KR102483242B1 - Mg53 돌연변이체, 및 그의 제조 방법 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

MG53 돌연변이체. 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역은 적어도 1개의 아미노산이 결실되고/거나 세린 또는 트레오닌을 제외한 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이된 아미노산으로 제공된다. 본 발명은 MG53 돌연변이체를 포함하는 제약 조성물, MG53 돌연변이체를 코딩하는 핵산, 및 MG53 돌연변이체를 제조하는 방법, 및 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에서의 MG53 돌연변이체의 용도를 포함한다. 특히, MG53 돌연변이체는 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하면서 야생형 MG53에 의해 야기되는 대사 부작용, 예컨대, 인슐린 저항성, 비만, 당뇨병, 고혈압, 및 이상지혈증을 피하거나 또는 감소시킬 수 있다.

Description

MG53 돌연변이체, 및 그의 제조 방법 및 그의 용도

본 발명은 생물의학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 MG53 돌연변이체, MG53 돌연변이체를 포함하는 제약 조성물, MG53 돌연변이체를 코딩하는 핵산, MG53 돌연변이체를 제조하는 방법, 및 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 MG53 돌연변이체의 용도에 관한 것이다.

TRIM72로도 알려진 Mitsugumin 53 (MG53)은 3부 모티프-함유 단백질 (TRIM) 패밀리의 구성원이다. MG53은 N-말단에서의 TRIM 모티프 및 C-말단에서의 SPRY 모티프를 포함한다. TRIM 모티프는 연속적으로 연결된 Ring, B-박스 및 코일드-코일 도메인으로 이루어진다 (문헌 [Chuanxi Cai et al., the Journal of Biological Chemistry, Vol. 284 (5), 3314-3322 (2009)] 참조). MG53은 신체 전체에 걸쳐 다양한 역할을 하지만, 주로 가로무늬근에서 발현되고, 골격근 및 심장의 항상성을 유지하는데 필수적이다. MG53은 세포 막 복구 기능 및 심장보호 기능을 갖는 것으로 이전에 밝혀졌다 (예를 들어, 문헌 [Chuanxi Cai et al., Nature Cell Biology, Vol. 11, 56-64 (2009)]; CN101797375B 참조). 게다가, 추가의 연구는 MG53이 또한 재관류 손상 샐비지 키나제 (RISK) 경로의 활성화에 의해, 허혈성 프리컨디셔닝 (IPC) 및 허혈성 포스트컨디셔닝 (PostC)에서 보호 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. MG53 분자의 N- 및 C-말단은 각각 카베올린-3 및 p85-PI3K 키나제에 결합하여 복합체를 형성할 수 있으며, 이는 심장 보호를 도출하는 RISK 경로를 활성화시킨다 (문헌 [Chun-Mei Cao et al., Circulation 121, 2565-2574, (2010)] 참조).

MG53이 세포 막 복구 기능 및 심장보호 기능을 가지고 있을지라도, 이전 연구는 또한 MG53이 E3 유비퀴틴 리가제 활성을 가지며, 이는 인슐린 저항성 및 대사 증후군의 발생에 기여한다는 것을 밝혀내었다. MG53의 N-말단에서의 TRIM 모티프의 Ring 도메인은 인슐린 수용체 (IR) 및 인슐린 수용체 기질-1 (IRS1)에 결합하고, 프로테아솜에 의한 이들 단백질의 유비퀴틴화 및 후속 분해를 매개하며, 그에 의해 인슐린 신호전달 경로를 차단하고 인슐린 저항성 및 연관된 대사 질환 예컨대 비만, 당뇨병, 고혈압, 이상지혈증 등으로 이어진다 (예를 들어, 문헌 [R. Song et al. Nature 494, 375-379, (2013); J. S. Yi et al., Nature Communications 4, 2354 (2013)] 참조). 이에 따라, 야생형 MG53은 세포 막 복구 기능 및 심장보호 기능을 도출하지만, 또한 유해한 부작용, 예컨대 인슐린 저항성 및 그의 연관된 대사 질환을 야기한다.

본 발명은 MG53 돌연변이체, MG53 돌연변이체를 포함하는 제약 조성물, MG53 돌연변이체를 코딩하는 핵산, MG53 돌연변이체를 제조하는 방법, 및 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 MG53 돌연변이체의 용도에 관한 것이다. 특히, MG53 돌연변이체는 세포 막 복구 기능 및/또는 심장보호 기능을 여전히 보유하면서 대사 부작용, 예컨대 인슐린 저항성, 비만, 당뇨병, 고혈압, 이상지혈증 등을 피하거나 또는 감소시킬 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 MG53 돌연변이체로서, 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역 내의 적어도 1개의 세린이 결실되고/거나 임의의 다른 비-세린 또는 비-트레오닌 아미노산(들)으로 돌연변이된 것을 제외하고는 야생형 MG53의 아미노산 서열과 동일한 MG53 돌연변이체에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 코일드-코일-SPRY 영역은 야생형 MG53의 아미노산 서열의 위치 122-477에 위치한다. 특정 실시양태에서, 야생형 MG53은 동물, 바람직하게는 포유동물, 예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 원숭이, 돼지, 개 등으로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 야생형 MG53의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 또는 서열식별번호: 142에 제시된다.

특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체는 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역 내의 적어도 1개의 세린이 비-극성 아미노산으로 돌연변이된 것을 제외하고는 야생형 MG53의 아미노산 서열과 동일하다. 특정 실시양태에서, 비-극성 아미노산은 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 특정 실시양태에서, 비-극성 아미노산은 알라닌이다. 특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체는 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역 내의 적어도 1개의 세린이 임의의 비-세린 또는 비-트레오닌 극성 아미노산(들)으로 돌연변이된 것을 제외하고는 야생형 MG53의 아미노산 서열과 동일하다. 특정 실시양태에서, 극성 아미노산은 글루타민, 시스테인, 아스파라긴, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 특정 실시양태에서, 극성 아미노산은 시스테인이다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열의 위치 150, 189, 211, 214, 246, 255, 269, 296, 297, 301, 305, 306, 307, 314, 341, 377, 405, 418, 425, 또는 430 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 서열식별번호: 139에 제시된 아미노산 서열의 위치 150, 189, 211, 214, 246, 255, 269, 296, 297, 301, 305, 306, 307, 314, 341, 377, 405, 418, 425, 또는 430 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 서열식별번호: 140에 제시된 아미노산 서열의 위치 150, 189, 211, 214, 246, 255, 269, 296, 297, 301, 305, 306, 307, 314, 341, 377, 405, 418, 425, 또는 430 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 서열식별번호: 141에 제시된 아미노산 서열의 위치 150, 189, 211, 214, 246, 255, 269, 296, 297, 301, 305, 306, 307, 314, 341, 377, 405, 418, 425, 또는 430 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 서열식별번호: 142에 제시된 아미노산 서열의 위치 150, 189, 211, 214, 246, 255, 또는 269 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열의 위치 188, 189, 210, 211, 214, 246, 253, 255, 269, 296, 297, 301, 305, 306, 307, 314, 341, 367, 377, 418, 430, 또는 440 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열의 위치 150, 188, 189, 210, 211, 214, 246, 253, 255, 269, 296, 297, 301, 305, 307, 314, 341, 367, 377, 418, 430, 440, 464, 또는 474 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열의 위치 150, 189, 211, 214, 246, 255, 269, 296, 297, 301, 305, 306, 307, 341, 377, 405, 418, 425, 430, 또는 464 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열의 위치 150, 189, 211, 214, 246, 255, 269, 296, 301, 305, 307, 314, 341, 377, 411, 418, 425, 430, 또는 474 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열의 위치 150, 189, 211, 214, 246, 255, 269, 296, 297, 301, 305, 307, 314, 341, 367, 377, 418, 425, 또는 430 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 아미노산 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 또는 서열식별번호: 142)의 위치 150, 188-189, 210-211, 214, 246, 253-255, 269, 296-297, 301, 305-307, 314, 341, 367, 377, 405, 411, 418, 425, 430, 440, 464, 또는 474 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 아미노산 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 또는 서열식별번호: 142)의 위치 189, 211, 214, 246, 253-255, 269, 296, 301, 305, 307, 341, 377, 418, 또는 430 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 아미노산 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 또는 서열식별번호: 142)의 위치 211, 214, 246, 253-255, 269, 296, 또는 297 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 아미노산 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 또는 서열식별번호: 142)의 위치 211, 214, 246, 255, 269, 296, 또는 297 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 아미노산 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 또는 서열식별번호: 142)의 위치 253-255 중 하나 이상에 위치한다. 특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 아미노산 서열의 위치 253에 위치한다. 특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 아미노산 서열의 위치 255에 위치한다. 특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열의 위치 255에 위치한다. 특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53의 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141 또는 서열식별번호: 142에 제시된 아미노산 서열의 위치 255에 위치한다.

특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체는 2개 이상의 세린 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체의 2개 이상의 세린 돌연변이는 위치 253-255 중 하나 이상에서의 세린 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체의 2개 이상의 세린 돌연변이는 위치 253에서의 세린 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체의 2개 이상의 세린 돌연변이는 위치 255에서의 세린 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체의 2개 이상의 세린 돌연변이는 위치 253 및 255에서의 세린 돌연변이를 포함한다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 상이한 종의 야생형 MG53 단백질 내의 세린 잔기가 상이한 위치에 위치할 수 있고, 이에 따라 결실 또는 돌연변이된 세린의 위치가 또한 상이할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 서열식별번호: 1에 제시된 야생형 MG53의 아미노산 서열 내의 상응하는 세린 위치의 1 내지 10개 아미노산, 1 내지 5개 아미노산, 또는 1 내지 3개 아미노산 상류 또는 하류 내에 있다.

특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체의 아미노산 서열은 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149 또는 서열식별번호: 150에 제시된 아미노산 서열이다. 바람직하게는, 특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체의 아미노산 서열은 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열이다. 특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체의 아미노산 서열은 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 150에 제시된 아미노산 서열 중 하나에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 상동성을 갖고, MG53 돌연변이체는 세포 막 복구 기능 및/또는 심장보호 기능을 여전히 보유하면서 야생형 MG53에 의해 야기되는 대사 부작용을 피한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 MG53 돌연변이체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 MG53 돌연변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 핵산은 서열식별번호: 13-18에 제시된 핵산 서열 중 어느 하나를 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산은 서열식별번호: 151-154에 제시된 핵산 서열 중 어느 하나를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 MG53 돌연변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 핵산은 서열식별번호: 13-18에 제시된 핵산 서열 중 어느 하나를 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산은 서열식별번호: 151-154에 제시된 핵산 서열 중 어느 하나를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 돌연변이를 위한 1개 이상의 세린 위치를 결정하고, 야생형 MG53의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드의 전장 서열 상의 상기 위치에서 부위-지정 돌연변이유발을 수행하고, 부위-지정 돌연변이유발을 갖는 플라스미드를 숙주 세포 내로 형질감염시키고, 숙주 세포가 MG53 돌연변이체를 생산하도록 유도하는 것을 포함하는, MG53 돌연변이체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 부위-지정 돌연변이유발은 하기 단계를 포함한다: (1) cDNA 서열 내 부위-지정 돌연변이유발에 대해 표적화된 아미노산의 상응하는 뉴클레오티드 부위를 결정하고; 표적 아미노산에 따른 돌연변이 부위에서의 뉴클레오티드 서열을 변형시키고; 돌연변이 부위를 포함하는 20-40 bp 길이의 서열을 절취함으로써 프라이머를 디자인하는 단계; (2) 단계 (1)의 프라이머를 사용하고 야생형 MG53 플라스미드를 주형으로 하여 PCR 반응을 수행하고, PCR 산물에 대해 아가로스 겔 전기영동을 수행하고, PCR 산물을 정제하는 단계; (3) 제한 엔도뉴클레아제를 사용함으로써 단계 (2)의 정제된 PCR 산물에 대해 효소적 반응을 수행하고, 효소-소화된 산물을 적합한 플라스미드 발현 벡터와 라이게이션하고, 라이게이션 산물을 박테리아 적격 세포에서 형질전환 및 배양하는 단계. 특정 실시양태에서, 부위-지정 돌연변이유발은 하기 단계를 추가로 포함한다: (4) 단계 (1)의 프라이머를 사용함으로써 콜로니 PCR 식별을 수행하기 위한 단계 (3)의 클론을 선택하고, PCR 산물에 대해 아가로스 겔 전기영동을 수행하고, 이어서 DNA 서열분석 식별을 수행하여 부위-지정 돌연변이유발을 갖는 양성 클론을 식별하는 단계.

또 다른 측면에서, 본 발명은 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 MG53 돌연변이체의 용도에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 의약은 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하면서 대사 부작용, 예컨대 인슐린 저항성, 비만, 당뇨병, 고혈압, 이상지혈증을 피하거나 또는 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 심장 질환은 당뇨병성 심장 질환, 심근 허혈, 심장 허혈/재관류 손상, 심근경색, 심부전, 부정맥, 심장 파열, 협심증, 심근염, 관상동맥 심장 질환, 및 심막염을 포함하나 이에 제한되지는 않는 심근 손상과 연관된 질환이다. 특정 실시양태에서, 당뇨병성 뇌혈관 질환은 뇌동맥경화증, 허혈성 뇌혈관 질환, 뇌출혈, 뇌위축, 및 뇌경색을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 당뇨병성 안구 합병증은 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 백내장, 당뇨병 연관된 포도막염, 및 실명을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 당뇨병성 신경병증은 당뇨병성 말초 신경병증을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 신장 질환은 급성 사구체신염, 만성 사구체신염, 신증후군, 급성 신장 손상, 당뇨병성 신병증 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환은 신장, 뇌, 폐, 간, 심장, 비장, 소화관, 및 피부의 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환, 예컨대 뇌 손상, 폐 손상, 비장 손상, 비장 파열, 위 궤양, 위염, 위 천공, 위장관 점막 손상, 외상, 화상, 궤양, 점막염, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 졸중, 피부 노화 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 서열식별번호: 7에 제시된 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149 또는 서열식별번호: 150에 제시된 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 MG53 돌연변이체를 투여하는 것을 포함하는, 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체는 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하면서 대사 부작용, 예컨대 인슐린 저항성, 비만, 당뇨병, 고혈압, 및 이상지혈증을 피하거나 또는 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 심장 질환은 당뇨병성 심장 질환, 심근 허혈, 심장 허혈/재관류 손상, 심근경색, 심부전, 부정맥, 심장 파열, 협심증, 심근염, 관상동맥 심장 질환, 및 심막염을 포함하나 이에 제한되지는 않는 심근 손상과 연관된 질환이다. 특정 실시양태에서, 당뇨병성 뇌혈관 질환은 뇌동맥경화증, 허혈성 뇌혈관 질환, 뇌출혈, 뇌위축, 및 뇌경색을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 당뇨병성 안구 합병증은 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 백내장, 당뇨병 연관된 포도막염, 및 실명을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 당뇨병성 신경병증은 당뇨병성 말초 신경병증을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 신장 질환은 급성 사구체신염, 만성 사구체신염, 신증후군, 급성 신장 손상, 당뇨병성 신병증 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환은 신장, 뇌, 폐, 간, 심장, 비장, 소화관, 및 피부의 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환, 예컨대 뇌 손상, 폐 손상, 비장 손상, 비장 파열, 위 궤양, 위염, 위 천공, 위장관 점막 손상, 외상, 화상, 궤양, 점막염, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 졸중, 피부 노화 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 서열식별번호: 7에 제시된 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 또는 서열식별번호: 150에 제시된 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하는데 사용하기 위한 MG53 돌연변이체에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체는 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하면서 대사 부작용, 예컨대 인슐린 저항성, 비만, 당뇨병, 고혈압, 및 이상지혈증을 피하거나 또는 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 심장 질환은 당뇨병성 심장 질환, 심근 허혈, 심장 허혈/재관류 손상, 심근경색, 심부전, 부정맥, 심장 파열, 협심증, 심근염, 관상동맥 심장 질환, 및 심막염을 포함하나 이에 제한되지는 않는 심근 손상과 연관된 질환이다. 특정 실시양태에서, 당뇨병성 뇌혈관 질환은 뇌동맥경화증, 허혈성 뇌혈관 질환, 뇌출혈, 뇌위축, 및 뇌경색을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 당뇨병성 안구 합병증은 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 백내장, 당뇨병 연관된 포도막염, 및 실명을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 당뇨병성 신경병증은 당뇨병성 말초 신경병증을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 신장 질환은 급성 사구체신염, 만성 사구체신염, 신증후군, 급성 신장 손상, 당뇨병성 신병증 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환은 신장, 뇌, 폐, 간, 심장, 비장, 소화관, 및 피부의 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환, 예컨대 뇌 손상, 폐 손상, 비장 손상, 비장 파열, 위 궤양, 위염, 위 천공, 위장관 점막 손상, 외상, 화상, 궤양, 점막염, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 졸중, 피부 노화 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하는데 사용하기 위한 서열식별번호: 7에 제시된 폴리펩티드에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하는데 사용하기 위한 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 또는 서열식별번호: 150에 제시된 폴리펩티드에 관한 것이다.

도 1은 야생형 MG53의 분자 구조를 예시한다.
도 2는 인간 야생형 MG53의 아미노산 서열 서열식별번호: 1 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 19를 예시한다.
도 3은 마우스 야생형 MG53의 아미노산 서열 서열식별번호: 2 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 20을 예시한다.
도 4는 래트 야생형 MG53의 아미노산 서열 서열식별번호: 3 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 21을 예시한다.
도 5는 원숭이 야생형 MG53의 아미노산 서열 서열식별번호: 4 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 22를 예시한다.
도 6은 돼지 야생형 MG53의 아미노산 서열 서열식별번호: 5 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 23을 예시한다.
도 7은 개 야생형 MG53의 아미노산 서열 서열식별번호: 6 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 24를 예시한다.
도 8은 인간 MG53 S255A 돌연변이체의 아미노산 서열 서열식별번호: 7 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 13을 예시한다.
도 9는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체의 아미노산 서열 서열식별번호: 8 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 14를 예시한다.
도 10은 래트 MG53 S255A 돌연변이체의 아미노산 서열 서열식별번호: 9 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 15를 예시한다.
도 11은 원숭이 MG53 S255A 돌연변이체의 아미노산 서열 서열식별번호: 10 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 16을 예시한다.
도 12는 돼지 MG53 S255A 돌연변이체의 아미노산 서열 서열식별번호: 11 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 17을 예시한다.
도 13은 개 MG53 S255A 돌연변이체의 아미노산 서열 서열식별번호: 12 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 18을 예시한다.
도 14는 아데노바이러스를 사용하여 신생아 래트의 1차 배양된 심근세포에서 마우스 야생형 MG53 및 마우스 MG53 S255A 돌연변이체를 과다발현한 후의 세포내 ATP 및 LDH 방출의 양을 예시한다. 상부 패널은 아데노바이러스를 사용하여 신생아 래트의 1차 배양된 심근세포에서 마우스 야생형 MG53 및 마우스 MG53 S255A 돌연변이체를 과다발현할 때 저산소증 및 재산소화 치료 후의 세포내 ATP의 검출된 양을 제시하며, 여기서 Adv-β-gal은 갈락토시다제를 발현하지만, 마우스 야생형 MG53 또는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체를 발현하지 않는 대조군 바이러스를 나타내며; Adv-MG53-myc는 마우스 야생형 MG53을 발현하는 아데노바이러스를 나타내며; Adv-MG53-S255A-myc는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체를 발현하는 아데노바이러스를 나타낸다 (n=7, *p <0.05, **p <0.01). 하부 패널은 아데노바이러스를 사용하여 신생아 래트의 1차 배양된 심근세포에서 마우스 야생형 MG53 및 마우스 MG53 S255A 돌연변이체를 과다발현할 때 저산소증 및 재산소화 치료 후의 LDH 방출의 검출된 양을 제시하며, 여기서 Adv-β-gal은 갈락토시다제를 발현하지만, 마우스 야생형 MG53 또는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체를 발현하지 않는 대조군 바이러스를 나타내며; Adv-MG53-myc는 마우스 야생형 MG53을 발현하는 아데노바이러스를 나타내며; Adv-MG53-S255A-myc는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체를 발현하는 아데노바이러스를 나타낸다 (n=7, **p<0.01, ***p<0.005).
도 15는 마우스 MG53 S255A 돌연변이가 마우스 야생형 MG53에 의한 AKT의 활성화에 영향을 미치지 않는다는 것을 예시한다. 상부 패널은 아데노바이러스를 사용하여 신생아 래트의 1차 배양된 심근세포에서 마우스 야생형 MG53 및 마우스 MG53 S255A 돌연변이체를 과다발현할 때 웨스턴 블롯에 의해 검출된 세포내 p-AKT⁴⁷³의 양을 제시하며, 여기서 β-gal은 갈락토시다제를 발현하지만, 마우스 야생형 MG53 또는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체를 발현하지 않는 대조군 아데노바이러스를 나타내며; MG53은 마우스 야생형 MG53을 발현하는 아데노바이러스를 나타내며; S255A는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체를 발현하는 아데노바이러스를 나타낸다. 하부 패널은 상부 패널의 통계적 다이어그램이며, 여기서 Adv β-gal은 갈락토시다제를 발현하지만, 마우스 야생형 MG53 또는 MG53 S255A 돌연변이체를 발현하지 않는 대조군 아데노바이러스를 나타내며; Adv MG53은 마우스 야생형 MG53을 발현하는 아데노바이러스를 나타내며; Adv MG53 S255A는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체를 발현하는 아데노바이러스를 나타낸다 (n = 5, * p <0.05).
도 16은 마우스 MG53 S255A 돌연변이가 MG53-매개된 기질 분해를 억제한다는 것을 예시한다. 도 16A의 상부 패널은 HEK293T 세포주에서 IRS1, 마우스 야생형 MG53, 마우스 MG53 S255A 돌연변이체, 또는 마우스 MG53-D-RING 말단절단된 돌연변이체를 과다발현하는 플라스미드에서의 웨스턴 블롯에 의해 검출된 IRS1 단백질 함량을 제시하며, 여기서 CON은 마우스 야생형 MG53, 마우스 MG53 S255A 돌연변이체, 및 마우스 MG53-D-RING 말단절단된 돌연변이체의 발현 없는 공벡터 플라스미드 대조군을 나타내며; MG53은 마우스 야생형 MG53을 발현하는 벡터 플라스미드를 나타내며; S255A는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체를 발현하는 벡터 플라스미드를 나타내며; D-RING는 마우스 MG53 말단절단된 돌연변이체 MG53-D-RING를 발현하는 벡터 플라스미드를 나타내며, 여기서 마우스 RING 도메인은 말단절단된다. 도 16A의 하부 패널은 상부 패널의 통계적 다이어그램이다 (n=5, *p <0.05; **p <0.01). 도 16B의 상부 패널은 HEK293T 세포주에서 IR, 마우스 야생형 MG53, 마우스 MG53 S255A 돌연변이체, 또는 마우스 MG53-D-RING 말단절단된 돌연변이체를 과다발현하는 플라스미드에서의 웨스턴 블롯에 의해 검출된 IR 단백질 함량을 제시하며, 여기서 CON은 마우스 야생형 MG53, 마우스 MG53 S255A 돌연변이체, 및 마우스 MG53-D-RING 말단절단된 돌연변이체의 발현 없는 공벡터 플라스미드 대조군을 나타내며; MG53은 마우스 야생형 MG53을 발현하는 벡터 플라스미드를 나타내며; S255A는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체를 발현하는 벡터 플라스미드를 나타내며; D-RING는 마우스 MG53-D-RING 말단절단된 돌연변이체를 발현하는 벡터 플라스미드를 나타낸다. 도 16B의 하부 패널은 상부 패널의 통계적 다이어그램이다 (n=5, **p <0.01).
도 17은 인간 MG53 S255A 돌연변이체가 MG53-매개된 기질 분해를 억제한다는 것을 예시한다. 상부 패널은 HEK293T 세포주에서 IRS1, 인간 야생형 MG53, 인간 MG53 S255A 돌연변이체, 또는 인간 MG53-D-RING 말단절단된 돌연변이체를 과다발현하는 플라스미드에서의 웨스턴 블롯에 의해 검출된 IRS1 단백질 함량을 제시하며, 여기서 CON은 인간 야생형 MG53, 인간 MG53 S255A 돌연변이체, 및 인간 MG53-D-RING 말단절단된 돌연변이체의 발현 없는 공벡터 플라스미드 대조군을 나타내며; MG53은 인간 야생형 MG53을 발현하는 벡터 플라스미드를 나타내며; MG53-dR은 인간 MG53-D-RING 말단절단된 돌연변이체를 발현하는 벡터 플라스미드를 나타낸다. 하부 패널은 상부 패널의 통계적 다이어그램이다 (n=5, **p <0.01).
도 18은 마우스 MG53 S255A 돌연변이체가 기질 IRS1에 대한 MG53의 결합을 억제한다는 것을 예시한다. 도 18A는 HEK293T 세포주에서 마우스 야생형 MG53 및 MG53 기질 IRS1을 공동-발현하거나, 또는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체 및 MG53 기질 IRS1을 공동-발현한 후에 IRS1 단백질을 면역침전하고 웨스턴 블롯을 수행함으로써 검출된 MG53-IRS1 복합체의 함량을 제시한다. 도 18A에서, MG53은 마우스 야생형 MG53을 나타내며, MG53 S255A는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체를 나타내며, IRS1은 마우스 인슐린 수용체 기질을 나타낸다. 도 18B는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 시험 동안 이동상에서의 정제된 단백질 마우스 야생형 MG53 또는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체에 대한 고정화 및 정제된 단백질 IRS1의 결합 강도를 제시하며, 여기서 MG53은 마우스 야생형 MG53을 나타내며, MG53-S255A는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체를 나타내며, 래트 IRS1은 래트 인슐린 수용체 기질을 나타낸다.
도 19는 단백질 IRS1의 양에 대한 마우스 MG53 S255A 돌연변이체의 영향을 예시한다. 상부 패널은 HEK293T 세포주에서 IRS1, Ub, MG53, 또는 MG53 S255A 돌연변이체를 과다발현하는 플라스미드에서의 웨스턴 블롯에 의해 검출된 단백질 IRS1의 함량을 제시하며, 여기서 Ub는 유비퀴틴을 나타내며, MG53은 마우스 야생형 MG53을 나타내며, MG53-S255A는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체를 나타낸다. 하부 패널은 상부 패널의 통계적 다이어그램이며, 여기서 CON은 마우스 야생형 MG53 및 마우스 MG53 S255A 돌연변이체의 발현 없는 공벡터 플라스미드 대조군을 나타내며, MG53-S255A는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체를 발현하는 벡터 플라스미드를 나타낸다 (n=3, *p <0.05; ***p <0.005).
도 20은 인간 MG53 하위유형의 아미노산 서열 서열식별번호: 139 (이는 NCBI 번호 BAD18630.1에 상응함) 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 143을 예시한다.
도 21은 인간 MG53 하위유형의 아미노산 서열 서열식별번호: 140 (이는 NCBI 수탁 번호 XP_016878743.1에 상응함) 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 144를 예시한다.
도 22는 인간 MG53 하위유형의 아미노산 서열 서열식별번호: 141 (이는 NCBI BAC03506.1에 상응함) 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 145를 예시한다.
도 23은 인간 MG53 하위유형의 아미노산 서열 서열식별번호: 142 (이는 NCBI 번호 AAH33211.1에 상응함) 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 146을 예시한다.
도 24는 인간 MG53 하위유형 S255A 돌연변이체의 아미노산 서열 서열식별번호: 147 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 151을 예시한다.
도 25는 인간 MG53 하위유형 S255A 돌연변이체의 아미노산 서열 서열식별번호: 148 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 152를 예시한다.
도 26은 인간 MG53 하위유형 S255A 돌연변이체의 아미노산 서열 서열식별번호: 149 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 153을 예시한다.
도 27은 인간 MG53 하위유형 S255A 돌연변이체의 아미노산 서열 서열식별번호: 150 및 그의 코딩 핵산 서열 서열식별번호: 154를 예시한다.
도 28은 본 발명의 각각의 종에 대한 전장 MG53 단백질 및 그의 단편의 아미노산 위치의 명명법 개략도를 예시한다.

본 발명의 다양한 측면 및 실시양태가 하기에 개시될지라도, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 출원의 대상의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 다양한 동등한 변화 및 변형을 만들 수 있다. 본원에 개시된 다양한 측면 및 실시양태는 단지 예시로서 주어지고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 출원의 실제 보호 범주는 청구범위에 의해 정의된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 출원에 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.

한 측면에서, 본 발명은 MG53 돌연변이체로서, 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역 내의 적어도 1개의 세린이 결실되고/거나 임의의 다른 비-세린 또는 비-트레오닌 아미노산으로 돌연변이된 것을 제외하고는 야생형 MG53의 아미노산 서열과 동일한 MG53 돌연변이체에 관한 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "야생형 MG53" 또는 "야생형 MG53 단백질"은 대상체에서 발현되는 전장 MG53 단백질 또는 그의 단편의 천연 서열을 지칭한다. MG53 단백질은 도 1에 제시된 구조를 갖는 다중기능적 단백질이다. 상이한 종의 전장 MG53 단백질은 길이가 다소 상이하지만, 일반적으로 N-말단에서의 TRIM 모티프 및 C-말단에서의 SPRY 모티프를 포함하여 약 477개의 아미노산을 갖는다. TRIM 모티프는 연속적으로 연결된 Ring, B-박스 및 코일드-코일 도메인 (RBCC)으로 이루어진다. MG53 단백질은 허혈-재관류 손상의 프리-컨디셔팅 및 포스트-컨디셔닝 보호에서 필수적인 역할을 하는 막 복구를 위한 중요한 성분 중 하나이다. 반면에, MG53 단백질의 고발현은 또한 인슐린 저항성 및 대사 증후군을 야기할 수 있다. MG53의 구조 및 기능, 뿐만 아니라 다른 단백질과의 그의 상호작용은 관련 기술분야에 상세히 보고된 바 있다 (예를 들어, 문헌 [Chuanxi Cai et al., Journal of Biological Chemistry, 284 (5), 3314-3322, (2009); Xianhua Wang et al., Circulation Research 107, 76-83, (2010); Eun Young Park et al., Proteins, 790-795 (2009)] 참조).

본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물 둘 다를 포함한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물, 예컨대 포유동물 및 비-포유동물을 포함한다. "대상체"는 또한 가축 동물 예컨대 소, 돼지, 양, 가금류 및 말; 또는 설치류 예컨대 래트, 마우스; 또는 영장류 예컨대 유인원, 원숭이; 또는 가축 예컨대 개 또는 고양이일 수 있다. "대상체"는 남성 또는 여성일 수 있고, 노인, 성인, 청소년, 소아 또는 유아일 수 있다. 인간 "대상체"는 백인, 아프리카인, 아시아인, 셈족, 또는 다른 인종, 또는 상기 인종 배경의 혼혈일 수 있다.

특정 실시양태에서, 야생형 MG53은 바람직하게는 포유동물, 예를 들어, 인간, 유인원, 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 등으로부터 유래된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 개방 채널 (예를 들어, 국립 생물 정보 센터 (NCBI))로부터, 본원에 참조로 포함된, 각각의 종의 야생형 MG53의 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 특정 실시양태에서, 야생형 MG53의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 6에 제시되며, 이는 각각 인간, 마우스, 래트, 원숭이, 돼지, 및 개 야생형 MG53 전장 단백질에 상응한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 본원에 기재된 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 또는 아미노산의 유사체 또는 모방체를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 관련 기술분야에 알려진 임의의 방법, 예컨대, 비제한적으로, 천연 단리, 재조합 발현, 화학적 합성 등에 의해 수득될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "코일드-코일-SPRY 영역"은 야생형 MG53의 아미노산 서열의 상응하는 영역이다. 대부분의 TRIM 패밀리 단백질에 존재하는 코일드-코일 도메인은, TRIM 패밀리 구성원 사이 또는 TRIM 구성원 및 다른 단백질 사이의 동종 또는 이종 회합을 매개하여 복합체 예컨대 이량체, 중합체 등을 형성하며, 그에 의해 세포 막 복구를 도출한다 (예를 들어, 문헌 [Ozato et al., Nature Review Immunology, 8: 849-860 (2008); Sanchez S. et al., PNAS, 111: 2494-2499 (2014)] 참조). SPRY 도메인은 야생형 MG53의 아미노산 서열의 C-말단에 위치하고, 전형적으로 야생형 MG53의 아미노산 서열의 위치 288-477에 위치한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 SPRY 도메인은 PRY 모티프 및 SPRY 모티프를 포함한다. SPRY 도메인은 진화론적으로 보존되고, 진균 내지 고등 동물 전반에 걸쳐 발현된다 (예를 들어, 문헌 [Ozato et al., Nature Review Immunology, 8: 849-860 (2008)] 참조). 지금까지, 약 60종의 TRIM 패밀리 구성원이 상이한 포유동물 게놈에서 확인되어 있고, 이들 중 15종의 구성원이 TRIM 도메인 (즉, Ring-B-박스-코일드-코일 도메인) 후에 유사한 SPRY 도메인을 보유하고, MG53은 이들 TRIM 슈퍼패밀리 단백질을 갖는 보존된 1차 구조를 나타낸다 (예를 들어, WO2009/073808 참조). 코일드-코일-SPRY 영역에 상응하는 특정한 아미노산 위치는 상이한 종 중에서 다소 상이할 수 있지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 선행 기술 (예를 들어, NCBI에 개시된 바와 같은 정보) 및/또는 상용 실험 방법을 통해 상이한 종의 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역에 상응하는 특정한 아미노산 위치를 수득할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 코일드-코일-SPRY 영역은 야생형 MG53의 아미노산 위치 122-477 또는 구조적으로 유사한 영역을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 구조적으로 유사한 영역은 아미노산 위치 122-477의 70%, 80% 또는 90% 인접 아미노산 서열을 포함하는 영역일 수 있다. 특정 실시양태에서, 구조적으로 유사한 영역의 N-말단 개시 부위는 아미노산 위치 122-477의 N-말단보다 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 아미노산만큼 더 길거나 또는 더 짧을 수 있고/거나, 구조적으로 유사한 영역의 C-말단 종결 부위는 아미노산 위치 122-477의 C-말단보다 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 아미노산만큼 더 길거나 또는 더 짧을 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 코일드-코일-SPRY 영역은 서열식별번호: 1의 아미노산 위치 122-477에 상응하는 인간 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 1)의 코일드-코일-SPRY 영역을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "MG53 돌연변이체" 또는 "MG53 단백질 돌연변이체"는 야생형 MG53 단백질의 천연 아미노산 서열이 변형된 MG53 단백질 변이체 또는 단편을 지칭한다. 이러한 변형은 1개 이상의 아미노산의 결실 및/또는 치환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MG53 돌연변이체는 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역 내의 적어도 1개의 세린이 결실되고/거나 임의의 다른 비-세린 또는 비-트레오닌 아미노산(들)으로 돌연변이된 것을 제외하고는 야생형 MG53의 아미노산 서열과 동일하다.

본원에 사용된 바와 같은 "적어도 1개의 세린"은 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역 내의 1개 이상의 세린, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 또는 그 초과의 세린을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, "다른 비-세린 또는 비-트레오닌 아미노산"은, 세린 또는 트레오닌이 아닌, 임의의 다른 천연 아미노산, 치환된 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 치환된 비-천연 아미노산, 또는 그의 임의의 조합을 지칭한다. 천연 아미노산의 명칭은 본 출원에서 표준 단일 문자 또는 3-문자 코드로서 나타내어진다. 천연 아미노산은 비-극성 아미노산 및 극성 아미노산을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 기재된 임의의 아미노산은 D- 또는 L-배위일 수 있다.

특정 실시양태에서, 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역 내의 적어도 1개의 세린 (Ser 또는 S)은 결실되거나 또는 비-극성 아미노산으로 돌연변이된다. 비-극성 아미노산은 글리신 (Gly 또는 G), 알라닌 (Ala 또는 A), 류신 (Leu 또는 L), 이소류신 (Ile 또는 I), 발린 (Val 또는 V), 프롤린 (Pro 또는 P), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 메티오닌 (Met 또는 M), 트립토판 (Trp 또는 W)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역 내의 적어도 1개의 세린은 결실되거나 또는 글리신 또는 알라닌으로 돌연변이된다. 바람직하게는, 특정 실시양태에서, 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역 내의 적어도 1개의 세린은 결실되거나 또는 알라닌으로 돌연변이된다. 보다 바람직하게는, 특정 실시양태에서, 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역 내의 적어도 1개의 세린은 알라닌으로 돌연변이된다.

특정 실시양태에서, 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역 내의 적어도 1개의 세린은 결실되거나 또는 극성 아미노산으로 돌연변이된다. 극성 아미노산은 글루타민 (Gln 또는 Q), 시스테인 (Cys 또는 C), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 티로신 (Tyr 또는 Y), 아스파르트산 (Asp 또는 D), 글루탐산 (Glu 또는 E), 리신 (Lys 또는 K), 아르기닌 (Arg 또는 R), 히스티딘 (His 또는 H)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역 내의 적어도 1개의 세린은 결실되거나 또는 시스테인 또는 히스티딘으로 돌연변이된다. 바람직하게는, 특정 실시양태에서, 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역 내의 적어도 1개의 세린은 결실되거나 또는 시스테인으로 돌연변이된다. 보다 바람직하게는, 특정 실시양태에서, 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역 내의 적어도 1개의 세린은 시스테인으로 돌연변이된다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 세린 돌연변이는 1개의 세린이 1개 이상의 다른 비-세린 또는 비-트레오닌 아미노산으로 치환된 것을 포함하며, 예를 들어, 1개의 세린은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 다른 비-세린 또는 비-트레오닌 아미노산으로 치환될 수 있다. 2개 이상의 세린이 치환되는 경우에, 각각의 세린은 각각 1개 이상의 다른 비-세린 또는 비-트레오닌 아미노산으로 독립적으로 치환될 수 있다.

각각의 종의 야생형 MG53의 특정한 세린 위치는 종마다 달라질 수 있지만; 그러나, 일단 종의 야생형 MG53의 아미노산 서열 및 그의 코일드-코일-SPRY 영역에 상응하는 아미노산 영역이 알려지면, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 코일드-코일-SPRY 영역 내의 세린이 상응하는 특정한 아미노산 위치를 결정할 수 있다. 예를 들어, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인간 야생형 MG53의 아미노산 서열이 서열식별번호: 1에 제시되고 그의 코일드-코일-SPRY 영역이 서열식별번호: 1의 아미노산 위치 122-477에 상응하다는 것을 알고 있다. 이러한 상황 하에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인간 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역 내의 세린에 상응하는 특정한 아미노산 위치가 각각 서열식별번호: 1의 위치 150, 189, 211, 214, 246, 255, 269, 296, 297, 301, 305, 306, 307, 314, 341, 377, 405, 418, 425, 430이라는 것을 결정할 수 있다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 서열식별번호: 1에 제시된 인간 야생형 MG53 아미노산 서열의 하기 위치: 위치 150, 189, 211, 214, 246, 255, 269, 296, 297, 301, 305, 306, 307, 314, 341, 377, 405, 418, 425, 430 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 MG53 단백질은 전장 MG53 단백질, 또는 그의 말단절단된 돌연변이체 (즉, 전장 MG53 단백질의 말단절단된 단편), 또는 전장 MG53 단백질 또는 그의 말단절단된 돌연변이체와 비교하여 1개 이상의 아미노산의 돌연변이, 첨가 또는 결실을 갖는 돌연변이체를 포함한다. 이러한 경우에, 상이한 MG53 단백질 하위유형의 아미노산 서열에 대한 아미노산 위치의 명명법을 통합하기 위해, 특정 MG53 단백질 하위유형의 아미노산 위치가 본 발명에 언급될 때, MG53 단백질 하위유형의 아미노산 서열은 전장 MG53 단백질 (예를 들어, 서열식별번호: 1)의 아미노산 서열과 정렬될 것이고, 필요한 경우에, 갭은 동일한 아미노산의 수를 최대화하도록 관련 아미노산 서열 내로 도입될 것이다. MG53 하위유형의 아미노산 서열 내의 첫번째 아미노산의 위치 번호는, 종의 야생형 MG53의 아미노산 위치를 참조할 때, 전장 MG53 단백질 및 그의 말단절단된 돌연변이체 둘 다가 전장 MG53 단백질의 아미노산 서열 내의 위치 번호를 지칭하도록, 상기 아미노산에 상응하는 전장 MG53 단백질의 위치 번호로서 지정된다.

예를 들어, 도 28에 제시된 바와 같이, 종의 전장 MG53 단백질은 n개의 아미노산을 갖고 상응하는 아미노산 위치는 위치 1-n이다. MG53 하위유형 1의 아미노산 서열은, 전장 MG53 단백질의 아미노산 서열과 비교하여, 전장 서열의 위치 m-n에 위치한 아미노산에 상응하는 말단절단된 돌연변이체를 함유한다. 이에 따라, MG53 하위유형 1 아미노산 서열의 첫번째 아미노산 위치는 위치 m으로서 지정되고, MG53 하위유형 1 아미노산 서열의 두번째 아미노산 위치는 위치 m+1로서 지정되며, 유사하게, MG53 하위유형 1 아미노산 서열의 마지막 아미노산 위치는 위치 n으로서 지정된다. 또 다른 예로서, MG53 하위유형 2의 아미노산 서열은, 전장 MG53 단백질의 아미노산 서열과 비교하여, 전장 서열의 위치 1-s에 위치한 아미노산에 상응하는 말단절단된 돌연변이체를 함유한다. 이에 따라, MG53 하위유형 2 아미노산 서열의 첫번째 아미노산 위치는 위치 1로서 지정되고, MG53 하위유형 2 아미노산 서열의 두번째 아미노산 위치는 위치 2로서 지정되며, 유사하게, MG53 하위유형 2 아미노산 서열의 마지막 아미노산 위치는 위치 s로서 지정된다. 또 다른 예로서, MG53 하위유형 3의 아미노산 서열은, 전장 MG53 단백질의 아미노산 서열과 비교하여, 전장 서열의 위치 p-q에 위치한 아미노산에 상응하는 말단절단된 돌연변이체를 함유한다. 이에 따라, MG53 하위유형 3 아미노산 서열의 첫번째 아미노산 위치는 위치 p로서 지정되고, MG53 하위유형 3 아미노산 서열의 두번째 아미노산 위치는 위치 p+1로서 지정되며, 유사하게, MG53 하위유형 3 아미노산 서열의 마지막 아미노산 위치는 위치 q로서 지정된다.

예를 들어, 서열식별번호: 140은 서열식별번호: 1에 제시된 인간 야생형 MG53 전장 서열의 아미노산 위치 145-477에 상응하는 333개의 아미노산을 갖는 인간 야생형 MG53 하위유형 중 하나이다. 이러한 상황 하에, 아미노산 서열 서열식별번호: 140의 첫번째 아미노산 (메티오닌) 위치는 서열식별번호: 140의 위치 145로서 지정되고, 두번째 아미노산 위치는 서열식별번호: 140의 위치 146으로서 지정되며, 유사하게, 아미노산 서열 서열식별번호: 140의 마지막 아미노산 위치는 서열식별번호: 140의 위치 477로서 지정된다. 또 다른 예로서, 서열식별번호: 141은 인간 야생형 MG53 하위유형 중 하나로서, 이는 또한 333개의 아미노산을 갖고, 단지 1개의 아미노산만이 서열식별번호: 1에 제시된 인간 야생형 MG53 전장 서열의 아미노산 위치 145-477과 상이하며, 즉, 서열식별번호: 1의 위치 315는 글루탐산인 반면, 서열식별번호: 141의 상응하는 위치는 글리신이다. 이러한 상황 하에, 서열식별번호: 141에 제시된 아미노산 서열의 첫번째 아미노산 위치 (메티오닌)는 서열식별번호: 141의 위치 145로서 지정되고, 두번째 아미노산 위치는 서열식별번호: 141의 위치 146으로서 지정되며, 유사하게, 마지막 아미노산 위치는 서열식별번호: 141의 위치 477로서 지정된다. 또 다른 예로서, 서열식별번호: 142는 서열식별번호: 1에 제시된 인간 야생형 MG53 전장 서열의 아미노산 위치 1-269에 상응하는 269개의 아미노산을 갖는 인간 야생형 MG53 하위유형 중 하나이다. 이러한 상황 하에, 아미노산 서열 서열식별번호: 142의 첫번째 아미노산 (메티오닌) 위치는 서열식별번호: 142의 위치 1로서 지정되고, 아미노산 서열 서열식별번호: 142의 두번째 아미노산 위치는 서열식별번호: 142의 위치 2로서 지정되며, 유사하게, 아미노산 서열 서열식별번호: 142의 마지막 아미노산 위치는 서열식별번호: 142의 위치 269로서 지정된다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 서열식별번호: 139에 제시된 인간 야생형 MG53 하위유형 아미노산 서열의 하기 위치: 위치 150, 189, 211, 214, 246, 255, 269, 296, 297, 301, 305, 306, 307, 314, 341, 377, 405, 418, 425, 또는 430 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 서열식별번호: 140에 제시된 인간 야생형 MG53 하위유형 아미노산 서열의 하기 위치: 위치 150, 189, 211, 214, 246, 255, 269, 296, 297, 301, 305, 306, 307, 314, 341, 377, 405, 418, 425, 또는 430 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 서열식별번호: 141에 제시된 인간 야생형 MG53 하위유형 아미노산 서열의 하기 위치: 위치 150, 189, 211, 214, 246, 255, 269, 296, 297, 301, 305, 306, 307, 314, 341, 377, 405, 418, 425, 또는 430 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 서열식별번호: 142에 제시된 인간 야생형 MG53 하위유형 아미노산 서열의 하기 위치: 위치 150, 189, 211, 214, 246, 255, 또는 269 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 서열식별번호: 2에 제시된 마우스 야생형 MG53 아미노산 서열의 하기 위치: 위치 188, 189, 210, 211, 214, 246, 253, 255, 269, 296, 297, 301, 305, 306, 307, 314, 341, 367, 377, 418, 430, 또는 440 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 서열식별번호: 3에 제시된 래트 야생형 MG53 아미노산 서열의 하기 위치: 위치 150, 188, 189, 210, 211, 214, 246, 253, 255, 269, 296, 297, 301, 305, 307, 314, 341, 367, 377, 418, 430, 440, 464, 또는 474 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 서열식별번호: 4에 제시된 원숭이 야생형 MG53 아미노산 서열의 하기 위치: 위치 150, 189, 211, 214, 246, 255, 269, 296, 297, 301, 305, 306, 307, 341, 377, 405, 418, 425, 430, 또는 464 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 서열식별번호: 5에 제시된 돼지 야생형 MG53 아미노산 서열의 하기 위치: 위치 150, 189, 211, 214, 246, 255, 269, 296, 301, 305, 307, 314, 341, 377, 411, 418, 425, 430, 또는 474 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 서열식별번호: 6에 제시된 개 야생형 MG53 아미노산 서열의 하기 위치: 위치 150, 189, 211, 214, 246, 255, 269, 296, 297, 301, 305, 307, 314, 341, 367, 377, 418, 425, 또는 430 중 하나 이상에 위치한다.

결실 또는 돌연변이된 세린의 특정한 위치는 종마다 달라질 수 있지만, 그러나, 야생형 MG53 단백질의 세린 위치는 다양한 종 중에서 고도로 보존된다. 예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 원숭이, 돼지 및 개 야생형 MG53 단백질의 아미노산 서열의 위치 189, 211, 214, 246, 255, 269, 296, 301, 305, 307, 341, 377, 418, 및 430은 모두 세린이다. 일부 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53 아미노산 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1-6)의 하기 위치: 위치 189, 211, 214, 246, 255, 269, 296, 301, 305, 307, 341, 377, 418, 또는 430 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53 아미노산 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 또는 서열식별번호: 142)의 하기 위치: 위치 150, 188-189, 210-211, 214, 246, 253-255, 269, 296-297, 301, 305-307, 314, 341, 367, 377, 405, 411, 418, 425, 430, 440, 464, 또는 474 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53 아미노산 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 또는 서열식별번호: 142)의 하기 위치: 위치 189, 211, 214, 246, 253-255, 269, 296, 301, 305, 307, 341, 377, 418, 또는 430 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53 아미노산 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 또는 서열식별번호: 142)의 하기 위치: 위치 211, 214, 246, 253-255, 269, 296, 또는 297 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53 아미노산 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 또는 서열식별번호: 142)의 하기 위치: 위치 211, 214, 246, 255, 269, 296, 또는 297 중 하나 이상에 위치한다.

특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53 아미노산 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141 또는 서열식별번호: 142)의 위치 253-255 중 하나 이상에 위치한다. 특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53 아미노산 서열의 위치 253에 위치한다. 특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53 아미노산 서열의 위치 255에 위치한다. 특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53 아미노산 서열 서열식별번호: 1의 위치 255에 위치한다. 특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 야생형 MG53 아미노산 서열 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 또는 서열식별번호: 142의 위치 255에 위치한다.

특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체는 2개 이상의 세린 돌연변이를 갖는다. 특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체의 2개 이상의 세린 돌연변이는 위치 253-255 중 하나 이상에서의 세린 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체의 2개 이상의 세린 돌연변이는 위치 253에서의 세린 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체의 2개 이상의 세린 돌연변이는 위치 255에서의 세린 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체의 2개 이상의 세린 돌연변이는 위치 253 및 255에서의 세린 돌연변이를 포함한다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 상이한 종의 야생형 MG53 단백질 중에서 세린 잔기가 상이한 위치에 위치할 수 있고, 이에 따라 결실 또는 돌연변이된 세린의 위치가 또한 상이할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이된 세린은 서열식별번호: 1에 제시된 야생형 MG53의 아미노산 서열 내의 상응하는 세린 위치의 1 내지 10개 아미노산, 1 내지 5개 아미노산, 또는 1 내지 3개 아미노산 상류 또는 하류 내에 있다.

특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체의 아미노산 서열은 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 또는 서열식별번호: 150에 제시된 아미노산 서열이다. 보다 바람직하게는, 특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체의 아미노산 서열은 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열이다. 특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체의 아미노산 서열은 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 150에 제시된 아미노산 서열 중 하나와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 상동성을 갖고, 세포 막 복구 기능 및/또는 심장보호 기능을 여전히 보유하면서 MG53 돌연변이체는 야생형 MG53에 의해 야기되는 대사 부작용을 피한다.

본원에 사용된 바와 같은, "에 대한 퍼센트 (%) 상동성"은, 아미노산 서열의 경우에, 동일한 아미노산의 최대 수를 달성하도록 후보 및 참조 서열을 정렬하고, 필요에 따라 갭을 도입한 후의 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성의 백분율을 지칭하며; 뉴클레오티드 서열의 경우에, 동일한 뉴클레오티드의 최대 수를 달성하도록 후보 및 참조 서열을 정렬하고, 필요에 따라 갭을 도입한 후의 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성의 백분율을 지칭한다.

상동성의 백분율은 관련 기술분야에 널리 알려진 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열의 비교는 하기 공개적으로 이용가능한 도구에 의해 달성될 수 있다: BLASTp 소프트웨어 (국립 생물 정보 센터 (NCBI)의 웹사이트로부터 이용가능함: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, 또한 문헌 [Altschul SF et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990); Stephen F. et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997)] 참조), ClustalW2 (유럽 생물정보학 연구소의 웹사이트로부터 이용가능함: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/, 문헌 [Higgins DG et al., Methods in Enzymology, 266: 383-402 (1996); Larkin MA et al., Bioinformatics (Oxford, England), 23 (21): 2947-8 (2007)] 참조), 및 TCoffee (스위스 생물정보학 연구소 웹사이트로부터 이용가능함, 또한 문헌 [Poirot O. et al., Nucleic Acids Res., 31 (13) : 3503-6 (2003); Notredame C. et al., J. Mol. Boil., 302 (1): 205-17 (2000)] 참조]. 서열의 정렬이 소프트웨어를 사용하여 수행되는 경우에, 소프트웨어에서 이용가능한 디폴트 파라미터가 사용될 수 있거나, 또는 또한 파라미터는 정렬 목적에 적합하게 맞춤화될 수 있다. 이들은 모두 관련 기술분야의 통상의 기술자의 지식 범주 내에 있다.

특정 실시양태에서, 서열식별번호: 7-12, 서열식별번호: 147-150, 및 서열식별번호: 7-12 및 서열식별번호: 147-150에 대한 아미노산 서열 상동성을 갖는 MG53 돌연변이체는 세포 막 복구 기능 및/또는 심장보호 기능을 여전히 보유하면서 야생형 MG53에 의해 야기되는 대사 부작용을 피한다.

본 발명의 발명자들은, 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역 내의 적어도 1개의 세린이 결실되거나 또는 임의의 다른 비-세린 또는 비-트레오닌 아미노산(들)으로 돌연변이될 때, MG53의 세포 막 복구 기능 및/또는 심장보호 기능에 대한 어떠한 영향도 없이, 야생형 MG53에 의해 야기되는 대사 부작용을 피하거나 또는 감소시킬 수 있다는 것을 밝혀내었다. 어떠한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 상기 결과는 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역 내의 세린의 인산화가 유의하게 MG53의 E3 유비퀴틴 리가제 활성을 조절하고 기질 IRβ 및 IRS1을 통해 인슐린 신호전달 시스템에 대한 MG53의 조절 기능을 조정할 수 있다는 사실에 기인할 수 있다. 그러나, 이러한 영역 내 세린의 인산화는 MG53의 세포 막 복구 기능 및/또는 심장보호 기능을 조절하지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은, "세포 막 복구 기능"은, 세포 손상, 특히 급성 세포 손상 동안, 세포 사멸을 감소시키고, 세포 생존을 촉진하고, 그에 의해 세포 기능을 복구하는 적절한 신호전달 경로 (예를 들어 RISK 경로)의 활성화를 통해, 손상된 세포 막을 복구 및 회복시키는 야생형 MG53 또는 MG53 돌연변이체의 능력을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 야생형 MG53 또는 MG53 돌연변이체는 생존 세포, 시험관내 세포, 또는 생체내 세포를 복구할 수 있다. 본 발명의 야생형 MG53 또는 MG53 돌연변이체는 또한 상이한 유형의 세포, 예컨대, 비제한적으로, 심근세포, 가로무늬근 세포, 골격근 세포, 신장 근위 세관 상피 세포, 폐포 상피 세포, 위장관 상피 세포 (예를 들어, 경구 상피 세포, 식도 상피 세포, 위 상피 세포, 십이지장 상피 세포, 소장 상피 세포, 공장 상피 세포, 회장 상피 세포, 결장 상피 세포), 점막 세포 (예를 들어, 경구 점막 세포, 비강 점막 세포, 위 점막 세포, 소장 점막 세포, 결장 점막 세포, 십이지장 점막 세포), 피부 세포 (예를 들어, 표피 세포, 상피 세포, 피부 세포, 내피 세포), 혈관 세포 (예를 들어, 혈관 벽 세포, 혈관 내피 세포, 혈관 내피 세포, 혈관 평활근 세포) 등을 복구할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 야생형 MG53 또는 MG53 돌연변이체는 심근세포, 골격근 세포, 가로무늬근 세포, 근위 신장 세관 상피 세포, 폐포 상피 세포 등을 복구할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 MG53 돌연변이체의 세포 막 복구 기능은 관련 기술분야에 널리 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 MG53 돌연변이체의 세포 막 복구 기능은 신생아 래트 심실 근세포 (NRVM)에서 아데노바이러스를 사용하여 본 발명의 야생형 MG53 및 MG53 돌연변이체를 과다발현하고, 저산소증을 사용하여 세포를 자극하고, 세포의 생존을 검출하고 (예를 들어, MTT 방법, 배지 중 ATP 및 LDH 농도 측정, TUNEL 염색 (상세한 단계에 대하여 문헌 [Zhang. T et al., Nature Medicine, 175-184 (2016)] 참조) 등에 의함), 이어서 대조군 (예를 들어 야생형 MG53 및 MG53 돌연변이체의 발현 없는 공벡터 음성 대조군, 야생형 MG53을 과다발현하는 양성 대조군) 및 시험군 (즉, 본 발명의 MG53 돌연변이체를 과다발현하는 군)의 지시자 (예를 들어 세포내 ATP 수준, LDH 방출 수준 등)를 비교함으로써 결정될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "심장보호 기능"은, 심근 손상, 특히 급성 심근 손상 동안, 야생형 MG53 또는 MG53 돌연변이체가, 임의적으로, 심근세포의 보호를 달성하며 그에 의해 심장 보호를 증진시키는 심근 세포-관련 신호전달 경로 (예를 들어, RISK 경로)의 활성화를 통해, 심근 세포 막 손상을 복구할 수 있다는 것을 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같은 MG53 돌연변이체의 심장보호 기능은 관련 기술분야에 널리 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 MG53 돌연변이체의 심장보호 기능은 신생아 래트 심실 근세포 (NRVM)에서 아데노바이러스를 사용하여 본 발명의 야생형 MG53 및 MG53 돌연변이체를 과다발현하고, 저산소증을 사용하여 세포를 자극하고, 세포의 생존을 검출하고 (예를 들어, MTT 방법, 배지 중 ATP 및 LDH 농도 측정, TUNEL 염색 (상세한 단계에 대하여 문헌 [Zhang. T et al., Nature Medicine, 175-184 (2016)] 참조) 등에 의함), 이어서 대조군 (예를 들어 야생형 MG53 및 MG53 돌연변이체의 발현 없는 공벡터 음성 대조군, 야생형 MG53을 과다발현하는 양성 대조군) 및 시험군 (즉, 본 발명의 MG53 돌연변이체를 과다발현하는 군)의 지시자 (예를 들어 세포내 ATP 수준, LDH 방출 수준 등)를 비교함으로써 결정될 수 있다. 또 다른 예로서, 심근세포는 각각 본원에 기재된 바와 같은 야생형 MG53 및 MG53 돌연변이체와 함께 인큐베이션하고, 다양한 자극 (예를 들어, 저산소증, H₂O₂)을 사용하여 세포 사멸로 이어지고, 본원에 기재된 바와 같은 MG53 돌연변이체의 심장보호 기능은 대조군 (예를 들어, 야생형 MG53도 MG53 돌연변이체도 없이 인큐베이션한 음성 대조군, 야생형 MG53을 과다발현하는 양성 대조군) 및 시험군 (즉, 본 발명의 MG53 돌연변이체와 함께 인큐베이션한 군)에서 생존율을 비교함으로써 평가된다. 세포 생존율은 MTT 세포 카운트, LDH, ATP, 또는 TUNEL 염색 측정에 의해 결정될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "대사 부작용"은 인슐린 저항성, 비만, 당뇨병, 고혈압, 이상지혈증 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 치료량의 약물의 투여 후의 치료 목적 이외의 대사 장애에 기인한 질환 또는 불편함을 지칭한다. 어떠한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 대사 부작용의 중증도가 MG53의 E3 유비퀴틴 리가제 활성을 측정함으로써 평가될 수 있는 것으로 여겨진다. 특정 실시양태에서, 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역 내의 적어도 1개의 세린이 결실되고/거나 임의의 다른 비-세린 또는 비-트레오닌 아미노산(들)으로 돌연변이될 때, 야생형 MG53의 E3 유비퀴틴 리가제 활성의 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 심지어 100%가 억제되며, 그에 의해 MG53의 세포 막 복구 기능 및/또는 심장보호 기능에 대한 어떠한 영향도 없이 야생형 MG53에 의해 야기되는 대사 부작용을 피하거나 또는 감소시킬 것이다. "야생형 MG53에 의해 야기되는 대사 부작용을 피하거나 또는 감소시키는"은 상응하는 야생형 MG53과 비교하여 야생형 MG53에 의해 야기되는 대사 부작용의 부재 또는 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 심지어 100%만큼 야생형 MG53에 의해 야기되는 대사 부작용의 중증도의 감소를 지칭한다. "MG53의 세포 막 복구 기능 및/또는 심장보호 기능에 대한 어떠한 영향도 없이"는 MG53의 세포 막 복구 기능 및/또는 심장보호 기능의 완전 보유, 또는 최대 5%, 최대 10%, 최대 15%, 최대 20%, 최대 25%, 최대 30% 등만큼의 MG53의 세포 막 복구 기능 및/또는 심장보호 기능의 감소를 지칭한다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 MG53 돌연변이체는 그의 유사체를 포함한다. MG53 돌연변이체 유사체는 본원에 제공된 MG53 돌연변이체의 모두 또는 일부와 실질적으로 유사한 기능적 또는 구조적 특징을 갖는 폴리펩티드를 지칭하지만, 그러나, MG53 돌연변이체 유사체의 아미노산 서열은 적어도 1개의 아미노산 위치에 의해 야생형 MG53의 아미노산 서열과 상이하다. MG53 돌연변이체 유사체는 MG53 돌연변이체의 부분적 단편, 유도체 또는 변이체일 수 있고, 화학적 또는 생물학적 변형을 포함할 수 있다. MG53 돌연변이체 유사체는 MG53 돌연변이체의 1개 이상의 아미노산 상의 보존적 치환, 첨가, 결실, 삽입, 말단절단, 변형 (예를 들어, 인산화, 글리코실화, 표지화 등) 또는 그의 임의의 조합을 가질 수 있다. MG53 돌연변이체 유사체는 MG53 돌연변이체의 천연적으로-발생하는 변이체 및 인공적으로-생산된 변이체, 예컨대 재조합 방법 또는 화학적 합성에 의해 수득된 인공 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. MG53 돌연변이체 유사체는 비-천연적으로 발생하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 MG53 돌연변이체 유사체가 MG53 돌연변이체로서 실질적으로 유사한 기능을 여전히 보유하며, 예를 들어, MG53 돌연변이체 유사체가 여전히 세포 막 복구 기능 및/또는 심장보호 기능을 보유하면서 야생형 MG53에 의해 야기되는 대사 부작용, 예컨대 인슐린 저항성, 비만, 당뇨병, 고혈압, 이상지혈증 등을 피하거나 또는 감소시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.

아미노산 잔기의 보존적 치환은 유사한 특징을 갖는 아미노산 사이의 치환, 예컨대 극성 아미노산 사이의 치환 (예를 들어 글루타민 및 아스파라긴 사이의 치환), 소수성 아미노산 사이의 치환 (예를 들어 아르기닌, 이소류신, 메티오닌 및 발린 사이의 치환), 및 동일한 전하를 갖는 아미노산 사이의 치환 (예를 들어 아르기닌, 리신 및 히스티딘 사이의, 또는 글루타민 및 아스파르테이트 사이의 치환) 등을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 MG53 돌연변이체의 서열은 서열식별번호: 7-12, 또는 서열식별번호: 147-150에 제시된 서열과 비교하여 단지 1개 이상의 비-세린 위치만에서의 보존적 치환을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 MG53 돌연변이체의 서열은 서열식별번호: 7-12, 또는 서열식별번호: 147-150에 제시된 서열과 비교하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-세린 위치에서의 보존적 치환을 갖는다.

본원에 기재된 MG53 돌연변이체는 또한, 활성이 영향을 받지 않는다는 전제 하에, 비-천연 아미노산을 함유할 수 있다. 비-천연 아미노산은, 예를 들어, β-플루오로알라닌, 1-메틸히스티딘, γ-메틸렌 글루타메이트, α-메틸 류신, 4,5-데히드로리신, 히드록시프롤린, 3-플루오로페닐알라닌, 3-아미노티로신, 4-메틸트립토판 등을 포함한다.

본 발명의 MG53 돌연변이체는 또한 관련 기술분야에 널리 알려진 방법을 사용하여 변형될 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로, PEG화, 글리코실화, 아미노-말단 변형, 지방 아실화, 카르복실-말단 변형, 인산화, 메틸화 등.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 MG53 돌연변이체가 관련 기술분야에 널리 알려진 방법에 의해 변형된 후에 MG53 돌연변이체와 실질적으로 유사한 기능을 여전히 보유한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 변형된 MG53 돌연변이체는 세포 막 복구 기능 및/또는 심장보호 기능을 여전히 보유하면서 야생형 MG53에 의해 야기되는 대사 부작용, 예컨대 인슐린 저항성, 비만, 당뇨병, 고혈압, 이상지혈증 등을 피하거나 또는 감소시킬 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 MG53 돌연변이체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는 담체"는 MG53 돌연변이체의 구조 및 특성을 방해하지 않으면서 대상체에게 MG53 돌연변이체를 전달하기 위해 사용된 제약상 허용되는 용매, 현탁화제, 또는 임의의 다른 약리학상 불활성 비히클을 지칭한다. 이러한 담체 중 일부는 MG53 돌연변이체가, 예를 들어, 대상체에게 경구 투여를 위한 정제, 환제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 및 트로키로서 제제화되는 것을 가능하게 할 수 있다. 이러한 담체 중 일부는 MG53 돌연변이체가 주사, 주입 또는 국소 투여로서 제제화되는 것을 가능하게 한다.

본 발명의 제약 조성물에 사용하기 위한 제약상 허용되는 담체는, 예를 들어, 제약상 허용되는 액체, 겔 또는 고체 담체, 수성 비히클 (예를 들어, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 등장성 글루코스 주사액, 멸균수 주사액, 또는 글루코스 및 락테이트의 링거 주사액), 비-수성 비히클 (예를 들어, 식물성 기원의 고정 오일, 목화씨 오일, 옥수수 오일, 참깨 오일, 또는 땅콩 오일), 항미생물제, 등장화제 (예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스), 완충제 (예컨대 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 항산화제 (예컨대 중황산나트륨), 마취제 (예컨대 프로카인 히드로클로라이드), 현탁화제/분산화제 (예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 또는 폴리비닐피롤리돈), 킬레이트화제 (예컨대 EDTA (에틸렌디아민 테트라아세트산) 또는 EGTA (에틸렌 글리콜 테트라아세트산)), 유화제 (예컨대 폴리소르베이트 80 (트윈-80)), 희석제, 아주반트, 부형제, 또는 비-독성 보조 물질, 관련 기술분야에 알려진 다른 성분, 또는 그의 다양한 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 적합한 성분은, 예를 들어, 충전제, 결합제, 붕해제, 완충제, 보존제, 윤활제, 향미제, 증점제, 착색제, 또는 유화제를 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 경구 제제이다. 경구 제제는 캡슐, 카쉐, 환제, 정제, 트로키 (맛 기질용, 통상적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트), 분말, 과립, 또는 수성 또는 비-수성 용액 또는 현탁액, 또는 유중수 또는 수중유 에멀젼, 또는 엘릭시르 또는 시럽, 또는 과자류 로젠지 (불활성 기재용, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 또는 아카시아) 및 / 또는 구강세정제 및 그의 유사체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

특정 실시양태에서, 경구 고체 제제 (예를 들어, 캡슐, 환제, 당의정, 분말, 과립 등)는 MG53 돌연변이체 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 예컨대 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘, 및/또는 하기를 포함한다: (1) 충전제 또는 증량제 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및/또는 규산; (2) 결합제 예컨대, 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로스, 및/또는 아카시아; (3) 함습제 예컨대 글리세롤; (4) 붕해제 예컨대 한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트, 및 탄산나트륨; (5) 지연제 용액 예컨대 파라핀; (6) 촉진 흡수제 예컨대 4급 암모늄 화합물; (7) 윤활제 예컨대 아세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제 예컨대 카올린 및 벤토나이트; (9) 윤활제 예컨대 활석, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 황산나트륨, 및 그의 혼합물; 및 (10) 착색제.

특정 실시양태에서, 경구 액체 제제는 제약상 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르 등을 포함한다. MG53 돌연변이체 이외에도, 액체 투여 형태는 또한 통상적인 불활성 희석제 예컨대 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제 예컨대 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤젠 (메트) 아크릴레이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 올리브, 피마자 및 참깨 오일), 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 지방산 소르비톨 에스테르, 및 그의 혼합물을 함유할 수 있다. 불활성 희석제 이외에도, 경구 조성물은 또한 아주반트 예컨대 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 감미제, 향미제, 착색제, 향미제 및 보존제를 함유할 수 있다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 멸균 수성 용액 또는 분산액, 현탁액 또는 에멀젼을 포함한, 주사가능한 제제일 수 있다. 모든 경우에, 주사가능한 제제는 멸균성이어야 하고, 주사를 용이하게 하기 위한 액체이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정하여야 하고, 미생물 (예컨대 박테리아 및 진균)의 감염에 대해 저항성이어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 적합한 혼합물 및 / 또는 그의 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 주사가능한 제제는 적절한 유동성을 유지하여야 하며, 이는 다양한 방식으로, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 사용하여, 계면활성제를 사용하는 것 등으로 유지될 수 있다. 항미생물 오염은 다양한 항박테리아제 및 항진균제 (예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등)의 첨가에 의해 달성될 수 있다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 경구 스프레이 제제 또는 비강 스프레이 제제이다. 이러한 스프레이 제제는 수성 에어로졸, 비-수성 현탁액, 리포솜 제제, 또는 고체 미립자 제제 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수성 에어로졸은 작용제의 수성 용액 또는 현탁액을 통상적인 제약상 허용되는 담체 및 안정화제와 조합함으로써 제제화된다. 담체 및 안정화제는 특정한 화합물의 필요에 따라 달라질 수 있지만, 일반적으로 비이온성 계면활성제 (트윈, 또는 폴리에틸렌 글리콜), 올레산, 레시틴, 아미노산 예컨대 글리신, 완충제, 염, 당 또는 당 알콜을 포함한다. 에어로졸은 통상적으로 등장성 용액으로부터 제조되고 네뷸라이저에 의해 전달될 수 있다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 1종 이상의 다른 약물과 조합하여 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 적어도 1종의 다른 약물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다른 약물은 심혈관 약물, 신장 질환을 치료하기 위한 약물, 세포 막 복구를 위한 약물 등이다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 경구 경로, 주사 경로 (예를 들어, 정맥내 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 심장내 주사, 척수강내 주사, 흉막내 주사, 복강내 주사 등), 점막 경로 (예를 들어, 비강내 투여, 경구 투여 등), 설하 경로, 직장 경로, 경피 경로, 안내 경로, 폐 경로를 포함하나 이에 제한되지는 않는 적합한 경로에 의해 대상체에게 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 주사 경로에 의해 투여될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 MG53 돌연변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "단리된"은 자연에 정상적으로 존재하는 환경으로부터 또는 자연에서 정상적으로 발견되는 환경과 상이한 환경에서 분리되는 물질 (예컨대 폴리펩티드 또는 핵산)을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 또는 리보뉴클레오시드-데옥시리보핵산의 혼합물 예컨대 DNA-RNA 하이브리드를 지칭한다. 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 단일- 또는 이중-가닥 DNA, RNA, 또는 DNA-RNA 하이브리드일 수 있다. 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 선형 또는 시클릭일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "코딩" 또는 "......을 코딩하는"은 mRNA로 전사 및/또는 펩티드 또는 단백질로 번역할 수 있다는 것을 의미한다. 용어 "코딩 서열" 또는 "유전자"는 mRNA, 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이들 두 용어는 본 출원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 단리된 핵산은 서열식별번호: 13-18에 제시된 핵산 서열 중 어느 하나를 포함한다.

서열식별번호: 13은 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 8에 제시된다.

서열식별번호: 14는 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 9에 제시된다.

서열식별번호: 15는 서열식별번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 10에 제시된다.

서열식별번호: 16은 서열식별번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 11에 제시된다.

서열식별번호: 17은 서열식별번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 12에 제시된다.

서열식별번호: 18은 서열식별번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 13에 제시된다.

특정 실시양태에서, 단리된 핵산은 서열식별번호: 151-154에 제시된 핵산 서열 중 어느 하나를 포함한다.

서열식별번호: 151은 서열식별번호: 147에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 24에 제시된다.

서열식별번호: 152는 서열식별번호: 148에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 25에 제시된다.

서열식별번호: 153은 서열식별번호: 149에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 26에 제시된다.

서열식별번호: 154는 서열식별번호: 150에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 27에 제시된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 단리된 핵산은 서열식별번호: 13-18, 서열식별번호: 151-154에 제시된 핵산 서열 중 어느 하나와 적어도 70% 상동성, 예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하고, 서열식별번호: 7-12, 서열식별번호: 147-150에 제시된 아미노산 서열 중 하나를 여전히 코딩할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 7-12, 서열식별번호: 147-150을 코딩하는 핵산 서열을 제공하지만, 이들은 유전자 코드의 축중성으로 인해 서열식별번호: 13-18, 서열식별번호: 151-154에 제시된 핵산 서열 중 어느 하나와 상이하다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "유전자 코드의 축중성"은 1개의 아미노산이 2개 이상의 상응하는 유전자 코돈을 갖는 현상을 지칭한다. 예를 들어, 프롤린은 4개의 동의 코돈 CCU, CCC, CCA, 및 CCG를 갖는다. 유전자 코드의 축중성으로 인해, 코딩된 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 주어진 핵산 서열 내의 특정한 위치에서 핵산을 대체하는 것이 가능한 것으로 관련 기술분야에 널리 알려져 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게, 예를 들어, 염기의 부위-지정 돌연변이유발에 의한 유전자 코드의 증축성의 대체를 수행하는 것은 사소한 것이다. 상이한 유기체는 상이한 코돈에 대한 상이한 선호도로 발생되었다. 선택된 생물학적 세포에서 본 발명의 폴리펩티드를 발현하기 위해, 생물학적 세포의 바람직한 코돈을 선택하여 상응하는 코딩 서열을 수득할 수 있고, 본 발명의 MG53 돌연변이체 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 7-12, 서열식별번호: 147-150)은 재조합 발현에 의해 수득할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 MG53 돌연변이체의 아미노산 서열의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 발현 벡터는, 예를 들어, DNA 플라스미드, 박테리아 플라스미드, 바이러스 등일 수 있다. 발현 벡터의 비제한적 예는, 예를 들어 문헌 [Paul et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 505; Miyagishi and Taira, 2002, Nature Biotechnology, 19, 497; Lee et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 500; 및 Novina et al. 2002, Nature Medicine, advance online publication doi: 10.1038 / nm725]에 기재되어 있다. 발현 벡터는, 발현 벡터가 숙주 세포로 진입한 후에 프로모터가 코딩 서열의 발현을 개시할 수 있도록, MG53 돌연변이체의 아미노산 서열의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 함유할 수 있다. 발현 벡터는 적합한 방법 예컨대, 비제한적으로, 인산칼슘 형질감염, 리포펙션 형질감염, 전기천공 형질감염, 박테리아 열 쇼크 등에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 상세한 설명을 위해, 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning (a laboratory manual, Cold Spring Harbor, 1989)]을 참조한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 발현 벡터는 서열식별번호: 13-18에 제시된 핵산 서열 중 어느 하나를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명에 기재된 숙주 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포일 수 있다. 적합한 진핵 세포는, 예를 들어, 포유동물 세포 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)를 포함할 수 있다. 적합한 원핵 세포는, 예를 들어, 박테리아 예컨대 이. 콜라이(E. coli)를 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 MG53 돌연변이체를 제조하는 방법에 관한 것이고, 본원에 제공된 MG53 돌연변이체는 관련 기술분야에 알려진 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 이들은 화학적 합성 또는 유전자 조작에 의해 제조될 수 있다.

화학적 합성 방법은 주로 고체-상 합성 및 액체-상 합성을 포함한다. 고체-상 폴리펩티드 합성 방법은, 예를 들어, 메리필드 고체-상 합성 방법을 포함하며, 이는 문헌 ["Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154", "M. Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, Second Edition, 1976" 및 "J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Vol. 2, p. 46, Academic Press (New York), 1983"]에 상세하게 기재되어 있다. 이들 문서의 전체 내용은 참고문헌으로서 본 출원에 포함된다. 메리필드 고체-상 합성은 주로 하기 단계를 포함한다: 펩티드의 보호된 C-말단 아미노산을 표적 단백질의 아미노산 서열을 기반으로 한 수지에 부착하는 단계. 부착 후에, 수지를 여과하고, 세척하고, C-말단 아미노산의 알파 아미노 기 상의 보호기 (예컨대, t-부틸옥시카르보닐)를 제거한다. 이러한 보호기의 제거는, 물론, 아미노산 및 수지 사이의 결합을 파괴시키지 않으면서 발생해야 한다. 이어서 생성된 수지 펩티드를 끝에서 두번째 C-말단 보호된 아미노산에 커플링시킨다. 이러한 커플링은 두번째 아미노산의 유리 카르복시 기 및 수지에 부착된 첫번째 아미노산의 아미노 기 사이의 아미드 결합의 형성에 의해 발생한다. 이러한 순서의 이벤트를 펩티드의 모든 아미노산이 수지에 부착될 때까지 연속적인 아미노산으로 반복한다. 최종적으로, 보호된 펩티드를 수지로부터 절단하고, 보호기를 제거하여 목적하는 펩티드를 수득한다. 본원에 개시된 폴리펩티드는 또한 액체-상 합성에 의해, 예를 들어, 표준 용액 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있으며, 이는 참조로서 그의 전문이 본원에 혼입된 문헌 ["E. Schroder and K. Kubke, The Peptides, Vol. 1, Academic Press (New York), 1965"]에 상세하게 기재된 바 있다. 액체-상 합성은 주로 아미드 결합을 형성하는 화학적 또는 효소적 방법에 의해 단계별로 아미노산 또는 펩티드 단편을 커플링시키는 것을 포함한다.

유전자 조작 방법은 적절한 숙주 세포에서 상응하는 MG53 돌연변이체를 코딩하는 핵산 서열을 발현하여 상응하는 돌연변이체를 생성하는 방법이다. 이러한 방법의 상세한 설명을 위해, 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning (a laboratory manual, Cold Spring Harbor, 1989)]을 참조한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 MG53 돌연변이체를 제조하는 방법은 돌연변이를 위한 1개 이상의 세린 위치를 결정하고, 야생형 MG53의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드의 전장 서열 상의 상기 위치에서 부위-지정 돌연변이유발을 수행하고, 부위-지정 돌연변이유발을 갖는 플라스미드를 숙주 세포 내로 형질감염시키고, 숙주 세포가 MG53 돌연변이체를 생산하도록 유도하는 것을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "부위-지정 돌연변이유발"은 염기의 첨가, 결실, 및 치환 등을 포함한, 표적 DNA 단편 내로의 관심 변화의 도입을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 표적 DNA 단편은 야생형 MG53의 코딩 서열, 즉, 서열식별번호: 19-24 및 서열식별번호: 143-146이다. 돌연변이되는 위치는 야생형 MG53의 코일드-코일-SPRY 영역의 코딩 서열 내의 1개 이상의 세린 위치에 위치한다.

서열식별번호: 19는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 2에 제시된다.

서열식별번호: 20은 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 3에 제시된다.

서열식별번호: 21은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 4에 제시된다.

서열식별번호: 22는 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 5에 제시된다.

서열식별번호: 23은 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 6에 제시된다.

서열식별번호: 24는 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 7에 제시된다.

서열식별번호: 143은 서열식별번호: 139에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 20에 제시된다.

서열식별번호: 144는 서열식별번호: 140에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 21에 제시된다.

서열식별번호: 145는 서열식별번호: 141에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 22에 제시된다.

서열식별번호: 146은 서열식별번호: 142에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이고, 그의 구체적 서열은 도 23에 제시된다.

특정 실시양태에서, 부위-지정 돌연변이유발은 하기 단계를 포함한다:

(1) cDNA 서열 내 부위-지정 돌연변이유발에 대해 표적화된 아미노산의 상응하는 뉴클레오티드 부위를 결정하고, 표적 아미노산에 따른 돌연변이 부위에서의 뉴클레오티드 서열을 변형시키고, 돌연변이 부위를 포함하는 20-40 bp 길이의 서열을 절취함으로써 프라이머를 디자인하는 단계;

(2) 단계 (1)의 프라이머를 사용하고 야생형 MG53 플라스미드를 주형으로 하여 PCR 반응을 수행하고, PCR 산물에 대해 아가로스 겔 전기영동을 수행하고, PCR 산물을 정제하는 단계;

(3) 제한 엔도뉴클레아제를 사용함으로써 단계 (2)의 정제된 PCR 산물에 대해 효소적 반응을 수행하고, 효소-소화된 산물을 적합한 플라스미드 발현 벡터와 라이게이션하고, 라이게이션 산물을 박테리아 적격 세포에서 형질전환 및 배양하는 단계.

특정 실시양태에서, 부위-지정 돌연변이유발은 하기 단계를 추가로 포함한다:

(4) 단계 (1)의 프라이머를 사용함으로써 콜로니 PCR 식별을 수행하기 위한 단계 (3)의 클론을 선택하고, PCR 산물에 대해 아가로스 겔 전기영동을 수행하고, 이어서 DNA 서열분석 식별을 수행하여 부위-지정 돌연변이유발을 갖는 양성 클론을 식별하는 단계.

야생형 MG53의 부위-지정 돌연변이유발은 다양한 상업적으로 입수가능한 부위-지정 돌연변이유발 키트를 사용하여, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발에 대한 방법 및 절차를 상술한, 베이징 트랜스젠 바이오테크(Beijing Transgen Biotech)로부터의 이지 돌연변이유발 시스템 키트에 대한 설명서를 참조하여 수행될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 MG53 돌연변이체의 용도에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 의약은 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하면서 대사 부작용, 예컨대 인슐린 저항성, 비만, 당뇨병, 고혈압, 이상지혈증을 피하거나 또는 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 심장 질환은 당뇨병성 심장 질환, 심근 허혈, 심장 허혈/재관류 손상, 심근경색, 심부전, 부정맥, 심장 파열, 협심증, 심근염, 관상동맥 심장 질환, 및 심막염을 포함하나 이에 제한되지는 않는 심근 손상과 연관된 질환이다. 특정 실시양태에서, 당뇨병성 뇌혈관 질환은 뇌동맥경화증, 허혈성 뇌혈관 질환, 뇌출혈, 뇌위축, 및 뇌경색을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 당뇨병성 안구 합병증은 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 백내장, 당뇨병 연관된 포도막염, 및 실명을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 당뇨병성 신경병증은 당뇨병성 말초 신경병증을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 신장 질환은 급성 사구체신염, 만성 사구체신염, 신증후군, 급성 신장 손상, 당뇨병성 신병증 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환은 신장, 뇌, 폐, 간, 심장, 비장, 소화관, 및 피부의 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환, 예컨대 뇌 손상, 폐 손상, 비장 손상, 비장 파열, 위 궤양, 위염, 위 천공, 위장관 점막 손상, 외상, 화상, 궤양, 점막염, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 졸중, 피부 노화 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 서열식별번호: 7에 제시된 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149 또는 서열식별번호: 150에 제시된 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 MG53 돌연변이체를 투여하는 것을 포함하는, 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체는 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하면서 대사 부작용, 예컨대 인슐린 저항성, 비만, 당뇨병, 고혈압, 및 이상지혈증을 피하거나 또는 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 심장 질환은 당뇨병성 심장 질환, 심근 허혈, 심장 허혈/재관류 손상, 심근경색, 심부전, 부정맥, 심장 파열, 협심증, 심근염, 관상동맥 심장 질환, 및 심막염을 포함하나 이에 제한되지는 않는 심근 손상과 연관된 질환이다. 특정 실시양태에서, 당뇨병성 뇌혈관 질환은 뇌동맥경화증, 허혈성 뇌혈관 질환, 뇌출혈, 뇌위축, 및 뇌경색을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 당뇨병성 안구 합병증은 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 백내장, 당뇨병 연관된 포도막염, 및 실명을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 당뇨병성 신경병증은 당뇨병성 말초 신경병증을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 신장 질환은 급성 사구체신염, 만성 사구체신염, 신증후군, 급성 신장 손상, 당뇨병성 신병증 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환은 신장, 뇌, 폐, 간, 심장, 비장, 소화관, 및 피부의 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환, 예컨대 뇌 손상, 폐 손상, 비장 손상, 비장 파열, 위 궤양, 위염, 위 천공, 위장관 점막 손상, 외상, 화상, 궤양, 점막염, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 졸중, 피부 노화 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 서열식별번호: 7에 제시된 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 또는 서열식별번호: 150에 제시된 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료 유효량"은 대상체의 질환 및 장애를 억제 또는 완화함으로써, 또는 질환 또는 장애의 발병을 예방적으로 억제 또는 방지함으로써 치료적 효과를 달성하는 의약의 양을 지칭한다. 치료 유효량은 대상체에서 질환 또는 장애의 1종 이상의 증상을 어느 정도까지 완화하고/거나; 질환 또는 장애와 연관되거나 또는 그의 원인이 되는 1종 이상의 생리학적 또는 생화학적 파라미터를 부분적으로 또는 완전히 정상으로 회복시키고/거나; 질환 또는 장애의 발병 가능성을 감소시키는 의약의 양일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하는데 사용하기 위한 MG53 돌연변이체에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, MG53 돌연변이체는 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하면서 대사 부작용, 예컨대 인슐린 저항성, 비만, 당뇨병, 고혈압, 및 이상지혈증을 피하거나 또는 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 심장 질환은 당뇨병성 심장 질환, 심근 허혈, 심장 허혈/재관류 손상, 심근경색, 심부전, 부정맥, 심장 파열, 협심증, 심근염, 관상동맥 심장 질환, 및 심막염을 포함하나 이에 제한되지는 않는 심근 손상과 연관된 질환이다. 특정 실시양태에서, 당뇨병성 뇌혈관 질환은 뇌동맥경화증, 허혈성 뇌혈관 질환, 뇌출혈, 뇌위축, 및 뇌경색을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 당뇨병성 안구 합병증은 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 백내장, 당뇨병 연관된 포도막염, 및 실명을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 당뇨병성 신경병증은 당뇨병성 말초 신경병증을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 신장 질환은 급성 사구체신염, 만성 사구체신염, 신증후군, 급성 신장 손상, 당뇨병성 신병증 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환은 신장, 뇌, 폐, 간, 심장, 비장, 소화관, 및 피부의 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환, 예컨대 뇌 손상, 폐 손상, 비장 손상, 비장 파열, 위 궤양, 위염, 위 천공, 위장관 점막 손상, 외상, 화상, 궤양, 점막염, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 졸중, 피부 노화 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하는데 사용하기 위한 서열식별번호: 7에 제시된 폴리펩티드에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 심장 질환, 당뇨병성 뇌혈관 질환, 당뇨병성 안구 합병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부, 신장 질환, 및 세포 및/또는 조직 손상과 연관된 질환을 치료하는데 사용하기 위한 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 또는 서열식별번호: 150에 제시된 폴리펩티드에 관한 것이다.

실시양태

모든 실시예에 사용된 생물학적 물질 예컨대 이. 콜라이 균주, 다양한 클론 및 발현 플라스미드, 배지, 효소, 완충제 용액, 및 다양한 배양 방법, 단백질 추출 및 정제 방법, 및 다른 분자 생물학적 작업 방법은 모두 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있다. 보다 상세한 사항에 대해, 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual" edited by Sambrook, et al. (Cold Spring Harbor, 1989) 및 "Short Protocols in Molecular Biology" (Frederick M. Ausubel, et al., translated by Yan Ziying et al., Science Press (Beijing), 1998)]을 참조한다.

실시예 1: MG53 돌연변이체의 제조

1. 인간 MG53 돌연변이체의 제조

인간 MG53 S255A 돌연변이체

(1) 프라이머 디자인: cDNA 서열 내 부위-지정 돌연변이유발에 대해 표적화된 아미노산의 상응하는 뉴클레오티드 부위를 결정하고, 돌연변이 아미노산에 따른 돌연변이 부위에서의 뉴클레오티드 서열을 변형시키고, 돌연변이 부위의 20 bp 상류 및 10 bp 하류의 서열을 절취함으로써 프라이머를 디자인한다. 프라이머의 서열은 하기와 같다:

인간 MG53 S255A의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctggcagaggctcccccacccg (서열식별번호: 25)

인간 MG53 S255A의 역방향 프라이머: tccagacgggcgggtgggggagcctctgccagg (서열식별번호: 26)

(2) 플라스미드 전장 클론의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR): 부위-지정 돌연변이유발에 대해 디자인된 프라이머를 사용하고, Taq 폴리머라제 하이 피델리티를 사용하고, 원래의 유전자 발현 플라스미드를 주형으로 하여 PCR 반응을 수행한다. 반응 시스템 및 조건은 하기와 같다:

PCR 산물의 아가로스 겔 전기영동: PCR 산물에 대해 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 그의 순도 및 수량을 식별한다.

PCR 산물의 에탄올 침전: 에탄올 침전의 방법에 의해 정확한 크기 및 단일 밴드를 갖는 PCR 산물을 정제한다.

Dpn I 소화: 제한 엔도뉴클레아제 Dpn I을 사용함으로써 정제된 PCR 산물에 대해 효소적 반응을 수행한다.

효소-소화된 산물의 형질전환: Dpn I-소화된 산물을 박테리아 적격 세포 내로 형질전환하고, 배양을 위한 적절한 스크린 플레이트 상에 코팅한다.

양성 클론의 식별: 콜로니 PCR 식별을 수행하기 위한 적절한 크기를 갖는 클론을 선택하고, PCR 산물에 대해 아가로스 겔 전기영동을 수행하고, 뚜렷한 밴드 및 정확한 크기를 갖는 클론에 대해 작은 부피 진탕 증폭 배양을 수행하고, 이어서 서열분석 식별을 수행한다.

동일한 방법을 사용하여 인간 MG53 S255G, S255L, S255V, S255P, S255F, S255W, S255Q, S255C, S255Y, S255D, S255R, S211A, S214A, S246A, S269A, S296A, S297A 돌연변이체를 제조하였다. 프라이머를 제외하고는, 모든 다른 단계는 인간 MG53 S255A 돌연변이체를 제조하는 단계와 동일하다. 각각의 돌연변이체의 프라이머는 하기와 같다:

(i) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 인간 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 1)의 위치 255에서의 세린은 글리신으로 돌연변이된 것인 인간 MG53 S255G의 정방향 및 역방향 프라이머.

인간 MG53 S255G의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctggcagagggtcccccacccg (서열식별번호: 27)

인간 MG53 S255G의 역방향 프라이머: tccagacgggcgggtgggggaccctctgccagg (서열식별번호: 28)

(ii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 인간 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 1)의 위치 255에서의 세린은 류신으로 돌연변이된 것인 인간 MG53 S255L의 정방향 및 역방향 프라이머.

인간 MG53 S255L의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctggcagagcttcccccacccg (서열식별번호: 29)

인간 MG53 S255L의 역방향 프라이머: tccagacgggcgggtgggggaagctctgccagg (서열식별번호: 30)

(iii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 인간 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 1)의 위치 255에서의 세린은 발린으로 돌연변이된 것인 인간 MG53 S255V의 정방향 및 역방향 프라이머.

인간 MG53 S255V의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctggcagaggttcccccacccg (서열식별번호: 31)

인간 MG53 S255V의 역방향 프라이머: tccagacgggcgggtgggggaacctctgccagg (서열식별번호: 32)

(iv) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 인간 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 1)의 위치 255에서의 세린은 프롤린으로 돌연변이된 것인 인간 MG53 S255P의 정방향 및 역방향 프라이머.

인간 MG53 S255P의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctggcagagcctcccccacccg (서열식별번호: 33)

인간 MG53 S255P의 역방향 프라이머: tccagacgggcgggtgggggaggctctgccagg (서열식별번호: 34)

(v) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 인간 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 1)의 위치 255에서의 세린은 페닐알라닌으로 돌연변이된 것인 인간 MG53 S255F의 정방향 및 역방향 프라이머.

인간 MG53 S255F의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctggcagagtttcccccacccg (서열식별번호: 35)

인간 MG53 S255F의 역방향 프라이머: tccagacgggcgggtgggggaaactctgccagg (서열식별번호: 36)

(vi) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 인간 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 1)의 위치 255에서의 세린은 트립토판으로 돌연변이된 것인 인간 MG53 S255W의 정방향 및 역방향 프라이머.

인간 MG53 S255W의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctggcagagtggcccccacccg (서열식별번호: 37)

인간 MG53 S255W의 역방향 프라이머: tccagacgggcgggtgggggccactctgccagg (서열식별번호: 38)

(vii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 인간 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 1)의 위치 255에서의 세린은 글루타민으로 돌연변이된 것인 인간 MG53 S255Q의 정방향 및 역방향 프라이머.

인간 MG53 S255Q의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctggcagagcaacccccacccg (서열식별번호: 39)

인간 MG53 S255Q의 역방향 프라이머: tccagacgggcgggtgggggttgctctgccagg (서열식별번호: 40)

(viii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 인간 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 1)의 위치 255에서의 세린은 시스테인으로 돌연변이된 것인 인간 MG53 S255C의 정방향 및 역방향 프라이머.

인간 MG53 S255C의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctggcagagtgtcccccacccg (서열식별번호: 41)

인간 MG53 S255C의 역방향 프라이머: tccagacgggcgggtgggggacactctgccagg (서열식별번호: 42)

(ix) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 인간 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 1)의 위치 255에서의 세린은 티로신으로 돌연변이된 것인 인간 MG53 S255Y의 정방향 및 역방향 프라이머.

인간 MG53 S255Y의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctggcagagtatcccccacccg (서열식별번호: 43)

인간 MG53 S255Y의 역방향 프라이머: tccagacgggcgggtgggggatactctgccagg (서열식별번호: 44)

(x) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 인간 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 1)의 위치 255에서의 세린은 아스파르트산으로 돌연변이된 것인 인간 MG53 S255D의 정방향 및 역방향 프라이머.

인간 MG53 S255D의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctggcagaggatcccccacccg (서열식별번호: 45)

인간 MG53 S255D의 역방향 프라이머: tccagacgggcgggtgggggctactctgccagg (서열식별번호: 46)

(xi) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 인간 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 1)의 위치 255에서의 세린은 아르기닌으로 돌연변이된 것인 인간 MG53 S255R의 정방향 및 역방향 프라이머.

인간 MG53 S255R의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctggcagagcgtcccccacccg (서열식별번호: 47)

인간 MG53 S255R의 역방향 프라이머: tccagacgggcgggtgggggacgctctgccagg (서열식별번호: 48)

(xii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 인간 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 1)의 위치 255에서의 세린은 알라닌으로 돌연변이된 것인 인간 MG53 S255A의 정방향 및 역방향 프라이머.

인간 MG53 S211A의 정방향 프라이머: ccttgcgccgggagctgggggccctgaactctt (서열식별번호: 49)

인간 MG53 S211A의 역방향 프라이머: gctgctccaggtaagagttcagggcccccagctcc (서열식별번호: 50)

(xiii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 인간 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 1)의 위치 214에서의 세린은 알라닌으로 돌연변이된 것인 인간 MG53 S214A의 정방향 및 역방향 프라이머.

인간 MG53 S214A의 정방향 프라이머: gggagctggggagcctgaacgcttacctggagc (서열식별번호: 51)

인간 MG53 S214A의 역방향 프라이머: tgccgcagctgctccaggtaagcgttcaggctc (서열식별번호: 52)

(xiv) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 인간 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 1)의 위치 246에서의 세린은 알라닌으로 돌연변이된 것인 인간 MG53 S246A의 정방향 및 역방향 프라이머.

인간 MG53 S246A의 정방향 프라이머: tgaaatactgcctggtgaccgccaggctgcaga (서열식별번호: 53)

인간 MG53 S246A의 역방향 프라이머: gccaggatcttctgcagcctggcggtcaccagg (서열식별번호: 54)

(xv) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 인간 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 1)의 위치 269에서의 세린은 알라닌으로 돌연변이된 것인 인간 MG53 S269A의 정방향 및 역방향 프라이머.

인간 MG53 S269A의 정방향 프라이머: aggagctgacctttgacccggcctctgcgcacc (서열식별번호: 55)

인간 MG53 S296A의 역방향 프라이머: accaggctcgggtgcgcagaggccgggtcaaag (서열식별번호: 56)

(xvi) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 인간 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 1)의 위치 297에서의 세린은 알라닌으로 돌연변이된 것인 인간 MG53 S297A의 정방향 및 역방향 프라이머.

인간 MG53 S297A의 정방향 프라이머: agctgacctttgacccgagcgctgcgcacccga (서열식별번호: 57)

인간 MG53 S297A의 역방향 프라이머: accaccaggctcgggtgcgcagcgctcgggtca (서열식별번호: 58)

2. 마우스 MG53 돌연변이체의 제조

마우스 MG53 S255A, S255G, S255L, S255W, S255Q, S255Y, S255D, 및 S255R 돌연변이체를 인간 MG53 S255A 돌연변이체를 제조하는 방법에 따라 제조하였다. 프라이머를 제외하고는, 모든 다른 단계는 인간 MG53 S255A 돌연변이체를 제조하는 단계와 동일하다. 각각의 돌연변이체의 프라이머는 하기와 같다:

(i) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 마우스 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 2)의 위치 255에서의 세린은 알라닌으로 돌연변이된 것인 마우스 MG53 S255A의 정방향 및 역방향 프라이머.

마우스 MG53 S255A의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctgtcagaggcaccaccaccgg (서열식별번호: 59)

마우스 MG53 S255A의 역방향 프라이머: tctagccttgccggtggtggtgcctctgacagg (서열식별번호: 60)

(ii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 마우스 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 2)의 위치 255에서의 세린은 글리신으로 돌연변이된 것인 마우스 MG53 S255G의 정방향 및 역방향 프라이머.

마우스 MG53 S255G의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctgtcagagggaccaccaccgg (서열식별번호: 61)

마우스 MG53 S255G의 역방향 프라이머: tctagccttgccggtggtggtccctctgacagg (서열식별번호: 62)

(iii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 마우스 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 2)의 위치 255에서의 세린은 류신으로 돌연변이된 것인 마우스 MG53 S255L의 정방향 및 역방향 프라이머.

마우스 MG53 S255L의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctgtcagagttaccaccaccgg (서열식별번호: 63)

마우스 MG53 S255L의 역방향 프라이머: tctagccttgccggtggtggtaactctgacagg (서열식별번호: 64)

(iv) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 마우스 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 2)의 위치 255에서의 세린은 트립토판으로 돌연변이된 것인 마우스 MG53 S255W의 정방향 및 역방향 프라이머.

마우스 MG53 S255W의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctgtcagagtggccaccaccgg (서열식별번호: 65)

마우스 MG53 S255W의 역방향 프라이머: tctagccttgccggtggtggccactctgacagg (서열식별번호: 66)

(v) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 마우스 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 2)의 위치 255에서의 세린은 글루타민으로 돌연변이된 것인 마우스 MG53 S255Q의 정방향 및 역방향 프라이머.

마우스 MG53 S255Q의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctgtcagagcaaccaccaccgg (서열식별번호: 67)

마우스 MG53 S255Q의 역방향 프라이머: tctagccttgccggtggtggttgctctgacagg (서열식별번호: 68)

(vi) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 마우스 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 2)의 위치 255에서의 세린은 티로신으로 돌연변이된 것인 마우스 MG53 S255Y의 정방향 및 역방향 프라이머.

마우스 MG53 S255Y의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctgtcagagtatccaccaccgg (서열식별번호: 69)

마우스 MG53 S255Y의 역방향 프라이머: tctagccttgccggtggtggatactctgacagg (서열식별번호: 70)

(vii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 마우스 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 2)의 위치 255에서의 세린은 아스파르트산으로 돌연변이된 것인 마우스 MG53 S255D의 정방향 및 역방향 프라이머.

마우스 MG53 S255D의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctgtcagaggatccaccaccgg (서열식별번호: 71)

마우스 MG53 S255D의 역방향 프라이머: tctagccttgccggtggtggatcctctgacagg (서열식별번호: 72)

(viii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 마우스 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 2)의 위치 255에서의 세린은 아르기닌으로 돌연변이된 것인 마우스 MG53 S255R의 정방향 및 역방향 프라이머.

마우스 MG53 S255R의 정방향 프라이머: tgcagaagatcctgtcagagcgaccaccaccgg (서열식별번호: 73)

마우스 MG53 S255R의 역방향 프라이머: tctagccttgccggtggtggtcgctctgacagg (서열식별번호: 74)

3. 래트 MG53 돌연변이체의 제조

래트 MG53 S255A, S255G, S255L, S255W, S255Q, S255Y, S255D, 및 S255R 돌연변이체를 인간 MG53 S255A 돌연변이체를 제조하는 방법에 따라 제조하였다. 프라이머를 제외하고는, 모든 다른 단계는 인간 MG53 S255A 돌연변이체를 제조하는 단계와 동일하다. 각각의 돌연변이체의 프라이머는 하기와 같다:

(i) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 래트 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 3)의 위치 255에서의 세린은 알라닌으로 돌연변이된 것인 래트 MG53 S255A의 정방향 및 역방향 프라이머.

래트 MG53 S255A의 정방향 프라이머: tgcagaagattctgtcagaggcaccacccccag (서열식별번호: 75)

래트 MG53 S255A의 역방향 프라이머: tctagccttgctgggggtggtgcctctgacaga (서열식별번호: 76)

(ii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 래트 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 3)의 위치 255에서의 세린은 글리신으로 돌연변이된 것인 래트 MG53 S255G의 정방향 및 역방향 프라이머.

래트 MG53 S255G의 정방향 프라이머: tgcagaagattctgtcagagggaccacccccag (서열식별번호: 77)

래트 MG53 S255G의 역방향 프라이머: tctagccttgctgggggtggtccctctgacaga (서열식별번호: 78)

(iii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 래트 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 3)의 위치 255에서의 세린은 류신으로 돌연변이된 것인 래트 MG53 S255L의 정방향 및 역방향 프라이머.

래트 MG53 S255L의 정방향 프라이머: tgcagaagattctgtcagagttaccacccccag (서열식별번호: 79)

래트 MG53 S255L의 역방향 프라이머: tctagccttgctgggggtggtaactctgacaga (서열식별번호: 80)

(iv) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 래트 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 3)의 위치 255에서의 세린은 트립토판으로 돌연변이된 것인 래트 MG53 S255W의 정방향 및 역방향 프라이머.

래트 MG53 S255W의 정방향 프라이머: tgcagaagattctgtcagagtggccacccccag (서열식별번호: 81)

래트 MG53 S255W의 역방향 프라이머: tctagccttgctgggggtggccactctgacaga (서열식별번호: 82)

(v) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 래트 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 3)의 위치 255에서의 세린은 글루타민으로 돌연변이된 것인 래트 MG53 S255Q의 정방향 및 역방향 프라이머.

래트 MG53 S255Q의 정방향 프라이머: tgcagaagattctgtcagagcaaccacccccag (서열식별번호: 83)

래트 MG53 S255Q의 역방향 프라이머: tctagccttgctgggggtggttgctctgacaga (서열식별번호: 84)

(vi) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 래트 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 3)의 위치 255에서의 세린은 티로신으로 돌연변이된 것인 래트 MG53 S255Y의 정방향 및 역방향 프라이머.

래트 MG53 S255Y의 정방향 프라이머: tgcagaagattctgtcagagtatccacccccag (서열식별번호: 85)

래트 MG53 S255Y의 역방향 프라이머: tctagccttgctgggggtggatactctgacaga (서열식별번호: 86)

(vii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 래트 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 3)의 위치 255에서의 세린은 아스파르트산으로 돌연변이된 것인 래트 MG53 S255D의 정방향 및 역방향 프라이머.

래트 MG53 S255D의 정방향 프라이머: tgcagaagattctgtcagaggatccacccccag (서열식별번호: 87)

래트 MG53 S255D의 역방향 프라이머: tctagccttgctgggggtggatcctctgacaga (서열식별번호: 88)

(viii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 래트 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 3)의 위치 255에서의 세린은 아르기닌으로 돌연변이된 것인 래트 MG53 S255R의 정방향 및 역방향 프라이머.

래트 MG53 S255R의 정방향 프라이머: tgcagaagattctgtcagagcgaccacccccag (서열식별번호: 89)

래트 MG53 S255R의 역방향 프라이머: tctagccttgctgggggtggtcgctctgacaga (서열식별번호: 90)

4. 원숭이 MG53 돌연변이체의 제조

원숭이 MG53 S255A, S255G, S255L, S255W, S255Q, S255Y, S255D, 및 S255R 돌연변이체를 인간 MG53 S255A 돌연변이체를 제조하는 방법에 따라 제조하였다. 프라이머를 제외하고는, 모든 다른 단계는 인간 MG53 S255A 돌연변이체를 제조하는 단계와 동일하다. 각각의 돌연변이체의 프라이머는 하기와 같다:

(i) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 원숭이 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 4)의 위치 255에서의 세린은 알라닌으로 돌연변이된 것인 원숭이 MG53 S255A의 정방향 및 역방향 프라이머.

원숭이 MG53 S255A의 정방향 프라이머: aagatcctggcagaggctcccccacccgcccgtctg (서열식별번호: 91)

원숭이 MG53 S255A의 역방향 프라이머: cagacgggcgggtgggggagcctctgccaggatctt (서열식별번호: 92)

(ii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 원숭이 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 4)의 위치 255에서의 세린은 글리신으로 돌연변이된 것인 원숭이 MG53 S255G의 정방향 및 역방향 프라이머.

원숭이 MG53 S255G의 정방향 프라이머: aagatcctggcagagggtcccccacccgcccgtctgg (서열식별번호: 93)

원숭이 MG53 S255G의 역방향 프라이머: ccagacgggcgggtgggggaccctctgccaggatctt (서열식별번호: 94)

(iii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 원숭이 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 4)의 위치 255에서의 세린은 류신으로 돌연변이된 것인 원숭이 MG53 S255L의 정방향 및 역방향 프라이머.

원숭이 MG53 S255L의 정방향 프라이머: agatcctggcagagttacccccacccgcccgtctgga (서열식별번호: 95)

원숭이 MG53 S255L의 역방향 프라이머: tccagacgggcgggtgggggtaactctgccaggatct (서열식별번호: 96)

(iv) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 원숭이 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 4)의 위치 255에서의 세린은 트립토판으로 돌연변이된 것인 원숭이 MG53 S255W의 정방향 및 역방향 프라이머.

원숭이 MG53 S255W의 정방향 프라이머: agatcctggcagagtggcccccacccgcccgtctgga (서열식별번호: 97)

원숭이 MG53 S255W의 역방향 프라이머: tccagacgggcgggtgggggccactctgccaggatct (서열식별번호: 98)

(v) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 원숭이 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 4)의 위치 255에서의 세린은 글루타민으로 돌연변이된 것인 원숭이 MG53 S255Q의 정방향 및 역방향 프라이머.

원숭이 MG53 S255Q의 정방향 프라이머: aagatcctggcagagcaacccccacccgcccgtctgga (서열식별번호: 99)

원숭이 MG53 S255Q의 역방향 프라이머: tccagacgggcgggtgggggttgctctgccaggatctt (서열식별번호: 100)

(vi) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 원숭이 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 4)의 위치 255에서의 세린은 티로신으로 돌연변이된 것인 원숭이 MG53 S255Y의 정방향 및 역방향 프라이머.

원숭이 MG53 S255Y의 정방향 프라이머: agatcctggcagagtatcccccacccgcccgtctgg (서열식별번호: 101)

원숭이 MG53 S255Y의 역방향 프라이머: ccagacgggcgggtgggggatactctgccaggatct (서열식별번호: 102)

(vii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 원숭이 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 4)의 위치 255에서의 세린은 아스파르트산으로 돌연변이된 것인 원숭이 MG53 S255D의 정방향 및 역방향 프라이머.

원숭이 MG53 S255D의 정방향 프라이머: aagatcctggcagaggatcccccacccgcccgtctgg (서열식별번호: 103)

원숭이 MG53 S255D의 역방향 프라이머: ccagacgggcgggtgggggatcctctgccaggatctt (서열식별번호: 104)

(viii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 원숭이 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 4)의 위치 255에서의 세린은 아르기닌으로 돌연변이된 것인 원숭이 MG53 S255R의 정방향 및 역방향 프라이머.

원숭이 MG53 S255R의 정방향 프라이머: aagatcctggcagagcgtcccccacccgcccgtctgg (서열식별번호: 105)

원숭이 MG53 S255R의 역방향 프라이머: ccagacgggcgggtgggggacgctctgccaggatctt (서열식별번호: 106)

5. 돼지 MG53 돌연변이체의 제조

돼지 MG53 S255A, S255G, S255L, S255W, S255Q, S255Y, S255D, 및 S255R 돌연변이체를 인간 MG53 S255A 돌연변이체를 제조하는 방법에 따라 제조하였다. 프라이머를 제외하고는, 모든 다른 단계는 인간 MG53 S255A 돌연변이체를 제조하는 단계와 동일하다. 각각의 돌연변이체의 프라이머는 하기와 같다:

(i) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 돼지 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 5)의 위치 255에서의 세린은 알라닌으로 돌연변이된 것인 돼지 MG53 S255A의 정방향 및 역방향 프라이머.

돼지 MG53 S255A의 정방향 프라이머: aagatcctggcagaggcgcccccacctgcccgcctg (서열식별번호: 107)

돼지 MG53 S255A의 역방향 프라이머: caggcgggcaggtgggggcgcctctgccaggatctt (서열식별번호: 108)

(ii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 돼지 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 5)의 위치 255에서의 세린은 글리신으로 돌연변이된 것인 돼지 MG53 S255G의 정방향 및 역방향 프라이머.

돼지 MG53 S255G의 정방향 프라이머: aagatcctggcagaggggcccccacctgcccgcctgg (서열식별번호: 109)

돼지 MG53 S255G의 역방향 프라이머: ccaggcgggcaggtgggggcccctctgccaggatctt (서열식별번호: 110)

(iii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 돼지 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 5)의 위치 255에서의 세린은 류신으로 돌연변이된 것인 돼지 MG53 S255L의 정방향 및 역방향 프라이머.

돼지 MG53 S255L의 정방향 프라이머: agatcctggcagagttgcccccacctgcccgcctgg (서열식별번호: 111)

돼지 MG53 S255L의 역방향 프라이머: ccaggcgggcaggtgggggcaactctgccaggatct (서열식별번호: 112)

(iv) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 돼지 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 5)의 위치 255에서의 세린은 트립토판으로 돌연변이된 것인 돼지 MG53 S255W의 정방향 및 역방향 프라이머.

돼지 MG53 S255W의 정방향 프라이머: agatcctggcagagtggcccccacctgcccgcctgg (서열식별번호: 113)

돼지 MG53 S255W의 역방향 프라이머: ccaggcgggcaggtgggggccactctgccaggatct (서열식별번호: 114)

(v) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 돼지 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 5)의 위치 255에서의 세린은 글루타민으로 돌연변이된 것인 돼지 MG53 S255Q의 정방향 및 역방향 프라이머.

돼지 MG53 S255Q의 정방향 프라이머: aagatcctggcagagcagcccccacctgcccgcctgg (서열식별번호: 115)

돼지 MG53 S255Q의 역방향 프라이머: ccaggcgggcaggtgggggctgctctgccaggatctt (서열식별번호: 116)

(vi) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 돼지 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 5)의 위치 255에서의 세린은 티로신으로 돌연변이된 것인 돼지 MG53 S255Y의 정방향 및 역방향 프라이머.

돼지 MG53 S255Y의 정방향 프라이머: agatcctggcagagtatcccccacctgcccgcctgga (서열식별번호: 117)

돼지 MG53 S255Y의 역방향 프라이머: tccaggcgggcaggtgggggatactctgccaggatct (서열식별번호: 118)

(vii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 돼지 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 5)의 위치 255에서의 세린은 아스파르트산으로 돌연변이된 것인 돼지 MG53 S255D의 정방향 및 역방향 프라이머.

돼지 MG53 S255D의 정방향 프라이머: aagatcctggcagaggatcccccacctgcccgcctgga (서열식별번호: 119)

돼지 MG53 S255D의 역방향 프라이머: tccaggcgggcaggtgggggatcctctgccaggatctt (서열식별번호: 120)

(viii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 돼지 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 5)의 위치 255에서의 세린은 아르기닌으로 돌연변이된 것인 돼지 MG53 S255R의 정방향 및 역방향 프라이머.

돼지 MG53 S255R의 정방향 프라이머: aagatcctggcagagcggcccccacctgcccgcctgg (서열식별번호: 121)

돼지 MG53 S255R의 역방향 프라이머: ccaggcgggcaggtgggggccgctctgccaggatctt (서열식별번호: 122)

6. 개 MG53 돌연변이체의 제조

개 MG53 S255A, S255G, S255L, S255W, S255Q, S255Y, S255D, 및 S255R 돌연변이체를 인간 MG53 S255A 돌연변이체를 제조하는 방법에 따라 제조하였다. 프라이머를 제외하고는, 모든 다른 단계는 인간 MG53 S255A 돌연변이체를 제조하는 단계와 동일하다. 각각의 돌연변이체의 프라이머는 하기와 같다:

(i) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 개 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 6)의 위치 255에서의 세린은 알라닌으로 돌연변이된 것인 개 MG53 S255A의 정방향 및 역방향 프라이머.

개 MG53 S255A의 정방향 프라이머: aagatcctggcagaagcaccaccgcctgcccgtttg (서열식별번호: 123)

개 MG53 S255A의 역방향 프라이머: caaacgggcaggcggtggtgcttctgccaggatctt (서열식별번호: 124)

(ii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 개 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 6)의 위치 255에서의 세린은 글리신으로 돌연변이된 것인 개 MG53 S255G의 정방향 및 역방향 프라이머.

개 MG53 S255G의 정방향 프라이머: aagatcctggcagaaggaccaccgcctgcccgtttgg (서열식별번호: 125)

개 MG53 S255G의 역방향 프라이머: ccaaacgggcaggcggtggtccttctgccaggatctt (서열식별번호: 126)

(iii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 개 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 6)의 위치 255에서의 세린은 류신으로 돌연변이된 것인 개 MG53 S255L의 정방향 및 역방향 프라이머.

개 MG53 S255L의 정방향 프라이머: agatcctggcagaattaccaccgcctgcccgtttgg (서열식별번호: 127)

개 MG53 S255L의 역방향 프라이머: ccaaacgggcaggcggtggtaattctgccaggatct (서열식별번호: 128)

(iv) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 개 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 6)의 위치 255에서의 세린은 트립토판으로 돌연변이된 것인 개 MG53 S255W의 정방향 및 역방향 프라이머.

개 MG53 S255W의 정방향 프라이머: agatcctggcagaatggccaccgcctgcccgtttgga (서열식별번호: 129)

개 MG53 S255W의 역방향 프라이머: tccaaacgggcaggcggtggccattctgccaggatct (서열식별번호: 130)

(v) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 개 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 6)의 위치 255에서의 세린은 글루타민으로 돌연변이된 것인 개 MG53 S255Q의 정방향 및 역방향 프라이머.

개 MG53 S255Q의 정방향 프라이머: aagatcctggcagaacaaccaccgcctgcccgtttgg (서열식별번호: 131)

개 MG53 S255Q의 역방향 프라이머: ccaaacgggcaggcggtggttgttctgccaggatctt (서열식별번호: 132)

(vi) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 개 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 6)의 위치 255에서의 세린은 티로신으로 돌연변이된 것인 개 MG53 S255Y의 정방향 및 역방향 프라이머.

개 MG53 S255Y의 정방향 프라이머: agatcctggcagaatatccaccgcctgcccgtttgga (서열식별번호: 133)

개 MG53 S255Y의 역방향 프라이머: tccaaacgggcaggcggtggatattctgccaggatct (서열식별번호: 134)

(vii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 개 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 6)의 위치 255에서의 세린은 아스파르트산으로 돌연변이된 것인 개 MG53 S255D의 정방향 및 역방향 프라이머.

개 MG53 S255D의 정방향 프라이머: aagatcctggcagaagatccaccgcctgcccgtttgga (서열식별번호: 135)

개 MG53 S255D의 역방향 프라이머: tccaaacgggcaggcggtggatcttctgccaggatctt (서열식별번호: 136)

(viii) MG53 돌연변이체를 나타내며, 여기서 개 야생형 MG53 (즉, 서열식별번호: 6)의 위치 255에서의 세린은 아르기닌으로 돌연변이된 것인 개 MG53 S255R의 정방향 및 역방향 프라이머.

개 MG53 S255R의 정방향 프라이머: aagatcctggcagaacgaccaccgcctgcccgtttgg (서열식별번호: 137)

개 MG53 S255R의 역방향 프라이머: ccaaacgggcaggcggtggtcgttctgccaggatctt (서열식별번호: 138)

각각의 세린 위치에서의 세린 결실 및/또는 돌연변이를 갖는 다양한 종의 MG53 돌연변이체는 인간 MG53 S255A 돌연변이체를 제조하는 방법에 따라 제조될 수 있다. 프라이머를 제외하고는, 모든 다른 단계는 인간 MG53 S255A 돌연변이체를 제조하는 단계와 동일하다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 관련 기술분야에서의 통상적인 기술적 수단에 의해 각각의 돌연변이체의 프라이머를 디자인할 수 있다.

실시예 2: 마우스 야생형 MG53의 세포 막 복구 기능 및 심장보호 기능에 대한 마우스 MG53 S255A 돌연변이체의 영향.

마우스 야생형 MG53의 세포 막 복구 기능 및 심장보호 기능에 대한 마우스 MG53 S255A 돌연변이체 (그의 아미노산 서열은 서열식별번호: 8에 제시됨)의 영향을 평가하기 위해, 본 발명자들은 1차 배양된 신생아 래트 심실 근세포 (NRVM)에서 아데노바이러스를 사용하여 마우스 야생형 MG53 및 마우스 MG53 돌연변이체를 과다발현하고, 세포의 생존율을 검출하였다. 결과는 도 14에 제시되며, 이는 저산소증/재산소화-모의 허혈-재관류 손상이 NRVM에서 락테이트 데히드로게나제 (LDH)의 대량 방출 및 감소된 세포내 ATP를 생성하며, 마우스 야생형 MG53 및 마우스 MG53 S255A 돌연변이체의 과다-발현이 LDH 방출 및 ATP 감소를 유사하게 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 이는 마우스 야생형 MG53이 허혈-재관류 유도된 아폽토시스 및 괴사에 대한 보호 효과를 갖는 반면에, 마우스 MG53 S255A 돌연변이체가 마우스 야생형 MG53의 세포 막 복구 기능 및 심장보호 기능에 영향을 미치지 않으며, 즉, 마우스 MG53 S255 위치의 인산화가 MG53의 세포 막 복구 기능 및 심장보호 기능을 조절하지 않는다는 것을 시사한다.

마우스 MG53 S255A 돌연변이는 RISK 신호전달 경로에 대한 MG53의 활성화에 영향을 미치지 않는다.

MG53의 심장보호 기능의 메카니즘은 하기와 같다: MG53은 심장 보호의 RISK 신호전달 경로에서의 필수적인 성분이고, RISK 신호전달 경로를 활성화시키기 위한 카베올린-3 및 p85-PI3K 단백질 사이의 상호작용, 예를 들어, 중요한 하류 신호전달 분자 AKT를 매개한다 (문헌 [Zhang Y. et al., Cardiovascular Research 91, 108-115 (2011)] 참조). 따라서, 본 발명자들은 마우스 MG53 S255A 돌연변이체 및 마우스 야생형 MG53이 RISK 신호전달 경로를 유사하게 활성화시킬 수 있다는 사실과 관련되는지 여부를 식별하기 위해 마우스 MG53 S255A 돌연변이가 MG53의 심장보호 기능에 영향을 미치지 않는 메카니즘을 추가로 연구하였다. 실험 결과는 도 15에 제시되며, 이는 NRVM에서의 마우스 야생형 MG53의 과다-발현이 RISK 신호전달 경로의 하류 신호전달 분자인 AKT의 위치 473에서의 세린의 인산화를 증진시키며, 즉, AKT를 활성화시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 마우스 MG53 S255A 돌연변이체 및 마우스 야생형 MG53은 AKT의 위치 473에서의 세린의 인산화를 유사하게 증진시킬 수 있으며, 즉, AKT를 활성화시킬 수 있다. 이는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체가 RISK 신호전달 경로의 마우스 야생형 MG53의 활성화에 영향을 미치지 않으며, 즉, 마우스 MG53 S255의 인산화에 대한 조절은 RISK 신호전달 심장보호 경로에 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다.

실시예 3: 야생형 MG53의 E3 유비퀴틴 리가제 활성에 대한 인간 또는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체의 영향.

MG53의 고발현에 의해 유도된 인슐린 신호전달 경로의 저해는 인슐린 저항성 및 대사 증후군의 발생에 대한 중요한 메카니즘 중 하나이고, 이는 또한 MG53의 중요한 기능 중 하나이다. 첫번째로, 본 발명자들은 마우스 야생형 MG53의 세린 돌연변이의 발현 플라스미드 --- 마우스 MG53 S255A (그의 아미노산 서열은 서열식별번호: 8에 제시됨)를 구축하였다. 게다가, 본 발명자들은 또한 IRS1, 유비퀴틴, 및 마우스 야생형 MG53의 발현 플라스미드를 구축하였다. 두번째로, 본 발명자들의 이전 연구는, MG53이 인슐린 기질 IRS1의 E3 유비퀴틴 리가제이고, 단백질의 프로테아솜 경로 분해를 매개한다는 것을 시사한다 (Song, R. et al., Nature 494, 375-379,(2013)). 따라서, 본 발명자들은 HEK293T 세포주를 IRS1, 유비퀴틴의 발현 세포주, 및 마우스 야생형 MG53 또는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체의 플라스미드로 공동-형질감염시키고, IRS1 단백질 함량에서의 변화를 통해 MG53 기능에 대한 마우스 MG53 S255A 돌연변이의 영향을 평가하였다. 실험 결과는 도 19에 제시되며, 이는 마우스 야생형 MG53이 IRS1 발현을 상당히 감소시킬 수 있는 반면에, 마우스 MG53 S255A 돌연변이체는 MG53-매개된 IRS1 단백질 감소를 상당히 억제할 수 있다는 것을 시사한다. 이는, HEK293T 세포주의 공동-발현 시스템에서, 마우스 야생형 MG53이 정상 E3 유비퀴틴 리가제 활성을 발휘할 수 있고, IRS1의 유비퀴틴 분해를 매개한다는 것을 시사한다. 이는 또한 검출된 마우스 MG53 S255A 돌연변이체가 MG53의 E3 유비퀴틴 리가제 활성을 억제하였으며, 즉, MG53 S255 위치의 인산화 상태가 MG53의 E3 유비퀴틴 리가제 활성을 조절할 수 있다는 것을 시사한다.

인간 또는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체는 MG53-매개된 기질 분해를 억제한다

MG53은 RING 도메인을 갖는 E3 유비퀴틴 리가제이며, 이는 기질의 유비퀴틴화 및 추가의 프로테아솜 분해를 매개하는 E2 유비퀴틴 효소와 연관된다. 따라서, RING 도메인이 없는 MG53-D-RING 말단절단된 돌연변이체는 MG53의 E3 유비퀴틴 리가제 활성을 상실한다. 추가로, 인간 또는 마우스 야생형 MG53의 E3 유비퀴틴 리가제 활성에 대한 인간 MG53 S255A 돌연변이체 (그의 아미노산 서열은 서열식별번호: 7에 제시됨) 및 마우스 MG53 S255A 돌연변이체 (그의 아미노산 서열은 서열식별번호: 8에 제시됨)의 영향을 정량적으로 평가하기 위해, 본 발명자들은, 인간 또는 마우스 MG53-D-RING를 양성 대조군으로 하여, 인간 배아 신장 상피 세포주 HEK293T에서 인간 또는 마우스 야생형 MG53, MG53 S255A 돌연변이체, 또는 MG53-D-RING 말단절단된 돌연변이체, 및 MG53의 기질 IRS1 또는 인슐린 수용체 IR을 공동-발현하고, MG53-매개된 기질 분해에 대한 상이한 돌연변이의 영향을 검출하였다. 결과는 도 16 (마우스) 및 도 17 (인간)에 제시되며, 이는 인간 또는 마우스 야생형 MG53이 IRS1 분해를 상당히 매개할 수 있고, 인간 또는 마우스 MG53-D-RING 말단절단된 돌연변이체가 IRS1 분해를 거의 매개할 수 없는 반면에, 마우스 MG53 S255A 돌연변이체가 단지 IRS1의 약 40% 분해를 매개할 수 있고, 인간 MG53 S255A 돌연변이체가 단지 IRS1의 약 10% 분해를 매개할 수 있다는 것을 나타낸다. 마우스 야생형 MG53은 IRβ의 약 50% 분해를 매개할 수 있고, 마우스 MG53-D-RING 말단절단된 돌연변이체 및 마우스 MG53 S255A 돌연변이체는 IRβ 분해를 거의 매개할 수 없다. 게다가, HEK293T 공동-발현 시스템에서, 마우스 야생형 MG53은 IRβ의 전구체 단백질의 분해를 매개할 수 있는 반면에, 마우스 MG53-D-RING 말단절단된 돌연변이체 및 마우스 MG53 S255A 돌연변이체는 MG53-매개된 분해를 거의 완전히 억제한다. 이러한 연구는 인간 또는 마우스 MG53-D-RING 말단절단된 돌연변이체가 MG53의 E3 유비퀴틴 리가제 활성을 상당히 억제하는 반면에, 인간 또는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체가 MG53의 약 적어도 50% E3 유비퀴틴 리가제 활성을 억제한다는 것을 시사한다.

마우스 MG53 S255A 돌연변이체는 기질 IRS1 단백질에 대한 MG53의 결합을 억제한다

마우스 MG53 S255A 돌연변이체 (그의 아미노산 서열은 서열식별번호: 8에 제시됨)가 기질 IRS1 단백질에 대한 MG53의 인식 및 결합에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 연구하기 위해, 본 발명자들은, 한 측면에서, 공동-면역침전을 통해 생체외 HEK293T 세포주에서 활성 상태 하에 기질 IRS1 및 마우스 야생형 MG53 또는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체의 결합 강도를 검출하고, 또 다른 측면에서, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 시험을 통해 정제된 단백질 IRS1 및 마우스 야생형 MG53 또는 마우스 MG53 S255A 돌연변이체의 직접 결합 강도를 검출하였다. 실험 결과는 도 18에 제시된다. 도 18A는 IRS1이 마우스 야생형 MG53에 물리적으로 결합할 수 있는 반면에, 동일한 양의 IRS1이 단지 매우 소량의 마우스 MG53 S255A 돌연변이체에 결합할 수 있다는 것을 제시하며; 도 18B는 마우스 야생형 MG53 단백질이 IRS1 단백질에, 64.2 nM의 KD로, 매우 잘 결합할 수 있는 반면에, 마우스 MG53 S255A 돌연변이체가 IRS1 단백질에 결합할 수 없다는 것을 제시한다. 상기에 비추어, 마우스 MG53 S255A 돌연변이체는 MG53의 E3 유비퀴틴 리가제 활성을 억제하기 위해 기질 IRS1 단백질에 대한 MG53의 인식 및 결합을 억제하였다.

실시예 4: 인간 MG53 S255A 돌연변이체의 생체내 활성

인간 MG53 S255A 돌연변이체 (그의 아미노산 서열은 서열식별번호: 7에 제시됨)가 생체내에서 세포 막 복구 기능 및 심장보호 기능을 여전히 보유하면서 야생형 MG53에 의해 야기되는 대사 부작용을 피하거나 또는 감소시킬 수 있는지 여부를 검증하기 위해, 본 발명자들은 인간 MG53 S255A 돌연변이체 및 인간 야생형 MG53을 각각 래트의 신체 내로 도입하여, 인간 MG53 S255A 돌연변이체의 생체내 활성을 추가로 분석한다. 첫번째로, 본 발명자들은 본 출원의 실시예 1에 따른 인간 MG53 S255A 돌연변이체를 제조한다. 두번째로, 15마리의 수컷 스프라그-돌리 (SD) 래트 (베이징 바이탈 리버 래버러토리 애니멀 테크놀로지 캄파니, 리미티드(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.)에 의해 제공된, 약 250g/래트)를 선택하고, 3개의 군, 즉, 시험군, 양성 대조군, 및 음성 대조군으로 군당 5마리씩 그룹화한다. 래트를 30mg/kg 펜토바르비탈 나트륨을 통해 (복강내 주사) 마취시키고, 이어서 개흉술을 좌측 세번째 늑골에서 수행하여 심장을 노출시킨다. 이어서, 인간 MG53 S255A 돌연변이체 단백질 (6mg/kg, iv)을 시험군 내 래트의 심장으로 정맥내로 주사하고, 인간 야생형 MG53 단백질 (그의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 제시됨) (6mg/kg, iv)을 양성 대조군 내 래트의 심장으로 정맥내로 주사하고, 소 혈청 알부민 (BSA) (6mg/kg, iv)을 음성 대조군 내 래트의 심장으로 정맥내로 주사한다. 각각의 군 내 래트의 좌측 전하행 동맥의 라이게이션을 상기 단백질의 정맥내 주사 5분 후에 수행하고, 45분 동안 지속한다. 라이게이션의 종료 전에, 각각의 군의 래트를 각각 상응하는 인간 MG53 S255A 돌연변이체 단백질, 인간 야생형 MG53 단백질 및 BSA (6mg/kg, iv)로 다시 정맥내로 주사하고, 이어서 관상 동맥을 방출한다. 24시간 재관류 기간 후에, 생존율을 시험군, 양성 대조군, 및 음성 대조군 사이에서 비교한다. 인슐린을 사용하여 각각의 군 내 래트를 자극하고, 이어서 래트를 희생시켜 시험군, 양성 대조군, 및 음성 대조군 내 래트의 경색 크기, 혈청 LDH 농도, 및 심근 부분의 TUNEL 염색을 비교한다. 종합하며, 이들 지시자는 각각의 군 내 래트의 심장 손상의 수준을 측정한다. 시험군 내 래트의 경색 크기가 음성 대조군 내 래트의 경색 크기보다 상당히 더 작거나, 또는 시험군 내 래트가 음성 대조군 내 래트와 비교하여 상당히 억제된 LDH 방출을 입증하거나, 또는 시험군 내 래트의 심근 부분의 TUNEL 염색 결과가 음성 대조군 내 래트의 것과 비교하여 감소된 세포 사멸을 나타내는 경우에, 이는 인간 MG53 S255A 돌연변이체가 인간 야생형 MG53의 세포 막 복구 기능 및 심장보호 기능에 영향을 미치지 않으며, 심장 질환, 예컨대 심근경색, 심장 허혈/재관류 손상 등을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 시사한다. 최종적으로, 시험군, 양성 대조군 및 음성 대조군 내 래트의 각각의 조직 (예를 들어 심근, 골격근, 간 등) 내의 p-AKT/t-AKT 변화를 비교하여 시험군, 양성 대조군 및 음성 대조군 내 래트의 각각의 조직의 인슐린 반응성을 평가한다. 양성 대조군 내 래트의 조직에서의 p-AKT/t-AKT의 비가 감소되는 경우에, 이는 인간 야생형 MG53 단백질이 인슐린 감수성의 감소를 유도할 수 있다는 것을 시사하며; 음성 대조군 내 래트의 조직에서의 p-AKT/t-AKT의 비가 정상인 경우에, 이는 BSA가 인슐린 감수성에 대해 어떠한 영향도 미치지 않는다는 것을 시사하며; 시험군 내 래트의 조직에서의 p-AKT/t-AKT의 비가 양성 대조군보다 더 높은 경우에, 이는 인간 MG53 S255A 돌연변이체가 인간 야생형 MG53 단백질에 의해 유도된 인슐린 감수성의 감소를 제거하거나 또는 약화시킬 수 있다는 것을 시사한다.

요약하면, MG53 코일드-코일-SPRY 영역 내의 적어도 1개의 세린 (특히 위치 255에서의 세린)이 결실되거나 또는 임의의 다른 비-세린 또는 비-트레오닌 (예를 들어 알라닌) 아미노산으로 돌연변이되는 경우에, 생성된 MG53 돌연변이체는 세포 복구 기능 및/또는 심장보호 기능을 여전히 보유하면서 야생형 MG53에 의해 야기되는 대사 부작용, 예컨대 인슐린 저항성을 피하거나 또는 감소시킬 수 있다.

본 발명이 구체적 실시양태를 도입함으로써 개시되고 기재될지라도, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 형식적이고 상세한 변형이 본 발명의 대상의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 상기 내용으로 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> PEKING UNIVERSITY <120> MG53 Mutants, Methods of Making the Same, and Uses Thereof <130> 066467-8001WO01 <160> 154 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 477 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu 1 5 10 15 Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser 20 25 30 Phe Cys Arg Ala Cys Leu Gly Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp 35 40 45 Gly Thr Val Leu Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln 65 70 75 80 Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr 85 90 95 Cys Glu Gln Asp Arg Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly 100 105 110 Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg 115 120 125 Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys 130 135 140 Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu 145 150 155 160 Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu 165 170 175 Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg 180 185 190 Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu 195 200 205 Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys 210 215 220 Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys 225 230 235 240 Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu Ser Pro 245 250 255 Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile Ser Asp Asp Phe 260 265 270 Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu 275 280 285 Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val 290 295 300 Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro 305 310 315 320 Ala Gly Glu Asp Pro Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala 325 330 335 His Gln Gln Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Asp Val Gly 340 345 350 Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Ala Ala Glu Ala Pro Arg 355 360 365 Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly 370 375 380 Leu Arg Glu Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro 385 390 395 400 Arg Ala Leu Arg Ser Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Leu Tyr 405 410 415 Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala 420 425 430 Asp Ala Leu Val Pro Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Arg Pro 435 440 445 Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala 450 455 460 Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gly Ala Glu Ala 465 470 475 <210> 2 <211> 477 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu Arg Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu 1 5 10 15 Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser 20 25 30 Phe Cys Arg Ala Cys Leu Ile Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp 35 40 45 Gly Thr Val Ala Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ser Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln 65 70 75 80 Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr 85 90 95 Cys Glu Gln Asp Arg Thr Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly 100 105 110 Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala Gln Ala Arg 115 120 125 Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Met Gln Leu Gln Glu Ala Cys 130 135 140 Met Arg Lys Glu Lys Thr Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu 145 150 155 160 Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu 165 170 175 Gly Lys Met Arg Met Phe Leu Ala Ala Leu Glu Ser Ser Leu Asp Arg 180 185 190 Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu 195 200 205 Leu Ser Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys 210 215 220 Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys 225 230 235 240 Phe Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ser Glu Ser Pro 245 250 255 Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Val Ile Ser Asp Asp Phe 260 265 270 Lys Phe Gln Val Trp Lys Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu 275 280 285 Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val 290 295 300 Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Asp Gln Lys Ala Pro Pro 305 310 315 320 Ala Gly Glu Asp Thr Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala 325 330 335 Gln Gln Leu Leu Ser Gln Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Glu Val Gly 340 345 350 Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Met Ala Ala Asp Ala Ser Arg 355 360 365 Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly 370 375 380 Leu Arg Asp Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro 385 390 395 400 Arg Ala Leu Arg Thr Pro Glu Arg Pro Pro Ala Arg Ile Gly Leu Tyr 405 410 415 Leu Ser Phe Ala Asp Gly Val Leu Ala Phe Tyr Asp Ala Ser Asn Pro 420 425 430 Asp Val Leu Thr Pro Ile Phe Ser Phe His Glu Arg Leu Pro Gly Pro 435 440 445 Val Tyr Pro Ile Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala 450 455 460 Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gln Glu Gln Ala 465 470 475 <210> 3 <211> 477 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 3 Met Ser Thr Ala Pro Gly Leu Leu Arg Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu 1 5 10 15 Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu 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acid sequence of rat MG53 S255A mutant <400> 9 Met Ser Thr Ala Pro Gly Leu Leu Arg Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu 1 5 10 15 Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser 20 25 30 Phe Cys Arg Ala Cys Leu Ile Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Asp Asp 35 40 45 Gly Thr Val Ala Cys Pro Cys Cys Gln Ala Ser Thr Arg Pro Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln 65 70 75 80 Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr 85 90 95 Cys Glu Gln Asp Arg Thr Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly 100 105 110 Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg 115 120 125 Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Ala Gln Leu Gln Glu Ala Cys 130 135 140 Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu 145 150 155 160 Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu 165 170 175 Gly Lys Met Arg Met Phe Leu Ala Ala Leu Glu Ser Ser Leu Asp Arg 180 185 190 Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu 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Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly 370 375 380 Leu Arg Asp Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro 385 390 395 400 Arg Ala Leu Arg Thr Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Ile Tyr 405 410 415 Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Pro 420 425 430 Asp Ala Leu Glu Leu Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Gly Pro 435 440 445 Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala 450 455 460 Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Asp Gly Glu Glu Ala 465 470 475 <210> 13 <211> 1434 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encoding sequence of human MG53 S255A mutant <400> 13 atgtcggctg cgcccggcct cctgcaccag gagctgtcct gcccgctgtg cctgcagctg 60 ttcgacgcgc ccgtgacagc cgagtgcggc cacagtttct gccgcgcctg cctaggccgc 120 gtggccgggg agccggcggc ggatggcacc gttctctgcc cctgctgcca ggcccccacg 180 cggccgcagg cactcagcac caacctgcag ctggcgcgcc tggtggaggg gctggcccag 240 gtgccgcagg gccactgcga ggagcacctg gacccgctga gcatctactg cgagcaggac 300 cgcgcgctgg tgtgcggagt gtgcgcctca ctcggctcgc accgcggtca tcgcctcctg 360 cctgccgccg aggcccacgc acgcctcaag acacagctgc cacagcagaa actgcagctg 420 caggaggcat gcatgcgcaa ggagaagagt gtggctgtgc tggagcatca gctggtggag 480 gtggaggaga cagtgcgtca gttccggggg gccgtggggg agcagctggg caagatgcgg 540 gtgttcctgg ctgcactgga gggctccttg gaccgcgagg cagagcgtgt acggggtgag 600 gcaggggtcg ccttgcgccg ggagctgggg agcctgaact cttacctgga gcagctgcgg 660 cagatggaga aggtcctgga ggaggtggcg gacaagccgc agactgagtt cctcatgaaa 720 tactgcctgg tgaccagcag gctgcagaag atcctggcag aggctccccc acccgcccgt 780 ctggacatcc agctgccaat tatctcagat gacttcaaat tccaggtgtg gaggaagatg 840 ttccgggctc tgatgccagc gctggaggag ctgacctttg acccgagctc tgcgcacccg 900 agcctggtgg tgtcttcctc tggccgccgc gtggagtgct cggagcagaa ggcgccgccg 960 gccggggagg acccgcgcca gttcgacaag gcggtggcgg tggtggcgca ccagcagctc 1020 tccgagggcg agcactactg ggaggtggat gttggcgaca agccgcgctg ggcgctgggc 1080 gtgatcgcgg ccgaggcccc ccgccgcggg cgcctgcacg cggtgccctc gcagggcctg 1140 tggctgctgg ggctgcgcga gggcaagatc ctggaggcac acgtggaggc caaggagccg 1200 cgcgctctgc gcagccccga gaggcggccc acgcgcattg gcctttacct gagcttcggc 1260 gacggcgtcc tctccttcta cgatgccagc gacgccgacg cgctcgtgcc gctttttgcc 1320 ttccacgagc gcctgcccag gcccgtgtac cccttcttcg acgtgtgctg gcacgacaag 1380 ggcaagaatg cccagccgct gctgctcgtg ggtcccgaag gcgccgaggc ctga 1434 <210> 14 <211> 1434 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encoding sequence of mouse MG53 S255A mutant <400> 14 atgtcggctg cacccggcct tctgcgtcag gaactgtcct gcccactgtg cttgcagctg 60 ttcgatgcgc cagtgacggc tgagtgtggc cacagtttct gccgtgcctg cctgatccgg 120 gtggcagggg agcctgctgc ggacggcaca gttgcctgtc cctgttgtca ggcacctaca 180 cggccgcagg ctctaagcac taacctccag ttgtcacgcc ttgtggaggg tttggcgcaa 240 gtgccccaag gccactgcga ggaacacctg gatccactga gcatctactg cgagcaggac 300 cgcacacttg tgtgtggtgt gtgtgcctcg ctcggttctc accgtggtca tcgtctcctg 360 cctgccgctg aagcccaagc acgcctcaag acacagcttc cacagcagaa gatgcagctg 420 caggaggcat gcatgcgcaa ggagaagact gtagcggtgc tggagcatca gctggtggag 480 gtggaggaga cagtgcgcca gttccgggga gctgtcgggg agcagctggg gaagatgcgg 540 atgttcctgg ctgccctaga aagttctctg gaccgtgaag cagaaagggt tcggggtgat 600 gctggggttg ccttgcgtcg ggagctgtca agcctgaact cttacctaga gcaactgagg 660 cagatggaga aggtgctgga ggaggtggct gacaagccac agacagaatt cctcatgaaa 720 ttctgcctgg taaccagcag gctgcagaag atcctgtcag aggcaccacc accggcaagg 780 ctagatatcc agctgcctgt catctcagat gacttcaaat tccaggtgtg gaagaagatg 840 ttccgggctc tgatgccagc gctggaggaa ctgacttttg accccagctc tgcgcacccg 900 agcctggtgg tgtcctcctc tggtcgccga gtggagtgct cagaccagaa ggcgccgcca 960 gcgggagaag acacgcgtca gttcgacaag gcagtagcgg tggtggcgca gcagctgctg 1020 tcacagggcg agcactattg ggaggtggag gtgggcgaca aaccacgctg ggccctggga 1080 gtgatggcgg ctgacgcttc ccgccgtggc cggctgcacg cggtgccctc acaggggctg 1140 tggctgctgg gtctgcgcga tggcaagatc ctggaggcgc acgtggaggc caaggagccg 1200 cgggcactgc gcaccccaga gaggcctccg gcgcgcattg gcctctacct aagcttcgca 1260 gatggcgtcc tggctttcta tgatgcgagc aaccccgacg tacttacgcc aatcttttct 1320 ttccacgagc 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gcaactgagg 660 cagatggaga aggtgctgga ggaggtggct gacaagccac agacagaatt cctcatgaaa 720 ttctgcctgg tgaccagcag gctgcagaag attctgtcag aggcaccacc cccagcaagg 780 ctagatatcc agctgcctgt catctcagat gacttcaaat tccaggtgtg gaagaagatg 840 ttccgggctc tgatgccaga gttggaggaa ctgacttttg accccagctc tgcgcacccg 900 agcctggtgg tgtccgcctc tggtcgccga gtggagtgct cggagcagaa ggcgccgcca 960 gcaggagaag acacgtgcca gttcgacaag acggtagcgg tagtggcgaa gcagctgctg 1020 tcacaggggg agcactactg ggaggtggag gtgggcgaca agccacgctg ggccctgggt 1080 gtgatggcgg ctgacgcttc ccgtcgtggc cgcctgcacg cggtgccctc acaggggctg 1140 tggttgctcg gcctgcgcga tggcaagatc ctggaggcac acgtggaggc caaggagcca 1200 cgggcactgc gcaccccaga gaggccacca gcgcgcattg gcctctacct aagctttgca 1260 gatggcgtcc tgactttcta tgatgcaagc aacaccgacg cgcttacacc gctcttttct 1320 tttcatgagc gtctgcctgg gccggtgtac cccatgtttg acgtgtgctg gcacgacaag 1380 ggcaagaatt ctcagccgct gttgctcgtg gggccagaca gtgagcaggc ctga 1434 <210> 16 <211> 1434 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encoding sequence of monkey MG53 S255A mutant <400> 16 atgtcggctg cgccgggcct cctgcaccag gagctgtcct gcccgctgtg cctgcagctg 60 ttcgacgcgc ccgtgacagc cgagtgcggc cacagtttct gtcgcgcctg cctgggccgc 120 gtggccgggg aaccggcggc ggatggcacc gttctctgcc cctgctgtca ggcccccacg 180 cggccgcagg cactcagcac caacctgcag ctggcgcgcc tggtggaggg gctggcccag 240 gtgccgcagg gccactgcga ggagcacctg gacccgctga gcatctactg tgagcaggac 300 cgcgcgctgg tgtgcggagt gtgcgcctca ctcggctcgc accgcggtca tcgcctgctg 360 cccgccgccg aggcccacgc acgcctcaag acgcagctgc cacagcagaa actgcagctg 420 caggaggcat gcatgcgcaa ggagaagagt gtagctgtgc tggagcatca gttggtggaa 480 gtggaggaga cagtgcgtca gttccggggg gccgtggggg agcagctggg caagatgcgg 540 gtgttcctgg ctgcactgga gggctccttg gaccgtgagg cagagcgtgt gcggggtgag 600 gcaggggtcg ccttgcgccg ggagctgggg agcctgaact cttacctgga gcagctgcgg 660 cagatggaga aggtgctgga ggaggtggcc gacaagccgc agactgagtt cctaatgaaa 720 tactgcctgg tgaccagcag gctgcagaag atcctggcag aggctccccc acccgcccgt 780 ctggacatcc agctgccaat catctcagat gacttcaaat tccaggtgtg gaggaagatg 840 ttccgggctc tgatgccagc gctggaggag ctgacctttg acccgagctc tgcgcacccc 900 agcctggtgg tgtcttcctc cggccgccgc gtggagtgct cggagcagaa ggcgccgccg 960 gcgggggagg acccgcgcca gttcgacaag gcggtagcgg tggtggcgca ccagcagctc 1020 tccgagggcg aacactactg ggaggtggag gtgggcgaca agccgcgctg ggcgctgggt 1080 gtgatcgcgg ccgaggggcc ccgtcgcggg cgcctgcacg cggtgccctc gcagggcctg 1140 tggctgctgg ggctgcgtga gggcaagatc ctggaggctc acgtggaggc caaggagccg 1200 cgcgctctgc gcagccccga gcggcggccc acgcgcatcg gcctctacct gagcttcggc 1260 gacggcgtcc tctccttcta cgatgccagc gacgccgacg cgctcgtgcc gctttttgcc 1320 ttccacgagc gcctgcctgg gcccgtgtac cccttcttcg acgtgtgctg gcacgacaag 1380 ggcaagaact cccagccgct gctgctcgtg gggtccgaag gcgccgaagc ctga 1434 <210> 17 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encoding sequence of swine MG53 S255A mutant <400> 17 atgtcagctg cgcccggcct cctgcaccag gagctgtcct gtccgctgtg cctgcagctg 60 ttcgatgcgc cggtgacggc tgagtgcggc cacagcttct gccgcgcctg cctgggccgc 120 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acccgcgcca gttcgacaag gcggtggcgg tggtgacgca ccagctgctg 1020 tcggaaggcg agcactactg ggaggtggag gtgggcgaca agccacgctg ggcgctgggc 1080 gtgatcgggg cccaggccgg tcgccgcggc cggctgcacg ccgtgccctc gcagggcctc 1140 tggctgctcg ggctgcgcga gggcaagatc ctggaggctc acgtcgaggc caaggagccg 1200 cgcgccctgc gcaccccgga gaggcggccg tcgcgcatcg ggatctacct gagcttcgcg 1260 gatggcgtcc tctcgttcta cgacgccagc gacgccgacg cgctggagct gctcttcgcc 1320 ttccacgaac gcctgccggg ccccgtgtac cccttcttcg acgtgtgctg gcacgacaag 1380 ggcaagaacg ctcagccgct cctgctggtg gggcccgaca gcggcgggga ggcctga 1437 <210> 18 <211> 1434 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encoding sequence of dog MG53 S255A mutant <400> 18 atgtcggccg cgccgggcct cctgcaccag gagctgtcct gcccgctctg cctgcagctg 60 tttgacgcgc cggtgaccgc cgagtgcggc cacagtttct gccgcgcctg cctgagccgc 120 gtggctgggg agccggcggc ggacggcacc gtgccctgcc cgtgctgcca ggcactcacg 180 cggccacagg cgctcagcac caaccagcag ctggcgcgcc tggtggaggg gctggcgcag 240 gtgccgcagg gccactgcga ggagcaccta gacccgctca 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gcagggcctc 1140 tggctgctcg ggctgcggga cggcaagatc ctggaggcgc acgtcgaagc caaggagccg 1200 cgcgcgctgc gcaccccgga gaggcggccc acgcgcatcg ggatctacct aagcttcggc 1260 gacggagtcc tctcctttta tgatgccagt gaccccgacg ccctcgagct gctctttgcc 1320 ttccacgagc gcctgcccgg gcccgtgtac cccttcttcg acgtatgctg gcacgacaag 1380 ggcaaaaatg ctcagccgct gctgctggtg gggcctgatg gcgaggaggc ctga 1434 <210> 19 <211> 1434 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 atgtcggctg cgcccggcct cctgcaccag gagctgtcct gcccgctgtg cctgcagctg 60 ttcgacgcgc ccgtgacagc cgagtgcggc cacagtttct gccgcgcctg cctaggccgc 120 gtggccgggg agccggcggc ggatggcacc gttctctgcc cctgctgcca ggcccccacg 180 cggccgcagg cactcagcac caacctgcag ctggcgcgcc tggtggaggg gctggcccag 240 gtgccgcagg gccactgcga ggagcacctg gacccgctga gcatctactg cgagcaggac 300 cgcgcgctgg tgtgcggagt gtgcgcctca ctcggctcgc accgcggtca tcgcctcctg 360 cctgccgccg aggcccacgc acgcctcaag acacagctgc cacagcagaa actgcagctg 420 caggaggcat gcatgcgcaa ggagaagagt gtggctgtgc tggagcatca gctggtggag 480 gtggaggaga cagtgcgtca gttccggggg gccgtggggg agcagctggg caagatgcgg 540 gtgttcctgg ctgcactgga gggctccttg gaccgcgagg cagagcgtgt acggggtgag 600 gcaggggtcg ccttgcgccg ggagctgggg agcctgaact cttacctgga gcagctgcgg 660 cagatggaga aggtcctgga ggaggtggcg gacaagccgc agactgagtt cctcatgaaa 720 tactgcctgg tgaccagcag gctgcagaag atcctggcag agtctccccc acccgcccgt 780 ctggacatcc agctgccaat tatctcagat gacttcaaat tccaggtgtg gaggaagatg 840 ttccgggctc tgatgccagc gctggaggag ctgacctttg acccgagctc tgcgcacccg 900 agcctggtgg tgtcttcctc tggccgccgc gtggagtgct cggagcagaa ggcgccgccg 960 gccggggagg acccgcgcca gttcgacaag gcggtggcgg tggtggcgca ccagcagctc 1020 tccgagggcg agcactactg ggaggtggat gttggcgaca agccgcgctg ggcgctgggc 1080 gtgatcgcgg ccgaggcccc ccgccgcggg cgcctgcacg cggtgccctc gcagggcctg 1140 tggctgctgg ggctgcgcga gggcaagatc ctggaggcac acgtggaggc caaggagccg 1200 cgcgctctgc gcagccccga gaggcggccc acgcgcattg gcctttacct gagcttcggc 1260 gacggcgtcc tctccttcta cgatgccagc gacgccgacg cgctcgtgcc gctttttgcc 1320 ttccacgagc gcctgcccag gcccgtgtac cccttcttcg acgtgtgctg gcacgacaag 1380 ggcaagaatg cccagccgct gctgctcgtg ggtcccgaag gcgccgaggc ctga 1434 <210> 20 <211> 1434 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 20 atgtcggctg cacccggcct tctgcgtcag gaactgtcct gcccactgtg cttgcagctg 60 ttcgatgcgc cagtgacggc tgagtgtggc cacagtttct gccgtgcctg cctgatccgg 120 gtggcagggg agcctgctgc ggacggcaca gttgcctgtc cctgttgtca ggcacctaca 180 cggccgcagg ctctaagcac taacctccag ttgtcacgcc ttgtggaggg tttggcgcaa 240 gtgccccaag gccactgcga ggaacacctg gatccactga gcatctactg cgagcaggac 300 cgcacacttg tgtgtggtgt gtgtgcctcg ctcggttctc accgtggtca tcgtctcctg 360 cctgccgctg aagcccaagc acgcctcaag acacagcttc cacagcagaa gatgcagctg 420 caggaggcat gcatgcgcaa ggagaagact gtagcggtgc tggagcatca gctggtggag 480 gtggaggaga cagtgcgcca gttccgggga gctgtcgggg agcagctggg gaagatgcgg 540 atgttcctgg ctgccctaga aagttctctg gaccgtgaag cagaaagggt tcggggtgat 600 gctggggttg ccttgcgtcg ggagctgtca agcctgaact cttacctaga gcaactgagg 660 cagatggaga aggtgctgga ggaggtggct gacaagccac agacagaatt cctcatgaaa 720 ttctgcctgg taaccagcag gctgcagaag atcctgtcag agtcaccacc accggcaagg 780 ctagatatcc agctgcctgt catctcagat gacttcaaat tccaggtgtg gaagaagatg 840 ttccgggctc tgatgccagc gctggaggaa ctgacttttg accccagctc tgcgcacccg 900 agcctggtgg tgtcctcctc tggtcgccga gtggagtgct cagaccagaa ggcgccgcca 960 gcgggagaag acacgcgtca gttcgacaag gcagtagcgg tggtggcgca gcagctgctg 1020 tcacagggcg agcactattg ggaggtggag gtgggcgaca aaccacgctg ggccctggga 1080 gtgatggcgg ctgacgcttc ccgccgtggc cggctgcacg cggtgccctc acaggggctg 1140 tggctgctgg gtctgcgcga tggcaagatc ctggaggcgc acgtggaggc caaggagccg 1200 cgggcactgc gcaccccaga gaggcctccg gcgcgcattg gcctctacct aagcttcgca 1260 gatggcgtcc tggctttcta tgatgcgagc aaccccgacg tacttacgcc aatcttttct 1320 ttccacgagc gtctgcccgg gccggtgtac cccatctttg acgtgtgctg gcacgacaag 1380 ggcaagaatg cccagcccct gctgcttgtg gggccggagc aggaacaggc ctga 1434 <210> 21 <211> 1434 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 21 atgtcgactg caccaggcct tttgcgccag gaactgtctt gcccgctgtg cttgcagctg 60 ttcgatgcac cagtgaccgc tgagtgtggc cacagtttct gccgtgcctg cctgatccgt 120 gtggcagggg agcctgccga cgatggcacg gttgcctgtc cctgttgtca ggcatctact 180 cggccacagg cgctaagcac taacctccag ttggcacgcc ttgtggaggg tttggcacaa 240 gtgccccaag gccactgcga ggaacacctg gatccactga gcatctactg cgagcaggac 300 cgcacacttg tgtgtggtgt gtgtgcctct ctcggttcac accgtggtca ccgtcttctg 360 cctgccgcag aagcccatgc acgtctcaag acacagcttc cacaacagaa ggcccagctg 420 caggaggcat gcatgcgcaa ggagaagagt gtagcagtcc tggagcatca gctggtggag 480 gtggaggaga ccgtgcgtca gttccgggga gctgttgggg agcagctggg gaagatgcgg 540 atgttcctgg ctgccctaga aagttctttg gaccgtgaag cagaaagggt tcgaggtgag 600 gcaggggttg ccttgcggcg ggagctgtca agcctgaact cttacctgga gcaactgagg 660 cagatggaga aggtgctgga ggaggtggct gacaagccac agacagaatt cctcatgaaa 720 ttctgcctgg tgaccagcag gctgcagaag attctgtcag agtcaccacc cccagcaagg 780 ctagatatcc agctgcctgt catctcagat gacttcaaat tccaggtgtg gaagaagatg 840 ttccgggctc tgatgccaga gttggaggaa ctgacttttg accccagctc tgcgcacccg 900 agcctggtgg tgtccgcctc 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gcagggcctg 1140 tggctgctgg ggctgcgtga gggcaagatc ctggaggctc acgtggaggc caaggagccg 1200 cgcgctctgc gcagccccga gcggcggccc acgcgcatcg gcctctacct gagcttcggc 1260 gacggcgtcc tctccttcta cgatgccagc gacgccgacg cgctcgtgcc gctttttgcc 1320 ttccacgagc gcctgcctgg gcccgtgtac cccttcttcg acgtgtgctg gcacgacaag 1380 ggcaagaact cccagccgct gctgctcgtg gggtccgaag gcgccgaagc ctga 1434 <210> 23 <211> 1437 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 23 atgtcagctg cgcccggcct cctgcaccag gagctgtcct gtccgctgtg cctgcagctg 60 ttcgatgcgc cggtgacggc tgagtgcggc cacagcttct gccgcgcctg cctgggccgc 120 gtggcagggg agccagccgc ggatggcacg gtgctctgcc ccagctgcca ggcacccacg 180 cggccgcagg cgctcagcac caaccagcag ctggcgcgcc tggtggaggg gctggcgcag 240 gtgccgcagg gccactgcga ggagcaccta gacccgctca gcatctactg cgagcaggac 300 cgcgtgctcg tgtgcggcgt ctgcgcctcg ctgggttcgc accgcggcca ccgcctgctg 360 cccgccgccg aagcccatgc gcgccttaag acgcagctcc cgcagcagaa gctgcagctg 420 caggaggcgt gtatgcggaa ggagaagagc gtgggtgtgc tggagcaaca actggtggaa 480 gtggaggaga 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ccccgtgtac cccttcttcg acgtgtgctg gcacgacaag 1380 ggcaagaacg ctcagccgct cctgctggtg gggcccgaca gcggcgggga ggcctga 1437 <210> 24 <211> 1434 <212> DNA <213> Canis lupus familiaris <400> 24 atgtcggccg cgccgggcct cctgcaccag gagctgtcct gcccgctctg cctgcagctg 60 tttgacgcgc cggtgaccgc cgagtgcggc cacagtttct gccgcgcctg cctgagccgc 120 gtggctgggg agccggcggc ggacggcacc gtgccctgcc cgtgctgcca ggcactcacg 180 cggccacagg cgctcagcac caaccagcag ctggcgcgcc tggtggaggg gctggcgcag 240 gtgccgcagg gccactgcga ggagcaccta gacccgctca gcatctactg cgagcaggat 300 cgagcgctcg tgtgcggcgt gtgcgcctcg ctcggctcgc accgcggcca ccgcctgctg 360 cccgccgccg aagcccacgc gcgcctcaag acacagctgc cacagcagaa actgcagctg 420 caggaggcat gtatgcgcaa ggagaagagt gtggctctgc tggagcatca gctcatggaa 480 gtggaggaga tggtgcgtca gttccggggg gctgtagggg agcagctggg caagatgcgg 540 gtgttcctgg ctgcactgga gggctccttg gaccgtgagg cagagcgcgt gcggggagag 600 gcaggggttg ccctgcggcg ggagctgggg agcctgaact cttacctgga gcagttgcgt 660 cagatggaga aggtgctgga ggaggtggcc gacaagccac 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cctggcagag gctcccccac ccg 33 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human MG53 S255A mutant <400> 26 tccagacggg cgggtggggg agcctctgcc agg 33 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human MG53 S255G mutant <400> 27 tgcagaagat cctggcagag ggtcccccac ccg 33 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human MG53 S255G mutant <400> 28 tccagacggg cgggtggggg accctctgcc agg 33 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human MG53 S255L mutant <400> 29 tgcagaagat cctggcagag cttcccccac ccg 33 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human MG53 S255L mutant <400> 30 tccagacggg cgggtggggg aagctctgcc agg 33 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human MG53 S255V mutant <400> 31 tgcagaagat cctggcagag gttcccccac ccg 33 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human MG53 S255V mutant <400> 32 tccagacggg cgggtggggg aacctctgcc agg 33 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human MG53 S255P mutant <400> 33 tgcagaagat cctggcagag cctcccccac ccg 33 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human MG53 S255P mutant <400> 34 tccagacggg cgggtggggg aggctctgcc agg 33 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human MG53 S255F mutant <400> 35 tgcagaagat cctggcagag tttcccccac ccg 33 <210> 36 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human MG53 S255F mutant <400> 36 tccagacggg cgggtggggg aaactctgcc agg 33 <210> 37 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human MG53 S255W mutant <400> 37 tgcagaagat cctggcagag tggcccccac ccg 33 <210> 38 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human MG53 S255W mutant <400> 38 tccagacggg cgggtggggg ccactctgcc agg 33 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human MG53 S255Q mutant <400> 39 tgcagaagat cctggcagag caacccccac ccg 33 <210> 40 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human MG53 S255Q mutant <400> 40 tccagacggg cgggtggggg ttgctctgcc agg 33 <210> 41 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human MG53 S255C mutant <400> 41 tgcagaagat cctggcagag tgtcccccac ccg 33 <210> 42 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human MG53 S255C mutant <400> 42 tccagacggg cgggtggggg acactctgcc agg 33 <210> 43 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human MG53 S255Y mutant <400> 43 tgcagaagat cctggcagag tatcccccac ccg 33 <210> 44 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human MG53 S255Y mutant <400> 44 tccagacggg cgggtggggg 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MG53 S297A mutant <400> 57 agctgacctt tgacccgagc gctgcgcacc cga 33 <210> 58 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human MG53 S297A mutant <400> 58 accaccaggc tcgggtgcgc agcgctcggg tca 33 <210> 59 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse MG53 S255A mutant <400> 59 tgcagaagat cctgtcagag gcaccaccac cgg 33 <210> 60 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse MG53 S255A mutant <400> 60 tctagccttg ccggtggtgg tgcctctgac agg 33 <210> 61 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse MG53 S255G mutant <400> 61 tgcagaagat cctgtcagag ggaccaccac cgg 33 <210> 62 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse MG53 S255G mutant <400> 62 tctagccttg ccggtggtgg tccctctgac agg 33 <210> 63 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse MG53 S255L mutant <400> 63 tgcagaagat cctgtcagag 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Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse MG53 S255Y mutant <400> 70 tctagccttg ccggtggtgg atactctgac agg 33 <210> 71 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse MG53 S255D mutant <400> 71 tgcagaagat cctgtcagag gatccaccac cgg 33 <210> 72 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse MG53 S255D mutant <400> 72 tctagccttg ccggtggtgg atcctctgac agg 33 <210> 73 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse MG53 S255R mutant <400> 73 tgcagaagat cctgtcagag cgaccaccac cgg 33 <210> 74 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse MG53 S255R mutant <400> 74 tctagccttg ccggtggtgg tcgctctgac agg 33 <210> 75 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of rat MG53 S255A mutant <400> 75 tgcagaagat tctgtcagag gcaccacccc cag 33 <210> 76 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of rat MG53 S255A mutant <400> 76 tctagccttg ctgggggtgg tgcctctgac aga 33 <210> 77 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of rat MG53 S255G mutant <400> 77 tgcagaagat tctgtcagag ggaccacccc cag 33 <210> 78 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of rat MG53 S255G mutant <400> 78 tctagccttg ctgggggtgg tccctctgac aga 33 <210> 79 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of rat MG53 S255L mutant <400> 79 tgcagaagat tctgtcagag ttaccacccc cag 33 <210> 80 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of rat MG53 S255L mutant <400> 80 tctagccttg ctgggggtgg taactctgac aga 33 <210> 81 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of rat MG53 S255W mutant <400> 81 tgcagaagat tctgtcagag tggccacccc cag 33 <210> 82 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of rat MG53 S255W mutant <400> 82 tctagccttg ctgggggtgg ccactctgac aga 33 <210> 83 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primer of rat MG53 S255R mutant <400> 89 tgcagaagat tctgtcagag cgaccacccc cag 33 <210> 90 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of rat MG53 S255R mutant <400> 90 tctagccttg ctgggggtgg tcgctctgac aga 33 <210> 91 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of monkey MG53 S255A mutant <400> 91 aagatcctgg cagaggctcc cccacccgcc cgtctg 36 <210> 92 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of monkey MG53 S255A mutant <400> 92 cagacgggcg ggtgggggag cctctgccag gatctt 36 <210> 93 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of monkey MG53 S255G mutant <400> 93 aagatcctgg cagagggtcc cccacccgcc cgtctgg 37 <210> 94 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of monkey MG53 S255G mutant <400> 94 ccagacgggc gggtggggga ccctctgcca ggatctt 37 <210> 95 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of monkey MG53 S255L mutant <400> 95 agatcctggc agagttaccc ccacccgccc gtctgga 37 <210> 96 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of monkey MG53 S255L mutant <400> 96 tccagacggg cgggtggggg taactctgcc aggatct 37 <210> 97 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of monkey MG53 S255W mutant <400> 97 agatcctggc agagtggccc ccacccgccc gtctgga 37 <210> 98 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of monkey MG53 S255W mutant <400> 98 tccagacggg cgggtggggg ccactctgcc aggatct 37 <210> 99 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of monkey MG53 S255Q mutant <400> 99 aagatcctgg cagagcaacc cccacccgcc cgtctgga 38 <210> 100 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of monkey MG53 S255Q mutant <400> 100 tccagacggg cgggtggggg ttgctctgcc aggatctt 38 <210> 101 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of monkey MG53 S255Y mutant <400> 101 agatcctggc agagtatccc ccacccgccc gtctgg 36 <210> 102 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of monkey MG53 S255Y mutant <400> 102 ccagacgggc gggtggggga tactctgcca ggatct 36 <210> 103 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of monkey MG53 S255D mutant <400> 103 aagatcctgg cagaggatcc cccacccgcc cgtctgg 37 <210> 104 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of monkey MG53 S255D mutant <400> 104 ccagacgggc gggtggggga tcctctgcca ggatctt 37 <210> 105 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of monkey MG53 S255R mutant <400> 105 aagatcctgg cagagcgtcc cccacccgcc cgtctgg 37 <210> 106 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of monkey MG53 S255R mutant <400> 106 ccagacgggc gggtggggga cgctctgcca ggatctt 37 <210> 107 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of swine MG53 S255A mutant <400> 107 aagatcctgg cagaggcgcc cccacctgcc cgcctg 36 <210> 108 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of swine MG53 S255A mutant <400> 108 caggcgggca ggtgggggcg cctctgccag gatctt 36 <210> 109 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of swine MG53 S255G mutant <400> 109 aagatcctgg cagaggggcc cccacctgcc cgcctgg 37 <210> 110 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of swine MG53 S255G mutant <400> 110 ccaggcgggc aggtgggggc ccctctgcca ggatctt 37 <210> 111 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of swine MG53 S255L mutant <400> 111 agatcctggc agagttgccc ccacctgccc gcctgg 36 <210> 112 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of swine MG53 S255L mutant <400> 112 ccaggcgggc aggtgggggc aactctgcca ggatct 36 <210> 113 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of swine MG53 S255W mutant <400> 113 agatcctggc agagtggccc ccacctgccc gcctgg 36 <210> 114 <211> 36 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Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of swine MG53 S255D mutant <400> 120 tccaggcggg caggtggggg atcctctgcc aggatctt 38 <210> 121 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of swine MG53 S255R mutant <400> 121 aagatcctgg cagagcggcc cccacctgcc cgcctgg 37 <210> 122 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of swine MG53 S255R mutant <400> 122 ccaggcgggc aggtgggggc cgctctgcca ggatctt 37 <210> 123 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of dog MG53 S255A mutant <400> 123 aagatcctgg cagaagcacc accgcctgcc cgtttg 36 <210> 124 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of dog MG53 S255A mutant <400> 124 caaacgggca ggcggtggtg cttctgccag gatctt 36 <210> 125 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of dog MG53 S255G mutant <400> 125 aagatcctgg cagaaggacc accgcctgcc cgtttgg 37 <210> 126 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg 180 185 190 Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu 195 200 205 Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys 210 215 220 Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys 225 230 235 240 Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu Ala Pro 245 250 255 Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile Ser 260 265 <210> 151 <211> 1434 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encoding nucleic acid sequence of a human MG53 subtype S255A mutant <400> 151 atgtcggctg cgcccggcct cctgcaccag gagctgtcct gcccgctgtg cctgcagctg 60 ttcgacgcgc ccgtgacagc cgagtgcggc cacagtttct gccgcgcctg cctaggccgc 120 gtggccgggg agccggcggc ggatggcacc gttctctgcc cctgctgcca ggcccccacg 180 cggccgcagg cactcagcac caacctgcag ctggcgcgcc tggtggaggg gctggcccag 240 gtgccgcagg gccactgcga ggagcacctg gacccgctga gcatctactg cgagcaggac 300 cgcgcgctgg tgtgcggagt gtgcgcctca ctcggctcgc accgcggtca tcgcctcctg 360 cctgccgccg aggcccacgc acgcctcaag acacagctgc cacagcagaa actgcagctg 420 caggaggcat gcatgcgtaa ggagaagagt gtggctgtgc tggagcatca gctggtggag 480 gtggaggaga cagtgcgtca gttccggggg gccgtggggg agcagctggg caagatgcgg 540 gtgttcctgg ctgcactgga gggctccttg gactgcgagg cagagcgtgt acggggtgag 600 gcaggggtcg ccttgcgccg ggagctgggg agcctgaact cttacctgga gcagctgcgg 660 cagatggaga aggtcctgga ggaggtggcg gacaagccgc agactgagtt cctcatgaaa 720 tactgcctgg tgaccagcag gctgcagaag atcctggcag aggctccccc acccgcccgt 780 ctggacatcc agctgccaat tatctcagat gacttcaaat tccaggtgtg gaggaagatg 840 ttccgggctc tgatgccagc gctggaggag ctgacctttg acccgagctc tgcgcacccg 900 agcctggtgg tgtcttcctc tggccgccgc gtggagtgct cggagcagaa ggcgccgccg 960 gccggggagg acccgcgcca gttcgacaag gcggtggcgg tggtggcgca ccagcagctc 1020 tccgagggcg agcactactg ggaggtggat gttggcgaca agccgcgctg ggcgctgggc 1080 gtgatcgcgg ccgaggcccc ccgccgcggg cgcctgcacg cggtgccctc gcagggcctg 1140 tggctgctgg ggctgcgcga gggcaagatc ctggaggcac acgtggaggc caaggagccg 1200 cgcgctctgc gcagccccga gaggcggccc acgcgcattg gcctttacct gagcttcggc 1260 gacggcgtcc tctccttcta cgatgccagc gacgccgacg cgctcgtgcc gctttttgcc 1320 ttccacgagc gcctgcccag gcccgtgtac cccttcttcg acgtgtgctg gcacgacaag 1380 ggcaagaatg cccagccgct gctgctcgtg ggtcccgaag gcgccgaggc ctga 1434 <210> 152 <211> 1002 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encoding nucleic acid sequence of a human MG53 subtype S255A mutant <400> 152 atgcgcaagg agaagagtgt ggctgtgctg gagcatcagc tggtggaggt ggaggagaca 60 gtgcgtcagt tccggggggc cgtgggggag cagctgggca agatgcgggt gttcctggct 120 gcactggagg gctccttgga ccgcgaggca gagcgtgtac ggggtgaggc aggggtcgcc 180 ttgcgccggg agctggggag cctgaactct tacctggagc agctgcggca gatggagaag 240 gtcctggagg aggtggcgga caagccgcag actgagttcc tcatgaaata ctgcctggtg 300 accagcaggc tgcagaagat cctggcagag gctcccccac ccgcccgtct ggacatccag 360 ctgccaatta tctcagatga cttcaaattc caggtgtgga ggaagatgtt ccgggctctg 420 atgccagcgc tggaggagct gacctttgac ccgagctctg cgcacccgag cctggtggtg 480 tcttcctctg gccgccgcgt ggagtgctcg gagcagaagg cgccgccggc cggggaggac 540 ccgcgccagt tcgacaaggc ggtggcggtg gtggcgcacc agcagctctc cgagggcgag 600 cactactggg aggtggatgt tggcgacaag ccgcgctggg cgctgggcgt gatcgcggcc 660 gaggcccccc gccgcgggcg cctgcacgcg gtgccctcgc agggcctgtg gctgctgggg 720 ctgcgcgagg gcaagatcct ggaggcacac gtggaggcca aggagccgcg cgctctgcgc 780 agccccgaga ggcggcccac gcgcattggc ctttacctga gcttcggcga cggcgtcctc 840 tccttctacg atgccagcga cgccgacgcg ctcgtgccgc tttttgcctt ccacgagcgc 900 ctgcccaggc ccgtgtaccc cttcttcgac gtgtgctggc acgacaaggg caagaatgcc 960 cagccgctgc tgctcgtggg tcccgaaggc gccgaggcct ga 1002 <210> 153 <211> 1002 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encoding nucleic acid sequence of a human MG53 subtype S255A mutant <400> 153 atgcgtaagg agaagagtgt ggctgtgctg gagcatcagc tggtggaggt ggaggagaca 60 gtgcgtcagt tccggggggc cgtgggggag cagctgggca agatgcgggt gttcctggct 120 gcactggagg gctccttgga ccgcgaggca gagcgtgtac ggggtgaggc aggggtcgcc 180 ttgcgccggg agctggggag cctgaactct tacctggagc agctgcggca gatggagaag 240 gtcctggagg aggtggcgga caagccgcag actgagttcc tcatgaaata ctgcctggtg 300 accagcaggc tgcagaagat cctggcagag gctcccccac ccgcccgtct ggacatccag 360 ctgccaatta tctcagatga cttcaaattc caggtgtgga ggaagatgtt ccgggctctg 420 atgccagcgc tggaggagct gacctttgac ccgagctctg cgcacccgag cctggtggtg 480 tcttcctctg gccgccgcgt ggagtgctcg gggcagaagg cgccgccggc cggggaggac 540 ccgcgccagt tcgacaaggc ggtggcggtg gtggcgcacc agcagctctc cgagggcgag 600 cactactggg aggtggatgt tggcgacaag ccgcgctggg cgctgggcgt gatcgcggcc 660 gaggcccccc gccgcgggcg cctgcacgcg gtgccctcgc agggcctgtg gctgctgggg 720 ctgcgcgagg gcaagatcct ggaggcacac gtggaggcca aggagccgcg cgctctgcgc 780 agccccgaga ggcggcccac gcgcattggc ctttacctga gcttcggcga cggcgtcctc 840 tccttctacg atgccagcga cgccgacgcg ctcgtgccgc tttttgcctt ccacgagcgc 900 ctgcccaggc ccgtgtaccc cttcttcgac gtgtgctggc acgacaaggg caagaatgcc 960 cagccgctgc tgctcgtggg tcccgaaggc gccgaggcct ga 1002 <210> 154 <211> 810 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encoding nucleic acid sequence of a human MG53 subtype S255A mutant <400> 154 atgtcggctg cgcccggcct cctgcaccag gagctgtcct gcccgctgtg cctgcagctg 60 ttcgacgcgc ccgtgacagc cgagtgcggc cacagtttct gccgcgcctg cctaggccgc 120 gtggccgggg agccggcggc ggatggcacc gttctctgcc cctgctgcca ggcccccacg 180 cggccgcagg cactcagcac caacctgcag ctggcgcgcc tggtggaggg gctggcccag 240 gtgccgcagg gccactgcga ggagcacctg gacccgctga gcatctactg cgagcaggac 300 cgcgcgctgg tgtgcggagt gtgcgcctca ctcggctcgc accgcggtca tcgcctcctg 360 cctgccgccg aggcccacgc acgcctcaag acacagctgc cacagcagaa actgcagctg 420 caggaggcat gcatgcgtaa ggagaagagt gtggctgtgc tggagcatca gctggtggag 480 gtggaggaga cagtgcgtca gttccggggg gccgtggggg agcagctggg caagatgcgg 540 gtgttcctgg ctgcactgga gggctccttg gaccgcgagg cagagcgtgt acggggtgag 600 gcaggggtcg ccttgcgccg ggagctgggg agcctgaact cttacctgga gcagctgcgg 660 cagatggaga aggtcctgga ggaggtggcg gacaagccgc agactgagtt cctcatgaaa 720 tactgcctgg tgaccagcag gctgcagaag atcctggcag aggctccccc acccgcccgt 780 ctggacatcc agctgccaat tatctcctga 810

Claims (35)

1. MG53 돌연변이체로서, 야생형 MG53의 아미노산 서열에서의 적어도 1개의 세린이 알라닌으로 돌연변이된 MG53 돌연변이체이며,
   여기서 돌연변이된 세린이 야생형 MG53의 아미노산 서열의 하기 위치에 위치하고:
   (i) 위치 255, 또는
   (ii) 위치 305, 306, 및 307, 또는
   (iii) 위치 255, 305, 306, 및 307;
   야생형 MG53의 아미노산 서열이 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 6에 제시된 것인 MG53 돌연변이체.
2. 제1항에 있어서, 돌연변이된 세린이 야생형 MG53의 아미노산 서열의 위치 255에 위치하는 것인 MG53 돌연변이체.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 돌연변이된 세린이 야생형 MG53의 아미노산 서열의 위치 305, 306, 및 307에 위치하는 것인 MG53 돌연변이체.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 아미노산 서열이 서열식별번호: 7-12, 및 147-150에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나인 MG53 돌연변이체.
13. 아미노산 서열이 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열인 MG53 돌연변이체.
14. 삭제
15. 제1항, 제2항, 제6항, 제12항, 및 제13항 중 어느 한 항의 MG53 돌연변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
16. 제15항에 있어서, 서열식별번호: 13-18, 및 151-154에 제시된 핵산 서열 중 어느 하나를 포함하는 핵산.
17. 제15항에 따른 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
18. 제17항에 있어서, 서열식별번호: 13-18, 및 151-154에 제시된 핵산 서열 중 어느 하나를 포함하는 발현 벡터.
19. 제17항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
20. 돌연변이를 위한 1개 이상의 세린 위치를 결정하고, 야생형 MG53의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드의 전장 서열 상의 상기 위치에서 부위-지정 돌연변이유발을 수행하고, 부위-지정 돌연변이유발을 갖는 플라스미드를 숙주 세포 내로 형질감염시키고, 숙주 세포가 MG53 돌연변이체를 생산하도록 유도하는 것을 포함하는, 제1항, 제2항, 제6항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항에 따른 MG53 돌연변이체를 제조하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 부위-지정 돌연변이유발이 하기 단계를 포함하는 것인 방법:
    (1) cDNA 서열 내 부위-지정 돌연변이유발에 대해 표적화된 아미노산의 상응하는 뉴클레오티드 부위를 결정하고, 표적 아미노산에 따른 돌연변이 부위에서의 뉴클레오티드 서열을 변형시키고, 돌연변이 부위를 포함하는 20-40 bp 길이의 서열을 절취함으로써 프라이머를 디자인하는 단계;
    (2) 단계 (1)의 프라이머를 사용하고 야생형 MG53 플라스미드를 주형으로 하여 PCR 반응을 수행하고, PCR 산물에 대해 아가로스 겔 전기영동을 수행하고, PCR 산물을 정제하는 단계;
    (3) 제한 엔도뉴클레아제를 사용함으로써 단계 (2)의 정제된 PCR 산물에 대해 효소적 반응을 수행하고, 효소-소화된 산물을 적합한 플라스미드 발현 벡터와 라이게이션하고, 라이게이션 산물을 박테리아 적격 세포에서 형질전환 및 배양하는 단계;
    (4) 단계 (1)의 프라이머를 사용함으로써 콜로니 PCR 식별을 수행하기 위한 단계 (3)의 클론을 선택하고, PCR 산물에 대해 아가로스 겔 전기영동을 수행하고, 이어서 DNA 서열분석 식별을 수행하여 부위-지정 돌연변이유발을 갖는 양성 클론을 식별하는 단계.
22. 삭제
23. 삭제
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25. 삭제
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