼同樣的多肽。應理解的是，本領域技術人員可利用例行技術進行不影響所述聚核苷酸編碼之多肽序列的核苷酸置換，以反映表現多肽之特定宿主生物體的密碼子的使用。因此，除非另外說明，「編碼一段胺基酸序列的核苷酸序列」包括所有編碼相同胺基酸序列且互為簡併版本的核苷酸序列。編碼蛋白及RNA的核苷酸序列可能包括內含子。

術語「重組核酸」係指一具有非自然相連結序列的聚核苷酸 或核酸。重組核酸可能以載體的形式呈現。「載體」可能包含一段需要的特定核苷酸序列及一段調控序列。載體可用於表現特定的核苷酸序列或維持特定的核苷酸序列，以利介於不同位置之間(例如，介於不同生物體之間)對該核苷酸序列進行複製、操作或轉移。載體可為了上述目的導入一適當的宿主細胞。

載體的例子包括，但不限於，質體、黏質體、噬菌體、YACs或PACs。通常在載體中，特定的核苷酸序列藉由操作連結至一調控序列，以至於當該載體引入宿主細胞，該特定核苷酸序列可在宿主細胞中經由調控序列的控制表現。該調控序列可包含，例如但不限於，啟動子序列(例如，巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動子、猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)早期啟動子、T7啟動子、以及醇氧化酶基因(alcohol oxidase gene，AOX1)啟動子、起始碼、複製起點、促進子、操作子序列、分泌訊息序列(例如，α-交配因子訊息)以及其他控制序列(例如，香德氏Shine-Dalgano序列及終止序列)。較佳地，載體可進一步包含用於之後篩選程序的標記序列(例如，對抗生素有抗藥性的標記序列)。更佳地，於載體中，需要的特定核苷酸序列可與上述調控序列以外的核苷酸序列連接，以生產一段融合的多肽，並有利於之後的純化程序。所述的多肽包括，但不限於，組胺酸標籤(His-tag)融合多肽及麩胺基硫轉移酵素(glutathione S-transferase，GST)融合多肽。

術語「多肽」係指由胜肽鍵連結之胺基酸殘基所構成之聚合物。術語「蛋白質」典型地係指相對較大的多肽。術語「胜肽」典型地係指相對較小的多肽。術語「L式胜肽」係指包含所有L式胺基酸的胜肽。術語「D式胜肽」係指包含所有D式胺基酸的胜肽。

胺基酸可由三個字母或一個字母表示。表1列出了標準胺基酸之縮寫。

ApoA-1係為高密度脂蛋白(HDL)的主要蛋白質成分。內源ApoA-I由肝臟及小腸合成前蛋白元形式(267個胺基酸殘基)，接著分泌出來並被切割，產生具有243個胺基酸殘基的成熟多肽。該243個胺基 酸殘基的成熟ApoA-1包含10個串連的22-mer雙性α-螺旋。典型地，ApoA-1如本技術領域所熟知係具有脂質結合活性及促進膽固醇流出的能力。

在一具體實施例中，全長之人類ApoA-1多肽(267個胺基酸)可用於本發明。

全長之人類ApoA-1胺基酸序列(SEQ ID NO：1)

在另一具體實施例中，成熟之人類ApoA-1多肽(243個胺基酸)可用於本發明。

成熟式之人類ApoA-1胺基酸序列(SEQ ID NO：2)

如此處所使用，「ApoA-1變異體」或「ApoA-1生物功能變異體」在本發明中可互換使用。所屬技術領域中具有通常知識者將充分理解，在「生物功能變異體」的固有定義中，係指在該分子的特定部分中發生有限數量的改變或調整，不影響蛋白之活性或功能，而仍可獲得具有可接受程度之等同生物活性的分子。術語「可接受程度」係表示所涉蛋白經此技藝已知之標準分析所測程度之至少20%、50%、60%、70%、80%或90%。因此，生物功能變異多肽此處係定義為特定胺基酸殘基可被取代之多肽。根據本發明，可製作並使用具不同取代之多肽。可在此種多肽之結構中進行調整與改變而仍能獲得具有相似或所需特徵之分子。舉例而言，在胜肽/多肽結構中部分胺基酸可以其他胺基酸取代，而不導致可估算的活性損失。

胺基酸取代通常基於胺基酸側鏈取代之相對相似性，例如， 其疏水性、親水性、電荷、大小等。舉例而言，精氨酸(Arg)、賴胺酸(Lys)及組胺酸(His)皆為正電荷殘基；以及丙胺酸(Ala)、甘胺酸(Gly)及絲胺酸(Ser)皆為小型胺基酸。因此，基於這些考量，精氨酸(Arg)、賴胺酸(Lys)及組胺酸(His)，以及丙胺酸(Ala)、甘胺酸(Gly)及絲胺酸(Ser)可定義為生物功能等同物。吾人可輕易設計及製備重組基因，供具有等同胺基酸殘基之多肽的微生物表現。另一方面，cDNA或基因體基因之修飾可藉由習知的定位基因突變(site-directed mutagenesis)技術而輕易完成並用以產生ApoA-1之類似物與衍生物。

如此處所使用，ApoA-1變異體維持自然或野生型ApoA-1的等同生物活性之可接受的程度，即脂質結合活性及促進膽固醇流出的能力，其可為所屬技術領域中具有通常知識者藉由進行此技藝之習知測試予以確認。可用習知測試方法針對指定的ApoA-1多肽或變異體或模擬肽分析此處所描述之ApoA-1活性，例如，膽固醇流出分析，如JBC.,2003,278,53055-53062所述，以及脂質結合研究，如J Lipid Res.2008,49,2302-2311所述。

在一具體實施例中，本發明之ApoA-1之生物功能變異體包含具有與SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列至少50%、60%、或65%、或70%、或75%、或80%、或85%、或90%、或95%同一性之胺基酸序列，且保有如此處所述之ApoA-1的活性。

為測定二胺基酸序列的同一性百分比，將該序列對齊以作為最佳比對之目的(例如，可將空隙引入第一胺基酸序列的序列中，以與第二胺基酸序列作最佳比對)。在計算同一性百分比時，計數典型地確切配對。二序列間同源性或同一性百分比的測定可使用此技藝之習知數學運算完成，例如，BLAST及Gapped BLAST程式、NBLAST及XBLAST程式、或ALIGN程式。

如此處所述，ApoA-1模擬肽係為胜肽，其「模仿」內源ApoA-1以致其維持典型的ApoA-1活性，即脂質結合活性及促進膽固醇流出的能力。在某些具體實施例中，該模擬肽具有少於100個胺基酸殘基，特定而言，少於80個胺基酸殘基，更特定而言少於60個胺基酸殘基，甚 至更特定而言少於40個胺基酸殘基。在一具體實施例中，該ApoA-1模擬肽包括至少一具有聚集於疏水-親水界面的正電荷胺基酸殘基及聚集於親水表面中心的負電荷胺基酸殘基的A級雙性α-螺旋。其他ApoA-1模擬肽之特質包括但不限於具有非極性側鏈的芳香族胺基酸的胜肽，如苯丙氨酸或酪氨酸，及正電荷胺基酸(如麩胺酸)介於二α-螺旋之間具有一適當的距離(如大約3.6個胺基酸殘基)。在特定具體實施例中，該胜肽之長度約為40或更少個胺基酸。在某些具體實施例中，該胜肽包含所有「L」胺基酸，而在某些其他具體實施例中，該胜肽包含至少一個「D」胺基酸殘基。在特定具體實施例中，所有包含該胜肽之鏡像異構物胺基酸為「D」胺基酸。 ApoA-1模擬肽之範例如下胺基酸序列所列：

關於ApoA-1模擬肽之參考文獻可參照Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005,25：1325-1331、Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005,25：1325-1331、J Pharmacol Exp Ther.2012,340,716-722、J Pharmacol Exp Ther.2012,340,716-722、Lipids Health Dis.2011,30,224,Atherosclerosis.2011,217,395-400、J Clin Invest.1994,94,1698-1705、以及J Biol Chem.2012,21,287,43730-43740。

在特定具體實施例中，該模擬肽係為選自由SEQ ID NOS：3-8所組成之群組的D式胜肽或L式胜肽。

可視需要地，模擬肽可進一步修飾。在某些具體實施例中，模擬肽可任意地包含保護基修飾(如一或多個與胺基(N端)及/或羧基(C 端)耦接的修飾)。適當的保護基包括，但不限於，乙酰基(AC)、酰胺基、C_3-20烷基、芴甲氧羰基(Fmoc)、t-丁氧羰基(t-BOC)、苯甲酰基、丙酰基、芐氧羰基、丙基、丁基、戊基、己基或N-鄰氨基苯甲酸甲酯。在特定具體實施例中，胜肽包含與胺基(如乙酰)耦接之第一保護基及與羧基(如酰胺)耦接之第二保護基。

在部分具體實施例中，模擬肽(如ECT-642)可與磷脂、脂質、或膽固醇，例如神經鞘磷脂及1,2-二棕櫚醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)結合，形成胜肽/磷脂複合物。

本發明之脂蛋白可由自然來源獲得，或藉由化學合成製程或重組表現技術所製造。在一具體實施例中，可構築含有編碼本發明之脂蛋白之聚核苷酸序列之重組表現載體，並導入至宿主細胞中，其可於適當之條件下培養供脂蛋白之表現。編碼本發明之脂蛋白之聚核苷酸序列已可為此技藝所獲得。在一具體實施例中，編碼本發明之脂蛋白之聚核苷酸序列如下：人類ApoA-1核苷酸序列(SEQ ID NO：9)

所表現之蛋白質接下來可藉由所屬技術領域中已知之技術由宿主細胞回收，例如，逆向層析高效液相層析、凝膠電泳、離子交換層析、親和層析等。在另一具體實施例中，本發明之脂蛋白或其變異體或模擬肽可藉由化學合成法所製造，其係藉由將一胺基酸之羧基(C端)與另 一胺基酸之胺基(N端)耦接而成。化學合成法之實例包含但不限於固相合成法，如t-Boc固相胜肽合成與Fmoc固相胜肽合成。此處所使用之相關技術例如聚核苷酸合成、聚合酶連鎖反應(PCR)、選殖、載體構築、細胞轉染、蛋白質表現、胜肽合成與純化皆係為所屬技術領域中具有通常知識者所熟知，且描述於，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，以及Frederick M.A.et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(2001)。

根據本發明，ApoA-1多肽或其變異體或模擬肽，或包含編碼同等的核酸片段的載體，或提升內源ApoA-1水平的試劑，可投予至個體以促進骨生成。

供製造ApoA-1之適合的表現載體可包括任一此領域已知的載體，其可導致編碼ApoA-1之核酸序列在哺乳動物細胞中之蛋白表現。適合的啟動子及其他調控序列可依特定應用之需要選擇，其可為誘導型、組織特異性型、事件特異型等。啟動子的例子如心肌特異性啟動子，肌球蛋白輕鏈-2，E-鈣粘素啟動子，C-反應蛋白基因啟動子，人類烯醇酶啟動子，thy-a抗原及γ-烯醇酶啟動子。也可選擇供表現本發明之ApoA-1多肽或其變異體或模擬肽的其他啟動子。

可使用病毒或非病毒載體以傳遞編碼ApoA-1多肽或其變異體或模擬肽的核酸片段至活體外或活體內細胞，致使需要的蛋白表現。也可使用供活體內傳遞並表現聚核苷酸的不同方法學的載體。在可供使用的不同靶向技術中，亦討論利用組織特異型及事件特異型的轉錄控制元件的靶向轉錄。

在一具體實施例中，提升內源ApoA-1水平如增加表現量/穩定性或減少代謝量之劑(如化合物)可投予至有需要的個體，以促進骨生成。增加ApoA-1水平之劑的範例包括但不限於RVX-208，如Curr Opin Investig Drugs.2010,11,357-64所述；及I-BET151，如Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2012,22,2963-2967所述。

本處所使用之術語「骨生成」係指骨生長或再生(新骨組織 的形成)。骨生成過程為導向骨系細胞的先驅細胞(如骨髓間葉幹細胞)的分化過程，形成成熟骨並形成成骨細胞，其係為負責形成骨之有機基質及在基質礦化期間併入羥基磷灰石晶體。骨生成過程的正調控子刺激先驅細胞分化為成骨細胞，因此促進骨生成。

本述所使用之術語「骨流失疾病」係指動物中一種病理上的疾病或病症，或一種症狀或狀態，其中骨生成及骨吸收之間不平衡，致使該動物若未給予治療將展現不正常的骨質量。骨質疏鬆為該等疾病之典型範例，特徵為低骨質量及骨組織之微架構惡化，導致骨脆性及骨折風險增加。根據世界衛生組織(WHO)之定義，骨質疏鬆是指骨礦物質密度(Bone Mineral Density)比參考標準(年輕健康成人之平均)骨密度低於2.5個標準差。初級骨質疏鬆係指與其他疾病無關的骨質量流失，並通常與老化及性腺功能之年齡相關疾病伴隨，例如，停經後骨質疏鬆。次級骨質疏鬆係指由初級骨質疏鬆所包括的年齡相關退化以外的因素引起的骨質疏鬆。許多疾病或狀況能引起骨流失，包括但不限於長期臥床、性腺功能減退的狀態(如卵巢或睪丸的手術切除)、內分泌失調(如庫興氏症候群及副甲狀腺機能亢進症)、胃腸道疾病(如克隆氏症及潰瘍性大腸炎)、營養不良(如維生素D、K或B12的缺乏)、風濕性疾病(如類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡及多關節型幼年特發性關節炎)、腎功能不全、血液系統疾病(如多發性骨髓瘤及白血病)、遺傳性疾病(如成骨不完善、馬凡氏症、高胱氨酸尿症及埃勒斯-當洛二氏症候群(Ehlers-Danlos syndrome))及腫瘤(特別是乳腺、前列腺、肺及腎腫瘤)。某些治療可引起骨流失，例如類固醇治療、胃或胃腸繞道手術、芳香化酶抑製劑治療、性荷爾蒙去除治療及免疫抑制藥物治療。本發明之方法亦適用於骨折或需要骨癒合之損傷。

術語「治療」係指一種動作、應用或療法，其中包括人類之個體，為受具有直接或間接改善個體症狀的目的之醫療幫助的對象。特定而言，在某些具體實施例中，該術語係指降低發病率、減輕症狀、消除復發、防止復發、防止發生率、改善症狀、改善預後或其組合。所屬技術領域中具有通常知識者將理解，治療不必然造成症狀完全消失或去除。在一具體實施例中，一種在人類患者中治療骨流失如骨質疏鬆的方法，如此處 所述，為有關於投予患者有效量之ApoA-1多肽，其作為骨質疏鬆的正調控子，從而促進骨生成並因此減輕或消除個體骨疾病的症狀。

本處所使用之術語「個體」包括人類及非人類之動物，例如伴侶動物(如狗、貓及之類)、飼養動物(牛、羊、豬、馬及之類)或實驗動物(如大鼠、小鼠、豚鼠及之類)。

為遞送之目的，本發明之脂蛋白或編碼相同之聚核苷酸或提升內源ApoA-1水平之劑可與生理上可接受之載劑配製成組合物或由植入物嵌入。此處所使用之「生理上可接受」意指該載劑係與包含於該組合物中之活性成分相容，較佳能穩定該活性成分而不會對於被治療之對象產生傷害。該載劑可用為該活性成分之稀釋劑、載體、賦形劑或介質。適合載劑之實例包含生理相容緩衝液，如漢克氏溶液、林格氏溶液、生理食鹽水緩衝液、乳糖、右旋葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、海藻膠、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶型纖維素、聚乙烯咯啶酮、纖維素、無菌水、糖漿及甲基纖維素。本發明之合物可額外地包含潤滑劑，例如，滑石、硬脂酸鎂及礦物油；潤濕劑；乳化與懸浮劑；保存劑，例如，甲基-及丙基-羥基苯甲酸鹽；甜味劑；以及調味劑。

在某些具體實施例中，本發明之組合物可以食品或補充物使用，以維持日常生活骨健康之良好症狀。

在某些具體實施例中，引進重組DNA構築體以表現ApoA-1(或其變異體或模擬肽)之基因轉殖植物或其植物產品(例如水果或種子)，可以食物來源獲得以供應ApoA-1並因此促進有需要的個體的骨生成。較佳的基因轉殖植物，包括但不限於，農作物如水稻、小麥、大麥、高粱、玉米和燕麥或經濟作物如番茄及香蕉。根據本發明，引進核苷酸進入生物體(轉殖)，原則上經由所屬技術領域中具有通常知識者熟習之所有方法均有效。在植物的案例中，描述來自植物組織或植物細胞之植物轉殖及再生之方法可用於瞬時或穩定轉殖。適當的方法為基因槍技術或通過原生質體轉化、電穿孔、顯微注射法和根癌農桿菌介導的基因轉移。

在本文中，與藥劑使用相關之術語「有效量」或「有效劑量」係指相較於未接受此量之對應個體，藥物或藥劑之用量造成所欲之藥理上 的結果、或疾病、異常或副作用之治療、治癒、預防、或改善之效果，或減少疾病或異常之擴展速度。藥劑之有效量或有效劑量可根據所使用之特定有效成分、投藥模式、年齡、體型、以及欲治療個體之條件而改變。藥劑之精確用量係依醫師之判斷進行投藥且依個體差異而異。

根據本發明之組合物可為片狀、藥丸、粉末、錠劑、囊袋、藥包、藥酒、懸浮液、乳化液、溶液、糖漿、軟明膠膠囊與硬明膠膠囊、栓劑、無菌注射溶液及經包裝之粉末之形式。

本發明之組合物可經由任何生理可接受途徑傳送。此些途徑包含但不限於非經口服投藥、系統性投藥、口服投藥、鼻腔投藥、直腸投藥、腹腔注射、血管注射、皮下注射、經皮投藥、吸入投藥及肌肉注射。

亦非可預期地發現ApoA-1具有刺激間葉幹細胞之骨分化的良好活性。因此，本發明亦提供刺激間葉幹細胞之骨分化的方法，包含以有效量之ApoA-1多肽或一生物功能變異體或其模擬肽接觸細胞。該方法可進一步包含應用該等幹細胞於治療或再生藥物。

本發明係藉由下列範例進一步說明，此僅提供而用於展現而非限制之目的。有鑑於本揭露，本領域具有通常知識者應理解可於所揭露之特定具體實施例進行許多修改而仍未脫離本發明之精神與範疇並獲得相似或類似之結果。

實例

間葉幹細胞(MSCs)為再生醫學之重要來源。MSCs不僅具有在活體內與活體外增生之能力，亦具有分化為骨系、脂肪系或軟骨系細胞之能力(Science 284,143-147)。然而，骨分化之詳細機制仍並未明確。我們使用包含12,000個人類開放閱讀框架(open reading frame,ORF)選殖株之無偏差cDNA基因庫，用以篩選促進人類骨髓間葉幹細胞(hBM-MSCs)分化為骨母細胞之基因。基於骨生成過程之早期標記：鹼性磷酸酶(ALP)活性之結果，可由功能增加篩選獲得一些候選基因。此外，藉由利用至少兩個獨立之短髮夾RNAs(short hairpin RNAs,shRNAs)進行功能減少分析，我們證明了此些候選基因對於骨生成過程是重要的。其中，我們進行了一連串的實驗且證明ApoA-1係為骨生成過程之正調節劑，因此其可用於促進 骨生成以及需要骨生成之骨疾病或症狀之治療，例如，骨流失疾病(如骨質疏鬆)或骨折。

I. 材料與方法

1. 細胞培養與試劑

人類骨髓間葉幹細胞係購自Lonza(Basel,Switzerland)且培養於MesenPro RS培養基(Invitrogen)中，HEK293T細胞來自中央研究院之國家型干擾性核醣核酸(RNAi)核心實驗室並培養於添加10% FBS(Invitrogen)之DMEM-HG培養基中。人類重組脂蛋白元A-1係購自Prospec(NJ,USA)。低葡萄糖DMEM培養基、高葡萄糖DMEM培養基、以及胎牛血清(FBS)係購自Invitrogen。甲基脫氫皮質類固醇(Dexamethasone)、β-甘油磷酸(β-glycerophosphate)、以及L-抗壞血酸磷酸(L-ascorbic acid phosphate)係購自Sigma。

2. 骨分化

細胞係培養於骨誘導培養基(DMEM-LG、10% FBS、0.1μM甲基脫氫皮質類固醇、10mM β-甘油磷酸、0.05mM L-抗壞血酸磷酸)。在分化的過程中每星期更換2次骨誘導培養基。

3. 細胞存活率分析與鹼性磷酸酶活性分析

為了測試相對的細胞存活率，在細胞誘導為骨母細胞7天之後，添加10%阿爾瑪藍(Alamar Blue,AB)試劑(Serotec)，且於37℃與5% CO2培養1小時後，再以微量盤式分析儀(Bio-Rad)測量OD 570nm/600nm。接著，細胞以PBS清洗2次，且於室溫下與鹼性磷酸酶基質p-NPP(Sigma)作用5至20分鐘。ALP活性係藉由在OD 405nm測量吸光值，且以阿爾瑪藍活性(AB)分析所獲得之相對細胞數加以標準化計算而得。

4. 茜素紅S(Alizarin Red S)分析

在細胞分化為骨母細胞21天之後，細胞係以冰冷之70%酒精於-20℃固定1小時，且以40mM之茜素紅(pH 4.2)染色10分鐘。在染色後，以PBS清洗孔槽5次並以顯微鏡拍照。為了定量，以10%氯化鯨蠟吡啶(cetylpyridinium chloridie)(Sigma)處理孔槽15分鐘，然後以微 量盤式分析儀(Bio-Rad)於OD 570nm測量反應產物之吸光值。

5. 即時反轉錄酶聚合酶連鎖反應(Real-time reverse transcription PCR)

總核醣核酸係根據使用者手冊以RNeasy Micro Kit(Qiagen)加以分離。在分離RNA之後，經過DNase處理之RNA藉由superscript III(Invitrogen)處理以合成cDNA，且接著使用SYBR GREEN 2x master mix(KAPA biosystems)以ABI 7900進行即時聚合酶連鎖反應。最後，mRNA之表現量係對應至GAPDH量加以標準化。PCR引子如下所示：GAPDH正向5’-catcaccatcttccaggagc-3’(SEQ ID NO：10)，GAPDH反向5’-atgccagtgagcttcccgttc-3’(SEQ ID NO：11)，ALP正向5’-tggagcttcagaagctcaacacca-3’(SEQ ID NO：12)，ALP反向5’-atctcgttgtctgagtaccagtcc-3’(SEQ ID NO：13)，BSP正向：5’-AACCTACAACCCCACCACAA-3’(SEQ ID NO：14),BSP反向：5’-AGGTTCCCCGTTCTCACTTT-3’(SEQ ID NO：15)。

6. 慢病毒感染(Lentiviral infection)

慢病毒(lentivirus)之製造係使用TurboFect(Fermentas,Glen Burnie MD,USA)於HEK293T細胞中進行。在轉染的前1天，於6孔培養盤中每孔注入4×10⁵細胞。隔天，各以1μg編碼以下之質體：shApoA1、shABCA1以及載體控制組，連同1μg之輔助質體(pCMVR8.91以及pMD.G)(國家型RNAi核心實驗室)轉染細胞。16至24小時後，更換培養基，並於轉染72小時後收集上清液。在感染方面，4×10⁴細胞係以病毒感染劑量(multiplicity of infection,MOI)為1予以轉染。在慢病毒感染方面，在8μg/ml之硫酸魚精蛋白(Protamine Sulfate)存在下，以控制組shRFP病毒以及ApoA-1 shRNA病毒感染hBM-MSCs。隔天，以PBS清洗細胞2次且誘導為骨母細胞。shRNAs之序列如下：

人類ApoA-1 shRNA-1：

選殖株ID：TRCN0000029114

目標序列：GCTCGGCATTTCTGGCAGCAA(SEQ ID NO：16)

人類ApoA-1 shRNA-2：

選殖株ID：TRCN0000029116

目標序列：GTGTACGTGGATGTGCTCAAA(SEQ ID NO：17)

人類ApoA-1 shRNA-29092：

選殖株ID：TRCN0000029092

目標序列：GCCTCGTGAAGTATGGAGAAA(SEQ ID NO：18)

人類ApoA-1 shRNA-29093：

選殖株ID：TRCN0000029093

目標序列：GCTGTGGAAGAACCTCACTTT(SEQ ID NO：19)

人類ApoA-1 shRNA-29089：

選殖株ID：TRCN0000029089

目標序列：GCCTCTATTTATCTTCCTGAT(SEQ ID NO：20)

7. 胜肽合成

ApoA-1之模擬胜肽(mimetic peptide)L-4F(Kelowna International Scientific Inc.)的序列係如過去所述(Am J Physiol Cell Physiol 298,1538~1548)。

L-4F胜肽序列：Ac-DWFKAFYDKVAEKFKEAF-NH2(SEQ ID NO：3)控制組胜肽序列：Ac-DWFAKDYFKKAFVEEFAK-NH2(SEQ ID NO：21)

8. 重組蛋白質生產

來自大腸桿菌(E.coli)的人類APOA1重組蛋白(264個胺基酸序列)，其於N端與組胺酸標籤(His-tag)融合，係由適當之層析技術加以純化。該264個胺基酸序列(SEQ ID NO：22)如下：

9. 動物及手術

攜帶人類ApoA-1轉殖基因的C57BL/6-Tg(APOA-I)1Rub/J小鼠係購自傑克遜實驗室(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME,USA)。作為野生型對照組的C57BL/6J小鼠係購自BioLASCO Taiwan Co.,Ltd. (Charles River Technology,Taipei,Taiwan)。所有規範皆經過中央研究院動物使用及管理委員會暨動物實驗管理小組認可。八週大的雌性ApoA-1轉殖基因小鼠或C57BL/6野生型進行雙側卵巢切除術或假手術，其卵巢在整體麻醉下取出但以完整的取代。所有小鼠在手術後8-12週犧牲並移除股骨供分析。

10. 微電腦斷層掃描分析

股骨遠端之骨小梁微架構以微電腦斷層攝影分析(Skyscan-1076,Skyscan,Belgium)。X-光設定為50Kv，200uA，0.5mm鋁過濾器，0.4u of rotation step,0.5mm鋁過濾器及9um/像素的掃描解析度。橫截面以NRecon軟體(Skyscan)重建，檔案以CTAn軟體(Skyscan)處理。

II. 結果

1. 人類ORF基因庫構築以及功能增加篩選鑑定出增進骨生成過程之潛力基因

我們使用包含12,000個人類ORF選殖株之無偏差cDNA基因庫，用以篩選促進人類骨髓間葉幹細胞(hBM-MSCs)分化為骨母細胞之基因。圖1顯示我們的研究中人類ORF基因庫構築之流程圖。圖1所述第三步驟的八個類別的殖株如下方表3所示。

2. 功能增加篩選鑑定出增進骨生成過程之潛力基因

接著，以含有136個人類ORF基因或控制組(GFP)之慢病毒感染MSCs。在誘導5天之後，檢測骨生成過程之早期標記：ALP之活性(結果未顯示)。經由功能增加篩選以獲得候選基因分庫。候選基因分庫進一步以骨生成過程之晚期標記：鈣沉積來檢測。簡言之，以25個候選基因分庫感染MSCs，且於誘導21天之後以茜素紅染色並於570nm測量吸光值以分析鈣沉積。圖2顯示功能增加篩選的結果(25個候選基因組)。

3. ApoA-1鑑定為骨生成過程之正調節劑

為了鑑定能夠促進骨生成過程之候選基因，以匯總的人類ORF 2002基因分庫的單一基因感染MSCs，且接著於誘導5天之後，檢測骨生成過程之早期標記鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)之活性。發現ApoA-1為2002基因庫中促進骨生成的候選基因之一。ALP之活性係以測量阿爾瑪藍(AB)活性所測量之相對細胞數加以標準化。圖3A顯示ApoA-1基因之過度表現增進MSCs中ALP之活性。

此外，為了測量於MSCs中抑制各個基因表現之作用，以帶有ApoA-1基因之2個獨立的shRNA或控制組之shRNA(shCtrl)的慢病毒於96孔盤中感染細胞，且接著檢測ALP/AB活性。圖3B顯示擊低ApoA-1之基因表現會抑制MSCs之骨生成過程。

此結果建議ApoA-1為骨生成過程之正調節劑。

4. ApoA-1促進hBM-MSCs之骨分化

MSCs係以不同劑量之ApoA-1處理且接著測量ALP/AB活性(* P<0.05)。圖4A顯示藉由ApoA-1可劑量依賴誘導MSCs之早期骨生成過程。

此外，亦測量了ALP之RNA量。圖4B顯示藉由以ApoA-1處理可增加ALP之RNA量。

再者，為了檢測骨生成過程之晚期標記：基質之礦化作用，在誘導21天之後，以茜素紅S將MSCs染色，接著於570nm測量吸光值以定量。** P<0.01；***** P<0.00001。圖4C顯示藉由ApoA-1可劑量依賴 誘導MSCs之晚期骨生成過程。

此結果顯示ApoA-1可劑量依賴誘導以促進MSCs之骨分化。

5. 擊低內源ApoA-1之基因表現可抑制骨生成過程

為了檢測內源ApoA-1於MSCs之骨生成過程中的作用，將以ApoA-1為標的之2個獨立的shRNAs以及控制組shRNA(shCtrl)的慢病毒分別感染MSCs，接著檢測ALP/AB活性。此外，在以各個shRNA感染細胞之後以茜素紅S染色MSCs。**,p<.01；***,p<.001；****,p<.0001。

圖5A顯示ApoA-1之基因靜默(silencing)會阻斷MSCs之早期骨生成過程。圖5B顯示ApoA-1之基因靜默會阻斷MSCs之晚期骨生成過程。

此結果顯示擊低內源ApoA-1之基因表現會抑制MSCs之骨生成過程。

6. ApoA-1係透過Jun N-端激酶(JNK)-有絲分裂活化蛋白質激酶(MAPK)路徑、轉錄訊息傳遞及活化子(STAT3)路徑、細胞外訊號調控激酶(ERK)路徑及三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ABCA1)路徑刺激骨分化

為了確認ApoA-1刺激骨分化之路徑，以骨誘導培養基(OIM)、ApoA-1及JNK抑制劑(10μM)處理MSCs，接著測量ALP/AB活性。圖6A顯示JNK抑制劑SP600125阻斷由ApoA-1所誘導之早期骨生成過程。

此外，將MSCs以茜素紅S染色，以檢測基質礦化作用。圖6B顯示JNK抑制劑SP600125阻斷由ApoA-1所誘導之晚期骨生成過程。

再者，細胞於營養缺乏之狀態下24小時之後，以OIM、ApoA-1及/或JNK抑制劑(5或10μM)處理。分離細胞溶裂物並以西方墨點法予以分析。圖6C顯示ApoA-1誘導JNK之磷酸化。

此結果建議ApoA-1透過JNK-MAPK路徑刺激骨分化。

此外，圖10-12提供數據顯示由ApoA-1刺激之骨分化亦涉及STAT3、ERK及ABCA1路徑。

7. ApoA-1抑制MSCs之脂肪生成過程

MSCs係於ApoA-1存在或不存在之下誘導朝向脂肪生成。在誘導脂肪生成過程21天之後，細胞以油紅O(oil red O)染色以鑑定脂肪滴沉積(lipid droplet deposition)。在染色之後，以相位差顯微鏡拍攝細胞型態以觀察細胞內脂肪滴。比例尺50μm。圖7顯示ApoA-1抑制MSCs之脂肪生成過程，其有利於朝向骨生成過程。

8. L-4F對於人類MSCs衍生之骨生成過程的影響

MSCs係於ApoA-1之模擬胜肽L-4F存在或不存在之下誘導朝向骨生成過程，且接著測量ALP/AB活性(* P<0.05)。圖8顯示ApoA-1之模擬胜肽L-4F誘導MSCs之早期骨生成過程

9. 基因轉殖ApoA-1可改善卵巢切除小鼠的骨質疏鬆

於茜素紅染色及鹼性磷酸酶分析中，我們證實ApoA-1於活體外刺激骨分化。接著，為調查ApoA-1是否能於活體內預防骨流失，進行模擬停經後骨質疏鬆、卵巢切除引起的骨質疏鬆的疾病模型。ApoA-1基因轉殖小鼠於卵巢切除後並未具有可測的骨流失或骨質疏鬆之症狀。於卵巢切除後，ApoA-1基因轉殖小鼠(ApoA1-TG)及野生型小鼠的骨微架構以微電腦斷層掃描(micro-CT)檢測。卵巢切除小鼠中，ApoA-1基因轉殖小鼠之骨量(BV/TV)與野生型小鼠相比明顯較高(60%)(圖9A)。此外，其他卵巢切除小鼠的結構參數，例如骨表面密度及骨小梁數量，在ApoA-1基因轉殖小鼠中以56%及74%高於野生型小鼠(圖9B及9C)。儘管無統計上意義，在ApoA-1基因轉殖小鼠中骨小梁分離輕微地減少(圖9D)。進一步而言，以micro-CT掃描卵巢切除小述的骨微架構，ApoA-1基因轉殖小鼠顯示低於野生型小鼠的骨流失(圖9E)。總而言之，這些結果指出ApoA-1的刺激功效改善卵巢切除誘發的骨量減少。

III. 結論

在此研究中，我們發現ApoA-1不僅可增進早期骨生成過程之標記(ALP活性)之表現，也刺激晚期骨生成過程之標記(茜素紅染色)的表現。此外，我們也發現c-Jun N-端激酶(JNK)路徑涉及ApoA-1調節之功能。以JNK抑制劑SP600125抑制JNK路徑，可阻斷由ApoA-1所增 進的骨生成過程標記與骨礦化。其他路徑，三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ATP-binding-cassette transporter A1，ABCA1)、細胞外訊號調控激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、轉錄訊息傳遞及活化子蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT3)亦涉及其中。我們亦證明ApoA-1在動物模型中可促進骨生成與預防骨流失，並因此有效治療活體內骨質疏鬆。總而言之，我們的結果證明ApoA-1係為骨生成過程之正調節劑，其經由JNK、ABCA1、ERK及/或STAT3路徑在hBM-MSCs骨生成之過程中刺激ALP活性與骨礦化，並可用於促進骨生成及有效治療骨流失疾病(如骨質疏鬆)。

咸信本發明所屬技藝中具一般知識者基於本文之敘述，無須進一步之例示即可將本發明應用至其最廣泛之範圍。因此，應了解此處所提供之敘述及申請專利範圍係供例示目的而非以任何方式限制本發明之範疇。

<110> 中央研究院

<120> 脂蛋白元A1用於促進骨生成之用途

<130> ACA0067TW-1

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<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 267

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 243

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 以可選的保護基團合成之D胜肽或L胜肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 以可選的保護基團合成之D胜肽或L胜肽

<400> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 以可選的保護基團合成之D胜肽或L胜肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 以可選的保護基團合成之D胜肽或L胜肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 以可選的保護基團合成之D胜肽或L胜肽

<400> 7

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 以可選的保護基團合成之D胜肽或L胜肽

<400> 8

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<213> 智人

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<213> 人工序列

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<223> GADPH 3'引子

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> ALP 5'引子

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> ALP 3'引子

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> BSP forward

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> Sh RNA目標序列

<400> 16

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sh RNA目標序列-2

<400> 17

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sh RNA目標序列29093

<400> 18

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sh RNA目標序列29093

<400> 19

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sh RNA目標序列29089

<400> 20

<210> 21

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 以可選的保護基團合成之D胜肽或L胜肽

<400> 21

<210> 22

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組ApoA-1多胜肽

<400> 22

Claims (13)

1. 一種(i)脂蛋白元A-1(ApoA-1)多肽或其生物功能變異體或其模擬肽，或(ii)包含編碼ApoA-1多肽或其生物功能變異體或其模擬肽之核酸片段之載體，在製造用於促進個體骨生成過程(osteogenesis)之組合物的用途，其中該ApoA-1多肽包含SEQ ID NO：1或2，該生物功能變異體具有與SEQ ID NO：1或2至少90%同一性之胺基酸序列，以及該模擬肽具有少於40個胺基酸殘基，其包括至少一具有聚集於疏水-親水界面的正電荷胺基酸殘基及聚集於親水表面中心的負電荷胺基酸殘基的A級雙性α-螺旋；該生物功能變異體及模擬肽具有等同於該ApoA-1多肽之脂質結合活性及促進膽固醇流出的能力。
2. 如請求項1之用途，其中該骨生成過程包括骨系細胞的先驅細胞分化形成成骨細胞(osteoblast)。
3. 如請求項2之用途，其中所述骨系細胞的先驅細胞為骨髓間葉幹細胞。
4. 如請求項1之用途，其中該生物功能變異體具有與SEQ ID NO：1或2至少95%同一性之胺基酸序列。
5. 如請求項1之用途，其中該模擬肽包含選自由SEQ ID NO：3-8所組成之群之胺基酸序列。
6. 如請求項1之用途，其中該模擬肽包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列。
7. 如請求項1-6中任一項之用途，其中該個體患有骨流失疾病，包括初級或次級骨質疏鬆。
8. 如請求項1-6中任一項之用途，其中該個體患有骨折。
9. 一種活體外促進間葉幹細胞之骨分化的方法，其包含使該細胞接觸有效量之ApoA-1多肽或其生物功能變異體或其模擬肽，其中該ApoA-1多肽包含SEQ ID NO：1或2，該生物功能變異體具有與SEQ ID NO：1或2至少90%同一性之胺基酸序列，以及該模擬肽具有少於40個胺基酸殘基，其包括至少一具有聚集於疏水-親水界面的正電荷胺基酸殘基及聚集於親水表面中心的負電荷胺基酸殘基的A級雙性α-螺旋；該生物功能變異體及模擬肽具有等同於該ApoA-1多肽之脂質結合活性及促進膽固醇流出的能力。
10. 如請求項9之方法，其中該方法係促進該骨髓間葉幹細胞分化形成成骨細胞(osteoblast)。
11. 如請求項9之方法，其中該生物功能變異體具有與SEQ ID NO：1或2至少95%同一性之胺基酸序列。
12. 如請求項9之方法，其中該模擬肽包含選自由SEQ ID NO：3-8所組成之群之胺基酸序列。
13. 如請求項9之方法，其中該模擬肽包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列。