CN116981482A - 使klf4去乙酰化以促进其转录活性的作用剂的用途、维持肺动脉内皮细胞功能的方法和治疗肺动脉高压的方法 - Google Patents

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Abstract

使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性的作用剂在制备用于治疗肺动脉高压的药物中的用途，其中，所述作用剂用于使KLF4在K228位点去乙酰化。一种通过使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性来维持肺动脉内皮细胞的功能的体外方法，包括：使所述肺动脉内皮细胞与有效增加KLF4去乙酰化的作用剂的量接触；其中，所述作用剂被用于使KLF4在K228位点去乙酰化以促进其对Pdgfb的转录活性。一种治疗肺动脉高压的方法，包括：给予需要治疗的患者或受试者有效量的使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性的作用剂，其中，所述作用剂为使KLF4在K228位点去乙酰化。

Description

使KLF4去乙酰化以促进其转录活性的作用剂的用途、维持肺 动脉内皮细胞功能的方法和治疗肺动脉高压的方法
技术领域
本申请涉及一种使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性的作用剂在制备治疗肺动脉高压的药物中的用途，一种通过使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性来维持肺动脉内皮细胞的功能的体外方法，以及一种治疗肺动脉高压的方法。
技术背景
此处的陈述仅提供与本申请相关的背景信息，并不一定构成现有技术。
肺动脉高压(PAH)是一种进行性肺血管疾病，其特征是肺动脉压升高(>25mmHg)和右心室肥大。肺内皮细胞功能障碍和肺动脉平滑肌细胞异常增殖导致肺血管功能失调和结构受损。更多证据表明，肺内皮细胞暴露于各种刺激，包括感染、缺氧、炎症因子和基因突变疾病，会产生紊乱的血管收缩因子、生长因子和炎症因子，最终导致肺血管重塑。在PAH治疗策略中需要旨在改善肺动脉内皮细胞功能的新方法。
Sirtuin7(SIRT7)是一种NAD+依赖性去乙酰化酶，属于Sirtuins家族。SIRT7主要位于细胞核中，通过使组蛋白去乙酰化来帮助维持染色质的稳定性。最近的研究证实SIRT7在血管内皮细胞中具有抗衰老的保护作用。在肺纤维化患者和啮齿动物模型中发现SIRT7水平降低，导致胶原蛋白和α-SMA表达增加，从而促进肺成纤维细胞的纤维化。此外，SIRT7缺乏加剧了LPS诱导的内皮-间充质转化(endoMT)、炎症和急性肺损伤期间肺内皮细胞的通透性。但SIRT7在PAH发病机制中的参与仍有待阐明。Krüpple样因子4(KLF4)是维持内皮稳态的关键转录因子。有趣的是，它在特发性肺动脉高压(IPAH)患者的肺组织中减少，而EC中的KLF4缺乏促进了啮齿动物模型中肺动脉高压(PH)的发展。虽然发现KLF4被p300、HDAC2和PCAF乙酰化，并被SIRT1去乙酰化，但KLF4的乙酰化状态是否在PAH发病过程中发生了改变，其机制尚不清楚。
发明内容
鉴于上述问题，本申请的目的之一是提供一种使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性的作用剂在制备治疗肺动脉高压的药物中的用途，一种通过使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性来维持肺动脉内皮细胞的功能的体外方法，以及一种治疗肺动脉高压的方法，其为旨在提高肺动脉内皮细胞功能的PAH治疗策略提供了新的途径。
为了实现上述目的，根据本申请的第一方面，提供了使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性的作用剂在制备用于治疗肺动脉高压的药物中的用途，其中，所述作用剂用于使KLF4在其第228位赖氨酸残基(K228)去乙酰化。
根据本申请的第二方面，提供了一种通过使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性来维持肺动脉内皮细胞的功能的体外方法，包括：使所述肺动脉内皮细胞与有效增加KLF4去乙酰化的作用剂的量接触；其中，所述作用剂被用于使KLF4在K228位点去乙酰化以促进其对Pdgfb的转录活性。
根据本申请的第三方面，提供了一种治疗肺动脉高压的方法，包括：给予需要治疗的患者或受试者有效量的使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性的作用剂，其中，所述作用剂用于使KLF4在K228位点去乙酰化。
本申请实施例的优点总结如下：
在本申请中，证明了SIRT7在K228位点使KLF4去乙酰化，以促进KLF4对Pdgfb的转录活性。SIRT7的内皮特异性递送(AAV-VCAM1-SIRT7)保护了肺动脉内皮细胞的功能并逆转了PH发病机制。SIRT7也可以通过外泌体传递，使用含有SIRT7蛋白的外泌体也可以实现KLF4的去乙酰化，达到同样的效果。此外，烟酰胺核糖体补充剂通过改善EC功能改善了啮齿动物模型中的PH。我们的研究表明，SIRT7通过KLF4的去乙酰化保护肺动脉内皮细胞免受PH发病过程中的功能障碍。
简要附图说明
图1A-1F显示了SIRT7缺乏加剧了PH发病机制。特别是，图1A显示了健康对照组、IPAH组和PAH组的相对SIRT7水平。图1B分别显示了对照组和PH组中SIRT7的相对mRNA水平和相对蛋白水平。图1C-1D显示了Nor+Ctrl组、SuHx+Ctrl组和SuHx+shSIRT7组中的RVPS和富尔顿指数。图1E-1F显示Sirt7缺乏加剧了肺血管厚度增加和小血管闭塞。
图2A-2C显示了敲低Sirt7对内皮细胞稳态的调节作用。特别是，图2A显示了对照组和siSIRT7组之间以及对照组和SIRT7组之间的管形成实验结果。图2B-2C显示对照组和siSIRT7组，以及对照组和SIRT7组之间的EndoMT、炎症和生长因子相关基因的表达。
图3A-3F显示了在体内PH期间SIRT7对内皮细胞的影响。特别是，图3A-3B显示了Nor+Ctrl组、Nor+ICre组、SuHx+Ctrl组和SuHx+ICre组中的RVPS和富尔顿指数。图3C-3D显示Nor+Ctrl组、SuHx+Ctrl组和SuHx+ICre组的肺血管厚度和血管闭塞。图3E和3F显示了Nor+Ctrl组、SuHx+Ctrl组和SuHx+ICre组中PH相关基因的表达。
图4A-4F显示SIRT7使KLF4去乙酰化以促进其对Pdgfb的转录活性。特别是，图4A显示了调节Pdgfb转录的KLF4结合基序(位点1或位点2)。图4B显示了对照组和KLF4组中的相对荧光素酶活性。图4C显示SIRT7过表达增加了PAEC中KLF4的蛋白质但不增加mRNA水平。图4D显示在抗HA-KLF4免疫沉淀物中观察到SIRT7，表明SIRT7确实与KLF4相互作用。图4E显示KLF4的乙酰化被SIRT7降低。图4F显示过表达SIRT7WT但不表达H187Y的细胞中KLF4的乙酰化水平降低。图4G显示SIRT7过表达增加了PDGFB的启动子活性，其因位点1和位点2的缺失而减弱。图4I显示KLF4在K228的乙酰化模拟突变体显示PDGFB启动子的活化受损。
图5A-5F显示SIRT7水平和活性的增强改善了小鼠的PH。特别是，图5A-5C显示rAAV1-ICAM2-SIRT7病毒颗粒的递送增加了ECs中SIRT7的水平，并减少了RVSP和RV肥大。图5D-5E显示SIRT7抑制血管重塑和血管结构受损。图5F-5G显示KLF4及其下游基因(包括eNOS)在过表达SIRT7的肺中被上调。
图6A-6F显示了用NAD+前体烟酰胺核苷对PH小鼠的治疗结果。特别是，图6A-6B显示NR处理显著降低了PH小鼠的RVSP和富尔顿指数。图6C-6D显示血管壁厚度和闭塞得到改善。图6E显示SIRT7缺失减弱了NR对PH的改善。
图7A-7B显示了SIRT7在对照组和SIRT7组的人脐静脉内皮细胞及其外泌体中的检测。
图8显示了NAD+的合成途径。
具体实施方式
为了进一步说明本申请，下面的实验详述了一种使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性的作用剂在制备治疗肺动脉高压的药物中的用途，一种通过使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性来维持肺动脉内皮细胞的功能的体外方法，以及一种治疗肺动脉高压的方法。需要说明的是，以下实施例是为了说明而不是限制本申请。
KLF4的去乙酰化
根据一实施例，本申请提供一种通过使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性来维持肺动脉内皮细胞的功能的方法。该方法包括：使所述肺动脉内皮细胞与有效增加KLF4去乙酰化的作用剂的量接触；其中，所述作用剂被用于使KLF4在K228位点的去乙酰化以促进其对Pdgfb的转录活性。
该方法可以在体外或体内进行。在一些实施方案中，该方法可以在体外进行，并且利用使KLF4在K228位点去乙酰化的作用剂可以提高肺动脉内皮细胞的血管生成能力。在其他实施方案中，该方法可以在体内进行，这表明使KLF4在K228位点去乙酰化的作用剂在维持PAH中的肺动脉内皮细胞功能中起重要作用。
在一实施例中，所述作用剂选自以下一种：使肺动脉内皮细胞特异性表达SIRT7蛋白的重组病毒；含有SIRT7蛋白的外泌体；以及SIRT7蛋白的激动剂。
在一实施例中，所述使肺动脉内皮细胞特异性表达SIRT7蛋白的重组病毒是rAAV1-ICAM2-SIRT7。在所述rAAV1-ICAM2-SIRT7中，SIRT7基因是小鼠SIRT7基因，具有由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，ICAM2具有由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，其中，SIRT7基因表达是由ICAM2启动子驱动的。
在一实施例中，含有SIRT7蛋白的外泌体是通过用慢病毒-SIRT7重组病毒感染人脐静脉内皮细胞，对过表达SIRT7蛋白的人脐静脉内皮细胞进行培养，并从所述过表达SIRT7蛋白的人脐静脉内皮细胞中收集细胞外泌体而获得的。
在一实施例中，含有SIRT7蛋白的外泌体也可以用慢病毒-SIRT7重组病毒感染间充质干细胞，对过表达SIRT7蛋白的间充质干细胞进行培养，并从所述过表达SIRT7蛋白的间充质干细胞中收集细胞外泌体而获得。
在一实施例中，所述SIRT7蛋白的激动剂是NAD+前体烟酰胺核苷。在另一实施例中，所述SIRT7蛋白的激动剂烟酰胺单核苷酸。
在一实施例中，所述肺动脉内皮细胞是人肺动脉内皮细胞。
治疗组合物和制剂
在一实施例中，本申请提供了使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性的作用剂在制备用于治疗肺动脉高压的药物中的用途。所述作用剂用于使KLF4在其第228位赖氨酸残基去乙酰化。
在一实施例中，所述作用剂选自以下一种：使肺动脉内皮细胞特异性表达SIRT7蛋白的重组病毒；含有SIRT7蛋白的外泌体；以及SIRT7蛋白的激动剂。
在一实施例中，所述使肺动脉内皮细胞特异性表达SIRT7蛋白的重组病毒是rAAV1-ICAM2-SIRT7。在所述rAAV1-ICAM2-SIRT7中，SIRT7基因是小鼠SIRT7基因，具有由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，ICAM2具有由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，其中，SIRT7基因表达是由ICAM2启动子驱动的。
在一实施例中，含有SIRT7蛋白的外泌体是通过用慢病毒-SIRT7重组病毒感染人脐静脉内皮细胞，对过表达SIRT7蛋白的人脐静脉内皮细胞进行培养，并从所述过表达SIRT7蛋白的人脐静脉内皮细胞中收集细胞外泌体来获得的。在一个实施方案中，含有SIRT7蛋白的外泌体也可以通过用慢病毒-SIRT7重组病毒感染间充质干细胞，对过表达SIRT7蛋白的间充质干细胞进行培养，并从所述过表达SIRT7蛋白的间充质干细胞中收集细胞外泌体来获得的。
在一实施例中，SIRT7蛋白的激动剂是NAD+前体烟酰胺核苷。在另一个实施方案中，SIRT7蛋白的激动剂是NAD+前体烟酰胺单核苷酸。
在一实施例中，当所述作用剂为所述使人肺动脉内皮细胞特异性表达SIRT7蛋白的重组病毒或者所述含有SIRT7蛋白的外泌体时，所述药物被制备成吸入制剂。
在一实施例中，当所述作用剂为NAD+前体烟酰胺核苷时，所述药物被制备成口服或者适于肠胃外给药的制剂。
在一实施例中，本申请还提供了一种治疗肺动脉高压的药物，其包括使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性的作用剂。该作用剂被用于使KLF4在其K228位点去乙酰化。该药剂是可以与药学上可接受的载体组合的形式。在这种情况下，该作用剂可以是例如分离的或基本上纯的。
术语“载体”是指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或溶媒。这样的药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油(例如矿物油)、植物油(例如花生油、大豆油和芝麻油)、动物油或合成来源的油的那些。盐溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射溶液。用于治疗或减轻中枢神经系统中的炎症的特别优选的药物载体是可以穿透血/脑屏障的载体。如本文所用，载体不包括天然存在的天然植物材料。
合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇和类似。如果需要，治疗组合物还可包含少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。该组合物可以与传统的粘合剂和载体(例如甘油三酸酯)一起配制。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中有所描述。这样的组合物包含治疗有效量的治疗组合物以及适当量的载体，以提供用于向患者适当给药的形式。该制剂应适合于给药方式。
在一实施例中，本申请提供了适于向人类局部注射给药的药物组合物。通常，用于局部注射给药的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，该组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂，例如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。通常，成分以单位剂型单独或混合在一起提供，例如，作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物，放在指示活性剂含量的密闭容器(例如安瓿或小药囊)中。在通过注射施用组合物的情况下，可以提供安瓿瓶的无菌注射用水或盐水，从而可以在施用之前将成分混合。
本申请的治疗或药物组合物可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离氨基形成的盐，例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与游离羧基形成的盐，例如源自钠、钾、铵、钙、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐，
本申请还提供了一种药物包装或药盒，其包括一个或多个装有本申请的药物组合物的一种或多种成分(例如化合物、载体)的容器。
给药途径
可以通过标准途径将本发明的化合物和组合物施用于正在治疗的受试者，包括口服、吸入或肠胃外给药，包括静脉内、皮下、局部、经皮、皮内、跨粘膜、腹膜内、肌内、囊内、眼眶内、心内、气管内、皮下、皮下、表皮内、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射、输注和电穿孔，以及作为(暂时或永久地)插入受试者中的任何医疗设备或物体的组分共同给药。
在治疗特定疾病、病况或障碍中有效的本申请的治疗或药物组合物的量将取决于给药途径以及疾病、病况或障碍的严重性，并且应根据取决于从业医师和每个患者的情况。通常，剂量为约0.001mg/kg至约3g/kg。例如，合适的单位剂量可以在约0.01至约3g、约0.01至约1g、约0.01至约500mg、约0.01至约400mg、约0.01至约300mg、约0.01至约200mg之间。约0.01至约100mg、约0.01至约50mg、约0.01至约30mg、约0.01至约20mg、约0.01至约10mg、约0.01至约5mg、约0.01至约3mg0.01至约1mg、或约0.01至约0.5mg。这样的单位剂量可以每天多次给药，例如一天两次或三次。
可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据病况的类型和待治疗的受试者而变化。一般来说，治疗组合物包含约5％至约95％的活性成分(w/w)。更具体地说，治疗组合物包含约20％(w/w)至约80％或约30％至约70％的活性成分(w/w)。
一旦患者状况得到改善，必要时可给予维持剂量。随后，可以根据症状将剂量或给药频率或两者降低至保持改善的状况的水平。当症状减轻至所需水平时，应停止治疗。但是，一旦疾病况状复发，患者可能需要长期间歇治疗。另外，可任选地采用体外实验法以帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中要使用的精确剂量还取决于给药途径以及疾病、病况或障碍的严重性，并且应根据从业医师的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线中推断出来。
疾病治疗
在一实施例中，本申请提供了一种治疗肺动脉高压的方法。其包括：给予需要治疗的患者或受试者有效量的使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性的作用剂，其中，所述作用剂用于使KLF4在其K228位点去乙酰化。
在一实施例中，所述作用剂选自以下一种：使肺动脉内皮细胞特异性表达SIRT7蛋白的重组病毒；含有SIRT7蛋白的外泌体；以及SIRT7蛋白的激动剂。
在一实施例中，所述使肺动脉内皮细胞特异性表达SIRT7蛋白的重组病毒是rAAV1-ICAM2-SIRT7。其中，所述rAAV1-ICAM2-SIRT7的SIRT7基因是小鼠SIRT7基因，具有由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，ICAM2具有由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，其中，SIRT7基因表达是由ICAM2启动子驱动的。
在一实施例中，含有SIRT7蛋白的外泌体是通过用慢病毒-SIRT7重组病毒感染人脐静脉内皮细胞，对过表达SIRT7蛋白的人脐静脉内皮细胞进行培养，并从所述过表达SIRT7蛋白的人脐静脉内皮细胞中收集细胞外泌体而获得的。
在一实施例中，含有SIRT7蛋白的外泌体也可以用慢病毒-SIRT7重组病毒感染间充质干细胞，对过表达SIRT7蛋白的间充质干细胞进行培养，并从所述过表达SIRT7蛋白的间充质干细胞中收集细胞外泌体而获得。
在一实施例中，所述SIRT7蛋白的激动剂是NAD+前体烟酰胺核苷。在另一实施例中，所述SIRT7蛋白的激动剂烟酰胺单核苷酸。
在一实施例中，当所述作用剂为所述使人肺动脉内皮细胞特异性表达SIRT7蛋白的重组病毒或者所述含有SIRT7蛋白的外泌体时，所述作用剂通过吸入的方式给药。
在一实施例中，当所述作用剂为NAD+前体烟酰胺核苷时，所述作用剂被制备成口服或者肠胃外的方式给药。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”描述了可以向其提供用根据本申请的组合物进行治疗的生物，包括哺乳动物，例如灵长类。可以从所公开的治疗方法中受益的哺乳动物物种包括但不限于猿、黑猩猩、猩猩、人、猴子；驯养动物，例如狗和猫；家畜，例如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡等；以及其他动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。
本文所用的术语“治疗”或其任何语法变化(例如，treat、treating和treatment等)包括但不限于减轻疾病或病况的症状；和/或减少、压制、抑制、减缓或影响疾病或病况的进展、严重程度和/或范围。如本文所用，术语“有效量”是指能够治疗、预防或改善疾病或病况或能够产生预期治疗效果的量。
材料和方法
PH啮齿动物模型和测量
所有动物研究均经深圳大学机构动物伦理委员会批准。将小鼠保持12小时的光照/黑暗循环，并在22℃的温度下随意喂食食物。8-12周龄的C57/BL6小鼠吸入递送AAV-shSIRT7或AAV-ICAM1-SIRT7或对照AAV，浓度为10^11PFU，两次(每周一次)。两周后，小鼠每周一次皮下注射Sugen5416或DMSO，并在缺氧(10％)下暴露3周。8-12周龄SIRT7flox/flox雄性小鼠每周一次，共两次，吸入AAV-ICAM1-Cre或AAV-ICAM1，然后暴露于Sugen5416以及缺氧条件以诱导PH。在测量血流动力学时，通过吸入异氟醚对小鼠实施安乐死。使用标准方案测量右心室收缩压(RVSP)。富尔顿指数(右心室重量与左心室加上室间隔重量之比；RV/[LV+S])用于评估RV肥大。使用图片刻度板测量肺动脉的厚度(直径约20μm，每只动物n＝20)。对于肺血管造影，小鼠被麻醉并将PBS注射到RV中以洗去肺中的血液。然后将Microfil聚合物注射到肺动脉中。使用乙醇对肺进行脱水，然后进行水杨酸甲酯培养。ImageJ用于量化肺组织的血管分支长度、分支数量和分支连接处。
细胞培养
人肺动脉内皮细胞(PAECs)和人肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)购自ScienCell，分别用内皮培养基(ECM；ScienCell)和平滑肌培养基(SMCM，Sciencell)培养。人胚肾293T(HEK293T)细胞获自ATCC，并使用DMEM(Corning)培养。具有第4-7代的PAEC和PASMC用于所有细胞培养实验。所有细胞均在37℃、5％CO2和95％相对湿度下培养。
管形成实验
将减少生长因子的Matrigel溶解并涂在24孔板中，每孔200μL。然后将1×106个细胞的人类PAEC接种到基质胶上。显微镜用于在接种后4小时和12小时捕获细胞管形成。ImageJ用于测量PAEC的管数和分支数。
萤光素酶报告基因测定
以人基因组DNA为模板，使用PCR扩增人PDGFB基因的启动子区域。然后将DNA片段克隆到含有萤火虫荧光素酶报告基因(Promega)的pGL4.11质粒中，然后使用测序验证。PDGFB位点1或2突变也使用克隆技术产生。使用lipofectamine 3000将报告质粒与pRSV-β-gal共转染到293T细胞中。在转染后48小时测量荧光素酶活性并将其标准化为β-gal活性。
免疫共沉淀(Co-IP)测定
Co-IP测定根据既定方案进行。简而言之，使用含有蛋白酶抑制剂的IP裂解缓冲液提取总蛋白质。下拉实验使用适当的抗体或蛋白质标签融合珠。洗涤后，从珠子中提取下拉蛋白并用于以下免疫印迹实验。
染色质免疫沉淀(ChIP)实验
处理后，PAEC在室温下与0.75％甲醛交联10分钟，然后使用125mM甘氨酸淬灭。洗涤后，细胞在FA裂解缓冲液中裂解并超声处理以迫使DNA分裂成大小为500-1000bp的片段。然后将细胞裂解物与适当的抗体和Dynabeads磁珠一起温育。免疫沉淀的DNA片段使用DNA清除分析进行反向交联和分离，然后进行qPCR测量。
RNA提取和实时qPCR
使用Trizol从细胞或肺组织中分离总RNA。将提取的RNA转化为cDNA，用于实时qPCR模板。根据制造商的指引，SYBRMix用于qPCR，引物见补充表X。
蛋白质印迹
使用RIPA裂解分离总蛋白质，并通过SDS-PAGE凝胶分离，转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。然后用一抗和二抗对膜进行免疫印迹，使用增强的化学发光(ECL)缓冲液进行可视化。ImageJ用于分析每个样品的蛋白质水平。
统计分析
SPSS用于统计分析。细胞实验的所有数据均以平均值±SEM表示。动物实验数据采用Kruskal-Wallis U检验比较各组间的差异。单因素方差分析和Bonferroni校正用于多组测试。双尾P<0.05被认为具有统计学意义。
含SIRT7的外泌体的制备
人脐静脉内皮细胞HUVECs用慢病毒-SIRT7感染以产生稳定的过表达SIRT7的内皮细胞。根据ExoQuick-TCTM的方案提取外泌体。1.收集生物液并以3000×g离心15分钟以去除细胞和细胞碎片。2.将上清液转移到无菌容器中，将适当体积的ExoQuick-TC添加到生物液中。通过倒置或轻弹试管充分混合。3.在+4℃下冷藏过夜(至少12小时)。在孵育期间，试管不应旋转或混合，应保持直立。4.以1500×g离心ExoQuick-TC/生物流体混合物30分钟。离心可在室温或+4℃下进行，结果相似。离心后，外泌体可能在容器底部显示为米色或白色颗粒。5.吸出上清液。以1500×g离心5分钟，将残留的ExoQuick-TC溶液降速。通过抽吸去除所有液体痕迹，小心不要干扰沉淀中沉淀的外泌体。6.使用无菌1XPBS或特定缓冲液将外泌体颗粒重悬于100-500μL溶液中。
示例1 SIRT7缺乏加剧PH发病机制
为了研究SIRT7在PH发展中的作用，我们首先分析了SIRT7在GEO数据库(GSE113439和GSE117261)中的表达水平。我们发现PH患者肺组织中的SIRT7水平显著降低(图1A)。一致地，在Sugen+缺氧(SuHx)条件诱导的PH小鼠模型的肺组织中证明了SIRT7的mRNA和蛋白质水平的降低(图1B)。为了确定SIRT7减少对PH发展的因果作用，我们使用AAV-shSIRT7敲低小鼠肺中的Sirt7，并将它们暴露于SuHx条件。值得注意的是，与对照小鼠相比，小鼠出现了更严重的PH，具有更高的RVSP和富尔顿指数(图1C和1D)。此外，Sirt7缺乏也加剧了肺血管厚度增加和小血管闭塞(图1E和1F)。这些发现暗示SIRT7缺乏会加剧PH的发病机制。
示例2 SIRT7维持PAEC功能
内皮功能障碍被认为是PH的初始和关键因素，我们之前已经表明，SIRT7减少引起的内皮功能障碍会加速衰老。在这里，我们培养了人肺动脉内皮细胞(PAEC)并敲低了Sirt7以检测其对内皮细胞稳态的调节作用。事实上，内皮功能在很大程度上受到了损害，如管形成实验(图2A)和内皮-间充质转化(EndoMT)的表达，炎症和生长因子相关基因的表达被si-Sirt7治疗显著改变(图2B)。否则，SIRT7的过度表达可能通过上调内皮标记基因和抑制炎症因子来改善EC功能(图2C)。SIRT7过表达也提高了EC的血管生成能力(图2A)。
为了在体内PH期间测试SIRT7对EC的影响，我们生成了AAV-ICAM1-Cre(ICreO)并将其递送到SIRT7flox/flox小鼠的肺中以删除啮齿动物肺中的内皮SIRT7。正如预期的那样，与SIRT7flox/flox+GFP小鼠相比，SIRT7flox/flox+ICreO小鼠的RVSP和富尔顿指数严重得多(图3A和3B)。此外，EC特异性SIRT7缺陷也加速了血管壁厚度和闭塞(图3C和3D)。PH相关基因的表达也受到ICreO的影响，这表明与对照小鼠相比，SIRT7flox/flox+ICreO小鼠肺组织中BMPR2水平降低和IL-6表达增加(图3E和3F)。总的来说，这些结果表明SIRT7通过PH维持EC功能发挥重要作用。
示例3SIRT7使KLF4去乙酰化以促进其对Pdgfb的转录活性
血小板衍生生长因子亚基B(PDGFB)是一种生长因子，通过刺激肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的增殖和迁移，在肺血管重塑中必不可少。虽然据报道在几位PAH患者中它增加，但也发现其受体(PDGF受体B)的阻断有利于预防博来霉素诱导的肺纤维化。有趣的是，我们最近的单细胞转录组学研究揭示了从早衰小鼠模型中纯化的ECs中Pdgfb的显著下调。然后，我们开始使用生物信息学工具搜索可能识别Pdgfb启动子的潜在转录因子。非常有趣的是，注意到了一个Kruppel样因子4(KLF4)结合基序，它是调节EC表型和功能的最重要的转录因子之一。为了验证KLF4对Pdgfb转录的调节作用，我们将潜在Pdgfb启动子的-2000-+116碱基对区域克隆到荧光素酶表达盒(图4A)中，并检查了KLF4操作后的荧光素酶活性。如图所示，KLF4过表达上调荧光素酶活性，而KLF4预测结合位点(位点1或位点2)的删除部分地减弱了这种影响(图4B)。总的来说，这些数据表明KLF4转录调节Pdgfb水平。
我们假设SIRT7可能调节KLF4水平以维持PDGFB水平和EC稳态。实际上，SIRT7过表达增加了PAEC中KLF4的蛋白质但不增加mRNA水平(图4C)。据报道，KLF4在K228处被p300乙酰化。因此，我们假设SIRT7可能在K228处使KLF4去乙酰化。我们首先检查了SIRT7是否与KLF4相互作用。通过免疫共沉淀(Co-IP)确定，在抗HA-KLF4免疫沉淀物中观察到SIRT7(图4D)，表明SIRT7确实与KLF4相互作用。在过表达HA-KLF4的HEK293细胞中的抗HA免疫沉淀物中检测到进一步的泛乙酰赖氨酸(K)水平，无论是否过表达SIRT7。结果表明SIRT7减少了KLF4的乙酰化(图4E)。一致地，在过表达SIRT7 WT但不是H187Y的细胞中，KLF4的乙酰化水平降低(图4F)。
SIRT7过表达也增加了PDGFB的启动子活性，其因为site1和site2的缺失而减弱(图4G)。SIRT7的催化突变体显示出较少的PDGFB启动子激活(图4H)。此外，K228(K228Q)处KLF4的乙酰化模拟突变体显示出PDGFB启动子的激活受损(图4I)。因此，我们得出结论，SIRT7使KLF4去乙酰化以促进其对Pdgfb的转录活性。
示例4提高SIRT7水平和活性可改善小鼠的PH
我们接下来检查了SIRT7是否可以作为PH的治疗靶点。为此，我们生成了SuHx-PH小鼠模型并使用了rAAV1-ICAM2-SIRT7(IS7O)病毒颗粒，它决定了Sirt7的EC特异性表达。如图所示，IS7O递送增加了EC中SIRT7的水平(图5A)，并降低了RVSP和RV肥大(图5B和5C)。SIRT7也抑制了肺血管重塑和受损的血管结构(图5D和5E)。此外，KLF4及其下游基因(包括eNOS)在SIRT7过表达的肺中上调(图5F和5G)。
SIRT7是NAD+依赖性去乙酰化酶。NAD+前体烟酰胺核苷(NR)可以上调组织中的NAD+水平并改善生理功能。我们将小鼠暴露于SuHx条件下以诱导PH，然后每天将NR口服递送至PH小鼠，以PBS作为对照，持续7天。血流动力学分析表明，NR治疗显著降低了PH小鼠的RVSP和富尔顿指数(图6A和6B)。血管壁厚度和闭塞也得到改善(图6C和6D)。为了阐明SIRT7在PH发病机制中的关键作用，我们进一步用NR治疗肺内皮细胞特异性SIRT7缺陷小鼠，其表明SIRT7缺失减弱了NR对PH的改善(图6E)。
除了NR之外，烟酰胺单核苷酸(NMN)也可以作为NAD+前体，并且可以增加NAD+水平，从而激活Sirtuins。Sirtuins是NAD+的主要下游介质，在调节代谢、DNA修复和染色质稳态方面具有重要作用。由于NR和NMN在衰老过程中都会增加SIRT1水平，因此NR和NMN激活SIRT7以调节细胞功能是合理的。
示例5 SIRT7可以通过外泌体传递
考虑到间充质干细胞(MSC)衍生的外泌体在临床中的治疗益处，我们打算使用外泌体提供SIRT7用于PH治疗。我们首先用慢病毒-SIRT7感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，以产生稳定的过表达SIRT7的内皮细胞。然后分离从内皮细胞衍生的外泌体，以表明SIRT7确实被分泌到外泌体中。因此，外泌体包装的SIRT7可用于随后的体内递送。
考虑到MSCs和MSCs衍生的外泌体的有益效果，也可以使用慢病毒-SIRT7对MSCs进行编辑，以产生含有SIRT7的外泌体。据报道，含有BDNF的MSCs衍生的外泌体可改善AD小鼠的脑功能。我们还可以使用MSCs衍生的外泌体来携带SIRT7并将其输送到患有肺动脉高压的小鼠的肺组织以改善血管重塑。
讨论
内皮功能障碍正在成为针对PAH的新治疗靶点。本研究旨在阐明PAH条件下内皮损伤的病理机制。老年患者中被更多地诊断出肺动脉高压，这表明与衰老相关的内皮损伤有助于血管重塑的启动。Sirtuins是NAD+依赖性去乙酰化酶，据报道其与人类和动物的寿命有关。NAD+水平在衰老过程中降低，老年生物体中SIRT的功能也减弱。在这里我们发现肺内皮细胞中减少的SIRT7与PAH的发病机制有关。PAH患者和动物模型均显示内皮细胞中SIRT7表达降低。此外，SIRT7的肺组织和内皮损失都加剧了PH的发展。
据报道，位于细胞核的SIRT7调节去乙酰化作用以及组蛋白和各种转录因子的功能，与血管老化有关。SIRT7的缺乏导致小鼠早衰，否则，SIRT7的过表达通过抗炎作用来改善血管衰老，延长早衰小鼠的寿命。因此，SIRT7也可能保护内皮功能免受PH的影响，PH也会发生炎症。此外，SIRT7的缺乏在急性肺损伤期间促进内皮细胞、炎症和通透性。肺动脉高压引起的EC功能障碍也受到EndoMT和炎症的影响。在这项研究中，我们发现由多环芳烃患者中上调的TGF-β和血清素诱导的内皮功能障碍，通过SIRT7敲低加速，而通过SIRT7过表达得到改善。
正如其他人发现KLF4的缺乏与PAH相关，我们的数据显示KLF4的修饰在PAH期间发生了改变。KLF4对内皮功能的调节依赖于其激活了EC保护性的NOS3的转录并抑制了炎症性NF-κB。SIRT7与KLF4的结合改变了其乙酰化状态，以促进其对PDGFB和NOS3的转录活性。Hao等人已发现KLF4的稳定性受E3连接酶Mule介导的Lys-48连接的泛素化调节，而Wang等人报道去泛素化酶USP10阻断了KLF4蛋白的降解。SIRT7缺乏会增加KLF4的mRNA水平，但不会增加其蛋白质水平，表明SIRT7也可能影响KLF4的翻译后调节。由于KLF4是一种重要的抗炎转录因子，SIRT7在血管中的抗炎作用可能是通过KLF4去乙酰化和激活来介导的。
NAD+是细胞生物过程的主要燃料。在老年哺乳动物中发现了较低的NAD+水平。据报道，口服NR上调NAD+可改善老年小鼠的骨骼肌功能并延长它们的寿命。由于Diederik发现PAH的肺ECs相比对照细胞对衰老更敏感，因此抗衰老剂可能会改善PAH发病机制中受损的EC功能。尽管发现烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)(NAD生物合成的限速成分)在PAH动物和患者中增加，但抑制NAMPT的有益作用主要取决于其通过钙库操作钙进入(SOCE)对PASMC的促增殖作用，而不是NAD+产生。我们的数据显示，直接增加NAD+水平的NR补充剂确实改善了动物模型中的PAH。考虑到SIRT7缺乏减弱了NR对肺血管重塑的有益作用，SIRT7在维持正常血管功能方面是可有可无的。
总之，我们的研究结果表明，SIRT7通过KLF4的去乙酰化作用保护内皮功能，有助于在PAH发病过程中维持正常的血管张力。更重要的是，我们的结果揭示了PAH的新治疗靶点以及未来临床前和临床治疗的新策略。
除非另有说明，否则本申请中涉及的数值范围包括上限值和下限值。尽管已经示出并描述了本申请的特定实施例，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以在不脱离本申请的更广泛方面的情况下进行改变和修改，因此，所附权利要求书的目的是涵盖落入本申请的真实精神和范围内的所有这样的改变和修改。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 使KLF4去乙酰化以促进其转录活性的作用剂的用途、维持肺动脉内皮细胞功能的方法和治疗肺动脉高压的方法
<130> PCT2200196
<160> 2
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 140
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ICAM2启动子
<400> 1
ccaagggctg cctggaggga gatggtgggc gcaggtctga gctatggccc agaatcccta 60
gccttctgca aactgatgac tgcatttcct ctcattatct gagagatctt tgggaagcca 120
cgtgcaccag ctcgttctag 140
<210> 2
<211> 1245
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠sirt7基因
<400> 2
gcgatcgcca tggcagccgg tggcggtctg agccgctcgg agcgcaaagc tgctgagcgg 60
gtccggaggc tgcgggagga gcagcagcgg gagcgcctcc gccaggtgtc acgcatcctg 120
aggaaggcgg ctgcagagcg cagcgcggag gagggccggc tcttggccga gagcgaggat 180
ctggtgaccg agctgcaggg tcgaagtcgg cggcgtgagg gcctcaagcg ccgccaggag 240
gaggtgtgtg atgacccgga ggagctgcgg aggaaggtcc gcgaactggc cggagctgtc 300
cgaagtgcca ggcacttggt tgtctacacg ggcgctggaa tcagcacagc agcttctatc 360
ccagattatc ggggtcctaa tggagtatgg acactgcttc agaaaggaag gcctgtgagt 420
gctgccgacc taagcgaagc ggagcctacc ctcacccaca tgagcatcac ccgtttgcat 480
gagcaaaagc tggtgcaaca cgtggtgtct cagaactgtg atgggctcca cctgcggagt 540
gggttgcccc ggaccgccat ctcagagctc catgggaata tgtatattga agtctgcacc 600
tcctgcatcc ctaacagaga gtatgtacga gtgtttgatg tgactgagcg tactgccctt 660
caccgacacc tgacaggccg gacctgccac aagtgcggga cccagcttcg ggataccatt 720
gtgcactttg gggagagggg gacattaggg cagcctctga actgggaggc agcgaccgag 780
gctgctagca aagcagacac aatcctgtgt ttagggtcca gcttgaaggt actaaagaaa 840
tatccccgcc tctggtgcat gacgaagcct ccaagccgtc gacccaaact ctacatcgtg 900
aacctgcagt ggaccccgaa ggatgactgg gctgccctga aactccatgg gaagtgtgat 960
gatgtcatgc aactcctcat gaatgaactg ggcctggaga ttcctgtcta caaccggtgg 1020
caggatccaa tcttctcctt ggcgaccccc ctccgtgctg gtgaagaagg cagccacagt 1080
aggaagtcac tatgcagaag cagagaagaa gccccacctg gggaccagag tgaccccctt 1140
gcctcagctc cccctatcct aggaggctgg tttggcaggg gttgtgccaa gcgtgcaaaa 1200
aggaagaaag tggcagatta taaggatgac gacgataaaa cgcgt 1245

Claims (20)

1.使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性的作用剂在制备用于治疗肺动脉高压的药物中的用途，其中，所述作用剂用于使KLF4在其第228位赖氨酸残基(K228)去乙酰化。
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述作用剂选自以下一种：
使肺动脉内皮细胞特异性表达SIRT7蛋白的重组病毒；
含有SIRT7蛋白的外泌体；以及
SIRT7蛋白的激动剂。
3.如权利要求2所述的用途，其中，所述使肺动脉内皮细胞特异性表达SIRT7蛋白的重组病毒是rAAV1-ICAM2-SIRT7。
4.如权利要求3所述的用途，其中，
在所述rAAV1-ICAM2-SIRT7中，SIRT7基因是小鼠SIRT7基因，具有由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，ICAM2具有由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，其中，SIRT7基因表达是由ICAM2启动子驱动的。
5.如权利要求2所述的用途，其中，所述含有SIRT7蛋白的外泌体是通过以下一种方式获得的：
用慢病毒-SIRT7重组病毒感染人脐静脉内皮细胞，对过表达SIRT7蛋白的人脐静脉内皮细胞进行培养，并从所述过表达SIRT7蛋白的人脐静脉内皮细胞中收集细胞外泌体；以及
用慢病毒-SIRT7重组病毒感染间充质干细胞，对过表达SIRT7蛋白的间充质干细胞进行培养，并从所述过表达SIRT7蛋白的间充质干细胞中收集细胞外泌体。
6.如权利要求2所述的用途，其中，所述SIRT7蛋白的激动剂是作为NAD+前体的烟酰胺核苷或者烟酰胺单核苷酸。
7.如权利要求2所述的用途，其中，
当所述作用剂为所述使人肺动脉内皮细胞特异性表达SIRT7蛋白的重组病毒或者所述含有SIRT7蛋白的外泌体时，所述药物被制备成吸入制剂。
8.如权利要求6所述的用途，其中，当所述作用剂为NAD+前体烟酰胺核苷时，所述药物被制备成口服或者适于肠胃外给药的制剂。
9.一种通过使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性来维持肺动脉内皮细胞的功能的体外方法，所述方法包括：
使所述肺动脉内皮细胞与有效增加KLF4去乙酰化的作用剂的量接触；其中，所述作用剂被用于使KLF4在K228位点去乙酰化以促进其对Pdgfb的转录活性。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述作用剂选自以下一种：
使肺动脉内皮细胞特异性表达SIRT7蛋白的重组病毒；
含有SIRT7蛋白的外泌体；以及
SIRT7蛋白的激动剂。
11.如权利要求10所述的方法，其中，
所述使肺动脉内皮细胞特异性表达SIRT7蛋白的重组病毒是rAAV1-ICAM2-SIRT7；并且
在所述rAAV1-ICAM2-SIRT7中，SIRT7基因是小鼠SIRT7基因，具有由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，ICAM2具有由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，其中，SIRT7基因表达是由ICAM2启动子驱动的。
12.如权利要求10所述的方法，其中，所述含有SIRT7蛋白的外泌体是通过以下一种方式获得的：
用慢病毒-SIRT7重组病毒感染人脐静脉内皮细胞，对过表达SIRT7蛋白的人脐静脉内皮细胞进行培养，并从所述过表达SIRT7蛋白的人脐静脉内皮细胞中收集细胞外泌体；以及
用慢病毒-SIRT7重组病毒感染间充质干细胞，对过表达SIRT7蛋白的间充质干细胞进行培养，并从所述过表达SIRT7蛋白的间充质干细胞中收集细胞外泌体。
13.如权利要求10所述的方法，其中，所述SIRT7蛋白的激动剂是作为NAD+前体的烟酰胺核苷或者烟酰胺单核苷酸。
14.如权利要求9所述的方法，其中，所述肺动脉内皮细胞是人肺动脉内皮细胞。
15.一种治疗肺动脉高压的方法，包括：给予需要治疗的患者或受试者有效量的使转录因子KLF4去乙酰化以促进其转录活性的作用剂，其中，所述作用剂用于使KLF4在K228位点去乙酰化。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述作用剂选自以下一种：
使肺动脉内皮细胞特异性表达SIRT7蛋白的重组病毒；
含有SIRT7蛋白的外泌体；以及
SIRT7蛋白的激动剂。
17.如权利要求16所述的方法，其中，
所述使肺动脉内皮细胞特异性表达SIRT7蛋白的重组病毒是rAAV1-ICAM2-SIRT7，其中，所述rAAV1-ICAM2-SIRT7的SIRT7基因是小鼠SIRT7基因，具有由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，ICAM2具有由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，其中，SIRT7基因表达是由ICAM2启动子驱动的。
18.如权利要求16所述的方法，其中，所述含有SIRT7蛋白的外泌体是通过以下一种方式获得的：
用慢病毒-SIRT7重组病毒感染人脐静脉内皮细胞，对过表达SIRT7蛋白的人脐静脉内皮细胞进行培养，并从所述过表达SIRT7蛋白的人脐静脉内皮细胞中收集细胞外泌体；以及
用慢病毒-SIRT7重组病毒感染间充质干细胞，对过表达SIRT7蛋白的间充质干细胞进行培养，并从所述过表达SIRT7蛋白的间充质干细胞中收集细胞外泌体。
19.如权利要求16所述的方法，其中，所述SIRT7蛋白的激动剂是作为NAD+前体的烟酰胺核苷或者烟酰胺单核苷酸。
20.如权利要求16所述的方法，其中，
当所述作用剂为所述使人肺动脉内皮细胞特异性表达SIRT7蛋白的重组病毒或者所述含有SIRT7蛋白的外泌体时，所述作用剂通过吸入的方式给药；
当所述作用剂为NAD+前体烟酰胺核苷时，所述作用剂被制备成口服或者肠胃外的方式给药。
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