JP2008518631A - ヒトインターフェロンベータ変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド;
(c)前記(a)または(b)のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド
具体的には、本発明のヒトインターフェロンベータ変異体は、ヒトインターフェロンベータ活性を有する下記のポリペプチドの一つにおいて、配列番号2のアミノ酸配列の中でアスパラギン−グリシン−スレオニン/セリン−ロイシンからなる25〜28番のアミノ酸配列を保存することで、その位置にN−結合型糖鎖が付加したポリペプチドと定義することができる。
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド;
(c)前記(a)または(b)のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド
(i)前述のヒトインターフェロンベータ変異体をコードするポリヌクレオチド;
(ii)前記(i)のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された、RNA分子を形成させるプロモーター;
(iii)リーダー配列をコードするポリヌクレオチド;
(iv)複製基点;及び
(v)前記RNA分子の3’−末端のポリアデニル化を惹起させる3’−非翻訳領域
を基本的に含む。
R27T−5’:GCAAT TGAAT GGGAC GCTTG AATAC TGCCT C (配列番号4)
R27T−3’:GAGGC AGTAT TCAAG CGTCC CATTC AATTG C (配列番号5)
ii)R27S作製用プライマーセット
R27S−5’:GCAAT TGAAT GGGAG TCTTG AATAC TGCCT C (配列番号6)
R27S−3’:GAGGC AGTAT TCAAG ACTCC CATTC AATTG C (配列番号7)
iii)GNITV作製用プライマーセット
GNITV−5’:CTTAC AGGTT ACCTC CGAAA CGGTA ATATC ACTGT CTGAA GATCTCCTAGCCTGTCC (配列番号8)
GNITV−3’:GAATG TCCAA TGGAG GCTTT GCCAT TATAG TGACA GACTT CTAGAGGATCGGACAGG (配列番号9)
実施例1で作製したインターフェロンベータ変異体の遺伝子を含むプラスミドを鋳型に使用して、プライマーP1(CCGGAATTCGCCACCATGACCAACAAGTGTCTCCTCCAAA、配列番号10)とP2(CCGCTCGAGGTCACTTAAACAGCATCTGCTGGTTGA、配列番号11)とを使用してPCRを遂行し、人工的に置換されたインターフェロンベータをコードする遺伝子を得た(図3)。ここで、DNA重合酵素(Stratagene)を使用し、この遺伝子末端は、制限酵素EcoRIおよびXhoI部位を有する。pCDNA3.1(Invitrogen社)と上で増幅したIFN−β遺伝子とを制限酵素EcoRIとXhoIとで各々処理した。アガロースゲルで線形化したpcDNA3.1とIFN−β変異体遺伝子をQiagen溶出キットを使用して回収した後、ライゲーション反応を経て大腸菌DH5αに形質転換した。LB−アンピシリン固形培地で一晩培養した後、現れたコロニーからプラスミドを分離し、制限酵素EcoRIとXhoIとで処理して、1%アガロースゲル電気泳動でIFN−β遺伝子が挿入されたコロニーのみを選択した。選択されたコロニーのプラスミドDNAのIFN−β遺伝子の塩基配列を確認した。このプラスミドをpCDNA3.1−IFN−β−X(ここでXは、インターフェロンベータ変異体の番号)と名付けた。
実施例3−1:糖鎖追加の確認
実施例2に記載のトランスフェクトCOS細胞から1〜2μgの組換えヒトインターフェロンベータ及びインターフェロンベータ変異体を含む培養上清を、室温でウサギ抗インターフェロンベータポリクローナル抗体で一晩免疫沈降した。前記抗体を含む培養上清に、PBSで1:1に懸濁したプロティンAセファロース樹脂を20〜80μl添加して常温で1時間反応させた。試料を遠心分離して、沈殿物をPBSで洗浄した。沈殿物の一部を酵素N−グリカナーゼで処理してN−結合型糖鎖を切断した。N−グリカナーゼで処理した沈殿物と処理していない沈殿物を15%SDS−ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ニトロセルロースメンブレンに移して、ルンケル(Runkel)等が発表した方法(Runkel等、Pharmaceutical Research、1998年、第15巻、641−649頁)によってマウス抗インターフェロンベータモノクローナル抗体を使用したウエスタンブロット法で分析した。
天然型インターフェロンベータとインターフェロンベータ変異体の活性を比べるために、EIAによりインターフェロンタンパク質の量を定量した。抗ウイルス活性試験法により天然型インターフェロンベータ及びインターフェロンベータ変異体の力価を測定した。
++++ 分子量が30kDaで2本の糖鎖が付加している。
60mm細胞培養容器でCHO細胞(DG44)を増殖させ、40〜80%コンフルエント程度に(1〜4×105細胞/60mmディッシュ)培養した。ギブコ(Gibco)社のリポフェクチン(Lipofectin)試薬3μlと細胞培地(α−MEM、無血清、無抗生剤)97μlとをよく混合して、プラスミドpcDNA3.1−IFN−β−X DNA(0.1μg/μl以上、約2μg)とpSP72−DHFR(0.2μg)を添加して室温で30分間反応させた後、用意した前記細胞に加えた(図4)。1日経過後、G418を500μg/mlになるように添加した培地(α−MEM、10% FBS)に交換した。約7〜10日間デオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシドが欠乏したα−MEM最小培地に入れ替えて培養することで、トランスフェクトされた細胞を選択した。以後、CHO DHFR+トランスフェクト細胞を2次選択した。2次選択されたCHO DHFR+トランスフェクト細胞を限界希釈法で96ウェルプレートにクローニングして選択培地で継続培養した後、MTX(メトトレキサート、米国Sigma社)濃度を20nMから1000nMまで2倍ずつ漸次増加させて、10%血清含有最小培地で培養しながら、MTX選択培地で成長するMTX抵抗性クローンを3次選択した。
実施例4に記載の突然変異配列を一つまたは二つ以上含む細胞株を、セルファクトリー(cell factory;Nunc社、Cat No.170069)を使用して培養した。10%FBS含有α−MEM培地で各発現細胞株を5×104細胞/mlに希釈し、セルファクトリーに継代して、5%CO2、37℃で72時間培養し、細胞増殖を確認した。PBSで3回洗浄して血清成分を最大限除去し、無血清培地(Sigma C8730)に置換した。無血清培地に置換した後、24時間ごとに培養液を回収して、新しい無血清培地を添加した。計4回にわたり培養液を回収して精製した。ブルーセファロース樹脂(Amersham−Pharmacia)200mlをXK50/20カラム(Amersham−Pharmacia)に充填後、緩衝液A(20mMリン酸ナトリウム、1M NaCl、pH7.4)を10C.V.(column volume)流し、平衡状態に達するようにした。平衡状態のカラムに除菌ろ過した培養液を20ml/分の流速で流し、UV検出器で波長280nmにてモニターした。緩衝液B(20mMリン酸ナトリウム、1M NaCl、30%エチレングリコール、pH7.4)をカラムに流して未吸着成分を洗浄し、緩衝液C(20mMリン酸ナトリウム、1M NaCl、60%エチレングリコール、pH7.4)で樹脂に付着したタンパク質を溶出した。溶出液をPBSに対して透析し、濃縮器(Centricon、Cut off 10,000)で濃縮して、再度PBSに対して透析した。
実施例6−1:SDS−PAGE及びウエスタンブロット
実施例5で精製した試料に5×サンプル緩衝溶液(125mM Tris−HCl、5%SDS、50%グリコール、0.1%β−メルカプトエタノール、1mg/mlブロモフェノールブルー)を1:4の割合で混合して、95℃で5分間前処理した後、分子量標準品とともに15%ポリアクリルアミドゲルのウェルに20μlずつローディングして展開した。電気泳動が終わった後、クマシーブリリアント染色液で染色した後、脱色液で脱色した結果、天然型インターフェロンベータは糖鎖がないタンパク質である約18.0kDaのバンドと糖鎖があるタンパク質である約22.0kDaのバンドを示して、1本の糖鎖が付加したIFN−βは約26.0kDaのバンドが加えられ、2本の糖鎖が付加したIFN−βは約30.0kDaのバンドが加えらたことが確認された(図6)。
精製したタンパク質は、全てPBL社が提供するヒトIFN−βELISAキット(Human IFN−β ELISA kit)を使用してインターフェロンベータの含量を測定した。そして、イトウ・マサキ(Masaki Ito等.Anal.Biochem.2002年、第300巻、260頁)の方法の変法により、各タンパク質のシアル酸含量を測定した。シアル酸は、80℃で1時間、0.1N塩酸で反応させて糖タンパク質から分離し、その中の一部をタカラ社が供給するシアル酸蛍光標識キットを使用してシアル酸に蛍光物質を標識して、HPLCで含量分析した。その結果を、天然型インターフェロンベータとインターフェロンベータ変異体対シアル酸の重量の%比で<表3>に示した。
実施例7−1:R27T、R27S及びGNITVインターフェロンベータ変異体の抗ウイルス活性
R27T、R27T+GNITV、GNITV、および糖鎖が除去されたインターフェロンベータ(IFNβ−1b)の抗ウイルス活性を、天然型インターフェロンベータ(IFNβ−1a)を基準に、相対的に比較した。天然型インターフェロンベータには、セロノ(Serono)のRebifを使用した。
細胞増殖に対するインターフェロンベータ変異体の効果を調査した。抗ウイルス活性と同様に天然型インターフェロンベータ(IFNβ−1a)を基準に相対比較し、天然型インターフェロンベータとしてセロノ(Serono)のRebifを使用した。抗増殖活性は、Daudi細胞を使用して調査した。
天然型インターフェロンベータ及び変異体の免疫調節機能は、A549細胞でMHCクラスIの活性化を通じて測定した。
in vivo活性試験は、CHO細胞で発現させたインターフェロンベータ変異体を投与したラットの血中インターフェロンベータ変異体の経時的濃度変化を測定する方法で実施した。in vivo活性試験に使用した実験動物はHsd:スプラグ−ドーレイ(Sprague−Dawley)ラットのメスで、体重分布は246.3〜258.1gであり、恒温(24±1℃)、恒湿(55%)、照明時間12時間に設定された動物室で1週間程度馴化させた後使用した。試験期間中、動物は、同一飼育室で飼育した。
Claims (16)
- 下記の(a)、(b)及び(c)からなる群から選択されるヒトインターフェロンベータ活性を有するポリペプチドにおいて、C−末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン配列を含み、その位置にN−結合型糖鎖を含む、ヒトインターフェロンベータ変異体:
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列全体を含むポリペプチド;
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド;
(c)前記(a)または(b)のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド。 - ヒトインターフェロンベータ活性を有するポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列からなる天然型ヒトインターフェロンベータであることを特徴とする、請求項1記載のヒトインターフェロンベータ変異体。
- ヒトインターフェロンベータ活性を有するポリペプチドが、(c)のポリペプチドであり、該ポリペプチドは配列番号1の27番アミノ酸であるアルギニンがスレオニンまたはセリンに置換されて、アスパラギン−グリシン−スレオニン/セリン−ロイシンからなる配列番号1の25〜28番のアミノ酸配列を含むことにより、その位置にN−結合型糖鎖を追加で含むことを特徴とする、請求項1記載のヒトインターフェロンベータ変異体。
- ヒトインターフェロンベータ活性を有するポリペプチドが、(a)のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチドであり、該ポリペプチドは27番アミノ酸であるアルギニンがスレオニンまたはセリンに置換されている配列番号1のアミノ酸配列を有し、前記置換によってアスパラギン−グリシン−スレオニン/セリン−ロイシンからなる25〜28番のアミノ酸配列を含むことにより、その位置にN−結合型糖鎖を追加で含むことを特徴とする、請求項1記載のヒトインターフェロンベータ変異体。
- 下記の(a)、(b)及び(c)からなる群から選択されるヒトインターフェロンベータ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号2の25〜28番に相当するアスパラギン−グリシン−スレオニン/セリン−ロイシン配列を保存することにより、その位置にN−結合型糖鎖を含むヒトインターフェロンベータ変異体:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列全体を含むポリペプチド;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド;
(c)前記(a)または(b)のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド。 - ヒトインターフェロンベータ活性を有するポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴とする、請求項5記載のヒトインターフェロンベータ変異体。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のヒトインターフェロンベータ変異体をコードするポリヌクレオチド。
- ヒトインターフェロンベータ変異体が、配列番号1のアミノ酸配列のC−末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン配列を含むヒトインターフェロンベータ変異体であることを特徴とする、請求項7記載のポリヌクレオチド。
- ヒトインターフェロンベータ変異体が、配列番号2のアミノ酸配列を含むヒトインターフェロンベータ変異体であることを特徴とする、請求項7記載のポリヌクレオチド。
- ヒトインターフェロンベータ変異体が、配列番号2のアミノ酸配列のC−末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン配列を含むヒトインターフェロンベータ変異体であることを特徴とする、請求項7記載のポリヌクレオチド。
- 請求項7〜10のいずれか1項に記載のヒトインターフェロンベータ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、動物細胞でヒトインターフェロンベータを発現させる発現ベクター。
- 請求項11に記載の発現ベクターで形質転換された動物細胞。
- 請求項12に記載の動物細胞を培養する工程を含む、ヒトインターフェロンベータ変異体の製造方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のヒトインターフェロンベータ変異体を含む薬剤学的組成物。
- 薬剤学的組成物が、天然型ヒトインターフェロンベータが有する薬理効果を有することを特徴とする、請求項14記載の薬剤学的組成物。
- 薬剤学的組成物が、天然型ヒトインターフェロンベータが有する薬理効果を有し、該薬理効果が、多発性硬化症、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染、HIV関連疾病およびC型肝炎からなる群から選択される疾病の予防または治療の薬理効果であることを特徴とする、請求項14記載の薬剤学的組成物。
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