JP2019530433A - Mg53突然変異体、その作製方法、およびその使用 - Google Patents
Mg53突然変異体、その作製方法、およびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
別の態様では、本発明は、MG53突然変異体のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離核酸に関する。ある特定の実施形態では、核酸は、配列番号13〜18で示された核酸配列のうちのいずれか1つを含む。ある特定の実施形態では、核酸は、配列番号151〜154で示された核酸配列のうちのいずれか1つを含む。
なおも別の態様では、本発明は、MG53突然変異体を調製するための方法であって、突然変異のための1つまたは複数のセリン位置を決定すること、野生型MG53のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むプラスミドの全長配列上の前記位置において、部位特異的突然変異誘発を実施すること、部位特異的突然変異を有するプラスミドを、宿主細胞へとトランスフェクトすること、およびMG53突然変異体を産生するように宿主細胞を誘導することを含む方法に関する。ある特定の実施形態では、部位特異的突然変異誘発は、(1)cDNA配列内の、部位特異的突然変異誘発で標的とされたアミノ酸の対応するヌクレオチド部位を決定し、突然変異部位においてヌクレオチド配列を標的アミノ酸に従って改変し、突然変異部位を含む20〜40bpの長さの配列を切り出すことにより、プライマーをデザインすること;(2)ステップ(1)のプライマーを使用し、野生型MG53プラスミドを鋳型とすることにより、PCR反応を実施し、PCR産物についてアガロースゲル電気泳動を実施し、PCR産物を精製すること;(3)制限エンドヌクレアーゼを使用することにより、ステップ(2)の精製PCR産物に対する酵素反応を実施し、酵素消化産物を、適切なプラスミド発現ベクターとライゲーションし、細菌コンピテント細胞内にライゲーション産物を形質転換し、培養することを含む。ある特定の実施形態では、部位特異的突然変異誘発は、以下のステップをさらに含む:(4)ステップ(3)のクローンを選択して、ステップ(1)のプライマーを使用することにより、コロニーPCR同定を実施し、PCR産物についてアガロースゲル電気泳動を実施し、次いで、DNAシーケンシング同定を実施して、部位特異的突然変異を有する陽性クローンを同定すること。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、MG53突然変異体を、対象へと、MG53突然変異体の構造および特性に干渉せずに送達するのに使用される、薬学的に許容される溶媒、懸濁薬剤、または他の任意の薬理学的に不活性の媒体を指す。このような担体の一部は、MG53突然変異体を、例えば、対象への経口投与のための、錠剤、丸剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、およびトローチとして製剤化されることを可能としうる。このような担体の一部は、MG53突然変異体が、注射、注入、または局所投与のために製剤化されることを可能とする。
本明細書で使用される「単離された」という用語は、物質(ポリペプチドまたは核酸など)が、天然で、それが通常存在する環境から分離されること、または天然で、それが通常見出される環境と異なる環境内にあることを指す。
配列番号13は、配列番号7で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図8に示される。
配列番号15は、配列番号9で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図10に示される。
配列番号17は、配列番号11で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図12に示される。
ある特定の実施形態では、単離核酸は、配列番号151〜154で示された核酸配列のうちのいずれか1つを含む。
配列番号152は、配列番号148で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図25に示される。
配列番号154は、配列番号150で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図27に示される。
本発明の発現ベクターは、例えば、DNAプラスミド、細菌プラスミド、ウイルスなどでありうる。発現ベクターの非限定例は、例えば、Paulら、2002、Nature Biotechnology、19、505;MiyagishiおよびTaira、2002、Nature Biotechnology、19、497;Leeら、2002、Nature Biotechnology、19、500;ならびにNovinaら、2002、Nature Medicine、advance online publication doi: 10.1038 /nm725に記載される。発現ベクターは、発現ベクターが、宿主細胞に入った後で、プロモーターが、コード配列の発現を引き起こしうるように、MG53突然変異体のアミノ酸配列のコード配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含有しうる。発現ベクターは、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、リポフェクションによるトランスフェクション、電気穿孔によるトランスフェクション、細菌ヒートショックなどであるがこれらに限定されない、適切な方法により、宿主細胞へと導入されうる。詳細については、Sambrookら、「Molecular Cloning(a laboratory manual、Cold Spring Harbor、1989)」を参照されたい。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される発現ベクターは、配列番号13〜18で示された核酸配列のうちのいずれか1つを含む。
本発明において記載される宿主細胞は、真核細胞の場合もあり、原核細胞の場合もある。適切な真核細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)など、哺乳動物細胞を含みうる。適する原核細胞は、例えば、E.coliなどの細菌を含みうる。
配列番号20は、配列番号2で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図3に示される。
配列番号22は、配列番号4で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図5に示される。
配列番号24は、配列番号6で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図7に示される。
配列番号144は、配列番号140で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図21に示される。
配列番号146は、配列番号142で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図23に示される。
(1)cDNA配列内の、部位特異的突然変異誘発で標的とされたアミノ酸の対応するヌクレオチド部位を決定し、突然変異部位においてヌクレオチド配列を標的アミノ酸に従って改変し、突然変異部位を含む20〜40bpの長さの配列を切り出すことにより、プライマーをデザインすること;
(2)ステップ(1)のプライマーを使用し、野生型MG53プラスミドを鋳型とすることによりPCR反応を実施し、PCR産物についてアガロースゲル電気泳動を実施し、PCR産物を精製すること;
(3)制限エンドヌクレアーゼを使用することにより、ステップ(2)の精製PCR産物に対する酵素反応を実施し、酵素消化産物を、適切なプラスミド発現ベクターとライゲーションし、細菌コンピテント細胞内にライゲーション産物を形質転換し、培養すること
を含む。
(4)ステップ(3)のクローンを選択して、ステップ(1)のプライマーを使用することにより、コロニーPCR同定を実施し、PCR産物についてアガロースゲル電気泳動を実施し、次いで、DNAシーケンシング同定を実施して、部位特異的突然変異を有する陽性クローンを同定するステップ
をさらに含む。
MG53突然変異体の調製
1.ヒトMG53突然変異体の調製
ヒトMG53 S255A突然変異体
(1)プライマーデザイン:cDNA配列内の、部位特異的突然変異誘発で標的とされたアミノ酸の対応するヌクレオチド部位を決定し、突然変異部位においてヌクレオチド配列を突然変異したアミノ酸に従って改変し、突然変異部位の20bp上流および10bp下流にある配列を切り出すことにより、プライマーをデザインする。プライマーの配列は、以下の通り:
ヒトMG53 S255Aのフォワードプライマー:tgcagaagatcctggcagaggctcccccacccg(配列番号25)
ヒトMG53 S255Aのリバースプライマー:tccagacgggcgggtgggggagcctctgccagg(配列番号26)
である。
(3)PCR産物についてのアガロースゲル電気泳動:PCR産物についてアガロースゲル電気泳動を実施して、その純度および量を同定する。
(5)Dpn Iによる消化:制限エンドヌクレアーゼであるDpn Iを使用することにより、精製されたPCR産物に対する酵素反応を実施する。
陽性クローンの同定:適正なサイズを伴うクローンを選択して、コロニーPCR同定を実施し、PCR産物についてアガロースゲル電気泳動を実施し、明瞭なバンドおよび適正なサイズを伴うクローンについての、小容量の振盪増幅培養を実施し、次いで、シーケンシング同定を実施する。
(i)ヒト野生型MG53(すなわち、配列番号1)の255位のセリンが、グリシンへと突然変異しているMG53突然変異体を表す、ヒトMG53 S255Gのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ヒトMG53 S255Gのフォワードプライマー:tgcagaagatcctggcagagggtcccccacccg(配列番号27)
ヒトMG53 S255Gのリバースプライマー:tccagacgggcgggtgggggaccctctgccagg(配列番号28)
の通りである。
ヒトMG53 S255Lのフォワードプライマー:tgcagaagatcctggcagagcttcccccacccg(配列番号29)
ヒトMG53 S255Lのリバースプライマー:tccagacgggcgggtgggggaagctctgccagg(配列番号30)
の通りである。
ヒトMG53 S255Vのフォワードプライマー:tgcagaagatcctggcagaggttcccccacccg(配列番号31)
ヒトMG53 S255Vのリバースプライマー:tccagacgggcgggtgggggaacctctgccagg(配列番号32)
の通りである。
ヒトMG53 S255Pのフォワードプライマー:tgcagaagatcctggcagagcctcccccacccg(配列番号33)
ヒトMG53 S255Pのリバースプライマー:tccagacgggcgggtgggggaggctctgccagg(配列番号34)
の通りである。
ヒトMG53 S255Fのフォワードプライマー:tgcagaagatcctggcagagtttcccccacccg(配列番号35)
ヒトMG53 S255Fのリバースプライマー:tccagacgggcgggtgggggaaactctgccagg(配列番号36)
の通りである。
ヒトMG53 S255Wのフォワードプライマー:tgcagaagatcctggcagagtggcccccacccg(配列番号37)
ヒトMG53 S255Wのリバースプライマー:tccagacgggcgggtgggggccactctgccagg(配列番号38)
の通りである。
ヒトMG53 S255Qのフォワードプライマー:tgcagaagatcctggcagagcaacccccacccg(配列番号39)
ヒトMG53 S255Qのリバースプライマー:tccagacgggcgggtgggggttgctctgccagg(配列番号40)
の通りである。
ヒトMG53 S255Cのフォワードプライマー:tgcagaagatcctggcagagtgtcccccacccg(配列番号41)
ヒトMG53 S255Cのリバースプライマー:tccagacgggcgggtgggggacactctgccagg(配列番号42)
の通りである。
ヒトMG53 S255Yのフォワードプライマー:tgcagaagatcctggcagagtatcccccacccg(配列番号43)
ヒトMG53 S255Yのリバースプライマー:tccagacgggcgggtgggggatactctgccagg(配列番号44)
の通りである。
ヒトMG53 S255Dのフォワードプライマー:tgcagaagatcctggcagaggatcccccacccg(配列番号45)
ヒトMG53 S255Dのリバースプライマー:tccagacgggcgggtgggggctactctgccagg(配列番号46)
の通りである。
ヒトMG53 S255Rのフォワードプライマー:tgcagaagatcctggcagagcgtcccccacccg(配列番号47)
ヒトMG53 S255Rのリバースプライマー:tccagacgggcgggtgggggacgctctgccagg(配列番号48)
の通りである。
ヒトMG53 S211Aのフォワードプライマー:ccttgcgccgggagctgggggccctgaactctt(配列番号49)
ヒトMG53 S211Aのリバースプライマー:gctgctccaggtaagagttcagggcccccagctcc(配列番号50)
の通りである。
ヒトMG53 S214Aのフォワードプライマー:gggagctggggagcctgaacgcttacctggagc(配列番号51)
ヒトMG53 S214Aのリバースプライマー:tgccgcagctgctccaggtaagcgttcaggctc(配列番号52)
の通りである。
ヒトMG53 S246Aのフォワードプライマー:tgaaatactgcctggtgaccgccaggctgcaga(配列番号53)
ヒトMG53 S246Aのリバースプライマー:gccaggatcttctgcagcctggcggtcaccagg(配列番号54)
の通りである。
ヒトMG53 S269Aのフォワードプライマー:aggagctgacctttgacccggcctctgcgcacc(配列番号55)
ヒトMG53 S269Aのリバースプライマー:accaggctcgggtgcgcagaggccgggtcaaag(配列番号56)
の通りである。
ヒトMG53 S297Aのフォワードプライマー:agctgacctttgacccgagcgctgcgcacccga(配列番号57)
ヒトMG53 S297Aのリバースプライマー:accaccaggctcgggtgcgcagcgctcgggtca(配列番号58)
の通りである。
マウスMG53の、S255A、S255G、S255L、S255W、S255Q、S255Y、S255D、およびS255R突然変異体は、ヒトMG53 S255A突然変異体を調製するための方法に従って調製した。プライマーを除き、他のステップの全ては、ヒトMG53 S255A突然変異体を調製するためのステップと同じである。各突然変異体のプライマーは、以下:
(i)マウス野生型MG53(すなわち、配列番号2)の255位のセリンが、アラニンへと突然変異しているMG53突然変異体を表す、マウスMG53 S255Aのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
マウスMG53 S255Aのフォワードプライマー:tgcagaagatcctgtcagaggcaccaccaccgg(配列番号59)
マウスMG53 S255Aのリバースプライマー:tctagccttgccggtggtggtgcctctgacagg(配列番号60)
の通りである。
マウスMG53 S255Gのフォワードプライマー:tgcagaagatcctgtcagagggaccaccaccgg(配列番号61)
マウスMG53 S255Gのリバースプライマー:tctagccttgccggtggtggtccctctgacagg(配列番号62)
の通りである。
マウスMG53 S255Lのフォワードプライマー:tgcagaagatcctgtcagagttaccaccaccgg(配列番号63)
マウスMG53 S255Lのリバースプライマー:tctagccttgccggtggtggtaactctgacagg(配列番号64)
の通りである。
マウスMG53 S255Wのフォワードプライマー:tgcagaagatcctgtcagagtggccaccaccgg(配列番号65)
マウスMG53 S255Wのリバースプライマー:tctagccttgccggtggtggccactctgacagg(配列番号66)
の通りである。
マウスMG53 S255Qのフォワードプライマー:tgcagaagatcctgtcagagcaaccaccaccgg(配列番号67)
マウスMG53 S255Qのリバースプライマー:tctagccttgccggtggtggttgctctgacagg(配列番号68)
の通りである。
マウスMG53 S255Yのフォワードプライマー:tgcagaagatcctgtcagagtatccaccaccgg(配列番号69)
マウスMG53 S255Yのリバースプライマー:tctagccttgccggtggtggatactctgacagg(配列番号70)
の通りである。
マウスMG53 S255Dのフォワードプライマー:tgcagaagatcctgtcagaggatccaccaccgg(配列番号71)
マウスMG53 S255Dのリバースプライマー:tctagccttgccggtggtggatcctctgacagg(配列番号72)
の通りである。
マウスMG53 S255Rのフォワードプライマー:tgcagaagatcctgtcagagcgaccaccaccgg(配列番号73)
マウスMG53 S255Rのリバースプライマー:tctagccttgccggtggtggtcgctctgacagg(配列番号74)
の通りである。
ラットMG53の、S255A、S255G、S255L、S255W、S255Q、S255Y、S255D、およびS255R突然変異体は、ヒトMG53 S255A突然変異体を調製するための方法に従って調製した。プライマーを除き、他のステップの全ては、ヒトMG53 S255A突然変異体を調製するためのステップと同じである。各突然変異体のプライマーは、以下:
(i)ラット野生型MG53(すなわち、配列番号3)の255位のセリンが、アラニンへと突然変異しているMG53突然変異体を表す、ラットMG53 S255Aのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ラットMG53 S255Aのフォワードプライマー:tgcagaagattctgtcagaggcaccacccccag(配列番号75)
ラットMG53 S255Aのリバースプライマー:tctagccttgctgggggtggtgcctctgacaga(配列番号76)
の通りである。
ラットMG53 S255Gのフォワードプライマー:tgcagaagattctgtcagagggaccacccccag(配列番号77)
ラットMG53 S255Gのリバースプライマー:tctagccttgctgggggtggtccctctgacaga(配列番号78)
の通りである。
ラットMG53 S255Lのフォワードプライマー:tgcagaagattctgtcagagttaccacccccag(配列番号79)
ラットMG53 S255Lのリバースプライマー:tctagccttgctgggggtggtaactctgacaga(配列番号80)
の通りである。
ラットMG53 S255Wのフォワードプライマー:tgcagaagattctgtcagagtggccacccccag(配列番号81)
ラットMG53 S255Wのリバースプライマー:tctagccttgctgggggtggccactctgacaga(配列番号82)
の通りである。
ラットMG53 S255Qのフォワードプライマー:tgcagaagattctgtcagagcaaccacccccag(配列番号83)
ラットMG53 S255Qのリバースプライマー:tctagccttgctgggggtggttgctctgacaga(配列番号84)
の通りである。
ラットMG53 S255Yのフォワードプライマー:tgcagaagattctgtcagagtatccacccccag(配列番号85)
ラットMG53 S255Yのリバースプライマー:tctagccttgctgggggtggatactctgacaga(配列番号86)
の通りである。
ラットMG53 S255Dのフォワードプライマー:tgcagaagattctgtcagaggatccacccccag(配列番号87)
ラットMG53 S255Dのリバースプライマー:tctagccttgctgggggtggatcctctgacaga(配列番号88)
の通りである。
ラットMG53 S255Rのフォワードプライマー:tgcagaagattctgtcagagcgaccacccccag(配列番号89)
ラットMG53 S255Rのリバースプライマー:tctagccttgctgggggtggtcgctctgacaga(配列番号90)
の通りである。
サルMG53の、S255A、S255G、S255L、S255W、S255Q、S255Y、S255D、およびS255R突然変異体は、ヒトMG53 S255A突然変異体を調製するための方法に従って調製した。プライマーを除き、他のステップの全ては、ヒトMG53 S255A突然変異体を調製するためのステップと同じである。各突然変異体のプライマーは、以下:
(i)サル野生型MG53(すなわち、配列番号4)の255位のセリンが、アラニンへと突然変異しているMG53突然変異体を表す、サルMG53 S255Aのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
サルMG53 S255Aのフォワードプライマー:aagatcctggcagaggctcccccacccgcccgtctg(配列番号91)
サルMG53 S255Aのリバースプライマー:cagacgggcgggtgggggagcctctgccaggatctt(配列番号92)
の通りである。
サルMG53 S255Gのフォワードプライマー:aagatcctggcagagggtcccccacccgcccgtctgg(配列番号93)
サルMG53 S255Gのリバースプライマー:ccagacgggcgggtgggggaccctctgccaggatctt(配列番号94)
の通りである。
サルMG53 S255Lのフォワードプライマー:agatcctggcagagttacccccacccgcccgtctgga(配列番号95)
サルMG53 S255Lのリバースプライマー:tccagacgggcgggtgggggtaactctgccaggatct(配列番号96)
の通りである。
サルMG53 S255Wのフォワードプライマー:agatcctggcagagtggcccccacccgcccgtctgga(配列番号97)
サルMG53 S255Wのリバースプライマー:tccagacgggcgggtgggggccactctgccaggatct(配列番号98)
の通りである。
サルMG53 S255Qのフォワードプライマー:aagatcctggcagagcaacccccacccgcccgtctgga(配列番号99)
サルMG53 S255Qのリバースプライマー:tccagacgggcgggtgggggttgctctgccaggatctt(配列番号100)
の通りである。
サルMG53 S255Yのフォワードプライマー:agatcctggcagagtatcccccacccgcccgtctgg(配列番号101)
サルMG53 S255Yのリバースプライマー:ccagacgggcgggtgggggatactctgccaggatct(配列番号102)
の通りである。
サルMG53 S255Dのフォワードプライマー:aagatcctggcagaggatcccccacccgcccgtctgg(配列番号103)
サルMG53 S255Dのリバースプライマー:ccagacgggcgggtgggggatcctctgccaggatctt(配列番号104)
の通りである。
サルMG53 S255Rのフォワードプライマー:aagatcctggcagagcgtcccccacccgcccgtctgg(配列番号105)
サルMG53 S255Rのリバースプライマー:ccagacgggcgggtgggggacgctctgccaggatctt(配列番号106)
の通りである。
ブタMG53の、S255A、S255G、S255L、S255W、S255Q、S255Y、S255D、およびS255R突然変異体は、ヒトMG53 S255A突然変異体を調製するための方法に従って調製した。プライマーを除き、他のステップの全ては、ヒトMG53 S255A突然変異体を調製するためのステップと同じである。各突然変異体のプライマーは、以下:
(i)ブタ野生型MG53(すなわち、配列番号5)の255位のセリンが、アラニンへと突然変異しているMG53突然変異体を表す、ブタMG53 S255Aのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ブタMG53 S255Aのフォワードプライマー:aagatcctggcagaggcgcccccacctgcccgcctg(配列番号107)
ブタMG53 S255Aのリバースプライマー:caggcgggcaggtgggggcgcctctgccaggatctt(配列番号108)
の通りである。
ブタMG53 S255Gのフォワードプライマー:aagatcctggcagaggggcccccacctgcccgcctgg(配列番号109)
ブタMG53 S255Gのリバースプライマー:ccaggcgggcaggtgggggcccctctgccaggatctt(配列番号110)
の通りである。
ブタMG53 S255Lのフォワードプライマー:agatcctggcagagttgcccccacctgcccgcctgg(配列番号111)
ブタMG53 S255Lのリバースプライマー:ccaggcgggcaggtgggggcaactctgccaggatct(配列番号112)
の通りである。
ブタMG53 S255Wのフォワードプライマー:agatcctggcagagtggcccccacctgcccgcctgg(配列番号113)
ブタMG53 S255Wのリバースプライマー:ccaggcgggcaggtgggggccactctgccaggatct(配列番号114)
の通りである。
ブタMG53 S255Qのフォワードプライマー:aagatcctggcagagcagcccccacctgcccgcctgg(配列番号115)
ブタMG53 S255Qのリバースプライマー:ccaggcgggcaggtgggggctgctctgccaggatctt(配列番号116)
の通りである。
ブタMG53 S255Yのフォワードプライマー:agatcctggcagagtatcccccacctgcccgcctgga(配列番号117)
ブタMG53 S255Yのリバースプライマー:tccaggcgggcaggtgggggatactctgccaggatct(配列番号118)
の通りである。
ブタMG53 S255Dのフォワードプライマー:aagatcctggcagaggatcccccacctgcccgcctgga(配列番号119)
ブタMG53 S255Dのリバースプライマー:tccaggcgggcaggtgggggatcctctgccaggatctt(配列番号120)
の通りである。
ブタMG53 S255Rのフォワードプライマー:aagatcctggcagagcggcccccacctgcccgcctgg(配列番号121)
ブタMG53 S255Rのリバースプライマー:ccaggcgggcaggtgggggccgctctgccaggatctt(配列番号122)
の通りである。
イヌMG53の、S255A、S255G、S255L、S255W、S255Q、S255Y、S255D、およびS255R突然変異体は、ヒトMG53 S255A突然変異体を調製するための方法に従って調製した。プライマーを除き、他のステップの全ては、ヒトMG53 S255A突然変異体を調製するためのステップと同じである。各突然変異体のプライマーは、以下:
(i)イヌ野生型MG53(すなわち、配列番号6)の255位のセリンが、アラニンへと突然変異しているMG53突然変異体を表す、イヌMG53 S255Aのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
イヌMG53 S255Aのフォワードプライマー:aagatcctggcagaagcaccaccgcctgcccgtttg(配列番号123)
イヌMG53 S255Aのリバースプライマー:caaacgggcaggcggtggtgcttctgccaggatctt(配列番号124)
の通りである。
イヌMG53 S255Gのフォワードプライマー:aagatcctggcagaaggaccaccgcctgcccgtttgg(配列番号125)
イヌMG53 S255Gのリバースプライマー:ccaaacgggcaggcggtggtccttctgccaggatctt(配列番号126)
の通りである。
イヌMG53 S255Lのフォワードプライマー:agatcctggcagaattaccaccgcctgcccgtttgg(配列番号127)
イヌMG53 S255Lのリバースプライマー:ccaaacgggcaggcggtggtaattctgccaggatct(配列番号128)
の通りである。
イヌMG53 S255Wのフォワードプライマー:agatcctggcagaatggccaccgcctgcccgtttgga(配列番号129)
イヌMG53 S255Wのリバースプライマー:tccaaacgggcaggcggtggccattctgccaggatct(配列番号130)
の通りである。
イヌMG53 S255Qのフォワードプライマー:aagatcctggcagaacaaccaccgcctgcccgtttgg(配列番号131)
イヌMG53 S255Qのリバースプライマー:ccaaacgggcaggcggtggttgttctgccaggatctt(配列番号132)
の通りである。
イヌMG53 S255Yのフォワードプライマー:agatcctggcagaatatccaccgcctgcccgtttgga(配列番号133)
イヌMG53 S255Yのリバースプライマー:tccaaacgggcaggcggtggatattctgccaggatct(配列番号134)
の通りである。
イヌMG53 S255Dのフォワードプライマー:aagatcctggcagaagatccaccgcctgcccgtttgga(配列番号135)
イヌMG53 S255Dのリバースプライマー:tccaaacgggcaggcggtggatcttctgccaggatctt(配列番号136)
の通りである。
イヌMG53 S255Rのフォワードプライマー:aagatcctggcagaacgaccaccgcctgcccgtttgg(配列番号137)
イヌMG53 S255Rのリバースプライマー:ccaaacgggcaggcggtggtcgttctgccaggatctt(配列番号138)
の通りである。
マウスMG53 S255A突然変異体の、マウス野生型MG53の、細胞膜修復機能および心保護機能に対する影響
マウスMG53 S255A突然変異体(そのアミノ酸配列は、配列番号8で示される)の、マウス野生型MG53の、細胞膜修復機能および心保護機能に対する影響を査定するために、本発明者らは、初代培養された新生仔ラット心室筋細胞(NRVM)内で、アデノウイルスを使用して、マウス野生型MG53およびマウスMG53突然変異体を過剰発現させ、細胞の生存率を検出した。結果を、低酸素状態/再酸素化により刺激される、虚血症−再灌流傷害が、大量の乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の放出、およびNRVM内の細胞内ATPの減少を結果としてもたらし、マウス野生型MG53およびマウスMG53 S255A突然変異体の過剰発現が、LDHの放出およびATPの低減を、同様に阻害しうることを指し示す、図14に示す。これは、マウス野生型MG53が、虚血症−再灌流により誘導されるアポトーシスおよび壊死に対する保護効果を有する一方で、マウスMG53 S255A突然変異体も、マウス野生型MG53の、細胞膜修復機能および心保護機能に影響を及ぼさない、すなわち、マウスMG53S255位のリン酸化が、MG53の細胞膜修復機能および心保護機能を調節しないことを示唆する。
MG53の心保護機能の機構は、以下の通りである:MG53は、心保護のRISKシグナル伝達経路内の不可欠の構成要素であり、カベオリン3と、p85−PI3Kタンパク質との相互作用を媒介して、RISKシグナル伝達経路、例えば、重要な下流シグナル伝達分子であるAKTを活性化させる(Zhang Y.ら、Cardiovascular Research、91、108〜115(2011)を参照されたい)。したがって、本発明者らは、マウスMG53 S255A突然変異が、MG53の心保護機能に影響を及ぼさない機構についてさらに研究して、それが、マウスMG53 S255A突然変異体と、マウス野生型MG53とが、RISKシグナル伝達経路を、同様に活性化させるという事実に関するのかどうかを同定した。実験結果を、NRVM内のマウス野生型MG53の過剰発現が、RISKシグナル伝達経路の、下流シグナル伝達分子であるAKTの473位におけるセリンのリン酸化を増強する、すなわち、AKTを活性化させうることを指し示す、図15に示す。マウスMG53 S255A突然変異体と、マウス野生型MG53とは、AKTの473位におけるセリンのリン酸化を、同様に増強する、すなわち、AKTを活性化させうる。これは、マウスMG53 S255A突然変異が、RISKシグナル伝達経路の、マウス野生型MG53による活性化に影響を及ぼさない、すなわち、マウスMG53S 255のリン酸化に対する調節が、RISKシグナル伝達心保護経路に影響を及ぼさないことを示唆する。
ヒトMG53 S255A突然変異体またはマウスMG53 S255A突然変異体の、野生型MG53のE3ユビキチンリガーゼ活性に対する影響
MG53の高発現により誘導される、インスリンシグナル伝達経路の抑制は、インスリン抵抗性およびメタボリックシンドロームの発生の重要な機構のうちの1つであり、また、MG53の重要な機能のうちの1つでもある。第1に、本発明者らは、マウス野生型MG53のセリン突然変異である、マウスMG53 S255Aの発現プラスミドを構築した(そのアミノ酸配列は、配列番号8で示される)。加えて、本発明者らはまた、IRS1、ユビキチン、およびマウス野生型MG53の発現プラスミドも構築した。第2に、本発明者らのかつての研究は、MG53が、インスリン基質であるIRS1のE3ユビキチンリガーゼであり、プロテアソーム経路によるタンパク質の分解を媒介することを示唆する(Song,R.ら、Nature、494、375〜379(2013))。したがって、本発明者らは、HEK293T細胞系に、IRS1、ユビキチンの発現プラスミドと、マウス野生型MG53またはマウスMG53 S255A突然変異体のプラスミドとを共トランスフェクトし、マウスMG53 S255A突然変異の、IRS1タンパク質の含量の変化を介する、MG53機能に対する影響を査定した。実験結果を、マウス野生型MG53が、IRS1の発現を著明に低減しうるのに対し、マウスMG53 S255A突然変異体は、MG53に媒介されるIRS1タンパク質の低減を、著明に阻害しうることを示唆する、図19に示す。これは、HEK293T細胞系の共発現系では、マウス野生型MG53は、正常なE3ユビキチンリガーゼ活性をもたらし、IRS1のユビキチン分解を媒介しうることを示唆する。これはまた、検出されたマウスMG53 S255A突然変異体が、MG53のE3ユビキチンリガーゼ活性を阻害した、すなわち、MG53 S255位のリン酸化状態が、MG53のE3ユビキチンリガーゼ活性を調節しうることも示唆する。
MG53は、E2ユビキチンコンジュゲート酵素と会合して、基質のユビキチン化と、さらなるプロテアソーム分解とを媒介する、RINGドメインを伴うE3ユビキチンリガーゼである。したがって、RINGドメインを伴わない、MG53−D−RING切断型突然変異体は、MG53のE3ユビキチンリガーゼ活性を喪失する。さらに、ヒトMG53 S255A突然変異体(そのアミノ酸配列は、配列番号7で示される)およびマウスMG53 S255A突然変異体(そのアミノ酸配列は、配列番号8で示される)の、ヒト野生型MG53またはマウス野生型MG53のE3ユビキチンリガーゼ活性に対する影響を、定量的に査定するために、本発明者ら、ヒトMG53−D−RINGまたはマウスMG53−D−RINGを、陽性対照とすることにより、ヒトまたはマウスの、野生型MG53、MG53 S255A突然変異体、またはMG53−D−RING切断型突然変異体と、MG53の基質であるIRS1、またはインスリン受容体であるIRとを、ヒト胎児腎臓上皮細胞系であるHEK293T内で共発現させ、異なる突然変異の、MG53に媒介された基質分解に対する影響を検出した。結果を、ヒト野生型MG53またはマウス野生型MG53が、IRS1分解を、著明に媒介しうるが、ヒトMG53−D−RING切断型突然変異体またはマウスMG53−D−RING切断型突然変異体が、IRS1分解を、ほとんど媒介しえないのに対し、マウスMG53 S255A突然変異体は、IRS1のうちの約40%の分解だけを媒介しうるが、ヒトMG53 S255A突然変異体は、IRS1のうちの約10%の分解だけを媒介しうることを指し示す、図16(マウス)および図17(ヒト)に示す。マウス野生型MG53は、IRβの約50%の分解を媒介しうるが、マウスMG53−D−RING切断型突然変異体およびマウスMG53 S255A突然変異体は、IRβの分解を、ほとんど媒介しない。加えて、HEK293T共発現系内では、マウス野生型MG53が、IRβの前駆体タンパク質の分解を媒介しうるのに対し、マウスMG53−D−RING切断型突然変異体およびマウスMG53 S255A突然変異体は、MG53に媒介された分解をほぼ完全に阻害した。この研究は、ヒトMG53−D−RING切断型突然変異体またはマウスMG53−D−RING切断型突然変異体が、MG53のE3ユビキチンリガーゼ活性を、著明に阻害するのに対し、ヒトMG53 S255A突然変異体またはマウスMG53 S255A突然変異体は、少なくとも約50%の、MG53 E3ユビキチンリガーゼ活性を阻害することを示唆する。
マウスMG53 S255A突然変異体(そのアミノ酸配列は、配列番号8で示される)が、MG53の、基質であるIRS1タンパク質の認識およびこれへの結合に影響を及ぼしうるのかどうかについて研究するために、本発明者らは、一態様では、基質であるIRS1と、マウス野生型MG53またはマウスMG53 S255A突然変異体との結合強度を、ex vivoのHEK293T細胞系内の、活性状態下で、共免疫沈降を介して検出し、別の態様では、精製タンパク質であるIRS1と、マウス野生型MG53またはマウスMG53 S255A突然変異体との、直接的な結合強度を、表面プラズモン共鳴(SPR)試験を介して検出した。実験結果を、図18に示す。図18Aは、IRS1が、マウス野生型MG53に、物理的に結合しうるのに対し、同量のIRS1は、極少量のマウスMG53 S255A突然変異体だけに結合しうることを示し;図18Bは、マウス野生型MG53タンパク質が、IRS1タンパク質に、64.2nMのKDで、極めて良好に結合しうるのに対し、マウスMG53 S255A突然変異体は、IRS1タンパク質に結合しえないことを示す。上記に照らし、マウスMG53 S255A突然変異は、MG53のE3ユビキチンリガーゼ活性を阻害するように、MG53の、基質であるIRS1タンパク質の認識およびこれへの結合を阻害した。
ヒトMG53 S255A突然変異体のin vivo活性
ヒトMG53 S255A突然変異体(そのアミノ酸配列は、配列番号7で示される)が、in vivoにおいても、細胞膜修復機能および心保護機能を保持しつつ、野生型MG53により引き起こされる代謝的副作用を依然として回避または低減しうるのかどうかを検証するために、本発明者らは、ヒトMG53 S255A突然変異体およびヒト野生型MG53を、それぞれ、ラットの体内へと導入して、ヒトMG53 S255A突然変異体のin vivo活性について、さらに解析した。第1に、本発明者らは、本出願の実施例1に従うヒトMG53 S255A突然変異体を調製する。第2に、15匹の雄Sprague−Dawley(SD)ラット(ラット1匹当たり約250g;Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd.製)を選択し、群1つ当たりのラット5匹ずつとする3つの群、すなわち、試験群、陽性対照群、および陰性対照群へと群分けする。30mg/kgのペントバルビタールナトリウム(腹腔内注射)を介して、ラットに麻酔をかけ、次いで、左第3肋骨において、開胸術を実施して、心臓を露出させる。次いで、ヒトMG53 S255A突然変異体タンパク質(6mg/kg、iv)を、被験群内のラットの心臓へと、静脈内注射し、ヒト野生型MG53タンパク質(そのアミノ酸配列は、配列番号1で示される)(6mg/kg、iv)を、陽性対照群内のラットの心臓へと、静脈内注射し、ウシ血清アルブミン(BSA)(6mg/kg、iv)を、陰性対照群内のラットの心臓へと静脈内注射する。各群内のラットの下行左前動脈の結紮を、上記のタンパク質の静脈内注射の5分後に行い、45分間にわたり続行した。結紮の終了の前に、各群のラットに、それぞれ、対応する、ヒトMG53 S255A突然変異体タンパク質、ヒト野生型MG53タンパク質、およびBSA(6mg/kg、iv)を、再度静脈内注射し、次いで、冠動脈を開放する。24時間にわたる再灌流時間の後、生存率を、被験群、陽性対照群、および陰性対照群の間で比較する。インスリンを使用して、各群内のラットを刺激し、次いで、ラットを屠殺して、被験群内、陽性対照群内、および陰性対照群内のラットの、梗塞サイズ、血清LDH濃度、および心筋断面についてのTUNEL染色を比較する。まとめると、これらの指標は、各群内のラットの心損傷のレベルを測定する。被験群内のラットの梗塞サイズが、陰性対照群内のラットの梗塞サイズより著明に小さいか、または被験群内のラットが、陰性対照群内のラットと比較して、著明に阻害されたLDH放出を裏付けるか、または被験群内のラットについての、心筋断面についてのTUNEL染色結果が、細胞死の、陰性対照群内のラットの細胞死と比較した減少を指し示す場合、ヒトMG53 S255A突然変異体が、ヒト野生型MG53の細胞膜修復機能および心保護機能に影響を及ぼさず、心筋梗塞、心虚血症/再灌流傷害などの心疾患を処置するために使用されうることが示唆される。最後に、被験群内、陽性対照群内、および陰性対照群内のラットの、各組織(例えば、心筋、骨格筋、肝臓など)内のp−AKT/t−AKTの変化を比較して、被験群内、陽性対照群内、および陰性対照群内のラットの各組織のインスリン応答性について査定する。陽性対照群内のラットの組織内のp−AKT/t−AKTの比が減少する場合は、ヒト野生型MG53タンパク質が、インスリン感受性の低減を誘導しうることが示唆され、陰性対照群内のラットの組織内のp−AKT/t−AKTの比が正常な場合は、BSAが、インスリン感受性に対して効果を及ぼさないことが示唆され、被験群内のラットの組織内のp−AKT/t−AKTの比が、陽性対照群より大きい場合は、ヒトMG53 S255A突然変異体が、ヒト野生型MG53タンパク質により誘導されたインスリン感受性の低減を消失または減弱させうることが示唆される。
Claims (35)
- MG53突然変異体であって、該MG53突然変異体は、野生型MG53のコイルドコイル−SPRY領域内の少なくとも1つのセリンを除き、野生型MG53のアミノ酸配列と同一であり、該セリンは、欠失しているおよび/またはセリンでないかもしくはトレオニンでない他の任意のアミノ酸へと突然変異している、前記MG53突然変異体。
- コイルドコイル−SPRY領域が、野生型MG53のアミノ酸配列の122〜477位に位置する、請求項1に記載のMG53突然変異体。
- 野生型MG53のアミノ酸配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6で示される、請求項1または2に記載のMG53突然変異体。
- セリンが、非極性アミノ酸へと突然変異している、請求項1から3のいずれか一項に記載のMG53突然変異体。
- 非極性アミノ酸が、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、およびトリプトファンからなる群から選択される、請求項4に記載のMG53突然変異体。
- 非極性アミノ酸が、アラニンである、請求項5に記載のMG53突然変異体。
- セリンが、セリンでないかまたはトレオニンでない極性アミノ酸へと突然変異している、請求項1から6のいずれか一項に記載のMG53突然変異体。
- 極性アミノ酸が、グルタミン、システイン、アスパラギン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される、請求項7に記載のMG53突然変異体。
- 極性アミノ酸が、システインである、請求項8に記載のMG53突然変異体。
- 欠失または突然変異したセリンが、野生型MG53のアミノ酸配列の以下の位置:189、211、214、246、255、269、296、301、305、307、341、377、418、430位のうちの1つまたは複数に位置する、請求項1から9のいずれか一項に記載のMG53突然変異体。
- 欠失または突然変異したセリンが、野生型MG53のアミノ酸配列の以下の位置:211、214、246、255、269、296、297位のうちの1つまたは複数に位置する、請求項1から10のいずれか一項に記載のMG53突然変異体。
- 欠失または突然変異したセリンが、野生型MG53のアミノ酸配列の255位に位置する、請求項1から11のいずれか一項に記載のMG53突然変異体。
- 2つ以上のセリン突然変異を有する、請求項12に記載のMG53突然変異体。
- 配列番号7〜12で示されたアミノ酸配列のうちのいずれか1つに対する少なくとも70%の相同性を有するアミノ酸配列を有し、細胞修復機能および/または心保護機能を依然として保持しつつ、野生型MG53により引き起こされる代謝的副作用を回避する、請求項1から13のいずれか一項に記載のMG53突然変異体。
- MG53突然変異体のアミノ酸配列が、配列番号7〜12で示されたアミノ酸配列のうちのいずれか1つである、請求項1から14のいずれか一項に記載のMG53突然変異体。
- MG53突然変異体のアミノ酸配列が、配列番号7で示されたアミノ酸配列である、請求項1から15のいずれか一項に記載のMG53突然変異体。
- 請求項1から16のいずれか一項に記載のMG53突然変異体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 請求項1から16のいずれか一項に記載のMG53突然変異体のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離核酸。
- 配列番号13〜18で示された核酸配列のうちのいずれか1つを含む、請求項18に記載の核酸。
- 請求項18に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
- 配列番号13〜18で示された核酸配列のうちのいずれか1つを含む、請求項20に記載の発現ベクター。
- 請求項20または21に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1から16のいずれか一項に記載のMG53突然変異体を調製するための方法であって、突然変異のための1つまたは複数のセリン位置を決定すること、野生型MG53のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むプラスミドの全長配列上の位置において、部位特異的突然変異誘発を実施すること、部位特異的突然変異を有するプラスミドを、宿主細胞へとトランスフェクトすること、およびMG53突然変異体を産生するように宿主細胞を誘導することを含む方法。
- 部位特異的突然変異誘発が、以下のステップ:
(1)cDNA配列内の、部位特異的突然変異誘発で標的とされたアミノ酸の対応するヌクレオチド部位を決定し、突然変異部位においてヌクレオチド配列を標的アミノ酸に従って改変し、突然変異部位を含む20〜40bpの長さの配列を切り出すことにより、プライマーをデザインすること;
(2)ステップ(1)のプライマーを使用し、野生型MG53プラスミドを鋳型とすることによりPCR反応を実施し、PCR産物についてアガロースゲル電気泳動を実施し、PCR産物を精製すること;
(3)制限エンドヌクレアーゼを使用することにより、ステップ(2)の精製PCR産物に対する酵素反応を実施し、酵素消化産物を、適切なプラスミド発現ベクターとライゲーションし、細菌コンピテント細胞内にライゲーション産物を形質転換し、培養すること;
(4)ステップ(3)のクローンを選択して、ステップ(1)のプライマーを使用することにより、コロニーPCR同定を実施し、PCR産物についてアガロースゲル電気泳動を実施し、次いで、DNAシーケンシング同定を実施して、部位特異的突然変異を有する陽性クローンを同定すること
を含む、請求項23に記載の方法。 - 心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および/または組織の損傷と関連する疾患を処置するための医薬の製造における、請求項1から16のいずれか一項に記載のMG53突然変異体の使用。
- 医薬が、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および/または組織の損傷と関連する疾患を処置しつつ、代謝的副作用を回避する、請求項25に記載の使用。
- 心疾患が、心筋損傷と関連する疾患である、請求項25または26に記載の使用。
- 心疾患が、糖尿病性心疾患、心筋虚血症、心虚血症/再灌流傷害、心筋梗塞、心不全、不整脈、心破裂、狭心症、心筋炎、冠動脈性心疾患、および心膜炎を含む、請求項25から27のいずれか一項に記載の使用。
- 糖尿病性脳血管疾患が、脳動脈硬化症、虚血性脳血管疾患、脳出血、脳萎縮、および脳梗塞を含む、請求項25または26に記載の使用。
- 糖尿病性眼合併症が、糖尿病網膜症、糖尿病性白内障、糖尿病関連ブドウ膜炎、および失明を含む、請求項25または26に記載の使用。
- 糖尿病性神経障害が、糖尿病性末梢神経障害を含む、請求項25または26に記載の使用。
- 腎疾患が、急性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、急性腎傷害、および糖尿病性腎症を含む、請求項25または26に記載の使用。
- 細胞および/または組織の損傷と関連する疾患が、腎臓、脳、肺、肝臓、心臓、脾臓、消化管、および皮膚の損傷と関連する疾患を含む、請求項25または26に記載の使用。
- 細胞および/または組織の損傷と関連する疾患が、外傷、火傷、潰瘍、粘膜炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、および皮膚の老化を含む、請求項33に記載の使用。
- MG53突然変異体のアミノ酸配列が、配列番号7で示されたアミノ酸配列である、請求項25から34のいずれか一項に記載の使用。
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