TW201805299A - Ｍｇ５３突變體及其製備方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本申請案關於一種MG53突變體，其中該MG53突變體在野生型MG53的胺基酸序列的基礎上，在所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY區域內具有至少一個絲胺酸缺失和/或突變為任何其他非絲胺酸或蘇胺酸的胺基酸。本申請案還關於包括所述MG53突變體的藥物組合物、編碼所述MG53突變體的核酸、所述MG53突變體的製備方法、MG53突變體在製備用於治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的藥物中的用途，特別地，所述MG53突變體在治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的同時，能夠避免或減少野生型MG53所帶來的代謝類副作用，例如，胰島素抗性、肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常等。

Description

MG53突變體及其製備方法和用途
本申請案係關於生物醫藥領域，具體地，本申請案係關於一種MG53突變體、包含所述MG53突變體的藥物組合物、編碼所述MG53突變體的核酸、所述MG53突變體的製備方法、以及MG53突變體在製備用於治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的藥物中的用途。
Mitsugumin 53(MG53)又稱為TRIM72，是三結構域蛋白(Tripartite motif-containing Proteins,TRIM)家族中的一員。MG53由N端的TRIM結構域和C端的SPRY結構域組成，TRIM結構域由依次相連的Ring、B-box、coiled-coil結構域組成(參見ChuanxiCai et al.,the Journal of Biological Chemistry,Vol.284(5),3314-3322(2009))。MG53主要表達在橫紋肌中，對於骨骼肌和心臟甚至整個機體的穩態維持發揮著重要作用。之前發現，MG53具有細胞修復功能和心臟保護功能(參見，例如，Chuanxi Cai et al.,Nature Cell Biology,Vol.11,56-64(2009)；CN101797375B)。另外，進一步的研究發現，在缺血預適應(ischemic preconditioning,IPC)和缺血後適應(ischemic postconditioning,PostC)中，MG53也是起保護作用的重要分子之一，MG53分子的兩端可以分別與Caveolin-3以及p85-PI3K激酶相互結合形成複合物，並啟動下游的再灌損傷保護激酶(reperfusion injury salvage kinase,RISK)途徑，從而實現心肌的保護作用(參見，Chun-Mei Cao et al.,Circulation 121,2565-2574,(2010))。
雖然MG53具有細胞修復功能和心臟保護功能，但是之前的研究還發現，MG53具有E3泛素連接酶活性，參與調控胰島素抗性和代謝症候群的發生發展。MG53 N端的TRIM結構域中的Ring結構域具有E3泛素連接酶活性，可以與胰島素受體(insulin receptor，IR)及胰島素受體基質1(insulin receptor substrate-1，IRS1)結合，並介導它們的泛素化修飾和蛋白酶體途徑的降解，進而阻遏胰島素訊息傳遞路徑，導致以胰島素抗性為發病核心環節的肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常等代謝類疾病(參見，例如，R.Song et al.,Nature 494,375-379,(2013)；J.S.Yi et al.,Nature communications 4,2354(2013))。由此可見，野生型MG53在修復細胞、保護心臟的同時，會引起胰島素抗性、肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常等代謝類疾病的副作用，這些副作用是人們所不希望的。
本申請案係關於一種MG53突變體、包含所述MG53突變體的藥物組合物、編碼所述MG53突變體的核酸、所述MG53突變體的製備方法以及MG53突變體在製備用於治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的藥物中的用途，特別地，所述MG53突變體在具有細胞修復功能和/或心臟保護功能的同時，能夠避免或減少野生型MG53所帶來的胰島素抗性、肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常等代謝類副作用。
在一態樣中，本申請案係關於一種MG53突變體，其中所述MG53 突變體在野生型MG53的胺基酸序列的基礎上，在所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY區域內具有至少一個絲胺酸缺失和/或突變為任何其他非絲胺酸或蘇胺酸的胺基酸。在某些實施例中，所述coiled-coil-SPRY區域位於野生型MG53的胺基酸序列的第122-477位胺基酸區域。在某些實施例中，所述野生型MG53來源於動物，較佳的，來源於哺乳動物，例如，人、小鼠、大鼠、猴子、豬、狗等。在某些實施例中，所述野生型MG53的胺基酸序列為SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142所示的胺基酸序列。
在某些實施例中，所述MG53突變體在野生型MG53的胺基酸序列的基礎上，在所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY區域內有至少一個絲胺酸突變為非極性胺基酸。在某些實施例中，所述非極性胺基酸選自下組：甘胺酸、丙胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸和色胺酸。較佳的，在某些實施例中，所述非極性胺基酸為丙胺酸。在某些實施例中，所述MG53突變體在野生型MG53的胺基酸序列的基礎上，在所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY區域內有至少一個絲胺酸突變為除絲胺酸和蘇胺酸之外的極性胺基酸。在某些實施例中，所述極性胺基酸選自下組：穀氨醯胺、半胱胺酸、天冬醯胺、酪胺酸、天冬胺酸、穀胺酸、賴胺酸、精胺酸和組胺酸。較佳的，在某些實施例中，所述極性胺基酸為半胱胺酸。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：1的第150位、第189位、第211位、第214位、第246 位、第255位、第269位、第296位、第297位、第301位、第305位、第306位、第307位、第314位、第341位、第377位、第405位、第418位、第425位或者第430位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：139的第150位、第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位、第297位、第301位、第305位、第306位、第307位、第314位、第341位、第377位、第405位、第418位、第425位或者第430位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：140的第150位、第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位、第297位、第301位、第305位、第306位、第307位、第314位、第341位、第377位、第405位、第418位、第425位或者第430位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：141的第150位、第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位、第297位、第301位、第305位、第306位、第307位、第314位、第341位、第377位、第405位、第418位、第425位或者第430位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：142的第150位、第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的 胺基酸序列SEQ ID NO：2的第188位、第189位、第210位、第211位、第214位、第246位、第253位、第255位、第269位、第296位、第297位、第301位、第305位、第306位、第307位、第314位、第341位、第367位、第377位、第418位、第430位或者第440位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：3的第150位、第188位、第189位、第210位、第211位、第214位、第246位、第253位、第255位、第269位、第296位、第297位、第301位、第305位、第307位、第314位、第341位、第367位、第377位、第418位、第430位、第440位、第464位或者第474位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：4的第150位、第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位、第297位、第301位、第305位、第306位、第307位、第341位、第377位、第405位、第418位、第425位、第430位或者第464位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：5的第150位、第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位、第301位、第305位、第307位、第314位、第341位、第377位、第411位、第418位、第425位、第430位或者第474位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：6的第150位、第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位、第297位、第301位、第305位、第307位、 第314位、第341位、第367位、第377位、第418位、第425位或者第430位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、或者SEQ ID NO：142)的第150位、第188-189位、第210-211位、第214位、第246位、第253-255位、第269位、第296-297位、第301位、第305-307位、第314位、第341位、第367位、第377位、第405位、第411位、第418位、第425位、第430位、第440位、第464位或者第474位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、或者SEQ ID NO：142)的第189位、第211位、第214位、第246位、第253-255位、第269位、第296位、第301位、第305位、第307位、第341位、第377位、第418位或者第430位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、或者SEQ ID NO：142)的第211位、第214位、第246位、第253-255位、第269位、第296位或者第297位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的 胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、或者SEQ ID NO：142)的第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位或者第297位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、或者SEQ ID NO：142)的第253-255位中的一個或多個位點。在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列的第253位。在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列的第255位。在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：1的第255位。在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141或SEQ ID NO：142的第255位。
在某些實施例中，所述MG53突變體具有兩個或兩個以上的絲胺酸突變。在某些實施例中，所述MG53突變體的兩個或兩個以上的絲胺酸突變包括在第253-255位中的一個或多個位點上的絲胺酸突變。在某些實施例中，所述MG53突變體的兩個或兩個以上的絲胺酸突變包括在第253位的絲胺酸突變。在某些實施例中，所述MG53突變體的兩個或兩個以上的絲胺酸突變包括在第255位的絲胺酸突變。在某些實施例中，所述MG53突變體的兩個或兩個以上的絲胺酸突變包括在第253位和第255位的絲胺酸突變。
本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以理解，不同物種的野 生型MG53蛋白中絲胺酸所處位點可能有所不同，因此發生缺失或突變的絲胺酸位點也可能有所不同。在某些實施方式中，發生缺失或突變的絲胺酸位於SEQ ID NO：1所示野生型MG53的胺基酸序列中相應絲胺酸位點的上游或下游的1至10個胺基酸之內、1至5個胺基酸之內、或1至3個胺基酸之內。
在某些實施例中，所述MG53突變體的胺基酸序列為SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149或者SEQ ID NO：150所示的胺基酸序列。較佳的，在某些實施例中，所述MG53突變體的胺基酸序列為SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。在某些實施例中，所述MG53突變體的胺基酸序列與SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150所示的胺基酸序列之一具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或者至少99%的胺基酸序列同源性，並且所述MG53突變體在具有細胞修復功能和/或心臟保護功能的同時，避免了野生型MG53所帶來的代謝類副作用。
在另一態樣中，本申請案係關於一種藥物組合物，其包括所述MG53突變體和藥學上可接受的載體。
在另一態樣中，本申請案係關於一種分離的核酸，其包含編碼所述MG53突變體的胺基酸序列的核酸序列。在某些實施例中，所述核酸包含SEQ ID NO：13~18所示的任一核酸序列。在某些實施例中，所述核酸包含SEQ ID NO：151~154所示的任一核酸序列。
在另一態樣中，本申請案係關於一種重組載體，其包含編碼所述 MG53突變體的胺基酸序列的核酸序列。在某些實施例中，所述核酸包含SEQ ID NO：13~18所示的任一核酸序列。在某些實施例中，所述核酸包含SEQ ID NO：151~154所示的任一核酸序列。
在另一態樣中，本申請案係關於一種宿主細胞，其包含本申請案所述的重組載體。
在另一態樣中，本申請案係關於一種所述MG53突變體的製備方法，其包括：確定需要進行突變的絲胺酸的一個或多個位置，對包含編碼野生型MG53胺基酸序列的核酸序列的質體的全長序列進行在所述位置的定點突變，將所述定點突變的質體轉染到宿主細胞，表達所述宿主細胞以產生所述MG53突變體。在某些實施例中，所述定點突變包括如下步驟：(1)確定需要定點突變的胺基酸在cDNA序列中相應的核苷酸位置，根據突變後的胺基酸修改突變位置的核苷酸序列，並截取包含突變位置的長度為20~40bp的序列設計引子；(2)以野生型MG53質體為範本，使用步驟(1)中設計的引子進行PCR反應，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，並對PCR產物進行純化；(3)步驟(2)中純化後的PCR產物使用核酸限制性內切酶進行酶切反應，並將酶切產物與合適的質體表達載體進行連接，將連接產物進行細菌勝任細胞的轉化，培養。在某些實施例中，所述定點突變進一步包括如下步驟：(4)挑取步驟(3)所得殖株使用步驟(1)所設計的引子進行菌落PCR鑒定，對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，然後進行DNA測序鑒定，鑒定出帶有所述定點突變的陽性殖株。
在另一態樣中，本申請案係關於所述MG53突變體在製備用於治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、 糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的藥物中的用途。在某些實施例中，所述藥物在治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的同時，避免或減少了代謝類副作用，例如胰島素抗性、肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常等副作用。在某些實施例中，所述心臟疾病是與心肌損傷相關的疾病，包括但不限於，糖尿病性心臟病、心肌缺血、心臟缺血/再灌注損傷、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心臟破裂、心絞痛、心肌炎、冠心病、心包炎。在某些實施例中，所述糖尿病腦血管疾病包括但不限於，腦動脈硬化、缺血性腦血管病、腦出血、腦萎縮、腦梗塞。在某些實施例中，所述糖尿病眼部併發症包括但不限於，糖尿病性視網膜病變、糖尿病性白內障、與糖尿病相關的葡萄膜炎、失明。在某些實施例中，所述糖尿病神經病變包括但不限於，糖尿病周圍神經病變。在某些實施例中，所述腎臟疾病包括但不限於，急性腎小球腎炎、慢性腎小球腎炎、腎病症候群、急性腎損傷、糖尿病腎病等。在某些實施例中，所述與細胞和/或組織損傷相關疾病包括但不限於與腎臟、腦、肺部、肝臟、心臟、脾臟、消化道的細胞和/或組織損傷相關的疾病、皮膚損傷相關的疾病，例如，腦損傷、肺損傷、脾臟損傷、脾臟破裂、胃潰瘍、胃炎、胃穿孔、消化道黏膜損傷、外傷、燒傷、潰瘍、黏膜炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、中風、皮膚老化等。在某些實施例中，本申請案係關於SEQ ID NO：7所示的多肽在製備用於治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的藥物中的用途。在某些實施例中，本申請案係關於SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149或者SEQ ID NO：150所示的多肽在製備用於治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的藥物中的用途。
在另一態樣中，本申請案係關於一種治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的方法，包括給予需要的對象治療有效量的所述MG53突變體。在某些實施例中，所述MG53突變體在治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的同時，避免或減少了代謝類副作用，例如胰島素抗性、肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常等副作用。在某些實施例中，所述心臟疾病是與心肌損傷相關的疾病，包括但不限於，糖尿病性心臟病、心肌缺血、心臟缺血/再灌注損傷、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心臟破裂、心絞痛、心肌炎、冠心病、心包炎。在某些實施例中，所述糖尿病腦血管疾病包括但不限於，腦動脈硬化、缺血性腦血管病、腦出血、腦萎縮、腦梗塞。在某些實施例中，所述糖尿病眼部併發症包括但不限於，糖尿病性視網膜病變、糖尿病性白內障、與糖尿病相關的葡萄膜炎、失明。在某些實施例中，所述糖尿病神經病變包括但不限於，糖尿病周圍神經病變。在某些實施例中，所述腎臟疾病包括但不限於，急性腎小球腎炎、慢性腎小球腎炎、腎病症候群、急性腎損傷、糖尿病腎病等。在某些實施例中，所述與細胞和/或組織損傷相關疾病包括但不限於與腎臟、腦、肺部、肝臟、心臟、脾臟、消化道的細胞和/或組織損傷相關的疾病、皮膚損傷相關的疾病，例如，腦損傷、肺損傷、脾臟損傷、脾臟破裂、胃 潰瘍、胃炎、胃穿孔、消化道黏膜損傷、外傷、燒傷、潰瘍、黏膜炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、中風、皮膚老化等。在某些實施例中，本申請案係關於一種治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的方法，包括給予需要的對象治療有效量的SEQ ID NO：7所示的多肽。在某些實施例中，本申請案係關於一種治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的方法，包括給予需要的對象治療有效量的SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149或者SEQ ID NO：150所示的多肽。
在另一態樣中，本申請案係關於用於治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的MG53突變體。在某些實施例中，所述MG53突變體在治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的同時，避免了代謝類副作用，例如胰島素抗性、肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常等副作用。在某些實施例中，所述心臟疾病是與心肌損傷相關的疾病，包括但不限於，糖尿病性心臟病、心肌缺血、心臟缺血/再灌注損傷、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心臟破裂、心絞痛、心肌炎、冠心病、心包炎。在某些實施例中，所述糖尿病腦血管疾病包括但不限於，腦動脈硬化、缺血性腦血管病、腦出血、腦萎縮、腦梗塞。在某些實施例中，所述糖尿病眼部併發症包括但不限於，糖尿病性視網膜病變、糖尿病性白內障、與糖尿病相關的葡萄膜炎、失明。在某些實施例中，所述糖尿病神經病變包 括但不限於，糖尿病周圍神經病變。在某些實施例中，所述腎臟疾病包括但不限於，急性腎小球腎炎、慢性腎小球腎炎、腎病症候群、急性腎損傷、糖尿病腎病等。在某些實施例中，所述與細胞和/或組織損傷相關疾病包括但不限於與腎臟、腦、肺部、肝臟、心臟、脾臟、消化道的細胞和/或組織損傷相關的疾病、皮膚損傷相關的疾病，例如，腦損傷、肺損傷、脾臟損傷、脾臟破裂、胃潰瘍、胃炎、胃穿孔、消化道黏膜損傷、外傷、燒傷、潰瘍、黏膜炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、中風、皮膚老化等。在某些實施例中，本申請案係關於用於治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的SEQ ID NO：7所示的多肽。在某些實施例中，本申請案係關於用於治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149或者SEQ ID NO：150所示的多肽。
圖1顯示野生型MG53的分子結構模式圖。
圖2顯示人野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：1及其編碼核酸序列SEQ ID NO：19。
圖3顯示小鼠野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：2及其編碼核酸序列SEQ ID NO：20。
圖4顯示大鼠野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：3及其編碼核酸序列SEQ ID NO：21。
圖5顯示猴子野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：4及其編碼核酸序列SEQ ID NO：22。
圖6顯示豬野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：5及其編碼核酸序列SEQ ID NO：23。
圖7顯示狗野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：6及其編碼核酸序列SEQ ID NO：24。
圖8顯示人MG53 S255A突變體的胺基酸序列SEQ ID NO：7及其編碼核酸序列SEQ ID NO：13。
圖9顯示小鼠MG53 S255A突變體的胺基酸序列SEQ ID NO：8及其編碼核酸序列SEQ ID NO：14。
圖10顯示大鼠MG53 S255A突變體的胺基酸序列SEQ ID NO：9及其編碼核酸序列SEQ ID NO：15。
圖11顯示猴子MG53 S255A突變體的胺基酸序列SEQ ID NO：10及其編碼核酸序列SEQ ID NO：16。
圖12顯示豬MG53 S255A突變體的胺基酸序列SEQ ID NO：11及其編碼核酸序列SEQ ID NO：17。
圖13顯示狗MG53 S255A突變體的胺基酸序列SEQ ID NO：12及其編碼核酸序列SEQ ID NO：18。
圖14顯示在新生大鼠的初代培養的心肌細胞中使用腺病毒過表達小鼠野生型MG53和小鼠MG53 S255A突變體後，細胞內ATP量和LDH釋放量。上圖為在新生大鼠的初代培養的心肌細胞中使用腺病毒過表達小鼠野生型MG53和小鼠MG53 S255A突變體，經缺氧復氧處理後檢測細胞內的 ATP的含量，Adv-β-gal表示表達半乳糖苷酶而不表達小鼠野生型MG53及小鼠MG53 S255A突變體的對照病毒，Adv-MG53-myc表示表達小鼠野生型MG53的腺病毒，Adv-MG53-S255A-myc表示表達小鼠MG53 S255A突變體的腺病毒(n=7,*p<0.05,**p<0.01)；下圖為在新生大鼠的初代培養的心肌細胞中使用腺病毒過表達小鼠野生型MG53和MG53 S255A突變體，經缺氧復氧處理後檢測細胞的LDH的釋放量，Adv-β-gal表示表達半乳糖苷酶而不表達小鼠野生型MG53及小鼠MG53 S255A突變體的對照病毒，Adv-MG53-myc表示表達小鼠野生型MG53的腺病毒，Adv-MG53-S255A-myc表示表達小鼠MG53 S255A突變體的腺病毒(n=7,**p<0.01,***p<0.005)。
圖15顯示小鼠MG53 S255A突變不影響小鼠野生型MG53對AKT的啟動。上圖為在新生大鼠的初代培養的心肌細胞中使用腺病毒過表達小鼠野生型MG53和小鼠MG53 S255A突變體，利用西方墨點法(Western Blot)檢測細胞內的p-AKT473的量，β-gal表示表達半乳糖苷酶而不表達小鼠野生型MG53及小鼠MG53 S255A突變體的對照腺病毒，MG53表示表達小鼠野生型MG53的腺病毒，S255A表示表達小鼠MG53 S255A突變體的腺病毒；下圖為上圖的統計圖，Adv β-gal表示表達半乳糖苷酶而不表達小鼠野生型MG53及MG53 S255A突變體的對照腺病毒，Adv MG53表示表達小鼠野生型MG53的腺病毒，Adv MG53 S255A表示表達小鼠MG53 S255A突變體的腺病毒(n=5,*p<0.05)。
圖16顯示小鼠MG53 S255A突變抑制了MG53介導的基質降解。圖16A部分的上圖是在HEK293T細胞系中過表達IRS1和小鼠野生型MG53、小 鼠MG53 S255A突變體、或小鼠MG53-D-RING截短體的質體，Western Blot檢測IRS1的蛋白含量，CON表示不表達小鼠野生型MG53、小鼠MG53 S255A突變體、小鼠MG53-D-RING截短體的空載體質體對照，MG53表示表達小鼠野生型MG53的載體質體，S255A表示表達小鼠MG53 S255A突變體的載體質體，D-RING表示表達小鼠RING結構域切除的MG53截短體MG53-D-RING的載體質體；圖16A部分的下圖是上圖的統計圖(n=5，*p<0.05；**p<0.01)；圖16B部分的上圖是在HEK293T細胞系中過表達IR和小鼠野生型MG53、小鼠MG53 S255A突變體、或小鼠MG53-D-RING截短體的質體，Western Blot檢測IR的蛋白含量，CON表示不表達小鼠野生型MG53、小鼠MG53 S255A突變體、小鼠MG53-D-RING截短體的空載體質體對照，MG53表示表達小鼠野生型MG53的載體質體，S255A表示表達小鼠MG53 S255A突變體的載體質體，D-RING表示表達小鼠MG53-D-RING截短體的載體質體；圖16B部分的下圖是上圖的統計圖(n=5，**p<0.01)。
圖17顯示人MG53 S255A突變體抑制了MG53介導的基質降解。上圖是在HEK293T細胞系中過表達IRS1和人野生型MG53、人MG53 S255A突變體、或人MG53-D-RING截短體的質體，Western Blot檢測IRS1的蛋白含量，CON表示不表達人野生型MG53、人MG53 S255A突變體、人MG53-D-RING截短體的空載體質體對照，MG53表示表達人野生型MG53的載體質體，MG53-dR表示表達人MG53-D-RING截短體的載體質體；下圖是上圖的統計圖(n=5，**p<0.01)。
圖18顯示小鼠MG53 S255A突變體抑制了MG53與基質IRS1的結合。圖18A部分顯示HEK293T細胞系中共表達小鼠野生型MG53和MG53的 基質IRS1，或者共表達小鼠MG53 S255A突變體和MG53的基質IRS1，然後免疫沉澱IRS1蛋白並進行Western Blot實驗檢測MG53-IRS1複合物的含量。圖18A部分中的MG53表示小鼠野生型MG53，MG53 S255A表示小鼠MG53 S255A突變體，IRS1表示小鼠胰島素受體基質；圖18B部分在表面等立體共振(SPR)實驗中，固定純化的蛋白IRS1，檢測它對流動相中的純化蛋白小鼠野生型MG53或小鼠MG53 S255A突變體的結合強度。圖18B部分中的MG53表示小鼠野生型MG53，MG53-S255A表示小鼠MG53 S255A突變體，Rat IRS1表示大鼠胰島素受體基質。
圖19顯示小鼠MG53 S255A突變體對IRS1蛋白量的影響。上圖是在HEK293T細胞系中過表達IRS1、Ub、MG53、MG53 S255A突變體的質體，Western Blot檢測IRS1的蛋白含量。Ub表示泛素，MG53表示小鼠野生型MG53，MG53-S255A表示小鼠MG53 S255A突變體；下圖為上圖實驗的統計圖，CON表示不表達小鼠野生型MG53和小鼠MG53 S255A突變體的空載體質體對照，MG53表示表達小鼠野生型MG53的載體質體，MG53-S255A表示表達小鼠MG53 S255A突變體的載體質體(n=3,*p<0.05；***p<0.005)。
圖20顯示人MG53亞型的胺基酸序列SEQ ID NO：139(其對應的NCBI編號為BAD18630.1)及其編碼核酸序列SEQ ID NO：143。
圖21顯示人MG53亞型的胺基酸序列SEQ ID NO：140(其對應的NCBI編號為XP_016878743.1)及其編碼核酸序列SEQ ID NO：144。
圖22顯示人MG53亞型的胺基酸序列SEQ ID NO：141(其對應的NCBI編號為BAC03506.1)及其編碼核酸序列SEQ ID NO：145。
圖23顯示人MG53亞型的胺基酸序列SEQ ID NO：142(其對應的 NCBI編號為AAH33211.1)及其編碼核酸序列SEQ ID NO：146。
圖24顯示人MG53亞型S255A突變體的胺基酸序列SEQ ID NO：147及其編碼核酸序列SEQ ID NO：151。
圖25顯示人MG53亞型S255A突變體的胺基酸序列SEQ ID NO：148及其編碼核酸序列SEQ ID NO：152。
圖26顯示人MG53亞型S255A突變體的胺基酸序列SEQ ID NO：149及其編碼核酸序列SEQ ID NO：153。
圖27顯示人MG53亞型S255A突變體的胺基酸序列SEQ ID NO：150及其編碼核酸序列SEQ ID NO：154。
圖28顯示本申請中各物種的全長MG53蛋白及其片段的胺基酸位點的命名示意圖。
儘管本申請將在以下公開多個方面和實施例，但是在不違背本申請主題精神和範圍的前提下，本發明所屬技術領域中具有通常知識者顯然可以對其進行各種等同改變和修改。本申請公開的多個態樣和實施例僅用於舉例說明，其並非旨在限制本申請，本申請的實際保護範圍以請求項為準。除非另外指出，本文中使用的所有技術和科學術語均具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常所理解的相同的含義。本申請中引用的所有參考文獻、專利、專利申請均透過整體引用併入本文。
一方面，本申請案係關於一種MG53突變體，其中所述MG53突變體在野生型MG53的胺基酸序列的基礎上，在所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY區域內具有至少一個絲胺酸缺失和/或突變為任何其他非絲 胺酸或蘇胺酸的胺基酸。
本申請中使用的術語「野生型MG53」或「野生型MG53蛋白」是指在對象體內表達的全長MG53蛋白的天然序列或其片段。MG53蛋白是一種多功能蛋白，其結構如圖1所示。各物種的全長MG53蛋白長度略有不同，但是通常具有約477個胺基酸，由N端的TRIM結構域和C端的SPRY結構域組成，TRIM結構域由依次相連的Ring、B-box、coiled-coil結構域(RBCC)組成。MG53蛋白是膜修復的重要成分之一，在缺血再灌注損傷的預適應保護和後適應保護中發揮重要作用，同時MG53蛋白的高表達也會引起胰島素抗性和代謝症候群的發生。關於MG53的結構、功能以及與其他蛋白的相互作用，本領域中已有詳細報導(參見，例如，Chuanxi Cai et al.,Journal of Biological Chemistry,284(5),3314-3322,(2009)；Xianhua Wang et al.,Circulation Research 107,76-83,(2010)；Eun Young Park et al.,Proteins,790-795(2009))。
本申請中使用的術語「對象」包括人類和非人類的動物。非人類的動物包括所有的脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物。「對象」也可以是家畜動物，例如牛、豬、羊、家禽和馬；或齧齒類動物，例如大鼠、小鼠；或靈長類動物，例如猿、猴子；或家養動物，例如狗和貓。「對象」可以是雄性或者雌性，可以是老年、成年、青少年、兒童或者嬰兒。人類「對象」可以是高加索人、非洲人、亞洲人、閃族人，或其他種族或所述種族背景的混合。
在某些實施例中，所述野生型MG53較佳的來源於哺乳動物，例如，人、猿、猴子、小鼠、大鼠、豬、狗等。本發明所屬技術領域中具有 通常知識者可以透過公開管道(例如，美國國家生物技術資訊中心網站(NCBI))獲得各物種的野生型MG53的胺基酸序列，各物種的野生型MG53的胺基酸序列透過引用併入本申請。在某些實施例中，所述野生型MG53的胺基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或者SEQ ID NO：6所示，分別對應於人、小鼠、大鼠、猴子、豬、狗等的野生型MG53全長蛋白。
本申請中使用的術語「蛋白」、「多肽」以及「肽」可以互換使用，是指胺基酸的聚合物。本申請所述的蛋白、多肽或肽可以含有天然的胺基酸，也可以含有非天然的胺基酸，或胺基酸的類似物、模擬物。本申請所述的蛋白、多肽或肽可以透過本領域公知的任何方法獲得，例如但不限於，透過天然分離、重組表達、化學合成等。
本申請中使用的術語「coiled-coil-SPRY結構域」是野生型MG53的胺基酸序列中對應的一個結構域。coiled-coil結構域(即，捲曲螺旋結構域)存在於大多數TRIM家族蛋白中，該結構域介導TRIM家族成員之間或者TRIM成員與其他蛋白之間的同源性或者異源性結合形成二聚體、多聚體等複合物，從而發揮細胞修復功能(參見，例如，Ozato et al.,Nature Review Immunology,8：849-860(2008)；Sanchez S.et al.,PNAS,111：2494-2499(2014))。SPRY結構域位於野生型MG53的胺基酸序列的C端，通常位於野生型MG53第288~477位胺基酸區域。在某些實施例中，本申請中所述的SPRY結構域包括PRY基序和SPRY基序。SPRY結構域在進化上非常保守，從真菌到高等動物中均有表現(參見，例如，Ozato et al.,Nature Review Immunology,8：849-860(2008))。迄今為止，在不同哺乳動物基因組內鑒定到的大約60 個TRIM家族成員中，15個成員在TRIM結構域(即Ring-B-box-Coiled-Coil結構域)之後攜帶一個類似的SPRY結構域，且MG53表現出與這些TRIM亞家族蛋白的保守性一級結構(參見，例如WO2009/073808)。Coiled-coil-SPRY結構域對應的具體胺基酸區域位點在不同物種中可能略有不同，但是本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以透過本領域的現有技術(例如，NCBI中公開的內容)和/或常規實驗方法得到不同物種的野生型MG53的coiled-coil-SPRY結構域所對應的具體胺基酸區域位點。在某些實施例中，本申請中的coiled-coil-SPRY結構域是指野生型MG53的第122-477位胺基酸或者與其結構類似的區域。在某些實施例中，所述結構類似區域可以是包括第122-477位胺基酸中的70%、80%或者90%的連續的胺基酸序列的區域。在某些實施例中，所述結構類似區域的N端起始位點可以比第122-477位胺基酸區域的N端增長或者縮短約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個或者20個胺基酸，和/或者其C端終止位點可以比第122-477位胺基酸區域的C端增長或者縮短約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個或者20個胺基酸。例如，在某些實施例中，本申請中的coiled-coil-SPRY結構域是指人的野生型MG53(即，SEQ ID NO：1)中的coiled-coil-SPRY結構域，其對應於SEQ ID NO：1的第122-477位胺基酸。
本申請中使用的術語「MG53突變體」或者「MG53蛋白突變體」是指野生型MG53蛋白的天然胺基酸序列被修飾的MG53蛋白變體或片段。這類修飾包括但不限於一個或多個胺基酸缺失和/或被取代。在某些實施例中，本申請中的MG53突變體在野生型MG53的胺基酸序列的基礎上，在所 述野生型MG53的coiled-coil-SPRY結構域內具有至少一個絲胺酸缺失和/或突變為任何其他非絲胺酸或蘇胺酸的胺基酸。
本申請中使用的「至少一個絲胺酸」是指一個或多個絲胺酸。例如，是指野生型MG53的coiled-coil-SPRY結構域內的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個或更多個絲胺酸。
本申請中使用的「其他非絲胺酸或蘇胺酸的胺基酸」是指除了絲胺酸、蘇胺酸之外的、任何其他的天然胺基酸、取代的天然胺基酸、非天然胺基酸、取代的非天然胺基酸或其任何組合。天然胺基酸的名稱在本申請中表示為標準的單字母或三字母代碼。天然胺基酸包括非極性胺基酸和極性胺基酸。除非另有說明，本文所述的任何胺基酸可以是D-或L-構型。
在某些實施例中，所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY結構域內的至少一個絲胺酸(Ser或S)缺失或者突變為非極性胺基酸。所述非極性胺基酸包括甘胺酸(Gly或G)、丙胺酸(Ala或A)、亮胺酸(Leu或L)、異亮胺酸(Ile或I)、纈胺酸(Val或V)、脯胺酸(Pro或P)、苯丙胺酸(Phe或F)、甲硫胺酸(Met或M)、色胺酸(Trp或W)。在某些實施例中，所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY結構域內的至少一個絲胺酸缺失或者突變為甘胺酸或丙胺酸。較佳的，在某些實施例中，所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY結構域內的至少一個絲胺酸缺失或者突變為丙胺酸。更較佳的，在某些實施例中，所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY結構域內的至少一個絲胺酸突變為丙胺酸。
在某些實施例中，所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY結構域內的至少一個絲胺酸缺失或者突變為極性胺基酸。所述極性胺基酸包括穀氨醯胺(Gln或Q)、半胱胺酸(Cys或C)、天冬醯胺(Asn或N)、酪胺酸(Tyr或Y)、天冬胺酸(Asp或D)、穀胺酸(Glu或E)、賴胺酸(Lys或K)、精胺酸(Arg或R)、組胺酸(His或H)。在某些實施例中，所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY結構域內的至少一個絲胺酸缺失或者突變為半胱胺酸或組胺酸。較佳的，在某些實施例中，所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY結構域內的至少一個絲胺酸缺失或者突變為半胱胺酸。更較佳的，在某些實施例中，所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY結構域內的至少一個絲胺酸突變為半胱胺酸。
在某些實施例中，本申請所述的絲胺酸突變包括一個絲胺酸被一個或多個非絲胺酸或蘇胺酸的其他胺基酸取代，例如，一個絲胺酸可以被1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個非絲胺酸或蘇胺酸的其他胺基酸取代。如果有兩個或兩個以上絲胺酸被取代，則每個絲胺酸可以分別獨立地被一個或多個非絲胺酸或蘇胺酸的其他胺基酸取代。
雖然各物種野生型MG53的具體絲胺酸位點隨著物種的不同而可能有所不同，但是一旦已知某物種野生型MG53的胺基酸序列及其coiled-coil-SPRY結構域對應的胺基酸區域，本發明所屬技術領域中具有通常知識者就可以確定coiled-coil-SPRY結構域內的絲胺酸所對應的具體胺基酸位點。例如，本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知人野生型MG53的胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其coiled-coil-SPRY結構域對應於SEQ ID NO：1的第122-477位胺基酸。在這種情況下，本發明所屬技術領域中具 有通常知識者就可以確定人野生型MG53的coiled-coil-SPRY結構域內的絲胺酸所對應的具體胺基酸位點分別位於SEQ ID NO：1的第150位、第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位、第297位、第301位、第305位、第306位、第307位、第314位、第341位、第377位、第405位、第418位、第425位、第430位。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於人野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：1的第150位、第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位、第297位、第301位、第305位、第306位、第307位、第314位、第341位、第377位、第405位、第418位、第425位、第430位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，本申請所述的MG53蛋白包括全長MG53蛋白，或者全長MG53蛋白的截短體(即全長MG53蛋白的截短的片段)，或者是與全長MG53蛋白或其截短體相比具有一個或多個胺基酸突變或者增加或者刪除的突變體。在這種情況下，為了統一不同的MG53蛋白亞型的胺基酸序列中的胺基酸位點數的命名，當本申請中提到某一MG53蛋白亞型的胺基酸位點時，將該MG53蛋白亞型的胺基酸序列與全長MG53蛋白的胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：1)進行序列對比，並在必要時在相關胺基酸序列中引入間隔，使相同的胺基酸數目達到最多，將該MG53亞型的胺基酸序列的第1個胺基酸的位點數指定為該胺基酸對應的全長MG53蛋白的胺基酸位點數，從而使得當提及某物種野生型MG53的胺基酸位點數時，不管是全長MG53蛋白還是其截短體，均指的是全長MG53蛋白的胺基酸序列中的位點數。
例如，如圖28所示，某物種的全長MG53蛋白具有n個胺基酸，對應的胺基酸位點為第1~n位。MG53亞型1的胺基酸序列與全長MG53蛋白的胺基酸序列相比，含有對應于全長序列的第m-n位胺基酸的截短體，那麼就將MG53亞型1的胺基酸序列的第1個胺基酸的位點數指定為第m位，將MG53亞型1的胺基酸序列的第2個胺基酸的位點數指定為第m+1位，以此類推，將MG53亞型1的胺基酸序列的最後一個胺基酸位點指定為第n位。再例如，MG53亞型2的胺基酸序列與全長MG53蛋白的胺基酸序列相比，含有對應于全長序列的第1~s位胺基酸的截短體，那麼就將MG53亞型2的胺基酸序列的第1個胺基酸的位點數指定為第1位，將MG53亞型2的胺基酸序列的第2個胺基酸的位點數指定為第2位，以此類推，將MG53亞型2的胺基酸序列的最後一個胺基酸位點指定為第s位。再例如，MG53亞型3的胺基酸序列與全長MG53蛋白的胺基酸序列相比，含有對應于全長序列的第p~q位胺基酸的截短體，那麼就將MG53亞型3的胺基酸序列的第1個胺基酸的位點數指定為第p位，將MG53亞型3的胺基酸序列的第2個胺基酸的位點數指定為第p+1位，以此類推，將MG53亞型3的胺基酸序列的最後一個胺基酸位點指定為第q位。
例如，SEQ ID NO：140是人的野生型MG53亞型之一，其具有333個胺基酸，對應於人野生型MG53全長序列SEQ ID NO：1的第145~477位胺基酸片段，在這種情況下，將SEQ ID NO：140的胺基酸序列的第1個胺基酸(甲硫胺酸)位點指定為SEQ ID NO：140的第145位，第2個胺基酸位點指定為SEQ ID NO：140的第146位，以此類推，將SEQ ID NO：140的胺基酸序列的最後一個胺基酸位點指定為SEQ ID NO：140的第477位。又例如，SEQ ID NO：141是人的野生型MG53亞型之一，其也具有333個胺基酸，與人野生型MG53全長序列SEQ ID NO：1第145-477位胺基酸相比只有1個胺基酸不同，即SEQ ID NO：1的第315位為穀胺酸，而SEQ ID NO：141的相應位置為甘胺酸，在這種情況下，將SEQ ID NO：141的胺基酸序列的第1個胺基酸(甲硫胺酸)位點指定為SEQ ID NO：141的第145位，第2個胺基酸位點指定為SEQ ID NO：141的第146位，以此類推，將SEQ ID NO：141的胺基酸序列的最後一個胺基酸位點指定為SEQ ID NO：141的第477位。再例如，SEQ ID NO：142是人的野生型MG53亞型之一，其具有269個胺基酸，對應於人野生型MG53全長序列SEQ ID NO：1的第1-269位胺基酸片段，在這種情況下，將SEQ ID NO：142的胺基酸序列的第1個胺基酸(甲硫胺酸)位點指定為SEQ ID NO：142的第1位，將SEQ ID NO：142的胺基酸序列的第2個胺基酸位點指定為SEQ ID NO：142的第2位，以此類推，將SEQ ID NO：142的胺基酸序列的最後一個胺基酸位點指定為SEQ ID NO：142的第269位。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於人野生型MG53亞型的胺基酸序列SEQ ID NO：139的第150位、第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位、第297位、第301位、第305位、第306位、第307位、第314位、第341位、第377位、第405位、第418位、第425位或者第430位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於人野生型MG53亞型的胺基酸序列SEQ ID NO：140的第150位、第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位、第297位、第301位、第305位、第306位、第307位、第314位、第341位、第377位、第405位、第418位、第 425位或者第430位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於人野生型MG53亞型的胺基酸序列SEQ ID NO：141的第150位、第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位、第297位、第301位、第305位、第306位、第307位、第314位、第341位、第377位、第405位、第418位、第425位或者第430位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於人野生型MG53亞型的胺基酸序列SEQ ID NO：142的第150位、第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於小鼠野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：2的第188位、第189位、第210位、第211位、第214位、第246位、第253位、第255位、第269位、第296位、第297位、第301位、第305位、第306位、第307位、第314位、第341位、第367位、第377位、第418位、第430位、第440位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於大鼠野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：3的第150位、第188位、第189位、第210位、第211位、第214位、第246位、第253位、第255位、第269位、第296位、第297位、第301位、第305位、第307位、第314位、第341位、第367位、第377位、第418位、第430位、第440位、第464位、第474位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於猴子野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：4的第150位、第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位、第297位、第301位、第305位、第 306位、第307位、第341位、第377位、第405位、第418位、第425位、第430位、第464位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於豬野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：5的第150位、第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位、第301位、第305位、第307位、第314位、第341位、第377位、第411位、第418位、第425位、第430位、第474位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於狗野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：6的第150位、第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位、第297位、第301位、第305位、第307位、第314位、第341位、第367位、第377位、第418位、第425位、第430位中的一個或多個位點。
雖然發生缺失或突變的具體絲胺酸位點隨著物種的不同而可能有所不同，但是野生型MG53蛋白的絲胺酸位點在各物種之間具有高度保守性。例如，對於人、小鼠、大鼠、猴子、豬、狗等的野生型MG53蛋白而言，各自野生型MG53蛋白的胺基酸序列的第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位、第301位、第305位、第307位、第341位、第377位、第418位、第430位均是絲胺酸。在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1~6)的第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位、第301位、第305位、第307位、第341位、第377位、第418位、第430位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、或者SEQ ID NO：142)的第150位、第188-189位、第210-211位、第214位、第246位、第253-255位、第269位、第296-297位、第301位、第305-307位、第314位、第341位、第367位、第377位、第405位、第411位、第418位、第425位、第430位、第440位、第464位或者第474位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、或者SEQ ID NO：142)的第189位、第211位、第214位、第246位、第253-255位、第269位、第296位、第301位、第305位、第307位、第341位、第377位、第418位或者第430位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、或者SEQ ID NO：142)的第211位、第214位、第246位、第253-255位、第269位、第296位或者第297位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、 SEQ ID NO：141、或者SEQ ID NO：142)的第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位或者第297位中的一個或多個位點。
在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、或者SEQ ID NO：142)的第253-255位中的一個或多個位點。在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列的第253位。在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列的第255位。在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：1的第255位。在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位於野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141或SEQ ID NO：142的第255位。
在某些實施例中，所述MG53突變體具有兩個或兩個以上的絲胺酸突變。在某些實施例中，所述MG53突變體的兩個或兩個以上的絲胺酸突變包括在第253-255位中的一個或多個位點上的絲胺酸突變。在某些實施例中，所述MG53突變體的兩個或兩個以上的絲胺酸突變包括在第253位的絲胺酸突變。在某些實施例中，所述MG53突變體的兩個或兩個以上的絲胺酸突變包括在第255位的絲胺酸突變。在某些實施例中，所述MG53突變體的兩個或兩個以上的絲胺酸突變包括在第253位和第255位的絲胺酸突變。
本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以理解，不同物種的野生型MG53蛋白中絲胺酸所處位點可能有所不同，因此發生缺失或突變的絲膠酸位點也可能有所不同。在某些實施例中，發生缺失或突變的絲胺酸位 於SEQ ID NO：1所示野生型MG53的胺基酸序列中相應絲胺酸位點的上游或下游的1至10個胺基酸之內、1至5個胺基酸之內、或1至3個胺基酸之內。
在某些實施例中，所述MG53突變體的胺基酸序列為SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149或者SEQ ID NO：150。更較佳的，在某些實施例中，所述MG53突變體的胺基酸序列為SEQ ID NO：7。在某些實施例中，所述MG53突變體的胺基酸序列與SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150所示的序列之一具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%的胺基酸序列同源性，並且所述MG53突變體在具有細胞修復功能和/或心臟保護功能的同時，避免了野生型MG53所帶來的代謝類副作用。
「序列同源性」的百分比定義為，針對胺基酸序列而言，將候選胺基酸序列與對比胺基酸序列進行序列對比，並在必要時引入間隔，使相同的胺基酸數目達到最多，並在此基礎上計算兩條胺基酸序列之間相同胺基酸的百分比；針對核酸序列而言，將候選核酸序列與對比核酸序列進行序列對比，並在必要時引入間隔，使相同的核苷酸數目達到最多，並在此基礎上計算兩條核酸序列之間相同核苷酸的百分比。
可以透過本領域所知的多種方式來對比以確定同源性的百分比。例如，可以用公開可用的以下工具進行序列對比，所述工具如BLASTp(美國國家生物技術資訊中心網站(NCBI)： http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，也可參見，Altschul S.F.et al.,J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)；Stephen F.et al，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))、ClustalW2(歐洲生物資訊研究所網站：http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/，可參見，Higgins D.G.et al.，Methods in Enzymology，266：383-402(1996)；Larkin M.A.et al.，Bioinformatics(Oxford、England)，23(21)：2947-8(2007))和TCoffee(瑞士生物資訊學研究所網站，可參見，Poirot O.et al.，Nucleic Acids Res.，31(13)：3503-6(2003)；Notredame C.et al.，J.Mol.Boil.，302(1)：205-17(2000))。使用軟體進行序列比對時，可以使用軟體提供的預設參數，也可以根據對比的需要適當調整參數，這些都在本發明所屬技術領域中具有通常知識者的知識範圍之內。
在某些實施例中，SEQ ID NOs：7~12、SEQ ID NOs：147~150以及與SEQ ID NOs：7~12、SEQ ID NOs：147~150具有胺基酸序列同源性的MG53突變體在具有細胞修復功能和/或心臟保護功能的同時，避免或減少了野生型MG53所帶來的代謝類副作用。
本申請案的發明人驚奇地發現，野生型MG53的coiled-coil-SPRY結構域內至少一個絲胺酸缺失或突變為任何其他非絲胺酸或蘇胺酸的胺基酸後，能夠避免或減少野生型MG53所帶來的代謝類副作用，但是並不影響MG53的細胞修復功能和/或心臟保護功能。不希望受到任何理論的束縛，上述結果可能是由於野生型MG53的coiled-coil-SPRY結構域內的絲胺酸位點的磷酸化能大幅度調控MG53的E3泛素連接酶功能，並透過基質IRβ和IRS1調節MG53對胰島素訊息傳遞系統的調控作用，但是該結構域內的絲胺酸位 點的磷酸化並不調控MG53的細胞修復功能和/或心臟保護功能。
本申請中使用的「細胞修復功能」是指，在細胞損傷時，特別是在細胞急性損傷時，野生型MG53或MG53突變體能夠對損傷細胞的細胞膜進行修補恢復，可選的，透過啟動相關訊息傳遞途徑(例如，RISK途徑)來減少細胞死亡，促進細胞生存，從而使細胞恢復功能。在某些實施例中，本申請的野生型MG53或MG53突變體可以修復活的細胞、體外的細胞、或者體內的細胞。本申請案的野生型MG53或MG53突變體還可以修復不同種類的細胞，例如，但不限於，心肌細胞、橫紋肌細胞、骨骼肌細胞、腎近端腎小管上皮細胞、肺泡上皮細胞、消化道上皮細胞(例如，口腔上皮細胞、食道上皮細胞、胃上皮細胞、十二指腸上皮細胞、小腸上皮細胞、空腸上皮細胞、迴腸上皮細胞、結腸上皮細胞)、黏膜細胞(例如，口腔黏膜細胞、鼻黏膜細胞、胃黏膜細胞、小腸黏膜細胞、結腸黏膜細胞、十二指腸黏膜細胞)、皮膚細胞(例如表皮細胞、上皮細胞、真皮細胞、內皮細胞)、血管細胞(例如血管壁細胞、血管內皮細胞、血管外皮細胞、血管平滑肌細胞)等。在某些實施例中，本申請案所述的野生型MG53或MG53突變體可以修復心肌細胞、骨骼肌細胞、橫紋肌細胞、腎近端腎小管上皮細胞、肺泡上皮細胞等。
可以使用本發明所屬技術領域習知的方法來測定本申請案所述的MG53突變體的細胞修復功能。例如透過在新生大鼠心肌細胞(NRVM)中使用腺病毒過表達野生型MG53和本申請所述的MG53突變體，利用缺氧刺激細胞，檢測細胞的存活狀況(例如，透過MTT法、培養基的ATP和LDH濃度測定法、TUNEL染色法等檢測(具體操作步驟參見Zhang.T et al.Nature Medicine,175-184,(2016))，然後比較對照組(例如，不表達野生型MG53、MG53突變體的空載體陰性對照組、過表達野生型MG53的陽性對照組)和實驗組(即，過表達本申請所述的MG53突變體的組)的觀測指標(例如，細胞內ATP水準、LDH的釋放水準等)，來測定本申請所述的MG53突變體的細胞修復功能。
本申請中所述的「心臟保護功能」是指，在心肌損傷時，特別是在心肌急性損傷時，野生型MG53或MG53突變體能夠透過對心肌細胞膜損傷的修復，可選的，透過啟動心肌細胞的相關訊息傳遞途徑(例如，RISK途徑)從而實現對心肌細胞的保護，進而提高心臟保護作用。可以使用本發明所屬技術領域習知的方法來測定本申請所述的MG53突變體的心臟保護功能。例如透過在新生大鼠心肌細胞(NRVM)中過表達野生型MG53和本申請案所述的MG53突變體，利用缺氧刺激細胞，檢測細胞的存活狀況(例如，透過MTT法、培養基的ATP和LDH濃度測定法、TUNEL染色法等檢測(具體操作步驟參見Zhang.T et al.Nature Medicine,175-184,(2016))，然後比較對照組(例如，不表達野生型MG53、MG53突變體的空載體陰性對照組、過表達野生型MG53的陽性對照組)和實驗組(即，過表達本申請所述的MG53突變體的組)的觀測指標(例如，細胞內ATP水準、LDH的釋放水準等)，來觀察本申請案所述的MG53突變體的心臟保護功能。又例如，分別使用野生型MG53和本申請所述的MG53突變體蛋白孵育心肌細胞，利用各種刺激(例如，缺氧、H2O2)引導細胞的死亡，透過比較對照組(例如，既不用野生型MG53、又不用MG53突變體孵育的陰性對照組、過表達野生型MG53的陽性對照組)和實驗組(即，用本申請所述的MG53突變體孵育 的組)的細胞存活率來評價本申請所述的MG53突變體的心臟保護功能。細胞存活率可以透過MTT細胞計數、LDH、ATP或者TUNEL染色的測量來確定。
本申請中所述的「代謝類副作用」是指，在應用了治療量的藥物後所出現的治療目的之外的、由於代謝紊亂所引起的疾病或不適，包括但不限於，胰島素抗性、肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常等。不希望受到任何理論的束縛，但是認為可以透過測定MG53的E3泛素連接酶功能來評價代謝類副作用的嚴重程度。在某些實施例中，當野生型MG53的coiled-coil-SPRY結構域內的至少一個絲胺酸缺失或突變為任何其他非絲胺酸或蘇胺酸的胺基酸後，會抑制野生型MG53至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、甚至100%的E3泛素連接酶功能，從而避免或減少野生型MG53產生的代謝類副作用，但是並不影響MG53的細胞修復功能和/或心臟保護功能。「避免或減少野生型MG53產生的代謝類副作用」是指完全沒有出現野生型MG53產生的代謝類副作用或者代謝類副作用的嚴重程度比相應的野生型MG53產生的代謝類副作用降低至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、甚至100%。「不影響MG53的細胞修復功能和/或心臟保護功能」是指MG53的細胞修復功能和/或心臟保護功能完全沒有受到影響或者MG53的細胞修復功能和/或心臟保護功能降低了至多5%、至多10%、至多15%、至多20%、至多25%、至多30%等。
在某些實施例中，本申請提供的MG53突變體包含其類似物。所 述MG53突變體類似物指的是一種多肽，其具有的功能或結構特徵與本申請提供的MG53突變體的全部或部分基本相似，但是所述MG53突變體類似物的胺基酸序列與野生型MG53的胺基酸序列至少在一個胺基酸位點不同。所述MG53突變體類似物可以是MG53突變體的部分片段、衍生物或變體，並可以包含化學或生物的修飾。所述MG53突變體類似物可以具有MG53突變體的一個或多個胺基酸的保守替換、增加、刪除、插入、截斷、修飾(例如，磷酸化、糖基化、標記等)或其任意組合。MG53突變體類似物可以包括MG53突變體天然存在的變體和人工產生的變體，如透過重組方法或化學合成獲得的人工多肽序列。MG53突變體類似物可以包含非天然存在的胺基酸殘基。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以理解，本申請所述的MG53突變體的類似物仍然保留了與MG53突變體基本上相似的功能，例如，MG53突變體的類似物在具有細胞修復功能和/或心臟保護功能的同時，能夠避免或減少野生型MG53所帶來的代謝類副作用，例如，胰島素抗性、肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常等。
胺基酸殘基的保守替換是指性質相似的胺基酸之間的替換，例如極性胺基酸之間的替換(如穀氨醯胺和天冬醯胺之間的替換)，疏水性胺基酸之間的替換(如亮胺酸、異亮胺酸、甲硫胺酸和纈胺酸之間的替換)，以及帶相同電荷的胺基酸之間的替換(如精胺酸、賴胺酸和組胺酸之間的替換，或者穀胺酸和天冬胺酸之間的替換)等。在某些實施例中，本申請所述的MG53突變體與SEQ ID NOs：7~12、SEQ ID NOs：147~150所示序列相比，僅在非絲胺酸的一個或多個胺基酸位點有胺基酸的保守替換。在某些實施例中，本申請所述的MG53突變體與SEQ ID NOs：7~12、SEQ ID NOs： 147~150所示序列相比，在非絲胺酸的2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、或20個胺基酸位點有胺基酸的保守替換。
在不影響活性的前提下，本申請所述的MG53突變體還可以含有非天然的胺基酸。非天然的胺基酸包括例如，β-氟代丙胺酸、1-甲基組胺酸、γ-亞甲基穀胺酸、α-甲基亮胺酸、4,5-脫氫賴胺酸、羥基脯胺酸、3-氟代苯基丙胺酸、3-胺基酪胺酸、4-甲基色胺酸等。
本申請的MG53突變體也可以使用本發明所屬技術領域習知的方法進行修飾。例如，但不限於，PEG化、糖基化、胺基端修飾、脂肪醯化、羧基端修飾、磷酸化、甲基化等。
本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以理解，本申請的MG53突變體使用本發明所屬技術領域習知的方法進行修飾之後，仍然保留了與MG53突變體基本上相似的功能，例如，經修飾的MG53突變體在具有細胞修復功能和/或心臟保護功能的同時，能夠避免或減少野生型MG53所帶來的代謝類副作用，例如，胰島素抗性、肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常等。
另一方面，本申請案係關於一種藥物組合物，其包括本申請所述的MG53突變體和藥學上可接受的載體。
本申請中使用的術語「藥學上可接受的載體」是指，用於給給藥對象遞送MG53突變體的藥學上可接受的溶劑、懸浮劑或任何其它藥理上惰性的媒介物，其不干擾MG53突變體的結構和性質。某些此類載體能使MG53突變體配製成例如片劑、丸劑、膠囊、液體、凝膠劑、糖漿劑、漿液、混懸液和錠劑以給給藥對象口服攝入。某些此類載體能使MG53突變體配製成 注射、輸注或局部給藥。
可以用在本申請的藥物組合物中的藥學上可接受的載體包括，但不限於，例如，藥學可接受的液體、凝膠、或固體載劑、水相介質(例如，氯化鈉注射液，林格氏液注射液，等滲葡萄糖注射液，無菌水注射液，或葡萄糖和乳酸林格注射液)、非水相介質(例如，植物來源的不揮發性油、棉花籽油、玉米油、芝麻油、或者花生油)、抗微生物物質、等滲物質(例如氯化鈉或葡萄糖)、緩衝液(例如磷酸鹽或枸櫞酸鹽緩衝液)、抗氧化劑(例如硫酸氫鈉)、麻醉劑(例如鹽酸普魯卡因)、懸浮劑/分散劑(例如羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素、或聚乙烯吡咯烷酮)、螯合劑(例如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸))、乳化劑(例如聚山梨醇酯80(TWEEN-80))、稀釋劑、佐劑、輔料、或無毒輔助物質，其他本發明所屬技術領域習知的成分、或以上的多種組合。適用的成分可包括，例如，填充劑、黏合劑、崩解劑、緩衝液、防腐劑、潤滑劑、攪味劑、增稠劑、著色劑或乳化劑。
在某些實施例中，所述的藥物組合物為口服製劑。口服製劑包括，但不限於，膠囊、囊劑、藥丸、片劑、錠劑(用於味道的基底，通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠)、粉末、顆粒劑、或者是水或非水溶液或懸浮液、或者油包水或水包油的乳劑、或者是酏劑或糖漿、或者是糖果錠劑(適用惰性基質，如白明膠和甘油，或蔗糖或者阿拉伯膠)和/或漱口藥及其類似物。
在某些實施例中，口服的固體製劑(如膠囊、片劑、丸劑、糖衣丸、粉末、顆粒等)中包括所述的MG53突變體與一種或多種藥學上可接受 的載體，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，和/或以下物質：(1)填料或者補充劑，例如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇，和/或矽酸；(2)黏合劑，例如，羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖、和/或阿拉伯膠；(3)濕潤劑，例如，丙三醇；(4)分裂劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或者木薯澱粉、海藻酸、某些矽酸鹽、與碳酸鈉，(5)阻滯劑溶液，例如石蠟；(6)加速吸收劑，例如季銨化合物；(7)潤滑劑，例如，乙醯醇與單硬脂酸甘油酯；(8)吸收劑，例如高嶺土與皂土；(9)潤滑劑，例如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉、及其混合物；與(10)著色劑。
在某些實施例中，口服的液體製劑包括藥學可接受的乳劑、微乳劑、溶液劑、懸浮劑、糖漿劑和酏劑等。除了MG53突變體之外，液體劑型還可以含有常用的惰性稀釋劑，例如，水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑，如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯(甲)酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油類(特別地，棉籽油、花生油、玉米油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯、以及混合物。除了惰性稀釋液之外，口服組合物也可以添加佐劑例如，潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、調味劑、顏料、香料和防腐劑。
在某些實施例中，所述的藥物組合物為注射製劑。注射製劑包括無菌水溶液或分散液、混懸劑或乳劑。在所有情況下，所述的注射製劑應當無菌且應當是液體以方便注射。它在生產和貯存條件下應保持穩定，並應當抗微生物(例如細菌和真菌)的污染。載體可以是一種溶劑或分散介質，其包含，例如，水、乙醇、多羥基化合物(例如，甘油、丙二醇，以 及液體聚乙二醇等)及其適當的混合物和/或植物油。所述的注射製劑應保持適當的流動性，適當的流動性可透過多種方式維持，例如，透過使用如卵磷脂等塗層，使用表面活性劑等。可以透過加入各種抗菌和抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)來實現抗微生物污染。
在某些實施例中，所述的藥物組合物為口腔噴霧製劑或鼻腔噴霧製劑。所述噴霧製劑包括，但不限於，水性氣霧劑、非水性懸浮液、脂質體製劑或者固體顆粒製劑等。水性氣霧劑是透過將作用劑的水性溶液或者懸浮液和常規的藥學上可接受的載體與穩定劑一同配製。該載體與穩定劑根據特定化合物的需要而變化，但是其一般包括非離子型表面活性劑(TWEEN類、或聚乙二醇)、油酸、卵磷脂、胺基酸如甘胺酸，緩衝液、鹽、糖或者糖醇。氣霧劑通常由等滲溶液製備，可以透過噴霧器遞送。
在某些實施例中，所述的藥物組合物可以和一種或多種其他藥物混合使用。在某些實施例中，所述的組合物包含至少一種其他藥物。在某些實施例中，所述的其他藥物為心血管類藥物、用於治療腎臟疾病的藥物或者用於細胞修復的藥物等。
在某些實施例中，所述的藥物組合物可以透過適當的途徑遞送到給藥對象中，包括但不限於，透過口服途徑、注射途徑(如靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內注射、心內注射、鞘內注射、胸膜腔內注射、腹腔內注射等)、黏膜途徑(如鼻腔內給藥、口腔內給藥等)、舌下途徑、直腸途徑、經皮途徑、眼內途徑、肺部途徑。在某些實施例中，所述的藥物組合物可透過注射途徑給藥。
另一方面，本申請案係關於一種分離的核酸，其包含編碼本申請所述MG53突變體的胺基酸序列的核酸序列。
本申請中使用的術語「分離的」是指一種物質(例如多肽或者核酸)與它在自然界中正常存在的環境相分離或存在於與它在自然界中正常存在的環境不同的環境中。
本申請使用的術語「核酸」或「多聚核苷酸」指核糖核酸(RNA)、去氧核糖核酸(DNA)、或核糖核酸-去氧核糖核酸的混合物如DNA-RNA雜交物。核酸或多聚核苷酸可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA或DNA-RNA雜交物。核酸或多聚核苷酸可以是線性的或環狀的。本申請使用的術語「編碼」或「為......編碼」指能夠轉錄為mRNA和/或翻譯為肽或蛋白。「編碼序列」或「基因」指編碼mRNA、肽或蛋白的多聚核苷酸序列。在本申請案中這兩個術語可以互換使用。
在某些實施例中，所述分離的核酸包含SEQ ID NO：13~18所示的任一核酸序列。
SEQ ID NO：13是編碼SEQ ID NO：7所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖8。
SEQ ID NO：14是編碼SEQ ID NO：8所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖9。
SEQ ID NO：15是編碼SEQ ID NO：9所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖10。
SEQ ID NO：16是編碼SEQ ID NO：10所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖11。
SEQ ID NO：17是編碼SEQ ID NO：11所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖12。
SEQ ID NO：18是編碼SEQ ID NO：12所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖13。
在某些實施例中，所述分離的核酸包含SEQ ID NO：151~154所示的任一核酸序列。
SEQ ID NO：151是編碼SEQ ID NO：147所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖24。
SEQ ID NO：152是編碼SEQ ID NO：148所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖25。
SEQ ID NO：153是編碼SEQ ID NO：149所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖26。
SEQ ID NO：154是編碼SEQ ID NO：150所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖27。
在某些實施例中，本申請提供的分離的核酸包含與SEQ ID NOs：13~18、SEQ ID NOs：151~154所示的任一核酸序列具有至少70%同源性的核酸序列，例如，至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%的同源性，並且仍能編碼SEQ ID NOs：7~12、SEQ ID NOs：147~150所示的胺基酸序列之一。
在某些實施例中，本申請提供了編碼SEQ ID NOs：7~12、SEQ ID NOs：147~150的核酸序列，但其核酸序列由於遺傳密碼的簡併性而不同於SEQ ID NOs：13~18、SEQ ID NOs：151~154所示的任一核酸序列。
本申請中使用的術語「遺傳密碼的簡併性」是指，同一種胺基酸具有兩個或更多個對應的密碼子的現象。例如，脯胺酸具有4個同義密碼子CCU、CCC、CCA、CCG。本發明所屬技術領域中習知，由於核酸遺傳密碼的簡併性，可以將某已知核酸序列中的某些位置的核酸進行替換，但卻不改變編碼的胺基酸序列。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以很容易地進行遺傳密碼簡併性的替換，例如，透過鹼基的定點突變技術。不同生物體對不同的密碼子的偏好性存在區別，為在某個選定的生物細胞內表達本申請的多肽，可以選擇該生物細胞所偏好的密碼子，獲得相應的編碼序列，透過重組表現得到本申請的MG53突變體序列(例如SEQ ID NOs：7~12、SEQ ID NOs：147~150)。
另一方面，本申請案係關於一種重組載體，其包含本申請所述的MG53突變體的胺基酸序列的編碼序列。
本申請中的重組載體可以是，例如，DNA質體、細菌質體、病毒等。重組載體的非限制性例子為如Paul等，2002,Nature Biotechnology,19,505；Miyagishi and Taira,2002,Nature Biotechnology,19,497；Lee等，2002,Nature Biotechnology,19,500；以及Novina等，2002,Nature Medicine,advance online publication doi：10.1038/nm725中所描述的。所述重組載體中可以進一步含有啟動子，其與所述MG53突變體的胺基酸序列的編碼序列操作性連接，使得當所述重組載體進入宿主細胞後，所述啟動子能夠啟動編碼序列的表達。重組載體可以透過適當的方法導入宿主細胞，例如，但不限於，磷酸鈣轉染、脂質體轉染、電穿孔轉染、細菌熱休克等，具體的方法請參見，Sambrook等人編著的「分子選殖」(實驗手冊，冷泉港，1989)。 在某些實施例中，本申請所述的重組載體包含SEQ ID NO：13~18所示的任一核酸序列。
另一方面，本申請案係關於一種宿主細胞，其包含本申請所述的重組載體。
本申請中所述的宿主細胞可以是真核細胞，也可以是原核細胞。適當的真核細胞可以包括，例如，哺乳動物細胞，如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)。適當的原核細胞可以包括，例如，細菌，如大腸桿菌。
另一方面，本申請案係關於所述MG53突變體的製備方法，本申請提供的MG53突變體可以透過本發明所屬技術領域的已知技術來製備。例如，可以透過化學合成方法製備，也可以透過基因工程方法製備。
化學合成方法主要包括固相合成和液相合成兩種方法。固相多肽合成方法包括，例如Merrifield固相合成法，該方法已詳細記載在文獻“Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154”和“M.Bodanszky等人，"Peptide Synthesis",John Wiley & Sons,Second Edition,1976”以及“J.Meienhofer,"Hormonal Proteins and Peptides",Vol.2,p.46,Academic Press(New York),1983”中。在此透過引用例將這些文獻全文併入到本申請案中用作參考。Merrifield固相合成法主要包括以下步驟，根據目標多肽的胺基酸序列，先使被保護的羧基末端胺基酸與樹脂連接；連接後洗滌樹脂；脫去羧基末端胺基酸α氨基上的保護基(例如，叔丁氧羰基)，脫去這個保護基的時候必須要確保不斷裂該胺基酸和樹脂間的連接鍵；然後在所得的樹脂上偶聯倒數第二個羧基末端被保護的胺基酸，進行這一偶聯時，在第二個胺基酸的游離羧基和連在樹脂上的第一個胺基酸的胺基之間形成一個醯胺鍵；根據 目標多肽的胺基酸連接順序，依次重複前述反應過程，直到所有胺基酸都連接到樹脂上；最後，從樹脂上切落被保護的肽，脫去保護基即可得到目標多肽。本申請的多肽也可以透過液相合成方法製備，例如可以用標準的溶液肽合成法製備，該方法已詳細記載在文獻“E.Schroder and K.Kubke,"The Peptides",Vol.1,Academic Press(New York),1965”中。在此透過引用例將該文獻全文併入到本申請案中用作參考。液相合成法主要包括，利用形成醯胺鍵的化學或酶方法分步偶聯胺基酸或肽片段。
基因工程方法為利用編碼相應MG53突變體的核酸序列在適合的宿主細胞中表達生成相應突變體的方法。有關該方法的詳細描述可參考Sambrook等人編著的「分子選殖」(實驗手冊，冷泉港，1989)。在某些實施例中，本申請案的所述MG53突變體的製備方法包括確定需要進行突變的絲胺酸的一個或多個位置，對包含編碼野生型MG53胺基酸序列的核酸序列的質體的全長序列進行在所述位置的定點突變，將所述定點突變的質體轉染到宿主細胞，表達所述宿主細胞以產生所述MG53突變體。
本申請中使用的術語「定點突變」是指，向目的DNA片段中引入感興趣的變化，包括鹼基的添加、刪除、替換等。在某些實施例中，所述目的DNA片段為野生型MG53的編碼序列SEQ ID NOs：19~24、SEQ ID NOs：143~146，引入突變的位點位於所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY結構域的編碼序列中的一個或多個絲胺酸位點。
SEQ ID NO：19是編碼SEQ ID NO：1所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖2。
SEQ ID NO：20是編碼SEQ ID NO：2所示胺基酸序列的核酸序 列，其具體序列參見圖3。
SEQ ID NO：21是編碼SEQ ID NO：3所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖4。
SEQ ID NO：22是編碼SEQ ID NO：4所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖5。
SEQ ID NO：23是編碼SEQ ID NO：5所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖6。
SEQ ID NO：24是編碼SEQ ID NO：6所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖7。
SEQ ID NO：143是編碼SEQ ID NO：139所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖20。
SEQ ID NO：144是編碼SEQ ID NO：140所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖21。
SEQ ID NO：145是編碼SEQ ID NO：141所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖22。
SEQ ID NO：146是編碼SEQ ID NO：142所示胺基酸序列的核酸序列，其具體序列參見圖23。
在某些實施例中，所述定點突變包括如下步驟：確定需要定點突變的胺基酸在cDNA序列中相應的核苷酸位置，根據突變後的胺基酸修改突變位置的核苷酸序列，並截取包含突變位置的長度為20~40bp的序列設計引子；以野生型MG53質體為範本，使用步驟(1)中設計的引子進行PCR 反應，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，並對PCR產物進行純化；步驟(2)中純化後的PCR產物使用核酸限制性內切酶進行酶切反應，並將酶切產物與合適的質體表達載體進行連接，將連接產物進行細菌勝任細胞的轉化，培養。
在某些實施例中，所述定點突變進一步包括如下步驟：挑取步驟(3)所得殖株使用步驟(1)所設計的引子進行菌落PCR鑒定，對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，然後進行DNA測序鑒定，鑒定出帶有所述定點突變的陽性殖株。
可以使用各種市售的定點突變試劑盒對野生型MG53進行定點突變，例如參考北京全式金公司的Easy Mutagenesis System試劑盒的說明書，其中詳細記載了定點突變的方法和步驟。
另一方面，本申請案係關於所述MG53突變體在製備用於治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組識損傷相關疾病的藥物中的用途。在某些實施例中，所述藥物在治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的同時，避免或減少了代謝類副作用，例如胰島素抗性、肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常等副作用。在某些實施例中，所述心臟疾病是與心肌損傷相關的疾病，包括但不限於，糖尿病性心臟病、心肌缺血、心臟缺血/再灌注損傷、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心臟破裂、心絞痛、心肌炎、冠心病、心包炎。在某些實施例中，所述糖尿病腦血管疾病包括但不限於，腦動脈硬化、缺血性腦血管病、腦出血、腦萎縮、腦梗塞。在某 些實施例中，所述糖尿病眼部併發症包括但不限於，糖尿病性視網膜病變、糖尿病性白內障、與糖尿病相關的葡萄膜炎、失明。在某些實施例中，所述糖尿病神經病變包括但不限於，糖尿病周圍神經病變。在某些實施例中，所述腎臟疾病包括但不限於，急性腎小球腎炎、慢性腎小球腎炎、腎病症候群、急性腎損傷、糖尿病腎病等。在某些實施例中，所述與細胞和/或組織損傷相關疾病包括但不限於與腎臟、腦、肺部、肝臟、心臟、脾臟、消化道的細胞和/或組織損傷相關的疾病、皮膚損傷相關的疾病，例如，腦損傷、肺損傷、脾臟損傷、脾臟破裂、胃潰瘍、胃炎、胃穿孔、消化道黏膜損傷、外傷、燒傷、潰瘍、黏膜炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、中風、皮膚老化等。在某些實施例中，本申請案係關於SEQ ID NO：7所示的多肽在製備用於治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的藥物中的用途。在某些實施例中，本申請案係關於SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149或者SEQ ID NO：150所示的多肽在製備用於治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的藥物中的用途。
另一方面，本申請案係關於一種治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的方法，包括給予需要的對象治療有效量的所述MG53突變體。在某些實施例中，所述MG53突變體在治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的同時，避免或減少了代謝類副作用， 例如胰島素抗性、肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常等副作用。在某些實施例中，所述心臟疾病是與心肌損傷相關的疾病，包括但不限於，糖尿病性心臟病、心肌缺血、心臟缺血/再灌注損傷、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心臟破裂、心絞痛、心肌炎、冠心病、心包炎。在某些實施例中，所述糖尿病腦血管疾病包括但不限於，腦動脈硬化、缺血性腦血管病、腦出血、腦萎縮、腦梗塞。在某些實施例中，所述糖尿病眼部併發症包括但不限於，糖尿病性視網膜病變、糖尿病性白內障、與糖尿病相關的葡萄膜炎、失明。在某些實施例中，所述糖尿病神經病變包括但不限於，糖尿病周圍神經病變。在某些實施例中，所述腎臟疾病包括但不限於，急性腎小球腎炎、慢性腎小球腎炎、腎病症候群、急性腎損傷、糖尿病腎病等。在某些實施例中，所述與細胞和/或組織損傷相關疾病包括但不限於與腎臟、腦、肺部、肝臟、心臟、脾臟、消化道的細胞和/或組織損傷相關的疾病、皮膚損傷相關的疾病，例如，腦損傷、肺損傷、脾臟損傷、脾臟破裂、胃潰瘍、胃炎、胃穿孔、消化道黏膜損傷、外傷、燒傷、潰瘍、黏膜炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、中風、皮膚老化等。在某些實施例中，本申請案係關於一種治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的方法，包括給予需要的對象治療有效量的SEQ ID NO：7所示的多肽。在某些實施例中，本申請案係關於一種治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的方法，包括給予需要的對象治療有效量的SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149或者SEQ ID NO：150所示的多肽。
本申請中使用的術語「治療有效量」是指，可以實現抑制或緩解對象的疾病或症狀，或者可以預防性地抑制或防止疾病或症狀發生的藥物的量。治療有效量可以是將對象的一種或多種疾病或症狀緩解到一定程度的藥物的量；可以將那些跟疾病或症狀成因相關的一種或多種生理或生物化學參數部分或完全恢復到正常的藥物的量；和/或可以降低疾病或症狀發生的可能性的藥物的量。
另一方面，本申請案係關於用於治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的MG53突變體。在某些實施例中，所述MG53突變體在治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的同時，避免了代謝類副作用，例如胰島素抗性、肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常等副作用。在某些實施例中，所述心臟疾病是與心肌損傷相關的疾病，包括但不限於，糖尿病性心臟病、心肌缺血、心臟缺血/再灌注損傷、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心臟破裂、心絞痛、心肌炎、冠心病、心包炎。在某些實施例中，所述糖尿病腦血管疾病包括但不限於，腦動脈硬化、缺血性腦血管病、腦出血、腦萎縮、腦梗塞。在某些實施例中，所述糖尿病眼部併發症包括但不限於，糖尿病性視網膜病變、糖尿病性白內障、與糖尿病相關的葡萄膜炎、失明。在某些實施例中，所述糖尿病神經病變包括但不限於，糖尿病周圍神經病變。在某些實施例中，所述腎臟疾病包括但不限於，急性腎小球腎炎、慢性腎小球腎炎、腎病症候群、急性腎損傷、糖尿病腎病等。在某些實施例中，所述與細胞和/或組織損傷相關疾病包括但 不限於與腎臟、腦、肺部、肝臟、心臟、脾臟、消化道的細胞和/或組織損傷相關的疾病、皮膚損傷相關的疾病，例如，腦損傷、肺損傷、脾臟損傷、脾臟破裂、胃潰瘍、胃炎、胃穿孔、消化道黏膜損傷、外傷、燒傷、潰瘍、黏膜炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、中風、皮膚老化等。在某些實施例中，本申請案係關於用於治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的SEQ ID NO：7所示的多肽。在某些實施例中，本申請案係關於用於治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149或者SEQ ID NO：150所示的多肽。
具體實施例
所有實施例中的涉及的生物學材料如大腸桿菌菌株、各種殖豬與表現質體、培養基、工具酶、緩衝液，和各種培養方法、蛋白提取和純化方法、其它的分子生物學操作方法，均為該領域技術人員所熟悉，可以參考Sambrook等人編著的「分子選殖」(實驗室手冊，冷泉港，1989)及「精編分子生物學實驗指南」(美/F.奧斯伯等著，顏子穎等譯，北京，科學出版社，1998)。
實施例1：MG53突變體的製備
1. 人MG53突變體的製備
人MG53 S255A突變體
(1)設計突變引子：確定需要點突變的胺基酸在cDNA序列中相 應核苷酸位置，對照胺基酸密碼子表，根據突變後的胺基酸修改突變位置的核苷酸序列，並截取突變位置上游20bp和下游10bp間的序列設計引子。引子序列如下：
人MG53 S255A正向引子：tgcagaagatcctggcagaggctcccccacccg(SEQ ID NO：25)
人MG53 S255A反向引子：tccagacgggcgggtgggggagcctctgccagg(SEQ ID NO：26)
(2)質體全長選殖的聚合酶鏈式反應(PCR)：以原基因表達質體為範本，使用設計的點突變引子，利用高保真Taq酶進行PCR反應，整個基因表達質體。反應體系和反應條件參照如下：
Figure TW201805299AD00001
(3)PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳：PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，以鑒定它的純度和數量。
(4)PCR產物的乙醇沉澱：對於大小正確且條帶單一的PCR產物，以乙醇沉澱的方法進行純化。
(5)Dpn I酶切：純化後的PCR產物使用核酸限制性內切酶Dpn I進行酶切反應。
(6)酶切產物的轉化：對Dpn I酶切產物進行細菌勝任細胞的轉 化，塗佈至合適的篩選平板上進行培養。
(7)陽性殖株的鑒定：挑取大小合適殖株進行菌落PCR鑒定，對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，對於條帶清晰並且大小正確的殖株進行小體積搖菌擴增培養，然後進行測序鑒定。
按照相同的方法製備人MG53 S255G、S255L、S255V、S255P、S255F、S255W、S255Q、S255C、S255Y、S255D、S255R、S211A、S214A、S246A、S269A、S296A、S297A突變體。除了突變引子不同之外，其他步驟均與人MG53 S255A突變體的製備步驟相同。各突變體的引子如下所示：
(i)人MG53 S255G的正向和反向引子，人MG53 S255G表示人的野生型MG53(即，SEQ ID NO：1)的第255位絲胺酸突變為甘胺酸的MG53突變體。
人MG53 S255G正向引子：tgcagaagatcctggcagagggtcccccacccg(SEQ ID NO：27)
人MG53 S255G反向引子：tccagacgggcgggtgggggaccctctgccagg(SEQ ID NO：28)
(ii)人MG53 S255L的正向和反向引子，人MG53 S255L表示人的野生型MG53(即，SEQ ID NO：1)的第255位絲胺酸突變為亮胺酸的MG53突變體。
人MG53 S255L正向引子：tgcagaagatcctggcagagcttcccccacccg(SEQ ID NO：29)
人MG53 S255L反向引子：tccagacgggcgggtgggggaagctctgccagg(SEQ ID NO：30)
(iii)人MG53 S255V的正向和反向引子，人MG53 S255V表示人的野生型MG53(即，SEQ ID NO：1)的第255位絲胺酸突變為纈胺酸的MG53突變體。
人MG53 S255V正向引子：tgcagaagatcctggcagaggttcccccacccg(SEQ ID NO：31)
人MG53 S255V反向引子：tccagacgggcgggtgggggaacctctgccagg(SEQ ID NO：32)
(iv)人MG53 S255P的正向和反向引子，人MG53 S255P表示人的野生型MG53(即，SEQ ID NO：1)的第255位絲胺酸突變為脯胺酸的MG53突變體。
人MG53 S255P正向引子：tgcagaagatcctggcagagcctcccccacccg(SEQ ID NO：33)
人MG53 S255P反向引子：tccagacgggcgggtgggggaggctctgccagg(SEQ ID NO：34)
(v)人MG53 S255F的正向和反向引子，人MG53 S255F表示人的野生型MG53(即，SEQ ID NO：1)的第255位絲胺酸突變為苯丙胺酸的MG53突變體。
人MG53 S255F正向引子：tgcagaagatcctggcagagtttcccccacccg(SEQ ID NO：35)
人MG53 S255F反向引子：tccagacgggcgggtgggggaaactctgccagg(SEQ ID NO：36)
(vi)人MG53 S255W的正向和反向引子，人MG53 S255W表示 人的野生型MG53(即，SEQ ID NO：1)的第255位絲胺酸突變為色胺酸的MG53突變體。
人MG53 S255W正向引子：tgcagaagatcctggcagagtggcccccacccg(SEQ ID NO：37)
人MG53 S255W反向引子：tccagacgggcgggtgggggccactctgccagg(SEQ ID NO：38)
(vii)人MG53 S255Q的正向和反向引子，人MG53 S255Q表示人的野生型MG53(即，SEQ ID NO：1)的第255位絲胺酸突變為穀氨醯胺的MG53突變體。
人MG53 S255Q正向引子：tgcagaagatcctggcagagcaacccccacccg(SEQ ID NO：39)
人MG53 S255Q反向引子：tccagacgggcgggtgggggttgctctgccagg(SEQ ID NO：40)
(viii)人MG53 S255C的正向和反向引子，人MG53 S255C表示人的野生型MG53(即，SEQ ID NO：1)的第255位絲胺酸突變為半胱胺酸的MG53突變體。
人MG53 S255C正向引子：tgcagaagatcctggcagagtgtcccccacccg(SEQ ID NO：41)
人MG53 S255C反向引子：tccagacgggcgggtgggggacactctgccagg(SEQ ID NO：42)
(ix)人MG53 S255Y的正向和反向引子，人MG53 S255Y表示人的野生型MG53(即，SEQ ID NO：1)的第255位絲胺酸突變為酪胺酸的MG53 突變體。
人MG53 S255Y正向引子：tgcagaagatcctggcagagtatcccccacccg(SEQ ID NO：43)
人MG53 S255Y反向引子：tccagacgggcgggtgggggatactctgccagg(SEQ ID NO：44)
(x)人MG53 S255D的正向和反向引子，人MG53 S255D表示人的野生型MG53(即，SEQ ID NO：1)的第255位絲胺酸突變為天冬胺酸的MG53突變體。
人MG53 S255D正向引子：tgcagaagatcctggcagaggatcccccacccg(SEQ ID NO：45)
人MG53 S255D反向引子：tccagacgggcgggtgggggctactctgccagg(SEQ ID NO：46)
(xi)人MG53 S255R的正向和反向引子，人MG53 S255R表示人的野生型MG53(即，SEQ ID NO：1)的第255位絲胺酸突變為精胺酸的MG53突變體。
人MG53 S255R正向引子：tgcagaagatcctggcagagcgtcccccacccg(SEQ ID NO：47)
人MG53 S255R反向引子：tccagacgggcgggtgggggacgctctgccagg(SEQ ID NO：48)
(xii)人MG53 S211A的正向和反向引子，人MG53 S211A表示人的野生型MG53(即，SEQ ID NO：1)的第211位絲胺酸突變為丙胺酸的MG53突變體。
人MG53 S211A正向引子：ccttgcgccgggagctgggggccctgaactctt(SEQ ID NO：49)
人MG53 S211A反向引子：gctgctccaggtaagagttcagggcccccagctcc(SEQ ID NO：50)
(xiii)人MG53 S214A的正向和反向引子，人MG53 S214A表示人的野生型MG53(即，SEQ ID NO：1)的第214位絲胺酸突變為丙胺酸的MG53突變體。
人MG53 S214A正向引子：gggagctggggagcctgaacgcttacctggagc(SEQ ID NO：51)
人MG53 S214A反向引子：tgccgcagctgctccaggtaagcgttcaggctc(SEQ ID NO：52)
(xiv)人MG53 S246A的正向和反向引子，人MG53 S246A表示人的野生型MG53(即，SEQ ID NO：1)的第246位絲胺酸突變為丙胺酸的MG53突變體。
人MG53 S246A正向引子：tgaaatactgcctggtgaccgccaggctgcaga(SEQ ID NO：53)
人MG53 S246A反向引子：gccaggatcttctgcagcctggcggtcaccagg(SEQ ID NO：54)
(xv)人MG53 S269A的正向和反向引子，人MG53 S269A表示人的野生型MG53(即，SEQ ID NO：1)的第269位絲胺酸突變為丙胺酸的MG53突變體。
人MG53 S269A正向引子：aggagctgacctttgacccggcctctgcgcacc(SEQ ID NO：55)
人MG53 S296A反向引子：accaggctcgggtgcgcagaggccgggtcaaag(SEQ ID NO：56)
(xvi)人MG53 S297A的正向和反向引子，人MG53 S297A表示人的野生型MG53(即，SEQ ID NO：1)的第297位絲胺酸突變為丙胺酸的MG53突變體。
人MG53 S297A正向引子：agctgacctttgacccgagcgctgcgcacccga(SEQ ID NO：57)
人MG53 S297A反向引子：accaccaggctcgggtgcgcagcgctcgggtca(SEQ ID NO：58)
2. 小鼠MG53突變體的製備
按照人MG53 S255A突變體相同的方法製備小鼠MG53 S255A、S255G、S255L、S255W、S255Q、S255Y、S255D、S255R突變體。除了突變引子不同之外，其他步驟均與人MG53 S255A突變體的製備步驟相同。各突變體的引子如下所示：
(i)小鼠MG53 S255A的正向和反向引子，小鼠MG53 S255A表示小鼠的野生型MG53(即，SEQ ID NO：2)的第255位絲胺酸突變為丙胺酸的MG53突變體。
小鼠MG53 S255A正向引子：tgcagaagatcctgtcagaggcaccaccaccgg(SEQ ID NO：59)
小鼠MG53 S255A反向引子：tctagccttgccggtggtggtgcctctgacagg(SEQ ID NO：60)
(ii)小鼠MG53 S255G的正向和反向引子，小鼠MG53 S255G表示小鼠的野生型MG53(即，SEQ ID NO：2)的第255位絲胺酸突變為甘胺酸的MG53突變體。
小鼠MG53 S255G正向引子：tgcagaagatcctgtcagagggaccaccaccgg(SEQ ID NO：61)
小鼠MG53 S255G反向引子：tctagccttgccggtggtggtccctctgacagg(SEQ ID NO：62)
(iii)小鼠MG53 S255L的正向和反向引子，小鼠MG53 S255L表示小鼠的野生型MG53(即，SEQ ID NO：2)的第255位絲胺酸突變為亮胺酸的MG53突變體。
小鼠MG53 S255L正向引子：tgcagaagatcctgtcagagttaccaccaccgg(SEQ ID NO：63)
小鼠MG53 S255L反向引子：tctagccttgccggtggtggtaactctgacagg(SEQ ID NO：64)
(iv)小鼠MG53 S255W的正向和反向引子，小鼠MG53 S255W表示小鼠的野生型MG53(即，SEQ ID NO：2)的第255位絲胺酸突變為色胺酸的MG53突變體。
小鼠MG53 S255W正向引子：tgcagaagatcctgtcagagtggccaccaccgg(SEQ ID NO：65)
小鼠MG53 S255W反向引子：tctagccttgccggtggtggccactctgacagg(SEQ ID NO：66)
(v)小鼠MG53 S255Q的正向和反向引子，小鼠MG53 S255Q表 示小鼠的野生型MG53(即，SEQ ID NO：2)的第255位絲胺酸突變為穀氨醯胺的MG53突變體。
小鼠MG53 S255Q正向引子：tgcagaagatcctgtcagagcaaccaccaccgg(SEQ ID NO：67)
小鼠MG53 S255Q反向引子：tctagccttgccggtggtggttgctctgacagg(SEQ ID NO：68)
(vi)小鼠MG53 S255Y的正向和反向引子，小鼠MG53 S255Y表示小鼠的野生型MG53(即，SEQ ID NO：2)的第255位絲胺酸突變為酪胺酸的MG53突變體。
小鼠MG53 S255Y正向引子：tgcagaagatcctgtcagagtatccaccaccgg(SEQ ID NO：69)
小鼠MG53 S255Y反向引子：tctagccttgccggtggtggatactctgacagg(SEQ ID NO：70)
(vii)小鼠MG53 S255D的正向和反向引子，小鼠MG53 S255D表示小鼠的野生型MG53(即，SEQ ID NO：2)的第255位絲胺酸突變為天冬胺酸的MG53突變體。
小鼠MG53 S255D正向引子：tgcagaagatcctgtcagaggatccaccaccgg(SEQ ID NO：71)
小鼠MG53 S255D反向引子：tctagccttgccggtggtggatcctctgacagg(SEQ ID NO：72)
(viii)小鼠MG53 S255R的正向和反向引子，小鼠MG53 S255R表示小鼠的野生型MG53(即，SEQ ID NO：2)的第255位絲胺酸突變為精 胺酸的MG53突變體。
小鼠MG53 S255R正向引子：tgcagaagatcctgtcagagcgaccaccaccgg(SEQ ID NO：73)
小鼠MG53 S255R反向引子：tctagccttgccggtggtggtcgctctgacagg(SEQ ID NO：74)
3. 大鼠MG53突變體的製備
按照人MG53 S255A突變體相同的方法製備大鼠MG53 S255A、S255G、S255L、S255W、S255Q、S255Y、S255D、S255R突變體。除了突變引子不同之外，其他步驟均與人MG53 S255A突變體的製備步驟相同。各突變體的引子如下所示：
(i)大鼠MG53 S255A的正向和反向引子，大鼠MG53 S255A表示大鼠的野生型MG53(即，SEQ ID NO：3)的第255位絲胺酸突變為丙胺酸的MG53突變體。
大鼠MG53 S255A正向引子：tgcagaagattctgtcagaggcaccacccccag(SEQ ID NO：75)
大鼠MG53 S255A反向引子：tctagccttgctgggggtggtgcctctgacaga(SEQ ID NO：76)
(ii)大鼠MG53 S255G的正向和反向引子，大鼠MG53 S255G表示大鼠的野生型MG53(即，SEQ ID NO：3)的第255位絲胺酸突變為甘胺酸的MG53突變體。
大鼠MG53 S255G正向引子：tgcagaagattctgtcagagggaccacccccag(SEQ ID NO：77)
大鼠MG53 S255G反向引子：tctagccttgctgggggtggtccctctgacaga(SEQ ID NO：78)
(iii)大鼠MG53 S255L的正向和反向引子，大鼠MG53 S255L表示大鼠的野生型MG53(即，SEQ ID NO：3)的第255位絲胺酸突變為亮胺酸的MG53突變體。
大鼠MG53 S255L正向引子：tgcagaagattctgtcagagttaccacccccag(SEQ ID NO：79)
大鼠MG53 S255L反向引子：tctagccttgctgggggtggtaactctgacaga(SEQ ID NO：80)
(iv)大鼠MG53 S255W的正向和反向引子，大鼠MG53 S255W表示大鼠的野生型MG53(即，SEQ ID NO：3)的第255位絲胺酸突變為色胺酸的MG53突變體。
大鼠MG53 S255W正向引子：tgcagaagattctgtcagagtggccacccccag(SEQ ID NO：81)
大鼠MG53 S255W反向引子：tctagccttgctgggggtggccactctgacaga(SEQ ID NO：82)
(v)大鼠MG53 S255Q的正向和反向引子，大鼠MG53 S255Q表示大鼠的野生型MG53(即，SEQ ID NO：3)的第255位絲胺酸突變為穀氨醯胺的MG53突變體。
大鼠MG53 S255Q正向引子：tgcagaagattctgtcagagcaaccacccccag(SEQ ID NO：83)
大鼠MG53 S255Q反向引子：tctagccttgctgggggtggttgctctgacaga (SEQ ID NO：84)
(vi)大鼠MG53 S255Y的正向和反向引子，大鼠MG53 S255Y表示大鼠的野生型MG53(即，SEQ ID NO：3)的第255位絲胺酸突變為酪胺酸的MG53突變體。
大鼠MG53 S255Y正向引子：tgcagaagattctgtcagagtatccacccccag(SEQ ID NO：85)
大鼠MG53 S255Y反向引子：tctagccttgctgggggtggatactctgacaga(SEQ ID NO：86)
(vii)大鼠MG53 S255D的正向和反向引子，大鼠MG53 S255D表示大鼠的野生型MG53(即，SEQ ID NO：3)的第255位絲胺酸突變為天冬胺酸的MG53突變體。
大鼠MG53 S255D正向引子：tgcagaagattctgtcagaggatccacccccag(SEQ ID NO：87)
大鼠MG53 S255D反向引子：tctagccttgctgggggtggatcctctgacaga(SEQ ID NO：88)
(viii)大鼠MG53 S255R的正向和反向引子，大鼠MG53 S255R表示大鼠的野生型MG53(即，SEQ ID NO：3)的第255位絲胺酸突變為精胺酸的MG53突變體。
大鼠MG53 S255R正向引子：tgcagaagattctgtcagagcgaccacccccag(SEQ ID NO：89)
大鼠MG53 S255R反向引子：tctagccttgctgggggtggtcgctctgacaga(SEQ ID NO：90)
4. 猴子MG53突變體的製備
按照人MG53 S255A突變體相同的方法製備猴子MG53 S255A、S255G、S255L、S255W、S255Q、S255Y、S255D、S255R突變體。除了突變引子不同之外，其他步驟均與人MG53 S255A突變體的製備步驟相同。各突變體的引子如下所示：
(i)猴子MG53 S255A的正向和反向引子，猴子MG53 S255A表示猴子的野生型MG53(即，SEQ ID NO：4)的第255位絲胺酸突變為丙胺酸的MG53突變體。
猴子MG53 S255A正向引子：aagatcctggcagaggctcccccacccgcccgtctg(SEQ ID NO：91)
猴子MG53 S255A反向引子：cagacgggcgggtgggggagcctctgccaggatctt(SEQ ID NO：92)
(ii)猴子MG53 S255G的正向和反向引子，猴子MG53 S255G表示猴子的野生型MG53(即，SEQ ID NO：4)的第255位絲胺酸突變為甘胺酸的MG53突變體。
猴子MG53 S255G正向引子：aagatcctggcagagggtcccccacccgcccgtctgg(SEQ ID NO：93)
猴子MG53 S255G反向引子：ccagacgggcgggtgggggaccctctgccaggatctt(SEQ ID NO：94)
(iii)猴子MG53 S255L的正向和反向引子，猴子MG53 S255L表示猴子的野生型MG53(即，SEQ ID NO：4)的第255位絲胺酸突變為亮胺酸的MG53突變體。
猴子MG53 S255L正向引子：agatcctggcagagttacccccacccgcccgtctgga(SEQ ID NO：95)
猴子MG53 S255L反向引子：tccagacgggcgggtgggggtaactctgccaggatct(SEQ ID NO：96)
(iv)猴子MG53 S255W的正向和反向引子，猴子MG53 S255W表示猴子的野生型MG53(即，SEQ ID NO：4)的第255位絲胺酸突變為色胺酸的MG53突變體。
猴子MG53 S255W正向引子：agatcctggcagagtggcccccacccgcccgtctgga(SEQ ID NO：97)
猴子MG53 S255W反向引子：tccagacgggcgggtgggggccactctgccaggatct(SEQ ID NO：98)
(v)猴子MG53 S255Q的正向和反向引子，猴子MG53 S255Q表示猴子的野生型MG53(即，SEQ ID NO：4)的第255位絲胺酸突變為穀氨醯胺的MG53突變體。
猴子MG53 S255Q正向引子：aagatcctggcagagcaacccccacccgcccgtctgga(SEQ ID NO：99)
猴子MG53 S255Q反向引子：tccagacgggcgggtgggggttgctctgccaggatctt(SEQ ID NO：100)
(vi)猴子MG53 S255Y的正向和反向引子，猴子MG53 S255Y表示猴子的野生型MG53(即，SEQ ID NO：4)的第255位絲胺酸突變為酪胺酸的MG53突變體。
猴子MG53 S255Y正向引子：agatcctggcagagtatcccccacccgcccgtctgg (SEQ ID NO：101)
猴子MG53 S255Y反向引子：ccagacgggcgggtgggggatactctgccaggatct(SEQ ID NO：102)
(vii)猴子MG53 S255D的正向和反向引子，猴子MG53 S255D表示猴子的野生型MG53(即，SEQ ID NO：4)的第255位絲胺酸突變為天冬胺酸的MG53突變體。
猴子MG53 S255D正向引子：aagatcctggcagaggatcccccacccgcccgtctgg(SEQ ID NO：103)
猴子MG53 S255D反向引子：ccagacgggcgggtgggggatcctctgccaggatctt(SEQ ID NO：104)
(viii)猴子MG53 S255R的正向和反向引子，猴子MG53 S255R表示猴子的野生型MG53(即，SEQ ID NO：4)的第255位絲胺酸突變為精胺酸的MG53突變體。
猴子MG53 S255R正向引子：aagatcctggcagagcgtcccccacccgcccgtctgg(SEQ ID NO：105)
猴子MG53 S255R反向引子：ccagacgggcgggtgggggacgctctgccaggatctt(SEQ ID NO：106)
5. 豬MG53突變體的製備
按照人MG53 S255A突變體相同的方法製備豬MG53 S255A、S255G、S255L、S255W、S255Q、S255Y、S255D、S255R突變體。除了突變引子不同之外，其他步驟均與人MG53 S255A突變體的製備步驟相同。各突變體的引子如下所示：
(i)豬MG53 S255A的正向和反向引子，豬MG53 S255A表示豬的野生型MG53(即，SEQ ID NO：5)的第255位絲胺酸突變為丙胺酸的MG53突變體。
豬MG53 S255A正向引子：aagatcctggcagaggcgcccccacctgcccgcctg(SEQ ID NO：107)
豬MG53 S255A反向引子：caggcgggcaggtgggggcgcctctgccaggatctt(SEQ ID NO：108)
(ii)豬MG53 S255G的正向和反向引子，豬MG53 S255G表示豬的野生型MG53(即，SEQ ID NO：5)的第255位絲胺酸突變為甘胺酸的MG53突變體。
豬MG53 S255G正向引子：aagatcctggcagaggggcccccacctgcccgcctgg(SEQ ID NO：109)
豬MG53 S255G反向引子：ccaggcgggcaggtgggggcccctctgccaggatctt(SEQ ID NO：110)
(iii)豬MG53 S255L的正向和反向引子，豬MG53 S255L表示豬的野生型MG53(即，SEQ ID NO：5)的第255位絲胺酸突變為亮胺酸的MG53突變體。
豬MG53 S255L正向引子：agatcctggcagagttgcccccacctgcccgcctgg(SEQ ID NO：111)
豬MG53 S255L反向引子：ccaggcgggcaggtgggggcaactctgccaggatct(SEQ ID NO：112)
(iv)豬MG53 S255W的正向和反向引子，豬MG53 S255W表示 豬的野生型MG53(即，SEQ ID NO：5)的第255位絲胺酸突變為色胺酸的MG53突變體。
豬MG53 S255W正向引子：agatcctggcagagtggcccccacctgcccgcctgg(SEQ ID NO：113)
豬MG53 S255W反向引子：ccaggcgggcaggtgggggccactctgccaggatct(SEQ ID NO：114)
(v)豬MG53 S255Q的正向和反向引子，豬MG53 S255Q表示豬的野生型MG53(即，SEQ ID NO：5)的第255位絲胺酸突變為穀氨醯胺的MG53突變體。
豬MG53 S255Q正向引子：aagatcctggcagagcagcccccacctgcccgcctgg(SEQ ID NO：115)
豬MG53 S255Q反向引子：ccaggcgggcaggtgggggctgctctgccaggatctt(SEQ ID NO：116)
(vi)豬MG53 S255Y的正向和反向引子，豬MG53 S255Y表示豬的野生型MG53(即，SEQ ID NO：5)的第255位絲胺酸突變為酪胺酸的MG53突變體。
豬MG53 S255Y正向引子：agatcctggcagagtatcccccacctgcccgcctgga(SEQ ID NO：117)
豬MG53 S255Y反向引子：tccaggcgggcaggtgggggatactctgccaggatct(SEQ ID NO：118)
(vii)豬MG53 S255D的正向和反向引子，豬MG53 S255D表示豬的野生型MG53(即，SEQ ID NO：5)的第255位絲胺酸突變為天冬胺酸的 MG53突變體。
豬MG53 S255D正向引子：aagatcctggcagaggatcccccacctgcccgcctgga(SEQ ID NO：119)
豬MG53 S255D反向引子：tccaggcgggcaggtgggggatcctctgccaggatctt(SEQ ID NO：120)
(viii)豬MG53 S255R的正向和反向引子，豬MG53 S255R表示豬的野生型MG53(即，SEQ ID NO：5)的第255位絲胺酸突變為精胺酸的MG53突變體。
豬MG53 S255R正向引子：aagatcctggcagagcggcccccacctgcccgcctgg(SEQ ID NO：121)
豬MG53 S255R反向引子：ccaggcgggcaggtgggggccgctctgccaggatctt(SEQ ID NO：122)
6. 狗MG53突變體的製備
按照人MG53 S255A突變體相同的方法製備狗MG53 S255A、S255G、S255L、S255W、S255Q、S255Y、S255D、S255R突變體。除了突變引子不同之外，其他步驟均與人MG53 S255A突變體的製備步驟相同。各突變體的引子如下所示：
(i)狗MG53 S255A的正向和反向引子，狗MG53 S255A表示狗的野生型MG53(即，SEQ ID NO：6)的第255位絲胺酸突變為丙胺酸的MG53突變體。
狗MG53 S255A正向引子：aagatcctggcagaagcaccaccgcctgcccgtttg(SEQ ID NO：123)
狗MG53 S255A反向引子：caaacgggcaggcggtggtgcttctgccaggatctt(SEQ ID NO：124)
(ii)狗MG53 S255G的正向和反向引子，狗MG53 S255G表示狗的野生型MG53(即，SEQ ID NO：6)的第255位絲胺酸突變為甘胺酸的MG53突變體。
狗MG53 S255G正向引子：aagatcctggcagaaggaccaccgcctgcccgtttgg(SEQ ID NO：125)
狗MG53 S255G反向引子：ccaaacgggcaggcggtggtccttctgccaggatctt(SEQ ID NO：126)
(iii)狗MG53 S255L的正向和反向引子，狗MG53 S255L表示狗的野生型MG53(即，SEQ ID NO：6)的第255位絲胺酸突變為亮胺酸的MG53突變體。
狗MG53 S255L正向引子：agatcctggcagaattaccaccgcctgcccgtttgg(SEQ ID NO：127)
狗MG53 S255L反向引子：ccaaacgggcaggcggtggtaattctgccaggatct(SEQ ID NO：128)
(iv)狗MG53 S255W的正向和反向引子，狗MG53 S255W表示狗的野生型MG53(即，SEQ ID NO：6)的第255位絲胺酸突變為色胺酸的MG53突變體。
狗MG53 S255W正向引子：agatcctggcagaatggccaccgcctgcccgtttgga(SEQ ID NO：129)
狗MG53 S255W反向引子：tccaaacgggcaggcggtggccattctgccaggatct (SEQ ID NO：130)
(v)狗MG53 S255Q的正向和反向引子，狗MG53 S255Q表示狗的野生型MG53(即，SEQ ID NO：6)的第255位絲胺酸突變為穀氨醯胺的MG53突變體。
狗MG53 S255Q正向引子：aagatcctggcagaacaaccaccgcctgcccgtttgg(SEQ ID NO：131)
狗MG53 S255Q反向引子：ccaaacgggcaggcggtggttgttctgccaggatctt(SEQ ID NO：132)
(vi)狗MG53 S255Y的正向和反向引子，狗MG53 S255Y表示狗的野生型MG53(即，SEQ ID NO：6)的第255位絲胺酸突變為酪胺酸的MG53突變體。
狗MG53 S255Y正向引子：agatcctggcagaatatccaccgcctgcccgtttgga(SEQ ID NO：133)
狗MG53 S255Y反向引子：tccaaacgggcaggcggtggatattctgccaggatct(SEQ ID NO：134)
(vii)狗MG53 S255D的正向和反向引子，狗MG53 S255D表示狗的野生型MG53(即，SEQ ID NO：6)的第255位絲胺酸突變為天冬胺酸的MG53突變體。
狗MG53 S255D正向引子：aagatcctggcagaagatccaccgcctgcccgtttgga(SEQ ID NO：135)
狗MG53 S255D反向引子：tccaaacgggcaggcggtggatcttctgccaggatctt(SEQ ID NO：136)
(viii)狗MG53 S255R的正向和反向引子，狗MG53 S255R表示狗的野生型MG53(即，SEQ ID NO：6)的第255位絲胺酸突變為精胺酸的MG53突變體。
狗MG53 S255R正向引子：aagatcctggcagaacgaccaccgcctgcccgtttgg(SEQ ID NO：137)
狗MG53 S255R反向引子：ccaaacgggcaggcggtggtcgttctgccaggatctt(SEQ ID NO：138)
可以按照人MG53 S255A突變體相同的方法製備其他物種MG53各位點絲胺酸缺失和/或突變的突變體。除了突變引子不同之外，其他步驟均與人MG53 S255A突變體的製備步驟相同。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以使用本領域常規技術手段設計各突變體的引子。
實施例2：小鼠MG53 S255A突變體對小鼠野生型MG53的細胞修復功能和心臟保護功能的影響
為了驗證小鼠MG53 S255A突變體(其胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示)對小鼠野生型MG53的細胞修復功能和心臟保護功能的影響，發明人在大鼠的初代培養的新生大鼠心肌細胞(NRVM)中使用腺病毒過表達小鼠野生型MG53及小鼠MG53 S255A突變體，檢測細胞的存活狀況。結果如圖14所示，模擬缺血再灌注損傷的缺氧復氧引起NRVM的乳酸脫氫酶(LDH)的大量釋放和細胞內ATP的降低；過表達小鼠野生型MG53及小鼠MG53 S255A突變體能差不多同等程度地抑制LDH的釋放和ATP的降低。這說明小鼠野生型MG53對缺血再灌注引起的細胞凋亡和壞死等損傷的具有保護作用，而小鼠MG53 S255A突變體並不影響小鼠野生型MG53的細胞修 復功能和心臟保護功能，即小鼠MG53 S255位點的磷酸化不調控MG53的細胞修復功能和心臟保護功能。
小鼠MG53 S255A突變不影響MG53對RISK訊息傳遞路徑的啟動
MG53的心臟保護功能的機制是：它是心臟保護的RISK訊息傳遞路徑中的重要分子，能介導小窩蛋白caveolin-3和p85-PI3K蛋白相互作用，從而啟動RISK訊息傳遞路徑，如下游重要的訊息傳遞分子AKT(參見Zhang Y.et al,Cardiovascular research 91,108-115(2011))。所以，進一步地，發明人檢測小鼠MG53 S255A突變不影響MG53心臟保護的機制是否是小鼠MG53 S255A突變體能和小鼠野生型MG53同等程度地啟動RISK訊息傳遞路徑。實驗結果如圖15所示，在NRVM中過表達小鼠野生型MG53能提高RISK訊息傳遞路徑的下游訊息傳遞分子AKT的473位絲胺酸的磷酸化，即能啟動AKT；而小鼠MG53 S255A突變體能與小鼠野生型MG53同等程度地提高AKT的473位絲胺酸的磷酸化，即啟動AKT。說明小鼠MG53 S255A突變體不影響小鼠野生型MG53對RISK訊息傳遞路徑的啟動，即，小鼠MG53 S255的磷酸化調控不影響心臟保護的RISK訊息傳遞路徑。
實施例3：人或小鼠MG53 S255A突變體對野生型MG53的E3泛素連接酶活性的影響
MG53高表達引起的胰島素訊息傳遞路徑的阻遏是胰島素抗性和代謝症候群發生發展的重要機制之一，也是MG53的重要功能之一。首先，發明人構建了小鼠野生型MG53的絲胺酸突變的表達質體一小鼠MG53 S255A(其胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示)。另外，發明人還構建了IRS1 的表達質體、泛素的表達質體、小鼠野生型MG53的表達質體。其次，發明人之前的研究表明，MG53是胰島素基質IRS1的E3泛素連接酶，可以介導其蛋白質的蛋白酶體途徑降解(Song,R.et al.Nature 494,375-379,(2013))。所以發明人將IRS1的表達質體、泛素的表達質體、與小鼠野生型MG53或小鼠MG53 S255A突變體的質體共轉染入HEK293T細胞系內，透過IRS1蛋白含量的變化來反應小鼠MG53 S255A突變對MG53功能的影響。實驗結果如圖19所示，結果表明，小鼠野生型MG53可以極大程度上降低IRS1的表達量；而小鼠MG53 S255A突變體能顯著地抑制MG53介導的IRS1的蛋白量降低。說明在HEK293T細胞系的共表達體系中，小鼠野生型MG53可以發揮正常的E3泛素連接酶功能，介導IRS1的泛素化降解；檢測到的小鼠MG53 S255A突變體抑制了MG53的E3泛素連接酶功能，即MG53的S255位點的磷酸化狀態能調控MG53的E3泛素連接酶功能。
人或小鼠MG53 S255A突變體抑制MG53介導的基質降解
MG53是RING結構域型E3泛素連接酶，MG53的RING結構域與E2泛素交聯酶相結合介導基質的泛素化和進一步的蛋白酶降解。所以RING結構域切除的截短體MG53-D-RING就喪失了野生型MG53的E3泛素連接酶功能。進一步地，為了定量地衡量人MG53 S255A突變體(其胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示)或小鼠MG53 S255A突變體(其胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示)對人或小鼠野生型MG53的E3泛素連接酶功能的影響，發明人以人或小鼠MG53-D-RING為陽性對照，在人胚腎上皮細胞系HEK293T中共表達人或小鼠野生型MG53、MG53 S255A突變體、或MG53-D-RING截短體和MG53的基質IRS1或胰島素受體IR，檢測不同的突變對MG53介導的基質的降解的 影響。結果如圖16(小鼠)和圖17(人)所示，人或小鼠野生型MG53可以極大程度地介導IRS1的降解；人或小鼠MG53-D-RING截短體幾乎完全不能介導IRS1的降解；而小鼠MG53 S255A突變體只能介導IRS1約40%的降解，人MG53 S255A突變體只能介導IRS1約10%的降解。小鼠野生型MG53可以介導約50%的IRβ的降解；小鼠MG53-D-RING截短體和小鼠MG53 S255A突變體幾乎完全不能介導IRβ的降解。另外，在HEK293T的共表達系統中，小鼠野生型MG53可以介導IRβ蛋白的前體蛋白的降解，同時小鼠MG53-D-RING截短體和小鼠MG53 S255A突變體幾乎完全抑制這種MG53介導的降解作用。本實驗說明，人或小鼠MG53-D-RING截短體極顯著地抑制了MG53的E3泛素連接酶功能；而人或小鼠MG53 S255A突變體大約能抑制MG53 50%以上的E3泛素連接酶功能。
小鼠MG53 S255A突變體抑制MG53與基質IRS1蛋白的結合
為了檢測小鼠MG53 S255A突變體(其胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示)是否影響MG53與基質IRS1蛋白的識別和結合，發明人一方面在離體的HEK293T細胞系中透過免疫共沉澱檢測活性狀態下基質IRS1與小鼠野生型MG53或小鼠MG53 S255A突變體的結合能力；另一方面透過表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)實驗檢測純化的蛋白IRS1和小鼠野生型MG53或小鼠MG53 S255A突變體的直接結合能力。實驗結果如圖18所示，圖18的A部分顯示IRS1可以和小鼠野生型MG53進行物理性結合；而同樣量的IRS1只能結合極少量的小鼠MG53 S255A突變體；圖18的B部分顯示小鼠野生型MG53蛋白可以與IRS1蛋白很好的結合，KD=64.2nM；而小鼠MG53 S255A突變體蛋白不能和IRS1蛋白結合。由此可見，小鼠MG53 S255A 突變體抑制了MG53對基質IRS1蛋白的識別和結合，從而抑制了MG53的E3泛素連接酶活性。
實施例4：人MG53 S255A突變體的體內活性
為了驗證人MG53 S255A突變體(其胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示)在體內是否仍然具有細胞修復功能和心臟保護功能，並且同時避免或減少了野生型MG53所帶來的代謝類副作用，發明人透過將人MG53 S255A突變體和人野生型MG53分別引入大鼠體內，進一步分析人MG53 S255A突變體的體內活性。首先，發明人根據實施例1製備人MG53 S255A突變體。其次，選擇15隻雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(每隻約250g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供)，分成三組，實驗組、陽性對照組、陰性對照組，每組分別5隻。30mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠之後，在左側第三肋間開胸，暴露出心臟。然後，向實驗組大鼠心臟靜脈注射人MG53 S255A突變體蛋白(6mg/kg，iv)，向陽性對照組大鼠心臟靜脈注射人野生型MG53蛋白(其胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示)(6mg/kg，iv)，向陰性對照組大鼠心臟靜脈注射牛血清白蛋白(BSA)(6mg/kg，iv)。各組大鼠分別在靜脈注射上述蛋白5分鐘後結紮心臟冠狀動脈左前降支，並持續45分鐘。結紮結束之前，各組大鼠再次靜脈注射相應的人MG53 S255A突變體蛋白、人野生型MG53蛋白以及BSA(6mg/kg，iv)，然後鬆開冠狀動脈。再灌注24小時之後，24小時內未死亡的大鼠定義為存活，死亡定義為死亡，以此結果比較實驗組、陽性對照組和陰性對照組大鼠的生存率。使用胰島素刺激各組大鼠，隨後處死大鼠，比較實驗組、陽性對照組和陰性對照組大鼠的心肌梗塞面積、血清LDH濃度以及心臟病理切片TUNEL染色 情況，進行各組大鼠心臟損傷評價。實驗組大鼠的心肌梗塞面積顯著性地小於陰性對照組大鼠的心肌梗塞面積，或者實驗組大鼠與陰性對照組大鼠相比能夠顯著性地抑制LDH釋放，或者實驗組大鼠的心臟病理切片TUNEL染色結果顯著性地優於陰性對照組大鼠的心臟病理切片TUNEL染色結果，則表明人MG53 S255A突變體並不影響人野生型MG53的細胞修復功能和心臟保護功能，能夠用於治療心臟疾病，例如心肌梗塞、心臟缺血/再灌注損傷等。最後比較實驗組、陽性對照組和陰性對照組大鼠各組織(例如，心肌、骨骼肌、肝臟)裡p-AKT/t-AKT的變化情況，從而評價實驗組、陽性對照組和陰性對照組大鼠各組織的胰島素反應性。陽性對照組大鼠的組織裡p-AKT/t-AKT比值下降，表明人野生型MG53蛋白引起胰島素敏感性下降；陰性對照組大鼠的組織裡p-AKT/t-AKT比值正常，表明BSA對胰島素敏感性無影響；實驗組大鼠的組織裡p-AKT/t-AKT比值比陽性對照組高，表明人MG53 S255A突變體可以消除或減弱人野生型MG53蛋白引起的胰島素敏感性下降。
綜上可知，MG53 coiled-coil-SPRY結構域內的至少一個絲胺酸(特別是第255位絲胺酸)缺失或突變為任何其他非絲胺酸或蘇胺酸(例如，丙胺酸)的胺基酸時，產生的MG53突變體在具有細胞修復功能和/或心臟保護功能的同時，又避免或減少了胰島素抗性等代謝類副作用。
雖然本發明透過引用特定實施例的例對發明進行特定的展現和描述，但是本發明所屬技術領域中具有通常知織者都應該理解，在不脫離本發明揭露的主旨和保護範圍的情況下，上述內容還可以進行各種形式和細節上的變化。
<110> 北京大學
<120> MG53突變體及其製備方法和用途
<130> 066467-8001TW01
<160> 154
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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<212> PRT
<213> 小鼠
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<212> PRT
<213> 大鼠
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<213> 豬
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<210> 7
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255A突變體的胺基酸序列
<400> 7
Figure TW201805299AD00020
Figure TW201805299AD00021
Figure TW201805299AD00022
<210> 8
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MG53 S255A突變體的胺基酸序列
<400> 8
Figure TW201805299AD00023
Figure TW201805299AD00024
Figure TW201805299AD00025
<210> 9
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠MG53 S255A突變體的胺基酸序列
<400> 9
Figure TW201805299AD00026
Figure TW201805299AD00027
Figure TW201805299AD00028
<210> 10
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子MG53 S255A突變體的胺基酸序列
<400> 10
Figure TW201805299AD00029
Figure TW201805299AD00030
Figure TW201805299AD00031
<210> 11
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬MG53 S255A突變體的胺基酸序列
<400> 11
Figure TW201805299AD00032
Figure TW201805299AD00033
Figure TW201805299AD00034
<210> 12
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗MG53 S255A突變體的胺基酸序列
<400> 12
Figure TW201805299AD00035
Figure TW201805299AD00036
Figure TW201805299AD00037
<210> 13
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255A突變體的編碼序列
<400> 13
Figure TW201805299AD00038
Figure TW201805299AD00039
<210> 14
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MG53 S255A突變體的編碼序列
<400> 14
Figure TW201805299AD00040
Figure TW201805299AD00041
<210> 15
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠MG53 S255A突變體的編碼序列
<400> 15
Figure TW201805299AD00042
Figure TW201805299AD00043
<210> 16
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子MG53 S255A突變體的編碼序列
<400> 16
Figure TW201805299AD00044
Figure TW201805299AD00045
<210> 17
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬MG53 S255A突變體的編碼序列
<400> 17
Figure TW201805299AD00046
Figure TW201805299AD00047
<210> 18
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗MG53 S255A突變體的編碼序列
<400> 18
Figure TW201805299AD00048
Figure TW201805299AD00049
<210> 19
<211> 1434
<212> DNA
<213> 智人
<400> 19
Figure TW201805299AD00050
Figure TW201805299AD00051
<210> 20
<211> 1434
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 20
Figure TW201805299AD00052
Figure TW201805299AD00053
<210> 21
<211> 1434
<212> DNA
<213> 大鼠
<400> 21
Figure TW201805299AD00054
Figure TW201805299AD00055
<210> 22
<211> 1434
<212> DNA
<213> 猴子
<400> 22
Figure TW201805299AD00056
Figure TW201805299AD00057
<210> 23
<211> 1437
<212> DNA
<213> 豬
<400> 23
Figure TW201805299AD00058
Figure TW201805299AD00059
<210> 24
<211> 1434
<212> DNA
<213> 狗
<400> 24
Figure TW201805299AD00060
Figure TW201805299AD00061
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255A突變體的正向引子
<400> 25
Figure TW201805299AD00062
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255A突變體的反向引子
<400> 26
Figure TW201805299AD00063
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255G突變體的正向引子
<400> 27
Figure TW201805299AD00064
<210> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255G突變體的反向引子
<400> 28
Figure TW201805299AD00065
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255L突變體的正向引子
<400> 29
Figure TW201805299AD00066
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255L突變體的反向引子
<400> 30
Figure TW201805299AD00067
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255V突變體的正向引子
<400> 31
Figure TW201805299AD00068
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255V突變體的反向引子
<400> 32
Figure TW201805299AD00069
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255P突變體的正向引子
<400> 33
Figure TW201805299AD00070
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255P突變體的反向引子
<400> 34
Figure TW201805299AD00071
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255F突變體的正向引子
<400> 35
Figure TW201805299AD00072
<210> 36
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255F突變體的反向引子
<400> 36
Figure TW201805299AD00073
<210> 37
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255W突變體的正向引子
<400> 37
Figure TW201805299AD00074
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255W突變體的反向引子
<400> 38
Figure TW201805299AD00075
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255Q突變體的正向引子
<400> 39
Figure TW201805299AD00076
<210> 40
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255Q突變體的反向引子
<400> 40
Figure TW201805299AD00077
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255C突變體的正向引子
<400> 41
Figure TW201805299AD00078
<210> 42
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255C突變體的反向引子
<400> 42
Figure TW201805299AD00079
<210> 43
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255Y突變體的正向引子
<400> 43
Figure TW201805299AD00080
<210> 44
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255Y突變體的反向引子
<400> 44
Figure TW201805299AD00081
<210> 45
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255D突變體的正向引子
<400> 45
Figure TW201805299AD00082
<210> 46
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255D突變體的反向引子
<400> 46
Figure TW201805299AD00083
<210> 47
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255R突變體的正向引子
<400> 47
Figure TW201805299AD00084
<210> 48
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S255R突變體的反向引子
<400> 48
Figure TW201805299AD00085
<210> 49
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S211A突變體的正向引子
<400> 49
Figure TW201805299AD00086
<210> 50
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S211A突變體的反向引子
<400> 50
Figure TW201805299AD00087
<210> 51
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S214A突變體的正向引子
<400> 51
Figure TW201805299AD00088
<210> 52
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S214A突變體的反向引子
<400> 52
Figure TW201805299AD00089
<210> 53
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S246A突變體的正向引子
<400> 53
Figure TW201805299AD00090
<210> 54
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S246A突變體的反向引子
<400> 54
Figure TW201805299AD00091
<210> 55
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S269A突變體的正向引子
<400> 55
Figure TW201805299AD00092
<210> 56
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S296A突變體的反向引子
<400> 56
Figure TW201805299AD00093
<210> 57
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S297A突變體的正向引子
<400> 57
Figure TW201805299AD00094
<210> 58
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53 S297A突變體的反向引子
<400> 58
Figure TW201805299AD00095
<210> 59
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MG53 S255A突變體的正向引子
<400> 59
Figure TW201805299AD00096
<210> 60
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MG53 S255A突變體的反向引子
<400> 60
Figure TW201805299AD00097
<210> 61
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MG53 S255G突變體的正向引子
<400> 61
Figure TW201805299AD00098
<210> 62
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MG53 S255G突變體的反向引子
<400> 62
Figure TW201805299AD00099
<210> 63
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MG53 S255L突變體的正向引子
<400> 63
Figure TW201805299AD00100
<210> 64
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MG53 S255L突變體的反向引子
<400> 64
Figure TW201805299AD00101
<210> 65
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MG53 S255W突變體的正向引子
<400> 65
Figure TW201805299AD00102
<210> 66
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MG53 S255W突變體的反向引子
<400> 66
Figure TW201805299AD00103
<210> 67
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MG53 S255Q突變體的正向引子
<400> 67
Figure TW201805299AD00104
<210> 68
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MG53 S255Q突變體的反向引子
<400> 68
Figure TW201805299AD00105
<210> 69
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MG53 S255Y突變體的正向引子
<400> 69
Figure TW201805299AD00106
<210> 70
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MG53 S255Y突變體的反向引子
<400> 70
Figure TW201805299AD00107
<210> 71
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MG53 S255D突變體的正向引子
<400> 71
Figure TW201805299AD00108
<210> 72
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MG53 S255D突變體的反向引子
<400> 72
Figure TW201805299AD00109
<210> 73
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MG53 S255R突變體的正向引子
<400> 73
Figure TW201805299AD00110
<210> 74
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MG53 S255R突變體的反向引子
<400> 74
Figure TW201805299AD00111
<210> 75
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠MG53 S255A突變體的正向引子
<400> 75
Figure TW201805299AD00112
<210> 76
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠MG53 S255A突變體的反向引子
<400> 76
Figure TW201805299AD00113
<210> 77
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠MG53 S255G突變體的正向引子
<400> 77
Figure TW201805299AD00114
<210> 78
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠MG53 S255G突變體的反向引子
<400> 78
Figure TW201805299AD00115
<210> 79
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠MG53 S255L突變體的正向引子
<400> 79
Figure TW201805299AD00116
<210> 80
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠MG53 S255L突變體的反向引子
<400> 80
Figure TW201805299AD00117
<210> 81
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠MG53 S255W突變體的正向引子
<400> 81
Figure TW201805299AD00118
<210> 82
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠MG53 S255W突變體的反向引子
<400> 82
Figure TW201805299AD00119
<210> 83
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠MG53 S255Q突變體的正向引子
<400> 83
Figure TW201805299AD00120
<210> 84
<21 1> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠MG53 S255Q突變體的反向引子
<400> 84
Figure TW201805299AD00121
<210> 85
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠MG53 S255Y突變體的正向引子
<400> 85
Figure TW201805299AD00122
<210> 86
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠MG53 S255Y突變體的反向引子
<400> 86
Figure TW201805299AD00123
<210> 87
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠MG53 S255D突變體的正向引子
<400> 87
Figure TW201805299AD00124
<210> 88
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠MG53 S255D突變體的反向引子
<400> 88
Figure TW201805299AD00125
<210> 89
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠MG53 S255R突變體的正向引子
<400> 89
Figure TW201805299AD00126
<210> 90
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠MG53 S255R突變體的反向引子
<400> 90
Figure TW201805299AD00127
<210> 91
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子MG53 S255A突變體的正向引子
<400> 91
Figure TW201805299AD00128
<210> 92
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子MG53 S255A突變體的反向引子
<400> 92
Figure TW201805299AD00129
<210> 93
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子MG53 S255G突變體的正向引子
<400> 93
Figure TW201805299AD00130
<210> 94
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子MG53 S255G突變體的反向引子
<400> 94
Figure TW201805299AD00131
<210> 95
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子MG53 S255L突變體的正向引子
<400> 95
Figure TW201805299AD00132
<210> 96
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子MG53 S255L突變體的反向引子
<400> 96
Figure TW201805299AD00133
<210> 97
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子MG53 S255W突變體的正向引子
<400> 97
Figure TW201805299AD00134
<210> 98
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子MG53 S255W突變體的反向引子
<400> 98
Figure TW201805299AD00135
<210> 99
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子MG53 S255Q突變體的正向引子
<400> 99
Figure TW201805299AD00136
<210> 100
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子MG53 S255Q突變體的反向引子
<400> 100
Figure TW201805299AD00137
<210> 101
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子MG53 S255Y突變體的正向引子
<400> 101
Figure TW201805299AD00138
<210> 102
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子MG53 S255Y突變體的反向引子
<400> 102
Figure TW201805299AD00139
<210> 103
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子MG53 S255D突變體的正向引子
<400> 103
Figure TW201805299AD00140
<210> 104
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子MG53 S255D突變體的反向引子
<400> 104
Figure TW201805299AD00141
<210> 105
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子MG53 S255R突變體的正向引子
<400> 105
Figure TW201805299AD00142
<210> 106
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子MG53 S255R突變體的反向引子
<400> 106
Figure TW201805299AD00143
<210> 107
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬MG53 S255A突變體的正向引子
<400> 107
Figure TW201805299AD00144
<210> 108
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬MG53 S255A突變體的反向引子
<400> 108
Figure TW201805299AD00145
<210> 109
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬MG53 S255G突變體的正向引子
<400> 109
Figure TW201805299AD00146
<210> 110
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬MG53 S255G突變體的反向引子
<400> 110
Figure TW201805299AD00147
<210> 111
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬MG53 S255L突變體的正向引子
<400> 111
Figure TW201805299AD00148
<210> 112
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬MG53 S255L突變體的反向引子
<400> 112
Figure TW201805299AD00149
<210> 113
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬MG53 S255W突變體的正向引子
<400> 113
Figure TW201805299AD00150
<210> 114
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬MG53 S255W突變體的反向引子
<400> 114
Figure TW201805299AD00151
<210> 115
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬MG53 S255Q突變體的正向引子
<400> 115
Figure TW201805299AD00152
<210> 116
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬MG53 S255Q突變體的反向引子
<400> 116
Figure TW201805299AD00153
<210> 117
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬MG53 S255Y突變體的正向引子
<400> 117
Figure TW201805299AD00154
<210> 118
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬MG53 S255Y突變體的反向引子
<400> 118
Figure TW201805299AD00155
<210> 119
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬MG53 S255D突變體的正向引子
<400> 119
Figure TW201805299AD00156
<210> 120
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬MG53 S255D突變體的反向引子
<400> 120
Figure TW201805299AD00157
<210> 121
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬MG53 S255R突變體的正向引子
<400> 121
Figure TW201805299AD00158
<210> 122
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬MG53 S255R突變體的反向引子
<400> 122
Figure TW201805299AD00159
<210> 123
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗MG53 S255A突變體的正向引子
<400> 123
Figure TW201805299AD00160
<210> 124
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗MG53 S255A突變體的反向引子
<400> 124
Figure TW201805299AD00161
<210> 125
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗MG53 S255G突變體的正向引子
<400> 125
Figure TW201805299AD00162
<210> 126
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗MG53 S255G突變體的反向引子
<400> 126
Figure TW201805299AD00163
<210> 127
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗MG53 S255L突變體的正向引子
<400> 127
Figure TW201805299AD00164
<210> 128
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗MG53 S255L突變體的反向引子
<400> 128
Figure TW201805299AD00165
<210> 129
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗MG53 S255W突變體的正向引子
<400> 129
Figure TW201805299AD00166
<210> 130
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗MG53 S255W突變體的反向引子
<400> 130
Figure TW201805299AD00167
<210> 131
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗MG53 S255Q突變體的正向引子
<400> 131
Figure TW201805299AD00168
<210> 132
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗MG53 S255Q突變體的反向引子
<400> 132
Figure TW201805299AD00169
<210> 133
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗MG53 S255Y突變體的正向引子
<400> 133
Figure TW201805299AD00170
<210> 134
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗MG53 S255Y突變體的反向引子
<400> 134
Figure TW201805299AD00171
<210> 135
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗MG53 S255D突變體的正向引子
<400> 135
Figure TW201805299AD00172
<210> 136
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗MG53 S255D突變體的反向引子
<400> 136
Figure TW201805299AD00173
<210> 137
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗MG53 S255R突變體的正向引子
<400> 137
Figure TW201805299AD00174
<210> 138
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗MG53 S255R突變體的反向引子
<400> 138
Figure TW201805299AD00175
<210> 139
<211> 477
<212> PRT
<213> 智人
<400> 139
Figure TW201805299AD00176
Figure TW201805299AD00177
Figure TW201805299AD00178
<210> 140
<211> 333
<212> PRT
<213> 智人
<400> 140
Figure TW201805299AD00179
Figure TW201805299AD00180
<210> 141
<211> 333
<212> PRT
<213> 智人
<400> 141
Figure TW201805299AD00181
Figure TW201805299AD00182
<210> 142
<211> 269
<212> PRT
<213> 智人
<400> 142
Figure TW201805299AD00183
Figure TW201805299AD00184
<210> 143
<211> 1434
<212> DNA
<213> 智人
<400> 143
Figure TW201805299AD00185
<210> 144
<211> 1002
<212> DNA
<213> 智人
<400> 144
Figure TW201805299AD00186
Figure TW201805299AD00187
<210> 145
<211> 1002
<212> DNA
<213> 智人
<400> 145
Figure TW201805299AD00188
Figure TW201805299AD00189
<210> 146
<211> 810
<212> DNA
<213> 智人
<400> 146
Figure TW201805299AD00190
<210> 147
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53亞型S255A突變體的胺基酸序列
<400> 147
Figure TW201805299AD00191
Figure TW201805299AD00192
Figure TW201805299AD00193
<210> 148
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53亞型S255A突變體的胺基酸序列
<400> 148
Figure TW201805299AD00194
Figure TW201805299AD00195
<210> 149
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53亞型S255A突變體的胺基酸序列
<400> 149
Figure TW201805299AD00196
Figure TW201805299AD00197
<210> 150
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53亞型S255A突變體的胺基酸序列
<400> 150
Figure TW201805299AD00198
Figure TW201805299AD00199
<210> 151
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53亞型S255A突變體的編碼核酸序列
<400> 151
Figure TW201805299AD00200
<210> 152
<211> 1002
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53亞型S255A突變體的編碼核酸序列
<400> 152
Figure TW201805299AD00201
<210> 153
<211> 1002
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53亞型S255A突變體的編碼核酸序列
<400> 153
Figure TW201805299AD00202
Figure TW201805299AD00203
Figure TW201805299AD00204
Figure TW201805299AD00205
Figure TW201805299AD00206
Figure TW201805299AD00207
<210> 154
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MG53亞型S255A突變體的編碼核酸序列
<400> 154
Figure TW201805299AD00208

Claims (35)

  1. 一種MG53突變體，其中所述MG53突變體在野生型MG53的胺基酸序列的基礎上，在所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY區域內具有至少一個絲胺酸缺失和/或突變為任何其他非絲胺酸或蘇胺酸的胺基酸。
  2. 如請求項1所述的MG53突變體，其中所述coiled-coil-SPRY區域位於野生型MG53的胺基酸序列的第122-477位胺基酸區域。
  3. 如請求項1或2所述的MG53突變體，其中所述野生型MG53的胺基酸序列為SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或者SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。
  4. 如請求項1~3中任一項所述的MG53突變體，其中所述絲胺酸突變為非極性胺基酸。
  5. 如請求項4所述的MG53突變體，其中所述非極性胺基酸選自下組：甘胺酸、丙胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸。
  6. 如請求項5所述的MG53突變體，其中所述非極性胺基酸為丙胺酸。
  7. 如請求項1~6中任一項所述的MG53突變體，其中所述絲胺酸突變為除絲胺酸和蘇胺酸之外的極性胺基酸。
  8. 如請求項7所述的MG53突變體，其中所述極性胺基酸選自下組：穀氨醯胺、半胱胺酸、天冬醯胺、酪胺酸、天冬胺酸、穀胺酸、賴胺酸、精胺酸、組胺酸。
  9. 如請求項8所述的MG53突變體，其中所述極性胺基酸為半胱胺酸。
  10. 如請求項1~9中任一項所述的MG53突變體，其中發生缺失或突變的絲 胺酸位於所述野生型MG53的胺基酸序列的以下一個或多個位點：第189位、第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位、第301位、第305位、第307位、第341位、第377位、第418位、第430位。
  11. 如請求項1~10中任一項所述的MG53突變體，其中發生缺失或突變的絲胺酸位於所述野生型MG53的胺基酸序列的以下一個或多個位點：第211位、第214位、第246位、第255位、第269位、第296位、第297位。
  12. 如請求項1~11中任一項所述的MG53突變體，其中發生缺失或突變的絲胺酸位於所述野生型MG53的胺基酸序列的第255位。
  13. 如請求項12所述的MG53突變體，其中所述MG53突變體具有兩個或兩個以上的絲胺酸突變。
  14. 如請求項1~13中任一項所述的MG53突變體，其中所述MG53突變體的胺基酸序列與SEQ ID NO：7~12所示的任一胺基酸序列具有至少70%的同源性，並且所述MG53突變體在具有細胞修復功能和/或心臟保護功能的同時，避免了野生型MG53所帶來的代謝類副作用。
  15. 如請求項1~14中任一項所述的MG53突變體，其中所述MG53突變體的胺基酸序列為SEQ ID NO：7~12所示的任一胺基酸序列。
  16. 如請求項1~15中任一項所述的MG53突變體，其中所述MG53突變體的胺基酸序列為SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。
  17. 一種藥物組合物，其包括請求項1~16中任一項所述的MG53突變體和藥學上可接受的載體。
  18. 一種分離的核酸，其包含編碼請求項1~16中任一項所述的MG53突變體的胺基酸序列的核酸序列。
  19. 如請求項18所述的核酸，其包含SEQ ID NO：13~18所示的任一核酸序列。
  20. 一種重組載體，其包含請求項18所述的核酸序列。
  21. 如請求項20所述的表達載體，其包含SEQ ID NO：13~18所示的任一核酸序列。
  22. 一種宿主細胞，其包含如請求項20或21所示的表達載體。
  23. 一種如請求項1~16中任一項所述的MG53突變體的製備方法，其中確定需要進行突變的絲胺酸的一個或多個位置，對包含編碼野生型MG53胺基酸序列的核酸序列的質體的全長序列進行在所述位置的定點突變，將所述定點突變的質體轉染到宿主細胞，表達所述宿主細胞以產生所述MG53突變體。
  24. 如請求項23所述的製備方法，其中所述定點突變包括如下步驟：(1)確定需要定點突變的胺基酸在cDNA序列中相應的核苷酸位置，根據突變後的胺基酸修改突變位置的核苷酸序列，並截取包含突變位置的長度為20~40bp的序列設計引子；(2)以野生型MG53質體為範本，使用步驟(1)中設計的引子進行PCR反應，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，並對PCR產物進行純化；(3)步驟(2)中純化後的PCR產物使用核酸限制性內切酶進行酶切反應，並將酶切產物與合適的質體重組載體進行連接，將連接產物進行細菌勝任細胞的轉化，培養；(4)挑取步驟(3)所得殖株使用步驟(1)所設計的引子進行菌落PCR鑒定，對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，然後進行DNA測 序鑒定，鑒定出帶有所述定點突變的陽性殖株。
  25. 如請求項1~16中任一項所述的MG53突變體在製備用於治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的藥物中的用途。
  26. 如請求項25所述的用途，其中所述藥物在治療心臟疾病、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、腎臟疾病、與細胞和/或組織損傷相關疾病的同時避免了代謝類副作用。
  27. 如請求項25或26所述的用途，其中所述心臟疾病是與心肌損傷相關的疾病。
  28. 如請求項25~27中任一項所述的用途，其中所述心臟疾病包括糖尿病性心臟病、心肌缺血、心臟缺血/再灌注損傷、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心臟破裂、心絞痛、心肌炎、冠心病、心包炎。
  29. 如請求項25或26所述的用途，其中所述糖尿病腦血管疾病包括腦動脈硬化、缺血性腦血管病、腦出血、腦萎縮、腦梗塞。
  30. 如請求項25或26所述的用途，其中所述糖尿病眼部併發症包括糖尿病性視網膜病變、糖尿病性白內障、與糖尿病相關的葡萄膜炎、失明。
  31. 如請求項25或26所述的用途，其中所述糖尿病神經病變包括糖尿病周圍神經病變。
  32. 如請求項25或26所述的用途，其中所述腎臟疾病包括急性腎小球腎炎、慢性腎小球腎炎、腎病症候群、急性腎損傷、糖尿病腎病。
  33. 如請求項25或26所述的用途，其中所述與細胞和/或組織損傷相關疾病包括與腎臟、腦、肺部、肝臟、心臟、脾臟、消化道、皮膚損傷相關的 疾病。
  34. 如請求項33所述的用途，其中所述與細胞和/或組織損傷相關疾病包括外傷、燒傷、潰瘍、黏膜炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、中風、皮膚老化。
  35. 如請求項25~34中任一項所述的用途，其中所述MG53突變體的胺基酸序列為SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。
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