CN110325190A - 增加血管密度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及增加受试者组织中血管密度和/或血流量的方法，并且涉及提高受试者的运动能力，该方法包括向受试者施用有效量的提高受试者的内皮细胞中SIRT1活性的试剂，本发明进一步包括向受试者施用NAD+激动剂或NAD+前体以增加血管密度和/或血流量。本发明包括含有所述试剂的组合物。

Description

增加血管密度的方法
技术领域
本发明涉及增加受试者组织中血管密度和/或血流量、提高受试者运动能力的方法，还涉及用于增加受试者组织中血管密度和血流量、提高受试者运动能力的组合物。
本申请要求澳大利亚临时申请2016905310号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
随着年龄的增长，身体最深刻的变化之一是排列构成血管系统的内皮细胞(EC)的数量和功能下降。根据血管衰老理论(Le Couteur和Lakatta，2010)，血管密度的逐渐丧失是衰老和年龄相关疾病的主要原因之一，其表现形式多种多样，包括心脏感染、中风、运动耐受差(exercise intolerance)、勃起功能障碍、肝功能衰竭、骨质疏松、伤口愈合受损、肌肉减少、痴呆和虚弱(Askew等,2005；Costa和Virag,2009；Duscha等，1999；Kolluru等，2012；Lanza和Crea,2010；McCormick,1966；Prior等，2016)。大多数器官和组织的表现严重依赖于丰富的功能齐全的微毛细血管网络，其维持氧气供应，交换热量和各种营养素，并去除新陈代谢的废物。
尽管血管密度损失对人类健康和长寿很重要，但令人惊讶的是人们对其根本原因了解甚少。运动是目前通过促进组织中的新血管形成(neovascularization)来延缓衰老对微血管系统影响的最佳方式，但几乎没有人知道为什么随着年龄的增长组织对运动不再敏感(Bassel-Duby and Olson,2006；Booth and Thomason,1991；Hood,2001)。
骨骼肌是研究衰老对毛细血管维持和响应于运动的新血管形成的负面影响的理想组织。在年轻人中，肌肉性能严重依赖于丰富的功能齐全的微毛细血管网络，其维持氧气供应，交换热量和各种营养素，并去除新陈代谢的废物。由于尚未明晰的原因，随着年龄的增长，肌内皮细胞的衰老和凋亡总体上增加，导致血管损失以及响应于运动的肌肉新血管形成减少。结果是在生命后期数十年中肌肉质量减少(肌肉减少症)和力量和耐力的稳定下降，即使进行运动也是如此。因此，增加老年受试者的血管密度和/或血流量是有利的。
血管形成的增加对于寻求增加肌肉组织中血管密度和/或血流量以提高体能的任何年龄的受试者也是有益的，或者对于患有其中增加血管密度和/或血流量可能有益的病症的任何年龄的受试者也是有益的。
尽管它们具有潜在的实用性，但仅报道了少数运动模拟剂(例如白藜芦醇和PPARγ激动剂)，其中没有一种通过促进新血管形成或肌肉毛细血管密度而起作用。
所需要的是增加受试者组织中血管密度和/或血流量的方法。
发明内容
发明人已经发现在组织增加内皮细胞中Sirtuin 1(SIRT1)活性或表达(例如在骨骼肌中)会导致该组织中血管密度的增加。本发明人进一步发现，内皮细胞SIRT1活性或表达增加的受试者具有提高的运动能力。
因此，本发明的第一方面提供了增加受试者组织中的血管密度和/或血流量的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者的内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
另一第一方面提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，其用于增加受试者组织中的血管密度和/或血流量，或者提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂在制备用于增加受试者组织中血管密度和/或血流量的药物中的用途。
第二方面提供了提高受试者运动能力的方法，该方法包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
另一第二方面提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，其用于提高受试者运动能力，或者提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂在制备用于提高受试者运动能力的药物中的用途。
本发明的第三方面提供了增加受试者组织中血管密度和/或血流量的方法，该方法包括向受试者施用有效量的NAD+激动剂。
另一第三方面提供了用于增加受试者组织中血管密度和/或血流量NAD+激动剂，或者提供了NAD+激动剂在制备用于增加受试者组织中血管密度和/或血流量的药物中的用途。
本发明的第四方面提供了提高受试者运动能力的方法，该方法包括向受试者施用有效量的NAD+激动剂。
另一第四方面提供了用于提高受试者运动能力的NAD+激动剂，或者提供了NAD+激动剂在制备用于提高受试者运动能力的药物中的用途。
本发明的第五方面提供了增加受试者组织中血管密度和/或血流量的方法，该方法包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
另一第五方面提供了用于增加受试者组织中血管密度和/或血流量的NAD+前体，或者提供了NAD+前体在制备用于增加受试者组织中血管密度和/或血流量的药物中的用途。
本发明的第六方面提供了提高受试者运动能力的方法，该方法包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
另一第六方面提供了用于提高受试者运动能力的NAD+前体，或者提供了NAD+前体在制备用于提高受试者运动能力的药物中的用途。
第七方面提供了增加受试者组织中血管生成和/或新血管形成的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
另一第七方面提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，其用于增加受试者组织中血管生成和/或新血管形成，或者提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂在制备用于增加受试者组织中血管生成和/或新血管形成的药物中的用途。
本发明的第八方面提供了增加受试者组织中血管生成和/或新血管形成的方法，该方法包括向受试者施用有效量的NAD+激动剂。
另一第八方面提供了用于增加受试者组织中血管生成和/或新血管形成的NAD+激动剂，或者提供了NAD+激动剂在制备用于增加受试者组织中血管生成和/或新血管形成的药物中的用途。
本发明的第九方面提供了增加受试者组织中血管生成和/或新血管形成的方法，该方法包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
另一第九方面提供了用于增加受试者组织中血管生成和/或新血管形成的NAD+前体，或者提供了NAD+前体在制备用于增加受试者组织中血管生成和/或新血管形成的药物中的用途。
第十方面提供了增加受试者组织中血管密度和/或血流量的方法，其包括：
(a)使受试者在运动训练期间接受运动训练；和
(b)在运动训练期之前和/或期间向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
另一第十方面提供了提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，其用于增加受试者组织中血管密度和/或血流量，其中：(a)受试者在运动训练期间接受运动训练；和(b)在运动训练期之前和/或期间施用所述试剂；或者提供了提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂在制备用于增加受试者组织中血管密度和/或血流量的药物中的用途，其中：(a)受试者在运动训练期间接受运动训练；和(b)在运动训练期之前和/或期间施用所述试剂。
第十一方面提供了增加受试者组织中血管密度和/或血流量的方法，包括：(a)使受试者在运动训练期间接受运动训练；(b)在运动训练期之前和/或期间向受试者施用有效量的NAD+激动剂。
另一第十一方面提供了NAD+激动剂，其用于增加受试者组织中血管密度和/或血流量，其中：(a)受试者在运动训练期间接受运动训练；(b)在运动训练期之前和/或期间施用NAD+激动剂；或者提供了NAD+激动剂在制备用于增加受试者组织中血管密度和/或血流量的药物中的用途，其中：(a)受试者在运动训练期间接受运动训练；和(b)在运动训练期之前和/或期间施用NAD+激动剂。
第十二方面提供了增加受试者运动能力的方法，包括：(a)使受试者在运动训练期间接受运动训练；(b)在运动训练期之前和/或期间向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
另一第十二方面提供了提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，其用于增加受试者运动能力，其中：(a)受试者在运动训练期间接受运动训练；(b)在运动训练期之前和/或期间施用该试剂；或者提供了提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂在制备用于增加受试者运动能力的药物中的用途，其中：(a)受试者在运动训练期间接受运动训练；和(b)在运动训练期之前和/或期间施用该试剂。
第十三方面提供了增加受试者运动能力的方法，包括：(a)使受试者在运动训练期间接受运动训练；(b)在运动训练期之前和/或期间向受试者施用有效量的NAD+试剂。
另一第十三方面提供了用于增加受试者运动能力的NAD+试剂，其中：(a)受试者在运动训练期间接受运动训练；(b)在运动训练之前和/或期间施用该试剂；或者提供了NAD+试剂在制备用于增加受试者运动能力的药物中的用途，其中：(a)受试者在运动训练期间接受运动训练；和(b)在运动训练期之前和/或期间施用该试剂。
第十四方面提供了增加受试者组织中血管密度和/或血流量的方法，包括：(a)使受试者在运动训练期间接受运动训练；(b)在运动训练期之前和/或期间向受试者施用有效量的NAD+前体。
另一第十四方面提供了NAD+前体，其用于增加受试者组织中血管密度和/或血流量，其中：(a)受试者在运动训练期间接受运动训练；(b)在运动训练期之前和/或期间施用NAD+前体；或者提供了NAD+前体在制备用于增加受试者组织中血管密度和/或血流量的药物中的用途，其中：(a)受试者在运动训练期间接受运动训练；和(b)在运动训练之前和/或期间施用NAD+前体。
第十五方面提供了增加受试者运动能力的方法，包括：(a)使受试者在运动训练期间接受运动训练；(b)在运动训练期之前和/或期间向受试者施用有效量的NAD+前体。
另一第十五方面提供了用于增加受试者运动能力的NAD+前体，其中：(a)受试者在运动训练期间接受运动训练；(b)在运动训练期之前和/或期间施用NAD+前体；或者提供了NAD+前体在制备用于增加受试者运动能力的药物中的用途，其中：(a)受试者在运动训练期间接受运动训练；和(b)在运动训练之前和/或期间施用NAD+前体。
第十六方面提供了治疗或预防受试者血管疾病的方法，包括：(a)使受试者在运动训练期间接受运动训练；(b)在运动训练期之前和/或期间向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
另一第十六方面提供了提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，其用于治疗或预防受试者血管疾病，其中：(a)受试者在运动训练期间接受运动训练；(b)在运动训练期之前和/或期间施用该试剂；或者提供了提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂在制备用于治疗或预防受试者血管疾病的药物中的用途，其中：(a)受试者在运动训练期间接受运动训练；和(b)在运动训练期之前和/或期间施用该试剂。
第十七方面提供了治疗或预防受试者血管疾病的方法，包括：(a)使受试者在运动训练期间接受运动训练；(b)在运动训练期之前和/或期间向受试者施用有效量的NAD+激动剂。
另一第十七方面提供了用于治疗或预防受试者血管疾病的NAD+激动剂，其中：(a)受试者在运动训练期间接受运动训练；(b)在运动训练期之前和/或期间施用NAD+激动剂；或者提供了NAD+激动剂在制备用于治疗或预防受试者血管疾病的药物中的用途，其中：(a)受试者在运动训练期间接受运动训练；和(b)在运动训练期之前和/或期间施用NAD+激动剂。
第十八方面提供了治疗或预防受试者血管疾病的方法，包括：(a)使受试者在运动训练期间接受运动训练；(b)在运动训练期之前和/或期间向受试者施用有效量的NAD+前体。
另一第十八方面提供了用于治疗或预防受试者血管疾病的NAD+前体，其中：(a)受试者在运动训练期间接受运动训练；(b)在运动训练期之前和/或期间施用NAD+激动剂；或者提供了NAD+前体在制备用于治疗或预防受试者血管疾病的药物中的用途，其中：(a)受试者在运动训练期间接受运动训练；和(b)在运动训练期之前和/或期间施用NAD+激动剂。
第十九方面提供了用于增加受试者血管密度和/或血流量和/或提高受试者运动能力的组合物，其包含NAD+激动剂和任选的H2S前体。
第二十方面提供了用于增加受试者血管密度和/或血流量和/或提高受试者运动能力的组合物，其包含NAD+前体和任选的H2S前体。
第二十一方面提供了治疗或预防受试者中的疾病或病症的方法，所述疾病或病症选自由以下组成的组：冠状动脉和/或外周动脉疾病；缺血；溃疡；肺部疾病；肺动脉高压；虚弱；少肌症；神经退行性疾病，如血管性痴呆；中风；出血；骨质疏松症；心脏病；和血管疾病，该方法包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
另一第二十一方面包括提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，其用于治疗或预防选自由以下组成的组的疾病或病症：冠状动脉和/或外周动脉疾病；缺血；溃疡；肺部疾病；肺动脉高压；虚弱；少肌症；神经退行性疾病，如血管性痴呆；中风；出血；骨质疏松症；心脏病；和血管疾病；或者包括提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂在制备用于治疗或预防选自由以下组成的组的疾病或病症的药物中的用途：冠状动脉和/或外周动脉疾病；缺血；溃疡；肺部疾病；肺动脉高压；虚弱；少肌症；神经退行性疾病，如血管性痴呆；中风；出血；骨质疏松症；心脏病；和血管疾病。
第二十二方面提供了在受试者中治疗或预防选自由以下组成的组的疾病或病症的方法：冠状动脉和/或外周动脉疾病；缺血；溃疡；肺部疾病；肺动脉高压；虚弱；少肌症；神经退行性疾病，如血管性痴呆；中风；出血；骨质疏松症；心脏病；和血管疾病，该方法包括向受试者施用有效量的NAD+激动剂。
另一第二十二方面提供了NAD+激动剂，其用于治疗或预防选自由以下组成的组的疾病或病症：冠状动脉和/或外周动脉疾病；缺血；溃疡；肺部疾病；肺动脉高压；虚弱；少肌症；神经退行性疾病，如血管性痴呆；中风；出血；骨质疏松症；心脏病；和血管疾病；或者提供了NAD+激动剂在制备用于治疗或预防选自由以下组成的组的疾病或病症的药物中的用途：冠状动脉和/或外周动脉疾病；缺血；溃疡；肺部疾病；肺动脉高压；虚弱；少肌症；神经退行性疾病，如血管性痴呆；中风；出血；骨质疏松症；心脏病；和血管疾病。
第二十三方面提供了在受试者中治疗或预防选自由以下组成的组的疾病或病症的方法：冠状动脉和/或外周动脉疾病；缺血；溃疡；肺部疾病；肺动脉高压；虚弱；少肌症；神经退行性疾病，如血管性痴呆；中风；出血；骨质疏松症；心脏病；和血管疾病，该方法包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
另一第二十三方面提供了NAD+前体，其用于治疗或预防选自由以下组成的组的疾病或病症：冠状动脉和/或外周动脉疾病；缺血；溃疡；肺部疾病；肺动脉高压；虚弱；少肌症；神经退行性疾病，如血管性痴呆；中风；出血；骨质疏松症；心脏病；和血管疾病；或者提供了NAD+前体在制备用于治疗或预防选自由以下组成的组的疾病或病症的药物中的用途：冠状动脉和/或外周动脉疾病；缺血；溃疡；肺部疾病；肺动脉高压；虚弱；少肌症；神经退行性疾病，如血管性痴呆；中风；出血；骨质疏松症；心脏病；和血管疾病。
第二十四方面提供了增加行动不便的受试者组织中血管密度和/或血流量的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
另一第二十四方面提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，其用于增加行动不便的受试者组织中血管密度和/或血流量，或者提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂在制备用于增加行动不便的受试者组织中血管密度和/或血流量的药物中的用途。
第二十五方面提供了提高行动不便的受试者的运动能力的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
另一第二十五方面提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，其用于提高行动不便的受试者的运动能力，或者提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂在制备用于提高行动不便的受试者的运动能力的药物中的用途。
第二十六方面提供了增强受试者肝窦内皮细胞功能的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者肝脏内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
另一第二十六方面提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，其用于增强受试者肝窦内皮细胞功能，或者提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂在制备用于增强受试者肝窦内皮细胞功能的药物中的用途。
第二十七方面提供了增强受试者(例如竞赛动物)体能(physical performance)的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
另一第二十七方面提供了提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，其用于增强受试者体能，或者提供了提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂在制备用于增强受试者体能的药物中的用途。
第二十八方面提供了提高受试者耐力的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
另一第二十八方面提供了提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，其用于提高受试者耐力，或者提供了提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂在制备用于提高受试者耐力的药物中的用途。
第二十九方面提供了增强受试者运动效果的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
另一第二十九方面提供了提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，其用于增强受试者运动效果，或者提供了提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂在制备用于增强受试者运动效果的药物的用途。
第三十方面提供了改善受试者在受伤或失去移动能力后的血管恢复的方法，包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
另一第三十方面提供了提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，其用于改善受试者在受伤或失去移动能力后的血管恢复，或者提供了提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂在制备用于改善受试者在受伤或失去移动能力后血管恢复的药物中的用途。
第三十二方面提供了增强受试者物理疗法益处的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
另一第三十二方面提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，其用于增强受试者物理疗法的益处，或者提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂在制备用于增强受试者的物理疗法的益处的药物中的用途。
第三十三方面提供了增强血液流向受试者眼睛的方法(例如改善视力)，包括向受试者施用有效量的增强受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
另一第三十三方面提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，用于增强血液流向受试者眼睛，或者提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂在制备用于增强血液流向受试者眼睛的药物中的用途。
第三十四方面提供了增强受试者皮肤外观的方法，包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
另一第三十四方面提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，用于增强受试者皮肤外观，或者提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂在制备用于增强受试者皮肤外观的药物中的用途。
第三十五方面提供了增加动物(例如被固定的动物或运动受限的动物)的肉产量的方法，其包括向动物施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
另一第三十五方面提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，其用于增加动物肉产量，或者提供了提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂在制备用于增加动物肉产量的药物中的用途。
第三十六方面提供了一种方法，其：
增加行动不便的受试者组织中血管密度；
增加行动不便的受试者的运动能力；
增强受试者肝窦内皮细胞功能；
提高受试者体能；
增强受试者运动效果；
改善受试者在受伤或失去移动能力后血管恢复；
增强受试者物理疗法益处；
提高受试者耐力；
增强增强血液流向受试者眼睛；
增强受试者皮肤外观；或
提高动物肉产量；
该方法包括向受试者施用有效量的NAD+激动剂。
另一第三十六方面提供了NAD+激动剂，其用于：
增加行动不便的受试者组织中血管密度；
增加行动不便的受试者的运动能力；
增强受试者肝窦内皮细胞功能；
提高受试者体能；
增强受试者运动效果；
改善受试者在受伤或失去移动能力后血管恢复；
增强受试者物理疗法益处；
提高受试者耐力；
增强增强血液流向受试者眼睛；
增强受试者皮肤外观；或
提高动物肉产量；
或者提供了NAD+激动剂在制备药物中的用途，该药物用于：
增加行动不便的受试者组织中血管密度；
增加行动不便的受试者的运动能力；
增强受试者肝窦内皮细胞功能；
提高受试者体能；
增强受试者运动效果；
改善受试者在受伤或失去移动能力后血管恢复；
增强受试者物理疗法益处；
提高受试者耐力；
增强增强血液流向受试者眼睛；
增强受试者皮肤外观；或
提高动物肉产量。
第三十七方面提供了运动模拟物，其包含NAD+激动剂和任选的H2S前体。
第三十八方面提供了用于增加受试者组织中血管密度和/或血流量和/或用于提高受试者运动能力的试剂盒，其包括提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
第三十九方面提供了用于增加受试者组织中血管密度和/或血流量和/或用于增加受试者运动能力的试剂盒，其包括NAD+激动剂。
第四十方面提供了用于增加受试者组织中的血管密度和/或血流量和/或用于增加受试者运动能力的试剂盒，其包括NAD+前体。
第四十一方面提供了用于增加受试者组织中血管密度和/或血流量，和/或增加受试者运动能力的组合物，其包括提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，以及任选的H2S前体。
第四十二方面提供了运动模拟物，其包括提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，以及任选的H2S前体。
简要附图说明
图1显示了(A)在6和20月龄C57BL/6J野生型小鼠的骨骼肌的胶原酶/分散酶消化后，并通过使用APC缀合的CD31抗体的流式细胞术检测内皮细胞(EC)得到的骨髓肌中CD31+内皮细胞的代表性散点图；(B)显示骨骼肌中CD31阳性EC百分比的图(n＝7)。数据表示为平均值±SEM。通过Student’s t检验，*p<0.05。
图2是显示在低强度和高强度跑步机测试(n＝11)中6月龄和20月龄小鼠的(A)奔跑至力竭时的时间和(B)奔跑至力竭时的距离的图。在跑步机上训练小鼠，并在两个不同的跑步机测试中测量它们的运动能力。数据表示为平均值±SEM。通过Student’s t检验，***p<0.0005，δp<0.00005。
图3(A)是用CD31和层粘连蛋白(嵌入图)抗体免疫染色以分别显示毛细血管和基质的6和20月龄小鼠的腓肠肌横切面的代表性图像(放大20倍)(白色条＝200μm)；(B)是腓肠肌中每高倍视野(HPF)中的毛细血管数和每肌纤维数中的毛细血管数比率(毛细血管密度)(n＝7)的图。(C)是用CD31和层粘连蛋白(嵌入图)抗体免疫染色以分别显示毛细血管和基质的6月龄和20月龄小鼠的四头肌切片(放大20倍)的代表性图像；(D)是股四头肌中每高倍视野(HPF)中的毛细血管数量和每肌纤维数量中的毛细血管数比率(毛细血管密度)(n＝5)的图。数据表示为平均值±SEM。通过Student's t检验，*p<0.05，**p<0.005。
图4是(A)显示在transwell迁移测定后每HPF中用+/-C2C12CM处理的迁移的EC数量(n＝10)的图，其中将从6月龄和20月龄小鼠中分离的原代小鼠肺内皮细胞(MLEC)饥饿过夜，然后接种(2.5×104个细胞)到具有8μm孔径的BD FluoroBlok transwell上，并从C2C12肌管收集条件培养基(CM)用加入至底部小室的表达PGC-1α转基因的腺病毒转导，加入到底室。24小时后，固定迁移的细胞，用DAPI染色，然后拍照(10倍放大)并计数；(B)来自管形成测定的管网相差显微照片(10倍放大)的代表性图像，其中将来自6月龄和20月龄小鼠的MLEC接种(5×104个细胞)到生长因子耗尽的基质胶基质上并用C2C12CM覆盖18小时(白色条＝400μm)；(C)是显示来自(B)中管形成测定的每视野中(n＝8)的管分支点数量+/-C2C12CM的数量定量的图；和(D)是显示在(B)中提到的管形成测定中由用+/-C2C12CM(n＝8)处理的6和20月龄小鼠的MLEC形成的毛细血管网络的总管长度的定量的图。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的双元素方差分析，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
图5是(A)EC球状体的代表性相差显微照片(10倍放大)，和(B)在球状体测定中定量球状体+/-C2C12CM(n＝10)的芽长度，其中将来自6和20月龄小鼠的MLEC的EC球状体(1000个细胞/球状体)包埋在I型胶原基质中，并用C2C12CM处理24小时。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的双元素方差分析，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
图6是(A)产生内皮细胞特异性GFP报道小鼠(Tie2Cre；Gfp)的策略的示意图。mTSTOPflox/flox,Gfp小鼠表达膜靶向串联二聚体TOMATO(mT)，当与Tie2Cre小鼠(Tie2Cre；Gfp)杂交时表达绿色荧光蛋白(GFP)，以及(B)来自表现出mT和GFP表达的mT-STOPflox/flox,Gfp和Tie2Cre；Gfp小鼠的腓肠肌横切面的代表性图像(20倍放大)。Tie2启动子介导的Cre蛋白导致肌肉毛细血管中的GFP表达。被细胞外基质包围的肌纤维的边界用白色框突出显示。白色箭头指示表达GFP的肌肉毛细血管。白色条＝100μm。
图7是(A)来自mT-STOPf/f-GFP和Tie2-Cre-GFP小鼠的腓肠肌横截面(40倍放大)的代表性图像，用GFP和CD31抗体免疫染色，显示出Tie2启动子介导的Cre蛋白导致GFP在肌肉毛细血管中特异性表达(CD31阳性)，并且TOMATO蛋白在肌纤维和周围基质中表达(白色条＝100μm)；和(B)来自mT-STOPf/f-GFP(白色条＝100μm)和Tie2-Cre-GFP小鼠(白色条＝150μm)的股四头肌肌肉横截面(40倍放大)的代表性图像，使用GFP和CD31抗体免疫染色。
图8是(A)来自mT-STOPf/f-GFP和Tie2-Cre-GFP小鼠的心脏切片(40倍放大)的代表性图像，使用GFP和CD31抗体进行免疫染色；和(B)来自mT-STOPf/f-GFP和Tie2-Cre-GFP小鼠的肺切片(40倍放大)的代表性图像，使用GFP和CD31抗体进行免疫染色(白色条＝200μm)。
图9是(A)显示通过杂交在EC特异性Tie2启动子(Tie2-Cre)的指导下表达Cre蛋白的转基因小鼠和含有位于SIRT1外显子4(催化结构域)侧翼的loxP位点的小鼠(SIRT1f/f或WT)从而来产生EC特异性SIRT1敲除小鼠(ESKO)的策略的示意图；(B)从野生型(WT)和内皮特异性SIRT1敲除(ESKO)小鼠的骨骼肌分离的EC中的SIRT1和eNOS的蛋白印迹图像。ESKO中EC特异性SIRT1外显子4切除导致SIRT1条带(Δexon4)略低于野生型(wt)SIRT1条带(白色条＝20μm)；(C)来自WT和ESKO小鼠的肺和四头肌组织蛋白匀浆中SIRT1的蛋白印迹图像，显示出SIRT1蛋白水平的总体降低；(D)显示来自用于(C)所示蛋白印迹的WT和ESKO小鼠(n＝3)的股四头肌中SIRT1水平的相对定量的图，通过Student's t检验，*p<0.05；和(E)是来自WT和ESKO小鼠的胸腺组织蛋白匀浆中SIRT1的蛋白印迹图像，其中外显子4切除的SIRT1条带(Δexon4)略低于野生型(wt)SIRT1条带。微管蛋白用作加样对照。
图10是(A)用CD31和层粘连蛋白(嵌入图)抗体免疫染色以分别显示毛细血管和基质的来自6月龄WT和ESKO小鼠的四头肌肌肉横截面(20倍放大)的毛细血管(CD31)和肌肉基质(层粘连蛋白，嵌入图)的代表性图像(20倍放大)(白色条＝200μm)；(B)显示股四头肌肌肉横截面中每HPF中的毛细血管数、每HPF中的毛细血管数/肌纤维数(n＝8)的图。(C)用CD31和层粘连蛋白(嵌入图)抗体免疫染色的来自6月龄WT和ESKO小鼠的腓肠肌横截面(20倍放大)的毛细血管(CD31)和肌肉基质(层粘连蛋白，嵌入图)的代表性图像(白色条＝200μm)；和(D)显示6月龄WT和ESKO小鼠的腓肠肌横截面中每HPF中的毛细血管数，每HPF中的毛细血管数/肌纤维数(n＝8)的图。数据表示为平均值±标准偏差(s.dev.)。通过Student'st检验，*p<0.05，**p<0.005。
图11是(A)显示6月龄WT和ESKO小鼠的体重、空腹血糖水平、尿肌酐水平和显示延迟跌落时间的转棒仪表现(rotarod performance)的图，(n＝7)；(B)显示6月龄WT和ESKO小鼠(n＝7)中的腓肠肌(Gastroc)、股四头肌(Quad)和心脏组织/体重比的图；和(C)是来自6月龄WT和ESKO小鼠的股四头肌的代表性H&E染色(10倍放大)图像。
图12是(A)显示6月龄WT和ESKO小鼠在高强度跑步机运动试验(n＝8)中奔跑至力竭时的时间和奔跑至力竭时的距离的图，其中小鼠在跑步机上以15m/min(5°斜度)奔跑20分钟；和(B)显示在高强度跑步机运动试验后6月龄WT和ESKO小鼠的运动后血清乳酸水平的图。通过尾部采血测量血乳酸水平(n＝5)。数据表示为平均值±标准偏差。通过Student'st检验，**p<0.005。
图13是(A)显示来自6月龄WT和ESKO小鼠(n＝10)的腓肠肌中肌球蛋白重链I、IIA、IIB和IIX的相对mRNA水平的图；和(B)来自6月龄WT和ESKO小鼠的股四头肌组织匀浆中的线粒体蛋白复合物的蛋白印迹图像。14-3-3用作加样对照。
图14是(A)显示用Scr或SIRT1siRNA (n＝3)转导的HUVEC中相对SIRT1 mRNA水平的图；(B)用乱序(Scr)或SIRT1siRNA转导，并在有或没有VEGF(30ng/mL)的情况下进行管形成测定的人静脉内皮细胞(HUVEC)的代表性图像。显示了所得管网的代表性明场图像(20倍放大)；(C)显示每个视野中的管分支点和总管长度的定量的图(n＝12)。数据表示为平均值±标准偏差。通过Student's t检验，*p<0.05，**p<0.005。
图15是(A)PCR分析的结果，显示在SIRT1-iKO小鼠的尾部和主动脉中切除SIRT1和野生型对照小鼠。该小鼠表达SIRT1的外显子4(催化结构域)的floxed等位基因和普遍存在的CAG启动子驱动的Cre-esr1融合蛋白。用4-羟基三苯氧胺处理后，Cre蛋白被激活，导致外显子4的缺失。全长野生型SIRT1(顶部带)在野生型小鼠中很明显，而较小的带对应于外显子4的丢失；(B)嵌入胶原基质中的主动脉环中的微血管芽的代表性图像(4倍放大)。从全身SIRT1诱导型敲除(SIRT1-iKO)小鼠和同窝对照(野生型)小鼠制备主动脉环，然后用VEGF(30ng/mL)或空载剂处理7天。得到的芽用BS1凝集素-FITC染色(黑色条＝500μm)；(C)显示源自(B)中所提到的主动脉环(每个处理n＝15)的芽的数量和总面积的定量的图。数据表示为平均值±标准偏差。通过双尾Student’s t检验，*p<0.05，**p<0.005，#p<0.00005。
图16是(A)transwell迁移测定中迁移的MS1细胞数的图。用Scr或SIRT1 siRNA转染MS1细胞，然后使用10ng/mL VEGF或来自用Adeno-PGC-1α转导的C2C12细胞的条件培养基进行transwell迁移测定。然后定量每个HPF的迁移细胞数(n＝16)；(B)显示用Scr或SIRT1siRNA转导的HUVEC中相对VEGF mRNA水平的图(n＝3)；(C)显示从6月龄ESKO和WT对照小鼠(n＝5)收集的血清中VEGF蛋白水平的图。(D)蛋白印迹显示用Scr或SIRT1siRNA转染的MS1细胞中的SIRT1蛋白水平。肌动蛋白用作加样对照。数据表示为平均值±标准偏差。通过双尾Student’s t检验，*p<0.05，**p<0.005。
图17是(A)来自久坐(SIRT1-iKO+WT)(Sed.)、运动WT(WT-ex.)和SIRT1-iKO(SIRT1-iKO-ex)小鼠的四头肌肌肉横截面(20倍放大)中的毛细血管(CD31)和基质(层粘连蛋白，嵌入图)的代表性图像，显示SIRT1是运动诱导的骨骼肌血管重塑所必需的。全身SIRT1诱导敲除(SIRT1-iKO)和WT(对照)小鼠(5月龄)喂食他莫昔芬饮食(360mg/kg)5周，之后训练动物进行四周的跑步机运动训练(在5°斜度，以15米/分钟跑30分钟)(白色条＝200μm)。(B)显示在(A)中提到的小鼠股四头肌中每HPF的毛细血管数量和每HPF的毛细血管数/肌纤维数比率(n＝6)的定量图。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的单因素方差分析(one-way ANOVA)，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
图18是(A)显示来自4月龄WT、ESKO、MCK-PGC-1α；WT和MCK-PGC-1α；ESKO小鼠(n＝5)的股四头肌中VEGF的相对mRNA水平的图。将WT和ESKO小鼠与肌肉特异性PGC1-α过表达(MCK-PGC-1α)杂交；(B)蛋白印迹图像显示来自4月龄WT、ESKO、MCK-PGC-1α；WT和MCK-PGC-1α；ESKO小鼠的股四头肌中PGC-1α、NDUFB5(复合物I)、SDH8(复合物II)和ATP5a(复合物V)的蛋白质水平。GAPDH用作加载对照。(C)来自MCK-PGC-1α；WT和MCK-PGC-1α；ESKO小鼠(4月龄)的四头肌肌肉横截面(40倍放大)的细胞核(DAPI)和毛细血管(CD31)的代表性图像；(白色条＝100μm)；(D)显示(C)中提到的小鼠股四头肌中每HPF的毛细血管数，每HPF的毛细血管数/肌纤维数比率(n＝6)的图。数据表示为平均值±SEM。通过Student's t检验(D)或Bonferroni多重比较检验的双因素方差分析(two-way ANOVA)(A)，*p<0.05，δp<0.00005。
图19是(A)显示来自MCK-PGC-1α；WT和MCK-PGC-1α；MSKO小鼠(4月龄)(n＝6)的股四头肌肌肉横截面中每HPF的毛细血管数，每HPF的毛细血管数/肌纤维数比率的图。将MCK-PGC-1α小鼠与肌肉特异性SIRT1KO(MSKO)小鼠杂交，用CD31和层粘连蛋白抗体免疫染色后评估同窝小鼠的肌肉毛细血管(40倍放大)；(B)显示在高强度跑步机运动试验中MCK-PGC-1α；WT和MCK-PGC-1α；ESKO小鼠(4月龄)奔跑至力竭时的时间和奔跑至力竭时的距离的图(n＝7)。(C)显示在高强度跑步机运动试验中MCK-PGC-1α；WT和MCK-PGC-1α；ESKO小鼠(4月龄)奔跑至力竭时的时间和奔跑至力竭时的距离的图(n＝7)。数据表示为平均值±SEM。通过Student's t检验，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
图20是(A)显示在Transwell迁移测定中每视野中从WT和ESKO小鼠+/-C2C12CM分离的迁移MLEC数量的图(n＝12)。(B)由WT和ESKO MLEC在基质胶基质上形成的管网(10倍放大)的代表性相差显微照片(白色条＝200μm)；(C)显示来自(B)中提到的管形成测定的每视野中管分支点和管长度+/-C2C12CM的定量的图(n＝5)；(D)在球状体测定(spheroidassay)中用C2C12CM处理的来自WT和ESKO MLEC的球状体的代表性相差显微照片(10倍放大)(n＝8)；和(E)显示在(D)中提到的球状体测定中用C2C12CM处理的WT和ESKO MLEC的球状体的芽长度的定量的图(n＝8)。数据表示为平均值±SEM。通过Student's t检验(E)或Bonferroni多重比较检验的双因素方差分析(A和C)，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
图21是(A)来自WT和SIRT1-iKO小鼠(n＝10)的主动脉环(4倍放大)中微血管芽的代表性图像，其中主动脉环由他莫昔芬处理并饥饿过夜的SIRT1-iKO和WT对照小鼠制备，然后包埋在I型胶原基质中，并用VEGF(50ng/mL)或FGF(50ng/mL)刺激7天。固定芽苗用FITC缀合的BS1凝集素染色。(黑色条＝500μm)(B)显示每个主动脉环的芽数量的定量，以及在(A)中制备的主动脉环中源自主动脉环(n＝10)的芽的总面积的图。(C)嵌入胶原基质中的(4倍放大)主动脉环中微血管芽的代表性图像，其中主动脉环由SIRT1-iKO和WT小鼠制备并用BSA或VEGF(30ng/mL)刺激7天。黑色条＝500μm)。(D)显示每个主动脉环的芽数量的定量，以及在(C)中制备的主动脉环中源自主动脉环(n＝15)的芽的总面积的图。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的单因素方差分析，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
图22是(A)使用表达乱序(Scr)或SIRT1(T1)shRNA的慢病毒感染的人主动脉EC(HAEC)的管形成测定得到的管网(10倍放大)的代表性相位对比显微照片，并在BSA(空载剂)、VEGF(25ng/mL)或FGF(25ng/mL)存在下评估基质胶基质上的管网。(白色条＝50μm)(B)显示在(A)中提到的管形成测定中形成的管中每视野中管分支点的数量和的总管长度的图(n＝8)。(C)显示使用表达慢病毒介导的Scr或T1 shRNA的HAEC，接种到transwell插入物上并用BSA、VEGF(50ng/mL)或FGF(50ng/mL)刺激24小时的Transwell迁移测定中每视野中的迁移EC数量的图(n＝8)。(D)显示用非靶向(NT)或SIRT1(T1)siRNA(n＝3)转导的HUVECS中的相对SIRT1和VEGF mRNA水平的图。(F)显示从6月龄WT和ESKO小鼠(n＝5)收集的血清中VEGF蛋白水平的定量的图。数据以平均值±SEM表示。通过Bonferroni多重比较检验的单因素方差分析(B)和(C)，或Student’s t检验(E)，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
图23是(A)显示通过将在EC特异性Tie2启动子指导下表达Cre蛋白的转基因小鼠与WT(SIRT1STOP)小鼠相杂交以产生EC特异性SIRT1过表达小鼠(ESTO)的策略的示意图。SIRT1STOP小鼠表达转基因，其中已将SIRT1克隆到组成型CAGGS启动子的下游，其后转录loxP-STOP-loxP盒。(B)来自内皮特异性SIRT1过表达(ESTO)和WT对照小鼠的四头肌、肺组织和胸腺组织蛋白质匀浆中的SIRT1蛋白的蛋白印迹图像显示SIRT1的过表达。微管蛋白作为加样对照。(C)股四头肌肌肉横切面(60倍放大)的代表性图像，显示SIRT1和CD31在肌肉毛细血管中的共表达。来自ESTO和WT小鼠的股四头肌肌肉横截面针对SIRT1和CD31抗体进行免疫染色，以显示SIRT1的EC特异性过表达。(白色条＝30μm)(D)显示6月龄WT和ESKO小鼠(n＝7)的体重、尿肌酐水平和显示延迟跌落时间的转棒仪表现的图。
图24是(A)显示在6月龄WT和ESTO小鼠(n＝7)中归一化至体重的腓肠肌(GA)、股四头肌(QA)和心脏(H)组织重量的定量的图。(B)来自6月龄WT和ESTO小鼠的股四头肌的代表性H&E染色图像。(C)显示来自6月龄WT和ESTO小鼠(n＝10)的腓肠肌中肌球蛋白重链I、IIA、IIB和IIX的相对mRNA水平的图。(D)来自6月龄WT和ESTO小鼠(14-3-3用作加样对照)的四头肌组织匀浆中的线粒体蛋白复合物II、IV和V的蛋白印迹图像，以及显示复合物II、IV和V的相对定量的图显示在右侧(n＝4)。(E)显示6月龄WT和ESTO小鼠(n＝7)的空腹血糖水平的定量的图。
图25是(A)来自6月龄WT和ESTO小鼠的股四头肌肌肉横截面(20倍放大)中的毛细血管(CD31)和基质(层粘连蛋白，嵌入图)的代表性图像(白色条＝200μm)(B)是显示WT和ESTO小鼠的股四头肌组织中每HPF的毛细血管数量和每HPF中毛细血管数/肌纤维数比率(n＝8)的定量的图。(C)来自6月龄WT和ESTO小鼠的腓肠肌横截面(20倍放大)的毛细血管(CD31)和肌肉基质(层粘连蛋白，嵌入图)的代表性图像(白色条＝100μm)。(D)显示在WT和ESTO小鼠的腓肠肌组织中每HPF中的毛细血管数量和每HPF中的毛细血管数/肌纤维数比率(n＝8)的定量图。数据以平均值±SEM表示。Student’s t t检验，*p<0.05，**p<0.005。
图26是(A)显示6月龄WT和ESTO小鼠在高强度跑步机运动试验(n＝8)中奔跑至力竭时的时间，和奔跑至力竭时的距离的图。(B)显示6月龄WT和ESTO小鼠(n＝5)运动后血液乳酸水平的图。数据以平均值±SEM表示。通过Student's t检验，*p<0.05，**p<0.005。
图27是(A)显示在Transwell迁移测定中每视野(n＝10)从WT和ESTO小鼠+/-C2C12CM分离的迁移MLEC的数目的图。(B)由WT和ESTO MLEC在基质胶基质+/-C2C12CM上形成的管网(10倍放大)的代表性相差显微照片(白色条＝50μm)(C)显示在(B)中提到的由WT和ESTO MLEC在基质胶基质+/-C2C12CM形成的管网中每视野(n＝8)中的管分支点数和总管长度的定量的图。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的双因素方差分析，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
图28是(A)来自用C2C12CM处理的WT和ESTO MLEC的球状体(10倍放大)的代表性相差显微照片。(B)显示用C2C12CM处理的WT和ESTO MLEC的芽长度的图(n＝8-9)。数据表示为平均值±SEM。通过Student's t检验，***p<0.0005。
图29是(A)蛋白印迹图像，显示用表达GFP或SIRT1(a.a.194-747)的腺病毒感染的HUVEC中的SIRT1的蛋白水平。在腺病毒SIRT1感染的细胞中，过表达的SIRT1略低于内源性SIRT1。14-3-3用作加样对照。(B)由用AdGFP或AdSIRT1感染的HUVEC形成并用BSA或VEGF(30ng/mL)处理的管网的相差显微照片(10倍放大)的代表性图像。(C)显示用表达GFP或SIRT1(AdSIRT1)的腺病毒(AdGFP)感染的人脐静脉EC(HUVEC)中的每视野中分支点数和总管长度的图，并针对管网+/-VEGF(30ng/mL)进行评估(n＝8-9)。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的双因素方差分析，*p<0.05。
图30是(A)由用VEGF(50ng/mL)刺激的Ad-GFP或Ad-SIRT1转导的HUVEC形成的球状体(10倍放大)的代表性相差显微照片。(B)显示来自(A)中提到的Ad-GFP或Ad-SIRT1+/-VEGF(50ng/mL)感染的HAEC的球状体的芽长的图(n＝8)。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的双因素方差分析，*p<0.05，δp<0.00005。
图31是(A)蛋白印迹图像，显示来自WT和全身过表达SIRT1转基因(SIRT1-Tg)小鼠的肺组织匀浆中的SIRT1蛋白水平。14-3-3用作加样对照。(B)在主动脉环测定中，在全身SIRT1转基因(SIRT1-Tg)和WT小鼠中制备并用BSA或VEGF(30ng/mL)处理的主动脉环(4倍放大)中微血管芽的代表性图像。对照条件是由于低因子刺激而几乎没有发芽的最小生长因子(2.5％FBS)(黑色条＝500μm)。(C)显示在(B)中提到的主动脉环测定中源自主动脉环(n＝15)的每环中的芽数和芽总面积的图。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的双因素方差分析，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。(D)显示从6月龄WT和ESTO小鼠(n＝5)收集的血清中VEGF蛋白水平的定量的图。数据表示为平均值±SEM。通过Student's t检验(D)和Bonferroni多重比较检验的双因素方差分析(C)，*p<0.05，**p<0.005。
图32是(A)在存在或不存在VEGF(30ng/mL)和NMN的情况下由人主动脉内皮细胞(HAEC)形成的管网的代表性明视场图像(10倍放大)。(B)显示在(A)中形成的管网的每视野中管分支点和总管长度的定量的图(n＝12)。(C)显示由用PBS或不同剂量的NMN(10μM、100μM或500μM)(相对于PBS，n＝3，*p<0.05，***p<0.0005和#p<0.00005)处理的HAEC形成的管网中的每视野中管分支点和总管长度的定量的图。(D)显示图4B将HUVEC与PBS或NMN(500μM)在完全生长培养基中温育48小时后的细胞数的图。使用流式细胞术测定细胞数。(E)显示在空载剂(PBS)或NMN(500μM)存在下HUVEC经受VEGF介导的transwell迁移测定后的结果的图。定量每高倍视野中的迁移细胞数(n＝12)。
图33是(A)显示在transwell迁移测定中每视野中(n＝12)从WT和ESKO小鼠+/-C2C12CM和+/-NMN(0.5mM)分离的迁移MLEC的数目的图。(B)显示用C2C12CM和+/-NMN(0.5mM)(n＝8)刺激的WT和ESKO的球状体的芽长的图。(C)显示来自用非靶向(NT)或SIRT1(T1)siRNA转导并用VEGF(50ng/mL)和+/-NMN(0.5mM)(n＝8)刺激的HAEC的球状体的芽长的图。(D)显示在使用用NT或T1siRNA转染并经受VGEF(30ng/mL)介导的管形成+/-NMN(0.5mM)的HAEC的管形成测定中，每视野中(n＝13)的分支点数和总管长度的图。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的双因素方差分析，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
图34是(A)是由WT和SIRT1-iKO小鼠制备并经VEGF(30ng/mL)+/-NMN(0.5mM)刺激7天的主动脉环(4倍放大)中微血管芽的代表性图像(黑色条＝500μm)。(B)是显示源自于由(A)中提到的由WT和SIRT1-iKO小鼠制备并经用VEGF(30ng/mL)介导发芽7天+/-NMN(0.5mM)的主动脉环中，每环中的芽数和芽总面积的图。(C)显示源自由18月龄野生型小鼠制备并用或不用VEGF(30ng/mL)处理7天(n＝15)的主动脉环的芽数和总面积的定量的图。(D)显示用Scr或SIRT1siRNA转染的HAEC，然后用PBS或NMN(500μM)进行VGEF介导的管形成的图。显示了所得管网的每视野中的管分支点和总管长度的定量(n＝12)。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的双因素方差分析，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
图35是(A)蛋白印迹的图像，显示用NT、SIRT3(T3)或SIRT6(T6)siRNA转染的HAEC中的SIRT3和SIRT6蛋白质水平。微管蛋白用作加样对照。(B)在VEGF(30ng/mL)+/-NMN(n＝10-12)下用NT、T3或T6siRNA转染的HAEC形成的所得管网的每视野中(10倍放大)的管分支点数量和管总长度的定量的图。(C)显示来自用NT、T3或T6siRNA转染并用VEGF+/-NMN(0.5mM)(n＝8)刺激的HAEC的球状体的芽长度的定量的图。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的单因素方差分析，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
图36是(A)显示来自用qPCR定量的VEGF(50ng/mL)+/-NMN(0.5mM)刺激的HAEC的Notch靶基因HEY1、HES1和NRARP和NOTCH1的相对mRNA水平的图(n＝4)。(B)显示Dll4刺激的HAEC(n＝3)中Notch靶基因(HEY2和NRARP)的相对mRNA水平的图。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的双因素方差分析，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
图37是(A)蛋白印迹图像，显示VEGF刺激的HAEC+/-NMN(0.5mM)中的notch胞内结构域(NICD)蛋白水平，以及位于右侧的显示相对NICD水平的图(n＝3)。(B)蛋白印迹图像显示Dll4刺激的HAEC+/-NMN(0.5mM)中的NICD蛋白水平，以及位于右侧的显示相对NICD水平的图(n＝3)。(C)显示来自用NT或T1siRNA转导并用VEGF(50ng/mL)+/-NMN(0.5mM)，+/-DAPT(20μM)和+/-SU5416(10μM)刺激的HAEC的球状体的芽长的图(n＝8)。DAPT(N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸叔丁酯)：γ-分泌酶抑制剂，SU5416：VEGFR2抑制剂。(D)显示源自由WT和SIRT1-iKO(18月龄)小鼠制备并经受VEGF(30ng/mL)介导的发芽7天+/-NMN(0.5mM)和+/-DAPT(20μM)的主动脉环(n＝13-15)的芽数的图。数据表示为平均值±SEM。通过Student’s t检验(A)，Bonferroni多重比较检验的单因素方差分析(C和D)，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
图38是(A)显示在完全生长培养基中用PBS或NMN(0.5mM)温育48小时，并使用流式细胞术测定细胞数的HUVEC的相对细胞数(n＝12)的定量的图。(B)显示当来自WT和ESKO小鼠的MLEC血清饥饿过夜，然后通过膜联蛋白V/PI染色评估细胞凋亡并使用流式细胞术进行分析时，凋亡细胞(膜联蛋白V+/PI-)(n＝12)的数量的图，数据表示为平均值±SEM。通过Student's t检验(A)或Bonferroni多重比较检验的双因素方差分析，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。(C)SIRT1如何促进发芽血管生成的模型的示意图。发芽期间血管生成中的VEGF刺激上调尖端细胞中Dll4配体的表达，其反过来激活茎细胞中的Notch信号传导。这种相互作用引发γ-分泌酶复合物对Notch受体的蛋白水解切割以从细胞膜释放NICD。NICD易位至细胞核并诱导转录基因激活。NMN激活SIRT1促进VEGF刺激的EC中的迁移、增殖和存活。在茎细胞中，NMN在VEGF/Dll4刺激期间降低NICD的水平并抑制Notch靶基因活化，从而促进发芽。
图39是(A)显示用PBS或NMN(500μM)预处理6小时，然后再另外暴露于H2O2(600μM)4小时的HUVEC中％膜联蛋白V染色的图。通过流式细胞术检测膜联蛋白V染色(n＝12)。(B)由Scr或SIRT1siRNA转染的HUVEC形成的管网的代表性明场图像(4倍放大)(白色条＝500μM)，所述由Scr或SIRT1siRNA转染的HUVEC暴露于H2O2(150μM)1小时，然后用PBS或NMN(500μM)进行10小时的VEGF诱导管形成。(C)显示Scr或SIRT1 siRNA转染的HUVEC的管分支点以及每视野中总管长度的定量，所述Scr或SIRT1 siRNA转染的HUVEC暴露于H2O2(150μM)1小时，然后用PBS或NMN(500μM)进行10小时的VEGF诱导管形成(n＝12)。数据表示为平均值±标准偏差。单因素方差分析检验，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.005和#p<0.00005。
图40是(A)显示从6、15月龄(在腓肠肌的情况下)和20月龄小鼠中分离的MLEC(n＝6)和腓肠肌(n＝10)中的NAD+水平的图，标准化为总蛋白含量。(B)显示来自空载剂和NMN处理的小鼠(18月龄)的肝脏和腓肠肌组织中的NAD+水平的图，其标准化为总蛋白含量(n＝12-14)。数据表示为平均值±标准偏差。通过student’s t检验，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.005和#p<0.00005。
图41是(A)显示20月龄经空载剂和NMN处理的小鼠(n＝10)的食物摄入量、耗水量、体重、瘦体重、脂肪量、空腹血糖、转棒仪表现和握力的定量的图。(B)显示使用超声心动图(Vevo 2100)测量的20月龄的经空载剂和NMN处理的小鼠的心脏功能的图。显示了收缩压和舒张压以及射血分数的定量(n＝10)。
图42是(A)来自20月龄经空载剂和NMN(400mg/kg/天)处理的小鼠的股四头肌肌肉横截面中的毛细血管(CD31)和基质(层粘连蛋白，嵌入图)(20倍放大)的代表性图像(白色条＝200μm)。(B)是显示来自20月龄经空载剂和NMN(400mg/kg/天)处理的老鼠的股四头肌肌肉横截面中每HPF的毛细血管数，每HPF的毛细血管数/肌纤维数比率(n＝8)的图。(C)来自20月龄经空载剂和NMN处理的小鼠的腓肠肌横截面(20倍放大)中的毛细血管(CD31)和肌肉基质(层粘连蛋白，嵌入图)的代表性图像(白色条＝200μm)(D)显示来自20月龄经空载剂和NMN(400mg/kg/天)处理的小鼠的腓肠肌横截面中每HPF的毛细血管数，每HPF的毛细血管数/肌纤维数比率(n＝8)的图。数据表示为平均值±标准偏差。通过Student's t检验，*p<0.05，**p<0.005。
图43是(A)显示使用对比度增强超声测量的峰增强(PE)的图。(B)显示经空载剂和NMN处理的小鼠(20月龄)(n＝13)的后肢中的后肢可溶性氧(sO2)水平的图。(C)使用对比增强超声(CEU)成像测量的使用或不使用NMN处理的20月龄小鼠的后肢骨骼肌灌注的代表性对比模式和峰值增强模式超声图像的图像。(D)显示平均峰值增强(PE)，最大-最小视频强度的图，显示了后肢相对血容量的指标(n＝5)。数据表示为平均值±标准偏差。通过Student’s t检验，*p<0.05。
图44是(A)来自20月龄经空载剂和NMN处理的小鼠的四头肌组织匀浆中的SIRT1和线粒体蛋白复合物II、III、IV和V的蛋白印迹的图像(14-3-3用作加样对照)，在右侧，显示了复合物II、III、IV和V的相对定量图(n＝4)。(B)来自20月龄经空载剂和NMN处理的小鼠的股四头肌的代表性COX染色图像，在右侧，显示了高于设定阈值的COX阳性纤维数量的定量的图(n＝4)。(C)显示通过测定来自20月龄经空载剂和NMN处理的小鼠(n＝10)的四头肌组织匀浆中的柠檬酸合酶和琥珀酸脱氢酶(SDH)活性来评估的线粒体容量的图。
图45是(A)显示使用Clark电极系统测量的在来自20月龄经空载剂和NMN处理的小鼠(n＝10)的比目鱼肌和EDL透化的肌纤维中通过线粒体复合物I、II和IV介导的氧消耗速率的相对定量的图。(B)显示20月龄经空载剂和NMN处理的小鼠(n＝13)中腓肠肌(GA)、股四头肌(QA)和心脏(H)组织重量的定量的图。(C)来自20月龄经空载剂和NMN处理的小鼠的股四头肌的代表性H&E染色图像。(D)显示来自20月龄经空载剂和NMN处理的小鼠(n＝13)的腓肠肌中肌球蛋白重链I、IIA、IIB和IIX的相对mRNA水平的图。(E)显示使用Oxymax-CLAMS系统测量的20月龄经空载剂和NMN处理的小鼠的运动活性(Xamb-在X轴上的连续束断裂)和氧消耗速率(VO2)的图。呈现了Xamb和VO2的定量(n＝6)。数据表示为平均值±标准偏差。通过Student’s t检验的p。
图46是显示在(A)低强度和(B)高强度跑步机运动试验中20月龄经空载剂和NMN处理的小鼠跑至力竭时的时间和跑至力竭时的距离的图。(C)是显示20月龄经空载剂和NMN处理的小鼠中的运动后血液乳酸水平的图(n＝13)。数据表示为平均值±标准偏差。通过Student's t检验，*p<0.05，**p<0.005。
图47是(A)显示通过免疫染色测定的以标准食物饲料+/-NMN(400mg/kg)中他莫昔芬喂养两个月的SIRT1-iKO和WT(20月龄)小鼠的腓肠肌横截面中的每HPF的毛细血管数/肌纤维数比率(20倍放大)(n＝5)的图。NMN处理增加WT小鼠中的毛细血管但不增加SIRT1-iKO小鼠中的毛细血管。(B)显示他莫昔芬喂养的SIRT1-iKO和WT(8月龄)小鼠在经受后肢缺血+/-NMN(500mg/kg/天)之后20天，通过CEU成像和通过腓肠肌横截面免疫染色的测定的缺血性腓肠肌横截面(n＝5)中缺血肢体的PE值和每HPF的毛细血管数/肌纤维数比率(20倍放大)(n＝5)的图。(C)在诱导后肢缺血后20天测量的经空载剂和NMN处理的小鼠的缺血后肢的代表性峰值增强模式超声图像。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的双因素方差分析，*p<0.05，**p<0.005。
图48是(A)是显示来自10月龄经空载剂和NMN处理的久坐或运动小鼠(n＝5)的股四头肌肌肉横截面中的毛细血管密度的图。WT C57BL/6J(10月龄)小鼠保持久坐或者训练四周的跑步机训练(以斜度5°，15米/分钟运动30分钟)+/-NMN(400mg/kg/天)。用CD31和层粘连蛋白抗体对股四头肌中的毛细血管和基质进行免疫染色，测定每HPF中的毛细管/肌纤维比率(n＝5)。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的双因素方差分析，p<0.00005，**p<0.005。
图49是(A)来自WT C57BL/6J小鼠(5月龄)的四头肌组织匀浆中的VEGF、VEGFR1、磷酸化VEGFR1和SIRT1的蛋白印迹图像，所述WT C57BL/6J小鼠(5月龄)保持久坐或训练四周的跑步机训练+/-NMN(400mg/kg/天)和+/-阿西替尼(30mg/kg/天)。14-3-3用作加样对照。(B)显示从(A)中提到的上述小鼠收集的血清中VEGF蛋白水平的定量的图(n＝5)。(C)显示图6(J)WT C57BL/6J小鼠(5月龄)的股四头肌中每HPF中的毛细血管数/肌纤维数比率的图，所述WT C57BL/6J小鼠(5月龄)保持久坐或训练四周的跑步机训练+/-NMN(400mg/kg/天)和+/-阿西替尼(30mg/kg/天)(n＝5)。在训练结束时，在高强度跑步机测试中评估小鼠的力竭耐力。右侧显示跑至力竭时的平均距离(n＝5)。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的单因素方差分析，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
图50是(A)来自C57BL/6J小鼠(5月龄)的四头肌肌肉横截面(20倍放大)的毛细血管(CD31)和肌肉基质(层粘连蛋白，嵌入图)的代表性图像，所述C57BL/6J小鼠(5月龄)保持久坐或运动训练+/-NMN和+/-阿西替尼(白色条＝200μm)。
图51是(A)蛋白印迹，(左)显示用NaHS(0.1mM)和/或NMN(0.5mM)处理的HUVEC中的SIRT1蛋白水平，(右)用NaHS(0.1mM)和/或NMN(0.5mM)处理的HUVEC中的相对SIRT1蛋白水平(n＝4)。(B)显示用增加剂量的NaHS处理24小时(n＝6)的HUVEC中相对NAD+水平的图。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的单因素方差分析，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
图52是(A)显示用H2O2(150μM)处理1小时用Scr或SIRT1 siRNA转导的HUVEC，然后用空载剂、NaHS(100μM)、NMN(500μM)或NaHS+NMN组合进行10小时VEGF介导的管形成的图。显示了每视野的管分支点的定量和总管长度(n＝12)。(B)显示当Scr或SIRT1siRNA转导的HUVEC的汇合单层暴露于H2O2(150μM)1小时时的细胞迁移，产生划痕并允许细胞与空载剂、NaHS(100μM)和/或NMN(500μM)迁移持续6小时。条棒表示封闭间隙的百分比(n＝6)(C)显示如使用XF96海马分析仪(n＝6)测量的用空载剂、NaHS(100μM)、NMN(500μM)或NMN+NaHS组合处理的HUVEC的基础氧消耗速率(OCR)的图。加入寡霉素(1μM)测定OCR，同时抑制复合物V并阻断ATP合成。
图53是(A)显示在transwell迁移测定中每视野(n＝15)的迁移细胞数的图，其中用C2C12CM，+/-NaHS(0.1mM)和+/-NMN(0.5mM)刺激从WT和ESKO小鼠分离的MLEC 12小时。(B)显示来自用VEGF(50ng/mL)、+/-NaHS(0.1mM)和+/-NMN(0.5mM)(n＝7)刺激的HUVEC的球状体的芽长度的定量的图。(C)显示划痕试验中面积闭合百分比的图，其中用NT或T1siRNA转导HUVEC，生长至汇合的单层并使用200μL移液管尖端造成划痕。使EC与+/-NaHS(0.1mM)和+/-NMN(0.5mM)一起迁移6小时。条棒表示闭合间隙的百分比(n＝6)。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni的多重比较检验的单向(B和C)或双向(A)方差分析，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
图54是显示32月龄用空载剂、NaHS、NMN和NMN+NaHS处理的小鼠(n＝7)的食物摄取、水消耗、体重、瘦体重和脂肪量的定量的图。
图55是(A)用+/-NaHS(20mg/kg/天)和+/-NMN(400mg/kg/天)连续处理四周的32月龄小鼠的股四头肌肌肉横截面的毛细血管(CD31)和肌肉基质(层粘连蛋白，嵌入图)(20倍放大)的代表性图像。(白色条＝100μm)(B)显示在(A)中提到的股四头肌中每HPF的毛细血管数，每HPF的毛细血管数/肌纤维数比率的图(n＝7)。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的单因素方差分析，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
图56是(A)显示通过TUNEL和CD31免疫染色分析的用+/-NaHS和+/-NMN处理的32月龄小鼠的股四头肌肌肉横截面中毛细血管的细胞凋亡百分比的图(n＝5)。(B)显示用空载剂、NaHS(0.1mM)和/或NMN(0.5mM)预处理6小时，然后再暴露于H2O2(600μM)4小时的HUVEC中凋亡细胞(膜联蛋白V+/PI-)百分比的图，通过膜联蛋白V和PI染色检测凋亡细胞，并使用流式细胞术分析(n＝12)。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的单因素方差分析，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
图57是显示在低强度跑步机试验中31月龄用空载剂、NaHS、NMN和NMN+NaHS处理的小鼠跑步至力竭所用(A)时间和(B)距离的图，(n＝7，*p<0.05和#p<0.00005，相比空载剂)。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的单因素方差分析，*p<0.05。
图58是(A)基于FUW骨架的慢病毒构建体的示意图，其中EGFP转基因和SIRT1miRNA仅从VE-钙粘蛋白启动子表达至靶EC。(B)在VE-钙粘蛋白启动子控制下，用表达非靶向(NT)或SIRT1 miRNA(miRNA#1-5)的慢病毒转导的WT MLEC中的SIRT1和NICD蛋白水平的蛋白印迹(左)。转导的MLEC的相对SIRT1蛋白水平的图显示在右侧(n＝3)。表达SIRT1 miRNA#5的慢病毒的转导导致SIRT1被敲低80％，同时MLEC中的NICD蛋白水平增加。数据表示为平均值±SEM。通过Student’s t检验，**p<0.005。
图59是(A)代表性图像(40倍放大)，显示慢病毒递送的分布和EC特异性。给WTC57BL/6J小鼠(20月龄)施用慢病毒颗粒，其通过眼眶后注射在VE-钙粘蛋白启动子的控制下转导EGFP和NT miRNA。10天后，对腓肠肌横切片进行EGFP和CD31免疫染色(白色条＝30μm)(B)显示WT C57BL/6J小鼠(20月龄)中腓肠肌横截面中每HPF的毛细血管数/肌纤维数比率的图(40倍放大)(n＝6)，其中所述WT C57BL/6J小鼠(20月龄)被施用转导NT或SIRT1#5miRNA NT或miRNA 5的慢病毒颗粒，并用+/-NaHS(20mg/kg/天)，+/-GYY4137(20mg/kg)处理/天)+/-NMN(400mg/kg/天)处理持续4周，然后通过CD31(毛细血管)和层粘连蛋白(肌肉基质)的免疫染色分析肌肉毛细血管。数据表示为平均值±SEM。通过Bonferroni多重比较检验的双元素方差分析，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，δp<0.00005。
具体实施方式
本公开涉及提高受试者组织中的血管密度和/或血流的方法。该方法包括向受试者施用有效量的提高受试者组织内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
去乙酰化酶1(Sirtuin 1，SIRT1)是NAD+依赖性脱酰基酶的去乙酰化酶(sirtuin)家族的成员，其介导饮食限制的健康益处。
如实施例中所述，本发明人发现，与携带野生型SIRT1的老年小鼠相比，携带SIRT1缺失的老年小鼠骨骼肌中的血管密度降低，并且运动能力降低。本发明人发现，与不表达转基因的老年小鼠相比，来自外源提供的转基因的老年小鼠的内皮细胞中SIRT1的过表达导致小鼠骨骼肌组织中的血管密度增加和小鼠的运动能力增加。本发明人发现，通过施用提高内皮细胞中SIRT1活性和/或表达的试剂，可以增加血管密度和运动能力。
本发明人进一步发现NAD+水平随着年龄的增长而下降，并且通过在老年期间用NAD+激动剂进行治疗以恢复或升高NAD+水平导致血管密度增加、肌肉灌注增加和运动能力提高。
如本文所用，“血管密度”是每部分组织的血管(通常是毛细血管)的数量。所述部分组织可以是例如一定体积的组织或组织区域，例如组织的横截面区域。在组织是肌肉的一些实施方式中，血管密度可以表示为每个肌纤维或每个横截面积的血管(通常是毛细血管)的数量。例如，可以通过确定肌肉组织的横截面中每个高倍视野的毛细血管数来计算肌肉组织中的血管密度。可以基于所观察的面积来计算面积，并且密度可以表示为每平方微米的毛细管数量。在一种形式中，肌肉中的毛细血管密度可表示为毛细血管/肌纤维比率。例如，毛细管/肌纤维比率可以例如以肌肉组织横截面中每个视野(通常为每个高倍视野)的毛细血管的数量除以肌纤维数量来计算。
在一个方面，本发明提供增加受试者组织中血管密度的方法，该方法包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。该方法增加受试者组织中的血管密度，即，受试者组织中的血管密度相对于施用试剂之前组织中的血管密度增加。
在一个实施方式中，血管密度的增加是微血管密度的增加。通常，微血管密度的增加是毛细血管密度的增加。
另一个方面提供了增加受试者组织中血流量的方法，该方法包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。该方法增加了受试者组织中的血流量，即，受试者组织中的血流量相对于施用试剂之前组织中的血流量增加。
另一个方面提供了增加受试者组织中血管密度和血流量的方法，该方法包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
组织可以是能够从血管密度和/或血流增加获益的任何组织。在一个实施方式中，组织选自肌肉、肝脏、脑、骨、眼睛、皮肤和心脏。在一个实施方式中，组织是肌肉。在一个实施方式中，肌肉是骨骼肌。在一个实施方式中，组织是心脏。在一个实施方式中，组织是脑。在一个实施方式中，组织是肝脏。在一个实施方式中，组织是皮肤。在一个实施方式中，组织是眼睛。在一个实施方式中，组织是骨。
在一些实施方式中，组织是健康组织。在一些实施方式中，组织是缺血性组织。
通常，该试剂使受试者的所有组织中的内皮细胞中的SIRT1活化或表达提高。然而，在一些实施方式中，所述试剂可以对受试者的一种或多种特定组织(例如特定器官)具有特异性。
另一个方面，本发明提供了提高受试者运动能力的方法，该方法包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1的表达的试剂。该方法提高了受试者运动能力，即，受试者运动能力相对于施用试剂之前受试者运动能力提高。
如本文所用，“运动能力(exercise capacity)”是受试者在运动期间，通常在连续运动期间，更通常在连续剧烈运动期间抗疲劳的能力。通常，受试者在运动期间抗疲劳能力的提高是受试者耐力的增加。受试者运动能力的提高可能是由于以下一项或多项原因：
(a)提高运动期间受试者肌肉组织中乳酸的消除；
(b)增加运动期间肌肉组织的氧气供应；
(c)提高运动期间肌肉组织中氧化产物的消除；
(d)增加运动期间用于组织功能的酶和辅因子的供应；
(e)增加运动期间肌肉组织再灌注；和/或
(f)运动时乳酸水平降低。
由于SIRT1是NAD+依赖性环化酶，通过提高NAD+水平、提高NAD+与NADH的比例和/或提高细胞中NAD+的产生，可以在细胞中增加SIRT1活性。
在一个实施方式中，提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂包含NAD+激动剂。
一个方面，本发明提供增加受试者组织中血管密度和/或血流量的方法，包括向受试者施用有效量的NAD+激动剂。
另一个方面，本发明提供提供受试者运动能力的方法，包括向受试者施用有效量的NAD+激动剂。
如本文所用，“NAD+激动剂”是在内皮细胞中提高NAD+水平和/或提高内皮细胞中NAD+与NADH的比例和/或提高内皮细胞中NAD+产生的试剂。
在一个实施方式中，NAD+激动剂是提高内皮细胞中NAD+水平的试剂。相对于在与试剂接触之前内皮细胞中NAD+的量，提高内皮细胞中NAD+水平的试剂增加了NAD+的量。
在一个实施方式中，NAD+激动剂是提高内皮细胞中NAD+与NADH比例的试剂。相对于与试剂接触之前内皮细胞中NAD+与NADH的比例，提高内皮细胞中NAD+与NADH比例的试剂提高了内皮细胞中NAD+与NADH的比例。
在一个实施方式中，NAD+激动剂是提高内皮细胞中NAD+产生的试剂。相对于在与试剂接触之前内皮细胞中NAD+的产生，提高内皮细胞中NAD+产生的试剂提高了内皮细胞中NAD+的产生。
在一个实施方式中，NAD+激动剂提高内皮细胞中的NAD+水平并提高内皮细胞中NAD+与NADH的比例。在一个实施方式中，NAD+激动剂提高内皮细胞中的NAD+水平，提高内皮细胞中NAD+与NADH的比例并提高内皮细胞中NAD+的产生速率。在一个实施方式中，NAD+激动剂提高内皮细胞中的NAD+水平并提高内皮细胞中NAD+的产生。
测定细胞中NAD+的量、细胞中NAD+与NADH的比例以及细胞中NAD+的产生的方法是本领域已知的，并且描述于例如Schwartz等，(1974)J.Biol.Chem.249:4138-4143；Sauveand Schramm(2003)Biochemistry 42(31):9249-9256；Yamada等，(2006)AnalyticalBiochemistry 352:282-285，或者可以使用市售试剂盒，例如NAD/NADH-Glo Assay(Promega Inc.)或NAD/NADH定量比色试剂盒(BioVision Inc.)进行测定。
在一种形式中，NAD+激动剂减少内皮细胞中NAD+的分解，从而提高细胞中的NAD+水平。减少细胞(包括内皮细胞)中NAD+分解的试剂的实例是CD38抑制剂。CD38是催化由NAD+和ADP-核糖合成和水解环状ADP-核糖的酶。CD38通过将NAD+转化为环状ADP-核糖来降低细胞中的NAD+水平。因此，在一个实施方式中，NAD+激动剂是CD38抑制剂。
如本文所用，“CD38抑制剂”是降低或消除CD38生物活性的试剂。通过抑制酶功能，或通过在基因表达和酶产生水平来抑制CD38表达，可以降低或消除CD38的生物活性。“抑制”旨在表示减少或消除，并且包括部分的和完全的减少或消除。
在一个实施方式中，CD38抑制剂是CD38酶功能的抑制剂。CD38酶功能的抑制剂是阻断或降低CD38的酶活性的试剂。
在一个实施方式中，CD38酶功能的抑制剂是式I的化合物，或其药学上可接受的盐、衍生物或前药：
其中：
X为H或OH；和
Y为H或OH；
在一个实施方式中，X和Y均为H。
CD38酶功能抑制剂的实例是芹菜素(apigenin)或其药学上可接受的盐、衍生物或前药。芹菜素(5,7-二羟基-2-(4-羟基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮)，也称为4',5,7-三羟基黄酮，是在包括水果和蔬菜(例如欧芹、芹菜和洋甘菊)的植物发现的异黄酮。芹菜素具有以下结构：
CD38酶功能抑制剂的另一个实例是槲皮素(quercetin)或其药学上可接受的盐、衍生物或前药。槲皮素[2-(3,4-二羟基苯基)-3,5,7-三羟基-4H-色烯-4-酮])是在包括水果、蔬菜、叶类和谷物的植物中发现的异黄酮。槲皮素具有以下结构：
芹菜素和槲皮素都表现为体外CD38活性的抑制剂(Esande等，(2013)Diabetes,1084-1093)。
异黄酮(例如芹菜素或槲皮素)通常以分离的形式施用。“分离的”是指异黄酮已经历至少一个纯化步骤。当CD38酶功能的抑制剂是异黄酮时，抑制剂可方便地以包含至少10％w/v抑制剂、至少20％w/v抑制剂、至少30％w/v抑制剂、至少40％w/v抑制剂、至少50％w/v抑制剂、至少60％w/v抑制剂、至少70％w/v抑制剂、至少80％w/v抑制剂、至少90％w/v抑制剂、至少95％w/v抑制剂、至少98％w/v抑制剂的组合物进行施用。在一个实施方式中，抑制剂是生物学纯的形式(即基本上不含其他生物活性化合物)。分离生物学纯形式的异黄酮如芹菜素和槲皮素的方法是本领域已知的。生物学纯的芹菜素和槲皮素也可从例如SigmaChemical Company(St.Louis)(目录号A3145和目录号Q4951)或Indofine ChemicalCompany(目录号A-002)商购获得。
在一些实施方式中，CD38抑制剂是CD38酶功能抑制剂的药学上可接受的盐或前药形式，例如芹菜素或槲皮素的药学上可接受的盐或前药。术语“前药”在本文中以其最广泛的含义使用，包括在体内转化为药物活性形式的那些化合物。使用前药策略可以优化NAD+激动剂向其作用位点的递送。
在一个实施方式中，CD38酶功能抑制剂的前药是抑制剂的酯或亚胺。
在一个实施方式中，NAD+激动剂是芹菜素，或其药学上可接受的盐、衍生物或前药。
在另一个实施方式中，CD38抑制剂是CD38基因表达或酶产生的抑制剂。CD38基因表达或酶产生的抑制剂是阻断或减少CD38基因转录或翻译的试剂。CD38基因表达或酶产生的抑制可以是，例如，通过RNA干扰(RNAi)(例如siRNA，shRNA)、反义核酸、锁定核酸(LNA)、DNA酶或核酶(其靶向CD38 mRNA转录物)，通过基因组编辑技术如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALENS)、聚类规则间隙短回文重复序列(CRISPR)、或工程化大范围核酸酶重组的归巢核酸酶(其靶向CD38基因)的抑制。“RNAi”是指形成双链RNA的核酸，当siRNA存在于与基因或靶基因相同的细胞中时，该双链RNA具有降低或抑制靶基因表达的能力。“shRNA”或“短发夹RNA”是指形成具有紧密发夹环的双链RNA的核酸，其具有降低或抑制基因或靶基因表达的能力。“反义”多核苷酸是与靶多核苷酸基本上互补的多核苷酸，并且具有与靶多核苷酸特异性杂交以降低靶基因表达的能力。核酶和DNA酶分别是催化性RNA和DNA分子，其与靶序列杂交并切割，从而减少或抑制靶基因的表达。使用反义、核酶、DNA酶和RNAi技术来控制基因表达的一般方法是本领域已知的。基因组编辑使用人工工程核酸酶在基因组中的所需位置产生特异性双链断裂，并利用细胞内源机制来修复断裂。使用基因组编辑技术沉默基因的方法描述于例如Tan等，(2012)Precision editing of large animalgenomes,Adv.Genet.80:37-97；de Souza(2011)Primer:Genome editing withengineered nucleases,Nat.Meth.9(1)27-27；Smith等，(2006)A combinatorialapproach to create artificial homing endonucleases cleaving chosen sequences,Nucleic Acids Research 34:22,e149；Umov等，(2010)Nat.Rev.Genet.11(9):636-646。使用iRNA抑制CD38表达描述于例如Escande等，(2013)Diabetes,62:1084-10935。
在另一个实施方式中，NAD+激动剂是促进内皮细胞中NAD+合成从而提高内皮细胞中NAD+水平的试剂。促进NAD+合成的试剂的实例是NAD+前体。
在一个方面，提供了增加受试者组织中血管密度和/或血流的方法，包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
在一个方面，提供了提高受试者运动能力的方法，包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
在一个方面，提供了增加受试者组织中血管生成和/或新血管形成的方法，包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
如本文所用，“NAD+前体”是NAD+合成的中间体，其不抑制sirtuin活性。NAD+前体的实例包括烟酰胺单核苷酸(NMN)、烟酰胺核糖核苷(NR)、烟酸核糖核苷(NaR)、烟酸核糖的酯衍生物、烟酸(niacin)、烟酸的酯衍生物、烟酸单核苷酸(NaMN)、烟酸腺嘌呤二核苷酸(NAAD)、5-磷酸-α-D-核糖基-1-焦磷酸(PPRP)，或其药学上可接受的盐、衍生物或前药。
在一个实施方式中，NAD+激动剂是NMN或其药学上可接受的盐、衍生物或前药，NR或其药学上可接受的盐、衍生物或前药，或NAAD或其药学上可接受的盐、衍生物或前药。
在一个实施方式中，NAD+激动剂是NMN或其药学上可接受的盐、衍生物或前药。
在一个实施方式中，NAD+激动剂是NR或其药学上可接受的盐、衍生物或前药。NR衍生物的实例及其制备方法描述于例如美国专利8106184号。
在一个实施方式中，NAD+激动剂是NAAD或其药学上可接受的盐、衍生物或前药。
在一个实施方式中，NAD+激动剂是NaR或其药学上可接受的盐、衍生物或前药。
在另一个实施方式中，NAD+激动剂是细胞可渗透形式的NAD+、其衍生物或前药。
在另一个实施方式中，可以通过降低对NAD+生物合成酶NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和NMNAT3的翻译的抑制来提高NAD+水平。抑制NAD+生物合成酶NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和NMNAT3的翻译是由靶向NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和NMNAT3的内源微RNA(miRNA)介导的。因此，通过抑制靶向NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和NMNAT3的内源miRNA的活性，可以在内皮细胞中提高NAD+水平。因此，在一个实施方式中，NAD+激动剂是NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和/或NMNAT3 miRNA拮抗剂。如本文所用，“NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和/或NMNAT3 miRNA拮抗剂”是抑制miRNA活性的试剂，miRNA抑制NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和NMNAT3中的任何一种或多种的翻译。NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和/或NMNAT3 miRNA拮抗剂可通过例如如下方式来抑制NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和/或NMNAT3 miRNA从而起作用：RNA干扰(RNAi)(例如siRNA，shRNA)、反义核酸、锁核酸(LNA)、DNA酶或核酶(其靶向靶向NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和/或NMNAT3的miRNA)，或者基因组编辑技术，如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALENS)、聚类规则间隙短回文重复序列(CRISPR)，或工程化大范围核酸酶重组回归核酸酶(其靶向编码miRNA的DNA序列，所述miRNA靶向NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和/或NMNAT3)。激活结构域可以靶向NAD生物合成基因(例如NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和/或NMNAT3)的基因，以使用CRISPR指导的异源调节结构域(例如VP16或VP64)来增加基因表达。
在另一个实施方式中，可以通过使细胞与NAD+激动剂接触来提高NAD+水平，所述NAD+激动剂增强NAD+生物合成酶的酶活性，例如来自其他物种如酵母、果蝇或植物的NAD+生物合成酶NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和/或NMNAT3或PNC1。例如，P7C3在体外增强NAMPT的活性，从而增加细胞内NAD+的水平(Wang等，(2014)Cell,158(6):1324-1334)。P7C3具有以下结构：
NAD+生物合成酶(例如NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和/或NMNAT3)的酶活性可以通过向受试者的细胞中引入在内皮细胞中表达一种或多种NAD+生物合成酶的核酸来增强。
在一个实施方式中，NAD+激动剂是相对于与NAD+激动剂接触之前的细胞中的NAD+与NADH的比例而言提高NAD+与NADH的比例的试剂。例如，通过使细胞与NAD+激动剂(其激活将NADH转化为NAD+的酶)接触可以提高NAD+与NADH的量的比例。例如，β-拉帕醌(3,4-二氢-2,2-二甲基-2H-萘酚[1,2-b]吡喃-5,6-二酮)活化NADH:醌氧化还原酶(NQ01)，该酶通过利用NADH作为电子供体催化醌还原为氢醌，结果增加了NAD+与NADH的比例。
因此，在一个实施方式中，NAD+激动剂是NQ01的活化剂，例如拉帕醌，或其药学上可接受的盐、衍生物或前药。
如实施例中所述，发明人发现施用NAD+前体NMN会：
-增加细胞包括内皮细胞中NAD+水平；
-当施用于老年小鼠时，增加骨骼肌中的血管密度并增加血流量；
-当施用于正在接受运动训练的小鼠时，增加年幼者和年老者骨骼肌的血管密度；
-降低剧烈运动后血乳酸水平；
-增加运动能力；
-促进内皮细胞的增殖并刺激血管生成；
-增加缺血组织中的血管密度和血流量。
在一个实施方式中，提供了增加受试者组织中血管密度和/或血流量和/或提高受试者运动能力的方法，其包括向受试者施用有效量的NMN或其药学上可接受的盐、衍生物或前药。
在一个实施方式中，提供了增加受试者组织中血管密度和/或血流的方法，其包括向受试者施用有效量的NMN或其药学上可接受的盐、衍生物或前药。
在一个实施方式中，提供了提高受试者运动能力的方法，包括施用有效量的NMN或其药学上可接受的盐、衍生物或前药。
在一个实施方式中，提供了增加受试者组织中血管生成和/或新血管形成的方法，其包括向受试者施用有效量的NMN或其药学上可接受的盐、衍生物或前药。
如实施例中所述，本发明人进一步发现，施用了NAD+激动剂NMN和H2S前体硫氢化钠的老年小鼠具有的骨骼肌血管密度和运动能力大于单独用NMN或硫氢化钠治疗的小鼠的运动能力。
因此，在一个实施方式中，本发明的方法包括施用NAD+激动剂与提高受试者内皮细胞中H2S水平的化合物的组合。
在一个实施方式中，在受试者的内皮细胞中升高H2S水平的化合物是H2S前体。因此，在一个实施方式中，提供了增加受试者组织中的血管密度和/或血流的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+激动剂与H2S前体的组合。
在一个实施方式中，提供了提高受试者运动能力的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+激动剂与H2S前体的组合。
在一个实施方式中，H2S前体是硫氢化钠或吗啉-4-基4-甲氧基苯基(吗啉代)二硫代磷酸酯(GYY4137)。
在一个实施方式中，H2S前体是硫氢化钠。
在一个实施方式中，H2S前体是GYY4137。
如实施例中所述，本发明人还发现SIRT1转基因在受试者的内皮细胞中的表达导致血管密度增加和运动能力增加。
因此，在一个实施方式中，提高受试者内皮细胞中SIRT1活性和/或表达的试剂提高了受试者内皮细胞中SIRT1的表达。在一个实施方式中，提高受试者组织的内皮细胞中SIRT1表达的试剂包括能够在受试者的内皮细胞中表达SIRT1的核酸。能够在受试者组织的内皮细胞中表达SIRT1的核酸可以包含与调节序列可操作地连接的SIRT1的编码序列，其一起操作以表达由内皮细胞中的编码序列编码的蛋白质。“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA或RNA序列。它可以构成“不间断的编码序列”，即缺少内含子(例如在cDNA中)，或者它可以包括由适当的剪接点界定的一个或多个内含子。人SIRT1编码序列的一个实例是Genbank登录号BC012499的核苷酸210至1877的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。“调节序列”是位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，其影响转录、RNA加工或稳定性、或相关编码序列的翻译。调节序列是本领域已知的，并且可包括例如转录调节序列，例如启动子、增强子翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化信号序列。编码序列通常与启动子可操作地连接。启动子是在某些条件下能够结合RNA聚合酶并启动通常位于启动子下游(3'方向)的编码序列转录的DNA区域。编码序列也可以与终止信号可操作地连接。表达盒还可以包括正确翻译编码序列所需的序列。编码序列可以在启动组织内皮细胞中的转录的组成型启动子或可调节启动子的控制下。例如，SIRT1编码序列可以与对于SIRT1基因而言并非天然的启动子例如在内皮细胞中表达编码序列或可在其中诱导的启动子可操作地连接，合适的启动子的实例包括Tie-1、Tie-2、CD34、eNOS、Flt-1、VE-钙粘蛋白、vWF、PDGFB、PECAM-1、VCAM-1。
当编码蛋白质的核酸(编码序列)相对于调节序列排列以允许蛋白质在细胞中表达时，其与调节序列可操作地连接。例如，如果启动子有助于启动编码序列的转录，则启动子可操作地连接到编码区。
如本文所用，核酸序列的“表达”是指包含编码序列的核酸序列的转录和翻译，以产生由编码序列编码的多肽。
可以将编码SIRT1的核酸序列插入合适的载体序列中。术语“载体(vector)”是指适于将基因转移到宿主细胞中的核酸序列。术语“载体”包括质粒、粘粒、裸DNA、病毒载体等。在一个实施方式中，载体是质粒载体。质粒载体是双链环状DNA分子，其中可插入另外的序列。质粒可以是表达载体。质粒和表达载体是本领域已知的，并描述于例如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版，第1-3卷,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)。
在一些实施方式中，载体是病毒载体。病毒载体包含病毒序列，其根据病毒载体允许病毒颗粒产生和/或整合到宿主细胞基因组中和/或病毒复制。可与本文所述的方法和组合物一起使用的病毒载体包括能够将核酸引入内皮细胞(例如骨骼肌的内皮细胞)的任何病毒载体。病毒载体的实例包括腺病毒载体；慢病毒载体；腺相关病毒载体；狂犬病毒载体；单纯疱疹病毒载体；SV40；多瘤病毒载体；痘病毒载体。
在一个方面，提供了用于增加受试者组织中的血管密度和/或血流和/或受试者运动能力的核酸，其中所述核酸包含编码蛋白质或RNA的编码序列，所述蛋白质或RNA导致受试者内皮细胞中SIRT1的活性或SIRT1的表达增加。在各种实施例中，编码序列编码：
(a)SIRT1蛋白；
(b)一种或多种NAD+生物合成酶，或
(c)NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和/或NMNAT3 miRNA拮抗剂。
在一个实施方式中，编码序列编码SIRT1。SIRT1氨基酸序列的实例包括Genbank登录号AAI52315.1(小鼠)(SEQ ID NO：3)、AAH12499.1(人)(SEQ ID NO：2)、NP_001277175.1(猫)(SEQ ID NO：4)、XP_005618990.1(狗)(SEQ ID NO：5)。
在一个实施方式中，编码序列编码蛋白质或RNA，其导致受试者的内皮细胞中NAD+水平增加。在一个实施方式中，编码序列编码一种或多种选自由NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和NMNAT3组成的组的NAD+生物合成酶。NAMPT的氨基酸序列的实例是Genbank登录号NP_005737.1(人)(SEQ ID NO：6)、NP_067499.2(小鼠)(SEQ ID NO：7)、XP_022261566.1(狗)(SEQ ID NO)：8)；NMNAT1的氨基酸序列的实例是Genbank登录号AAH14943.1(人)(SEQ IDNO：9)、NP_597679.1(小鼠)(SEQ ID NO：10)、XP_005620579.1(狗)(SEQ ID NO：11)；NMNAT2的氨基酸序列的实例是Genbank登录号NP_055854.1(人)(SEQ ID NO：12)、NP_780669.1(小鼠)(SEQ ID NO：13)、XP_022276670.1(狗)(SEQ ID NO：14)；NMNAT3的氨基酸序列的实例是AAH36218.1(人)(SEQ ID NO：15)、NP_001344374.1(小鼠)(SEQ ID NO：16)、(XP_022264401.1)(狗)(SEQ ID NO：17)。
在一个实施方式中，编码序列编码NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和/或NMNAT3 miRNA拮抗剂。
在一个实施方式中，编码以下的编码序列与在内皮细胞中表达该编码序列或在内皮细胞中可诱导的启动子可操作地连接：SIRT1蛋白；一种或多种NAD+生物合成酶，或NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和/或NMNAT3 miRNA拮抗剂的。在一个实施方式中，启动子选自由Tie-1、Tie-2、CD34、eNOS、Flt-1、VE-钙粘蛋白、vWF、PDGFB、PECAM-1、VCAM-1构成的组。在一个实施方式中，启动子是Tie-2。
用于增加受试者组织中血管密度和/或血流量和/或受试者运动能力的核酸可以掺入病毒载体中以施用于受试者。因此，在一个方面，提供了病毒载体，其中病毒载体包含用于增加受试者组织中血管密度和/或血流量和/或受试者运动能力的核酸，其中所述核酸包含编码蛋白质或RNA的编码序列，所述蛋白质或RNA导致受试者的内皮细胞中SIRT1的活性或SIRT1的表达增加。在各种实施方式中，编码序列编码：
(a)SIRT1蛋白；
(b)一种或多种NAD+生物合成酶，或
(c)NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和/或NMNAT3 miRNA拮抗剂。
通常，编码序列与在内皮细胞中表达编码序列或在内皮细胞中可诱导的启动子可操作地连接。在一个实施方式中，启动子选自由Tie-1、Tie-2、CD34、eNOS、Flt-1、VE-钙粘蛋白、vWF、PDGFB、PECAM-1、VCAM-1构成的组。在一个实施方式中，启动子是Tie-2。典型的病毒载体如上所述，包括腺病毒载体；慢病毒载体；腺相关病毒载体；狂犬病毒载体；单纯疱疹病毒载体；SV40；多瘤病毒载体；痘病毒载体。
在一个实施方式中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一个实施方式中，AAV载体是选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8和AAV9载体或其变体构成的组的血清型。使用重组AAV载体将核酸导入细胞是本领域已知的，并描述于例如，US20160038613；Grieger和Samulski(2005)Adeno-associated virus as a gene therapyvector:vector development,production and clinical applications,Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology 99:119-145；用于产生重组AAV的方法是本领域已知的，并描述于例如Harasta等，(2015)Neuropsychopharmacology 40:1969-1978。
通常使用本领域已知的方法将病毒载体包装到病毒颗粒中。然后可以使用病毒颗粒转移核酸，以增加受试者组织中的血管密度和/或血流量和/或受试者运动能力。因此，另一个方面提供了包含病毒载体的病毒，其中所述病毒载体包含用于增加受试者组织中血管密度和/或血流量，和/或受试者运动能力的核酸，其中所述核酸包含编码蛋白质或RNA的编码序列，所述蛋白质或RNA导致受试者的内皮细胞中SIRT1的活性或SIRT1的表达增加。在各种实施方式中，编码序列编码：
(a)SIRT1蛋白；
(b)一种或多种NAD+生物合成酶，或
(c)NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和/或NMNAT3 miRNA拮抗剂。
在一个方面，存在增加老年受试者的组织中的血管密度和/或血流量和/或增加老年受试者运动能力的方法，其包括施用有效量的本文所述的病毒。
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物。哺乳动物可以是，例如，人、灵长类动物或其他动物(例如绵羊、牛、马、驴、猪、狗、猫、小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠、狐狸、鹿、猴)。
在一个实施方式中，哺乳动物是人。
在一个实施方式中，哺乳动物是非人哺乳动物。
在一个实施方式中，哺乳动物是竞赛动物(例如赛马、灰狗)。
在一个实施方式中，哺乳动物是伴侣动物(例如狗、猫)。
尽管使用鼠模型举例说明了本发明，但是本发明的方法可以应用于其他物种。
在一些实施方式中，受试者是中年或老年受试者。在一些实施方式中，中年或老年受试者是人。在一些实施方式中，受试者是中年人。中年人的年龄范围为35至65岁。在一些实施方式中，受试者是年老者。在一些实施方式中，受试者是老年人。老年人的年龄在66至110岁之间。应当理解，被认为是中年和老年将取决于受试者的物种并且可以由本领域技术人员容易地确定。
在一些实施方式中，受试者可以是任何年龄。
在一个实施方式中，提供了增加中年或老年受试者(通常是老年受试者)的组织中的血管密度和/或血流的方法，该方法包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1的表达的试剂，其任选地与H2S前体相组合。
在一个实施方式中，提供了增加中年或老年受试者(通常是老年受试者)的组织中的血管密度和/或血流的方法，该方法包括向受试者施用有效量的NAD+激动剂，其任选地与H2S前体相组合。
在一个实施方式中，提供了增加中年或老年受试者(通常是老年受试者)的组织中的血管密度和/或血流的方法，该方法包括向受试者施用有效量的NAD+前体，其任选地与H2S前体相组合。
在一个实施方式中，提供了提高中年或老年受试者(通常是老年受试者)运动能力的方法，该方法包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂，其任选地与H2S前体相组合。
在一个实施方式中，提供了增加中年或老年受试者(通常是老年受试者)运动能力的方法，该方法包括向受试者施用有效量的NAD+激动剂，其任选地与H2S前体相组合。
在一个实施方式中，提供了增加中年或老年受试者(通常是老年受试者)运动能力的方法，该方法包括向受试者施用有效量的NAD+前体，其任选地与H2S前体相组合。
发明人设想该方法可用于治疗、预防或改善通过增加血管密度和/或血流和/或增加运动能力而治疗、预防或改善的任何疾病或病症。例如，发明人设想：促进心脏组织血管密度的能力可用于治疗或预防心脏病，例如缺血性心脏病和心力衰竭；促进外周组织血管密度的能力可用于治疗糖尿病性血管疾病、外周动脉疾病和溃疡；促进心脏组织血管密度的能力将有助于治疗冠状动脉疾病和心脏病；促进脑组织血管密度的能力将有助于治疗血管性痴呆；促进肺组织血管密度的能力将有助于治疗肺病，如COPD和肺动脉高压；促进骨骼肌血管密度的能力将有助于治疗肌肉减少症和虚弱；促进大脑血管密度和/或血流的能力将有助于治疗神经退行性疾病，如血管性痴呆，以及其他脑部疾病，如中风和出血；促进骨中血管密度和/或血流的能力将有助于治疗骨质疏松症。
在一个方面，提供了治疗或预防冠状动脉和/或外周动脉疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了治疗或预防冠状动脉和/或外周动脉疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
在一个方面，提供了治疗或预防局部缺血的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了治疗或预防受试者局部缺血的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
在一个方面，提供了治疗或预防溃疡的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了治疗或预防受试者溃疡的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
在一个方面，提供了治疗或预防受试者肺部病症的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了治疗或预防受试者肺部病症的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
在一个实施方式中，肺部病症是肺病，例如COPD。
在一个实施方式中，肺部病症是肺动脉高压。
在一个方面，提供了治疗或预防虚弱的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了治疗或预防虚弱的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
虚弱(frailty)是一种通常与衰老相关的病况，其与健康状况不佳的风险增加有关。虚弱的表现组成包括肌肉减少症和肌肉无力。
在一个方面，提供了治疗或预防肌肉减少症的方法，包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了治疗或预防受试者的方法，包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
在一个实施方式中，肌肉减少症是零重力肌肉减少症，通常由太空旅行产生。
在一个实施方式中，肌肉减少症是与年龄相关的肌肉减少症。
在一个方面，提供了增加行动不便的受试者的血管密度或运动能力的方法，包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了一种增加行动不便的受试者的血管密度或运动能力的方法，包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
行动不便的受试者可能具有一个或多个身体部位的行动不便。由于一个或多个身体部位的行动不便，行动不便的受试者易受肌肉减少症、虚弱和/或运动能力降低的影响。行动不便的受试者的实例包括四肢瘫痪、截瘫、肌萎缩侧索硬化症患者、需要长期卧床的受试者、诸如骨折等受伤后的肢体活动受限的受试者、老年受试者和具有久坐生活方式的受试者。
在一个方面，提供了治疗或预防神经变性疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了治疗或预防神经变性疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
在一个实施方式中，神经变性疾病是血管性痴呆。
在一个方面，提供了治疗或预防中风的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了治疗或预防中风的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
在一个方面，提供了治疗或预防出血的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了治疗或预防出血的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
在一个方面，提供了治疗或预防心脏病的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了治疗或预防心脏病的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
在一个方面，提供了治疗或预防血管疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了治疗或预防血管疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
在一个实施方式中，血管疾病是糖尿病性血管疾病。
在一个方面，提供了增强受试者诸如运动员、休闲运动人员、军事人员或执法人员的体能的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了增强受试者诸如运动员、休闲运动人员、军事人员或执法人员的体能的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
在一个方面，提供了增强物理疗法益处的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了增强物理疗法益处的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
在一个方面，提供了增加肉产量例如保持在固定条件下的动物肉产量的方法，其包括向动物施用有效量的增加动物内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了增加肉产量例如保持在固定条件下的动物肉产量的方法，包括向动物施用有效量的NAD+前体。
在一个方面，提供了增强血液流向受试者皮肤的方法，例如，以改善皮肤外观用于美容用途，包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了增强血液流向受试者皮肤的方法，例如，以改善皮肤外观用于美容用途，包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
通常，提高的流向皮肤的血流量是提高的皮肤和皮下血流量。
在一个方面，提供了增强受试者运动效果的方法，包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了增强受试者运动效果的方法，包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
如实施例中所述，NAD+前体NMN的施用促进缺血组织中血管生长和血流量。
因此，在一个方面，提供了增加受试者缺血组织中血管密度和/或血流量的方法，其包括施用有效量的提高内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。通常，该试剂是NAD+激动剂。通常，该试剂是NAD+前体。
在一个方面，提供了增加受试者缺血组织中血管密度和/或血流量的方法，其包括施用有效量的NAD+前体。
在一个方面，提供了改善受试者在受伤或失去移动能力后血管恢复的方法，其包括向受试者施用有效量的增强受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了改善受试者在受伤或失去移动能力后血管恢复的方法，包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
在一个方面，提供了一种在长时间零重力之后(例如在太空旅行之后)改善受试者的体能的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了一种在长时间零重力之后(例如在太空旅行之后)改善受试者的体能的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
由于本文所述的试剂促进血管密度和血流量，本发明人设想施用本文所述的试剂将有助于增强肝脏中代谢副产物和毒素的交换。因此，在一个方面，提供了增强肝窦内皮细胞功能的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了增强肝窦内皮细胞功能的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
发明人设想随着向组织提供更多血液，受试者的活力或活动水平将增加。因此，发明人设想增加受试者的血管密度、血流量和/或运动能力将增加其活力。这种活力的增加不仅对老年人而且对老年宠物如狗、猫、马等都很重要。
因此，在一个方面，提供了增加老年受试者活力的方法，其包括向受试者施用有效量的增强受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了增加老年受试者活力的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+激动剂。
在一个方面，提供了增加老年受试者活力的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
在一个实施方式中，受试者是动物。在一个实施方式中，动物是伴侣动物，例如宠物。
如本文所用，活力(vitality)是指参与活动包括身体活动、心理活动和进食的意愿和能力。
活力的增加有助于减少动物的以下症状：老年动物中的缺乏协调、极度疲劳和嗜睡、食欲不振、现有病症例如绝症的劣化或恶化、伤口愈合缓慢和与年龄有关的疾病的发病。
因此，在各个方面，提供了减少老年受试者中的以下情形的方法：
(a)缺乏协调；
(b)极度疲劳和嗜睡；
(c)食欲不振；
(d)已有病况变差或恶化；
(e)伤口愈合缓慢；或
(f)与年龄有关的疾病的发病，
该方法包括向受试者施用有效量的增强受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。在一个实施方式中，老年受试者是伴侣动物。在一个实施方式中，伴侣动物是狗。
在各个实施方式中，提供了减少老年受试者中的以下情形的方法：
(a)缺乏协调；
(b)极度疲劳和嗜睡；
(c)食欲不振；
(d)已有病况变差或恶化；
(e)伤口愈合缓慢；或
(f)与年龄有关的疾病的发病，
该方法包括向受试者施用有效量的NAD+激动剂。在一个实施方式中，老年受试者是伴侣动物。在一个实施方式中，伴侣动物是狗。
在各个实施方式中，提供了减少老年受试者中的以下情形的方法：
(a)缺乏协调；
(b)极度疲劳和嗜睡；
(c)食欲不振；
(d)已有病况变差或恶化；
(e)伤口愈合缓慢；或
(f)与年龄有关的疾病的发病，
该方法包括向受试者施用有效量的NAD+前体。在一个实施方式中，老年受试者是伴侣动物。在一个实施方式中，伴侣动物是狗。
如实施例中所述，与不进行运动而施用仅NMN或NMN和硫氢化钠的小鼠的血管密度和运动能力的增加相比，当对小鼠施用仅NMN、或NMN和硫氢化钠、或NMN和GYY4137并结合运动时，小鼠表现出的血管密度和运动能力的增加更大。因此，本发明人设想，提高SIRT1活性或表达的试剂的施用可以增强训练中和/或需要增强体能的受试者，例如运动员、军队或执法人员、宇航员和竞赛动物的体能。
因此，在一个方面，提供了一种增强受试者(例如竞赛动物、运动员、军队或执法人员或宇航员)的体能的方法，其包括向受试者施用有效量的增加受试者组织内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了增强受试者(例如竞赛动物、运动员、军队或执法人员或宇航员)的体能的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+前体。受试者可以是寻求增强运动能力的任何动物。在一个实施方式中，受试者是寻求增强的运动能力的人。在一个实施方式中，受试者是运动员或休闲运动者。在另一个实施方式中，受试者是寻求体能改善的军人或执法人员。在另一个实施例中，受试者是宇航员，其在长时间零重力空间旅行之后将易受体能降低的影响。
在一个实施方式中，受试者是竞赛动物。竞赛动物可以是寻求增强运动能力的任何动物。在一个实施方式中，竞赛动物选自马和狗。竞赛动物的实例包括赛马、赛狗(greyhound)。
在一个方面，提供了增加受试者组织中血管密度和/或血流量的方法，包括：(a)使受试者在运动训练期间接受运动训练；(b)在运动训练期之前和/或期间向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了增加受试者组织中血管密度和/或血流量的方法，包括：(a)使受试者在运动训练期间接受运动训练；(b)在运动训练期之前和/或期间向受试者施用有效量的NAD+前体。
相对于运动训练后而不施用NAD+前体的组织的血管密度和血流量，该方法增加了受试者组织中的血管密度和/或血流量。
在运动训练期间进行运动训练。运动训练期是足以允许在运动训练期间定期进行运动训练以增加血管密度和/或血流量的一段时间。应当理解，运动训练期将根据各种因素而变化，包括受试者的物种、受试者的饮食、性别和状况。例如，健康人的运动训练期可以是1周至1年，1周至6个月，或1个月至6个月，或2周至5个月，或1周至4个月，或1周至3个月，或1周至2个月，或1周至1个月。运动训练期间的运动训练可以是在运动训练期间定期进行的任何运动。通常，运动训练的类型是增加健康年轻受试者的血管密度和流向组织的血流量的训练(例如耐力训练)。
在运动训练期之前和/或期间施用试剂。在这方面，可以在运动训练期开始之前立即施用试剂，和/或可以在运动训练期的过程中以一个或多个剂量施用试剂。
在一些实施方式中，施用试剂并结合运动训练以治疗需要在运动训练中工作的肌肉血管形成的病症。例如，可以施用该试剂于受试者并结合运动训练以治疗血管疾病。
因此，一个方面提供了治疗受试者的血管疾病的方法，其包括：(a)使受试者在运动训练期间接受运动训练；和(b)在运动训练期之前和/或期间向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了治疗受试者的血管疾病的方法，其包括：(a)使受试者在运动训练期间接受运动训练；和(b)在运动训练期之前和/或期间向受试者施用有效量的NAD+前体。
如实施例中所述，用仅NMN、或NMN和硫氢化钠、或NMN和GYY4137治疗小鼠导致运动能力增加，包括耐力增加。因此，在一个方面，提供了提高受试者耐力的方法，其包括向受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
在一个方面，提供了提高受试者耐力的方法，其包括向受试者施用有效量的NAD+前体。
在各个实施方式中，提供了一种方法，其在受试者中：
(a)增加受试者肌肉组织中的血管密度；
(b)增加受试者运动能力；
(c)促进受试者组织中的血管生成和/或新血管形成；
(d)治疗或预防受试者的冠状动脉和/或外周动脉疾病；
(e)治疗或预防受试者的局部缺血；
(f)治疗或预防受试者的溃疡；
(g)治疗或预防受试者的肺部疾病；
(h)治疗或预防受试者的肺动脉高压；
(i)治疗或预防受试者虚弱；
(j)治疗或预防受试者的肌肉减少症；
(k)增加行动不便受试者的受试者血管密度或运动能力；
(l)治疗或预防受试者的心脏病；
(m)治疗或预防受试者的糖尿病性血管疾病；
(n)增强受试者的肝窦内皮细胞功能；
(o)提高受试者中受试者的体能；
(p)提高受试者的耐力；
(q)提高竞赛动物的表现；
(r)增强受试者中受试者的运动效果；
(s)改善受试者在受伤或失去移动能力后血管恢复；
(t)增加受试者中受试者物理疗法的益处；
(u)增强血液流向受试者眼睛；
(v)增强受试者的皮肤外观；
(w)提高动物肉产量；
(x)治疗或预防神经退行性疾病(如血管性痴呆)；
(y)治疗或预防中风；
(z)治疗或预防出血；
(aa)治疗或预防骨质疏松症；
(bb)增加活力；
该方法包括向受试者施用有效量的NAD+激动剂和H2S前体。在各个实施方式中，提供了一种方法，其在受试者中：
(a)增加受试者肌肉组织中的血管密度；
(b)增加受试者运动能力；
(c)促进受试者组织中的血管生成和/或新血管形成；
(d)治疗或预防受试者的冠状动脉和/或外周动脉疾病；
(e)治疗或预防受试者的局部缺血；
(f)治疗或预防受试者的溃疡；
(g)治疗或预防受试者的肺部疾病；
(h)治疗或预防受试者的肺动脉高压；
(i)治疗或预防受试者虚弱；
(j)治疗或预防受试者的肌肉减少症；
(k)增加行动不便受试者的受试者血管密度或运动能力；
(l)治疗或预防受试者的心脏病；
(m)治疗或预防受试者的糖尿病性血管疾病；
(n)增强受试者的肝窦内皮细胞功能；
(o)提高受试者中受试者的体能；
(p)提高受试者的耐力；
(q)提高竞赛动物的表现；
(r)增强受试者中受试者的运动效果；
(s)改善受试者在受伤或失去移动能力后血管恢复；
(t)增加受试者中受试者物理疗法的益处；
(u)增强血液流向受试者眼睛；
(v)增强受试者的皮肤外观；
(w)提高动物肉产量；
(x)治疗或预防神经退行性疾病(如血管性痴呆)；
(y)治疗或预防中风；
(z)治疗或预防出血；
(aa)治疗或预防骨质疏松症；
(bb)增加活力；
该方法包括向受试者施用有效量的NAD+前体和H2S前体。
在各个实施方式中，NAD+前体是：
(a)NMN或其药学上可接受的盐、衍生物或前药；
(b)NR或其药学上可接受的盐、衍生物或前药；
(c)NAAD或其药学上可接受的盐、衍生物或前药；
(d)NaR或其药学上可接受的盐、衍生物或前药；
(e)烟酸(niacin)、烟酸的酯衍生物，或其药学上可接受的盐、衍生物或
前药；
(f)NaMN或其药学上可接受的盐、衍生物或前药；或
(g)PPRP或其药学上可接受的盐、衍生物或前药。
如本文所用，“治疗”是指影响受试者、组织或细胞以获得所需的药理学和/或生理学效果，并包括抑制病症，即阻止其发展；或缓解或改善病症的影响，即引起病症影响的逆转或消退。如本文所用，“预防”意指防止病症发生在可能有患病风险的细胞或受试者中，但不一定意味着病症最终不会发展，或受试者最终不会生出病症。预防包括延迟细胞或受试者中病症的发作。
术语“有效量”是指研究人员、兽医、医生或其他临床医生正在寻求的引起组织、系统、动物或人的生物或医学反应的化合物的量。因此，提及施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂是指有效提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂的量。
提高SIRT1活性或表达的试剂，例如NAD+激动剂，可以作为包含试剂和药学上可接受的载剂的药物组合物进行施用。“药学上可接受的载剂”是与组合物的其他成分相容并且对受试者无害的载体。组合物可以含有如下所述的其它治疗剂，并且可以根据诸如药物制剂领域公知的技术(参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,2005,Lippincott Williams&Wilkins)，例如通过使用常规的固体或液体载体或稀释剂，以及适合于所需施用方式的类型的药物添加剂(例如赋形剂、粘合剂、防腐剂、稳定剂、调味剂等)来配制。
在一些实施方式中，载体是合成的(非天然存在的)载体。
提高SIRT1活性或表达的试剂可以通过任何允许试剂提高受试者组织内皮细胞中SIRT1活性或表达的方式进行施用。在试剂是NAD+激动剂的实施方式中，试剂可以口服施用，例如以片剂、胶囊、颗粒或粉末的形式；舌下施用；经脸颊施用；肠胃外施用，例如通过皮下、静脉内、肌肉内、皮内(经皮)、腹膜内或脑池内注射或输注技术(例如，作为无菌可注射水性或非水性溶液或悬浮液)；经鼻施用，例如吸入喷雾或吹气；在含有无毒、药学上可接受的载剂或稀释剂的剂量单位制剂中。例如，试剂可以以适于立即释放或缓释的形式进行施用。通过使用包含所述试剂的合适药物组合物可以实现立即释放或缓释。通常，口服施用提高SIRT1活性或表达的试剂。
用于施用的药物组合物可以方便地以剂量单位形式提供，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。这些方法通常包括使试剂与构成一种或多种辅助成分的载体相结合的步骤。通常，通过将化合物与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后，如果需要，将产物成型为所需的制剂，从而制备药物组合物。在药物组合物中，活性化合物的含量足以产生所需效果。如本文所用，术语“组合物”旨在涵盖包含特定量的特定成分的产品，以及直接或间接由特定量的特定成分的组合产生的任何产品。
药物组合物可以是适于口服使用的形式，例如片剂、含片剂(troche)、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳液、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。用于口服的组合物可以根据本领域已知的任何制备药物组合物的方法制备，并且这种组合物可以含有一种或多种试剂，例如甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以提供药学上稳定和适口的制剂。含有一种或多种NAD+激动剂的片剂可以与适用于制备片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂混合制备。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶，和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的，或者可以通过已知技术包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在较长时间内提供持续作用。例如，可以使用延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它们也可以被包衣以形成用于控制释放的渗透性治疗片剂。
口服使用的制剂也可以作为硬明胶胶囊提供，其中将提高SIRT1活性或表达的试剂与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土相混合；或者作为软明胶胶囊提供，其中试剂与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油相混合。
水性悬浮液含有活性物质与适于制备水性悬浮液的赋形剂的混合物。这些赋形剂是：悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，其可以是天然存在的磷脂(例如卵磷脂)，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，或者环氧乙烷与长链脂肪醇(例如十七烷氧基乙醇)的缩合产物，或者环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯(例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯的缩合产物)，或者环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯(例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯的缩合产物)。含水悬浮液还可含有一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，和一种或多种甜味剂(例如蔗糖或糖精)。
可以通过将提高SIRT1活性或表达的试剂悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如液体石蜡)中来配制油性悬浮液。油性悬浮液可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可加入如上所述的甜味剂和调味剂以提供适口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂如抗坏血酸来保存。
适于通过加入水制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒使化合物与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂的实例有上文已经提到的那些。还可以存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
药物组合物也可以是水包油乳液的形式。油相可以是植物油(例如橄榄油或花生油)或矿物油(例如液体石蜡)或这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶例如阿拉伯树胶或黄蓍胶)、天然存在的磷脂(例如大豆、卵磷脂)以及衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如脱水山梨糖醇单油酸酯)以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。乳液还可含有甜味剂和调味剂。
糖浆和酏剂可以用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖来配制。此类制剂还可含有缓和剂、防腐剂和调味剂和着色剂。
药物组合物可以是无菌可注射水性或油性悬浮液的形式。该悬浮液可以根据已知技术使用上面提到的那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的载剂和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，如油酸等脂肪酸可用于制备可注射制剂。
提高SIRT1活性或表达的试剂也可以脂质体的形式施用。如本领域所知，脂质体通常衍生自磷脂或其他脂质物质。脂质体由分散在水性介质中的单层或多层水合液晶形成。可以使用能够形成脂质体的任何无毒的、生理学上可接受的和可代谢的脂质。除本发明化合物外，脂质体形式的本发明组合物还可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质是(天然的和合成的)磷脂和磷脂酰胆碱。形成脂质体的方法是本领域已知的。
提高SIRT1活性或表达的试剂也可以以结晶NAD+前体的形式施用，以获得优异的稳定性和纯度。
在各个实施方式中，提供了药物组合物，其包含：
(a)NMN或其药学上可接受的盐；
(b)NR或其药学上可接受的盐；
(c)NAAD或其药学上可接受的盐；
(d)NaMN或其药学上可接受的盐；
(e)NaR或其药学上可接受的盐；
(f)NMN或其药学上可接受的盐和硫氢化钠或其药学上可接受的盐；
(g)NMN或其药学上可接受的盐和GYY4137或其药学上可接受的盐；
(h)NR或其药学上可接受的盐和硫氢化钠或其药学上可接受的盐；
(i)NR或其药学上可接受的盐和GYY4137或其药学上可接受的盐；
(j)NAAD或其药学上可接受的盐和硫氢化钠或其药学上可接受的盐；
(k)NAAD或其药学上可接受的盐和GYY4137或其药学上可接受的盐；
(l)NaMN或其药学上可接受的盐和硫氢化钠或其药学上可接受的盐；
(m)NaMN或其药学上可接受的盐和GYY4137或其药学上可接受的盐；
(n)NaR或其药学上可接受的盐和硫氢化钠或其药学上可接受的盐；或
(o)NaR或其药学上可接受的盐和GYY4137或其药学上可接受的盐。
另一个方面提供了运动模拟物，其包含NAD+激动剂和任选的H2S前体。
另一个方面提供了一种运动模拟物，其包含NAD+前体和任选的H2S前体。
如本文所用，“运动模拟物(exercise mimetic)”是模拟与运动相关的一种或多种生理效应的试剂。
应当理解，任何特定受试者的具体剂量水平和剂量频率可以变化，并且取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用方式和时间、排泄速率、药物组合和特定病症的严重程度。
还提供了制品和试剂盒，其包含含有NAD+激动剂的容器。容器可以简单地是包含口服剂型的NAD+激动剂的瓶，每个剂型包含单位剂量的NAD+激动剂。例如，芹菜素的量为例如约100mg至750mg，或NMN的量为约100mg至750mg，NaHS的量为约100mg至750mg。该试剂盒还包括印刷的说明书。制品将包括标签等，表明根据本方法对受试者的治疗。在一种形式中，制品可以是包含局部剂量形式的NAD+激动剂的容器。例如，NAD+激动剂可以是例如管或瓶等一次性容器中的乳膏形式。
发明人还设想在某些情况下，降低血管密度可能是有利的，例如在需要白度的肉类中，例如小牛肉(veal)。
因此，一个方面，提供了增加小牛肉白度的方法，包括向动物施用有效量的降低NAD+或SIRT1活性或SIRT1蛋白水平的试剂。
如本文所使用的，除非上下文由于明确的语言或必要的含义而另外要求，否则词语“包括”或诸如“包含”或“含有”的变体在本发明的各种实施例中以包含性的含义使用，即指定所陈述的特征的存在但不排除存在或添加其他特征。
本说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。本领域技术人员将理解，在不脱离广泛描述的本发明的主旨或范围的情况下，可以对具体实施方式中所示的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本发明的实施例在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。
提供以下非限制性实施例来举例说明本发明的性质以使其可以被更清楚地理解。
实施例
在这项研究中，我们测试了内皮细胞中SIRT1的下降是否是肌肉中的血流和耐力随年龄减少的主要原因，以及衰老的这种影响是否可以逆转。
实验步骤
小鼠和饮用水补充
先前描述了SIRT1-iKO、SIRT1-Tg和SIRT1STOP小鼠(Firestein等，2008,PLoS One3,e2020；Price等，2012,Cell Metab 15,675-690)。Tie2Cre和Sirt1flox/flox小鼠购自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)。MCK-PGC-1α和MyogCre小鼠分别由BruceSpiegelman博士(Dana Farber Cancer Center,MA)和Eric N.Olson博士(UTSouthwestern,Dallas,TX)惠赠。mT-STOPflox/flox,Gfp小鼠由EOW内部产生，其由普遍存在的肌动蛋白B启动子驱动的等位基因组成，其具有loxP位点位于膜靶向串联二聚体TOMATO(mT)和转录终止盒的侧翼序列，随后是GFP编码序列。用于NMN和NaHS实验的野生型C57Bl/6J小鼠购自Australian BioResources(Moss Vale,NSW)。如前所述(Price等，2012)，将SIRT1-iKO小鼠喂食他莫昔芬(360mg/kg)饮食五周以引发全身SIRT1外显子4切除。在饮用水中施用NMN(400mg/kg,Bontac Bio-Engineering,中国)和NaHS(20mg/kg，Sigma)和/或GYY4137(20mg/kg/天，Cayman Chemical)。NMN储备液每周更换两次，NaHS/GYY4137每天进行补充。通过食物施用阿西替尼(30mg/kg/天)并每日更换。
给小鼠喂食标准啮齿动物食物并在12小时光照/12小时黑暗循环下饲养，在上午7点开灯，并在晚上7点关灯。所有实验均按照UNSW动物护理和伦理委员会(University ofNew South Wales,Sydney,澳大利亚)、麻省理工学院动物护理委员会(MassachusettsInstitute of Technology,Cambridge,MA)和机构动物护理和使用委员会(Beth IsraelDeaconess Medical Center and Harvard Center for Comparative Medicine,Boston,MA)批准的程序进行。
慢病毒的眼窝后施用
通过超速离心(cite)浓缩慢病毒颗粒，并通过(cite试剂盒)测定病毒滴度，并通过眼眶后注射将携带SIRT1或NT miRNA的慢病毒颗粒以1×1010TU/小鼠注射至20月龄WTC57BL/6J小鼠(NIA)。两天后，小鼠在两只眼睛后交替连续两次注射。最后一次注射后10天，将小鼠分配到不同的治疗组。
葡萄糖、乳酸、VEGF和肌酐测量
将小鼠禁食6小时并通过尾部出血测量血糖水平(Accu Check Performa,Roche)。通过尾部采血(Accutrend Plus,Roche)在跑步机运动训练之前和以15米/分钟跑20分钟之后立即测量血乳酸。对于VEGF分析，在短暂的异氟烷麻醉下从眶后窦抽取全血。收集血清并通过ELISA(Eve Technologies,Canada)测定VEGF表达。在禁食2小时后收集尿液，并使用比色测定试剂盒(Cayman chemical,US)按照制造商的方案分析肌酸酐水平。
跑步机和转棒仪测试
耐力测试。跑步机测试在1050-RM Exer 3/6开放跑步机(Columbus Instruments,OH)上进行。在耐力测试之前使小鼠适应跑步机系统3天，以10米/分钟至15米/分钟的速度运行20分钟。在低强度耐久性测试中，速度以5米/分钟开始，持续5分钟(热身)，然后速度每分钟增加1米/分钟直到21米/分钟并保持恒定。在高强度耐久性测试中，速度以13米/分钟开始，在5°斜度下进行5分钟(热身)，然后速度每分钟增加1米/分钟直到20米/分钟并保持恒定20分钟。每20分钟，速度增加5米/分钟并保持恒定20分钟。当小鼠坐在震动板上超过10秒而没有尝试重新开始跑步时，它们被认为是力竭。
运动训练
通过以10米/分钟的速度运行20分钟，使小鼠在运动训练开始前适应跑步机系统3天。然后使成功适应的动物在5°斜度以15米/分钟至20米/分钟的速度奔跑30分钟，每天一次，持续一个月。
转棒仪试验
使用如前所述的转棒仪测试评估运动协调性(Mersmann等，2011,Plos One 6,e20336)。简而言之，使小鼠在装置(Ugo Basile,Comerio,意大利)中适应3天，在3次试验中以5rpm的恒定速度持续2分钟。在第4天，在加速辊上对动物进行三次试验(4分钟内45rpm至40rpm)并记录小鼠保持的时间。
后肢缺血
根据公开的方案(Limbourg等，2009,Nat Protoc 4,1737-1746)，使用SIRT1-iKO和WT小鼠在后肢缺血的鼠模型中评估NMN在缺血诱导的血管形成中的作用。在股动脉结扎前一周开始通过饮用水用NMN(500mg/kg/天)处理动物，并持续至实验结束。在手术后20天，使用对比增强超声成像测量缺血肢体中的血流量。
体内成像
光声成像。使用MSOT inVision 256-TF小动物成像系统(iThera Medical GmbH,Munich,德国)(Morscher等，2014,Photoacoustics 2,103-110)。用异氟烷(1.5％-2％，500ml O2/min)麻醉小鼠，并使用脱毛膏将胸部以下的身体部分脱掉。然后将动物水平放置在成像室中，并按照制造商的方案进行下部的三维扫描。简而言之，由Nd:YAG激光器泵浦的可调谐光学参量振荡器(OPO)提供激发脉冲，持续时间为9ns，波长为680nm至980nm，重复频率为10Hz，波长调谐速度为10ms，在730nm处的峰值脉冲能量为100mJ。纤维束的十个臂提供均匀照射的环形光带约为8mm宽。对于超声检测，使用256个环形聚焦超声换能器，其中心频率为5MHz(带宽为60％)，排列成270°角度覆盖的凹阵列和4cm的曲率半径。
对比增强超声
用异氟烷(1.5％-2％，500ml O2/min)麻醉小鼠，使用脱毛膏对后肢脱毛，并将27号导管置入每只小鼠的尾部并用手术胶带保持在适当位置。将每只小鼠置于加热至38℃的平台上的仰卧位置，每只爪子贴在表面电极上以监测ECG、心率和呼吸速率。以18MHz的成像频率进行对比增强超声(CEU)(Vevo 2100,Visualsonics,加拿大)。将探针放置在腿的内侧以使下肢在矢状平面中成像。根据制造商的说明通过尾静脉导管注射微泡(VevoMicroMarker,加拿大)。以20帧/秒的帧速率记录电影回放(cine loop)，总共1,000帧。曲线拟合分析用于测量随时间的回波功率。最大和最小视频强度的差异被确定为峰值增强，并且是用于确定肌肉灌注的变量。
心脏超声检查。如前所述(Respress and Wehrens,2010)，使用Vevo 2100系统(Visualsonics)获取胸骨旁短轴M模式图像。用1-2％异氟烷麻醉小鼠，并且对于所有测量，心率保持在450和500次/分钟之间。
代谢测量和身体成分
使用代谢室(CLAMSTM,Columbus Instruments,Columbus,OH)进行代谢功能的全身测量。在适应代谢室后，在48小时内连续监测单独饲养的小鼠以确定氧消耗、二氧化碳产生、呼吸交换比、能量消耗、食物摄取、水摄入和活动。通过EchoMRI(Echo MRITM 900)测量身体组成(脂肪量、瘦体重和总身体水)。
分析肌肉中的CD31+细胞：解剖骨骼肌，然后用胶原酶/分散酶消化并通过40微米过滤器过滤。将细胞悬浮液与APC缀合的抗小鼠CD31抗体(Biolegend)一起温育，并通过流式细胞术(BD LSR II,BD Biosciences)进行分析。
透化纤维呼吸
根据公开的方案并进行一些修改来制备透化纤维(Kuznetsov等，2008,NatProtoc 3,965-976)。简而言之，将比目鱼肌和趾长伸肌(EDL)肌肉以肌腱至肌腱解剖到冰冷的分离缓冲液A中(Kuznetsov等，2008,Nat Protoc 3,965-976)并立即制备纤维用于高分辨率呼吸测量。将纤维束(约3mg湿重)用皂苷50μg/ml在40℃处理20分钟，随后在冷呼吸介质B中洗涤(0.5mM EGTA，3mM MgCl2·6H2O，20mM牛磺酸，10mM KH2PO4，20mM HEPES，0.1％BSA，15mM乳糖酸钾，110mM甘露醇，0.3mM二硫苏糖醇，pH7.1)。根据已公布的方案(Kuznetsov等，2008,Nat Protoc 3,965-976)，在37℃在呼吸介质B中在克拉克型电极(Rank Brothers Ltd,Cambridge,英国)上原位分析线粒体呼吸链功能，依次加入10mM谷氨酸盐和5mM苹果酸盐，2mM ADP，0.5μM鱼藤酮，10mM琥珀酸盐，5μM抗霉素A，0.5mM N,N,N’,N’-四甲基-对苯二胺二盐酸盐(TMPD)和2mM抗坏血酸，10μM细胞色素c。极谱法后回收纤维，结果表示为每毫克湿重每分钟纳摩尔氧。通过细胞色素c释放测试验证线粒体膜完整性。
酶活性测定
将四头肌肌肉在50mM Tris-HCl，1mM EDTA，0.1％Triton X-100，pH 7.4中以1:19(w/v)匀浆。将匀浆进行三次冻融循环，并在4℃以7,000g离心10分钟。如前所述(Turner等，2009,Diabetes 58,2547-2554)，使用上清液测定柠檬酸合酶(CS)和琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性。根据公开的方案(Ross,2011,J Vis Exp,e3266)进行肌肉切片的细胞色素c氧化酶染色。简言之，将20μl股四头肌低温恒温切片与细胞色素c(0.1mM,Sigma)、过氧化氢酶(2μg/mL,Sigma)和3,3'-二氨基联苯胺(DAB,0.05％,Sigma)在PBS中在37℃温育40分钟。将载玻片通过乙醇脱水，在二甲苯中澄清，然后用DPX(Grale HDS)固定。
NAD+测量
根据制造商的说明书，使用市售试剂盒(NAD-NADH Glo,Promega)在EC和肌肉匀浆中测量NAD+和NADH水平的水平。或者，通过内部开发的方法测定肌肉和肝脏中的NAD+水平(Uddin等，2016,Front Pharmacol 7,258)。简言之，将肝脏和腓肠肌样品在提取缓冲液(10mM Tris-HCl，0.5％TritonX-100，10mM烟酰胺，pH7.4)中匀浆，然后离心(12,000×g，4℃，5分钟)，之后取一份上清液用于蛋白质定量。在苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿萃取后，将上清液分成两等份。一个用于测量总NAD。将另一等分试样用HCl酸化，然后在冰上用NaOH中和以定量NAD+。将样品在96孔板中混合，在室温下将样品与醇脱氢酶(ADH)混合。使用Bio-Rad Imark酶标仪定量总NADH和NAD+。
细胞培养、RNAi敲低和腺病毒感染
汇集的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人主动脉内皮细胞(HAEC)购自澳大利亚的Lonza，并在37℃、含5％CO2的潮湿气氛中在EGM-2(Lonza，澳大利亚)中生长，所述EGM-2含有血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)、氢化可的松、肝素、硫酸庆大霉素两性霉素、1％抗坏血酸和2％胎牛血清(FBS)。MS1细胞(ATCC)在补充有10％FBS、100IU/mL青霉素和100mg/mL链霉素的高葡萄糖DMEM中于37℃在具有5％CO2的潮湿培养箱中生长。根据公开的方案(van Beijnum等，2008,Nat Protoc 3,1085-1091)进行修改并使用EasySep选择试剂盒(Stem CellTechnologies)分离并纯化来自肺(MLEC)和肌肉的原代小鼠EC。将EC在EGM-2培养基(Lonza)中于37℃用3％O2和5％CO2培养。C2C12和HEK293T细胞在补充有10％FBS的DMEM(Life Technologies)中于37℃，5％CO2下生长。将用表达PGC-1α的腺病毒转染的C2C12成肌细胞分化成肌管，然后收集条件培养基(CM)48小时。
按照制造商的方案，使用Dharmafect 4(GE Dharmacon)，用SIRT1 siRNA(L-003540-00-0005,GE Dharmacon)和非靶向乱序(Scr)siRNA(D-001810-01-05,GEDharmacon)转染HUVEC和HAEC。使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)，用靶向鼠SIRT1的esiRNA(000411，Sigma-Aldrich)转染MS1细胞。根据制造商的方案，用SIRT1或GFP腺病毒(ABM Inc.，加拿大)感染HUVEC。转染后48小时，将细胞用于测定。
为了沉默SIRT1、SIRT3和SIRT6表达，按照制造商的方案使用Dharmafect 4转染试剂用经验证的siRNA双链体池(ON-Targetplus SMART pool,Dharmacon)转染EC。ON-TARGETplus非靶向对照(NT)siRNA用作阴性对照。如前所述使用pLKO.1shRNA实现SIRT1沉默(Gomes等，2013,Cell 155,1624-1638)。将编码乱序shRNA的pLKO.1用作阴性对照。表达人SIRT1或GFP的腺病毒购自Abmgood Inc.，并根据制造商的方案转导EC。
EC的Dll4和VEGF刺激。将待刺激的EC血清饥饿过夜并转移至含有VEGF(50ng/mL)的培养基或转移至涂有Dll4的平板，然后温育指定的时间。如前所述进行Dll4涂覆(Guarani等，2011,Nature 473,234-238)。将冻干的重组Dll4(R&D Systems)在含有0.1％牛血清白蛋白的PBS中重建。将培养皿用0.1％明胶溶液中的Dll4(0.5μg/mL)在37℃包被1小时。
慢病毒miRNA载体的构建
如所述构建表达NT或SIRT1 miRNA的慢病毒(Zhang等，2013,FASEB J 27,4041-4058)。Lenti-VE-Cad miRNA质粒由Dr.Patty J.Lee(Yale University)惠赠。使用BLOCK-iT RNAi设计工具(Invitrogen)设计靶向小鼠SIRT1开放阅读框(GenBank登录号NM_019812.3)的pre-miRNA序列。将对应于miRNA的寡核苷酸退火并根据制造商的说明书连接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体(Invitrogen)中。pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg对照质粒用作对照。使用引物(正义：5'-AGGCGCGCCTGGCTAACTAGAGAAC-3'；反义：5'-GAATTCTATCTCGAGTGCGGC-3')通过聚合酶链式反应(PCR)扩增携带EmGFP和miRNA序列的片段。用AscI和EcoRI消化扩增的片段，然后插入Lenti-VE-Cad miRNA质粒的AscI和EcoRI位点以产生表达NT或SIRT1 miRNA的慢病毒质粒。所有限制性内切核酸酶均购自New EnglandBiolabs。
慢病毒生产
根据Addgene描述的方案产生慢病毒颗粒。简言之，使用FuGENE HD转染试剂(Promega)将psPAX2(由Didier Trono惠赠，Addgene质粒#12260)，pMD2.G(由Didier Trono惠赠，Addgene质粒#12259)和载体质粒共转染到293T细胞中。在转染后48小时，收获病毒并通过超速离心在PBS中浓缩至约1×1012转导单位(TU)/mL。慢病毒滴定试剂盒购自TakaraBio Inc.并根据制造商说明书进行使用。
细胞增殖测定
将EC(0.1×105个细胞)接种在48孔板中，并与PBS(载体)或NMN(500μM)在完全生长培养基中温育48小时。在温育时间结束时，收获细胞并重悬于Opti-MEM培养基中。使用流式细胞术(FACSCanto II Analyzer,BD Biosciences,美国)测定细胞数。
管形成测定
如前所述评估管网的形成(Borradaile and Pickering,2009,Aging Cell 8,100-112)。将EC以每孔10,000个细胞接种在涂有150μL Cultrex还原生长因子基底膜提取物(Trevigen)的24孔板(Corning)中。向细胞补充含有VEGF(30ng/mL)或FGF(30ng/mL)的C2C12CM或EBM-2培养基。无论何处提及该培养基，其均添加有NMN(0.5mM)和NaHS(0.1mM)。温育18小时后，通过光学显微镜(Nikon Eclipse TiE)分析所得的管网。对于使用H2O2处理的管形成测定，在接种前将细胞与150μM H2O2一起温育1小时，然后在10小时温育后成像。通过ImageJ软件量化分支点的数量和小管网络的总长度。
球状体测定
如前所述产生EC球状体(Korff和Augustin,1998,J Cell Biol 143,1341-1352)。将EC(每个球状体1000个细胞)悬浮在含有20％甲基纤维素(粘度：4000cps，Sigma)的EGM-2培养基中，并接种在非粘附的圆底96孔板(Sigma)中。在这些条件下，所有悬浮细胞都有助于形成单个球状体。在嵌入胶原凝胶中24小时后收获球状体。通过添加含有VEGF(50ng/mL)的C2C12CM或EBM-2培养基开始发芽。将NMN(0.5mM)、NaHS(0.1mM)、DAPT(20μM，CaymanChemical)或SU5416(10μM，Sigma)加入到所述的培养基中。通过测量每个球状体生长的芽长度来量化血管生成活性，每组分析8-10个球状体。
主动脉环测定
根据公开的方案进行主动脉环测定(Baker等，2012,Nat Protoc 7,89-104)。简而言之，切除来自小鼠的胸主动脉并转移至Opti-MEM培养基。在解剖显微镜下用镊子和手术刀除去所有外在的脂肪、组织和分支血管。将主动脉切成约0.5mm宽的环，通过在37℃/5％CO2下在Opti-MEM中温育来进行血清饥饿过夜。第二天，将每个主动脉环包埋在96孔板中的50μL胶原基质中，并在37℃/5％CO2下温育1小时。包埋后，通过用150μL含有FBS(2.5％)，含有或不含VEGF(30ng/mL)或FGF(30ng/mL)的Opti-MEM培养物补充环并在37℃/5％CO2温育7天，以刺激血管发芽。无论何处提及，将NMN(500μM)添加到培养基中，并且每3天更换一次。将得到的芽用BS1凝集素-FITC(Sigma)染色，并使用荧光显微镜成像。通过ImageJ软件量化源自主动脉环的芽的数量和总面积。
细胞凋亡测定
用PBS(载体)、NaHS(100μM)、NMN(500μM)或NMN+NaHS处理HUVEC 6小时，然后再暴露于H2O2(600μM)4小时。处理后，根据制造商的说明，使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒(eBioscience)测定凋亡细胞的数量。简而言之，通过胰蛋白酶消化和以1500rpm离心5分钟收集细胞，然后用冷PBS洗涤细胞沉淀两次，并将细胞沉淀重悬于1X膜联蛋白结合缓冲液中。然后，将5μL膜联蛋白-V FITC加入到195μL细胞悬浮液中，并于室温在黑暗中温育15分钟。温育后，将细胞离心，重悬浮于195μL 1X膜联蛋白结合缓冲液中，然后加入5μL碘化丙啶工作溶液。轻轻混合后，用流式细胞仪(FACSCanto II Analyzer,BD Biosciences)在530nm和575nm的发射和488nm的激发下检测荧光强度。用流式细胞仪(FACSCanto II Analyzer,BD Biosciences)在530nm和575nm的发射和488nm的激发下检测膜联蛋白-V和PI染色。
伤口划痕试验
培养EC直至形成汇合的单层，并使用200μL移液管尖端进行划痕。然后使细胞在EGM-2培养基+/-NaHS(0.1mM)和+/-NMN(0.5mM)中迁移6小时。每2小时使用明场倒置显微镜(Olympus 2467)在相同位置拍摄图像。使用ImageJ软件计算间隙闭合面积。
在一些实验中，用Scr或SIRT1 siRNA转导HUVEC并培养直至形成汇合的单层。将细胞暴露于H2O2(150μM)1小时，并使用200μL移液管尖端进行划痕。然后使细胞与PBS(载体)、NaHS(100μM)和/或NMN(500μM)在EGM-2培养基中迁移6小时。每2小时使用明场倒置显微镜(Olympus 2467)在相同位置拍摄图像。使用ImageJ软件计算间隙闭合面积。
Transwell迁移试验
如前所述进行趋化性测定(Oommen等，2011)。将EC在补充有0.2％FBS的DMEM中血清饥饿过夜，然后在已用含有0.2％FBS的DMEM在37℃预热2小时的Transwell插入物(8.0μm孔径)(Corning Life Sciences)的上部隔室中以每个插入物25,000至50,000个细胞的密度接种。在铺板细胞后30分钟，用化学引诱物培养基(含有10ng/mL VEGF和0.2％FBS的DMEM，或含有1％FBS的DMEM或从用于PGC-1α的腺病毒表达构建体转染的分化的C2C12肌管收集的条件培养基)替换下部隔室中的培养基。用含有0.2％FBS的VEGF(50ng/mL，Invitrogen)或FGF(50ng/mL，Invitrogen)的EBM-2培养基(Lonza)刺激HUEVC和HAEC。无论何处提及该化学引诱剂培养基，均添加有NMN(0.5mM,Bontac Bio-Engineering,中国)和NaHS(0.1mM，Sigma)。在18小时至24小时后测量EC向Transwell插入物下部隔室的迁移。将迁移的EC用PBS中的4％多聚甲醛在室温下固定20分钟，并使用棉签除去残留在上部隔室中的细胞。Transwell膜用TBST中的5％BSA封闭，然后用TBST中的phallioidin-FITC(eBioscience)染色4小时以观察丝状肌动蛋白。将Transwell插入物在PBST中洗涤3次并用DAPI封固剂(Vector Labs)固定在载玻片上。使用荧光显微镜(Olympus，Waltham，MA)获得图像。使用ImageJ软件在每个Transwell膜的4个随机视野上进行迁移细胞数量的定量。
在已用含有0.2％FBS的EBM-2在37℃预热1小时的Transwell插入物(8.0μm孔径)(Corning Life Sciences)的上部隔室中以每个插入物50,000个细胞的密度接种HUVEC。30分钟后，用含有NMN(500μM)和/或VEGF(30ng/mL)的EBM-2培养基替换下部隔室中的培养基。6小时后测量细胞迁移。如上所述处理和分析迁移的细胞。
Seahorse分析
使用Seahorse XF96分析仪(Seahorse Bioscience)根据制造商的说明测量耗氧率。简而言之，将40,000个HUVEC接种到XF96平板上，并在37℃/5％CO2下温育过夜。第二天，用补充有葡萄糖(1g/L)、谷氨酸(2mM)和丙酮酸(1mM)的XF测定培养基(DMEM)替换培养基，并将pH调节至7.4。在实验开始时加入NaHS(100μM)和/或NMN(500μM)。在基础条件下和添加寡霉素(1μM)后大约每8分钟进行氧消耗测量。在6个孔中复制实验并对每个实验条件取平均值。
免疫荧光
将新鲜分离的全股四头肌和腓肠肌样品固定在OCT化合物(Tissue-Tek)中，置于异戊烷浴中并在液氮中缓慢冷却。在低温恒温器(Leica)上切割厚度为20μm的横截面。将切片在预冷的丙酮(-20℃)中固定10分钟并用PBS洗涤。然后将载玻片在正常山羊血清和5％封闭试剂(PerkinElmer)的PBST(含有0.1％Triton-X的PBS)溶液中在室温下封闭1小时，然后在4℃与稀释在封闭缓冲液中的抗CD31(ab56299，Abcam)和抗层粘连蛋白(L9393，Sigma)、GFP(ab6556，Abcam)或SIRT1(HPA006295，Sigma)抗体温育过夜。用PBST洗涤载玻片，然后在室温下与在封闭缓冲液中稀释至1:500的抗大鼠Alexa Fluor 488-缀合抗体(Life Technologies)和抗兔Alexa Fluor 594-缀合抗体(Life Technologies)温育2小时。将载玻片再次用PBST洗涤并用Fluoroshield和DAPI封固剂(Sigma)固定。使用共聚焦荧光显微镜(Nikon A1)获取图像。使用ImageJ软件进行毛细血管和毛细血管密度的定量。根据制造商的方案，使用原位BrdU-Red DNA片段化(TUNEL)测定试剂盒(Abcam)在肌肉切片中进行TUNEL染色。
H&E(苏木精和曙红)染色
固定冷冻切片后，将样品用0.1％苏木精(Sigma)染色10分钟，用dH2O冲洗，用Scott's蓝色溶液染色1分钟，然后用dH2O洗涤。然后将切片浸入曙红中3分钟，通过乙醇脱水并在二甲苯中澄清。载玻片用DPX(Grale HDS)固定。
PCR分析
从SIRT1-iKO和对照小鼠获得一小片尾巴或组织，并向每个中加入50μL碱性裂解试剂(25mM NaOH，0.2mM EDTA，pH 12)。将样品在100℃下温育1小时。冷却后，向各自中加入50μL中和试剂(40mM Tris-HCl，pH5)并混合。使用引物Sir2A6860(CATGTAATCTCAACCTTGAG)和Sir2A6171(GCCCATTAAAGCAGTATGTG)，将约2μL上清液用于PCR以检测SIRT1基因的切除。
RNA分析
使用TRIzol(Life Technologies)从细胞和组织中分离总mRNA。使用M-MLV逆转录酶(Biorad)从1μg总RNA合成cDNA。根据制造商的说明书，使用LightCycler 480 System(Roche)，用LightCycler 48 SYBR Green I Mastermix(Roche)进行qPCR。使用ΔΔCt方法计算相对mRNA表达水平。qPCR扩增反应中使用的正向和反向引物序列显示在表1中。
表1：qPCR扩增反应中使用的引物序列
蛋白印迹
根据标准程序进行SDS-PAGE和蛋白印迹分析，并用ECL检测试剂盒(Bio-rad，澳大利亚)检测。对于蛋白印迹分析，使用了针对SIRT1(Sigma)、SIRT3(CST)、SIRT6(SantaCruz)、eNOS(Cell Signaling Technology或CST)、切割Notch1(CST)、总OXPHOS混合物(Abcam)、PGC-1α(Millipore)、VEGF(Abcam)，VEGFR2(Abcam)、磷酸化VEGFR2(Millipore)、肌动蛋白(Cell Signaling Technology)、微管蛋白(Sigma)、14-3-3(CellSignaling Technology)、GAPDH(SantaCruz)的抗体。使用ImageJ软件对通过光密度测定法的条带强度进行定量。
统计分析
数据表示为平均值±标准偏差。统计显著性使用双尾Student's t检验、Bonferroni的多重比较检验的单因素或双因素方差分析进行。使用GraphPad Prism软件进行统计学检验。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。
结果
哺乳动物衰老最可靠但最有害的方面之一是骨骼肌的血流量减少。与此相一致的是，20月龄C57BL/6J小鼠的骨骼肌内皮细胞(EC)和毛细血管的丰度显著低于6月龄小鼠(图1A和1B)，由跑步机测试中直至力竭时所用时间和距离而确定的他们的运动能力也较低(图2A和2B)。此外，与6月龄小鼠相比，20月龄小鼠的腓肠肌组织和股四头肌组织的毛细血管数和毛细血管密度显著降低(图3A-3D)
毛细血管密度降低的可能解释是血管生成潜能受损。为了测试这一点，对来自年轻和年老小鼠的小鼠肺内皮细胞(MLEC)进行了一系列体外血管生成测定。MLEC在条件培养基(CM)存在下培养，所述培养基具有由PGC-1α-过表达C2C12肌管提供的血管生成因子(Arany等，2008,Nature 451,1008-1012)。与来自年轻小鼠的那些相比，来自20月龄小鼠的MLEC具有降低的迁移能力(图4A)和如通过分支点和管长度测量的降低的形成毛细血管样结构的能力(图4B-4D)。类似地，当嵌入胶原凝胶并用血管生成因子刺激时，来自老MLEC的EC球状体具有比来自幼年小鼠的凝胶基质更短的发芽样生长(图5A和5B)。
小鼠内皮SIRT1的特异性缺失模拟了衰老对毛细血管密度和耐力的影响
SIRT1是产后生长过程中血管生成的重要调节因子，但是它是否是生命晚期血管维持和血管生成所必需的尚不清楚。为了测试这一点，我们在小鼠的内皮细胞中敲除和过表达SIRT1并使它们变老。具体而言，我们在让小鼠变老之前使用Tie2启动子驱动的Cre品系(Tie2-Cre)特异性地在小鼠的EC中敲除或过表达SIRT1。
为了测试Tie2启动子是否是内皮细胞特异性，我们将C57BL/6J小鼠品系与floxedTomato荧光蛋白(mT)EGFP小鼠品系(mT-STOPflox/flox,Gfp)杂交(Koni等，2001)(图6A)。该小鼠专门设计用于普遍表达膜靶向Tomato荧光蛋白(mT)，并在存在Cre的任何地方表达绿色荧光蛋白(EGFP)(Muzumdar等，2007)。在mT-STOPflox/flox,Gfp对照小鼠中，mT在相邻肌纤维的外周和腓肠肌和股四头肌的横切面的周围基质细胞中表达，未发现有EGFP(图6B，7A和7B)。在Tie2Cre；Gfp小鼠中，EGFP仅在毛细血管所在的相邻肌纤维的细胞外基质中显而易见，这与CD31染色一致(图7A和7B)。在胫骨肌和比目鱼肌横截面中也观察到类似的表达，证实了骨骼肌中的毛细血管特异性表达。心脏和肺部横截面中GFP和CD31之间的重叠(图8A和8B)证实Tie2驱动的Cre特异性地在骨骼肌、心脏和肺组织的毛细血管中表达。
通过将Tie2-Cre小鼠与floxed SIRT1系(其中loxP位点侧接SIRT1的外显子4)杂交产生内皮SIRT1敲除小鼠(基因型Tie2-Cre；SIRT1flox/flox)或“ESKO小鼠”，(图9A)(Potente等，2007,Genes Dev 21,2644-2658；Vasko等，2014,J Am Soc Nephrol 25,276-291；Wen等，2013,Proc Natl Acad Sci U S A 110,E2420-2427；Pearson等，2008,CellMetab 8,157-168)。
ESKO小鼠出生时具有预期的孟德尔比率，没有明显的发育或身体异常。在从骨骼肌(图9B)和四头肌、肺和胸腺组织(图9C，9D和9E)分离的EC中证实了SIRT1外显子4的EC特异性缺失。然后对股四头肌的横截面进行免疫染色，以分别使用抗CD31和抗层粘连蛋白抗体显现纤维周围的毛细血管和基底层(Cebasek等，2004,Eur J Histochem 48,151-158)。我们将检查限制在肌肉的中部，因其具有高毛细血管密度和众所周知的运动适应性(Chinsomboon等，2009Proc Natl Acad Sci U S A 106,21401-21406)。有趣的是，与年龄匹配的对照野生型(WT)对照小鼠相比，6月龄ESKO小鼠的毛细血管密度和数量显著降低(图10A和10B)。类似的腓肠肌分析还显示，与对照同窝小鼠相比，ESKO小鼠腓肠肌中部的毛细血管密度和数量减少(图10C和10D)。
与WT小鼠相比，ESKO小鼠的总体分析显示，基因型之间的总体重、空腹血糖、尿肌酐、肌肉重量、心脏重量、肌肉形态和运动协调没有差异(图11A至11C)。鉴于ESKO小鼠的毛细血管数量较低，我们假设运动能力可能较低。在初始适应阶段后，对WT和ESKO小鼠以13-30m/min范围内速度逐渐增加进行高强度耐久性测试。与WT小鼠相比，ESKO小鼠具有相当低的运动能力，在跑步机上奔跑的时间和距离均为WT同窝小鼠的一半(图12A)。还注意到运动后血清乳酸水平升高的趋势(图12B)(p＝0.055)。
运动能力的差异通常可归因于肌纤维类型的变化(Pette和Staron,2000,MicroscRes Tech 50,500-509)或线粒体含量(Lin等，2002,Nature 418,797-801)。来自ESKO小鼠和WT小鼠的腓肠肌和股四头肌的比较显示纤维类型(图13A)线粒体活性没有显着差异(图13B)，表明ESKO小鼠的运动能力降低是由于毛细血管密度降低。
内皮SIRT1是运动诱导的新血管形成所必需的
在年轻个体中，运动是血管生成的有效刺激物，但是由于年龄的增长，这种作用显著减弱，原因尚不清楚。血管内皮生长因子(VEGF)是刺激骨骼肌新血管形成的血管生成的关键调节剂(Arany等，2008,Nature 451,1008-1012)。为了确定VEGF是否需要SIRT1来刺激血管生成，我们进行了一系列体外和离体测定。首先，使用RNAi将SIRT1在人脐静脉EC(HUVEC)中敲低(图14A)，然后用空载剂或VEGF(30ng/mL)处理，并测试在生长因子减少的基质胶上形成管状网络的能力(图14B和14C)。如图14B和14C所示，SIRT1的敲低显著降低了VEGF刺激HUVEC中管形成的能力，如分支点数量和肾小管总长度的减少所示。通过培养从18月龄WT和SIRT1敲除小鼠(SIRT1-iKO)的胸主动脉收集的主动脉环的外植体培养物，在不存在或存在VEGF的情况下也在三维(3D)胶原基质中进行离体血管生成测定(图15A)(Gomes等，2013,Cell 155,1624-1638；Price等，2012,Cell Metab 15,675-690)。与仅空载剂处理相比，VEGF处理增加了主动脉环中的发芽(图15B和15C)，SIRT1缺失使效果降低了两倍(图15C)。SIRT1对HUVEC中的VEGF mRNA水平(图16B)或血清中的VEGF蛋白(图16C)没有明显影响。总之，这些结果表明，SIRT1是VEGF有效促进血管生成所必需的。
运动后，肌纤维通过分泌VEGF向EC发送促血管生成信号(Booth and Thomason,1991,Physiol Rev 71,541-585；Rowe等，2014,Circulation 129,798-810)。为了测试成肌细胞-EC通讯是否需要内皮SIRT1，我们进行了体外transwell迁移测定，其中将来自鼠C2C12肌管的VEGF或条件培养基加入到鼠来源的永生化MS1EC中(Arbiser等，2000,Am JPathol 156,1469-1476)。令人惊讶的是，SIRT1的敲低(图16D)几乎完全消除了MS1细胞对VEGF和C2C12条件培养基的趋化响应(图16A)。这些数据表明，内皮SIRT1可能是肌纤维-EC通讯的关键介质，可促进运动后肌肉微血管重塑。
我们对年轻诱导型SIRT1敲除小鼠(SIRT1-iKO)(Price等，2012)进行了为期四周的跑步机训练范例。SIRT1刚缺失后，毛细血管数或密度没有差异。然而，经过四周的运动训练后，与WT小鼠相比，SIRT1-iKO小鼠股四头肌的毛细血管数量和毛细血管密度仅比久坐小鼠高1.4倍，而WT小鼠比久坐小鼠高2倍(图17A和17B)，表明SIRT1是运动诱导的肌肉新血管形成所必需的。
过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(PGC-1α)因其在促进心肌细胞线粒体功能中的作用而闻名，但它似乎通过诱导VEGF分泌诱导EC重塑和新血管形成在血管生成中具有同等重要的作用(Booth和Thomasen 1991,Physiol Rev 71,541-585；Rowe等，2014；Arany等，2008)。实际上，骨骼肌中缺乏PGC-1α的小鼠缺乏运动诱导的血管生成能力(Chinsomboon等，2009)，而肌肉中过表达PGC-1a的小鼠(MCK-PGC-1a)肌肉中的线粒体和毛细血管含量增加，并且整个动物的耐力能力更强(Zin等，2002)。
为了测试SIRT1是否在该途径中发挥作用，我们使一种过表达PGC-1α的小鼠品系(MCK-PGC-1α)的EC或肌细胞中的SIRT1缺失，该小鼠品系由于肌肉中的线粒体、毛细血管含量增加和耐力能力较高而被当作运动模拟物(图18A)(Lin等，2002)。尽管对线粒体蛋白水平没有影响(图18B)，与MCK-PGC-1α；WT小鼠(图18C和18D)相比，MCK-PGC-1α；WT ESKO小鼠的毛细血管数和毛细血管密度显著降低，表明内皮SIRT1是PGC-1α诱导的血管生成的关键介质。
为了测试它是否是内皮特异性效应，我们通过将SIRT1flox/flox小鼠与Myog-Cre小鼠杂交，创建了肌细胞特异性SIRT1敲除小鼠(MSKO)品系，其中在骨骼肌肌细胞中缺失SIRT1(Chalkiadaki等，2014,PLoS Genet 10,e1004490)。有趣的是，肌肉特异性SIRT1敲除和对照小鼠之间的毛细血管数量没有差异。然后我们用MCK-PGC-1α小鼠杂交MSKO品系。如图19A所示，肌细胞中SIRT1的存在或不存在在PGC-1α中诱导的毛细血管数量上并没有差异。总之，这些数据表明骨骼肌的内皮细胞而非肌细胞中的SIRT1是源自肌纤维的PGC-1α-诱导的促血管生成信号的关键下游介质。
在生理水平上，使内皮SIRT1而非肌细胞SIRT1缺失的作用是明显的。在耐力测试中，与MCK-PGC-1α小鼠相比，MCK-PGC-1α；ESKO小鼠只跑了一半时间和一半距离(图19B)，而在MCK-PGC-1ΔαSIRT1肌细胞特异性敲除小鼠中观察到运动能力的统计学上无显著降低(图19C)。因此，即使线粒体功能已经更高，PGC-1α还需要内皮细胞中的SIRT1来改善小鼠的运动耐受性，这突出了脉管系统SIRT1在耐力中的关键作用。总之，这些数据支持了这样的模型：其中SIRT1对于EC接收来自肌纤维的血管重塑信号以增加毛细血管密度和肌肉耐力是必要的。
因此，肌肉毛细血管的增加可以进一步改善具有增加的线粒体功能的小鼠的运动耐受性，突出了脉管系统在耐力中的关键作用。总之，体外和体内数据均支持这样的模型：其中SIRT1是内皮细胞接收来自肌纤维的血管重塑信号以增加肌肉的毛细血管密度和耐力能力所必需的。
从肌细胞到EC的促血管生成生长因子信号传导需要SIRT1
为了研究EC SIRT1响应的特定信号，我们使用源自WT和ESKO小鼠的MLEC进行体外transwell迁移和球状体测定。没有SIRT1的MLEC具有钝化的趋化反应(图20A)，管形成减少(图20B和20C)，以及更短的EC球状芽长(图20D和20E)。运动后EC复制和迁移的刺激涉及几种促血管生成因子，包括VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(FGF)(Arany等，2008)。为了确定生长因子是否需要EC SIRT1活性，我们使用了三维(3D)胶原基质中的离体血管生成测定。将来自野生型和SIRT1-iKO小鼠的外植体胸主动脉环培养物暴露于VEGF或FGF(图21A至21D)。在这些剂量下，VEGF发芽的程度大于FGF的发芽程度(图21A和21B)。VEGF和FGF处理都增加了发芽，但是在缺乏SIRT1的主动脉环中这种作用降低(图21A至21D)。作为SIRT1在下游信号传导中的作用的额外测试，测试了使用慢病毒介导的RNAi敲除SIRT1的人主动脉EC(HAEC)在生长因子减少的基质胶上形成管状网络的能力。SIRT1的敲低降低了VEGF和FGF刺激管形成的能力，如分支点数量和肾小管长度的减少所示(图22A和22B)。SIRT1敲低也消除了生长因子诱导的HAEC迁移(图22C)。在两种情况下，VEGF的作用显著大于FGF的作用。SIRT1对EC中的VEGF mRNA(图22D)或血清中的VEGF蛋白(图22E)水平没有明显影响。这些数据支持这样的模型：其中内皮SIRT1是肌纤维和EC之间运动诱导的PCG-1α-VEGF信号传导的关键下游介质。
SIRT1在内皮中的过表达增加了骨骼肌毛细血管密度和运动能力
已经证明内皮细胞SIRT1是小鼠血管重塑和增加耐力所必需的，我们想知道增加其丰度或活性是否足以诱导这些变化。我们通过将Tie2Cre小鼠与我们之前产生的floxedSIRT1转基因小鼠品系(SIRT1STOP)杂交建立了内皮细胞特异性SIRT1过表达或“ESTO”小鼠品系(Firestein等，2008,PLoS One 3,e2020)(图23A)。对四头肌和富含毛细血管的组织(例如肺和胸腺)的蛋白印迹分析证实，与同窝对照相比，ESTO小鼠中SIRT1过表达(图23B)。骨骼肌的免疫组织化学证实SIRT1过表达对毛细血管是特异性的(图23C)。与ESKO小鼠一样，ESTO小鼠出生时具有预期的孟德尔比率，没有明显的异常。在体重、尿肌酐水平和转棒仪测试中观察到ESTO和SIRT1STOP小鼠之间没有显著差异(图23D)。品系之间的肌肉重量(图24A)、肌肉形态(图24B)、纤维组成(图24C)和氧化代谢(图24D)也相似。有趣的是，与SIRT1STOP小鼠相比，ESTO小鼠中的血糖水平显著降低(图24E)，表明内皮SIRT1也可促进葡萄糖摄取或抑制糖异生。
检查ESTO小鼠的股四头肌显示与同窝对照相比，毛细血管数量增加1.5倍，毛细血管数量增加2倍(图25A和25B)，腓肠肌增加相似(图25C和25D)。为了测试这些变化是否存在生理影响，对6月龄小鼠进行高强度跑步机方案。我们确定，与WT对照相比，6月龄ESTO小鼠和同窝对照具有显著更高的运动能力，力竭之前在跑步机上奔跑了1.8倍的时间，1.9倍的距离(图26A)。即使ESTO小鼠跑得更远且更久，ESTO小鼠的运动后血清乳酸水平也显著低于对照小鼠(图26B)。因此，增加EC中的SIRT1足以不仅增加骨骼肌的毛细血管密度，而且还增加动物的运动耐量。
上述的功能丧失和获得研究表明内皮SIRT1是来自肌细胞的血管生成信号的下游介质。如果这是正确的，那么增加内皮SIRT1的表达或活性应该增加这些信号。MLEC中SIRT1的过表达增加了对化学引诱剂梯度的细胞运动性(图27A)，以及条件培养基中EC球状体的管形成和发芽长度(图27B、27C、28A和28B)。
我们的上述研究表明内皮SIRT1是来自肌细胞的VEGF信号传导的下游介质。如果正确，那么增加内皮SIRT1的表达或活性应该增强VEGF的作用。为了测试这一点，在存在或不存在VEGF(30ng/mL)的情况下，用表达SIRT1cDNA的腺病毒(a.a.194-747)或GFP对照的HUVEC进行管形成测定(图29A)。与对照细胞相比，HUVEC中SIRT1的过表达使分支点的数量增加33％，总小管长度增加15％(图29B和29C)。在球状体发芽测定中，与VEGF刺激后的对照细胞相比，腺-SIRT1感染的EC导致19％更长的芽长(图30A和30B)。
然后使用从SIRT1过表达小鼠的主动脉(SIRT1-Tg)(Price等人，2012)和它们的WT同窝对照制备的主动脉环进行离体血管生成测定(图31A)。与WT同窝对照(图S4N)相比，当在VEGF存在下温育时，SIRT1过表达使发芽数加倍并且总发芽面积增加至三倍(图31B和31C)。该结果与ESTO小鼠具有较高VEGF血清蛋白水平的事实相结合(图31D)，暗示SIRT1激活可以提供对肌细胞VEGF的正反馈。无论哪种方式，这些结果都提供了强有力的证据表明内皮细胞中的SIRT1对于骨骼肌中的毛细血管形成是必要的和足够的，以响应来自肌细胞的VEGF介导的信号。
NAD+前体NMN通过抑制SIRT1介导的Notch信号传导来促进血管生成
考虑到SIRT1在衰老中的作用，我们假设老年小鼠和人类运动反应的丧失可能是由于SIRT1的下降或其共底物NAD+的水平下降(Gomes等，2013；Massudi等，2012)。已知用NAD+前体治疗小鼠可提高细胞内NAD+水平并刺激SIRT1活性(Bogan和Brenner,2008,AnnuRev Nutr 28,115-130；Gomes等，2013；Yoshino等，2011,Cell Metab 14,528-536)。首先，我们测试了NAD+前体烟酰胺单核苷酸(NMN)是否可以在存在和不存在SIRT1的情况下在各种基于细胞的测定中促进血管生成。与单独的VEGF相比，HAEC的NMN和VEGF共处理导致分支点数量增加32％和小管长度增加15％(图32A和32B)。NMN本身将分支点数增加了25％，表明即使没有VEGF，NMN也可促进血管生成(图32A和32B)。此外，HAEC的NMN处理以剂量依赖性方式稳定地增加了分支点的数量和管的总长度(图32C)。HAEC管形成的延时视频显示，NMN不仅改善了结构化小管的形成，而且还在延长的18小时内防止了管的崩解。当在transwell迁移测定中用NMN处理时，HUVEC暴露于NMN还促进细胞生长(图32D)和响应VEGF的运动性(图32E)。在用ESKO衍生的MLEC(图33A和33B)或VEGF处理的HAEC(图33C)的细胞迁移和发芽血管生成测定或在管形成测定(图33D)中，NMN刺激血管生成测量的能力是SIRT1依赖性的。有趣的是，NMN对HAEC的处理不仅改善了结构小管的形成，而且还在长达18小时中防止了管的崩解。
为了测试NMN对老年组织环境中血管生成的影响，我们使用来自18月龄小鼠(大致相当于70岁的人)的主动脉环进行了离体VEGF介导的血管生成测定。来自每个主动脉环的VEGF介导的向外生长或发芽的测量显示，与PBS处理的环(图34C)相比，NMN内皮芽的数量加倍(图34C)。通过敲低SIRT1完全阻断NMN在HAEC细胞中的作用(图34D)。NMN使来自老年WT小鼠的主动脉环的生长物或芽的数量加倍，而对老年SIRT1-iKO小鼠没有作用(图34A和34B)。
除了SIRT1之外，SIRT3和SIRT6还影响培养物中EC的血管生成潜力(Cardus等，2013,Cardiovasc Res 97,571-579；Wei等，2017,J Am Heart Assoc 6)。使用siRNA敲除HAEC中的SIRT3和SIRT6(图35A)降低了VEGF介导的管形成和球状体发芽，而这通过NMN处理被部分地挽救(图35B和35C)，从而表明NMN的血管生成作用部分地由SIRT3和SIRT6介导但主要由SIRT1介导。
Notch信号通路对于脊椎动物的血管形成是必不可少的。在发芽血管生成期间，内皮Notch信号传导途径控制VEGF信号传导下游的尖端和茎细胞行为(Blanco和Gerhardt,2013,Cold Spring Harb Perspect Med 3,a006569)。EC中的Notch信号传导由Notch1细胞内结构域(NICD)蛋白的水平决定，其又由SIRT1负调节(Guarani等，2011,Nature 473,234-238)。与此一致的是，在用VEGF或Notch配体Dll4刺激后(图36A和36B)，NMN处理显著降低Notch靶基因表达并促进NICD降低(图37A和37B)。用β-分泌酶抑制剂DAPT阻断NICD释放增加了芽长度，而与SIRT1水平无关(图37C)，但用VEGF受体(VEGFR)抑制剂SU5416处理完全阻止发芽，并且这不能通过NMN处理挽救(图37C)。与NMN的Notch活化一致的是，处理诱导增殖(图38A)并减少EC中的细胞凋亡(Chang等，2013,Microvasc Res 89,80-85；Noseda等，2004,Mol Cell Biol 24,8813-8822)，而这些影响是SIRT1依赖性的(图38B)。内皮细胞凋亡抵消了成体生物体中的新血管形成(Dimmeler和Zeiher,2000)。NMN降低了经历早期凋亡的细胞的百分比并且在用H2O2处理后促进VEGF介导的血管生成(图39A和39B)。总之，这些结果表明，NAD+前体NMN以SIRT1依赖性方式刺激VEGF诱导的血管生成。
这些发现支持这样的模型，：其中从肌细胞到EC的VEGF和Notch信号传导依赖于EC的NAD+水平和SIRT1的伴随活性(图38C)。
NAD+逆转老年小鼠的微脉管系统和运动能力的丧失
在衰老期间，许多组织中NAD+的水平下降，这可能是由于CD38、NAD糖水解酶和PARP1的活性增加(Braidy等，2011；Canto等，2012,Cell Metab 15,838-847；Gomes等，2013；Massudi等，2012；Mouchiroud等，2013b,Cell 154,430-441；Yoshino等，2011)。我们假设降低EC中的NAD+水平可能解释为何年老个体在衰老过程中毛细血管减少和血流量减少。与我们的假设一致的是，与来自6月龄小鼠的那些相比，从20月龄小鼠分离的腓肠肌和EC具有显著更低的NAD+水平(图40A和40B)。因此，我们推断，将老鼠的EC中的NAD+水平恢复到年轻水平也可能恢复毛细血管密度、血流量和耐力。为了测试这一点，我们通过饮用水以400mg/kg/天向18月龄小鼠施用NMN两个月。NMN在包括肌肉在内的几种组织中提高NAD+水平(图40B)，并且对食物摄取、水消耗、体重、身体组成、运动学习技能和心脏功能没有影响(图41A和41B)。
引人注目的是，与年龄匹配的未处理小鼠(图42A至42D)相比，NMN施用将老年小鼠的毛细血管数和毛细血管密度恢复为年幼小鼠的数量(图42A至42D)。下肢的对比增强超声成像(Baltgalvis等，2014,Am J Physiol Heart Circ Physiol 306,H1128-1145)评估峰值增强(稳态下相对血容量的量度)(图43A)也显示NMN增加了静息肌肉灌注(图43C和43D)。与载体处理的年龄匹配的对照相比，通过光声层析成像测量的静息肌中的可溶性氧(sO2)水平在NMN处理的小鼠中高15％(图43B)。
NMN没有显著改变线粒体蛋白水平(图44A)、线粒体活性(图44B和44C)、单根纤维的呼吸能力(图45A)、组织重量(图45B)、肌肉形态(图45C)、纤维类型(图45D)或饲养笼活动。与未处理的对照小鼠相比，NMN处理的小鼠的氧消耗在光周期中高30％，在暗周期中高23％(图45E)。NMN补充显著改善了低强度耐力，比未处理的小鼠提高了56％(441米对比686米)，图46A和46B。当在高耐力运动方案下测试时，与未处理的小鼠相比，NMN处理的小鼠多奔跑80％，并且具有较低的血乳酸积累(4.9mmol/L对3.9mmol/L)，图46B和46C。
接下来，我们试图测试SIRT1是否是体内新血管形成所必需的。通过用他莫昔芬处理20月龄SIRT1-iKO小鼠，然后将它们置于NMN(400mg/kg/天)上两个月，从而在EC细胞中使SIRT1缺失。NMN增加WT小鼠的腓肠肌毛细血管，而在SIRT1-iKO小鼠中未观察到变化(图47A)。血管可塑性不仅是随着衰老而下降的正常生理学的重要组成部分，而且它在响应于缺血时也是必不可少的。将8月龄SIRT1-iKO和WT小鼠和小鼠的股结扎用NMN(400mg/kg/天)处理20天。与我们先前的观察结果一致，NMN恢复了相对血容量(峰值增强)和毛细血管密度，并且这种效应依赖于SIRT1(图47B和47C)。
我们假设NMN可能进一步增强对运动训练的反应，即使在年轻的小鼠中也是如此。为了测试这一点，在用或未用NMN(400mg/kg/天)的情况下对年轻小鼠进行一个月的耐力训练。如所预期的，与久坐的小鼠相比，运动的小鼠具有两倍数量的毛细血管(图48A)。有趣的是，如果将NMN添加到相同的训练方案中，观察到毛细血管密度增加3.2倍，但如果保持久坐，则NMN补充剂不会增加毛细血管密度或运动能力。仅进行运动的小鼠的腓肠肌比来自久坐小鼠的毛细血管多33％，而来自运动和NMN处理的小鼠的毛细血管多70％。因此，NMN补充不仅在年老个体中而且在年轻个体中对骨骼肌毛细血管形成有效，但仅在与运动相结合时才有效。这些有趣的结果表明，运动减轻了限制新血管形成的抑制剂或运动期间对NAD+的需求增加。
为了测试NMN的作用是否需要VEGF，我们在用阿西替尼(30mg/kg/天)处理的小鼠中重复上述运动训练方案。阿西替尼通过抑制VEGFR的磷酸化和增加血清VEGF水平来阻断VEGF信号传导(图49A)((Escudier和Gore,2011)。阿西替尼处理不仅阻断NMN介导的毛细血管密度增加，而且阻止运动能力的任何改善(图49B、49C和50)，证实NMN作用于VEGF的下游，肌肉毛细血管化是运动是否增加耐力的关键决定因素。
总之，这些数据表明，短期NMN处理可以恢复骨骼肌毛细血管的数量，老年小鼠的耐力恢复到年轻水平，增加的血流量可能才是用STAC处理小鼠耐力增加的原因，而不是改善的线粒体功能。
外源性硫化氢激活SIRT1并增强NMN的作用
H2S与NAD+作为信号分子具有许多相似之处。H2S增加SIRT1活性，并防止氧化应激。因此，我们关注了测试NAD+和H2S信号传导之间的潜在重叠。我们首先测试了NMN和NaHS对HUVEC细胞凋亡的潜在累加效应。单独用NaHS或NMN处理HUVEC增加了SIRT1蛋白水平，并且两种SIRT1水平的组合增加了两倍(图51A)。NaHS还以剂量依赖性方式提高EC中的细胞内NAD+水平(图51B)。
接下来，我们试图确定这种组合是否可以改善HUVEC细胞在氧化应激下的血管生成潜力，以及这是否是由SIRT1介导的。与未处理的对照相比，两种处理都增加了管形成，但组合处理的效果最大，其显著提高了分支点的数量和总管长度(图52A)。H2S以SIRT1依赖性方式增加细胞迁移(图52B)并降低HUVEC的基础OCR(图52C)，而NMN对这些参数没有影响。
所述处理对MLEC的运动性(图53A)和EC球状发芽测定(图53B)方面具有累加效应，该效应是SIRT1依赖性的(图53A)。与Alban等一致的是，H2S在划痕试验中增加细胞迁移，这不依赖于VEGF但依赖于SIRT1(图53C)。H2S也降低了HUVEC的基础OCR，而NMN则没有。这些发现表明NAD+和H2S在EC中具有重叠而不同的功能。
为了测试NMN和NaHS组合的效果，我们用NMN和NaHS共同处理小鼠，看它们是否比单独的任一处理对毛细血管形成和耐力具有更大的影响。在30月龄小鼠的饮用水中提供NMN(400mg/kg/天)和NaHS(20mg/kg/天)的组合，持续4周。处理对水消耗、食物消耗、体重、瘦体重或脂肪量没有影响(图55A和55B)。如图55A和55B所示，与所有其他组相比，用NaHS和NMN的组合处理的小鼠具有更高的毛细血管密度和毛细血管数。
老年个体的新血管形成部分地由于氧化应激和内皮细胞凋亡的增加而下降，这种效应可以通过细胞培养物中的H2O2模拟(Dimmeler和Zeiher,2000；Pearson等，2008)。使用TUNEL测定对CD31的老年股四头肌组织和对DNA片段化的共染色显示NMN将具有凋亡细胞的毛细血管的数量从42％减少至17％，并且NMN和NaHS的组合将其降低至11％(图56A)。响应于H2O2，NMN使HUVECS中的细胞凋亡减少了13％，并且所述组合将其减少了36％(图56B)。
为了测试骨骼肌中的这些结构变化是否有功能，对处理过的小鼠进行跑步机试验。用NMN处理的小鼠显示出跑至力竭时的时间和距离增加的显著趋势(图57A和57B)，但是与NaHS的组合最令人瞩目，耐力增加了一倍，是迄今为止报告的任何治疗或运动方案的最大增加。
为了测试NMN和H2S组合的作用是否由SIRT1介导，我们使用表达EGFP转基因的慢病毒载体和血管内皮钙粘蛋白(VE-cad)启动子下游的SIRT1微小RNA(miRNA)在老年成年小鼠中产生EC特异性SIRT1KO(图58A)(Zhang等，2013)。在测试多种miRNA构建体后，5号被认为是最有效的，其将SIRT1蛋白水平降低80％(图58B)。然后通过眼眶后注射在20月龄小鼠中敲除SIRT1。免疫染色表明EGFP在也用CD31阳性染色的细胞中表达，证实了敲低的效率和特异性(图59A)。在确认慢病毒整合到EC中后，用NMN和H2S前体NaHS和GYY4137(Rose等，2015)处理小鼠四周。如图59B所示，在SIRT1敲低小鼠中，单独的或与H2S前体组合的NMN增加血管形成的能力被阻断。总之，这些数据显示内皮细胞SIRT1是血管生成反应的关键介质，并且用NMN刺激SIRT1活性是增加骨骼肌中毛细血管形成和血流量以提高运动耐力的有效方法，这一途径可以通过与H2S的共处理进一步增强。
总之，这些数据显示内皮SIRT1是血管生成响应于运动的关键介质，刺激SIRT1活性是增加骨骼肌毛细血管形成和血流量的有效方法，这一途径可通过NaHS共处理进一步加强(图6G)。
讨论
从人类35岁开始，组织的灌注稳定地且看似不可阻挡地下降。这种下降是几乎所有人到中年的健康和长寿的主要决定因素，导致虚弱、肌肉减少症和大多数与年龄有关的疾病。建议进行运动，但它只会延迟衰退，最初是因为中年时对运动的血管生成响应变弱，而最终将因为虚弱而禁止运动。
在这项研究中，我们开始于测试内皮SIRT1是否参与肌肉脉管系统的调节，以及是否可以对其靶向以恢复老年小鼠的毛细血管密度和耐力。我们的实验表明，内皮细胞中的SIRT1是血管重塑的关键调节因子，这是对PGC-1α-VEGF刺激的血管生成的响应所必需的。
我们还表明，NAD+前体烟酰胺单核苷酸(NMN)可作为运动模拟药物，可迅速逆转衰老对毛细血管形成的影响，这种作用与H2S信号传导(另一种SIRT1依赖途径)协同作用。令人惊讶的是，即使在32月龄小鼠(以寿命百分比耗尽计大约相当于90岁的人)中，老化对微脉管系统的影响也可以迅速逆转。这些发现表明，NAD+和H2S前体可能对健康有益，可以逆转与年龄相关的运动能力下降和身体对运动响应能力下降，从而重新建立有益的活动循环。
此外，我们表明NAD+前体NMN可以增加血管密度和血流量，并增加运动训练时年轻和年老受试者运动能力。
我们还表明，NAD+前体NMN可以促进缺血组织中血管密度和血流量的增加。
结论
我们显示了内皮SIRT1活性的丧失导致骨骼肌血管密度和运动能力的早期下降的表型，而内皮SIRT1的过表达具有相反的保护性作用。在药理学上提高NAD+水平以刺激SIRT1活性使老年小鼠的毛细血管密度和跑步机耐力恢复到年轻水平，这种效果通过H2S进一步增强。当与运动相结合时，药理学上提高NAD+水平以刺激SIRT1活性增加了年轻小鼠和年老小鼠的毛细血管密度和跑步机耐力。在药理学上提高NAD+水平增加了缺血组织中的毛细血管密度。
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ttcaggtcaa gggatggtat ttatgctcgc cttgctgtag acttcccaga tcttccagat 300
cctcaagcga tgtttgatat tgaatatttc agaaaagatc caagaccatt cttcaagttt 360
gcaaaggaaa tatatcctgg acaattccag ccatctctct gtcacaaatt catagccttg 420
tcagataagg aaggaaaact acttcgcaac tatacccaga acatagacac gctggaacag 480
gttgcgggaa tccaaaggat aattcagtgt catggttcct ttgcaacagc atcttgcctg 540
atttgtaaat acaaagttga ctgtgaagct gtacgaggag ctctttttag tcaggtagtt 600
cctcgatgtc ctaggtgccc agctgatgaa ccgcttgcta tcatgaaacc agagattgtg 660
ttttttggtg aaaatttacc agaacagttt catagagcca tgaagtatga caaagatgaa 720
gttgacctcc tcattgttat tgggtcttcc ctcaaagtaa gaccagtagc actaattcca 780
agttccatac cccatgaagt gcctcagata ttaattaata gagaaccttt gcctcatctg 840
cattttgatg tagagcttct tggagactgt gatgtcataa ttaatgaatt gtgtcatagg 900
ttaggtggtg aatatgccaa actttgctgt aaccctgtaa agctttcaga aattactgaa 960
aaacctccac gaacacaaaa agaattggct tatttgtcag agttgccacc cacacctctt 1020
catgtttcag aagactcaag ttcaccagaa agaacttcac caccagattc ttcagtgatt 1080
gtcacacttt tagaccaagc agctaagagt aatgatgatt tagatgtgtc tgaatcaaaa 1140
ggttgtatgg aagaaaaacc acaggaagta caaacttcta ggaatgttga aagtattgct 1200
gaacagatgg aaaatccgga tttgaagaat gttggttcta gtactgggga gaaaaatgaa 1260
agaacttcag tggctggaac agtgagaaaa tgctggccta atagagtggc aaaggagcag 1320
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agtgaaattg aagaattcta caatggctta gaagatgagc ctgatgttcc agagagagct 1560
ggaggagctg gatttgggac tgatggagat gatcaagagg caattaatga agctatatct 1620
gtgaaacagg aagtaacaga catgaactat ccatcaaaca aatcatag 1668
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<213> 人
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Val Asp Leu Leu Ile Val Ile Gly Ser Ser Leu Lys Val Arg Pro Val
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<213> 小鼠
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<212> PRT
<213> 猫
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<213> 小鼠
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50 55 60
Pro Pro Asn Thr Ser Lys Val Tyr Ser Tyr Phe Glu Cys Arg Glu Lys
65 70 75 80
Lys Thr Glu Asn Ser Lys Ile Lys Lys Val Lys Tyr Glu Glu Thr Val
85 90 95
Phe Tyr Gly Leu Gln Tyr Ile Leu Asn Lys Tyr Leu Lys Gly Lys Val
100 105 110
Val Thr Ala Glu Lys Ile Gln Glu Ala Lys Glu Val Tyr Arg Glu His
115 120 125
Phe Gln Asp Asp Val Phe Asn Glu Lys Gly Trp Asn Tyr Ile Leu Glu
130 135 140
Lys Tyr Asp Gly His Leu Pro Ile Glu Ile Lys Ala Val Pro Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Val Ile Pro Arg Gly Asn Val Leu Phe Thr Val Glu Asn Thr Asp
165 170 175
Pro Glu Cys Tyr Trp Leu Thr Asn Trp Ile Glu Thr Ile Leu Val Gln
180 185 190
Ser Trp Tyr Pro Ile Thr Val Ala Thr Asn Ser Arg Glu Gln Lys Lys
195 200 205
Ile Leu Ala Lys Tyr Leu Leu Glu Thr Ser Gly Asn Leu Asp Gly Leu
210 215 220
Glu Tyr Lys Leu His Asp Phe Gly Tyr Arg Gly Val Ser Ser Gln Glu
225 230 235 240
Thr Ala Gly Ile Gly Ala Ser Ala His Leu Val Asn Phe Lys Gly Thr
245 250 255
Asp Thr Val Ala Gly Ile Ala Phe Val Lys Lys Tyr Tyr Gly Thr Lys
260 265 270
Asp Pro Val Pro Gly Tyr Ser Val Pro Ala Ala Glu His Ser Thr Ile
275 280 285
Thr Ala Trp Gly Lys Asp Arg Glu Lys Asp Ala Phe Glu His Ile Val
290 295 300
Thr Gln Phe Ser Ser Val Pro Val Ser Val Val Ser Asp Ser Tyr Asp
305 310 315 320
Ile Tyr Asn Ala Cys Glu Lys Ile Trp Gly Glu Asp Leu Arg His Leu
325 330 335
Ile Leu Ser Arg Thr Thr Glu Ala Pro Leu Ile Ile Arg Pro Asp Ser
340 345 350
Gly Asn Pro Leu Asp Thr Val Leu Lys Val Leu Asp Ile Leu Gly Lys
355 360 365
Lys Phe Pro Ile Thr Glu Asn Ser Lys Gly Tyr Lys Leu Leu Pro Pro
370 375 380
Tyr Leu Arg Val Ile Gln Gly Asp Gly Val Asp Ile Asn Thr Leu Gln
385 390 395 400
Glu Ile Val Glu Gly Met Lys Gln Lys Lys Trp Ser Ile Glu Asn Ile
405 410 415
Ala Phe Gly Ser Gly Gly Ala Leu Leu Gln Lys Leu Thr Arg Asp Leu
420 425 430
Leu Asn Cys Ser Phe Lys Cys Ser Tyr Val Val Thr Asn Gly Leu Gly
435 440 445
Ile Asn Val Phe Lys Asp Pro Val Ala Asp Pro Asn Lys Arg Ser Lys
450 455 460
Lys Gly Arg Leu Ser Leu His Arg Thr Pro Ala Gly Asn Phe Val Thr
465 470 475 480
Leu Glu Glu Gly Lys Gly Asp Leu Glu Glu Tyr Gly His Asp Leu Leu
485 490 495
His Thr Val Phe Lys Asn Gly Lys Val Thr Lys Ser Tyr Ser Phe Asp
500 505 510
Glu Ile Arg Lys Asn Ala Lys Leu Asn Ile Glu Leu Glu Val Ala Pro
515 520 525
His
<210> 9
<211> 279
<212> PRT
<213> 人
<400> 9
Met Glu Asn Ser Glu Lys Thr Glu Val Val Leu Leu Ala Cys Gly Ser
1 5 10 15
Phe Asn Pro Ile Thr Asn Met His Leu Arg Leu Phe Glu Leu Ala Lys
20 25 30
Asp Tyr Met Asn Gly Thr Gly Arg Tyr Thr Val Val Lys Gly Ile Ile
35 40 45
Ser Pro Val Gly Asp Ala Tyr Lys Lys Lys Gly Leu Ile Pro Ala Tyr
50 55 60
His Arg Val Ile Met Ala Glu Leu Ala Thr Lys Asn Ser Lys Trp Val
65 70 75 80
Glu Val Asp Thr Trp Glu Ser Leu Gln Lys Glu Trp Lys Glu Thr Leu
85 90 95
Lys Val Leu Arg His His Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ser Asp Cys Asp
100 105 110
His Gln Gln Asn Ser Pro Thr Leu Glu Arg Pro Gly Arg Lys Arg Lys
115 120 125
Trp Thr Glu Thr Gln Asp Ser Ser Gln Lys Lys Ser Leu Glu Pro Lys
130 135 140
Thr Lys Ala Val Pro Lys Val Lys Leu Leu Cys Gly Ala Asp Leu Leu
145 150 155 160
Glu Ser Phe Ala Val Pro Asn Leu Trp Lys Ser Glu Asp Ile Thr Gln
165 170 175
Ile Val Ala Asn Tyr Gly Leu Ile Cys Val Thr Arg Ala Gly Asn Asp
180 185 190
Ala Gln Lys Phe Ile Tyr Glu Ser Asp Val Leu Trp Lys His Arg Ser
195 200 205
Asn Ile His Val Val Asn Glu Trp Ile Ala Asn Asp Ile Ser Ser Thr
210 215 220
Lys Ile Arg Arg Ala Leu Arg Arg Gly Gln Ser Ile Arg Tyr Leu Val
225 230 235 240
Pro Asp Leu Val Gln Glu Tyr Ile Glu Lys His Asn Leu Tyr Ser Ser
245 250 255
Glu Ser Glu Asp Arg Asn Ala Gly Val Ile Leu Ala Pro Leu Gln Arg
260 265 270
Asn Thr Ala Glu Ala Lys Thr
275
<210> 10
<211> 285
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 10
Met Asp Ser Ser Lys Lys Thr Glu Val Val Leu Leu Ala Cys Gly Ser
1 5 10 15
Phe Asn Pro Ile Thr Asn Met His Leu Arg Leu Phe Glu Leu Ala Lys
20 25 30
Asp Tyr Met His Ala Thr Gly Lys Tyr Ser Val Ile Lys Gly Ile Ile
35 40 45
Ser Pro Val Gly Asp Ala Tyr Lys Lys Lys Gly Leu Ile Pro Ala His
50 55 60
His Arg Ile Ile Met Ala Glu Leu Ala Thr Lys Asn Ser His Trp Val
65 70 75 80
Glu Val Asp Thr Trp Glu Ser Leu Gln Lys Glu Trp Val Glu Thr Val
85 90 95
Lys Val Leu Arg Tyr His Gln Glu Lys Leu Ala Thr Gly Ser Cys Ser
100 105 110
Tyr Pro Gln Ser Ser Pro Ala Leu Glu Lys Pro Gly Arg Lys Arg Lys
115 120 125
Trp Ala Asp Gln Lys Gln Asp Ser Ser Pro Gln Lys Pro Gln Glu Pro
130 135 140
Lys Pro Thr Gly Val Pro Lys Val Lys Leu Leu Cys Gly Ala Asp Leu
145 150 155 160
Leu Glu Ser Phe Ser Val Pro Asn Leu Trp Lys Met Glu Asp Ile Thr
165 170 175
Gln Ile Val Ala Asn Phe Gly Leu Ile Cys Ile Thr Arg Ala Gly Ser
180 185 190
Asp Ala Gln Lys Phe Ile Tyr Glu Ser Asp Val Leu Trp Arg His Gln
195 200 205
Ser Asn Ile His Leu Val Asn Glu Trp Ile Thr Asn Asp Ile Ser Ser
210 215 220
Thr Lys Ile Arg Arg Ala Leu Arg Arg Gly Gln Ser Ile Arg Tyr Leu
225 230 235 240
Val Pro Asp Leu Val Gln Glu Tyr Ile Glu Lys His Glu Leu Tyr Asn
245 250 255
Thr Glu Ser Glu Gly Arg Asn Ala Gly Val Thr Leu Ala Pro Leu Gln
260 265 270
Arg Asn Ala Ala Glu Ala Lys His Asn His Ser Thr Leu
275 280 285
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<212> PRT
<213> 狗
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Met Glu Asn Ser Lys Met Glu Val Val Leu Leu Ala Cys Gly Ser Phe
1 5 10 15
Asn Pro Ile Thr Asn Met His Leu Arg Leu Phe Glu Leu Ala Lys Asp
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Tyr Met Asn Gly Thr Gly Lys Tyr Lys Val Ile Lys Gly Ile Ile Ser
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Pro Val Gly Asp Ala Tyr Lys Lys Lys Gly Leu Ile Ser Ala His His
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Val Leu Arg His His Gln Glu Lys Leu Glu Ala Gly Ser Cys Asp His
100 105 110
Gln Gln Asp Ser Pro Val Arg Gly Arg Pro Gly Gln Lys Arg Lys Trp
115 120 125
Ala Glu Gln Arg Gln Asp Phe Ser Gln Lys Lys Ser Leu Glu Pro Lys
130 135 140
Thr Lys Asp Val Pro Lys Val Lys Leu Leu Cys Gly Ala Asp Leu Leu
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Glu Ser Phe Gly Val Pro Asn Leu Trp Lys Ser Glu Asp Ile Thr Gln
165 170 175
Ile Val Gly Asp Tyr Gly Leu Val Cys Ile Thr Arg Ala Gly Asn Asp
180 185 190
Ala Gln Lys Phe Ile Tyr Glu Ser Asp Ala Leu Trp Gln His Arg Asn
195 200 205
Asn Ile His Leu Val Asn Glu Trp Ile Thr Asn Asp Ile Ser Ser Thr
210 215 220
Lys Ile Arg Arg Ala Leu Arg Arg Gly Gln Ser Ile Arg Tyr Leu Val
225 230 235 240
Pro Asp Leu Val Gln Glu Tyr Ile Glu Lys His Asp Leu Tyr Ser Cys
245 250 255
Glu Ser Glu Glu Arg Asn Val Gly Val Ile Leu Ala Pro Leu Gln Arg
260 265 270
Asn Thr Ala Glu Ala Asn Ser
275
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<212> PRT
<213> 人
<400> 12
Met Thr Glu Thr Thr Lys Thr His Val Ile Leu Leu Ala Cys Gly Ser
1 5 10 15
Phe Asn Pro Ile Thr Lys Gly His Ile Gln Met Phe Glu Arg Ala Arg
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Asp Tyr Leu His Lys Thr Gly Arg Phe Ile Val Ile Gly Gly Ile Val
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Ser Pro Val His Asp Ser Tyr Gly Lys Gln Gly Leu Val Ser Ser Arg
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Asp Pro Trp Glu Cys Tyr Gln Asp Thr Trp Gln Thr Thr Cys
85 90 95
Ser Val Leu Glu His His Arg Asp Leu Met Lys Arg Val Thr Gly Cys
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Ile Leu Ser Asn Val Asn Thr Pro Ser Met Thr Pro Val Ile Gly Gln
115 120 125
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Ser Arg Ile Cys Cys Val Arg Pro Pro Val Glu Arg Phe Thr Phe Val
165 170 175
Asp Glu Asn Ala Asn Leu Gly Thr Val Met Arg Tyr Glu Glu Ile Glu
180 185 190
Leu Arg Ile Leu Leu Leu Cys Gly Ser Asp Leu Leu Glu Ser Phe Cys
195 200 205
Ile Pro Gly Leu Trp Asn Glu Ala Asp Met Glu Val Ile Val Gly Asp
210 215 220
Phe Gly Ile Val Val Val Pro Arg Asp Ala Ala Asp Thr Asp Arg Ile
225 230 235 240
Met Asn His Ser Ser Ile Leu Arg Lys Tyr Lys Asn Asn Ile Met Val
245 250 255
Val Lys Asp Asp Ile Asn His Pro Met Ser Val Val Ser Ser Thr Lys
260 265 270
Ser Arg Leu Ala Leu Gln His Gly Asp Gly His Val Val Asp Tyr Leu
275 280 285
Ser Gln Pro Val Ile Asp Tyr Ile Leu Lys Ser Gln Leu Tyr Ile Asn
290 295 300
Ala Ser Gly
305
<210> 13
<211> 307
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 13
Met Thr Glu Thr Thr Lys Thr His Val Ile Leu Leu Ala Cys Gly Ser
1 5 10 15
Phe Asn Pro Ile Thr Lys Gly His Ile Gln Met Phe Glu Arg Ala Arg
20 25 30
Asp Tyr Leu His Lys Thr Gly Arg Phe Ile Val Ile Gly Gly Ile Val
35 40 45
Ser Pro Val His Asp Ser Tyr Gly Lys Gln Gly Leu Val Ser Ser Arg
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Asp Pro Trp Glu Cys Tyr Gln Asp Thr Trp Gln Thr Thr Cys
85 90 95
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100 105 110
Ile Leu Ser Asn Val Asn Thr Pro Ser Met Thr Pro Val Ile Gly Gln
115 120 125
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130 135 140
Thr Lys Pro Thr Ala Ala Lys Ile Leu Gly Lys Val Gly Glu Ser Leu
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Ser Arg Ile Cys Cys Val Arg Pro Pro Val Glu Arg Phe Thr Phe Val
165 170 175
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Leu Arg Ile Leu Leu Leu Cys Gly Ser Asp Leu Leu Glu Ser Phe Cys
195 200 205
Ile Pro Gly Leu Trp Asn Glu Ala Asp Met Glu Val Ile Val Gly Asp
210 215 220
Phe Gly Ile Val Val Val Pro Arg Asp Ala Ala Asp Thr Asp Arg Ile
225 230 235 240
Met Asn His Ser Ser Ile Leu Arg Lys Tyr Lys Asn Asn Ile Met Val
245 250 255
Val Lys Asp Asp Ile Asn His Pro Met Ser Val Val Ser Ser Thr Lys
260 265 270
Ser Arg Leu Ala Leu Gln His Gly Asp Gly His Val Val Asp Tyr Leu
275 280 285
Ser Gln Pro Val Ile Asp Tyr Ile Leu Lys Ser Gln Leu Tyr Ile Asn
290 295 300
Ala Ser Gly
305
<210> 14
<211> 307
<212> PRT
<213> 狗
<400> 14
Met Thr Glu Thr Thr Lys Thr His Val Ile Leu Leu Ala Cys Gly Ser
1 5 10 15
Phe Asn Pro Ile Thr Lys Gly His Ile Gln Met Phe Glu Arg Ala Arg
20 25 30
Asp Tyr Leu His Lys Thr Gly Arg Phe Ile Val Ile Gly Gly Ile Val
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Ser Pro Val His Asp Ser Tyr Gly Lys Gln Gly Leu Val Ser Ser Arg
50 55 60
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Arg Val Asp Pro Trp Glu Cys Tyr Gln Asp Thr Trp Gln Thr Thr Cys
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Thr Lys Pro Thr Ala Ala Lys Ile Leu Gly Lys Val Gly Glu Ser Leu
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Ser Arg Ile Cys Cys Val Arg Pro Pro Val Glu Arg Phe Thr Phe Val
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Asp Glu Asn Ala Asn Leu Gly Thr Val Met Arg Tyr Glu Glu Ile Glu
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Leu Arg Ile Leu Leu Leu Cys Gly Ser Asp Leu Leu Glu Ser Phe Cys
195 200 205
Ile Pro Gly Leu Trp Asn Glu Ala Asp Met Glu Val Ile Val Gly Asp
210 215 220
Phe Gly Ile Val Val Val Pro Arg Asp Ala Ala Asp Thr Asp Arg Ile
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Met Asn His Ser Ser Ile Leu Arg Lys Tyr Lys Asn Asn Ile Met Val
245 250 255
Val Lys Asp Asp Ile Asn His Pro Met Ser Val Val Ser Ser Thr Lys
260 265 270
Ser Arg Leu Ala Leu Gln His Gly Asp Gly His Val Val Asp Tyr Leu
275 280 285
Ser Gln Pro Val Ile Asp Tyr Ile Leu Lys Ser Gln Leu Tyr Ile Asn
290 295 300
Ala Ser Gly
305
<210> 15
<211> 142
<212> PRT
<213> 人
<400> 15
Met Glu Gly Pro Asp His Gly Lys Ala Leu Phe Ser Thr Pro Ala Ala
1 5 10 15
Val Pro Glu Leu Lys Leu Leu Cys Gly Ala Asp Val Leu Lys Thr Phe
20 25 30
Gln Thr Pro Asn Leu Trp Lys Asp Ala His Ile Gln Glu Ile Val Glu
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Lys Phe Gly Leu Val Cys Val Gly Arg Val Gly His Asp Pro Lys Gly
50 55 60
Tyr Ile Ala Glu Ser Pro Ile Leu Arg Met His Gln His Asn Ile His
65 70 75 80
Leu Ala Lys Glu Pro Val Gln Asn Glu Ile Ser Ala Thr Tyr Ile Arg
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Arg Ala Leu Gly Gln Gly Gln Ser Val Lys Tyr Leu Ile Pro Asp Ala
100 105 110
Val Ile Thr Tyr Ile Lys Asp His Gly Leu Tyr Thr Lys Gly Ser Thr
115 120 125
Trp Lys Gly Lys Ser Thr Gln Ser Thr Glu Gly Lys Thr Ser
130 135 140
<210> 16
<211> 179
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 16
Met Ala Arg Leu Ala Leu Gln Thr Ser Asp Trp Ile Arg Val Asp Pro
1 5 10 15
Trp Glu Ser Glu Gln Ala Gln Trp Met Glu Thr Val Lys Val Leu Arg
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35 40 45
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50 55 60
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165 170 175
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<212> PRT
<213> 狗
<400> 17
Met Lys Ser Arg Ile Pro Val Val Leu Leu Ala Cys Gly Ser Phe Asn
1 5 10 15
Pro Ile Thr Asn Met His Leu Arg Leu Phe Glu Val Ala Arg Asp His
20 25 30
Leu His Gln Thr Gly Trp Tyr Phe Ser Leu Leu Ser Pro Val Leu Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ser Ala His His Arg Val Ala Met Ala Arg Leu Ala Leu Gln Thr Ser
100 105 110
Asp Trp Val Arg Val Asp Pro Trp Glu Ser Glu Gln Val Gln Trp Met
115 120 125
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130 135 140
Thr Val Gln His His His Ser Glu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Gln Thr
145 150 155 160
Glu Gly Leu Asp His Gly Arg Ala Gly Ser Thr Ala Arg Thr Ala Gly
165 170 175
Pro Glu Leu Lys Leu Leu Cys Gly Ala Asp Val Leu Lys Thr Phe Gln
180 185 190
Thr Pro Asn Leu Trp Lys Asp Ala His Ile Gln Glu Ile Val Glu Lys
195 200 205
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260 265 270
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275 280 285
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Pro Ala Pro Pro Pro Arg Ser Ser Ser
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 18
tagccttgtc agataaggaa gga 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 19
acagcttcac agtcaacttt gt 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
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tgtgacagag agatggctgg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
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atcttccaga tcctcaagcg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<400> 22
agctgcgctg atagacatcc 20
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
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ctgtaacgat gaagccctgg ag 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 25
tggtgaggtt tgatccgcat 20
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 26
gccaactatg ctggagctga tgccc 25
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
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ggtgcgtgga gcgcaagttt gtcataag 28
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 28
ggcacaaact gctgaagcag aggc 24
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 29
ggtgctcctg aggttggtca tcagc 25
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
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gagctactgg atgccagtga gcgc 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 31
ctggacgatg tcttccatct ctcc 24
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 32
ggcagcagca gctgcggaag cagagtctgg 30
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 33
gagtgctcct cagattggtc attagc 26
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 34
gttaagcagt acagccccaa a 21
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<400> 35
agggcatatc caacaacaaa ctt 23
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 36
aggtcggtgt gaacggattt g 21
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<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 37
tgtagaccat gtagttgagg tca 23
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 38
aactgttggt ggcctgaatc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 39
aattctttgt gttgctgggg 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 40
ttcaaggcag ctcggtaact 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 41
gggcatttta cttccccaat 20
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 引物序列
<400> 42
tcaacacgac accggataaa c 21
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 43
gccgcgagct atctttcttc a 21
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 44
tcaacgtgaa ctcgttcggg 20
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 45
acttcgcctt ggtgatgaga t 21
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 46
gcaacagctc cttccacttc 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 47
gcctcagaca ctttgaagcc 20
<210> 48
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 48
gttgtcgacg acgagcg 17
<210> 49
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 49
gcacagagcc tcgcctt 17
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 50
accctttcca aatcctcagc 20
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物序列
<400> 51
gttatggcga cccgcag 17

Claims (60)

1.增加受试者的组织中的血管密度和/或血流量的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的提高受试者的内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
2.增加受试者的组织中的血管密度和/或血流量的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的NAD+激动剂。
3.增加受试者的组织中的血管密度和/或血流量的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的NAD+前体。
4.提高受试者的运动能力的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的提高受试者的内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
5.提高受试者的运动能力的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的NAD+激动剂。
6.提高受试者的运动能力的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的NAD+前体。
7.增加受试者的组织中的血管生成和/或新血管形成的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的提高受试者内皮细胞中SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
8.增加受试者的组织中的血管生成和/或新血管形成的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的NAD+激动剂。
9.增加受试者的组织中的血管生成和/或新血管形成的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的NAD+前体。
10.增加受试者的组织中的血管密度和/或血流量的方法，该方法包括：(a)使所述受试者在运动训练期内接受运动训练；和(b)在所述运动训练期之前和/或期间向所述受试者施用有效量的提高受试者的内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
11.增加受试者组织中血管密度和/或血流量的方法，该方法包括：(a)使所述受试者在运动训练期内接受运动训练；(b)在所述运动训练期之前和/或期间向所述受试者施用有效量的NAD+前体。
12.提高受试者的运动能力的方法，该方法包括：(a)使所述受试者在运动训练期内接受运动训练；(b)在所述运动训练期之前和/或期间向所述受试者施用有效量的提高受试者的内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
13.提高受试者的运动能力的方法，该方法包括：(a)使所述受试者在运动训练期内接受运动训练；(b)在所述运动训练期之前和/或期间向所述受试者施用有效量的NAD+前体。
14.如权利要求2、5或8中任一项所述的方法，其中，所述NAD+激动剂是提高受试者的内皮细胞中NAD+水平的试剂。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述提高受试者的内皮细胞中NAD+水平的试剂包括NAD+前体。
16.如权利要求3、6、9、11、13和15中任一项所述的方法，其中，所述NAD+前体是NMN或其药学上可接受的盐、NR或其药学上可接受的盐、NaR或其药学上可接受的盐、NAAD或其药学上可接受的盐，或者NaMN或其药学上可接受的盐。
17.如权利要求1、4、7、10或12中任一项所述的方法，其中，所述试剂与H2S前体组合施用。
18.如权利要求2、5或8中任一项所述的方法，其中，所述NAD+激动剂与H2S前体组合施用。
19.如权利要求3、6、9、11、13、15或16中任一项所述的方法，其中，所述NAD+前体与H2S前体组合施用。
20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中，所述H2S前体是硫氢化钠或其药学上可接受的盐，或者GYY4137或其药学上可接受的盐。
21.如权利要求1、2、3、10或11中任一项所述的方法，其中，所述血管密度的增加是微血管密度的增加。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述微血管密度的增加是毛细血管密度的增加。
23.如权利要求1-3、7-11和14-22中任一项所述的方法，其中，所述组织是肌肉。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述肌肉是骨骼肌。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中，所述受试者是老年受试者。
26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中，所述试剂、NAD+激动剂或NAD+前体经口服施用。
27.治疗或预防受试者中的疾病或病症的方法，所述疾病或病症选自由以下组成的组：冠状动脉和/或外周动脉疾病；缺血；溃疡；肺部疾病；肺动脉高压；虚弱；少肌症；神经退行性疾病，如血管性痴呆；中风；出血；骨质疏松症；心脏病；和血管疾病，所述方法包括向所述受试者施用有效量的提高受试者的内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
28.治疗或预防受试者中的疾病或病症的方法，所述疾病或病症选自由以下组成的组：冠状动脉和/或外周动脉疾病；缺血；溃疡；肺部疾病；肺动脉高压；虚弱；少肌症；神经退行性疾病，如血管性痴呆；中风；出血；骨质疏松症；心脏病；和血管疾病，该方法包括向所述受试者施用有效量的NAD+激动剂。
29.治疗或预防受试者中的疾病或病症的方法，所述疾病或病症选自由以下组成的组：冠状动脉和/或外周动脉疾病；缺血；溃疡；肺部疾病；肺动脉高压；虚弱；少肌症；神经退行性疾病，如血管性痴呆；中风；出血；骨质疏松症；心脏病；和血管疾病，该方法包括向所述受试者施用有效量的NAD+前体。
30.增加行动不便的受试者的血管密度或运动能力的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的提高受试者的内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
31.增强受试者的肝窦内皮细胞功能的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的提高受试者的肝脏内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1的表达的试剂。
32.提高竞赛动物的表现的方法，该方法包括向所述竞赛动物施用有效量的提高该动物的内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
33.提高受试者的耐力的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的提高受试者的内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
34.增强受试者的体能的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的提高受试者的内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
35.增强受试者的运动效果的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的提高受试者的内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
36.改善受试者在受伤或失去移动能力后的血管恢复的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的提高受试者的内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
37.增强受试者的物理疗法益处的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的提高受试者的内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
38.增强血液流向受试者眼睛的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的提高受试者的内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
39.增强受试者的皮肤外观的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的提高受试者的内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
40.增加动物的肉产量的方法，该方法包括向所述动物施用有效量的提高动物的内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
41.一种方法，该方法：
-增加行动不便的受试者的组织中的血管密度；
-增加行动不便的受试者的运动能力；
-增强受试者的肝窦内皮细胞功能；
-提高受试者的体能；
-增强受试者的运动效果；
-改善受试者在受伤或失去移动能力后的血管恢复；
-增强受试者的物理疗法益处；
-提高受试者的耐力；
-增强血液流向受试者眼睛；
-增强受试者的皮肤外观；或
-提高动物的肉产量；
该方法包括向所述受试者施用有效量的NAD+激动剂。
42.如权利要求41所述的方法，其中，所述NAD+激动剂是NAD+前体。
43.用于增加受试者的血管密度和/或血流量和/或运动能力的组合物，其包含NAD+激动剂和任选的H2S前体。
44.用于增加受试者的血管密度和/或血流量和/或运动能力的组合物，其包含NAD+前体和任选的H2S前体。
45.包含病毒载体的病毒，其中，所述病毒载体包含增加受试者的组织中的血管密度和/或血流量以及/或者提高受试者的运动能力的核酸，其中所述核酸包含编码以下物质的编码序列：
(a)SIRT1蛋白；
(b)一种或多种NAD+生物合成酶，或
(c)NAMPT、NMNAT1、NMNAT2和/或NMNAT3 miRNA拮抗剂。
46.如权利要求45所述的病毒，其中，所述编码序列与在内皮细胞中表达所述编码序列的启动子可操作地连接。
47.如权利要求46所述的病毒，其中，所述启动子是诱导型启动子。
48.如权利要求46或47所述的病毒，其中，所述启动子选自由Tie-1、Tie-2、CD34、eNOS、Flt-1、VE-钙粘蛋白、vWF、PDGFB、PECAM-1、VCAM-1组成的组。
49.如权利要求48所述的病毒，其中，所述启动子是Tie-2。
50.增加老年受试者的活力的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的提高受试者的内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
51.增加老年受试者的活力的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的NAD+激动剂。
52.增加老年受试者的活力的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的NAD+前体。
53.如权利要求50至52中任一项所述的方法，其中，所述受试者是伴侣动物(宠物)。
54.增加老年受试者的活力的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的提高受试者的内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
55.增加老年受试者的活力的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的NAD+激动剂。
56.增加老年受试者的活力的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的NAD+前体。
57.一种方法，其减少老年受试者中的：
(g)协调缺乏；
(h)极度疲劳和嗜睡；
(i)食欲不振；
(j)已有病症变差或恶化；
(k)伤口愈合缓慢；或
(l)与年龄有关的疾病的发病，
该方法包括向所述受试者施用有效量的提高受试者的内皮细胞中的SIRT1活性或SIRT1表达的试剂。
58.如权利要求57所述的方法，其中，所述试剂是NAD+激动剂。
59.如权利要求57所述的方法，其中，所述试剂是NAD+前体。
60.如权利要求54至59中任一项所述的方法，其中，所述老年受试者是狗。
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