CN101111519A - 人β干扰素突变蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人β干扰素突变蛋白。具体地，本发明涉及与天然人β干扰素相比具有一条或两条额外的糖链的人β干扰素突变蛋白。

Description

人β干扰素突变蛋白
发明领域
本发明涉及人β干扰素突变蛋白。具体地，本发明涉及与天然的人β干扰素相比具有一条或两条额外糖链的人β干扰素突变蛋白。
发明背景
干扰素(IFN)是显示出抗病毒活性的细胞因子的一个成员，抑制细胞增殖和调节天然免疫应答。β干扰素(IFN-β)是球形蛋白，具有5个螺旋和22kDa的分子量，当除去它的糖链时变成18kDa(Arduini et al，ProteinScience 8：pp 1867-1877，1999)。
已经活跃的研究了β干扰素的临床应用，具体地，它已经作为多发性硬化症状的减轻、改善或者治疗剂处于研究的焦点中(Goodkin et al.，Multiple sclerosis：Treatment options for patients with relapsing-remitting andsecondary progressive multiple sclerosis，1999)。
除了多发性硬化，已经报导β干扰素显示出不同的免疫学活性，如抗病毒活性、细胞生长抑制或者抗生长活性、增强淋巴细胞毒性、免疫调节活性、诱导或抑制靶细胞的增殖、激活巨噬细胞、增加细胞因子产生、增强细胞毒性T细胞效果、增加自然杀伤细胞，因此，它有效地用于治疗癌症、自身免疫病、病毒感染、HIV相关的疾病、丙型肝炎、类风湿性关节炎等等(Pilling et al.，European Journal of Immunology 29：pp 1041-1050，1999，Young et al.，Neurology 51：pp 682-689，1998；Cirelli et al.，Majortherapeutic uses of interferons.Clin Immunother 3：pp 27-87，1995)。
人β干扰素是一种糖蛋白，其连接一条或多条糖链，此类糖链在该糖蛋白的活性中起重要作用。
因此，存在当引入额外的糖链时，糖蛋白的活性增加的实例。
PCT公布号WO96/25498和美国专利号5,618,698已经公开了通过引入一条或多条糖链增加hTPO和hEPO糖蛋白的活性。
本发明已经公开了通过向人天然β干扰素引入糖链而具有增加的或提高的活性或能力的人β干扰素突变蛋白，如上述的观点。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供了通过向人天然β干扰素引入糖链而具有增加的或提高的活性或能力的人β干扰素突变蛋白。
在下文提供本发明的其他目的和实施方案。
发明详述
在优选实施方案中，本发明涉及人β干扰素突变蛋白。
因为本发明的人β干扰素突变蛋白采取了向天然人β干扰素引入一个或两个额外的糖链的形式，所以它显示出提高或增加的抗病毒活性、细胞生长抑制活性、免疫调节能力和延长的体内半寿期(见图7-10)。
如下面实施例中描述的，对于在动物细胞中表达在具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的天然人β干扰素中第27个氨基酸精氨酸(R)用苏氨酸(T)或者丝氨酸(S)替换或者向天然人β干扰素的C-末端加入甘氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-缬氨酸(G-N-I-T-V)序列，本发明可以通过向天然β干扰素引入一个或两个额外的N-连接的糖链而制备与天然人β干扰素相比具有提高的或增加的活性或能力的人β干扰素突变蛋白。基于这些实验结果提供本发明。与天然人β干扰素相比具有提高的或增加的活性或能力的人β干扰素突变蛋白的特征是在天然人β干扰素或者天然人β干扰素突变蛋白的氨基酸序列的C-末端包括甘氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-缬氨酸(G-N-I-T-V)序列并且在该序列位置具有N-连接的糖链。
在本文中，包括权利要求书中使用的术语“天然人β干扰素突变蛋白”包括含有来自天然人β干扰素的部分或者完整氨基酸序列并且保持人β干扰素活性的所有多肽。
本文使用的术语“人β干扰素活性”指在人β干扰素显示出的以前已知的活性中足以将多肽定义为人β干扰素的一种或多种活性。此类活性包括减轻、缓解或治疗多发性硬化的活性、抗病毒活性、细胞生长抑制、抗生长活性、抗增殖、增强淋巴细胞毒性、免疫调节活性、诱导或抑制靶细胞的增殖、增加细胞因子产生、增强细胞毒性T细胞效果、增加自然杀伤细胞、预防或治疗癌症、预防或治疗自身免疫病、预防或治疗病毒感染、预防或治疗HIV相关的疾病、预防或治疗丙型肝炎和预防或治疗类风湿性关节炎的活性。
此外，本文使用的术语“包括来自天然人β干扰素的部分或者完整氨基酸序列的多肽”指含有SEQ ID NO：1代表的天然人β干扰素的完整氨基酸序列或者其必需部分的多肽或者与该多肽基本上类似的多肽。
本文使用的术语“包括SEQ ID NO：1的完整氨基酸的必需部分”指这样的多肽，其与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的天然人β干扰素相比具有相对较低的活性，但是含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的一部分并且仍然具有人β干扰素活性。此外，本文使用的术语“基本类似于SEQ IDNO：1的完整氨基酸序列的多肽或者其必需部分”指显示出比具有SEQ IDNO：1的氨基酸的天然人β干扰素相对较低的活性，但是含有SEQ ID NO：1的完整氨基酸序列或者其必需部分，其具有一个或多个替代的氨基酸但是仍然具有人β干扰素活性。
例如，包括SEQ ID NO：1的完整氨基酸序列的必需部分的多肽可以是在具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽中缺失它的N-末端和/或C-末端的多肽。此外，基本上类似于SEQ ID NO：1的完整氨基酸序列或者其必需部分的多肽通过具有一个或多个替代的氨基酸的多肽例示，其中所替代的氨基酸在化学等同于(chemically equivalent)替代前的最初氨基酸。例如，对于疏水氨基酸如丙氨酸的情况，优选用另一种疏水氨基酸如甘氨酸或者不同于最初氨基酸的另外的亲水氨基酸如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸替代。
有时，因为N-末端、C-末端或者替代的氨基酸可以影响人β干扰素的活性必需的基序，所以存在缺失其N-末端和/或C-末端或者具有替代的氨基酸的多肽不显示出任何人β干扰素活性的情况。然而，通过证实衍生自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽是否具有上述活性中的一种或多种活性，和/或通过基于本发明申请日时本领域中众所周知的涉及人β干扰素的鉴定的方法，从此类无活性多肽分类和检测活性多肽属于本领域技术人员的常规能力范围之内。
一起考虑上面的描述，可以将本发明的人β干扰素突变蛋白定义为下面的多肽之一：其在其C末端含有甘氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸序列，并且在该序列位置具有N-连接的糖链并且显示出人β干扰素活性：
(a)含有SEQ ID NO：1的完整氨基酸序列的多肽；
(b)包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的必需部分的多肽；和
(c)基本上类似于多肽(a)或(b)的多肽。
因此，将理解本发明的人β干扰素突变蛋白是具有人β干扰素活性的多肽，其在其C-末端含有甘氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸序列并且在该序列位置具有N-连接的糖链。
同样，尽管将本发明的人β干扰素突变蛋白定义和理解为显示出人β干扰素活性、在其C-末端含有甘氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸序列并且在该序列位置具有N-连接的糖链的所有多肽，但是本发明的优选的人β干扰素突变蛋白是在具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的天然人β干扰素的C末端具有甘氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸序列并且在该序列位置具有N-连接的糖链的多肽。此外，本发明的优选的人β干扰素突变蛋白是基本上类似于含有SEQ ID NO：1的完整氨基酸序列或者其必需部分的多肽(对应于上面的多肽(C))。这种多肽含有两个N-连接的糖链：一个位于它的C-末端的甘氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸序列，另一个位于SEQ ID NO：1的第25到28个氨基酸序列，其由天冬酰胺-甘氨酸-苏氨酸/丝氨酸-亮氨酸组成，其通过用苏氨酸或者丝氨酸替换SEQ IDNO：1的27位氨基酸精氨酸而被修饰。
本发明的人β干扰素突变蛋白的最优选的形式是这样的多肽，其在SEQ ID NO：1的27位氨基酸精氨酸被苏氨酸或丝氨酸替代的位置含有N-连接的糖链，并且在甘氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸序列加入到它的C-末端的位置处含有另一N-连接的糖链。
本发明下面的实施例显示了引入两个额外糖链的人β干扰素突变蛋白与天然的人β干扰素相比，显示出比引入仅一个糖链的人β干扰素突变蛋白进一步提高或者增加的活性或能力(见实施例5和6，图7-10)。
同时，本发明的人β干扰素突变蛋白可以如下以不同的方式定义。
具体地，本发明的人β干扰素突变蛋白可以定义为显示出下面多肽之一的人β干扰素活性的多肽，其在SEQ ID NO：2的由天冬酰胺-甘氨酸-苏氨酸/丝氨酸-亮氨酸组成的25位到28位氨基酸序列是保守的位置引入额外的N-连接的糖链：
(a)含有SEQ ID NO：2的完整氨基酸序列的多肽；
(b)包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列的必需部分的多肽；和
(c)基本上类似于多肽(a)或(b)的多肽。
在本文中，包括权利要求书中使用的短语“由天冬酰胺-甘氨酸-苏氨酸/丝氨酸-亮氨酸组成的25位到28位氨基酸序列是保守的”指由天冬酰胺-甘氨酸-苏氨酸/丝氨酸-亮氨酸组成的25位到28位氨基酸序列一定存在于多肽(b)或者(c)中(即，包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列的必需部分的多肽或者基本上类似于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的完整或者必需部分的多肽)。
当以与上述不同的方式定义本发明的人β干扰素突变蛋白时，本发明的优选的人β干扰素突变蛋白是含有SEQ ID NO：2的完整氨基酸序列的多肽，其在由天冬酰胺-甘氨酸-苏氨酸/丝氨酸-亮氨酸组成的25位到28位氨基酸序列的位置引入额外的N-连接的糖链。
SEQ ID NO：2的氨基酸序列是SEQ ID NO：1的氨基酸序列中27位氨基酸精氨酸被苏氨酸或丝氨酸替代的序列。
同时，术语“包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列的必需部分的多肽”或者“基本上类似于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的完整或者必需部分的多肽”具有与上述相同的含义。
在另一实施方案中，本发明涉及编码如上述人β干扰素突变蛋白的多核苷酸。术语“如上述的人β干扰素突变蛋白”包括如上述用两种不同的方式定义的本发明的人β干扰素突变蛋白和其每种所有的优选实施方案。
当给予某个氨基酸序列时，本领域技术人员可以基于该给定序列通过使用他的常规技术容易地合成编码该氨基酸序列的多核苷酸。
本文使用的术语“多核苷酸”定义为指包括所有单链或者双链RNA或DNA或者其多聚体。
同时，当考虑活性时，上面的多核苷酸优选为编码人β干扰素突变蛋白的多核苷酸，该人β干扰素突变蛋白在由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的天然人β干扰素的C-末端引入甘氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸-缬氨酸序列或者编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的人β干扰素突变蛋白的多核苷酸。更优选地，该多核苷酸是编码人β干扰素突变蛋白的多核苷酸，该人β干扰素突变蛋白在由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的天然人β干扰素的C-末端引入甘氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸-缬氨酸序列，并且具有27位氨基酸精氨酸用苏氨酸或丝氨酸的替代。
在另一实施方案中，本发明涉及包含上述多核苷酸的动物细胞表达载体，该载体能够在动物细胞中表达本发明的人β干扰素突变蛋白。
本发明的人β干扰素突变蛋白与天然的人β干扰素相比包括一条或两天额外的糖链。当考虑此类糖链的添加是在动物细胞中通常发生的现象这一事实，该动物细胞表达载体基本上包含：
(i)编码如上述的人β干扰素突变蛋白的多核苷酸；
(ii)可操作连接(i)的核苷酸序列的启动子，所述核苷酸序列产生RNA分子；
(iii)编码前导序列的多核苷酸；
(iv)复制起点；和
(iv)3’-非翻译区(3′-UTR)，其导致所述RNA分子的3’末端多聚腺苷酸化。
可用于本发明的启动子指本领域中众所周知的能够激活转录的序列。类似地，导致翻译的蛋白质转移到内质网中发生糖基化的前导序列，能够稳定前导序列和mRNA的3′-UTR是本领域众所周知的。同时，本发明的表达载体可以选择性包含报道基因(例如，萤光素酶或者β葡糖醛酸糖苷酶)或者抗生素抗性基因作为选择标记(例如，新霉素、羧苄青霉素、卡那霉素、壮观霉素、潮霉素)并且可以还包含增强子。
同时，可用于本发明的动物细胞表达载体包括pSV2-neo(Southern andBerg，J.Mol.Appl.Genet.1：327-341，1982)，pCAGGS(Niwa et al.，Gene 108：193-200，1991)，pcDL-SRα296(Takebe et al.，MoI.Cell Biol.8：466-472，1988)，pAc373(Luckow et al.，Bio/Technology 6：47-55，1988)，并且需要时，上面列出的此类载体可以包含上述启动子、前导序列、复制起点、3′-UTR、报道基因、选择标记基因和/或增强子。
在另一实施方案中，本发明涉及用表达载体转化的动物细胞和通过培养动物细胞产生人β干扰素突变蛋白的方法。
在本文中，包括权利要求书中使用的术语“转化”指通过导入外源多核苷酸(在本发明中指编码人β干扰素突变蛋白的多核苷酸)修饰宿主细胞基因型，并且指不考虑使用的转化方法，向宿主细胞中导入外源多核苷酸。导入宿主细胞的外源多核苷酸可以在整合或不整合到宿主基因组的条件下保持，并且本发明包括这两种情况。
同时，本文使用的术语“动物细胞”包括用于产生重组蛋白的所有动物细胞和昆虫细胞。用于本发明中的示例性动物细胞包括COS细胞、CHO细胞、C-127细胞、BHK细胞、大鼠Hep I细胞、大鼠Hep II细胞、TCMK细胞、人肺细胞、人肝细胞瘤细胞、HepG2细胞、小鼠肝细胞、DUKX细胞、293细胞等等，昆虫细胞为例如蚕培养细胞。
在另一实施方案中，本发明涉及包含根据本发明的人β干扰素突变蛋白的药物组合物。
包括在本发明的药物组合物中的人β干扰素已经一般用作多发性硬化的治疗剂，但是也已经报导它可以用于治疗癌症、自身免疫病、病毒感染、HIV相关的疾病和丙型肝炎(Pilling et al.，European journal of Immunology29：1041-1050，1999)，以及连续发现了它的新药理学作用。
因此，必须理解本发明的药物组合物中的药理学作用包括人β干扰素显示出的所有其他药理学作用以及作为多发性硬化的治疗剂的药理学作用。
此外，必须理解此类药理学作用包括将在将来发现的任何药理学作用以及迄今报导的作为人β干扰素的药理学作用的所有药理学作用。
因为本发明的药物组合物的特征是包含根据本发明方法制备的具有提高的或者增加的活性或能力的人β干扰素突变蛋白，尽管本发明的药物组合物可以包括人β干扰素的将在将来发现的任何药理学作用以及迄今报导的它的所有药理学作用，但是本发明的范围将不会不适当地扩大。然而，当考虑到人β干扰素已经广泛用作多发性硬化的治疗剂并且以前已经发现了它对于癌症、自身免疫病、病毒感染、HIV相关的疾病和丙型肝炎的治疗作用的事实，上面的药理学作用优选为此类药理学作用。同时，本发明的药物组合物可以通过多种途径施用，包括经口、经皮、皮下、静脉内和肌内导入。
根据任一种常规方法，本发明的药物组合物可以配制成几种制剂。在制剂的制备中，活性成分优选用稀释剂如填料、膨胀剂、黏合剂、增湿剂、崩解剂和表面活性剂或者赋形剂混合或稀释。
对于人类患者的治疗，本发明药物组合物的典型的日剂量可以为约0.01到5mg/kg体重，并且可以以单次剂量或者分开剂量施用。然而，将理解实际施用的活性成分的量应该按照多种相关的因素决定，这些因素包括待治疗的病症、所选的施用途径、个体患者的年龄、性别和体重，和患者症状的严重性；并且因此，上面的剂量不意在以任何方式限制本发明的范围。
附图简述
图1是编码人β干扰素的基因的核苷酸序列和其中编码的氨基酸序列。被人工替代的氨基酸序列以方框表示。
图2是示意图，显示了通过位点定向诱变在特定位点人工修饰编码人β干扰素的基因的步骤。在第一步中，合成的引物对结合到核苷酸序列的特定位点并通过DNA聚合酶的作用合成具有替代的核苷酸序列的新基因。第二步中，含有新合成的β干扰素基因的PCR反应产物内甲基化的β干扰素模板基因通过用限制酶DpnI处理除去，并用所得的PCR反应混合物转化大肠杆菌(E.coli)。
图3是示意图，显示了装配用于表达人β干扰素突变蛋白的表达载体pcDNA3.1-IFN-β的步骤。
图4是示意图，显示了向动物细胞中共转染表达载体pcDNA3.1-IFN-β和psp72-DHFR以表达人β干扰素突变蛋白的步骤。
图5显示了蛋白质印迹分析COS细胞中β干扰素突变蛋白的表达的结果。此外，它还显示了用N-聚糖酶处理后蛋白质印迹分析该突变蛋白的结果。对人β干扰素特异的单克隆抗体用作一级抗体，HRP--缀合的抗小鼠免疫球蛋白兔抗体用作二级抗体。
图6显示了用于分析从CHO细胞的培养溶液纯化的β干扰素突变蛋白的SDS-PAGE的结果。
图7显示了在CHO细胞中表达的β干扰素突变蛋白与天然β干扰素的抗病毒活性的比较结果。
图8显示了在CHO细胞中表达的β干扰素突变蛋白与天然β干扰素对细胞生长的抑制效果比较的结果。
图9显示了通过A549细胞中MHC I类的激活测量CHO细胞中表达的β干扰素突变蛋白和天然β干扰素的免疫调节作用并比较它们的结果。
图10显示了CHO细胞中表达的β干扰素突变蛋白和天然β干扰素在大鼠中根据时间过程的残留血液浓度。
下面的实施例意在进一步阐明本发明并且它们不应被理解为限制本发明的范围。
实施例1：通过诱变合成编码具有一个或多个额外的Asn-X-Ser/Thr 序列的人β干扰素突变蛋白的基因
为了将SEQ ID NO：1(图1)表示的人β干扰素(IFN-β)的氨基酸序列中R27(27位氨基酸序列，精氨酸)人工修饰成苏氨酸(T)或者丝氨酸(S)x或者向IFN-β的C-末端加入甘氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸-缬氨酸序列(G-N-I-T-V)，使用SEQ ID NO：3的编码天然β干扰素的基因作为模板进行位点定向诱变和DNA合成。
即，通过针对将进行诱变的位点合成一系列引物对。此时，用于合成编码β干扰素突变蛋白的基因的重叠PCR中所使用的引物对如下：
i)用于合成R27T的引物对
R27T-5′：GCAATTGAATGGGACGCTTGAATACTGCCTC(SEQ ID NO：4)
R27T-3′：GAGGCAGTATTCAAGCGTCCCATTCAATTGC(SEQ ID NO：5)
ii)用于合成R27S的引物对
R27S-5′：GCAATTGAATGGGAGTCTTGAATACTGCCTC(SEQ ID NO：6)
R27S-3′：GAGGCAGTATTCAAGACTCCCATTCAATTGC(SEQ ID NO：7)
iii)用于合成GNITV的引物对
GNIT V-5′：CTTACAGGTTACCTCCGAAACGGTAATATCACTGTCTGAAGATCTCCTAGCCTGTCC(SEQ ID NO：8)
GNITV-3′：GAATGTCCAATGGAGGCTTTGCCATTATAGTGACAGACTTCTAGAGGATCGGACAGG(SEQ ID NO：9)
(其中R27T和R27S为编码β干扰素突变蛋白的基因，该突变蛋白在27位的精氨酸分别通过β干扰素基因的诱变用苏氨酸和丝氨酸替代，GNITV是编码β干扰素突变蛋白的基因，该突变蛋白通过β干扰素基因的诱变在其C-末端加入甘氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸-缬氨酸(G-N-I-T-V)序列。下面的是相同的)。
如图2所示，使用含有编码β干扰素的基因的质粒pGEM-T Easy载体(Promega，USA)作为模板、两个重叠引物对和Pfu-turbo DNA聚合酶进行PCR。通过混合5μl10x反应缓冲液、5-50ng模板基因、125ng每种引物对和1μl dNTP混合物制备PCR反应溶液，其最终体积用超纯水调节到50μl，然后向其中加入1μl Pfu Turbo DNA聚合酶(2.5U/μl)。PCR条件如下：在95℃30秒的最初变性后，进行12个循环的：95℃30秒、55℃60秒和68℃480秒。
将PCR产物用1μl DpnI(10U/μl)在37℃处理4小时以除去甲基化的模板基因。向在冰上解冻的XLl-blue大肠杆菌细胞中加入1ul DpnI处理的PCR产物后，将混合物在42℃加热45秒并通过冰冷却。将如此制备的大肠杆菌细胞悬浮在500μl培养基中，在37℃温育1小时，进行离心以收获细胞。将收获的细胞涂布在LB琼脂板上，在37℃温育16小时或者更长时间直到产生菌落。从菌落纯化质粒DNA后，编码β干扰素突变蛋白的基因通过用DNA测序仪进行测序分析。结果，27位氨基酸通过定向诱变修饰成编码苏氨酸(R27T)或丝氨酸(R27S)的密码子。此外，向天然人β干扰素的C-末端加入编码由甘氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸-缬氨酸组成的氨基酸序列(GNITV)的密码子。含有如此制备的基因的质粒分别命名为pGEMT-IFN-β-R27T、pGEMT-IFN-β-R27S和pGEMT-IFN-β-GNITV。
通过使用pGEMT-IFN-β-R27T和pGEMT-IFN-β-R27S作为模板，对GNITV特异的重叠引物对(iii)和Pfu-turbo DNA聚合酶在相同条件下进行PCR，将如此所扩增的PCR产物进行如上述的克隆。结果，得到了在27位用苏氨酸或丝氨酸替代丙氨酸并且加入编码由甘氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸-缬氨酸组成的氨基酸序列的密码子的基因。含有该基因的质粒称作pGEMT-IFN-β-R27T+GNITV和pGEMT-IFN-β-R27S+GNITV。
表1显示了分别插入根据本发明制备的5种β干扰素突变蛋白基因的质粒。
[表1]
β干扰素突变蛋白基因
   质粒     氨基酸替代    替代和添加
   pGEMT-IFN-β-R27T     R27T    AGG→ACG
   pGEMT-IFN-β-R27S     R27S    AGG→AGT
   pGEMT-IFN-β-GNITV     GNITV    +GGTAATATCACTGTC
   pGEMT-IFN-β-R27T+GNITV     R27T+GNITV    AGG→ACG+GGTAATATCACTGTC
   pGEMT-IFN-β-R27S+GNITV     R27S+GNITV    AGG→AGT+GGTAATATCACTGTC
实施例2；构建表达载体，转染到COS细胞和细胞培育
通过使用实施例1中制备的含有β干扰素突变蛋白的每种质粒作为模板和引物对P1(CCGGAATTCGCCACCATGACCAACAAGTGTCTCCTCCAAA7 SEQ ID NO：10)和P2(CCGCTCGAGGTCACTTAAACAGCATCTGCTGGTTGA，SEQ ID NO：11)进行PCR，得到编码人工替代的β干扰素的基因(图3)。此时，在该PCR反应中使用DNA聚合酶(Stratagene)，扩增的基因在其两端具有限制酶EcoRI和XhoI的识别位点。分别用EcoRI和XhoI处理如此扩增的IFN-β突变蛋白基因和pCDNA3.1(Invitrogen)。使用Qiagen提取试剂盒从琼脂糖凝胶回收线性化的IFN-β突变蛋白基因和pCDNA3.1，进行连接，然后转化到大肠杆菌DH5α中。在LB-氨苄青霉素琼脂培养基中培养大肠杆菌转化体后从产生的菌落纯化质粒DNA，用限制酶EcoRI和XhoI处理，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，以选择仅插入IFN-β突变蛋白基因的菌落。通过测序分析证实所选的菌落的质粒DNA具有IFN-β突变蛋白基因的核苷酸序列。这种质粒命名为pCDNA3.1-IFN-β-X(其中X是每个β干扰素突变蛋白的数目)。
在制备的重组表达载体中，用对应于天然β干扰素、β干扰素突变蛋白R27T、R27S、R27T+GNITV和R27S+GNITV的重组表达载体分别转染COS细胞(ATCC No.CRL-1650)。即，将预培养的COS细胞以2×105个细胞/ml的浓度接种到60mm组织培养皿中并培育24小时。向没有血清的100μl DMEM中分别加入每种重组表达载体DNA 2μg和7μlLipofectinTM(Gibco BRL)试剂，并在室温保持15分钟。将如此制备的两种溶液互相混合并在室温保持15分钟，以形成lipofectin-DNA复合体。向lipofectin-DNA复合体中加入无血清的DMEM后，将混合物轻轻放在平板中培养的COS细胞上，并在37℃，5％CO2培养箱中温育平板6小时以发生转染。在补充10％胎牛血清(JRH)，50μg/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM中37℃，5％CO2下培养用每种表达载体转染的COS细胞48小时。在培养期间，收集条件培养溶液3到5天。
实施例3：β干扰素突变蛋白实例3-1的表征：证实糖链加入
从用实施例2中制备的转染的COS细胞的培养溶液分离含有重组人β干扰素或者β干扰素突变蛋白的上清液。将上清液1～2μg与抗β干扰素兔多克隆抗体混合并在室温过夜进行免疫沉淀。向含有抗体的上清液中加入用等体积的PBS(磷酸缓冲盐溶液)稀释的蛋白A sepharose树脂20-80μl，并在室温反应混合物1小时。将混合物离心以分离沉淀物，用PBS洗涤沉淀物。一部分沉淀物用N-聚糖酶处理以切割N-连接的糖链。用和不用N-聚糖酶处理的沉淀进行15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将凝胶转移到硝酸纤维素膜并使用抗β干扰素小鼠单克隆抗体，根据Runkel et al(Pharaceutical Research 15：641-649，1998)描述的方法进行蛋白质印迹分析。
作为分析用每种β干扰素突变蛋白转染的COS细胞的上清液的结果，已经证实β干扰素突变蛋白的蛋白质分子量与天然β干扰素的相比增加(图5)。当用N-聚糖酶处理具有增加的蛋白质分子量的β干扰素突变蛋白时，它的糖链被除去，导致降低分子量(图5)。
实施例3-2；β干扰素突变蛋白的活性比较
为了比较天然β干扰素和β干扰素突变蛋白的活性，通过EIA(酶免疫测定法)定量干扰素蛋白质的量，通过病毒活性测试测量天然β干扰素和β干扰素突变蛋白的效价。
使用试剂盒(PBL)根据生产商的使用说明书进行EIA。即，将100μl稀释溶液分布到酶免疫测定试剂盒中包括的抗体吸收板内指定的每个孔中。用稀释溶液以适当的稀释率稀释国际标准溶液和样品，并向每孔加入100μl每种稀释剂。将平板在室温保持1小时。此时，通过将1 ample人IFN-β国际标准(NIBSC)溶解在1ml配制缓冲液中并向瓶中分配100μl所得溶液来制备国际标准溶液。该瓶子在-70℃保存，使用时，解冻冷冻的瓶子并将内容物在用前用稀释溶液适当稀释。从每孔除去残留的反应液后，用250μl洗涤溶液洗涤孔板3次，向每孔加入100μl酶-抗体缀合溶液。将孔板在室温保持1小时。反应完成后，除去反应液。用200μl洗涤溶液洗涤孔板3次，并从中完全除去残留溶液。然后向每孔加入预先制备的底物显色溶液100μl并在室温反应30分钟。反应完成后，向每孔加入100μl反应终止液以终止反应并在450nm测量吸光度。通过将标准溶液的浓度作为横轴并将其吸光度(A450nm)作为纵轴作图绘制标准曲线，对应于国际标准溶液和样品的每个吸光度的人IFN-β的浓度从标准曲线计算。通过将计算的浓度乘以每个稀释率计算三种稀释剂浓度的平均值，并从中计算国际标准溶液和样品的测量值，然后，计算终浓度。根据如实施例6中描述的相同方法进行抗病毒活性测试。在表2中显示了瞬时表达每种β干扰素突变蛋白的COS细胞的几种培养溶液中抗病毒效价和EIA值的比值。从这些结果，可以证实由于加入糖链，β干扰素突变蛋白的分子量增加，并且它的活性也等于或者高于天然β干扰素。为了此类β干扰素突变蛋白的大量产生，将上述β干扰素突变蛋白表达载体转染到CHO细胞系中。
[表2]
β干扰素突变蛋白分子量的增加和抗病毒效价与EIA值的比值
    突变蛋白编号     氨基酸替代 分子量的增加 抗病毒效价与EIA值的比值
    R27T     R27T     ++     3
    R27S     R27S     ++     3
    +GNITV     +GNITV     ++     1.5
    R27T+GNITV     R27T+GNITV     ++++     4
    R27S+GNITV     R27S+GNITV     ++++     4
++：分子量为26kDa，其加入一条糖链。
++++：分子量为30kDa，其加入两条糖链。
实施例4：转染和细胞培养物(CHO细胞)
在60mm细胞培养皿中培养CHO细胞(DG44)直到它们的汇合度达到约40-80％(1～4×105个细胞/60mm培养皿)。将LipofectinTM试剂3μl(Gibco)与97μl α-MEM(无血清和无抗生素)充分混合，并向其中加入质粒pcDNA31-IFN-β-X DNA(0.1μg/μl或更多，约2μg)和pSP72-DHFR(0.2μg)。混合物在室温保持30分钟后，将其加到上面培养的CHO细胞中(图4)。一天后，培养基用补充50μg/ml G418和10％FBS的α-MEM替换。随后，细胞在缺少脱氧核糖核苷和核糖核苷的α-MEM基本培养基中培养7-10天，以选择转染的细胞。之后，再次选择CHO DHFR+转染子细胞。将再次选择的CHO DHFR+转染子细胞通过有限稀释方法在96孔板上建群并在选择培养基中连续培养。最后，在含有10％血清的基本培养基中培养转染子细胞，将MTX(氨甲蝶呤，Sigma)浓度逐渐2倍增加，从20nM到1000nM，以第三次选择在MTX选择培养基中生长的MTX抗性克隆。
从在含有1μM MTX的培养基中生长至少1个月的健康细胞系分离单个细胞。首先，将单个细胞接种到96孔多孔板的每个孔并培养后，选择仅具有单个细胞的孔。通过EIA定量分析选择显示出高表达率的候选组。通过顺序将其从24孔板转移到6孔板培养所选的候选组。将如此培养的候选组再次通过EIA定量分析选择，以最后建立β干扰素的高表达细胞系。作为测量上面制备的重组CHO细胞系中产生的β干扰素的量的结果，尽管天然β干扰素细胞系产生了1.8μg/ml/24hr IFN-β，但是表达β干扰素突变蛋白的CHO-R27T和CHO-R27T-GNITV细胞系分别产生了6.5μg/ml/24hr和7.0μg/ml/24hr IFN-β，其比天然细胞系的高3倍。
实施例5：在CHO细胞系中产生的加入一条或者多条糖链的β干扰素 的纯化
使用细胞工厂(Nunc，Cat No.170069)培养实施例4中掺入一个或多个突变蛋白序列的细胞系。将每种表达细胞系用含有10％FBS的α-MEM稀释到5×104个细胞/ml的浓度，并在细胞工厂中5％CO2，37℃下传代培养72小时，以证实细胞生长。将细胞用PBS洗涤三次以除去多数残留的血清组分，并将其培养基用无血清的培养基(Sigma C8730)替换。用无血清的培养基替换后，每24个小时收集培养溶液4次，并每次收集时向其中加入新鲜的无血清培养基。纯化总共四次收集的培养液。向XK50/20柱(Amersham-Pharmacia)中装入Blue sepharose树脂(Amersham-Pharmacia)200ml并用10CV.(柱体积)缓冲液A(20mM磷酸钠，1M NaCl，pH7.4)平衡。将微滤的培养液以20mi/min的流速流入平衡的柱子中，并通过UV检测器在280nm波长监测。缓冲液B(20mM磷酸钠，1M NaCl，30％乙二醇，pH7.4)流入柱子以除去未吸收的组分，用缓冲液C(20mM磷酸钠，1M NaCl，60％乙二醇，pH7.4)洗脱吸收到树脂的蛋白质。洗脱液用PBS(磷酸缓冲盐溶液)透析，用浓缩器(Centricon，截留10,000)浓缩，然后再次用PBS透析。
实施例6：在CHO细胞系中产生的加入一条或多条糖链的β干扰素的理化表征
实施例6-1：SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
将实施例5中纯化的样品与5×样品缓冲液(125mM Tris-HCl，5％SDS，50％甘油，0.1％β-巯基乙醇，1mg/ml溴酚蓝)以1∶4的比例混合，并将混合物95℃下预处理5分钟。将预处理的混合物20μl装入具有分子量标准参照物的15％聚丙烯酰胺凝胶的孔中并电泳。电泳完成后，将凝胶用考马斯亮蓝染色并用脱色溶液脱色。结果，天然的β干扰素显示出约18.0kDa的带，对应于没有糖链的蛋白质，和约22.0kDa的带，对应于具有糖链的蛋白质。与天然β干扰素的带型比较，对于引入了一条额外糖链的IFN-β而言，额外检测约26.0kDa的带，对于引入两条额外糖链的IFN-β而言，额外检测约30.0kDa的带(图6)。
实施例6-2：用于证实在糖链末端加入唾液酸的试验
使用人IFN-βELISA试剂盒(PBL)测量所有纯化的蛋白质中β干扰素的含量。通过修改Masaki Ito et al.Anal.Biochem.300：260，2002)的方法测量每种蛋白质中唾液酸的含量。通过将纯化的蛋白质与0.1N盐酸在80℃反应1小时从糖蛋白分离唾液酸。通过唾液酸荧光标记试剂盒(Takara)将它们的一些用荧光素标记并进行HPLC以分析含量。结果在表3中显示为与天然β干扰素相比，在β干扰素突变蛋白中唾液酸的重量百分比。
[表3]
β干扰素突变蛋白中唾液酸的重量
    β干扰素     唾液酸的重量/INF-β的重量
    天然的     1.96±0.14
    R27T，R27S     3.50±0.12
    GNITV     3.23±0.32
    R27T+GNITV，R27S+GNITV     6.90±0.25
实施例7：CHO细胞中表达的β干扰素突变蛋白的生物活性
实施例7-1；R27T、R27S和GNITVβ干扰素突变蛋白的抗病毒活性
基于天然β干扰素(IFNβ-la)的抗病毒活性，彼此相对地比较R27T、R27T+GNITV、GNITVβ干扰素突变蛋白和除去糖链的β干扰素(IFNβ-lb)的抗病毒活性。此时，Rebif(Serono)用作天然β干扰素。
在补充10％FBS，100×MEM非必需氨基酸溶液和100mM丙酮酸钠的MEM中培养A549细胞。在此类分析当天，将细胞转移到相同的新鲜培养基中并调节它们的细胞密度至3×105个细胞/ml。用相同的培养基稀释测试和对照β干扰素。在96孔多孔板中进行此类稀释以在孔中含有100μl/孔的体积并将样品连续稀释2倍。所有样品都制备两份。其中包括仅含有100μl培养基(没有β干扰素)的对照孔。向每孔加入100μl细胞后，将孔板在37℃，5％CO2温育20小时。从板除去培养基并向每孔加入用相同培养基稀释的100μl EMCV(1000 TCID50/1M)。将孔板在37℃，5％CO2温育22小时后，除去培养基，并将孔板用结晶紫染色。除去染料后，向其中加入100μl 2-甲氧基乙醇萃取染料，在450nm测量吸光度以测定抗病毒活性。
尽管除去了其糖链的β干扰素(IFNβ-lb)在相同条件下显示出相对较低的活性，但是R27T、R27T+GNITV和GNITV显示出比天然β干扰素(IFNβ-la；Rebif)更高的活性。引入两条额外糖链的R27T+GNITV比天然β干扰素显示出高4倍的活性，引入一条糖链的R27T显示出比天然β干扰素显示出高3倍的活性(图7)。
实施例7-2：细胞生长的抑制
检查β干扰素突变蛋白对细胞生长的影响，并基于天然β干扰素(IFNβ-la)等于抗病毒活性的效果相互相对地比较。此时，使用Rebif(Serono)作为天然的β干扰素。通过使用Daudi细胞测量抗增殖活性。
在补充100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺和10％FBS的RPMI 1640中培养Daudi细胞。用含有10％FBS的RPMI 1640将测试和对照干扰素β在96孔多孔板中顺序稀释两倍以在孔中含有每孔100μl体积。所有样品都制备两份。将细胞以1×104个细胞/孔的浓度加入96孔多孔板，并在37℃，5％CO2温育孔板40到48小时。随后，向每孔加入含有1μCi3[H]胸苷的50μl培养基，并温育孔板6小时。收获细胞并测量它掺入的放射性的量。
β干扰素突变蛋白抑制Daudi细胞的生长并且它们的活性是剂量依赖性的。除去其糖链的β干扰素(IFNβ-lb)显示出低于天然β干扰素(IFNβ-la)的抗增殖活性，而R27T、R27T+GNITV和GNITVβ干扰素突变蛋白显示出比天然β干扰素更高的活性。β干扰素突变蛋白的活性排列顺序为R27T+GNITV、R27T和GNITV(图8)。
实施例7-3：免疫调节能力
通过A549细胞中MHC I类的活化测量天然β干扰素和其突变蛋白的免疫调节能力。在补充10％FBS和2mM谷氨酰胺的DMEM中培养A549细胞。将细胞以1×105个细胞/ml的密度接种到分别含有2倍连续稀释的天然β干扰素、其突变蛋白或者除去其糖链的β干扰素(IFNβ-lb)的培养基中，并在37℃，5％CO2中培养48小时。细胞用含有5mM EDTA的Hank′s缓冲盐溶液处理并通过离心收获。将如此分离的沉淀物以2×107个细胞/ml的密度悬浮在FACS缓冲液中，并通过FACS分析测量MHC I类的表达量。该测量中使用偶联生物素的抗-HLAABA抗体和偶联荧光素的链霉抗生素蛋白，所有样品制备两份。
β干扰素突变蛋白的免疫增强作用类似或者稍高于天然β干扰素(IFNβ-la)的免疫增强作用。β干扰素突变蛋白的此类作用以GNITV、R27T和R27T+GNITV的顺序增加，其等于上述两种不同的活性。没有额外的糖链的β干扰素与其浓度相比显示出低免疫调节作用(图9)。
实施例7-4：药物代谢动力学常数研究
根据这样的方法进行体内活性测试，该方法测量依赖于施用在CHO细胞中表达的β干扰素突变蛋白的大鼠中的时间测量β干扰素突变蛋白的血液浓度的改变。具有246.3±258.1g平均体重的Hsd：Sprague-Dawley雌性大鼠用于此类体内活性测试中，并且将它们在笼子环境中适应1周，该环境设置温度为24±1℃，相对湿度为55％，光照条件为12小时白天/12小时黑夜。在实验期间，大鼠在相同的笼子中喂养。
对大鼠称重并使它们根据它们的平均体重随机分布后，将它们分成四组，分别施用天然β干扰素、两种突变蛋白和无药物，每组由4只大鼠组成。实验前2天通过外科手术在大鼠的颈静脉插入导管。插入导管的大鼠的平均体重为253.5g。
将天然β干扰素和每种β干扰素突变蛋白通过尾静脉注射到大鼠中作为试样。血液收集前用盐水洗涤颈静脉导管，并在对应于注射后1、5、15、30、75、180、300和480min的时间点收集0.3ml血液。血液收集后，导管装入肝素盐水(50IU/ml)以防止它凝固。将收集的血样立即用作为抗凝血剂的4％柠檬酸钠溶液处理以防止凝血，并进行离心以分离除血细胞以外的血浆。将分离的血浆在-70℃保存。通过抗病毒测试测量实验动物中β干扰素的血液浓度。图10显示了根据时间过程，在大鼠中剩余的β干扰素突变蛋白和天然β干扰素的血液浓度。此外，从这些残留的血液浓度计算药物代谢动力学常数。
结果在表4中显示，引入两条额外糖链的R27T+GNITV和R27S+GNITVβ干扰素突变蛋白显示出比天然β干扰素长3倍的半寿期，引入一条额外糖链的R27T、R27S和GNITVβ干扰素突变蛋白显示出比天然β干扰素长3倍的半寿期。
[表4]β干扰素突变蛋白和天然β干扰素在大鼠中的半寿期
    样品  AUC(hr*IU/ml)     平均保留时间(hr)   Vss(ml/kg)    清除率(ml/kg/hr) 半寿期(hr)
  R27T  203966     0.726214     65.0     100.1  2.48
  GNITV  190610     0.647452     74.4     114.9  2.46
  R27T+GNITV  316807     0.952376     45.1     60.5  3.50
  天然的  116807     0.512376     96.1     187.5  1.13
如上述，根据本发明，可以提供与天然β干扰素相比具有提高的或增加的活性或能力的β干扰素突变蛋白。因为本发明的人β干扰素突变蛋白与天然人β干扰素相比还含有一条或两条额外的糖链，所以它们显示出提高的或增加的抗病毒活性、细胞生长抑制活性、免疫调节能力和延长的半寿期。这意味着它能够减少人β干扰素的剂量和注射次数。
同时，根据本发明，还提供了编码β干扰素突变蛋白的基因、含有该基因的动物细胞表达载体、用该表达载体转染的动物细胞、通过培养所述动物细胞制备人β干扰素突变蛋白的方法和包含所述人β干扰素的药物组合物。
尽管本发明已经关于上面的特定实施方案进行了描述，但是将认识到本领域技术人员可以对本发明作出多种修饰和改变，它们也在如所附权利要求书定义的本发明的范围内。
序列表
<110>三星精细化学有限责任公司
<120>人β干扰素突变蛋白
<160>11
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>1
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
  1             5               10              15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
            20              25              30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
        35              40              45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
    50              55              60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65              70              75              80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
            85              90              95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
        100             105             110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
        115             120             125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His  Cys Ala Trp Thr
    130             135             140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145              150               155                 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
              165
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<110>三星精细化学有限责任公司
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<110>三星精细化学有限责任公司
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ccgctcgagg tcacttaaac agcatctgct  ggttga          36

Claims (16)

1.人β干扰素突变蛋白，其是选自由下面的(a)、(b)和(c)组成的组并且具有人β干扰素活性的多肽，其中该多肽在它的C-末端含有甘氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸-缬氨酸序列并且在上面的序列位置含有N-连接的糖链：
(a)含有SEQ ID NO：1的完整氨基酸序列的多肽；
(b)包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的必需部分的多肽；和
(c)基本上类似于多肽(a)或(b)的多肽。
2.权利要求1的人β干扰素突变蛋白，其中所述具有人β干扰素活性的多肽是具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的天然人β干扰素。
3.权利要求1的人β干扰素突变蛋白，其中所述具有人β干扰素活性的多肽是多肽(c)，其中通过在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中27位氨基酸用苏氨酸或丝氨酸替代，该多肽含有由天冬酰胺-甘氨酸-苏氨酸/丝氨酸-亮氨酸组成的25位到28位氨基酸序列，并且从而在该序列位置含有额外的N-连接的糖链。
4.权利要求1的人β干扰素突变蛋白，其中所述具有人β干扰素活性的多肽基本上类似于多肽(a)，其中该多肽具有SEQ ID NO：1氨基酸序列，且用苏氨酸或丝氨酸替代27位精氨酸，含有通过此类替代产生的由天冬酰胺-甘氨酸-苏氨酸/丝氨酸-亮氨酸组成的25位到28位氨基酸序列，并且从而在该序列位置含有额外的N-连接的糖链。
5.人β干扰素突变蛋白，其是选自由下面的(a)、(b)和(c)组成的组并且具有人β干扰素活性的多肽，其中该多肽含有对应于SEQ ID NO：2的25位到28位氨基酸序列的保守的天冬酰胺-甘氨酸-苏氨酸/丝氨酸-亮氨酸序列，并且从而在该序列位置含有N-连接的糖链：
(a)含有SEQ ID NO：2的完整氨基酸序列的多肽；
(b)包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列的必需部分的多肽；和
(c)基本上类似于多肽(a)或(b)的多肽。
6.权利要求5的人β干扰素突变蛋白，其中所述具有人β干扰素活性的多肽是具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。
7.多核苷酸，其编码权利要求1到6的任一种人β干扰素突变蛋白。
8.权利要求7的多核苷酸，其中所述人β干扰素突变蛋白是在SEQ IDNO：1的氨基酸序列的C-末端包括甘氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸-缬氨酸序列的人β干扰素突变蛋白。
9.权利要求7的多核苷酸，其中所述人β干扰素突变蛋白是包括SEQID NO：2的氨基酸序列的人β干扰素突变蛋白。
10.权利要求7的多核苷酸，其中所述人β干扰素突变蛋白是在SEQID NO：2的氨基酸序列的C-末端包括甘氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸-缬氨酸序列的人β干扰素突变蛋白。
11.表达载体，其在动物细胞中表达人β干扰素突变蛋白，所述表达载体包含编码权利要求7到11的人β干扰素突变蛋白的任一种多核苷酸。
12.动物细胞，其用权利要求11的表达载体转染。
13.制备人β干扰素突变蛋白的方法，其包括培养权利要求12的动物细胞的步骤。
14.药物组合物，其包含权利要求1到6的任一种人β干扰素突变蛋白。
15.权利要求14的药物组合物，其显示出天然人β干扰素的药理学作用。
16.权利要求14的药物组合物，其具有天然人β干扰素的药理学作用，其中所述药理学作用是预防或治疗选自由多发性硬化、癌症、自身免疫病、病毒感染、HIV相关的疾病和丙型肝炎组成的组的疾病。
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