CN101797375B

CN101797375B - Mg53蛋白预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤的用途

Info

Publication number: CN101797375B
Application number: CN 200910241451
Authority: CN
Inventors: 曹春梅; 张岩; 肖瑞平; 麻建杰
Original assignee: Peking University
Current assignee: Beijing Boya Herui Technology Co., Ltd.
Priority date: 2009-12-02
Filing date: 2009-12-02
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2029-12-02
Also published as: CN101797375A

Abstract

本发明公开了MG53蛋白的新用途，尤其是在制备用于预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤所致疾病的药物中的用途。MG53蛋白参与了缺血预适应过程，它将两条重要的IPC(缺血预适应)分子通路，即PI3K-Akt-GSK3β通路和CaV3通路联系起来，通过促进CaV3和PI3K-p85的相互作用，进而活化Akt/GSK3β通路，对心脏缺血/再灌损伤产生保护作用，为制备一种心脏的保护药物提供了新的支持证据，从而可应用于制备预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤所致疾病的药物。

Description

MG53蛋白预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤的用途

技术领域

本发明涉及MG53蛋白的新用途，尤其是在制备用于预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤所致疾病的药物中的用途。

背景技术

缺血性心肌病是目前造成人类死亡的最主要的原因之一¹。冠状动脉粥样硬化或者血栓造成的血管堵塞，以及冠状动脉手术都会造成心肌细胞的缺血死亡，而目前防止心肌细胞的缺血死亡的最佳办法就是恢复血流。但是在血流恢复后的一小段时间内，由于大量富含氧和其他营养物质的血流进入到缺血区，会引起缺血区心肌细胞内的氧化应激反应、钙离子超载以及有害组分的激活，这些都会进一步加重心肌细胞的损伤，引起更多的心肌细胞的死亡，这就是心脏缺血/再灌注损伤。缺血/再灌损伤最常见的后果是引起“心力衰竭”。同时心肌细胞的死亡还可以引起“心律失常”，“心脏破裂”等并发症。

缺血预适应是目前发现的对抗缺血损伤以及再灌注引起的损伤最强有效的心脏保护机制 ²。缺血预适应是指在长时间的缺血以前，进行几个短暂的心脏缺血和再灌注的循环，能够保护心脏免受后面的长时间缺血和再灌注引起的损伤。除心脏以外，脑、肝脏、肾脏等其他器官中都有缺血预适应现象^3-5。

目前已发现有很多的细胞信号分子都参与心脏缺血预适应过程，包括促进细胞生存的激酶(PI3K，Akt以及GSK3β)^6-8以及细胞内的“脚手架”蛋白，Caveolin 3(CaV3)⁹。这些分子的缺失都能够影响缺血预适应的保护作用，而它们的蛋白水平或者活性的增加都能够产生类似于心脏缺血预适应的保护作用。尤其是其是CaV3这种“脚手架”蛋白能够在细胞内聚集生存相关的分子，从而促进其相互的活化。但是以上提到的这些分子都是相对独立的信号体系，它们之间的联系和相互作用，以及调节这些信号分子在细胞内的空间和时间分布的因素，目前还没有研究清楚，但这些因素对于人们了解缺血预适应现象的机制，从而将其应用到临床却具有非常重要的意义。

MG53是最近发现的一种在心肌和骨骼肌中特异性表达的蛋白，其氨基酸序列如MG53蛋白氨基酸序列表中的SEQ ID NO.1所示。MG53蛋白的制备方法如下：先从心脏组织提取mRNA，通过逆转录合成cDNA文库，然后用MG53基因的特异引物进行PCR扩增，将扩增得到的特异条带连接入测序载体，测序证实其序列的正确性。利用PCR扩增时引物两端引入的酶切位点将扩增获得的特异条带构建到真核表达载体pcDNA4/TO/MYC HisB中，用该载体转染HEK 293A细胞，利用载体上的抗性基因Zeocin筛选出稳定表达MG53蛋白的细胞。培养该细胞系大量扩增表达蛋白，破碎细胞之后，收集总蛋白，利用MG53的多抗亲和纯化MG53蛋白，蛋白纯度通过PAGE检测。

已有的研究结果表明，在骨骼肌中MG53能够作为一种结构蛋白促进细胞膜损伤的修复¹⁰，同时也能够调节细胞内小泡的转运和骨骼肌细胞再生^11，12。目前，有关MG53的研究都是在骨骼肌内进行的，包括细胞小泡的转运，肌细胞的再生以及膜修复等。但是MG53是一种在骨骼肌和心肌内特异性表达的蛋白，而且在心肌内的表达量大于骨骼肌¹⁰，因此MG53蛋白很可能在心脏缺血预适应保护作用中扮演着重要的角色。鉴于心血管系统和人类的生命密切相关，心血管系统疾病又是危害人类健康，威胁人类生命的最主要的原因之一，因此，研究MG53蛋白在心脏缺血预适应保护作用中所起的作用，对于充分开发其在缺血性心肌病方面的临床应用具有更加重要的意义。

发明内容

本发明的目的是公开MG53蛋白的新功能，提供MG53蛋白的一种新的用途，具体是在制备用于预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤所致疾病的药物中的用途。缺血/再灌损伤最常见的后果是引起“心力衰竭”。缺血/再灌损伤会引起心肌细胞的死亡，心肌细胞的死亡还可以引起“心律失常”，“心脏破裂”等并发症。因此预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤，也能预防和/或治疗心力衰竭、心律失常、心脏破裂。

本发明人经过努力的研究证明了：MG53蛋白能够对心脏缺血/再灌损伤产生保护作用；MG53产生上述保护作用的机制是将两条重要的IPC(缺血预适应)分子通路，即PI3K-Akt-GSK3β通路和CaV3通路，联系起来，它通过促进CaV3和PI3K-p85的相互作用，进而活化Akt/GSK3β通路，产生其保护作用，说明MG53蛋白是这两条通路相互作用必需的中间分子。

本发明的一个具体实施方案是：应用大鼠心脏冠状动脉缺血/再灌(IR)以及缺血预适应(IPC)与IR结合的模型研究MG53蛋白与IR和IPC的关系，结果发现，IPC能够减少IR引起的心脏损伤标志物LDH(乳酸脱氢酶)的释放和心肌梗死的面积，而心肌中MG53的mRNA和蛋白水平随着IR引起的心脏损伤而下降，这种下降能够被IPC阻止。说明MG53的下降可能是导致IR损伤的因素，同时它也参与IPC的保护作用。

本发明的另一个实施方案是在体外培养心肌细胞，利用模拟心脏缺血的缺氧刺激，研究 MG53蛋白对心肌细胞的缺氧损伤产生保护作用。结果表明，在体外培养的心肌细胞中，和体内的情况一样，模拟心脏缺血的缺氧刺激也能够引起心肌细胞的死亡，同时伴有MG53表达水平的下降；在体外培养的心肌细胞中利用腺病毒载体过表达连有绿色荧光蛋白的MG53(GFP-MG53融合蛋白)，可以剂量依赖性地提高细胞内GFP-MG53的表达水平，同时高表达的GFP-MG53能够对心肌细胞的缺氧损伤产生保护作用；此外，利用RNA干扰技术特异性地降低MG53蛋白水平，可以抑制GFP-MG53过表达产生的保护作用。这些结果都说明MG53蛋白水平与心肌细胞的生存率成正比。

本发明还有一个实施方案是利用MG53基因敲除的小鼠来进一步研究MG53对于心脏IPC的作用。该实施方案中所用的MG53基因敲除小鼠的心脏没有MG53的表达¹⁰，所用的8周的小鼠心脏，无论是在形态学还是功能学方面，都和正常小鼠没有明显的差别。研究结果表明，体外灌流的正常小鼠心脏中，IPC能够减小IR引起的心脏损伤标志物LDH的释放和心肌梗死的面积；但是在MG53敲除的小鼠中，不但IR引起的损伤更加严重，而且IPC的这种保护作用也消失。已知MG53蛋白能够帮助修复骨骼肌细胞的膜损伤¹⁰，但是在我们的研究中发现，IPC在正常小鼠心脏中减少了心肌细胞的凋亡，但在MG53敲除的小鼠中这种保护作用消失了，说明MG53蛋白还参与了IPC的抗凋亡保护作用。此外，过表达的MG53蛋白可以抑制缺氧引起的细胞凋亡，一种没有膜损伤的细胞死亡，这就说明除了膜修复外，肯定还有其他机制参与MG53的心脏保护作用。

本发明中，研究上述MG53保护心脏缺血/再灌损伤机制的一个实施方案是研究MG53与两种重要的细胞生存分子Akt和其下游因子GSK3β之间的相互关系。在体外培养的心肌细胞中利用腺病毒载体过表达GFP-MG53，其结果表明，GFP-MG53的过表达可以增加Akt和其下游因子GSK3β的活化；同时发现在正常的小鼠心脏中，IPC能够增加Akt和GSK3β的活性；而在MG53基因敲除的小鼠心脏中，Akt和GSK3β的活性比正常小鼠要低，而且IPC也不能引起这两个分子的活化。

上述MG53活化Akt和GSK3β的机制可通过本发明的另一个实施方案来阐明。现有的研究结果表明，细胞内一种重要的“脚手架”分子CaV3能够把很多分子聚集到其周围，介导其相互作用^9，13，特别是能够和Akt/GSK3β的上游分子PI3K的调节亚单位p85相互作用，从而活化整个信号通路¹³，本实施方案表明，MG53也能够和CaV3相互作用；而在MG53基因敲除的小鼠的心脏中，CaV3却不能再和PI3K-p85相互作用。另一方面，利用RNA干扰技术降低CaV3的表达，不但可以抑制MG53的保护作用，而且可以抑制MG53过表达引起的Akt/GSK3β的活化。利用免疫组织化学技术，也发现CaV3主要分布在正常心肌细胞膜周围，少量的PI3K-p85在细胞膜周围和CaV3共定位，而IPC可以促使更多的PI3K-p85到细胞膜周围和CaV3共定位进而增加PI3K的活性；然而，在MG53基因敲除的小鼠心脏中，无论有无IPC，PI3K-p85都不能和CaV3在膜周围共定位，同时PI3K的活性也比正常小鼠的心脏中低。通过western blot方法测得：正常小鼠心脏中的PI3K-p85和CaV3蛋白水平与MG53基因敲除小鼠心脏中的PI3K-p85和CaV3蛋白水平没有差异，在此前题下，本实施方案的上述实验结果清楚地显示了CaV3通过MG53蛋白的介导而使Akt/GSK3β活化的机制，也充分说明了MG53蛋在保护心脏免受缺血/再灌损伤的过程中所起的重要作用。

以上所述证明了在心肌中表达的MG53蛋白具有一种新的功能，即MG53蛋白参与了IPC的过程，从而对心脏缺血/再灌损伤产生保护作用，该功能为制备一种心脏的保护药物提供了新的支持证据，MG53蛋白在进行某些改造使其能够进到细胞内以后，就能够保护缺血/再灌等因素造成的心脏损伤，从而成为一个药物设计的潜在靶点。作为目前最强大而有效的心肌缺血/再灌损伤的保护手段，缺血预适应具有非常广阔的临床应用前景，而本发明大大加深了人们对于缺血预适应的机制的认识，尤其是MG53蛋白不仅本身具有参与缺血预适应过程的功能，而且是联系其他IPC分子通路使其相互作用所必需的中间分子，从而为临床上更好的应用缺血预适应现象提供了可能。

因此，本发明的一个方面涉及MG53蛋白在制备用于预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤所致疾病的药物中的用途。其中所说的疾病包括心力衰竭和心律失常、心脏破裂等并发症。

本发明另一方面涉及用于预防和/或治疗心脏缺血损伤的药物，它包括作为活性成分的经修饰的MG53蛋白以及药用的赋型剂或载体。

作为一种预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤的药物，MG53蛋白可以从两个方面应用于临床。一个方面是通过对MG53蛋白添加某些能够使其进入细胞的标签(如TAT)，或者构建能够过表达MG53蛋白的载体(如缺陷型腺病毒或反转录病毒)，然后利用常规的药物制备方法，采用药用的赋型剂或载体将其制成针剂，而后注射到心脏局部或冠状动脉中，可以提高心肌细胞内MG53的水平，激活其下游的生存信号，对心脏缺血产生保护作用。另一个方面是根据本发明所证实的MG53蛋白所具有的新功能，对新型化合物进行筛选，选择能够诱导细胞内MG53表达的化合物作为药物，也可以起到保护心脏缺血的作用。

附图说明

图1大鼠心脏缺血/再灌(IR)和缺血预适应(IPC)结合IR的模型示意图(a)，以及大鼠心脏IR、IPC结合IR与其血液中LDH浓度(b)、心肌梗死面积(c)、MG53的mRNA(d)和蛋白水平(e)的关系；

图2体外培养的大鼠心肌细胞中缺氧与MG53蛋白表达(a)、心肌细胞死亡(b)的关系，以及GFP-MG53过表达(c)对心肌细胞的保护作用(d、e、f)；

图3正常小鼠与MG53基因敲除小鼠的心脏中MG53蛋白的表达(a)、心脏形态(b)、IR损伤以及IPC保护作用(c、d、e)的比较；

图4用western blot方法检测的在体外培养的大鼠心肌细胞中，GFP-MG53过表达对细胞内Akt(a)和GSK3β分子(b)的活化作用，以及在正常小鼠与MG53基因敲除小鼠的心脏中，IPC对Akt(c)和GSK3β分子(d)活化的影响；

图5体外培养的大鼠心肌细胞中，MG53蛋白与CaV3蛋白的免疫组织化学染色(a)和免疫共沉淀(b)结果；正常小鼠与MG53基因敲除小鼠的心脏中，PI3K-p85与CaV3的免疫共沉淀的结果(c)；体外培养的大鼠心肌细胞中，CaV3蛋白的水平与GFP-MG53过表达对心肌细胞的保护作用(d)，以及与GFP-MG53过表达引起的Akt和GSK3β的活化的关系(e)；正常小鼠与MG53基因敲除小鼠的心脏中，PI3K-p85与CaV3的免疫组织化学染色的结果(f)，以及IPC对该结果的影响(g)；

图6用western blot方法检测的正常小鼠和MG53基因敲除小鼠心脏中PI3K-p85(左图)和CaV3(右图)的蛋白水平。

具体实施方式

实施例1MG53蛋白对心脏缺血/再灌损伤的保护作用

目的：利用大鼠的心脏缺血/再灌(IR)和缺血预适应(IPC)结合IR的模型研究MG53蛋白表达的变化在该两个过程中的作用。

材料和方法：每个模型的实验选用两组各为8只一组的SD大鼠(200-250g)分别作为实验组和对照组。实验组的大鼠用戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉以后，正中开胸，结扎冠状动脉前降支45分钟后松开，制作心脏缺血/再灌模型。缺血预适应模型是在45分钟的冠状动脉结扎以前，进行5分钟的冠状动脉结扎和5分钟的冠状动脉再灌的短周期，共重复4次短周期。对照组(Sham)的大鼠除了不进行冠状动脉结扎以外，其余操作同实验组。血清中乳酸脱氢酶(LDH)的浓度利用Sigma公司的试剂盒进行测量，心脏梗死面积的测量是利用Alcian染料结合TTC染色进行测量，MG53的mRNA和蛋白的含量分别采用实时定量PCR和免疫印迹进行测量。

结果和讨论：图1的a是大鼠心脏缺血/再灌(IR)和缺血预适应(IPC)结合IR的模型示意图。图1的b、c、d、e中，IR代表心脏缺血/再灌模型，IPC+IR代表缺血预适应(IPC)结合IR的模型，β-tubulin(β-微管蛋白)代表内参照物，图中所示的结果是由每组8只动物所得的平均数据。由图的b、c可以看出大鼠缺血/再灌可以引起血清内心肌损伤的标志物乳酸脱氢酶(LDH)浓度和心脏的梗死面积增加，通过缺血预适应可以抑制血清乳酸脱氢酶浓度的增加和减少心脏的梗死面积；而图1的d和e分别从mRNA和蛋白水平表明在缺血/再灌损伤的心肌组织中，MG53的表达和含量下降，而受到缺血预适应保护的缺血/再灌损伤的心肌组织中，MG53的下降受到了阻止。以上实验结果证明了MG53的下降可能是导致缺血/再灌损伤的因素，并且证明了MG53参与了缺血预适应的保护作用。

实施例2MG53蛋白对心肌细胞的缺氧损伤的保护作用

目的：在细胞水平探讨MG53表达的增加与心肌细胞缺氧损伤的之间的关系。

材料和方法：选用SD大鼠的1天龄幼鼠，采取酶消化的方式由其心脏获得大鼠心肌细胞，然后利用能够过表达MG53的缺陷腺病毒感染该心肌细胞以提高MG53的水平；同时还利用RNA干扰技术来降低MG53蛋白的水平。细胞的死亡采取DNA梯度和细胞ATP含量的方法进行检测。

结果和讨论：图2b显示缺氧能够引起心肌细胞的死亡，而且随着缺氧时间的延长，死亡的心肌细胞逐渐增多；而细胞内MG53蛋白的水平同体内的实验相似，也随着缺氧时间的延长而逐渐降低(图2a)；图2c说明表达GFP-MG53融合蛋白的腺病毒能够提高体外培养的心肌细胞内的MG53的水平；通过图2的d和e，可以看出缺氧能够引起心肌细胞的死亡，而过表达MG53以后，能够减少缺氧引起的心肌细胞的死亡；利用RNA干扰技术降低MG53的水平(图2f右)以后，其保护作用就消失了(图2f左)。图2中：β-actin(β-肌动蛋白)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)为内参照物；Adv(Adenovirus)表示腺病毒，Adv-GFP、Adv-GFP-MG53分别代表GFP的复制缺陷型病毒表达系统和GFP-MG53的复制缺陷型病毒表达系统；“+”、“-”分别表示图的左侧所示条件的“存在”和“不存在”；Scramble-shRNA代表的是对照短RNA，是一种非特异性的短RNA，用来排除非特异性的短RNA干扰的效应。以上实验结果清楚地表明了MG53的过表达与缺氧引起的心肌细胞死亡之间的关系，从而说明MG53能够保护缺氧引起的心肌细胞的损伤。

实施例3MG53蛋白参与IPC的抗IR引起损伤和抗凋亡的保护作用

目的：选用MG53基因敲除小鼠的心脏缺血/再灌和缺血预适应模型，进一步证实MG53的作用。

材料和方法：通过基因敲除得到不含有MG53基因的小鼠，采用8-10周龄的MG53基因敲除的小鼠和与其同龄的正常小鼠进行实验。实验的方法是采用体外心脏灌流的方式进行，利用30分钟停灌而后复灌达到缺血的效果，缺血预适应是通过2个周期的5分钟停灌和5分钟再灌的循环实现的。心脏的损伤采用梗死面积的测量(方法同实施例1的大鼠)、细胞凋亡的检测(TUNEL染色)以及流出液中乳酸脱氢酶(LDH)的浓度进行评价。

结果和讨论：通过图3的a可以看出，利用基因敲除技术获得的MG53敲除小鼠的心脏中不含有MG53，同时表1和b图显示在正常情况下，MG53基因敲除小鼠和正常小鼠的心脏的功能和形态没有差别。图3的c、d和e图分别通过乳酸脱氢酶浓度、心肌梗死面积和心肌细胞凋亡(TUNEL染色法)的检测证明，在正常小鼠的心脏中，缺血/再灌能够引起心脏的损伤，而缺血预适应能够减少损伤。但是在MG53基因敲除的小鼠的心脏中，缺血/再灌能够造成比正常小鼠更严重的损伤，而且缺血预适应的保护作用也消失了。从而说明MG53是心脏对抗缺血/再灌损伤的重要分子，同时也是缺血预适应的保护作用中必需的分子。

表1左心室功能和形态指标

表1所得数据为8只基因敲除小鼠和8只正常小鼠所得数据的平均值

表1和图3中，wt代表正常小鼠；mg53-/-代表MG53基因敲除小鼠；GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)为内参照物。图3的a、b所示的结果为4只基因敲除小鼠和4只正常小鼠所得数据的平均值；c、d、e、f所示的结果为8只基因敲除小鼠和8只正常小鼠所的数据的平均值。

实施例4MG53蛋白保护心脏缺血/再灌损伤的机制

目的：研究MG53蛋白对心脏保护的分子机制。

材料和方法：本实施例中所用的心肌细胞同实施例2，用携带GFP-MG53基因的复制缺陷腺病毒载体转染体外培养的大鼠心肌细胞，使GFP-MG53过表达；MG53基因敲除小鼠和正常小鼠的心脏缺血/再灌和缺血预适应模型的制备如实施例3所述。然后用超声破碎组织的方法提取蛋白后，利用Western blot方法检测细胞中的相应分子。

结果和讨论：通过图4的a和b的Western blot分析结果，可以看出在体外培养的大鼠心肌细胞中，利用腺病毒过表达MG53蛋白，能够增加细胞内重要的生存分子Akt的磷酸化，提高其活性(a)，同时影响其下游分子GSK3β(b)，从而激活细胞内的促生存信号通路。在正常小鼠心脏中，同以前的研究一致，通过缺血预适应刺激以后，细胞内的生存通路(Akt/GSK3β)得到激活从而发挥缺血预适应的保护作用(图4c和d的左边)；但是在MG53基因敲除的小鼠心脏中，基础状态下的生存通路Akt/GSK3β的活性比正常小鼠低，同时缺血预适应也无法活化该生存通路(图4c和d的右边)。以上结果表明MG53的心脏的保护作用是通过激活细胞内重要的生存通路Akt/GSK3β起作用的，在没有MG53的心脏中，该生存通路的基础活性以及受到保护因素激活的能力都受到抑制。图4中，wt代表正常小鼠；mg53-/-代表MG53基因敲除小鼠；p-Akt⁴⁷³、p-GSK3β分别表示磷酸化的Akt⁴⁷³和磷酸化的GSK3β。图4的c 和d所示的结果分别为4只正常小鼠和4只MG53基因敲除小鼠所得实验数据的平均值；对照(con)分别为未经缺血预适应刺激的4只正常小鼠和4只MG53基因敲除小鼠所得实验数据的平均值。

实施例5MG53蛋白活化Akt和GSK3β的机制

目的：研究MG53是如何激活细胞内的生存通路Akt/GSK3β的。

材料和方法：分别利用体外培养的成年大鼠的心肌细胞以及小鼠的心脏组织蛋白通过免疫荧光和免疫共沉淀的方法检测分子间的相互作用。细胞生存率的检测和RNA干扰技术同实施例2，不同之处是使用的RNA干扰序列是针对CaV3分子的。分子共定位的实验是利用体外灌流的小鼠的心脏，经过或不经过缺血预适应刺激后，进行切片、免疫荧光染色后用激光共聚焦显微镜进行观察。小鼠心肌组织中PI3K激酶的活性用Etholon公司的试剂盒进行测量

结果和讨论：如图5的a所示，通过用免疫荧光分别对在由同一个大鼠分离的心肌细胞中的MG53蛋白和CaV3蛋白染色，结果发现，它们在细胞内的分布是基本重合的，即能够共定位。而利用免疫共沉淀的方法进一步证明，这两种分子在心脏组织中也能够形成复合物(图5b)。这就说明MG53和CaV3在心肌细胞内能够相互作用，而以前的研究已证明CaV3在心脏中能够使Akt/GSK3β的上游调节分子PI3K的调节亚单位p85亚单位在其周围聚集，增强其活性，因此我们推断MG53激活Akt/GSK3β的作用可能是通过其与CaV3相互作用实现的。图5c的上面两个图显示，在正常的小鼠的心脏中，与前面的研究一样，CaV3能够和PI3K的p85亚单位形成复合物(免疫共沉淀)；而有趣的是，在敲除了MG53的小鼠的心脏中，CaV3就不能够和PI3K的p85亚单位形成复合物(图5c下面两个图)，这就说明MG53不但是通过CaV3和PI3K-p85亚单位发挥其作用，而且MG53也是CaV3和PI3K-p85亚单位相互作用所必需的。

对于图5的d，当利用RNA干扰的方式减少细胞内的CaV3的含量时(右图)，我们发现MG53对于心肌细胞的保护作用也相应的消失了(左图)。不但如此，细胞内的CaV3的含量降低时，MG53对于Akt/GSK3β的活化作用也消失了(图5的e)，这就进一步证明CaV3是MG53激活细胞内的生存信号进而发挥其保护作用所必需的分子。

图5的f通过免疫组织化学技术制成，它显示在正常小鼠心脏中，PI3K-p85和CaV3在细胞的边缘形成共定位，而缺血预适应使这种共定位增加；而在MG53基因敲除小鼠的心脏中，无论有无缺血预适应，PI3K-p85和CaV3都无法形成共定位；图5的g是通过ELISA试剂盒检测的结果：在正常小鼠心脏中，缺血预适应引起PI3K的活性增加，而MG53基因敲除小鼠的心脏中，PI3K的活性比正常小鼠低，同时缺血预适应不能引起其增加。

图5中，裂解物(Lysate)为阳性对照；IP(Immunoprecipitation)、IB(Immunoblot) 分别表示免疫沉淀、免疫印迹；CaV3-shRNA代表针对CaV3的短RNA干扰序列；Adv-GFP、Adv-MG53分别表示GFP的复制缺陷型病毒表达系统和MG53的复制缺陷型病毒表达系统；p-Akt473、p-GSK3β分别表示磷酸化的Akt473和磷酸化的GSK3β；其余符号和缩写的含义同前所述。

至此，我们发现了MG53蛋白是在传统的细胞生存通路CaV3/PI3K/Akt/GSK3β通路中的一个重要的调节分子，是这条通路发挥其保护作用所必需的。

实施例6正常小鼠与MG53基因敲除小鼠的心脏中几种信号分子的表达的比较

目的：研究MG53基因敲除小鼠的心脏中几种信号分子的表达情况。

材料和方法：采用正常小鼠与MG53基因敲除小鼠的心脏，分别用超声破碎组织的方法提取蛋白后，利用免疫印迹的方法检测相应分子。

结果和讨论：图6的a和b表明，与正常小鼠相比，MG53敲除后的小鼠心脏中PI3K的p85亚单位和CaV3分子的含量都没有改变，由此可说明MG53对其功能的影响是通过改变其相互作用而实现的。

MG53蛋白氨基酸序列表_ST25.txt

SEQUENCE LISTING

<110>北京大学

<120>MG53蛋白预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤的用途

<130>09SG1F0438

<160>1

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>477

<212>PRT

<213>human

<220>

<221>INIT-MET

<222>(1)..(1)

<400>1

Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu

1 5 10 15

Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser

20 25 30

Phe Cys Arg Ala Cys Leu Gly Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp

35 40 45

Gly Thr Val Leu Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala

50 55 60

Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln

65 70 75 80

Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr

85 90 95

Cys Glu Gln Asp Arg Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly

100 105 110

Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg

115 120 125

Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys

130 135 140

Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu

145 150 155 160

Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu

165 170 175

Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Cys

180 185 190

Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu

195 200 205

MG53蛋白氨基酸序列表_ST25.txt

Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys

210 215 220

Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys

225 230 235 240

Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu Ser Pro

245 250 255

Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile Ser Asp Asp Phe

260 265 270

Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu

275 280 285

Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val

290 295 300

Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro

305 310 315 320

Ala Gly Glu Asp Pro Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala

325 330 335

His Gln Gln Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Asp Val Gly

340 345 350

Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Ala Ala Glu Ala Pro Arg

355 360 365

Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly

370 375 380

Leu Arg Glu Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro

385 390 395 400

Arg Ala Leu Arg Ser Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Leu Tyr

405 410 415

Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala

420 425 430

Asp Ala Leu Val Pro Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Arg Pro

435 440 445

Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala

450 455 460

Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gly Ala Glu Ala

465 470 475

Claims

1.MG53蛋白在制备用于预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤所致疾病的药物中的用途，其中所述疾病为心律失常。

2.MG53蛋白在制备用于预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤所致疾病的药物中的用途，其中所述疾病为心脏破裂。